JP6951154B2 - 細胞培養モニタリングシステム - Google Patents

Description

本発明は、細胞培養モニタリングシステムに関するものである。

従来、細胞の培養状況を定量的に評価し、時系列に記録することにより、細胞の培養工程を管理する細胞培養モニタリングシステムが知られている（例えば、特許文献１参照。）。特許文献１に記載の細胞培養モニタリングシステムは、培養器に収容される複数の培養容器ごとに設けられたカメラを１つのコンピュータシステムにより集中管理し、このコンピュータシステムにより各カメラから送られてくる各データに基づいて培養器内の状態を監視している。

特表２００９−５３３０５３号公報

しかしながら、各カメラを制御するプログラムを記憶するメモリ空間を共有にし、１つのＰＣ（Personal Computer）においてこれら複数のカメラの実行を共通のプロセスで集中管理すると、長期間のモニタリング中に１つでもカメラがエラーを起こすことによりシステム全体がダウンした場合に、正常なカメラのモニタリングまで終了してしまうという不都合がある。また、細胞培養のモニタリングを続ける中で新規に培養状況をモニタリングするカメラを追加したい場合があるが、カメラを追加するにはシステムを一旦停止しなければならず、再度モニタリングを開始するための再設定等の手間がかかるという不都合がある。

本発明は上述した事情に鑑みてなされたものであって、複数のカメラを他のカメラの影響を受けることなく個々に管理して、細胞の培養状況を監視することができる細胞培養モニタリングシステムを提供することを目的としている。

上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を提供する。
本発明の一態様は、細胞の培養状態を計測する複数の計測ユニットと、複数の該計測ユニットが接続され、これら複数の計測ユニットの制御を行うためのプログラムを実行する制御装置および前記プログラムの実行に必要な記憶装置を有する集中管理装置とを備え、前記制御装置が、複数の前記計測ユニットの接続状態を管理するとともに、接続された前記計測ユニットごとに独立して動作させる前記プログラムの実行単位である子プロセスを前記計測ユニットごとに起動させて各前記計測ユニットを管理する親プロセスを実行し、前記記憶装置において相互に独立した記憶空間を割り当てられた状態で対応する各前記計測ユニットを個別に制御するように起動された各前記子プロセスを実行することで、前記親プロセスが各前記子プロセスと通信して複数の前記計測ユニットを個別に制御する細胞培養モニタリングシステムである。

本態様によれば、集中管理装置の制御装置により、複数の計測ユニットの接続状態を管理する親プロセスが実行され、この親プロセスにより計測ユニットごとの複数の子プロセスが起動され、各計測ユニットに対応する子プロセスの実行に従い各計測ユニットが個別に制御されて細胞の培養状態が計測される。

この場合において、制御装置が、記憶装置における子プロセスごとに割り当てられる相互に独立した記憶空間を用いて各子プロセスを実行させて各計測ユニットを個別に制御することで、いずれかの計測ユニットにおいて障害が発生して対応する子プロセスに異常が生じた場合であっても、その影響を対応する子プロセス内だけに抑えられるので、他の正常動作している計測ユニットによる計測をそれぞれの子プロセスに基づいて継続させることができる。

また、新たな計測ユニットを追加する場合も、親プロセスにより、新たな計測ユニットに対応する新たな子プロセスが起動される。この新たな子プロセスは、他の子プロセスと記憶空間を分けて管理された状態で実行されるため、他の計測ユニットに影響を与えることがない。
したがって、複数の計測ユニットを他の計測ユニットの影響を受けることなく個々に管理して、細胞の培養状況を監視することができる。

上記態様においては、前記制御装置が、複数の前記計測ユニットに対応して起動させた複数の前記子プロセスを互いに処理時間が重複しないよう時間的に分離して実行させることとしてもよい。

このように構成することで、いずれかの計測ユニットの接続が断絶し、その計測ユニットの子プロセスが廃止されまたは異常が生じても、各計測ユニットを管理する親プロセスが存続するので、親プロセスにより他の計測ユニットを引き続き管理して計測を継続させることができる。また、複数の子プロセスの処理時間が互いに分離するように管理されるため、制御装置のプロセッサが１つの場合であっても複数の子プロセス相互の独立性が保たれる。

上記態様においては、前記子プロセスが、撮影位置および撮影条件を調整するとともに、画像取得を実行させ、前記親プロセスが、所定の時間間隔で各前記子プロセスを択一的に実行させるとともに、各前記計測ユニットにより取得された画像を解析することとしてもよい。

このように構成することで、計測ユニットごとに個々の子プロセスに基づいて細胞の培養状態を計測して画像を取得し、集中管理装置において、親プロセスに基づいて計測ユニットごとの画像を解析して、細胞の培養状況を評価することができる。

本発明に係る顕微鏡によれば、複数のカメラを他のカメラの影響を受けることなく個々に管理して、細胞の培養状況を監視することができるという効果を奏する。

本発明の一実施形態に係る細胞培養モニタリングシステムの概略構成図である。 モニタリングカメラに培養容器を搭載した状態の培養容器と撮像ユニットの縦断面図である。 図２の撮像ユニットを撮像素子の撮像光軸に沿って見た平面図である。 図１のＰＣの概略構成図である。 複数のモニタリングカメラがＵＳＢ２．０ケーブルを介してコンピュータ本体に接続されている様子を説明する図である。 モニタリングカメラごとの子プロセスが主記憶装置のメモリ空間を分けて実行されることを説明する図である。 培養容器の全域に亘って画像を取得するよう、画像を取得する位置を培養容器に対して所定の距離間隔でＸＹ方向にずらしていくことを説明する図である。 画像を取得する時間間隔を説明する図である。 制御装置において、親プロセスにより、モニタリングカメラごとの子プロセスと通信して各モニタリングカメラを制御することを説明する図である。 培養容器の底部の厚さに応じた細胞の観察位置に合わせて撮像素子の焦点位置を調整することを説明する縦断面図である。 図１の細胞培養モニタリングシステムにより細胞の培養状態をモニタリングして定量的に評価する工程を説明するフローチャートである。

本発明の一実施形態に係る細胞培養モニタリングシステムについて、図面を参照して以下に説明する。
本実施形態に係る細胞培養モニタリングシステム１は、図１および図２に示すように、細胞Ｓの培養状態を計測する複数のモニタリングカメラ（計測ユニット）３と、これらモニタリングカメラ３の制御、画像や定量情報等の細胞カルテの記憶・処理・管理等を行うＰＣ（Personal Computer）５とを備えている。ユーザは、ＰＣ５に無線または有線でアクセスして、ブラウザで細胞カルテを確認することができるようになっている。

モニタリングカメラ３は、細胞Ｓおよび培地Ｗ（図２参照。）を収容した培養容器７を搭載して、インキュベータ（Incubator）９内に収容されるようになっている。また、各モニタリングカメラ３により計測された計測データは、それぞれＵＳＢ２．０ケーブル１１を介してＰＣ５に送られるようになっている。

これらモニタリングカメラ３は、培養容器７を載置する光学的に透明なガラス板１３を有する筐体１５と、筐体１５内のガラス板１３の下方に配置され、培養容器７の底面に接着して成長している細胞Ｓの画像を経時的に取得する撮像ユニット１７とを備えている。

培養容器７は、例えば、図２に示すように、天板７ａを有する細胞培養フラスコであり、全体的に光学的に透明な樹脂により形成されている。この培養容器７は、培地Ｗとともに細胞Ｓを収容して、所定の温度および湿度に保たれたインキュベータ９に投入されることにより、細胞Ｓを培養するようになっている。

筐体１５は、例えば、略立方体の形態を有し、上面にガラス板１３が配置されている。以下、筐体１５の短手方向をＸ方向、長手方向をＹ方向、筐体１５の高さ方向をＺ方向とする。この筐体１５には、培養容器７の温度を測定する温度センサ１９が設けられている。

また、筐体１５のＹ方向に交差する一面（前面）には、各モニタリングカメラ３に固有の識別表示として機能する複数の識別ＬＥＤ（Light-Emitting Diode）２１と、継代時に一時的に停止および再開を行うために操作されるＰＳ（Passage）ボタン２３および継代状態を表示するＰＳ状態ＬＥＤ２５と、培地交換時に一時的に停止および再開を行うために操作されるＭＣ（Media Change）ボタン２７および培地交換状態を表示するＭＣ状態ＬＥＤ２９とが設けられている。
複数の識別ＬＥＤ２１は、モニタリングカメラ３ごとに異なる位置の識別ＬＥＤ２１が点灯させられるようになっている。

撮像ユニット１７は、図２および図３に示すように、細胞Ｓから筐体１５のガラス板１３を透過してくる光を受光して細胞Ｓを撮影する撮像素子３１と、ガラス板１３を透過して上方に照明光を射出する偏斜照明装置３３と、撮像素子３１と偏斜照明装置３３をガラス板１３の下方で撮像光軸に交差する方向に一体的に移動させる移動機構３５とを備えている。

撮像素子３１は、Ｚ方向に沿って延びる撮像光軸を有し、ガラス板１３に対向して配置されている。撮像素子３１により取得された細胞Ｓの画像は、計測データとして、モニタリングカメラ３ごとの識別情報と対応付けられてＰＣ５に送られるようになっている。

偏斜照明装置３３は、撮像素子３１の周囲に周方向に等間隔に配置された複数（本実施形態においては４個。）のＬＥＤ光源３７を備えている。これら４つのＬＥＤ光源３７の内の２つは撮像素子３１を間に挟んでＸ方向に間隔を空けて配置され、残りの２つは撮像素子３１を間に挟んでＹ方向に間隔を空けて配置されている。

各ＬＥＤ光源３７は、ガラス板１３の下方から斜め上方に向かって照明光を射出して筐体１５のガラス板１３および培養容器７の底部７ｂを透過させた後、培養容器７の天板７ａにおいて照明光を反射させて、斜め上方から細胞Ｓに照明光を照射するようになっている。この偏斜照明装置３３は、特定のＬＥＤ光源３７を独立して点灯させることができるようになっている。

ＰＣ５は、図４に示すように、ユーザが指示を入力するマウス、キーボード、タッチパネル、タッチペン等の入力装置（図示略）と、ユーザからの入力に従い各種設定を行ったり各モニタリングカメラ３を制御したりするコンピュータ本体（集中管理装置）４１と、容器情報、画像情報、各種データおよびプログラム等を記憶する補助記憶装置４３と、モニタリングカメラ３により取得された細胞Ｓの画像等を表示するモニタ４５とを備えている。

コンピュータ本体４１には、図５に示すように、複数のモニタリングカメラ３がＵＳＢ２．０ケーブル等により接続されるようになっている。このコンピュータ本体４１は、図４に示すように、補助記憶装置４３に記憶されているプログラムを読み込んで、各モニタリングカメラ３の制御および計測データ（画像）の処理および管理を行う中央処理装置（ＣＰＵ）４７と、中央処理装置４７が演算に使用する主記憶装置（記憶装置）４９とを備えている。

主記憶装置４９は、各モニタリングカメラ３および各計測データを管理するプログラムの実行単位である１つの親プロセスの実行と、モニタリングカメラ３ごとに設けられ、モニタリングカメラ３ごとに独立して動作させるプログラムの実行単位である複数の子プロセスの実行とを含む、各種プログラムの実行に用いられる、例えばＲＡＭ（Random Access Memory）である。

この主記憶装置４９は、図６に示すように、各モニタリングカメラ３の子プロセスごとにメモリ空間（記憶空間）を分けて使用されるようになっている。図６では、複数のモニタリングカメラ３をモニタリングカメラ３−１，３−２，・・・３−ｎと記している。各モニタリングカメラ３の子プロセスにはそれぞれ異なる番地が付されており、主記憶装置４９内で各番地に従って各子プロセスは相互に干渉しないようになっている。なお、各子プロセスは親プロセスとも干渉しないように管理される。メモリ空間の管理は、中央処理装置４７が実行しているオペレーティングシステムにより行われるようになっている。

中央処理装置４７は、図４に示すように、親プロセスおよび子プロセスを含む各種プログラムを実行する制御装置５１と、各モニタリングカメラ３により取得された画像等を演算処理する演算装置５３とを備えている。

制御装置５１は、親プロセスに基づいて、ユーザの管理、画像解析の管理、タイムラプス設定の管理、モニタリングカメラ３の管理を行うようになっている。ユーザの管理としては、親プロセスにより、ログインするユーザを管理するようになっている。画像解析の管理としては、親プロセスにより、演算装置５３による演算処理を制御し、モニタリングカメラ３ごとの画像を解析して、培養容器７ごとに細胞数、細胞密度等の培養の状態を示す情報を時系列に算出するようになっている。

タイムラプス設定の管理としては、親プロセスにより、モニタリングする画像の取得位置や、画像を取得する時間間隔を管理するようになっている。例えば、モニタリングカメラ３ごとに、図７に示すように、画像を取得する位置を培養容器７に対して所定の距離間隔でＸＹ方向にずらしていき培養容器７の全域に亘って画像を取得するよう、モニタリングする画像の取得位置を管理するようになっている。また、モニタリングカメラ３ごとに、図８に示すように、モニタリングを開始してから一定時間（Delay Time）経過した後に、画像取得（Acquire）と一定時間の経過（Rest）とを繰り返すよう、画像を取得する時間間隔を管理するようになっている。

モニタリングカメラ３の管理としては、親プロセスにより、コンピュータ本体４１と各モニタリングカメラ３との接続および断続を管理したり、所定の時間間隔で各子プロセスを択一的に実行させたりするようになっている。

具体的には、制御装置５１は、モニタリングカメラ３が接続される度に、親プロセスによって、接続されたモニタリングカメラ３に対応する子プロセスを立ち上げるようになっている。制御装置５１は、モニタリングカメラ３ごとに接続状態か非接続状態かをモニタ４５に表示させることとしてもよい。

また、制御装置５１は、図９に示すように、親プロセスによって各モニタリングカメラ３の子プロセスと通信し、各子プロセスに基づいて、モニタリングカメラ３ごとに、移動機構３５による撮像素子３１と偏斜照明装置３３の移動、偏斜照明装置３３の点灯、撮像素子３１における露光時間およびＩＳＯ感度の調整、焦点位置の調整、画像取得の実行等を個別に制御するようになっている。

具体的には、図７に示すように、移動機構３５により撮像素子３１と偏斜照明装置３３をＸＹ方向に移動させて、画像を取得するＸＹ位置を変更していくようになっている。また、図１０に示すように、ＸＹ位置ごとに、培養容器７の底部７ｂの厚さに応じた細胞Ｓの観察位置に合わせて撮像素子３１の焦点位置を調整するようになっている。さらに、図２に示すように、培養容器７の側壁７ｃによって照明光が遮られないよう、培養容器７内の細胞Ｓの位置に応じて、点灯させるＬＥＤ光源３７を切り替えるようになっている。

このように構成された細胞培養モニタリングシステム１により細胞Ｓの培養状態をモニタリングして定量的に評価する工程について、図１１のフローチャートを参照して説明する。
まず、サンプルとして培養容器７内に細胞Ｓと培地Ｗを収容してモニタリングカメラ３に搭載したものを複数用意し（ステップＳＡ１）、それぞれインキュベータ９内に配置して細胞Ｓのモニタリングを開始する（ステップＳＡ２）。各モニタリングカメラ３によりモニタリングを開始して１日〜３日程度経過したらモニタリングを一時停止し（ステップＳＡ３）、３０分程度で培地Ｗを交換する（ステップＳＡ４）。

培地Ｗを交換したら、各モニタリングカメラ３によりモニタリングを再開する（ステップＳＡ５）。そして、各モニタリングカメラ３により１日〜３日程度モニタリングしたら、モニタリングを停止し（ステップＳＡ６）、３０分程度で継代する（ステップＳＡ７）。

継代が済んだら、各モニタリングカメラ３によりモニタリングを再開し（ステップＳＡ８）、ステップＳＡ３〜ステップＳＡ８を繰り返す（ステップＳＡ９）。そして、モニタリングを開始してから１〜３週間程度モニタリングを繰り返し実施したら、継代ごとのグラフを比較して細胞Ｓの培養状況を評価する（ステップＳＡ１０）。

次に、本実施形態に係る細胞培養モニタリングシステム１の作用について説明する。
本実施形態に係る細胞培養モニタリングシステム１により細胞Ｓの培養状態をモニタリングするには、まず、ユーザは、コンピュータ本体４１にログインし、少なくとも２以上のモニタリングカメラ３を個々にＵＳＢ２．０ケーブル１１を用いてコンピュータ本体４１に接続する。

コンピュータ本体４１の制御装置５１においては、親プロセスにより、ログインしたユーザおよび各モニタリングカメラ３の接続が管理されるとともに、モニタリングカメラ３ごとに、モニタリングする画像取得位置や、画像を取得する時間間隔が管理される。また、親プロセスにより、接続されたモニタリングカメラ３ごとに対応するえが立ち上げられる。

次いで、制御装置５１により、親プロセスと各モニタリングカメラ３の子プロセスとがそれぞれ通信され、モニタリングカメラ３ごとに対応する子プロセスによって処理時間を分けて個別に制御されてモニタリングが行われる。なお、本実施形態において、「処理時間を分ける」とは、中央処理装置４７による演算処理において親プロセスおよび各プロセスごとに時間的に分離されて処理が実行されることであり、複数のモニタリングカメラ３の動作は互いに並列的に行われるものであり、人の見た目にも各モニタリングカメラ３の動作は同時に行われる。また、中央処理装置（制御装置）が並列的に動作可能な複数のプロセッサを備えている場合には、いくつかのプロセスが時間的に同時に処理されてもよい。

各モニタリングカメラ３においては、制御装置５１により、対応する子プロセスに基づいて、設定された時間間隔にて以下が実行される。
まず、いずれかのモニタリングカメラ３において、移動機構３５により、設定されたＸＹ位置に撮像素子３１と偏斜照明装置３３が移動させられる。そして、培養容器７の側壁７ｃによって照明光が遮られないいずれかのＬＥＤ光源３７が点灯される。

また、撮像素子３１において、露光時間とＩＳＯ感度が調整されるとともに、図１０に示すように、培養容器７の底部７ｂの厚さに応じた細胞Ｓの観察位置に合わせて焦点位置が調整される。そして、モニタリングが開始され、図８に示すように、開始から一定時間（Delay Time）経過した後、画像が取得される（Acquire）。

続いて、一定時間の経過（Rest）後、画像取得（Acquire）と一定時間の経過（Rest）とが繰り返される。そして、画像取得（Acquire）と画像取得（Acquire）との間に、撮像素子３１と偏斜照明装置３３がＸＹ方向に移動させられてＸＹ位置が変更されるとともに、ＸＹ位置に応じて点灯するＬＥＤ３７が切り替えられ、露光時間、ＩＳＯ感度および焦点位置が調整されながら、各ＸＹ位置にて細胞Ｓの画像が取得される。

これにより、いずれかのモニタリングカメラ３により、培養容器７の全体にわたって細胞Ｓの画像が取得され、取得された画像がコンピュータ本体４１に送られる。
同様にして、制御装置５１により、他のモニタリングカメラ３も、対応する子プロセスに基づいて、設定された時間間隔にて個別に制御され、培養容器７の全体に亘って細胞Ｓの画像が取得されてコンピュータ本体４１に送られる。

そして、制御装置５１により、親プロセスに基づいて演算装置５３が制御されて、モニタリングカメラ３ごとの細胞Ｓの画像が解析されて、培養容器７ごとに、細胞数、細胞密度等の培養の状態を示す情報が時系列に算出される。

以上説明したように、本実施形態に係る細胞培養モニタリングシステム１によれば、主記憶装置４９においてモニタリングカメラ３ごとにメモリ空間を分けて子プロセスを実行するとともに、中央処理装置４７において子プロセスごとに処理時間を分けて個別に処理することで、いずれかのモニタリングカメラ３において障害が発生した場合であってもその影響を対応する子プロセス内だけに抑え、他のモニタリングカメラ３によるモニタリングをそれぞれの子プロセスに基づいて継続させることができる。

また、新たなモニタリングカメラ３を追加する場合も、対応する新たな子プロセスを親プロセスが立ち上げることにより、他のモニタリングカメラ３とメモリ空間および処理時間を分けて新たなモニタリングカメラ３が管理され、他のモニタリングカメラ３に影響を与えることがない。
したがって、複数のモニタリングカメラ３を他のモニタリングカメラ３の影響を受けることなく個々に管理して、細胞Ｓの培養状況を監視することができる。

なお、本実施形態においては、各モニタリングカメラ３の制御を行うためのプログラムが補助記憶装置４３に記憶されていることとしたが、これに代えて、例えば、コンピュータ本体４１が、各モニタリングカメラ３の制御を行うためのプログラムを記憶する他の記憶装置を別途備えることとしてもよい。

１ 細胞培養モニタリングシステム
３ モニタリングカメラ（計測ユニット）
４１ コンピュータ本体（集中管理装置）
４７ 中央処理装置（制御装置）
４９ 主記憶装置（記憶装置）

Claims (3)

1. 細胞の培養状態を計測する複数の計測ユニットと、
   複数の該計測ユニットが接続され、これら複数の計測ユニットの制御を行うためのプログラムを実行する制御装置および前記プログラムの実行に必要な記憶装置を有する集中管理装置とを備え、
   前記制御装置が、複数の前記計測ユニットの接続状態を管理するとともに、接続された前記計測ユニットごとに独立して動作させる前記プログラムの実行単位である子プロセスを前記計測ユニットごとに起動させて各前記計測ユニットを管理する親プロセスを実行し、前記記憶装置において相互に独立した記憶空間を割り当てられた状態で対応する各前記計測ユニットを個別に制御するように起動された各前記子プロセスを実行することで、前記親プロセスが各前記子プロセスと通信して複数の前記計測ユニットを個別に制御する細胞培養モニタリングシステム。
2. 前記制御装置が、複数の前記計測ユニットに対応して起動させた複数の前記子プロセスを互いに処理時間が重複しないよう時間的に分離して実行させる請求項１に記載の細胞培養モニタリングシステム。
3. 前記子プロセスが、撮影位置および撮影条件を調整するとともに、画像取得を実行させ、
   前記親プロセスが、所定の時間間隔で各前記子プロセスを択一的に実行させるとともに、各前記計測ユニットにより取得された画像を解析する請求項１または請求項２に記載の細胞培養モニタリングシステム。
   

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