JP6940185B2

JP6940185B2 - 蛍光タンパク質を発現する遺伝子及び光感作剤を用いた光力学治療用組成物及びこれを用いた光力学治療方法

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Publication number: JP6940185B2
Application number: JP2019559250A
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Inventors: ウチェ，ジン
Original assignee: コアファーマカンパニー，リミテッド
Priority date: 2017-01-16
Filing date: 2018-01-16
Publication date: 2021-09-22
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Description

本発明は、蛍光タンパク質を発現する遺伝子及び光感作剤（ｐｈｏｔｏｓｅｎｓｉｔｉｚｅｒ）を用いた光力学治療用組成物及びこれを用いた光力学治療方法に関し、より具体的に、蛍光タンパク質を発現する遺伝子が導入された癌細胞に光感作剤を処理した後、光源を照射することにより、正常細胞には影響を及ぼすことなく、癌細胞を選択的に死滅させることができる光力学治療用組成物及びこれを用いた光力学治療方法を提供する。

光力学治療（ｐｈｏｔｏｄｙｎａｍｉｃｔｈｅｒａｐｙ）は、光に鋭敏な反応を示す物質である光感作剤（ｐｈｏｔｏｓｅｎｓｉｔｉｚｅｒ）を体内に投与すると、外部から光を照射した場合に、体内の豊富な酸素と外部光による化学反応で一重項酸素（ｓｉｎｇｌｅｔｏｘｙｇｅｎ）または自由ラジカル（ｆｒｅｅｒａｄｉｃａｌ）が生成され、このような一重項酸素または自由ラジカルが各種の病変部位や癌細胞の細胞死滅を誘導して破壊する原理を用いた治療法であって、近年、嘱望される癌治療方法の一つである。

しかし、現在、使用中の光力学治療は、光の透過制限により、体積が大きい腫瘍には用いられておらず、特に、光感作剤の人体内の代謝が遅いことから光毒性の副作用が発見されており、腫瘍内の光感作剤の濃度が低くて効率的な治療効果を奏していない。また、治療以外の長時間体内に累積して副作用を誘発したりもする。従って、腫瘍選択性を高めて副作用を減らし、レーザによる効率的な治療のための新たな光感作剤の開発が要求される。また、光力学治療の腫瘍細胞致死効果は、癌塊内の光の浸透深さと関連するが、組織内の光の影響は、距離に対して幾何級数的に減少する。組織の弱化は、最適な吸収、内因性分子及び薬物発色団自体による散乱によって影響を受ける。皮膚組織の最大透過率は７００〜８００ｎｍの領域にあり、この領域内で最大吸収を示す光感作剤の開発が要求される。６３０ｎｍでの有効な浸透深さは１〜３ｍｍの間であるのに対して、７００〜８５０ｎｍでは最小で６ｍｍの光の浸透が観察された。従って、理想的な光感作剤は、近赤外線領域で強い吸収を示さなければならない。

光力学治療は、バレット食道（Ｂａｒｒｅｔｔ’ｓｅｓｏｐｈａｇｕｓ）、子宮頸部異形成症（ｃｅｒｖｉｃａｌｄｙｓｐｌａｓｉａ）のような悪性になる前の病変だけでなく、頭と首を含む皮膚、膀胱のような悪性部位の治療にも用いられてきた。最近、光力学治療の使用を拡大させ、癌細胞に対する有効性及び特異性を増加させるために、いくつか他の方式の方法が開発された。例えば、ＦＲＥＴ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｒｅｓｏｎａｎｃｅｅｎｅｒｇｙｔｒａｎｓｆｅｒ）及びＢＲＥＴ（ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅｒｅｓｏｎａｎｃｅｅｎｅｒｇｙｔｒａｎｓｆｅｒ）のような共鳴エネルギー伝達メカニズムを用いる方法がある。ＦＲＥＴは、ドナーの発光波長（ｅｍｉｓｓｉｏｎｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ）とレセプターの励起波長（ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ）とがオーバーラップされるときに、２つの発色団の間に起こる現象であって、ドナーから受容体（ｒｅｃｉｐｉｅｎｔ）へエネルギーが移動することになる。ＦＲＥＴを用いた癌治療のための前臨床試験で進展があった。ＢＲＥＴは、生物発光源（ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔｓｏｕｒｃｅ）の代わりに、外部光とドナー発色団を用いる。生物発光は、酵素−基質反応のため、疾患部位にかかわらず、光感作剤の活性化を可能にする。ルシフェリンが放出する光は、細胞内の蛍火がルシフェラーゼと反応して光感作剤を活性化させ、光は、最大９０％程度の腫瘍細胞を破壊させる。Ｈｓｕｅｔａｌでは、ＢＲＥＴ−基盤量子点を光力学治療に必要な光源の代替剤として用いることについて、その可能性を提示している。

よって、本発明者等は、癌細胞に対する有効性及び特異性を増加させた光力学治療方法を開発するために努力した結果、多様な蛍光タンパク質を発現する遺伝子が導入された癌細胞に光感作剤を処理した後、光源を照射して、正常細胞には影響を及ぼすことなく、癌細胞のみを選択的に死滅させることができることを確認して、前記蛍光タンパク質を発現する遺伝子及び光感作剤を有効成分として含有する光力学治療用組成物及びこれを用いた光力学治療方法を開発することにより、本発明を完成した。

本発明の目的は、蛍光タンパク質（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎ）を発現する遺伝子を搭載したウイルスベクター、蛍光タンパク質と結合された抗体、蛍光染料及び蛍光物質を含む組成物からなる群より選ばれたいずれか１つ以上、及び光感作剤（ｐｈｏｔｏｓｅｎｓｉｔｉｚｅｒ）を含有する、光力学治療用組成物、光力学治療方法及び光力学治療用キットを提供することである。

本発明の目的を達成するために、本発明は、蛍光タンパク質（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎ）を発現する遺伝子を搭載したウイルスベクター、蛍光タンパク質と結合された抗体、蛍光染料及び蛍光物質を含む組成物からなる群より選ばれたいずれか１つ以上、及び光感作剤（ｐｈｏｔｏｓｅｎｓｉｔｉｚｅｒ）を含有する、光力学治療用組成物を提供する。

また、本発明は、個体における光力学治療方法であって、前記方法は、前記個体に、蛍光タンパク質（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎ）を発現する遺伝子を搭載したウイルスベクター、蛍光タンパク質と結合された抗体、蛍光染料及び蛍光物質を含む組成物からなる群より選ばれたいずれか１つ以上を導入するステップ；光感作剤を投与するステップ；及び光を照射するステップを含む、光力学治療方法を提供する。

また、本発明は、蛍光タンパク質（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎ）を発現する遺伝子を搭載したウイルスベクター、蛍光タンパク質と結合された抗体、蛍光染料及び蛍光物質を含む組成物からなる群より選ばれたいずれか１つ以上、及び光感作剤を含有する、光力学治療用組成物；及び光源を含む、光力学治療に用いるためのキットを提供する。

また、本発明は、光力学治療用組成物として用いるための、蛍光タンパク質（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎ）を発現する遺伝子を搭載したウイルスベクター、蛍光タンパク質と結合された抗体、蛍光染料及び蛍光物質を含む組成物からなる群より選ばれたいずれか１つ以上、及び光感作剤の用途を提供する。

本発明者等は、癌幹細胞、特にＬｇｒ５＋細胞にローズベンガル（ｒｏｓｅｂｅｎｇａｌ；ＲＢ）を活用した、ｃＦＲＥＴ−基盤ＰＤＴを用いて除去する新規の方法を提供し、Ｌｇｒ５−ＥＧＦＰ−ＩＲＥＳ−ｃｒｅＥＲＴ２ノックイン（ｋｎｏｃｋ−ｉｎ）のマウスを用いてその有効性を立証した。本発明では、Ｌｇｒ５＋細胞の疾患の「シード（ｓｅｅｄ）」及び治療的標的としての役割を究明し、本発明による方法によって、正常なＬｇｒ５＋幹細胞に害を与えることなく、Ｌｇｒ５＋大腸癌幹細胞を除去することができるという点をさらに究明した。

また、本発明者等は、多様な蛍光タンパク質を発現する遺伝子が導入された癌細胞に光感作剤（ｐｈｏｔｏｓｅｎｓｉｔｉｚｅｒ）を処理した後、光源を照射して、正常細胞には影響を及ぼすことなく、癌細胞のみを選択的に死滅させることができることを確認したため、前記蛍光タンパク質を発現する遺伝子及び光感作剤を光力学治療用組成物の有効成分として有用に用いることができるという点を究明した。

ｃＦＲＥＴ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｒｅｓｏｎａｎｃｅｅｎｅｒｇｙｔｒａｎｓｆｅｒ）の実験コンセプトを図示しているものであって、ｅＧＦＰ及びローズベンガル（ＲＢ）の吸光度及び蛍光発光を示している。ｃＦＲＥＴ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｒｅｓｏｎａｎｃｅｅｎｅｒｇｙｔｒａｎｓｆｅｒ）の実験コンセプトを図示しているものであって、ｅＧＦＰ及びローズベンガル（ＲＢ）の吸光度及び蛍光発光を示している。ＲＢ活性化のためにブルーレーザ光を図示しているときに誘導される選択的な細胞死滅を図で示しているものである。レーザの照射後、ｅＧＦＰ−細胞に比べてｅＧＦＰ＋及びｅＧＦＰ−細胞で選択的に細胞死滅が生じる程度を、ＭＴＴ分析に基づいて測定した結果を示しているものであって、Ｃｅ６はクロリンｅ６；ＲＢはローズベンガルを示し、灰色はＧＦＰ−細胞を；緑色はｅＧＦＰ＋細胞を示し、スケールバーは５０μｍである。ｅＧＦＰ−及びｅＧＦＰ＋４Ｔ１細胞の顕微鏡像を示し（上側カラム）；４８８ｎｍレーザ光に露出した後、６時間後にｅＧＦＰ＋細胞に対して選択的に誘導された細胞毒性を示し（中間カラム）；中間カラムにおいて赤い点で表示している領域をズームインした像である（下側カラム）。細胞毒性を、多様な光敏感剤の濃度及び露出時間による濃度勾配ビットマップグラフィックを用いて示しているものであって、左側はｅＧＦＰ−を、右側はｅＧＦＰ＋を示す。ＬＤＨ分析で４種類のｅＧＦＰ＋細胞（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、４Ｔ１、Ｈ４６０及びＢ１６Ｆ１０）の細胞毒性における差を測定したものである。トランスフェクションされたＥＧＦＰ遺伝子の濃度による細胞毒性の変化を測定した結果を示しているものである。＊：Ｐ＜０．０５；＊＊：Ｐ＜０．０１、＊＊＊：Ｐ＜０．００１である。トランスフェクションされたＥＧＦＰ遺伝子の濃度による細胞毒性の変化を測定した結果を示しているものである。＊：Ｐ＜０．０５；＊＊：Ｐ＜０．０１、＊＊＊：Ｐ＜０．００１である。ｅＧＦＰ−細胞移植のマウスモデルでｃＧＲＥＴＰＤＴの実験結果を示しているものであり、移植された腫瘍部位に皮膚をフラップした状態で、腫瘍に４８８ｎｍのレーザ光を照射することを示しているものである。照射前及び照射２ラウンド後のｅＧＦＰ＋細胞の蛍光共焦点顕微鏡像を示しているものである。ｅＧＦＰ＋細胞を示す領域をＩｍａｇｅＪ２．０で分析した結果を示しているものであって（上側カラム：Ｂ１６Ｆ１０、下側カラム：Ｈ４６０）；スケールバーは１００μｍであり、＊＊＊：Ｐ＜０．００１である。その他の処理配合群の間で移植されたＧＦＰ−またはＧＦＰ＋Ｂ１６Ｆ１０の腫瘍の体積をモニタリングした結果を示しているものであって、＊：Ｐ＜０．０５；＊＊：Ｐ＜０．０１。処置後の代表的な分離した腫瘍を示しているものであって、スケールバーは１ｃｍを示す。腫瘍表面下の広い部位で細胞死滅が観察されることを示しているものであって、バックス抗体を死滅細胞部位の免疫染色のために用いており、スケールバーは２００μｍである。カスパーゼ３及びＴＮＦ−αの発現または分泌水準を示しているものであって、免疫組織化学法で測定したものであり、＊：Ｐ＜０．０５；＊＊：Ｐ＜０．０１、＊＊＊：Ｐ＜０．００１、スケールバーは５０μｍである。カスパーゼ３及びＴＮＦ−αの発現または分泌水準を示しているものであって、免疫組織化学法で測定したものであり、＊：Ｐ＜０．０５；＊＊：Ｐ＜０．０１、＊＊＊：Ｐ＜０．００１、スケールバーは５０μｍである。炎症誘導性大腸癌のマウスモデルでｃＦＲＥＴＰＤＴの実験結果を示しているものであり、Ｌｇｒ５−ＥＧＦＰ−ＩＲＥＳ−ｃｒｅＥＲＴ２ノックインのマウスモデルのクリプトにおけるＬｇｒ５＋大腸幹細胞の共焦点像である（スケールバーは５０μｍ）。散発的な大腸腫瘍におけるＬｇｒ５＋ｅＧＦＰ細胞の存在を示しているものである（スケールバーは５０μｍ）。マウスの大腸上皮に光を均一に照射する場合、６００μｍの直径を有するシリンダー型拡散繊維である（上：照射前；下：照射後）。シリンダー型拡散繊維を用いて肛門を経由してマウスの大腸に照射することを示しているものである。多様な条件のＰＤＴ下でポリープ数を測定した結果を示しているものである（ｎｓは、ｎｏｔｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ、＊＊：Ｐ＜０．０１）。大腸ビューシステムを用いて得られた、野生型（上側カラム）及びＬＧＲ５（下側カラム）の大腸の代表的なｉｎｖｉｖｏｂｒｉｇｈｔ−ｆｉｅｌｄの映像である。未処理群及び光のみを照射した群の全て（陰性対照群）で細胞死滅を追跡した結果を示しているものである。ＲＢ投与及び光照射後の周辺のｅＧＦＰ＋細胞領域における特定の死滅シグナルを示しているものである（＊＊：Ｐ＜０．０１；スケールバー：１００μｍ）。Ｃｅ６処理及び６５０ｎｍの赤色光処理時のｅＧＦＰ発現癌細胞及びｎｏｎ−ＧＦＰ癌細胞の間における細胞毒性の測定結果を示しているものであって、２つのグループにおいて差がないという点が分かる。図６はｉｎｖｉｔｒｏでの血液循環システムを示したものである。左の図は血液循環システムを模倣したｉｎｖｉｔｒｏ流体システムとレーザ照射の概要を、右上の図は青色レーザ照射後の死細胞の割合（＊＊＊：Ｐ＜０．００１）を、右下の図は３回までのレーザ照射後のＧＦＰ＋及びＧＦＰ−ＮＣＩ−Ｈ４６０細胞間の細胞死の差を示している。青色及び赤色シグナルはそれぞれＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２及びヨウ化プロピジウムの染色によるものである。ＣＴＣ大腿静脈が照射を受けた後の癌細胞数の測定結果を示している。ＣＴＣターゲット療法の概略である。赤色蛍光タンパク質（Ｒｅｄｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎ；ＲＦＰ）の励起スペクトル及び発光スペクトル、及び光感作剤としてのエチルエチオプルプリンすず（ｔｉｎｅｔｈｙｌｅｔｉｏｐｕｒｐｕｒｉｎ）の吸光度を示しているものである。ＲＦＰ及びエチルエチオプルプリンすずを用いたＦＲＥＴの実験コンセプトを模式化した図を示しているものである。ＲＦＰを導入した乳癌細胞にエチルエチオプルプリンすずを処理し、５８０ｎｍの黄色光の照射時間による細胞死滅をＬＤＨ分析法で確認したものである。ＲＦＰを導入した乳癌細胞にエチルエチオプルプリンすずを処理し、５８０ｎｍの黄色光の照射時間による細胞死滅をＭＴＴ分析法で確認したものである。ＲＦＰを導入した乳癌細胞にエチルエチオプルプリンすずを濃度別に処理し、５８０ｎｍの黄色光の照射時間による細胞死滅をＭＴＴ分析法で確認したものである。ＧＦＰまたはＲＦＰを導入した乳癌細胞に、光感作剤として、Ｃｅ６（Ｃｈｌｏｒｉｎｅ（ｅ６））、ローズベンガル（Ｒｏｓｅｂｅｎｇａｌ）またはエチルエチオプルプリンすずを処理し、６５０ｎｍの赤色光、４８０ｎｍの青色光または５８０ｎｍの黄色光を照射した後、細胞毒性を確認したものである。ＧＦＰを導入した肺癌細胞にローズベンガルを処理し、青色光の照射後、蛍光強度を確認したものである。実際の皮膚環境の条件下で、ＧＦＰまたはＲＦＰが導入された細胞に光感作剤を処理し、光照射した後、細胞死滅の程度を確認するための実験方法を模式化した図を示しているものである。実際の皮膚環境の条件下で、ＧＦＰを導入した乳癌細胞にローズベンガルを処理し、４７３ｎｍの青色光を照射した後、またはＲＦＰを導入した乳癌細胞にエチルエチオプルプリンすずを処理し、５８０ｎｍの黄色光を照射した後、細胞死滅の程度を確認したものである。ＲＦＰが導入された細胞が、５８０ｎｍの黄色光の照射後、エチルエチオプルプリンすずの活性によって選択的な細胞死滅が生じる過程を模式化した図を示しているものである。ＧＦＰ、黄色蛍光タンパク質（Ｙｅｌｌｏｗｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎ；ＹＦＰ）またはＲＦＰが導入された非小細胞肺癌細胞を蛍光共焦点顕微鏡で確認した図を示しているものであって、Ｇは、ＧＦＰが導入された非小細胞肺癌細胞、Ｙは、ＹＦＰが導入された非小細胞肺癌細胞、Ｒは、ＲＦＰが導入された非小細胞肺癌細胞、ＥＶは、ｐｃＤＮＡ３．１ベクターが導入された非小細胞肺癌細胞を示す。ＧＦＰ、ＹＦＰまたはＲＦＰが導入された非小細胞肺癌細胞、または対照群の細胞（ＥＶ）に、光感作剤としてローズベンガルを処理し、４８８ｎｍの青色光を照射した後、細胞死滅の程度を確認したものである。＊＊：ｐ＜０．０１である。ＧＦＰ、ＲＦＰまたはＹＦＰが導入された非小細胞肺癌細胞、または対照群の細胞（ＥＶ）に、光感作剤としてヘマトポルフィリン（Ｈｅｍａｔｏｐｏｒｐｈｙｒｉｎ）を処理し、５７０ｎｍの黄色光を照射した後、細胞死滅の程度を確認したものである。＊＊：ｐ＜０．０１；＊＊＊：ｐ＜０．００１である。ＧＦＰ、ＲＦＰまたはＹＦＰが導入された非小細胞肺癌細胞、または対照群の細胞（ＥＶ）に、光感作剤として５−ＡＬＡ（５−Ａｍｉｎｏｌｅｖｕｌｉｎｉｎｃａｃｉｄｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）を処理し、５７０ｎｍの黄色光を照射した後、細胞死滅の程度を確認したものである。＊＊：ｐ＜０．０１；＊＊＊：ｐ＜０．００１である。

以下、本発明をさらに詳細に説明する。

本発明は、蛍光タンパク質（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎ）を発現する遺伝子を搭載したウイルスベクター、蛍光タンパク質と結合された抗体、蛍光染料及び蛍光物質を含む組成物からなる群より選ばれたいずれか１つ以上、及び光感作剤（ｐｈｏｔｏｓｅｎｓｉｔｉｚｅｒ）を含有する、光力学治療用組成物を提供する。

前記蛍光タンパク質は、緑色蛍光タンパク質（ｇｒｅｅｎｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎ）、赤色蛍光タンパク質（ｒｅｄｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎ）または黄色蛍光タンパク質（ｙｅｌｌｏｗｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎ）であり得る。

前記緑色蛍光タンパク質の場合、具体的に、発光スペクトルの頂点（ｐｅａｋ）は５０８ｎｍであり、励起スペクトルの頂点（ｐｅａｋ）は４８９ｎｍであるが、メーカーによって発光スペクトルの頂点の範囲が一部異なることもあり、いずれも本発明に含まれる。

前記赤色蛍光タンパク質の場合、具体的に、発光スペクトルの頂点は５７０〜６００ｎｍであり、より具体的に、発光スペクトルの頂点は５８４ｎｍであり、励起スペクトルの頂点は５５５ｎｍであるが、メーカーによって発光スペクトルの頂点の範囲が一部異なることもあり、いずれも本発明に含まれる。

前記黄色蛍光タンパク質の場合、具体的に、発光スペクトルの頂点は５２０〜５５０ｎｍであり、より具体的に、発光スペクトルの頂点は５３９ｎｍであり、励起スペクトルの頂点は５２９ｎｍであるが、メーカーによって発光スペクトルの頂点の範囲が一部異なることもあり、いずれも本発明に含まれる。

前記蛍光染料（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｄｙｅ）または蛍光物質（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｓｕｂｓｔａｎｃｅ）は、アクリジンオレンジ（ａｃｒｉｄｉｎｅｏｒａｎｇｅ）、ジアミジノ−２−フェニルインドール（４’，６’−ｄｉａｍｉｄｉｎｅ−２’−ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅ；ＤＡＰＩ）、蛍光性イソチオネート（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）、テトラメチルローダミン（ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｒｈｏｄａｍｉｎｅ；ＴＲＩＣＴ）、ローダミンイソチオチオネート（ｒｈｏｄａｍｉｎｅ−Ｂｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ；ＲＩＴＣ）、フィコエリトリン（ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ；ＰＥ）またはシアニン（ｃｙａｎｉｎ）、例えば、Ｃｙ３またはＣｙ５であり得るが、これに制限されるものではない。

前記光感作剤は、ローズベンガル（ｒｏｓｅｂｅｎｇａｌ）、エチルエチオプルプリンすず（ｔｉｎｅｔｈｙｌｅｔｉｏｐｕｒｐｕｒｉｎ）、ヘマトポルフィリン（ｈｅｍａｔｏｐｏｒｐｈｙｒｉｎ）または５−ＡＬＡ（５−Ａｍｉｎｏｌｅｖｕｌｉｎｉｃａｃｉｄｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）であり得る。

前記ローズベンガルは、５４９ｎｍの最大吸光度スペクトル及び５１０ｎｍのショルダー吸光度スペクトルを有する。緑色蛍光タンパク質の発光波長がローズベンガルのショルダー吸収波長とオーバーラップされる可能性があるため、ＦＲＥＴ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｒｅｓｏｎａｎｃｅｅｎｅｒｇｙｔｒａｎｓｆｅｒ）が生じ得る。

前記エチルエチオプルプリンすずは、光感作剤（ｐｈｏｔｏｓｅｎｓｉｔｉｚｅｒ）であって、「Ｓｎ（ＩＶ）エチオプルプリン（Ｓｎ（ＩＶ）ｅｔｉｏｐｕｒｐｕｒｉｎ）」、「ＳｎＥＴ２」、「フォトポイントＳｎＥＴ２（ＰｈｏｔｏＰｏｉｎｔＳｎＥＴ２）」、「エチオプルプリンすず（ｔｉｎｅｔｉｏｐｕｒｐｕｒｉｎ）」または「ロスタポルフィン（Ｒｏｓｔａｐｏｒｆｉｎ）」とも呼ばれ、６４０ｎｍ〜６６０ｎｍの吸光度スペクトルを有する。赤色蛍光タンパク質の発光波長がエチルエチオプルプリンすずの吸収波長とオーバーラップされる可能性があるため、ＦＲＥＴが生じ得る。

前記ヘマトポルフィリンは、６２０ｎｍ〜６４０ｎｍの吸光度スペクトルを有する。赤色蛍光タンパク質または黄色蛍光タンパク質の発光波長がヘマトポルフィリンの吸収波長とオーバーラップされる可能性があるため、ＦＲＥＴが生じ得る。

前記５−ＡＬＡは、３５０〜６４０ｎｍ、より具体的に６１０〜６４０ｎｍの吸光度スペクトルを有する。赤色蛍光タンパク質または黄色蛍光タンパク質の発光波長がヘマトポルフィリンの吸収波長とオーバーラップされる可能性があるため、ＦＲＥＴが生じ得る。

本発明による、緑色蛍光タンパク質−ローズベンガル、赤色蛍光タンパク質−エチルエチオプルプリンすず、赤色蛍光タンパク質−ヘマトポルフィリン、赤色蛍光タンパク質−５−ＡＬＡ、黄色蛍光タンパク質−ローズベンガル、黄色蛍光タンパク質−ヘマトポルフィリン、または黄色蛍光タンパク質−５−ＡＬＡの組み合わせによる光力学治療の際に、細胞蛍光共鳴エネルギー伝達（ｃｅｌｌｕｌａｒｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｒｅｓｏｎａｎｃｅｅｎｅｒｇｙｔｒａｎｓｆｅｒ）によって光力学治療が可能になる。

前記組成物は、緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質または黄色蛍光タンパク質を発現する遺伝子が導入された細胞、または蛍光タンパク質と結合された抗体、蛍光染料及び蛍光物質を含む組成物で標識された細胞を標的化して選択的に除去することができ、具体的に、緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質または黄色蛍光タンパク質を発現する遺伝子が導入、または蛍光タンパク質と結合された抗体、蛍光染料及び蛍光物質を含む組成物で標識された癌細胞、循環腫瘍細胞（ｃｉｒｃｕｌａｒｔｕｍｏｒｃｅｌｌ）、免疫細胞または脂肪細胞を標的化して選択的に除去することができ、より具体的に、Ｌｇｒ５陽性癌幹細胞、乳癌細胞または肺癌細胞を標的化して選択的に除去することができるが、これに限定されるものではない。

前記組成物は、癌組織に選択的に蓄積され、レーザの照射によって一重項酸素または自由ラジカルの生成が可能になる。より具体的に、光に鋭敏な反応を示す物質である光感作剤を体内に投与すると、外部から光を照射した場合に、体内の豊富な酸素と外部光による化学反応で一重項酸素（ｓｉｎｇｌｅｔｏｘｙｇｅｎ）または自由ラジカル（ｆｒｅｅｒａｄｉｃａｌ）が生成されるが、本発明は、このような一重項酸素または自由ラジカルが各種の病変部位や癌細胞の細胞死滅を誘導して破壊する原理を用いた治療法である。

前記癌は、大腸腺腫、大腸癌、直腸癌、肛門癌、小腸癌、乳癌、肺癌、胃癌、肝臓癌、血液癌、慢性または急性白血病、骨髄癌、リンパ球リンパ腫、骨癌、膵臓癌、皮膚癌、頭頸部癌、皮膚黒色腫、眼球黒色腫、子宮肉腫、卵巣癌、卵管癌、子宮内膜癌、子宮頸部癌、内分泌癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、腎癌、軟組織腫瘍、尿道癌、前立腺癌、気管支癌、バレット食道（Ｂａｒｒｅｔｔ’ｓｅｓｏｐｈａｇｕｓ）、子宮頸部異形成症（ｃｅｒｖｉｃａｌｄｙｓｐｌａｓｉａ）、腎癌及び輸尿管癌から構成されたグループより選ばれ得、より具体的に、乳癌または肺癌であり得るが、これに限定されるものではない。

前記光力学治療用組成物は、緑色蛍光タンパク質を発現する遺伝子が導入された細胞にローズベンガルを処理し、ここに４７０〜４９０ｎｍの青色光を照射する場合、癌細胞が選択的に死滅するメカニズムによって癌疾患の治療が可能である。また、４７０ｎｍ未満の青色光を照射する場合、細胞内で緑色蛍光タンパク質が光反応をすることができないこともあり、４９０ｎｍを超えた青色光を照射する場合、緑色蛍光タンパク質が導入された癌細胞の周辺の正常細胞にも影響を及ぼして細胞死滅を誘発することができる。

また、赤色蛍光タンパク質を発現する遺伝子が導入された細胞にエチルエチオプルプリンすず、ヘマトポルフィリンまたは５−ＡＬＡを処理し、ここに５６５〜５９０ｎｍの黄色光を２秒以上照射する場合、癌細胞が選択的に死滅するメカニズムによって癌疾患の治療が可能である。また、５６５ｎｍ未満の黄色光を照射する場合、細胞内で赤色蛍光タンパク質が光反応をすることができないこともあり、５９０ｎｍを超えた黄色光を照射する場合、赤色蛍光タンパク質が導入された癌細胞の周辺の正常細胞にも影響を及ぼして細胞死滅を誘発することができる。また、２秒未満で光照射を行う場合、細胞内で赤色蛍光タンパク質が光反応をすることができないこともある。

また、黄色蛍光タンパク質を発現する遺伝子が導入された細胞にローズベンガルを処理し、ここに４７０〜４９０ｎｍの青色光を照射するか、または黄色蛍光タンパク質を発現する遺伝子が導入された細胞にヘマトポルフィリンまたは５−ＡＬＡを処理し、ここに５６５〜５９０ｎｍの黄色光を照射する場合、癌細胞が選択的に死滅するメカニズムによって癌疾患の治療が可能である。

前記組成物を用いて、生体内または生体外で光活性化され得、より具体的に生体外で光活性化され得る。

本発明の具体的な実施例において、本発明者等は、緑色蛍光タンパク質が導入されたＬｇｒ５陽性癌幹細胞または肺癌細胞に、光感作剤としてローズベンガルを処理した後、青色光を照射して、正常細胞には影響を及ぼすことなく、細胞のみを選択的に死滅させることができることを確認した。

また、本発明者等は、赤色蛍光タンパク質が導入された乳癌細胞または肺癌細胞に、光感作剤としてエチルエチオプルプリンすず、ヘマトポルフィリンまたは５−ＡＬＡを処理した後、黄色光を照射して、正常細胞には影響を及ぼすことなく、癌細胞のみを選択的に死滅させることができることを確認した。

さらに、本発明者等は、黄色蛍光タンパク質が導入された肺癌細胞に、光感作剤としてローズベンガルを処理した後に青色光を照射するか、またはヘマトポルフィリンまたは５−ＡＬＡを処理した後に黄色光を照射して、正常細胞には影響を及ぼすことなく、癌細胞のみを選択的に死滅させることができることを確認した。

従って、本発明者等は、多様な蛍光タンパク質が導入された癌細胞に光感作剤を処理した後、光源を照射して、正常細胞には影響を及ぼすことなく、癌細胞のみを選択的に死滅させることができることを確認したため、前記蛍光タンパク質を発現する遺伝子及び光感作剤を光力学治療用組成物の有効成分として有用に用いることができる。

また、本発明は、
個体における光力学治療方法であって、
前記方法は、前記個体に、蛍光タンパク質（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎ）を発現する遺伝子を搭載したウイルスベクター、蛍光タンパク質と結合された抗体、蛍光染料及び蛍光物質を含む組成物からなる群より選ばれたいずれか１つ以上を導入するステップ；
光感作剤を投与するステップ；及び
光を照射するステップを含む、光力学治療方法を提供する。

前記蛍光タンパク質は、緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質または黄色蛍光タンパク質であり得、前記光感作剤は、ローズベンガル、エチルエチオプルプリンすず、ヘマトポルフィリンまたは５−ＡＬＡであり得る。

前記光は、４７０〜４９０ｎｍの青色光、または５６５〜５９０ｎｍの黄色光であり得る。

具体的に、前記光力学治療方法は、緑色蛍光タンパク質を発現する遺伝子が導入された細胞にローズベンガルを処理し、ここに４７０〜４９０ｎｍの青色光を照射する場合、細胞が選択的に死滅するメカニズムによって光力学治療が可能である。

また、赤色蛍光タンパク質を発現する遺伝子が導入された細胞にエチルエチオプルプリンすず、ヘマトポルフィリンまたは５−ＡＬＡを処理し、ここに５６５〜５９０ｎｍの黄色光を照射する場合、細胞が選択的に死滅するメカニズムによって光力学治療が可能である。

また、黄色蛍光タンパク質を発現する遺伝子が導入された細胞にローズベンガルを処理し、ここに４７０〜４９０ｎｍの青色光を照射するか、または黄色蛍光タンパク質を発現する遺伝子が導入された細胞にヘマトポルフィリンまたは５−ＡＬＡを処理し、ここに５６５〜５９０ｎｍの黄色光を照射する場合、細胞が選択的に死滅するメカニズムによって光力学治療が可能である。

前記個体は、癌を保有している個体、例えば、癌幹細胞によって特徴付けられる癌を保有しているヒト、またはヒトを除く個体であり得る。

本発明において、用語の「ヒトを除く個体」は、本発明による光力学治療用組成物の投与によって症状が好転することができる、ヒトのみを除く、豚、牛、馬、羊、ヤギ、犬などの動物を意味し、具体的に、癌を保有しているヒトのみを除く動物を意味する。本発明による光力学治療方法で癌疾患を効果的に治療することができる。

本発明の治療方法は、血液透析方法を用いて個体の血液中の癌細胞を死滅させることができ、本発明による光力学治療用組成物が投与された個体の血液を体外へ排出させた後、ここに光源を照射することにより、癌細胞をより効果的に死滅させることができる。ここで、血液透析とは、個体の血液を機械に連結された透析機械に通して特殊なフィルターで水分及び老廃物をろ過した後、血液を再度患者の体内に注入する治療方法をいう。

一方、胃、小腸、大腸などに腫瘍または癌が存在する場合、本発明による光力学治療用組成物が処理された状態で、内視鏡形の光源を照射することのできる装置を入れて光源を照射することにより、癌細胞をより効果的に死滅させることができる。しかし、前記部位に限定されるものではなく、上記のような方法が適用され得る全ての癌疾患部位に適用され得ることは、上記の記載内容からこの技術分野における通常の技術者にとって自明であろう。

本発明者等は、多様な蛍光タンパク質が導入された癌細胞に光感作剤を処理した後、光源を照射して、正常細胞には影響を及ぼすことなく、癌細胞のみを選択的に死滅させることができることを確認したため、前記蛍光タンパク質を発現する遺伝子及び光感作剤を光力学治療に有用に用いることができる。

また、本発明は、蛍光タンパク質（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎ）を発現する遺伝子を搭載したウイルスベクター、蛍光タンパク質と結合された抗体、蛍光染料及び蛍光物質を含む組成物からなる群より選ばれたいずれか１つ以上、及び光感作剤を含有する光力学治療用組成物；及び
光源を含む、
光力学治療に用いるためのキットを提供する。

前記蛍光タンパク質、蛍光染料、蛍光物質、光感作剤及び光源については、前記光力学治療用組成物についての説明と同一であるところ、具体的な説明は、上記の内容を援用し、以下においては、キットの特有な構成についてのみ説明することとする。

前記キットは、癌治療用キットであり得、前記癌は、大腸腺腫、大腸癌、直腸癌、肛門癌、小腸癌、乳癌、肺癌、胃癌、肝臓癌、血液癌、慢性または急性白血病、骨髄癌、リンパ球リンパ腫、骨癌、膵臓癌、皮膚癌、頭頸部癌、皮膚黒色腫、眼球黒色腫、子宮肉腫、卵巣癌、卵管癌、子宮内膜癌、子宮頸部癌、内分泌癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、腎癌、軟組織腫瘍、尿道癌、前立腺癌、気管支癌、バレット食道、子宮頸部異形成症、腎癌及び輸尿管癌から構成されたグループより選ばれ得、より具体的に乳癌または肺癌であり得るが、これに限定されるものではない。

本発明者等は、多様な蛍光タンパク質が導入された癌細胞に光感作剤を処理した後、光源を照射して、正常細胞には影響を及ぼすことなく、癌細胞のみを選択的に死滅させることができることを確認したため、前記蛍光タンパク質を発現する遺伝子及び光感作剤を、光力学治療に用いるためのキットの有効成分として有用に用いることができる。

さらに、本発明は、光力学治療用組成物として用いるための、蛍光タンパク質（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎ）を発現する遺伝子を搭載したウイルスベクター、蛍光タンパク質と結合された抗体、蛍光染料及び蛍光物質を含む組成物からなる群より選ばれたいずれか１つ以上、及び光感作剤の用途を提供する。

前記蛍光タンパク質、光感作剤については、前記光力学治療用組成物についての説明と同一であるところ、具体的な説明は、上記の内容を援用する。

以下、本発明について、実施例及び実験例を通じてさらに詳細に説明する。下記の実施例及び実験例は、本発明の理解を助けるためのものであって、本発明の権利範囲がこれに限定されることを意図しない。

１−１．細胞の培養
Ｂ１６−Ｆ１０（Ｍｕｓｍｕｓｃｕｌｕｓｓｋｉｎｍｅｌａｎｏｍａ）、ＮＣＩ−Ｈ４６０（ｈｕｍａｎｎｏｎ−ｓｍａｌｌｃｅｌｌｌｕｎｇｃａｎｃｅｒｃｅｌｌｓ）、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（ｍｅｔａｓｔａｔｉｃｈｕｍａｎｂｒｅａｓｔｃａｎｃｅｒｃｅｌｌｌｉｎｅ）、４Ｔ１（Ｍｕｓｍｕｓｃｕｌｕｓｍａｍｍａｒｙｂｒｅａｓｔｃａｎｃｅｒ）及びＡ５４９（ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍｉｃｈｕｍａｎａｌｖｅｏｌａｒｂａｓａｌｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌ）の細胞株を韓国細胞株銀行（ＫｏｒｅａｎＣｅｌｌＬｉｎｅＢａｎｋ）から購入した。Ｂ１６Ｆ１０細胞は、ダルベッコ修正イーグル培地（Ｈｙｃｌｏｎｅ）に置き；他の細胞は、ＲＰＭＩ（ＲｏｓｗｅｌｌＰａｒｋＭｅｍｏｒｉａｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅ）−１６４０の培地に１０％ＦＢＳを添加した培地で、３７℃、５％ＣＯ２を含有する加湿条件（ｈｕｍｉｄｉｆｉｅｄａｔｍｏｓｐｈｅｒｅ）で培養した。

１−２．緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）−及びＧＦＰ＋細胞の製造
細胞の形質転換及び安定化細胞株（ｓｔａｂｌｅｃｅｌｌｌｉｎｅ）のスクリーニング方法
リポフェクタミン２０００反応剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて一時的な形質転換（ｔｒａｎｓｉｅｎｔｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎｓ）を行った。細胞を、１０％ＦＢＳ及び抗生剤を含有するＲＰＭＩ培養液（Ｇｉｂｃｏ）で、３７℃、５％ＣＯ２の条件で培養した。細胞成長率を倒立顕微鏡（ｉｎｖｅｒｔｅｄｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）で観察した。コンフルエンスが８５％に達したときに、細胞を６ウェルプレートにプレーティングし、ウェル当たり２μｇｐＥＧＦＰ−１（ｃｌｏｎｔｅｃｔ、＃６０８６−１）プラスミドを添加した［プラスミド（μｇ）：リポフェクタミン２０００（μｌ）＝１：３］。形質転換から２４時間後、細胞を０．２５％トリプシンで消化させ、培養液を０．６ｍｇ／ｍｌＧ４１８及び１０％ＦＢＳを含有するＲＰＭＩ培地でさらに培養するためにプレートに移した後、１０日間培養した。

抵抗力のある細胞クローンの量を観察するときに、０．２５％トリプシンで消化させ、その後、追加の培養のためにエイセプティックピペットを用いて新たな培養フラスコに移し、これらは、ＧＦＰ−クローン及びＧＦＰ＋クローンである。類似した成長率及び腫瘍の成長に基づいて、ＧＦＰ−及びＧＦＰ＋細胞を選別した。

１−３．赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）−及びＲＦＰ＋４Ｔ１細胞の製造
光力学治療（ｐｈｏｔｏｄｙｎａｍｉｃｔｈｅｒａｐｙ）に赤色蛍光タンパク質（ｒｅｄｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎ；ＲＦＰ）を用いることができるのかを確認するために、ＲＦＰが導入された乳癌細胞を作製した。

具体的に、前記１−１．に記載された方法と同一の方法で、マウスの乳癌細胞株である４Ｔ１細胞株にｐＣＭＶＲＦＰＣ−ＨＡベクター（Ｔｈｅｒｍｏ、８２０２５）プラスミドを添加し、培養して、ＲＦＰ−及びＲＦＰ＋４Ｔ１細胞を選別した。

１−４．ＧＦＰ＋、ＲＦＰ＋及び黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）＋Ａ５４９細胞の製造
ＧＦＰ＋、ＲＦＰ＋またはＹＦＰ＋細胞で光源及び光感作剤による光力学治療活性を確認するために、ＧＦＰ、ＲＦＰまたはＹＦＰが導入された非小細胞肺癌細胞を作製した。

具体的に、前記１−１．に記載された方法と同一の方法で、ヒトの非小細胞肺癌細胞株であるＡ５４９細胞株にｐｃＤＮＡ３−ＧＦＰＡｄｄｇｅｎｅＰｌａｓｍｉｄ＃７４１６５、ｐｃＤＮＡ３．２ＹＦＰＡｄｄｇｅｎｅＰｌａｓｍｉｄ＃８４９１０、またはｐｃｍＣｈｅｒｒｙ３．１（−）ＡｄｄｇｅｎｅＰｌａｓｍｉｄ＃６２８０３を添加し、培養して、ＧＦＰ＋Ａ５４９、ＲＦＰ＋Ａ５４９及びＹＦＰ＋Ａ５４９細胞を選別した。

２−１．ＧＦＰ＋及びＧＦＰ−細胞とローズベンガルを用いて、光照射後、ＩｎｖｉｔｒｏＰＤＴ実験
青色光の照射後、ＧＦＰ−及びＧＦＰ＋細胞の光破壊を、ローズベンガル（ＲＢ）の存在または不存在の条件でＭＴＴ分析によって測定した。具体的な実験過程は、次のとおりである。

ＲＢを、１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭで希釈して、６．２５、１２．５、２５、５０及び１００μＭの濃度のＲＢを製造した。ＧＦＰ−及びＧＦＰ＋細胞を、９６ウェル、ブラック及びクリアな底プレートでウェル当たり２×１０^４の細胞の密度で前培養した。細胞をＲＢと共に４時間で培養した。ウェルに光敏感剤のないフレッシュな培養培地を添加したものを未処理対照群とした。細胞をＰＢＳ緩衝液で３回洗浄した。

ＰＤＴ処理群の場合、細胞にブルーレーザ光（４７３ｎｍ；放射線量比率＝８０ｍＷ／ｃｍ^２）を１〜６０秒間照射した。純粋なＲＢのＧＦＰ＋及びＧＦＰ−細胞に対する毒性を暗室で測定した。照射後、フレッシュな培養培地をウェルに添加し、細胞を再度２４時間で培養した。その後、培地をＭＴＴ分析で測定した。１５０μＬの可溶化溶液及びストップ溶液を添加し、３７℃で４時間培養した。反応溶液の吸光度を５７０ｎｍで測定した。細胞の生存能力を次の式で計算した：
（ＯＤ_{ｔｒｅａｔｅｄ}／ＯＤ_{ｃｏｎｔｒｏｌ}）×１００％

各実験は、独立して行われた。細胞死滅は、ＬＤＨ分析で測定した。

細胞を２４ウェルプレートにウェル当たり５×１０^４の密度でシーディングし、光敏感剤で処理した後、青色光を前述したように照射した。培地をそれぞれ準備した。ＬＤＨ分析用としては、ＬＤＨ細胞毒成分析キット（ＬＤＨＣｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙＡｓｓａｙｋｉｔ、ＣａｙｍａｎＣｈｅｍｉｃａｌＣｏｍｐａｎｙ，ＡｎｎＡｒｂｏｒ，ＭＩ，ＵＳＡ）をメーカーのプロトコルに従って用いた。培養された細胞の上澄液１００μＬを、ウェルから新たなプレートの対応するウェルへ移動させた後、１００μＬの反応溶液を各ウェルに添加した。プレートを室温で３０分間オービタルシェーカーでジェントルにシェーキングしながら培養した。マイクロプレートリーダーを用いて４９０ｎｍで吸光度を測定した。

２−２．ＲＦＰ＋及びＲＦＰ−細胞とエチルエチオプルプリンすずを用いて、時間別の光照射後、ＩｎｖｉｔｒｏＰＤＴ実験
黄色光を時間別に照射後、ＲＦＰ＋及びＲＦＰ−細胞の光破壊をエチルエチオプルプリンすず（Ｔｉｎｅｔｈｙｌｅｔｉｏｐｕｒｐｕｒｉｎ）存在の条件でＭＴＴ分析によって測定した。具体的な実験過程は、次のとおりである。

具体的に、エチルエチオプルプリンすず（ＭｉｒａｖａｎｔＭｅｄｉｃａｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙＩｎｃ，ＵＳＡ）を、１０％ＦＢＳが含まれているＲＰＭＩ−１６４０培地で希釈して、１μＭの濃度のエチルエチオプルプリンすずを製造した。また、前記１−３．で選別したＲＦＰ−またはＲＦＰ＋４Ｔ１細胞を、２４ウェルプレートにウェル当たり５×１０^４の細胞の密度で前培養した。その後、前記前培養した細胞をエチルエチオプルプリンすずと共に４時間で培養した。４時間後、細胞をＰＢＳ緩衝液で３回洗浄し、黄色のレーザ光（５７０ｎｍ；放射線量比率＝２Ｊ／ｃｍ^２）を０、５及び１０秒間照射した。その後、ＬＤＨＣｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙＡｓｓａｙｋｉｔ（ＣａｙｍａｎＣｈｅｍｉｃａｌＣｏｍｐａｎｙ，ＵＳＡ）を用いて、メーカーの手続きに従ってＬＤＨ分析を行った。培養された細胞の上澄液１００μｌを、ウェルから新たなプレートの対応するウェルへ移動させた後、１００μｌの反応溶液を各ウェルに添加した。プレートを室温で３０分間オービタルシェーカーでジェントルにシェーキングしながら培養した。マイクロプレートリーダーを用いて４９０ｎｍで吸光度を測定した。

また、上記と同一の方法で、前記１−３．で選別したＲＦＰ−またはＲＦＰ＋４Ｔ１細胞に、黄色のレーザ光（５７０ｎｍ；放射線量比率＝２Ｊ／ｃｍ^２）を０、１、２、５、７または１０秒間照射した後、ＭＴＴ分析を行った。ＭＴＴ分析のために、前記照射済みの細胞に、フレッシュな培養培地をウェルに添加し、細胞を再度２４時間で培養した。その後、ＭＴＴＡｓｓａｙｋｉｔを用いて、メーカーの手続きに従ってＭＴＴ分析を行った。１５０μｌの可溶化溶液及びストップ溶液を添加し、３７℃で４時間培養した。反応溶液の吸光度を５７０ｎｍで測定した。細胞の生存能力を次の式で計算した：
（ＯＤ_{ｔｒｅａｔｅｄ}／ＯＤ_{ｃｏｎｔｒｏｌ}）×１００％

２−３．ＲＦＰ＋及びＲＦＰ−細胞と濃度別のエチルエチオプルプリンすずを用いて、光照射後、ＩｎｖｉｔｒｏＰＤＴ実験
黄色光を照射後、ＲＦＰ＋及びＲＦＰ−細胞の光破壊を、エチルエチオプルプリンすず（Ｔｉｎｅｔｈｙｌｅｔｉｏｐｕｒｐｕｒｉｎ）の濃度別の条件で、ＭＴＴ分析によって測定した。具体的な実験過程は、次のとおりである。

具体的に、上記に記載された方法と同一の方法で、エチルエチオプルプリンすずを０、０．５、１及び２μＭの濃度で製造した。その後、前記１−３．で選別したＲＦＰ−またはＲＦＰ＋４Ｔ１細胞と共に４時間で培養し、黄色のレーザ光（５７０ｎｍ；放射線量比率＝２Ｊ／ｃｍ^２）を５秒間照射した後、ＭＴＴ分析を行った。

２−４．ＧＦＰ＋細胞及びＲＦＰ＋細胞と光感作剤を用いて、光照射後、ＩｎｖｉｔｒｏＰＤＴ実験
赤色光、青色光または黄色光の照射後、ＲＦＰ＋またはＧＦＰ＋細胞の細胞毒性を、光感作剤として、Ｃｅ６（Ｃｈｌｏｒｉｎｅ（ｅ６））、ローズベンガルまたはエチルエチオプルプリンすずの存在下で、ＭＴＴ分析によって測定した。具体的な実験過程は、次のとおりである。

具体的に、光感作剤として、Ｃｅ６（ｓａｎｔａｃｒｕｚ、ｓｃ−２６３０６７）、ローズベンガル（ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ、３３００００−５Ｇ）またはエチルエチオプルプリンすずを、１０％ＦＢＳが含まれているＲＰＭＩ−１６４０培地で希釈して、１μＭの濃度で製造した。また、前記１−３．で選別したＲＦＰ＋４Ｔ１細胞及び前記１−４．で選別したＧＦＰ＋４Ｔ１細胞を、９６ウェル、ブラック、及びクリアな底プレートでウェル当たり２×１０^４の細胞の密度で前培養した。その後、前記前培養した細胞をＣｅ６、ローズベンガルまたはエチルエチオプルプリンすずと共に４時間で培養した。ＲＦＰまたはＧＦＰが導入されていない４Ｔ１細胞を対照群とした。４時間後、細胞をＰＢＳ緩衝液で３回洗浄し、赤色のレーザ光（６５０ｎｍ；放射線量比率＝２Ｊ／ｃｍ^２）、青色のレーザ光（４８８ｎｍ；放射線量比率＝２Ｊ／ｃｍ^２）または黄色のレーザ光（５７０ｎｍ；放射線量比率＝２Ｊ／ｃｍ^２）を５秒間照射した。照射後、フレッシュな培養培地をウェルに添加し、細胞を再度２４時間で培養した。その後、ＭＴＴ分析を行った。

２−５．ＧＦＰ＋細胞、ＲＦＰ＋細胞及びＹＦＰ＋細胞と光感作剤を用いて、光照射後、ＩｎｖｉｔｒｏＰＤＴ実験
ＧＦＰ＋細胞、ＲＦＰ＋細胞、ＹＦＰ＋細胞で光感作剤による光破壊をＭＴＴ分析によって測定した。具体的な実験過程は、次のとおりである。

具体的に、ＧＦＰ＋細胞、ＲＦＰ＋細胞、ＹＦＰ＋細胞で光感作剤による光破壊を調べるために、光感作剤として、ローズベンガル、ヘマトポルフィリン（ｈｅｍａｔｏｐｏｒｐｈｙｒｉｎ、Ｓｉｇｍａ−ａｌｄｒｉｃｈ＃５５１８）または５−ＡＬＡ（５−Ａｍｉｎｏｌｅｖｕｌｉｎｉｃａｃｉｄｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｃｈ、Ｓｉｇｍａ−ａｌｄｒｉｃｈ＃Ａ３７８５）を、１０％ＦＢＳが含まれているＲＰＭＩ培地で希釈して、１μＭの濃度で製造した。また、前記１−４．で選別したＧＦＰ＋Ａ５４９細胞、ＲＦＰ＋Ａ５４９細胞及びＹＦＰ＋Ａ５４９細胞を、９６ウェル、ブラック、及びクリアな底プレートでウェル当たり５×１０^３の細胞の密度で前培養した。対照群として、ｐｃＤＮＡ３．１ベクターを導入したＡ５４９細胞を培養した。その後、前記前培養した細胞に、前記前培養した細胞に、前記製造した光感作剤のそれぞれを処理または無処理し、４時間で培養した。４時間後、細胞をＰＢＳ緩衝液で３回洗浄し、青色のレーザ光（４８８ｎｍ；放射線量比率＝２Ｊ／ｃｍ２）または黄色のレーザ光（５７０ｎｍ；放射線量比率＝２Ｊ／ｃｍ^２）を５秒間照射または非照射した。照射または非照射後、フレッシュな培養培地をウェルに添加し、細胞を再度２４時間で培養した。その後、ＭＴＴ分析を行った。

３．腫瘍移植された動物試験
１６Ｆ１０及びＧＦＰ−Ｂ１６−Ｆ０メラノーマ細胞を、細胞リフターを用いて得て、血清フリーＤＭＥＭに再懸濁した。約２×１０^６／１００μＬのＢ１６Ｆ１０及びＧＦＰ−Ｂ１６−Ｆ０メラノーマ細胞を雌性のＣ５７ＢＬ／６マウスの両脇腹に皮下注射した。１０〜１５日後、平均腫瘍直径が少なくとも０．３ｃｍに達したときに、直径に基づいてマウスを４グループに分けた。その後、このマウスをランダムに４グループに分けた（グループ当たり、ｎ＝５）。対照群の動物には、化学物質の代わりに０．９％生理食塩水のみを与えた。

実験群には、１週間に２回、ＲＢ（３６３ｍｇ／ｍＬ、５３ｎＭ／ｍＬ）を静脈内に投与した後、注射から４時間後、青色光（２ｍｉｎ）を腫瘍部位に照射した。１週間に２回、マウスの体重（ｂｏｄｙｗｅｉｇｈｔ）及び腫瘍の体積を測定した。３週間後、マウスを安楽死させ、腫瘍を除去して１０％中性緩衝ホルマリンに固定した。翌日、映像をキャプチャーした。ＧＦＰ＋及びＧＦＰ− Ｈ４６０細胞についても、類似した過程の実験を行った。約２×１０^６／１００μＬの細胞を両脇腹に皮下注射した。

４．Ｃ−ＦＲＥＴＰＤＴ処理されたＧＦＰ−Ｌｇｒ５マウスのポリープスｉｎｖｉｔｒｏイメージング
散発的な腫瘍（ｓｐｏｒａｄｉｃｔｕｍｏｕｒｓ）を生成させるために、アゾキシメタン（１０ｍｇ／ｋｇ）を野生型マウスまたはＧＦＰ−Ｌｇｒ５マウスに腹腔内注射した。注射から１週間後、マウスに飲用水として２％ＤＳＳを７日間与え、その後の７日間は、正常に水を与えた。このようなＤＳＳ適用サイクルを、３回繰り返した。マウスを４グループにランダムに分けた（グループ当たり、ｎ＝５）。

野生型及びＧＦＰ−Ｌｇｒ５マウスの各５匹のさらに他のグループは、化学処理を行っていないグループとした。７週間、１週間に２回、各実験群の野生型及びＧＦＰ−Ｌｇｒ５マウスにＲＢを静脈内注射し（５０ｎＭ／ｍＬ、０．７５ｍｌ／ｋｇ）、ＲＢ注射後、４時間後に青色光（２ｍｉｎ）を肛門挿入で照射した。

ポリープ（ｐｏｌｙｐ）の成長を、ポリープの直径を測定することにより、内視鏡でモニタリングした。麻酔後、マウスを大腸内視鏡検査のためにステージに位置させた。曲がりにくい真っ直ぐな望遠鏡を有する内視鏡（ＣｏｌｏＶｉｅｗ；ＫａｒｌＳｔｏｒｔｚ，Ｉｎｃ．）を用いた。これは、ゼノンランプの光源強度をチューニングするための繊維化チューブ（ｆｉｂｒｏｔｉｃｔｕｂｅｓ）及びスイッチを有している（ＸＥＮＯＮｎｏｖａ１７５；ＫａｒｌＳｔｏｒｔｚ，Ｉｎｃ．）。コーディネートに基づいて、大腸内視鏡（ｏｕｔｅｒｄｉａｍｅｔｅｒ、１．９ｍｍ）を肛門に通して入れた。大腸壁のコラプスを防ぎ、鮮明なビューを担保するために、大腸にエアポンプを用いて注意深く吹き込んだ。高解像度の３チップカメラを用いてビデオを得て、これをコンピュータに保存した。フレーム抽出ソフトウェアを用いて、録画されたビデオファイルからキャプチャーして、各映像を得た。映像から腫瘍のサイズを測定した（幅×高さ×２）。大腸内視鏡の距離依存性倍率（ｄｉｓｔａｎｃｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｍａｇｎｉｆｉｃａｔｉｏｎ）は、同一のフィールドでルーラーを用いてイメージングすることにより計算した。

ＦＲ−ＰＤＴ前後の腫瘍の大きさを比較するために、よく分離した腫瘍を選択し、腹腔鏡検査で用いられるロコモーションパス（ｌｏｃｏｍｏｔｉｏｎｐａｔｈ）を各腫瘍について詳細に録画した。腫瘍位置は、取り囲む組織の構造に基づいて決定し、これを以前の映像と比較した。腫瘍像に焦点を合わせた後、本発明者は、腫瘍の大きさを計算するために、同一のフィールドでルーラー像に焦点を合わせた。

５．ｉｎｖｉｖｏ細胞死滅の視角化
生きている動物で細胞死滅を測定するために、動物の体重による容量で、ＦＬＩＶＯＴＭプローブを、１％ＤＭＳＯを含有するＰＢＳで希釈した。蛍光レッドプローブＦＬＩＶＯＴＭ（ＩｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓＬＬＣ，ＡｂＣｙｓＳＡ，Ｐａｒｉｓ，Ｆｒａｎｃｅ）を野生型及びＧＦＰ−Ｌｇｒ５マウスに静脈内注射した。マウスを１時間後に安楽死させた後、大腸組織を分離した。ＦＬＩＶＯＴＭからの蛍光シグナルを共焦点顕微鏡を用いて映像化した。

６．ＰＤＴのために大腸癌細胞にレーザを照射
大腸癌細胞に均一にレーザを照射するために、オーダーメイドのシリンダー型拡散繊維（ｃｕｓｔｏｍ−ｍａｄｅｃｙｌｉｎｄｒｉｃａｌｄｉｆｆｕｓｅｆｉｂｒｅ）を用いた（ＳＯＭＴＡ，Ｌｔｄ．）。光学繊維のコアを介して拡散される光を拡散パートに放射状に照射し（３６０°）、ここで、前記光は多数方式（ｍｕｌｔｉｔｕｄｉｎｏｕｓｍａｎｎｅｒ）で散在された。

シリンダー型拡散繊維は、曲げることができるものであって、ディフューザーの直径及び長さはそれぞれ６００μｍ及び２ｃｍであった。拡散繊維をマウスのコロンに肛門を通して注意して挿入した後、４７３ｎｍの青色光を光学ウェーブガイドを介して照射し、放射状に均一に照射されるようにした。ユニットエリア（ｍＷ／ｍｍ２）における拡散パートの放射電力（ｒａｄｉａｔｉｏｎｐｏｗｅｒ）は、２２及び２５ｍＷの間に調整した。繊維伝達損失は、短い長さの繊維を用いた（５ｍ）ため、無視できる水準であった。

７．ペリスタルティックポンプを用いた実験
（１）ｎｏｎ−ＧＦＰとＧＦＰ細胞を１００ｍｍのディッシュにそれぞれ１×１０^７の細胞となるようにシーディングした。翌日、１００μＭとなるようにローズベンガル（ＲＢ、ｓａｎｔａｃｒｕｚ、ｓｃ−２０３７５７）を処理した（この後の過程は、光を最大限避けて実験を行わなければならない）。暗室でＥＰ−１エコノポンプ（Ｂｉｏ−ｒａｄ、７３１−９００１）に４ｍｍＩＤ×６ｍｍＯＤ×１ｍｍＷａｌｌものの透明なチューブ（Ｔｙｇｏｎ、Ｅ−３６０３）を連結し、レーザ装備を準備した。

ＲＢ処理から４時間後にトリプシンを用いて細胞をハーベストして、２０ｍｌに培養液で浮遊させ、５０ｍｌのチューブに入れておいた。ポンプを用いて細胞液がチュービングを１ｍｌ／ｍｉｎの速度で通るようにし、８０ｍＷの強度で４７３ｎｍの光を照射した。２、４、８、１０回繰り返して移動させたそれぞれの細胞液を、１ｍｌ１２ウェルプレートにシーディングした。翌日、ダブル染色を行ってｎｏｎ−ＧＦＰとＧＦＰ細胞との間の死滅程度を比較した。

ｎｏｎ−ＧＦＰ細胞とＧＦＰ細胞のそれぞれ０．５×１０^７個ずつ（合計１×１０^７）を混ぜた。翌日、１００μＭとなるようにローズベンガル（ＲＢ、ｓａｎｔａｃｒｕｚ、ｓｃ−２０３７５７）を処理した（この後の過程は、光を最大限避けて実験を行わなければならない）。暗室でＥＰ−１エコノポンプ（Ｂｉｏ−ｒａｄ、７３１−９００１）に４ｍｍＩＤ×６ｍｍＯＤ×１ｍｍＷａｌｌものの透明なチューブを連結し、レーザ装備を準備した。

ＲＢ処理から４時間後にトリプシンを用いて細胞をハーベストして、２０ｍｌに培養液で浮遊させ、５０ｍｌのチューブに入れておいた。ポンプを用いて細胞液がチュービングを１ｍｌ／ｍｉｎの速度で通るようにし、８０ｍＷの強度で４７３ｎｍの光を照射した。２、４、８、１０回繰り返して移動させたそれぞれの細胞液を、１ｍｌ１２ウェルプレートにシーディングした。翌日、ダブル染色を行ってｎｏｎ−ＧＦＰとＧＦＰ細胞との間の死滅程度を比較した。その結果、ＧＦＰ細胞のみが特異的に死滅することが確認された。

８．ＰＤＴ後の細胞死滅確認試験−Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２及びＰＩダブル染色
ＰＤＴ処理を行った細胞を１２ウェルプレートに５０％以上のコンフルエンスとなるように調節してシーディングした（ウェル当たり１ｍＬ）。ＰＢＳにＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｈ３５７０）とＰＩストック溶液（１０００Ｘ、Ｓｉｇｍａ、Ｐ４１７０）をそれぞれ２０μｇ／ｍｌ、２μｇ／ｍｌ（２Ｘ）となるように希釈させた（光を注意）。この溶液をサンプルに１ｍｌずつ入れ（培養培地と同一の体積で）、３７℃で２０分間培養した。サンプルを取り出して細胞リフターで掻き出した後、１．５ｍｌのチューブに集めて１２００ｒｐｍで３分程度遠心分離し、ＰＢＳで懸濁し、４８（２００μｌ）または９６（１００μｌ）ウェルプレートに移し替えた。光顕微鏡によって細胞を観察し、写真撮影（Ｍｅｒｇｅ写真）した。細胞写真当たりの死んだ細胞数（ＰＩ染色された細胞）／全細胞数＊１００して３枚の平均値を求めることにより、細胞死滅の程度を測定した。

９．ラットカニュレーション（Ｒａｔｃａｎｕｌａｔｉｏｎ）を用いた実験
（１）ＧＦＰ細胞（ＧＦＰ−Ｈ４６０）を１００ｍｍのディッシュの２つにそれぞれ１×１０^７となるようにシーディングした。翌日、１００μＭとなるようにローズベンガル（ＲＢ）を処理した（この後の過程は、光を最大限避けて実験を行わなければならない）。ＲＢ処理から４時間後にトリプシンを用いて細胞をハーベストして、２×１０^６ｃｅｌｌｓ／３００μｌにＦＢＳフリー培地に浮遊させ、１．５ｍｌのチューブに入れておいた。グルーピングは、下記の表に示しているようにした。

８週齢のＳＤラットの総１０匹のうち６匹に前記細胞液をＩＶ（尻尾）注射した。５匹のＳＤラットの気管支がある部位を切開して頸動脈、静脈を探し、ｈｅｐａｒｉｎを付けた２７９μｍＩＤ×６０９μｍＯＤ×１５２μｍＷａｌｌのポリエチレンチュービング（ＢＤ、４２７４０１）を用いてカニュレーションして、血液が流れるようにした。カニュレーションされたチュービング部位に８０ｍＷの強度で４７３ｎｍの光を５分間照射した。光照射済みのラットを手抄し、恒温恒湿動物室に一晩間培養した。心臓採血によって１０匹のラットからそれぞれ５ｍｌずつ採血し、そのうち１ｍｌをｈｅｐａｒｉｎが付いたチューブに取り、ＣＢＣテストを依頼した。

ＧＦＰ−癌細胞を注射したラットの血液４ｍｌに２０ｍｌのＲＢＣリーシス緩衝液を入れて注意して混合し、１０分間常温で培養した。３００ｇ、５分間遠心分離して上層液を除去し、１ｍｌの４％ＰＦＡ／ＰＢＳ溶液で１０分間固定した。４ｍｌのＰＢＳＴを入れて５回ｉｎｖｅｒｔした後、３００ｇ、５分間遠心分離した。

０．１μｇ／ｍｌＤＡＰＩ／ＰＢＳＴ溶液１ｍｌを入れて１０分間培養して、染色を行った。４ｍｌのＰＢＳＴを入れて５回ｉｎｖｅｒｔした後、３００ｇ、５分間遠心分離した。上層液を除去し、観察緩衝液（ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎｂｕｆｆｅｒ、１０ｍｇＰｅｎ−ｓｔｒｅｐ（ＢＤ、１５１４０−１２２）／１００ｍｌＰＢＳ）５ｍｌを入れ、９６ウェルプレートにウェル当たり１００μｌずつプレーティングした。蛍光顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ、Ｄｉａｐｈｏｔ３００）を用いてＧＦＰ−癌細胞を計数し、光照射の有無による個数を比較した。

（２）ｎｏｎ−ＧＦＰ細胞とＧＦＰ−細胞のそれぞれ０．５×１０^７個ずつ（合計１×１０^７）を混ぜてシーディングした。翌日、１００μＭとなるようにローズベンガル（ＲＢ）を処理した（この後の過程は、光を最大限避けて実験を行わなければならない）。ＲＢ処理から４時間後にトリプシンを用いて細胞をハーベストして、１×１０^６ｃｅｌｌｓ／３００μｌにＦＢＳフリー培地に浮遊させ、１．５ｍｌのチューブに入れておいた。８週齢のＳＤラットの総１０匹のうち、６匹に前記細胞液をＩＶ（尻尾）注射した。

５匹のＳＤラットの気管支がある部位を切開して頸動脈、静脈を探し、ｈｅｐａｒｉｎを付けた２７９μｍＩＤ×６０９μｍＯＤ×１５２μｍＷａｌｌのポリエチレンチュービングを用いてカニュレーションして、血液が流れるようにした。カニュレーションされたチュービング部位に８０ｍＷの強度で４７３ｎｍの光を５分間照射した。光照射済みのラットを手抄し、恒温恒湿動物室で一晩培養した。心臓採血によって１０匹のラットからそれぞれ５ｍｌずつ採血し、そのうち１ｍｌをｈｅｐａｒｉｎが付いたチューブに取り、ＣＢＣテストを依頼した。ＧＦＰ−癌細胞を注射したラットの血液４ｍｌに２０ｍｌのＲＢＣリーシス緩衝液（Ｑｉａｇｅｎ、＃１５８９０４）を入れて注意して混合し、１０分間常温で培養した。３００ｇ、５分間遠心分離して上層液を除去し、１ｍｌの４％ＰＦＡ／ＰＢＳ溶液で１０分間固定した。４ｍｌのＰＢＳＴを入れて５回ｉｎｖｅｒｔした後、３００ｇ、５分間遠心分離した。

０．１μｇ／ｍｌＤＡＰＩ／ＰＢＳＴ溶液１ｍｌを入れて１０分間培養して、染色を行った。４ｍｌのＰＢＳＴを入れて５回ｉｎｖｅｒｔした後、３００ｇ、５分間遠心分離した。上層液を除去し、観察緩衝液（ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎｂｕｆｆｅｒ、１０ｍｇＰｅｎ−ｓｔｒｅｐ／１００ｍｌＰＢＳ）５ｍｌを入れ、９６ウェルプレートにウェル当たり１００μｌずつプレーティングした。蛍光顕微鏡を用いてＧＦＰ−癌細胞を計数し、光照射の有無による個数を比較した。その結果、ＧＦＰ細胞のみが特異的に死滅することが確認された。

１０．人工皮膚を用いた実験
実際の皮膚環境の条件を適用してＧＦＰ＋細胞及びＲＦＰ＋細胞に光感作剤を処理し、光を照射した後、ＭＴＴ分析法を用いて細胞死滅の程度を測定した。具体的な実験過程は、次のとおりである。

具体的に、前記２−４．に記載された方法と同一の方法で、ローズベンガル及びエチルエチオプルプリンすずを１μＭの濃度で製造した。その後、前記１−３．で選別したＲＦＰ＋４Ｔ１細胞に前記エチルエチオプルプリンすずを処理し、前記１−４．で選別したＧＦＰ＋４Ｔ１細胞に前記ローズベンガルを処理した後、４時間で培養し、ＰＢＳ緩衝液で３回洗浄した。その後、図１６に示している模式図のように、人工皮膚（ａｒｔｉｆｉｃｉａｌｓｋｉｎｔｉｓｓｕｅ：ＡＳＴ、厚さ１ｍｍ）（ＧｅｉｓｔｌｉｃｈＭｕｃｏｇｒａｆｔ，ＧｅｉｓｔｌｉｃｈＰｈａｒｍａＡＧ）を光源（ｌｉｇｈｔｓｏｕｒｃｅ）と細胞との間に置いて実際の皮膚環境の条件を設けた後、ＧＦＰ＋細胞の場合、青色のレーザ光（４７３ｎｍ；放射線量比率＝２Ｊ／ｃｍ^２）を、ＲＦＰ＋細胞の場合、黄色のレーザ光（５８０ｎｍ；放射線量比率＝２Ｊ／ｃｍ^２）を５秒間照射した。照射してから２時間後、ＰＢＳ緩衝液で２回洗浄し、前記実験例２−２．に記載された方法と同一の方法で、ＭＴＴ分析を行った。前記実験は、ＧＦＰ、ＲＦＰの発現の強さと光の強さにより絶対数値の比較が困難であるため、人工皮膚が存在しない場合と人工皮膚が存在する場合とに分けて細胞死滅効果の減少値を比較した。

１１．ＧＦＰ＋及びＧＦＰ−細胞とローズベンガルを用いて、光照射後、Ｉｎｖｉｔｒｏ蛍光強度測定実験
青色光の照射後、ＧＦＰ−及びＧＦＰ＋細胞の蛍光強度を、ＲＢの存在または不存在の条件で測定した。具体的な実験過程は、次のとおりである。

前記１−１．に記載された方法で製造したＧＦＰ−及びＧＦＰ＋ＮＣＩ−Ｈ４６０細胞株１×１０^６個を、１０％ＦＢＳが添加されたＲＰＭＩ−１６４０培地で７５ｃｍ^２の細胞培養ティシュィで培養した。１２時間後、前記細胞株の培養培地をＦＢＳがないＲＰＭＩ−１６４０培地に交替し、多様な濃度（０μＭ、５μＭ、１０μＭ、５０μＭ）のＲＢを添加した。ＲＢが細胞内に蓄積されるように４時間で培養した後、細胞を遠心分離して得た。各細胞グループのペレットを１ｍｌＰＢＳに懸濁した。その後、前記細胞にブルーレーザ光（４７３ｎｍ；放射線量比率＝８０ｍＷ／ｃｍ^２）を照射し、分光蛍光測定器（ｓｐｅｃｔｒｏｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒ，ＪＡＳＣＯＩｎｃ．）を用いて各細胞グループの発光スペクトルを測定した。各グループの測定は５回繰り返した。ＦＲＥＴ効率は、次の数式によって計算された：
Ｅ＝１−［Ｆ（ＤＡ）／Ｆ（Ｄ）］、
Ｅ：ＦＲＥＴ効率、
Ｆ（ＤＡ）：ＲＢ存在時のＧＦＰの蛍光強度（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）、及び
Ｆ（Ｄ）：ＲＢ非存在時のＧＦＰの蛍光強度。

＜実験結果＞
１．ｃＦＲＥＴ基盤光力学治療
ＲＢの最大吸光度及びショルダー吸光度のスペクトルは、それぞれ５４９ｎｍ及び５１０ｎｍである。ｅＧＦＰの最大吸光度が４８９ｎｍであり、発光スペクトルの頂点が５０８ｎｍであるため、ＲＢのショルダー吸光度の範囲は、ブルーレーザ光（Ｌａｓｅｒ−ｓｔａｒｃｏ，．Ｌｔｄ、ＬＳＢ４７３−８０−ｄｏｔ）が照射されたｅＧＦＰの発光波長をカバーする（図１Ａ）。従って、ＦＲＥＴ現象がＲＢ及びｅＧＦＰの間で可能である。

本発明による、生きている細胞の蛍光を用いたＦＲＥＴ技術を、ｃＦＲＥＴと命名した。ＲＢがｅＧＦＰ＋及びｅＧＦＰ− ４Ｔ１細胞を処理するために用いられており、ブルーレーザ光（４７３ｎｍ）を照射したときに選択的に細胞が死滅することが示された（図１Ｂ）。

これは、ＲＢが、ＧＦＰ＋細胞においてＧＦＰから放出される、５１０ｎｍの光によってさらに比較的容易に活性化し、活性化したＲＢが、隣り合う酸素の豊富な環境から反応性酸素種（ＲＯＳ）を生成させることを助けることができるためであると予想される（図１Ｃ）。しかし、ＧＦＰ−細胞は、単に４７３ｎｍの光に対してしか反応できないため、活性化の程度は不十分である。

２．ｅＧＦＰ＋細胞に対するｃＦＲＥＴで誘導された選択的な細胞毒性
略６０％のｅＧＦＰ＋細胞は、ＲＢ処理後、４７３ｎｍのレーザ光に露出したときに選択的に死滅したのに対して、ｅＧＦＰ−細胞の場合、単に２０％程度のみが類似の条件で死滅した（図２Ａ）。２０％の細胞が死滅した理由は、持続的なレーザ光の照射によって生成された一重項酸素のモイエティ及び誘導された熱ストレスのためであると見られる。

２つのタイプの癌細胞（ｅＧＦＰ−及びｅＧＦＰ＋４Ｔ１細胞）を準備して、１：１の割合でランダムに混合した。レーザ光（４７３ｎｍ）に６時間露出した後、選択的な細胞毒性はｅＧＦＰ＋細胞から誘導された（図２Ｂ）。

ＭＴＴ分析の結果、レーザ照射後、ｅＧＦＰ−細胞に比べてｅＧＦＰ＋細胞において細胞毒性が顕著に高く示された（図２Ｂ）。光敏感剤の濃度及び露出時間によって死滅細胞の比が多様に示された。

低い水準のｅＧＦＰ−細胞死滅及び高い水準のｅＧＦＰ＋細胞死滅が同一の割合で観察された（図２Ｃ）。さらに高い容量のＲＢ及びさらに長い時間の露出を与えた場合、ｅＧＦＰ−細胞と比較したとき、ｅＧＦＰ＋細胞の細胞死滅の程度がさらに高くなった。しかし、極度に高い濃度のＲＢを処理し、露出時間も極度に長くしたときは、ｅＧＦＰ＋及びｅＧＦＰ−細胞において類似した水準の細胞毒性が示された（図２Ｃ）。

また、ＬＤＨ分析を用いて得られた実験結果も類似に示されたが、これは、異なる種類の癌細胞について得られた細胞毒性の程度は異なるということを示唆する。

４種類のｅＧＦＰ＋細胞（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、４Ｔ１、Ｈ４６０及びＢ１６Ｆ１０）について、ＲＢ処置による効果を同一の方法で測定した。たとえ、細胞毒性の程度は環境条件及び種に依存的であることが示されたとしても、ｅＧＦＰ＋及びｅＧＦＰ−細胞に示された傾向性はかなり類似していた（図２Ｄ）。類似に、クロリンｅ６（Ｃｅ６）及び６５０ｎｍの赤色のレーザ光を用いた実験において、ｅＧＦＰ＋及びｅＧＦＰ−細胞に対する細胞毒性は差がなかった（図５を参照）。また、ｃＦＲＥＴ−誘導性細胞毒性は、ＧＦＰトランスフェクションの程度が増加するにつれて増加した（図２Ｅ及び２Ｆ）。

３．ｅＧＦＰ＋細胞移植動物におけるｃＦＲＥＴの腫瘍成長抑制効果
Ｈ４６０及びＢ１６Ｆ１０細胞株のｅＧＦＰ＋及びｅＧＦＰ−サブラインの混合物をマウスの脇腹に移植した。１０〜１５日間で腫瘍を成長させた後、ブルーレーザ光（４７３ｎｍ）を各マウスの皮膚フラップ内部の腫瘍に繰り返して照射した（図３Ａ）。照射の２回目のラウンド後、選択的なｅＧＦＰ＋細胞死滅が観察された。ＧＦＰシグナルは、初期の腫瘍領域に比べて照射された領域で比較的顕著に減少することが示された。

略８０％のｅＧＦＰ＋細胞が除去されており、ｅＧＦＰ＋細胞による暗い領域が拡大したことが分かる。類似の現象が、移植された癌細胞のタイプにかかわらず、観察された（図３Ｂ及び３Ｃ）。

その後、ＧＦＰ＋及びＧＦＰ− Ｂ１６Ｆ１０細胞を分離して注射し、腫瘍の成長をモニタリングした。４７３ｎｍのレーザ光を照射した場合、光敏感剤処理を行わなくても、ＧＦＰ＋細胞の場合、腫瘍の成長が若干阻害されることが示されており、光敏感剤処理及び４７３ｎｍのレーザ光の照射を共に行った場合、腫瘍の成長が顕著に減少することが示された。しかし、このような阻害は、Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓｔ−ｔｅｓｔによって、統計学的に有意味な水準であることは示されていない。

ＲＢ処理したＧＦＰ＋細胞の場合、４７３ｎｍのレーザ光を照射した場合に、顕著な腫瘍阻害効果を奏した（図３Ｄ及び３Ｅ）。ＧＦＰ＋細胞が移植されたマウスの腫瘍において、顕著な組織損傷及び細胞死滅がさらに観察された（図３Ｆ）。Ｂａｘ及びｐ５３のような細胞死滅マーカーの発現水準が細胞死滅部位で測定され、ｃＦＲＥＴＰＤＴの後に顕著な損傷が観察された。ＴＮＦ−αを用いた免疫組織化学試験の結果は、細胞死滅がほとんど怪死（ｎｅｃｒｏｓｉｓ）に起因したものであることを示す。

４．大腸腫瘍が発達する間のＬｇｒ５＋細胞の選択的標的化：治療効果
Ｌｇｒ５＋大腸幹細胞は、ＡＯＭ、ＤＳＳの後、管腔の表面に移動し；Ｌｇｒ５−ＥＧＦＰ−ＩＲＥＳ−ｃｒｅＥＲＴ２ノックインマウスを用いた実験において、ｅＧＦＰ＋−Ｌｇｒ５＋大腸幹細胞の移動が観察された。ＢＡＢＢ溶液できれいにした組織を観察した結果、多くのｅＧＦＰ＋−Ｌｇｒ５＋細胞がクリプトの管腔の表面に位置し、ポリープに含浸（ｅｍｂｅｄｄｅｄ）されていることが示された（図４Ａ及び４Ｂ）。

マウスの大腸上皮に均一に光を照射するために、放射状の光の放出が可能な光学繊維を製造した（図４Ｃ）。シリンダー型拡散繊維（直径：６００μｍ）を肛門を通してマウスの大腸中に注意して挿入し；４７３ｎｍのブルーレーザ光をレーザの放出に用いた（図４Ｄ）。

ＲＢ処理及びＰＤＴ基盤レーザの放出後、Ｌｇｒ５−ＥＧＦＰＩＲＥＳ−ｃｒｅＥＲＴ２ノックインマウスにおいて、野生型マウスに比べてポリープの成長が阻害されることが示されており（図４Ｅ及び４Ｆ）；ポリープの数は、ｃＦＲＥＴ治療時に減少した。

また、Ｌｇｒ５−ＥＧＦＰ−ＩＲＥＳ−ｃｒｅＥＲＴ２ノックインマウスにＲＢ処理及び緑色のレーザ光の照射後、細胞死滅の未処理群及びレーザのみを照射した群において、十分に強力でない細胞死滅のシグナルが観察されたのに対して、周辺の低い−ＧＦＰ−発現領域と比較して、ｅＧＦＰ＋−Ｌｇｒ５＋細胞の同一の細胞領域部位において、細胞死滅のシグナルがより強力に示された。

５−１．光照射時間によるＲＦＰ＋細胞の細胞死滅の確認
図９に示しているように、ＲＦＰの場合、励起スペクトルの頂点は５５５ｎｍであり、発光スペクトルの頂点は５８４ｎｍである。光感作剤としてのエチルエチオプルプリンすず（Ｔｉｎｅｔｈｙｌｅｔｉｏｐｕｒｐｕｒｉｎ）は、６４０〜６６０ｎｍの吸光度スペクトルを有する。一方、エチルエチオプルプリンすずの６４０〜６６０ｎｍの吸光領域におけるＲＦＰ発光収得率（ｙｉｅｌｄ）は、５０％程度を有する。従って、図１０の模式図のように、ＦＲＥＴを用いた光力学治療のためにＲＦＰ及びエチルエチオプルプリンすずを用いることができるのかを確認するために、ＲＦＰ＋４Ｔ１細胞にエチルエチオプルプリンすずを処理し、ＲＦＰが光反応をすることのできる波長の光を時間別に照射した後、ＬＤＨ（ｌａｃｔａｔｅｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）分析法及びＭＴＴ分析法を用いて細胞死滅の程度を測定した。

その結果、ＲＦＰ＋細胞の場合、黄色のレーザ光によってＲＦＰが光反応し、これにより、活性化したエチルエチオプルプリンすずが細胞死滅を誘導することを確認した。また、ＲＦＰ＋細胞の場合、ＲＦＰ−細胞に比べて、細胞死滅が、光照射してから２秒が経過した後から顕著に増加した（図１１及び図１２）。

５−２．エチルエチオプルプリンすずの処理濃度によるＲＦＰ＋細胞の細胞死滅の確認
ＦＲＥＴを用いた光力学治療のためにＲＦＰ及びエチルエチオプルプリンすずを用いることができるのかを確認するために、ＲＦＰ＋４Ｔ１細胞にエチルエチオプルプリンすずを濃度別に処理し、ＲＦＰが光反応をすることのできる波長の光を照射した後、ＭＴＴ分析法を用いて細胞死滅の程度を測定した。

その結果、ＲＦＰ＋細胞の場合、エチルエチオプルプリンすずの処理濃度に依存的に細胞死滅が顕著に増加することを確認した（図１３）。

従って、前記結果により、光力学治療のためにＲＦＰ及びエチルエチオプルプリンすずを用いることができ、光力学治療のために少なくとも２秒の光照射が行わなければならないことを確認した。

６．光照射によるＲＦＰ＋細胞の細胞毒性の確認
赤色光、青色光または黄色光の照射後、ＲＦＰ＋またはＧＦＰ＋細胞の細胞毒性を、光感作剤として、Ｃｅ６（Ｃｈｌｏｒｉｎｅ（ｅ６））、ローズベンガル（Ｒｏｓｅｂｅｎｇａｌ）またはエチルエチオプルプリンすずの存在下で、ＭＴＴ分析によって測定した。

その結果、光感作剤としてＣｅ６を処理し、赤色のレーザ光を照射した場合、対照群、ＲＦＰ＋、ＧＦＰ＋細胞のいずれも毒性が示された。これに対して、光感作剤としてエチルエチオプルプリンすずを処理し、黄色のレーザ光を照射した場合、ＲＦＰ＋細胞のみにおいて細胞毒性が示され、対照群及びＧＦＰ＋細胞においては細胞毒性が示されないことを確認した。また、光感作剤としてエチルエチオプルプリンすずを処理し、黄色のレーザ光を照射したＲＦＰ＋細胞の場合、光感作剤としてローズベンガルを処理し、青色のレーザ光を照射したＧＦＰ＋細胞よりも、細胞毒性の程度がさらに高くなることを確認した（図１４）。

７．光照射によるＧＦＰ＋細胞のｉｎｖｉｔｒｏ蛍光強度の確認
青色光の照射後、ＧＦＰ−及びＧＦＰ＋細胞の蛍光強度を、ＲＢの存在または不存在の条件で測定した。

その結果、ＲＢの濃度が高くなるほど、ＧＦＰの放出ピーク（ｐｅａｋ）である５０８ｎｍにおける放出強度が減少し、前記減少したエネルギーがＲＢの放出ピークである５８０〜５９０ｎｍにおいて増加することが示された。従って、前記結果により、ＦＲＥＴ原理によってＧＦＰとＲＢによって細胞を選択的に死滅させることができることを確認した（図１５）。

８．皮膚環境の条件下における光照射によるＧＦＰ＋細胞及びＲＦＰ＋細胞の細胞死滅の確認
ＲＦＰが光反応をすることのできる波長は、ＧＦＰが光反応をすることのできる波長よりも長波長の領域にため、生きている組織に対する浸透深さの差によって細胞死滅に影響があるのかを調べるために、実際の皮膚環境の条件を適用してＧＦＰ＋細胞及びＲＦＰ＋細胞に光感作剤を処理し、光を照射した後、ＭＴＴ分析法を用いて細胞死滅の程度を測定した。

その結果、人工皮膚が存在しない場合だけでなく、人工皮膚が存在する場合も、光感作剤としてエチルエチオプルプリンすずを処理し、黄色のレーザ光を照射したＲＦＰ＋細胞の場合、光感作剤としてローズベンガルを処理し、青色のレーザ光を照射したＧＦＰ＋細胞よりも、長波長領域の光が照射されてより深く細胞に浸透可能であることから、細胞死滅の程度がさらに高くなることを確認した（図１７）。

従って、前記結果により、図１８の模式図のように、ＧＦＰと同様に、ＲＦＰが導入された癌細胞の場合も、黄色光の照射によって、正常細胞には影響を及ぼすことがないと共に、ＲＦＰが導入された癌細胞のみを選択的に死滅するため、光力学治療のためにＲＦＰ及びエチルエチオプルプリンすずを用いることができることを確認した。また、前記ＲＦＰ及びエチルエチオプルプリンすずを用いた光力学治療の場合、ＧＦＰ及びローズベンガルを用いた光力学治療よりも優れた効果を奏することができることを確認した。

９．光感作剤によるＧＦＰ＋細胞、ＲＦＰ＋細胞及びＹＦＰ＋細胞の細胞死滅の確認
ＦＲＥＴを用いた光力学治療のために、ＲＢ及びエチルエチオプルプリンすず以外に他の光感作剤を適用することができるのか、ＧＦＰ及びＲＦＰ以外に蛍光タンパク質を適用することができるのかを確認するために、図１９のように、ＧＦＰを発現するＧＦＰ＋Ａ５４９細胞、ＲＦＰを発現するＲＦＰ＋Ａ５４９細胞及びＹＦＰを発現するＹＦＰ＋Ａ５４９細胞を作製し、前記細胞にＲＢ、ヘマトポルフィリンまたは５−ＡＬＡを処理し、青色のレーザ光（４８８ｎｍ）または黄色のレーザ光（５７０ｎｍ）を照射した後、ＭＴＴ分析法を用いて細胞死滅の程度を測定した。

その結果、光感作剤としてＲＢを処理し、青色のレーザ光を照射した場合、ＧＦＰ＋細胞よりもＹＦＰ＋細胞において細胞死滅効果に優れていることを確認した（図２０）。これは、ＹＦＰの放出ピークが５４０ｎｍ程度であって、ＲＢの吸収波長ピークにさらに近接することを示唆する。

また、光感作剤としてヘマトポルフィリンまたは５−ＡＬＡを処理し、黄色のレーザ光を照射した場合、ＹＦＰ＋細胞及びＲＦＰ＋細胞において有意的な細胞死滅効果が奏され、ＲＦＰ＋細胞の場合、顕著に優れた細胞死滅効果が奏されることを確認した（図２１及び図２２）。

従って、前記結果から、ＹＦＰが導入された癌細胞の場合も、光感作剤を処理し、光照射によって、正常細胞には影響を及ぼさないと共に、ＹＦＰが導入された癌細胞のみを選択的に死滅するため、光力学治療のためにＹＦＰを用いることができ、ＹＦＰを光力学治療に用いる場合、光感作剤として、ＲＢ、ヘマトポルフィリンまたは５−ＡＬＡを適用することができることを確認した。また、ＲＦＰを光力学治療に用いる場合、光感作剤として、エチルエチオプルプリンすずだけでなく、ヘマトポルフィリンまたは５−ＡＬＡも適用することができることを確認した。

本発明は、蛍光タンパク質を発現する遺伝子及び光感作剤を用いた光力学治療用組成物及びこれを用いた光力学治療方法に関し、本発明の蛍光タンパク質を発現する遺伝子及び光感作剤を癌疾患の治療に有用に用いることができる。

Claims

蛍光タンパク質（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎ）を発現する遺伝子を搭載したウイルスベクター、及び光感作剤（ｐｈｏｔｏｓｅｎｓｉｔｉｚｅｒ）を含有する、光力学治療用組成物であって、
前記蛍光タンパク質は、赤色蛍光タンパク質（ｒｅｄｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎ）であり、前記光感作剤は、エチルエチオプルプリンすず、ヘマトポルフィリン及び５−ＡＬＡから構成された群より選ばれた光感作剤である、５６５〜５９０ｎｍの黄色光を照射して、赤色蛍光タンパク質を発現する遺伝子が導入された細胞を選択的に死滅させるための、光力学治療用組成物。
蛍光タンパク質（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎ）を発現する遺伝子を搭載したウイルスベクター、及び光感作剤（ｐｈｏｔｏｓｅｎｓｉｔｉｚｅｒ）を含有する、光力学治療用組成物であって、
前記蛍光タンパク質は、黄色蛍光タンパク質（ｙｅｌｌｏｗｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎ）であり、前記光感作剤は、ローズベンガルである、４７０〜４９０ｎｍの青色光を照射して、黄色蛍光タンパク質を発現する遺伝子が導入された細胞を選択的に死滅させるための、光力学治療用組成物。
蛍光タンパク質（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎ）を発現する遺伝子を搭載したウイルスベクター、及び光感作剤（ｐｈｏｔｏｓｅｎｓｉｔｉｚｅｒ）を含有する、光力学治療用組成物であって、
前記蛍光タンパク質は、黄色蛍光タンパク質（ｙｅｌｌｏｗｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎ）であり、前記光感作剤は、ヘマトポルフィリンまたは５−ＡＬＡである、５６５〜５９０ｎｍの黄色光を照射して、黄色蛍光タンパク質を発現する遺伝子が導入された細胞を選択的に死滅させるための、光力学治療用組成物。
前記赤色蛍光タンパク質の発光スペクトルの頂点が５７０〜６００ｎｍであることを特徴とする、請求項１に記載の光力学治療用組成物。
前記黄色蛍光タンパク質の発光スペクトルの頂点が５２０〜５５０ｎｍであることを特徴とする、請求項２又は３に記載の光力学治療用組成物。
前記細胞は、癌細胞、循環腫瘍細胞（ｃｉｒｃｕｌａｒｔｕｍｏｒｃｅｌｌ）、免疫細胞及び脂肪細胞から構成された群より選ばれたいずれか１つ以上であることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか一項に記載の光力学治療用組成物。
前記癌細胞は、乳癌細胞または肺癌細胞であることを特徴とする、請求項６に記載の光力学治療用組成物。
前記組成物は、癌組織に選択的に蓄積され、レーザの照射によって一重項酸素または自由ラジカルの生成が可能であることを特徴とする、請求項１〜７のいずれか一項に記載の光力学治療用組成物。
前記癌は、大腸腺腫、大腸癌、直腸癌、肛門癌、小腸癌、乳癌、肺癌、胃癌、肝臓癌、血液癌、慢性または急性白血病、骨髄癌、リンパ球リンパ腫、骨癌、膵臓癌、皮膚癌、頭頸部癌、皮膚黒色腫、眼球黒色腫、子宮肉腫、卵巣癌、卵管癌、子宮内膜癌、子宮頸部癌、内分泌癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、腎癌、軟組織腫瘍、尿道癌、前立腺癌、気管支癌、バレット食道（Ｂａｒｒｅｔｔ’ｓｅｓｏｐｈａｇｕｓ）、子宮頸部異形成症（ｃｅｒｖｉｃａｌｄｙｓｐｌａｓｉａ）、腎癌及び輸尿管癌から構成されたグループより選ばれることを特徴とする、請求項８に記載の光力学治療用組成物。
前記組成物を用いて、生体内または生体外で光活性化させることを特徴とする、請求項１〜９のいずれか一項に記載の光力学治療用組成物。
請求項１〜請求項１０のいずれか一項に記載の光力学治療用組成物；及び光源を含む、光力学治療に用いるためのキット。
前記キットは、癌治療用キットであることを特徴とする、請求項１１に記載の光力学治療に用いるためのキット。