JP6926285B2 - 改善された補体活性化を示す操作された免疫グロブリンｆｃポリペプチド - Google Patents

Description

本出願は、２０１５年２月９日に出願された米国仮出願番号第６２／１１３，７１７号に基づく優先権の利益を主張しており、その全体の内容は参考として本明細書中に援用される。

（発明の背景）
（１．発明の分野）
本発明は、全般的には、タンパク質工学の分野に関する。より詳細には、本発明は、野生型Ｆｃ抗体ドメインと比べてＣ１ｑへの結合増加を付与するＦｃ抗体ドメインを含む組成物に関係する。

（２．関連する技術の説明）
現在、上位２５種の市販の組換え治療抗体は、＄４３５億／年をはるかに上回る売上高を有し、これは、２０１０年から２０１５年にかけて９．２％の予想年間成長率であり、２０１５年までに＄６２７億／年まで増加する見通しである（Elvinら、２０１３年）。モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、現在診療所にある組換えタンパク質の大部分を構成し、１０６４種の製品が、米国またはＥＵにおいて会社出資の臨床治験を受けており、そのうち１６４種が第ＩＩＩ相にある（Elvinら、２０１３年）。治療上の焦点の観点から、ｍＡｂ市場は、腫瘍学、関節炎ならびに免疫および炎症性障害に大きな焦点が置かれており、これらの治療分野内の製品は、予想期間にわたって重要な成長推進力であり続けることになる。遺伝子操作されたｍＡｂはグループとしてみると一般に、小分子薬物よりも高い、ＦＤＡ承認成功の確率を有する。少なくとも５０社のバイオテクノロジー会社およびあらゆる主要な製薬会社で、抗体発見プログラムを積極的に実施している。ｍＡｂの単離および産生のための本来の方法は、最初にＭｉｌｓｔｅｉｎおよびＫｏｈｌｅｒによって１９７５年に報告され（KohlerおよびMilstein、１９７５年）、これは、マウスハイブリドーマを生じるマウスリンパ球および骨髄腫細胞の融合が関与した。治療用マウスｍＡｂは、１９８０年代初期に臨床研究に入った；しかし、患者がヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）を産生することによる、有効性の欠如および急速なクリアランスに伴う問題が明らかとなった。これらの課題と共に、本技術に関して時間と費用がかかることが、ｍＡｂ産生技術の進化の推進力となった。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、免疫化した動物のリンパ球から直接のモノクローナル抗体遺伝子のクローニングおよび細菌における抗体断片のコンビナトリアルライブラリーの発現を容易にした（Orlandiら、１９８９年）。より最近のライブラリーは、再編成された相補性決定領域３（ＣＤＲ３）を有するナイーブ遺伝子を使用して、完全にｉｎ ｖｉｔｒｏクローニング技法によって作製された（GriffthsおよびDuncan、１９９８年；Hoogenboomら、１９９８年）。結果として、所望の特異性を有する抗体断片の単離はもはや、対応する抗原の免疫原性に依存しない。さらに、合成コンビナトリアルライブラリーにおける抗原特異性の範囲は、免疫化されたマウスから作製されるハイブリドーマのパネルに見出されるものよりも大きかった。これらの利点は、小分子化合物（ハプテン）（HoogenboomおよびWinter、１９９２年）、分子複合体（Chamesら、２０００年）、不安定な化合物（Kjaerら、１９９８年）および細胞表面タンパク質（Desaiら、１９９８年）を含む多数の特有の抗原に対する抗体断片の開発を容易にした。微生物細胞において、ディスプレイスクリーニングをフローサイトメトリーによって行うことができる。特に、繋留型ペリプラズム発現（ＡＰＥｘ）は、Ｅ．ｃｏｌｉの内膜の周辺面（ｐｅｒｉｐｌａｓｍｉｃ ｆａｃｅ）における抗体断片の繋留に続く、外膜の破壊、蛍光標識された標的とのインキュベーションおよびスフェロプラストの選別に基づく（米国特許第７，０９４，５７１号）。ＡＰＥｘは、抗体断片の親和性成熟のために使用された（Harveyら、２００４年；Harveyら、２００６年）。一研究において、僅か２ラウンドのスクリーニングの後に、２００倍を超える親和性改善が得られた。

抗体治療薬の効力の根底にある重要な一機構は、２種のプロセスによる標的抗原（または細胞）のクリアランスのためのＦｃ媒介性エフェクター機能である。Ｆｃドメインは、血清中の可溶性タンパク質および細胞表面における受容体を含む多数のタンパク質に結合する。補体タンパク質Ｃ１ｑへの、病原性標的細胞と免疫複合体を形成した抗体のＦｃ領域の結合は、古典的補体活性化カスケードの活性化をもたらす（Walport、２００１年；Janewayら、２００５年）。これとは別に、Ｆｃドメインは、白血球の表面において発現された異なる受容体に結合して、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）および抗体依存性細胞ファゴサイトーシス（ＡＤＣＰ）を誘発する。

特に、Ｃ１ｑと病原体に結合した抗体との間で複合体を形成した後の古典的経路の活性化は、いくつかの機構を経て病原体排除をもたらす生化学的反応のカスケードを誘発する。第１に、細胞膜の完全性を損なう（comprising）ことにより細胞を死滅させる、細胞の表面における膜侵襲複合体（ＭＡＣ）の形成。第２に、病原体の表面における補体タンパク質の沈着によるオプソニン化と、白血球における補体受容体による補体オプソニンの認識が、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣＣ）を誘発する。Ｃ１ｑに対するＩｇＧの低親和性のため、および、いわゆる「古典的」補体経路の活性化に必要な立体構造的変化を惹起するために、Ｃ１ｑが、適切な空間的配向性で（すなわち、免疫複合体として）複数のＩｇＧ分子に結合するという要件のために、ＩｇＧの単一分子は、補体経路を活性化することができない（Walport、２００１年；Janewayら、２００５年）。

ヒトにおいて、ＩｇＧサブクラス抗体のＦｃドメインに結合するＦｃγＲの以下の２種の一般クラスが存在する：細胞質免疫受容体のチロシンベースの活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）配列の存在によって特徴付けられる活性化受容体、および免疫受容体のチロシンベースの阻害性モチーフ（ＩＴＩＭ）配列の存在によって特徴付けられる阻害性受容体（Daeron、１９９７年；Bollandら、１９９９年）。注目すべきことに、活性化ＦｃγＲ（すなわち、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＩＡおよびＦｃγＲＩＩＩＢ）は、活性化または炎症促進性応答を誘導する一方、阻害性受容体（すなわち、ＦｃγＲＩＩＢ）は、抗炎症性応答を誘導する。活性化ＡＤＣＣを誘導する抗体の能力は、活性化ＦｃγＲに対する結合親和性と対阻害性ＦｃγＲＩＩＢに対する結合親和性の比に依存する（Ａ／Ｉ比）（Boruchovら、２００５年；Kalergisら、２００２年）。ＦｃγＲの多数のアロタイプが公知である。例えば、ＦｃγＲＩＩＡ_Ｈ１３１アロタイプは、ＩｇＧに対して、ＦｃγＲＩＩＡ_Ｒ１３１アロタイプよりも高い結合親和性を示す一方、ＦｃγＲＩＩＩＡ_Ｖ１５８アロタイプは、活性化および阻害性ＦｃγＲの両方ならびにＣ１ｑに結合するＦｃγＲＩＩＩＡ_Ｆ１５８ＩｇＧ１ Ｆｃドメインよりも高い結合親和性を示す。対照的に、ヒトＩｇＧ２アイソタイプ抗体は、Ｃ１ｑに弱く結合する（よって、補体活性化の媒介が非常に不良であり、ＦｃγＲへの結合をほとんどまたは全く示さない）。ヒトＩｇＧ３およびＩｇＧ４アイソタイプ抗体はそれぞれ、ＩｇＧ１に対してより高いＣ１ｑ結合およびＣ１ｑ結合全く呈さず、概してＦｃγＲに対してより弱い親和性を呈する。

ＩｇＧ１におけるＣ１ｑおよびＦｃγＲ結合部位は、Ｃ１ｑとのＩｇＧ１のドッキングモデルおよびＦｃγＲの細胞外ドメインとのＦｃドメインの結晶構造に基づき識別された。Ｃ１ｑおよびＦｃγＲの両方が、ＩｇＧ１抗体のＦｃ ＣＨ２ドメインおよび場合によってはヒンジに位置するアミノ酸と主に相互作用する。Ｃ１ｑに関して、Ｆａｂ腕の配向性がそうであるように、Ａｓｐ２７０、Ｌｙｓ３２２およびＰｒｏ３２９〜Ｐｒｏ３３１が、結合に特に重要である（Gaboriaudら、２００３年；Guddatら、１９９３年）。ＦｃγＲ結合の観点から、ＩｇＧ下部（lower）ヒンジ領域におけるＬｅｕ２３４〜Ｓｅｒ２３９およびＣＨ２ドメインにおけるＡｓｐ２６５〜Ｓｅｒ２６７が、特に重要である（Gaboriaudら、２００３年；Woofら、２００４年）。ＣＨ２ドメインは、Ａｐｎ２９７に１個のＮ−グリコシル化部位を有し、Ａｓｎ２９７におけるＮ連結型グリカンは、２個のＣＨ２ドメインの間のギャップを架橋する。この架橋は、Ｃ１ｑおよびＦｃγＲへの結合のためのＣＨ２ドメインの適切な立体構造を維持する。他方では、Ａｓｎ２９７におけるグリカンの除去は、ＣＨ２ドメインの立体構造上の柔軟性を増加させ、結果として、非グリコシル化（aglycosylated）Ｆｃは、Ｃ１ｑおよびＦｃγＲへの結合を基本的に示さず、よって、ＡＤＣＣおよびＣＤＣを消失する（Borrokら、２０１２年）。
抗体媒介性補体活性化およびＣＤＣは、多数の治療抗体の機能において特に重要である（Rogersら、２０１４年）。したがって、補体活性化を増加させるための戦略は、多大な注目を集めてきた。例えば、ＩｇＧ１およびＩｇＧ３を含むキメラＩｇＧ分子（Natsumeら、２００８年）は、ＦｃγＲ結合能に影響を与えることなく、増強されたＣ１ｑ結合を呈し、ＣＤ２０＋リンパ腫細胞株に向かう増強されたＣＤＣ活性をもたらすことが報告された。Dall’Acquaら（２００６年）は、ヒトＩｇＧ１のヒンジ領域におけるアミノ酸置換が、野生型ＩｇＧと比較して、僅かに減少したＣＤＣ活性およびより低いＡＤＣＣ活性をもたらしたことを報告した。別の研究では、ＩｇＧ１ ＦｃドメインにおけるＫ３２６Ｗ／Ｅ３３３Ｓ二重変異は、Ｃ１ｑへの結合の５倍増加およびＣＤＣの２倍増加をもたらした（Idusogieら、２００１年）。より最近では、Mooreら（２０１０年）が、ＩｇＧ１ ＦｃドメインにおけるＳ２６７Ｅ／Ｈ２６８Ｆ／Ｓ３２４Ｔ三重変異体が、Ｃ１ｑに対する４７倍増強された親和性およびＣＤＣにおける６．９倍増強されたＥＣ_５０値を示したことを報告した。Ｓ２６７Ｅ／Ｈ２６８Ｆ／Ｓ３２４Ｔ三重変異体はまた、全てではないがいくつかのヒトＦｃγＲに対しても親和性増加を示した（Mooreら、２０１０年）。最後に、Diebolderら（２０１４年）は、ＩｇＧ六量体の形成に好都合なＦｃドメインにおける変異、最も注目すべきものとしてはＥ３４５Ｒ置換が、ＣＤ２０＋陽性Ｄａｕｄｉ細胞に向かう１２倍増強されたＣＤＣ有効性を示したことを報告した。しかし、ＦｃγＲ結合またはＡＤＣＣにおける六量体形成の効果は、報告されていない。
Ｅ．ｃｏｌｉは、ジスルフィド結合によるタンパク質のフォールディングに不適な還元性細胞質を保有し、タンパク質は、アンフォールドまたは不正確にフォールドされた状態で蓄積する（BaneyxおよびMujacic、２００４年）。細胞質とは対照的に、Ｅ．ｃｏｌｉのペリプラズム（ｐｅｒｉｐｌａｓｍ）は、タンパク質ジスルフィド結合の形成を可能にする酸化状態で維持される。注目すべきことに、ペリプラズム発現は、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２等、抗体断片の発現に首尾よく用いられてきた（KipriyanovおよびLittle、１９９９年）。これらの断片は、抗原結合活性を保持しつつ、相対的に迅速に多量に作製することができる。しかし、抗体断片は、Ｆｃドメインを欠くため、ＦｃＲｎ受容体に結合せず、迅速に除去される；よって、抗体断片は、治療タンパク質としてごく稀にしか適さない（Knightら、１９９５年）。最近まで、全長抗体は、不溶性凝集塊としてＥ．ｃｏｌｉ中で発現され、次いでｉｎ ｖｉｔｒｏでリフォールドさせることしかできなかった（Bossら、１９８４年；Cabillyら、１９８４年）。現在の技術では、数百万または数千万種の抗体を個々にリフォールドすることは不可能なため、明らかにこのアプローチは、抗体ライブラリーのハイスループットスクリーニングには受け入れられない。さらなる問題は、Ｅ．ｃｏｌｉ発現抗体は、グリコシル化されていないため、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）を除いて、補体因子１ｑ（Ｃｌｑ）またはＦｃおよび他のＦｃγ受容体に結合することができないことであり、この結合は、循環におけるＩｇＧ抗体の長期持続に決定的である。

米国特許第７，０９４，５７１号明細書

Elvinら, Int. J. Pharm., 440:83-98, 2013. KohlerおよびMilstein, Nature, 256:495-497, 1975. Orlandiら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:3833-3837, 1989. GriffithsおよびDuncan, Curr. Opin. Biotechnol., 9:102-108, 1998. Hoogenboomら, Immunotechnology, 4:1-20, 1998. HoogenboomおよびWinter, J. Mol. Biol., 227:381-388, 1992. Chamesら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97:7969-7974, 2000. Kjaerら, FEBS Lett., 431:448-452, 1998. Desaiら, Cancer Res., 58:2417-2425, 1998. Harveyら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 101:9193-9198, 2004. Harveyら, J. Immunol. Methods. 308:43-52, 2006. Walport, Complement. First of two parts. N. Engl. J. Med., 344:1058-1066, 2001. Janewayら, Immunobiology: The Immune System in Health and Disease. 6th Edition. New York: Garland Publishing, 2005. Daeron, Annu. Rev. Immunol., 15:203-234, 1997. BollandおよびRavetch, Adv. Immunol., 72:149-177, 1999. Boruchovら, J. Clin. Invest., 115:2914-2923, 2005. KalergisおよびRavetch, J. Exp. Med., 195:1653-1659, 2002. Gaboriaudら, J. Biol. Chem., 278:46974-46982, 2003. Guddatら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:4271-4275, 1993. Borrokら, ACS Chem. Biol., 7:1596-1602, 2012. Natsumeら, Cancer Res., 68:3863-3872, 2008. Dall’ Acquaら, J. Immunol., 177:1129-1138, 2006. Idusogieら, J. Immunol., 166:2571-2575, 2001. Mooreら, mAbs, 2:181-189, 2010. Diebolderら, Science, 343:1260-1263, 2014.

（発明の要旨）
本開示は、Ｃ１ｑに対する親和性増加および／またはＣ１ｑのみに対する選択性もしくはＣ１ｑと活性化Ｆｃ受容体への結合に対する選択性を呈するが、ＦｃγＲＩＩＢには結合しない非グリコシル化（ａｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ）抗体Ｆｃドメインが関与する化合物および方法を提供する。

一部の実施形態では、ヒトＩｇＧ１抗体由来のバリアント非グリコシル化Ｆｃドメイン（「抗体Ｆｃドメイン」）を有するポリペプチドを含む組成物が提供される。追加的な実施形態では、非グリコシル化Ｆｃドメインは、Ｃ１ｑのみへの高度に選択的な結合を可能にし、エフェクターＦｃ受容体、すなわち、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＩＡおよびＦｃγＲＩＩＩＢのいずれにも結合しない、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメイン（配列番号１；配列番号１のポジション１は、ＫａｂａｔにおけるＥＵ指標のポジション２３１に対応する）のバリアントである。他の実施形態では、操作されたバリアントＦｃドメインは、非グリコシル化型で発現された場合およびグリコシル化型で発現された場合の両方で、Ｃ１ｑに高度に選択的に結合することができ、エフェクターＦｃ受容体への結合をほとんどまたは全く呈さない。またさらなる実施形態では、配列番号１（野生型ヒトＦｃドメイン）と比べて、Ｃ１ｑに対し、および活性化型炎症促進性Ｆｃ受容体に対しても親和性増加を呈するが、阻害性受容体ＦｃγＲＩＩＢに対しては親和性増加を呈さないバリアントＦｃドメインを含む抗体が提供される。変異し、かつ非グリコシル化されたＦｃドメインを有するポリペプチドと、グリコシル化された野生型Ｆｃドメインを有するポリペプチドとの間の相対的結合能は、倍数的な差（増加または減少）を単位として表現することができる。追加的な実施形態では、操作されたバリアントＦｃドメインは、グリコシル化された野生型Ｆｃドメインを有するポリペプチドの１０倍以内〜２５０倍の間の、より好ましくは、１５０倍以内〜２５０倍の間のＣ１ｑに対する親和性増加を呈する。

一部の実施形態では、特定のアミノ酸置換を含む非グリコシル化バリアントヒトＦｃドメインを含むポリペプチドが提供される。一部の実施形態では、複数のアミノ酸置換が存在する。一部の態様では、Ｃ１ｑのみに結合することができ、いかなるＦｃ受容体にも結合しないバリアントヒトＩｇＧ Ｆｃドメインは、アミノ酸３２０および３８６に置換を含むことができる。一部の態様では、Ｃ１ｑのみに結合することができ、いかなるＦｃ受容体にも結合しないバリアントヒトＩｇＧ Ｆｃドメインは、アミノ酸２３５、２３６、２３７および３５１に置換を含むことができる。一部の態様では、Ｃ１ｑおよび活性化Ｆｃγ受容体に結合することができるが、ＦｃγＲＩＩＢには結合しないバリアントヒトＩｇＧ Ｆｃドメインは、アミノ酸３０８、３３７、３３８、３４０、３４２、３４４、３４５および３７２に置換を含むことができる。Ｆｃドメインにおける残基の番号は、ＫａｂａｔにおけるＥＵ指標の番号である。

一部の態様では、バリアントＦｃドメインが、アミノ酸３２０および３８６にアミノ酸置換を含む場合、アミノ酸３２０における置換は、グルタミン酸（Ｋ３２０Ｅ）であり、アミノ酸３８６における置換は、アルギニン（Ｑ３８６Ｒ）である。ある特定の態様では、非グリコシル化バリアントヒトＩｇＧ Ｆｃドメインは、Ｆｃ８０１（配列番号７）であり得る。

一部の態様では、バリアントＦｃドメインが、アミノ酸２３５、２３６、２３７および３５１にアミノ酸置換を含む場合、アミノ酸２３５における置換は、リシン（Ｌ２３５Ｋ）であり、アミノ酸２３６における置換は、メチオニン（Ｇ２３６Ｍ）であり、アミノ酸２３７における置換は、アルギニン（Ｇ２３７Ｒ）であり、アミノ酸３５１における置換は、グルタミン（Ｌ３５１Ｑ）である。ある特定の態様では、非グリコシル化バリアントヒトＩｇＧ Ｆｃドメインは、Ｆｃ８０２（配列番号１０）であり得る。

一部の態様では、バリアントＦｃドメインが、アミノ酸３０８、３３７、３３８、３４０、３４２、３４４、３４５および３７２にアミノ酸置換を含む場合、アミノ酸３０８における置換は、アラニン（Ｖ３０８Ａ）であり、アミノ酸３３７における置換は、プロリン（Ｓ３３７Ｐ）であり、アミノ酸３３８における置換は、グルタミン（Ｋ３３８Ｑ）であり、アミノ酸３４０における置換は、アルギニン（Ｋ３４０Ｒ）であり、アミノ酸３４２における置換は、プロリン（Ｑ３４２Ｐ）であり、アミノ酸３４４における置換は、グリシン（Ｒ３４４Ｇ）であり、アミノ酸３４５における置換は、チロシン（Ｅ３４５Ｙ）であり、アミノ酸３７２における置換は、ロイシン（Ｆ３７２Ｌ）である。ある特定の態様では、非グリコシル化バリアントヒトＩｇＧ Ｆｃドメインは、Ｆｃ８０５（配列番号２２）であり得る。

一部の態様では、バリアントＦｃドメインが、アミノ酸２５２にアミノ酸置換を含む場合、アミノ酸２５２における置換は、バリン（Ｍ２５２Ｖ）である。ある特定の態様では、非グリコシル化バリアントヒトＩｇＧ Ｆｃドメインは、Ｆｃ−Ｖ１（配列番号３６）であり得る。

一部の態様では、バリアントＦｃドメインが、アミノ酸２４６、３２２および４０２にアミノ酸置換を含む場合、アミノ酸２４６における置換は、アスパラギン（Ｋ２４６Ｎ）であり、アミノ酸３２２における置換は、グルタミン酸（Ｋ３２２Ｅ）であり、アミノ酸４０２における置換は、アスパラギン酸（Ｇ４０２Ｄ）である。ある特定の態様では、非グリコシル化バリアントヒトＩｇＧ Ｆｃドメインは、Ｆｃ−Ｖ１１（配列番号３７）であり得る。

一部の態様では、バリアントＦｃドメインが、アミノ酸３２０および３８６にアミノ酸置換を含む場合、アミノ酸３２０における置換は、グルタミン酸（Ｋ３２０Ｅ）であり、アミノ酸３８６における置換は、アルギニン（Ｑ３８６Ｒ）である。ある特定の態様では、非グリコシル化バリアントヒトＩｇＧ Ｆｃドメインは、Ｆｃ８０１（配列番号７）であり得る。

一部の態様では、バリアントＦｃドメインが、アミノ酸２４２、３１５、３３６、３４０、３４２、３７８および３８６にアミノ酸置換を含む場合、アミノ酸２４２における置換は、ロイシン（Ｆ２４２Ｌ）であり、アミノ酸３１５における置換は、セリン（Ｎ３１５Ｓ）であり、アミノ酸３３６における置換は、メチオニン（Ｉ３３６Ｍ）であり、アミノ酸３４０における置換は、アルギニン（Ｋ３４０Ｒ）であり、アミノ酸３４２における置換は、アスパラギン酸（Ｑ３４２Ｄ）であり、アミノ酸３７８における置換は、スレオニン（Ａ３７８Ｔ）であり、アミノ酸３８６における置換は、アルギニン（Ｑ３８６Ｒ）である。ある特定の態様では、非グリコシル化バリアントヒトＩｇＧ Ｆｃドメインは、Ｆｃ−Ｖ１２（配列番号３８）であり得る。

一部の態様では、バリアントＦｃドメインが、アミノ酸３３４、３５１および４２１にアミノ酸置換を含む場合、アミノ酸３３４における置換は、グルタミン酸（Ｋ３３４Ｅ）であり、アミノ酸３５１における置換は、グルタミン（Ｌ３５１Ｑ）であり、アミノ酸４２１における置換は、アスパラギン酸（Ｎ４２１Ｄ）である。ある特定の態様では、非グリコシル化バリアントヒトＩｇＧ Ｆｃドメインは、Ｆｃ−Ｖ１５（配列番号３９）であり得る。

一部の態様では、バリアントＦｃドメインが、アミノ酸３４１および３５１にアミノ酸置換を含む場合、アミノ酸３４１における置換は、アラニン（Ｇ３４１Ａ）であり、アミノ酸３５１における置換は、グルタミン（Ｌ３５１Ｑ）である。ある特定の態様では、非グリコシル化バリアントヒトＩｇＧ Ｆｃドメインは、Ｆｃ−Ｖ１７（配列番号４０）であり得る。

一部の態様では、バリアントＦｃドメインが、アミノ酸２５２、３４１および３５１にアミノ酸置換を含む場合、アミノ酸２５２における置換は、バリン（Ｍ２５２Ｖ）であり、アミノ酸３４１における置換は、アラニン（Ｇ３４１Ａ）であり、アミノ酸３５１における置換は、グルタミン（Ｌ３５１Ｑ）である。ある特定の態様では、非グリコシル化バリアントヒトＩｇＧ Ｆｃドメインは、Ｆｃ−Ｖ１８（配列番号４１）であり得る。

一部の態様では、バリアントＦｃドメインが、アミノ酸２４６、２６０、３１５および３８６にアミノ酸置換を含む場合、アミノ酸２４６における置換は、グルタミン（Ｋ２４６Ｑ）であり、アミノ酸２６０における置換は、アラニン（Ｔ２６０Ａ）であり、アミノ酸３１５における置換は、セリン（Ｎ３１５Ｓ）であり、アミノ酸３８６における置換は、アルギニン（Ｑ３８６Ｒ）である。ある特定の態様では、非グリコシル化バリアントヒトＩｇＧ Ｆｃドメインは、Ｆｃ−Ｖ１９（配列番号４２）であり得る。

一部の態様では、バリアントＦｃドメインが、アミノ酸２４６、２５２、３２２、３４４、３４５および３７２にアミノ酸置換を含む場合、アミノ酸２４６における置換は、アスパラギン（Ｋ２４６Ｎ）であり、アミノ酸２５２における置換は、バリン（Ｍ２５２Ｖ）であり、アミノ酸３２２における置換は、グルタミン酸（Ｋ３２２Ｅ）であり、アミノ酸３４４における置換は、グリシン（Ｒ３４４Ｇ）であり、アミノ酸３４５における置換は、チロシン（Ｅ３４５Ｙ）であり、アミノ酸３７２における置換は、ロイシン（Ｆ３７２Ｌ）である。ある特定の態様では、非グリコシル化バリアントヒトＩｇＧ Ｆｃドメインは、Ｆｃ−Ｖ２３（配列番号４３）であり得る。

一部の態様では、バリアントＦｃドメインが、アミノ酸２４２、２５２、３３８、３４１および３４５にアミノ酸置換を含む場合、アミノ酸２４２における置換は、ロイシン（Ｆ２４２Ｌ）であり、アミノ酸２５２における置換は、バリン（Ｍ２５２Ｖ）であり、アミノ酸３３８における置換は、グルタミン（Ｋ３３８Ｑ）であり、アミノ酸３４１における置換は、アラニン（Ｇ３４１Ａ）であり、アミノ酸３４５における置換は、チロシン（Ｅ３４５Ｙ）である。ある特定の態様では、非グリコシル化バリアントヒトＩｇＧ Ｆｃドメインは、Ｆｃ−Ｖ２４（配列番号４４）であり得る。

一部の態様では、バリアントＦｃドメインが、アミノ酸３３４、４０２、３３８、３４２、３４４、３４５および３７２にアミノ酸置換を含む場合、アミノ酸３３４における置換は、グルタミン酸（Ｋ３３４Ｅ）であり、アミノ酸４０２における置換は、アスパラギン酸（Ｇ４０２Ｄ）であり、アミノ酸３３８における置換は、グルタミン（Ｋ３３８Ｑ）であり、アミノ酸３４２における置換は、プロリン（Ｑ３４２Ｐ）であり、アミノ酸３４４における置換は、グリシン（Ｒ３４４Ｇ）であり、アミノ酸３４５における置換は、チロシン（Ｅ３４５Ｙ）であり、アミノ酸３７２における置換は、ロイシン（Ｆ３７２Ｌ）である。ある特定の態様では、非グリコシル化バリアントヒトＩｇＧ Ｆｃドメインは、Ｆｃ−Ｖ２６（配列番号４５）であり得る。

一部の態様では、非グリコシル化バリアントヒトＦｃドメインは、アミノ酸２９９に置換（例えば、Ｔ２９９Ｌ）を含むことができる。

バリアントＦｃドメインポリペプチドは、無改変ポリペプチド（例えば、野生型Ｆｃドメインポリペプチド）または本明細書に開示されているいずれかのポリペプチド配列と比較して、ある特定のパーセンテージの同一性を有すると特徴付けることができる。パーセンテージ同一性は、改変されたポリペプチドの無改変部分（すなわち、いかなる指定された置換も除外する、改変されたポリペプチドの配列）および対応する野生型ポリペプチドの間で、約少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％（またはそこから導くことができるいずれかの範囲）であり得る。上に記す同一性のパーセンテージが、ポリペプチドの無改変領域と比較した、ポリペプチドの特定の改変された領域に関係する場合があることも企図される。例えば、野生型Ｆｃドメインに対し少なくとも９０％同一性を有すると特徴付けられるバリアントＦｃドメインポリペプチドは、そのバリアントポリペプチドにおけるアミノ酸の少なくとも９０％が、野生型ポリペプチドにおけるアミノ酸と同一であることを意味する。

抗体Ｆｃドメインは、ヒトＩｇＧ抗体またはそのバリアントのＦｃドメインであり得る。ある特定の態様では、Ｆｃドメインは、抗ＨＥＲ２抗体（例えば、トラスツズマブ）のＦｃドメインまたは抗ＣＤ２０抗体（例えば、リツキシマブ）のＦｃドメイン等、ＩｇＧ１ Ｆｃドメインであり得る。ポリペプチドが、抗体分子に由来しないポリペプチドに融合された、本明細書に開示されている操作されたバリアントＦｃドメインの融合体を含むことができることも企図される。

本明細書に記載されているポリペプチドは、一部の実施形態では、リンカーを含むことができる。さらなる実施形態では、リンカーは、コンジュゲート可能なリンカーである。一部の実施形態では、ポリペプチドは、抗体に由来するＦｃドメインを含有する。これは、別の結合ドメイン等、抗体由来の他の領域を含有することができる。追加的な結合ドメインは、ある特定の実施形態では、ＦｃＲ結合ドメインでなくてもよい。一部の実施形態では、これは、抗体由来の抗原結合部位またはドメインを含有することができる。これは、抗体由来の可変領域の全体または部分を含むであろう。他の実施形態では、ポリペプチドは、非ＦｃＲ結合ドメインである別の結合ドメインではなく、抗体由来のＦｃドメインを含有する。一部の実施形態では、非Ｆｃ結合領域は、抗体の抗原結合部位ではなく、細胞表面タンパク質または可溶性タンパク質に特異的に結合する。場合によっては、非Ｆｃ結合領域が認識する細胞表面タンパク質は、受容体である。

他のポリペプチドは、Ｃ１ｑポリペプチドに結合することができる非グリコシル化Ｆｃドメインと、非Ｆｃ受容体結合ドメインである第２の結合ドメインとを有するようなポリペプチドを含み、第２の結合ドメインは、細胞表面分子または可溶性タンパク質に特異的に結合することができる。一部の実施形態では、第２の結合ドメインは、抗体の抗原結合ドメイン（「Ｉｇ可変ドメイン」）である。一部の態様では、ポリペプチドは、全長抗体であり得る。場合によっては、第２の結合ドメインは、抗体抗原結合ドメインではない。一部の実施形態では、第２の結合ドメインは、タンパク質性分子である細胞表面分子に特異的に結合することができる。一部の態様では、第２の結合ドメインは、可溶性タンパク質に特異的に結合することができる。

実施形態は、本明細書に記すポリペプチドのいずれかをコードする核酸にも関係する。核酸は、単離することができ、そして／または組換体であり得る。これは、単離され、そして／または組換体である核酸セグメントであり得る。一部の実施形態では、核酸は、ＤＮＡであるが、他方では、ＲＮＡである。ある特定の実施形態では、核酸は、ＤＮＡセグメントである。他の実施形態では、核酸は、ヒトＣ１ｑに特異的に結合する１個または複数の置換を有するＦｃ結合ドメインを有するポリペプチドのいずれかを発現することができる発現ベクターである。核酸は、ポリペプチドが産生される仕方に応じてグリコシル化されていてもされていなくてもよい、上に記す１種または複数のポリペプチドをコードすることができる。

一部の実施形態では、ヒトＣ１ｑに特異的に結合することができるＦｃドメインを有するポリペプチドをコードする核酸が存在する。核酸は、ポリペプチド、特に、非グリコシル化バージョンのポリペプチドを発現することができる宿主細胞に入れることができる。宿主細胞は、細菌細胞等、原核細胞であり得る。あるいは、宿主細胞は、哺乳動物細胞等、真核細胞であり得る。一部の実施形態では、宿主細胞は、第１の発現ベクターを含有するが、同様に第２の発現ベクターを含むこともできる。一部の抗体は、複数のポリペプチドで構成されているため、一部の実施形態では、これらの複数のポリペプチドを発現する宿主細胞が企図される。例えば、一部の実施形態では、免疫グロブリン軽鎖を含むポリペプチドをコードする第２の発現ベクターを含む宿主細胞が存在する。

一部の実施形態では、宿主細胞の集団が存在し、この集団は、異なるＦｃドメインを有するポリペプチドを発現する複数の宿主細胞を含有する。任意の２種の異なるＦｃドメインのアミノ酸配列が、同一性において２０％未満、１５％、１０％、５％またはそれ未満異なることが企図される。

一部の実施形態では、本明細書に記載されているポリペプチド（非グリコシル化Ｆｃ領域を有するポリペプチド）を作製する方法、ならびにこれらのポリペプチドを使用する方法が存在する。本明細書に記載されているポリペプチドのいずれかに関して、これらの方法のいずれを実行することもできる。

一部の実施形態では、非グリコシル化ポリペプチドを調製するための方法であって、ａ）Ｃ１ｑに結合することができるＦｃドメインを含む非グリコシル化ポリペプチドを発現することができる宿主細胞を得るステップと、ｂ）非グリコシル化ポリペプチドの発現を促進するための条件下で、培養において宿主細胞をインキュベートするステップと、ｃ）宿主細胞から、発現されたポリペプチドを精製するステップとを含む方法が存在する。一部の実施形態では、宿主細胞は、細菌細胞等、原核細胞である。他の実施形態では、宿主細胞は、真核細胞であり、ポリペプチドは、Ｔ２９９Ｌ置換を含む。さらなる実施形態では、方法は、上清からの発現されたポリペプチドの収集が関与し、これは、精製に先立ち行うことができる。

一部の実施形態では、方法は、上清からのポリペプチドの精製が関与する。これは、上清由来のポリペプチドを、濾過、ＨＰＬＣ、アニオンもしくはカチオン交換、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、親和性クロマトグラフィーまたはこれらの組合せに付すことが関与し得る。一部の実施形態では、方法は、ＩｇＧ Ｆｃ領域に結合するブドウ球菌プロテインＡを使用した親和性クロマトグラフィーが関与する。他の精製方法は、当業者に周知である。

一部の実施形態では、薬学的に許容される担体中に本実施形態のポリペプチドまたは核酸を含む医薬品製剤が提供される。

一部の実施形態では、対象に抗体を与えるステップを含む、対象における免疫応答を誘導する方法であって、抗体が、非グリコシル化されており、本実施形態のＦｃドメインを含む、方法が提供される。一部の態様では、非グリコシル化抗体は、ヒトＣ１ｑに特異的に結合することができる場合がある。一部の態様では、非グリコシル化抗体は、ヒトＣ１ｑおよびヒト活性化Ｆｃ受容体に特異的に結合することができる場合がある。ある特定の態様では、非グリコシル化抗体は、グリコシル化された野生型バージョンの抗体の少なくとも５０分の１のレベルで、ＦｃγＲＩＩＢポリペプチドに特異的に結合することができる場合がある。一部の態様では、抗体は、非グリコシル化バージョンの治療抗体であり得る。

さらなる実施形態では、Ｆｃバリアントを含むポリペプチドによって誘導することができる白血病細胞死は、野生型ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域を含むポリペプチドによって誘導される白血病細胞死と比較して増強される。さらにさらなる実施形態では、本発明に係るポリペプチドは、野生型ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域を含むポリペプチドによって誘導されるＣＤＣと比較して、強く増強されたＣＤＣを示す。さらにさらなる実施形態では、本発明に係るポリペプチドは、野生型ヒトＩｇＧ抗体と比較して、ＡＤＣＣまたはＡＤＣＰを示さないかも知れない。

さらなる実施形態では、本明細書で企図されるバリアントＦｃポリペプチドを含む抗体によって標的にされる細胞の死滅は、野生型ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域を含むポリペプチドによって誘導される白血病細胞死と比較して増強される。さらにさらなる実施形態では、本発明に係るポリペプチドは、野生型ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域を含むポリペプチドによって誘導されるＣＤＣと比較して、強く増強されたＣＤＣを示す。

一実施形態では、腫瘍を有する対象を処置するための方法であって、有効量の本実施形態の医薬品製剤を対象に投与するステップを含む方法が提供される。一部の態様では、本方法は、補体依存性細胞傷害を誘導することができる。一部の態様では、本方法は、抗体依存性細胞傷害を誘導することができる。他の態様では、本方法は、抗体依存性細胞傷害を誘導しないかも知れない。一部の態様では、腫瘍は、固形腫瘍または血液学的腫瘍であり得る。ある特定の態様では、対象は、ヒト患者であり得る。一部の態様では、医薬品製剤は、腫瘍内に、静脈内に、皮内に、動脈内に、腹腔内に、病巣内に、頭蓋内に、関節内に、前立腺内に、胸膜内に、気管内に、眼球内に、鼻腔内に、硝子体内に、腟内に、直腸内に、筋肉内に、皮下に、結膜下、小胞内に、粘膜に、心膜内に、臍帯内に、経口によって、吸入によって、注射によって、注入によって、持続注入によって、標的細胞を直接浸す局在化灌流によって、カテーテルにより、または洗浄により投与することができる。一部の態様では、本方法は、例えば、外科療法、化学療法、放射線療法、寒冷療法、ホルモン療法、免疫療法またはサイトカイン療法等、少なくとも第２の抗がん療法を対象に投与するステップをさらに含むことができる。

一実施形態では、疾患の処置における使用のための、本実施形態のバリアントＦｃドメインまたは本実施形態のバリアントＦｃドメインをコードする核酸を含む組成物が提供される。前記疾患は、標的細胞に対する補体依存性細胞傷害を誘導することによって処置される疾患であり得る。一部の態様では、疾患は、がんであり得る。別の実施形態では、がん等の疾患の処置のための医薬の製造における本実施形態に係るポリペプチドまたは本実施形態に係るポリペプチドをコードする核酸の使用が提供される。

本明細書において使用する場合、「を基本的に含まない」は、指定された構成成分に関して、指定された構成成分のいずれも、組成物において意図的に製剤化されていない、および／またはそれが単なる夾雑物としてもしくは微量で存在することを意味するように本明細書で使用されている。組成物のいずれかの意図されない混入に起因する指定された構成成分の総量は、したがって、０．０５％をはるかに下回り、好ましくは０．０１％を下回る。指定された構成成分の量を標準分析方法により検出することができない組成物が最も好ましい。

本明細書において使用する場合、用語「親和性」は、２種の作用物質の可逆的結合の平衡定数を指し、Ｋ_Ｄとして表現される。その標的に対する結合ドメインの親和性は、例えば、約１００ナノモル濃度（ｎＭ）〜約０．１ｎＭ、約１００ｎＭ〜約１ピコモル濃度（ｐＭ）または約１００ｎＭ〜約１フェムトモル濃度（ｆＭ）であり得；あるいは、これは、１００ｎＭ〜１ｎＭの間または０．１ｎＭ〜１０ｎＭの間であり得る。さらに、２種の作用物質の間に上に記す親和性範囲内の親和性が存在する場合、作用物質同士が特異的に結合することが企図される。

本明細書において使用する場合、核酸に関連する用語「コードする」または「コード化すること」は、当業者が本発明を容易に理解できるようにするために使用され；しかし、これらの用語は、それぞれ「を含む」または「を含むこと」と互換的に使用することができる。

本明細書において使用する場合、「を基本的に含まない」は、指定された構成成分の観点から、指定された構成成分のいずれも、組成物において意図的に製剤化されていない、および／またはそれが単なる夾雑物としてもしくは微量で存在することを意味するように本明細書で使用されている。組成物のいずれか意図されない混入に起因する指定された構成成分の総量は、したがって、０．０５％をはるかに下回り、好ましくは、０．０１％を下回る。指定された構成成分の量を標準分析方法により検出することができない組成物が最も好ましい。

本明細書において、「１つの（ａ）」または「１つの（ａｎ）」は、１または複数を意味することができる。本明細書の請求項（単数または複数）において使用する場合、単語「を含む（comprising）」と併せて使用される場合、単語「１つの（ａ）」または「１つの（ａｎ）」は、１または２以上を意味することができる。

特許請求の範囲における用語「または」の使用は、選択肢のみを指すことまたは選択肢が相互排他的であることを明確に示さない限り、「および／または」を意味するように使用されているが、本開示は、選択肢のみおよび「および／または」を指す規定を支持する。本明細書において使用する場合、「別の」は、少なくとも第２のまたはそれを超える数のものを意味することができる。

本願を通して、用語「約」は、値が、この値の決定に用いられている装置、方法に固有の誤差変動、または研究対象の間に存在する変動を含むことを示すように使用されている。

本発明の他の目的、特色および利点は、次の詳細な説明から明らかである。しかし、本発明の精神および範囲内の様々な変更および修正が、この詳細な説明から当業者に明らかであり得るため、詳細な説明および具体例は、本発明の好ましい実施形態を示しているが、単なる例示として提示されていることを理解されたい。

以下の図は本明細書の一部を形成し、本発明のある特定の態様をさらに実証するために含まれる。本発明は、これらの図の１つまたは複数を本明細書で提示されている特定の実施形態の詳細な説明と組み合わせて参照することによって、よりよく理解することができる。
特定の実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
ヒトＣ１ｑに結合することができる非グリコシル化バリアントヒトＩｇＧ Ｆｃドメインを含むポリペプチドであって、前記Ｆｃドメインが、（ａ）３０８、３３７、３３８、３４０、３４２、３４４、３４５および３７２；（ｂ）３２０および３８６；（ｃ）２３５、２３６、２３７および３５１；（ｄ）２４６、３２２および４０２；（ｅ）２４２、３１５、３３６、３４０、３４２、３７８および３８６；（ｆ）３３４、３５１および４２１；（ｇ）３４１および３５１；（ｈ）２５２、３４１および３５１；（ｉ）２４６、２６０、３１５および３８６；（ｊ）２４６、２５２、３２２、３４４、３４５および３７２；（ｋ）２４２、２５２、３３８、３４１および３４５；ならびに（ｌ）３３４、４０２、３３８、３４２、３４４、３４５および３７２からなる群から選択されるアミノ酸置換を含み、前記Ｆｃドメインにおける前記残基のナンバリングが、ＫａｂａｔにおけるＥＵ指標のナンバリングであるポリペプチド。
（項目２）
ヒトＣ１ｑの結合に特異的な親和性を有する、項目１に記載のポリペプチド。
（項目３）
Ｆｃγ受容体に検出可能に結合しない、項目１に記載のポリペプチド。
（項目４）
ヒトＣ１ｑおよび活性化Ｆｃ受容体の結合に特異的な親和性を有する、項目１に記載のポリペプチド。
（項目５）
ＦｃγＲＩＩｂに検出可能に結合しない、項目４に記載のポリペプチド。
（項目６）
前記非グリコシル化バリアントヒトＩｇＧ Ｆｃドメインが、置換Ｋ３２０ＥおよびＱ３８６Ｒを含む、項目２に記載のポリペプチド。
（項目７）
前記非グリコシル化バリアントヒトＩｇＧ Ｆｃドメインが、Ｆｃ８０１（配列番号７）である、項目６に記載のポリペプチド。
（項目８）
前記非グリコシル化バリアントヒトＩｇＧ Ｆｃドメインが、置換Ｌ２３５Ｋ、Ｇ２３６Ｍ、Ｇ２３７ＲおよびＬ３５１Ｑを含む、項目２に記載のポリペプチド。
（項目９）
前記非グリコシル化バリアントヒトＩｇＧ Ｆｃドメインが、Ｆｃ８０２（配列番号１０）である、項目８に記載のポリペプチド。
（項目１０）
前記非グリコシル化バリアントヒトＩｇＧ Ｆｃドメインが、置換Ｖ３０８Ａ、Ｓ３３７Ｐ、Ｋ３３８Ｑ、Ｋ３４０Ｒ、Ｑ３４２Ｐ、Ｒ３４４Ｇ、Ｅ３４５ＹおよびＦ３７２Ｌを含む、項目４に記載のポリペプチド。
（項目１１）
前記非グリコシル化バリアントヒトＩｇＧ Ｆｃドメインが、Ｆｃ８０５（配列番号２２）である、項目１０に記載のポリペプチド。
（項目１２）
前記非グリコシル化バリアントヒトＩｇＧ Ｆｃドメインが、置換Ｍ２５２Ｖを含む、項目４に記載のポリペプチド。
（項目１３）
前記非グリコシル化バリアントヒトＩｇＧ Ｆｃドメインが、Ｆｃ−Ｖ１（配列番号３６）である、項目１２に記載のポリペプチド。
（項目１４）
前記非グリコシル化バリアントヒトＩｇＧ Ｆｃドメインが、置換Ｇ４３１ＡおよびＬ３５１Ｑをさらに含む、項目１２に記載のポリペプチド。
（項目１５）
前記非グリコシル化バリアントヒトＩｇＧ Ｆｃドメインが、Ｆｃ−Ｖ１８（配列番号４１）である、項目１４に記載のポリペプチド。
（項目１６）
前記非グリコシル化バリアントヒトＩｇＧ Ｆｃドメインが、置換Ｋ２４６Ｎ、Ｋ３２２Ｅ、Ｒ３４４Ｇ、Ｅ３４５ＹおよびＦ３７２Ｌをさらに含む、項目１２に記載のポリペプチド。
（項目１７）
前記非グリコシル化バリアントヒトＩｇＧ Ｆｃドメインが、Ｆｃ−Ｖ２３（配列番号４３）である、項目１６に記載のポリペプチド。
（項目１８）
前記非グリコシル化バリアントヒトＩｇＧ Ｆｃドメインが、置換Ｆ２４２Ｌ、Ｋ３３８Ｑ、Ｇ３４１ＡおよびＥ３４５Ｙをさらに含む、項目１２に記載のポリペプチド。
（項目１９）
前記非グリコシル化バリアントヒトＩｇＧ Ｆｃドメインが、Ｆｃ−Ｖ２４（配列番号４４）である、項目１８に記載のポリペプチド。
（項目２０）
前記非グリコシル化バリアントヒトＩｇＧ Ｆｃドメインが、置換Ｋ２４６Ｎ、Ｋ３２２ＥおよびＧ４０２Ｄを含む、項目４に記載のポリペプチド。
（項目２１）
前記非グリコシル化バリアントヒトＩｇＧ Ｆｃドメインが、Ｆｃ−Ｖ１１（配列番号３７）である、項目２０に記載のポリペプチド。
（項目２２）
前記非グリコシル化バリアントヒトＩｇＧ Ｆｃドメインが、置換Ｆ２４２Ｌ、Ｎ３１５Ｓ、Ｉ３３６Ｍ、Ｋ３４０Ｒ、Ｑ３４２Ｄ、Ａ３７８ＴおよびＱ３８６Ｒを含む、項目４に記載のポリペプチド。
（項目２３）
前記非グリコシル化バリアントヒトＩｇＧ Ｆｃドメインが、Ｆｃ−Ｖ１２（配列番号３８）である、項目２２に記載のポリペプチド。
（項目２４）
前記非グリコシル化バリアントヒトＩｇＧ Ｆｃドメインが、置換Ｋ３３４Ｅ、Ｌ３５１ＱおよびＮ４２１Ｄを含む、項目４に記載のポリペプチド。
（項目２５）
前記非グリコシル化バリアントヒトＩｇＧ Ｆｃドメインが、Ｆｃ−Ｖ１５（配列番号３９）である、項目２４に記載のポリペプチド。
（項目２６）
前記非グリコシル化バリアントヒトＩｇＧ Ｆｃドメインが、置換Ｇ３４１ＡおよびＬ３５１Ｑを含む、項目４に記載のポリペプチド。
（項目２７）
前記非グリコシル化バリアントヒトＩｇＧ Ｆｃドメインが、Ｆｃ−Ｖ１７（配列番号４０）である、項目２６に記載のポリペプチド。
（項目２８）
前記非グリコシル化バリアントヒトＩｇＧ Ｆｃドメインが、置換Ｋ２４６Ｑ、Ｔ２６０Ａ、Ｎ３１５ＳおよびＱ３８６Ｒを含む、項目４に記載のポリペプチド。
（項目２９）
前記非グリコシル化バリアントヒトＩｇＧ Ｆｃドメインが、Ｆｃ−Ｖ１９（配列番号４２）である、項目２８に記載のポリペプチド。
（項目３０）
前記非グリコシル化バリアントヒトＩｇＧ Ｆｃドメインが、置換Ｋ３３４Ｅ、Ｇ４０２Ｄ、Ｋ３３８Ｑ、Ｑ３４２Ｐ、Ｒ３３４Ｇ、Ｅ３４５ＹおよびＦ３７２Ｌを含む、請求項４に記載のポリペプチド。
（項目３１）
前記非グリコシル化バリアントヒトＩｇＧ Ｆｃドメインが、Ｆｃ−Ｖ２６（配列番号４５）である、項目３０に記載のポリペプチド。
（項目３２）
アミノ酸２９９におけるロイシン置換（Ｔ２９９Ｌ）をさらに含む、項目１〜３１のいずれか一項に記載のポリペプチド。
（項目３３）
非Ｆｃ受容体（非ＦｃＲ）結合ドメインをさらに含む、項目１〜３１のいずれか一項に記載のポリペプチド。
（項目３４）
前記非ＦｃＲ結合ドメインが、Ｉｇ可変ドメインである、項目３３に記載のポリペプチド。
（項目３５）
全長抗体としてさらに規定されている、項目３４に記載のポリペプチド。
（項目３６）
前記非ＦｃＲ結合領域が、抗体の抗原結合部位ではない、項目３３に記載のポリペプチド。
（項目３７）
前記非ＦｃＲ結合領域が、細胞表面タンパク質に結合する、項目３３に記載のポリペプチド。
（項目３８）
前記非ＦｃＲ結合領域が、可溶性タンパク質に結合する、項目３３に記載のポリペプチド。
（項目３９）
項目１〜３８に記載のポリペプチドのいずれかをコードする核酸。
（項目４０）
ＤＮＡセグメントである、項目３９に記載の核酸。
（項目４１）
発現ベクターである、項目３９に記載の核酸。
（項目４２）
項目３９〜４１のいずれか一項に記載の核酸を含む宿主細胞。
（項目４３）
前記核酸を発現する、項目４２に記載の宿主細胞。
（項目４４）
非グリコシル化ポリペプチドを調製するための方法であって、
ａ）項目４３に記載の宿主細胞を得るステップと、
ｂ）前記非グリコシル化ポリペプチドの発現を促進するための条件下で、培養において前記宿主細胞をインキュベートするステップと、
ｃ）前記宿主細胞から、発現された前記ポリペプチドを精製するステップと
を含む方法。
（項目４５）
前記宿主細胞が、真核細胞であり、前記ポリペプチドが、アミノ酸２９９にロイシン置換（Ｔ２９９Ｌ）を含む、項目４４に記載の方法。
（項目４６）
前記宿主細胞が、原核細胞である、項目４４に記載の方法。
（項目４７）
薬学的に許容される担体中に、項目１〜３８のいずれか一項に記載のポリペプチドまたは項目３９〜４１のいずれか一項に記載の核酸を含む医薬品製剤。
（項目４８）
対象に抗体を与えるステップを含む、対象における免疫応答を誘導する方法であって、前記抗体が、非グリコシル化されており、かつ項目１に記載のＦｃドメインを含む、方法。
（項目４９）
前記非グリコシル化抗体が、ヒトＣ１ｑに特異的に結合することができる、項目４８に記載の方法。
（項目５０）
前記非グリコシル化抗体が、ヒトＣ１ｑおよびヒト活性化Ｆｃ受容体に特異的に結合することができる、項目４８に記載の方法。
（項目５１）
前記非グリコシル化抗体が、グリコシル化された野生型バージョンの抗体の少なくとも５０分の１のレベルで、ＦｃγＲＩＩｂポリペプチドに特異的に結合することができる、項目５０に記載の方法。
（項目５２）
前記抗体が、非グリコシル化バージョンの治療抗体である、項目４８に記載の方法。
（項目５３）
腫瘍を有する対象を処置する方法であって、有効量の項目４７に記載の製剤を前記対象に投与するステップを含む方法。
（項目５４）
補体依存性細胞傷害を誘導する、項目５３に記載の方法。
（項目５５）
抗体依存性細胞傷害を誘導する、項目５４に記載の方法。
（項目５６）
抗体依存性細胞傷害を誘導しない、項目５４に記載の方法。
（項目５７）
前記腫瘍が、固形腫瘍である、項目５３に記載の方法。
（項目５８）
前記腫瘍が、血液学的腫瘍である、項目５３に記載の方法。
（項目５９）
前記対象が、ヒト患者である、項目５３に記載の方法。
（項目６０）
前記製剤が、腫瘍内に、静脈内に、皮内に、動脈内に、腹腔内に、病巣内に、頭蓋内に、関節内に、前立腺内に、胸膜内に、気管内に、眼球内に、鼻腔内に、硝子体内に、腟内に、直腸内に、筋肉内に、皮下に、結膜下、小胞内に、粘膜に、心膜内に、臍帯内に、経口によって、吸入によって、注射によって、注入によって、持続注入によって、標的細胞を直接浸す局在化灌流によって、カテーテルにより、または洗浄により投与される、項目５３に記載の方法。
（項目６１）
少なくとも第２の抗がん療法を前記対象に投与するステップをさらに含む、項目５３に記載の方法。
（項目６２）
前記第２の抗がん療法が、外科療法、化学療法、放射線療法、寒冷療法、ホルモン療法、免疫療法またはサイトカイン療法である、項目６１に記載の方法。
（項目６３）
疾患の処置における使用のための、項目１〜３８のいずれか一項に記載のポリペプチド。
（項目６４）
前記疾患が、標的細胞に対する補体依存性細胞傷害を誘導することによって処置される疾患である、項目６３に記載のポリペプチド。
（項目６５）
前記疾患が、がんである、項目６４に記載のポリペプチド。
（項目６６）
がん等の疾患の処置のための医薬の調製における、項目１〜３８のいずれか一項に記載のポリペプチドの使用。

図１Ａ〜Ｂ。トラスツズマブ軽鎖（図１Ａ）およびトラスツズマブ重鎖（図１Ｂ）の細菌ペリプラズムディスプレイのための２つのプラスミド系の簡単なスキーム。

変異Ｆｃポリペプチドのライブラリーを構築するための特定の戦略の簡単なスキーム。

図３Ａ〜Ｄ。Ｃ１ｑまたはＦｃγＲＩＩＩａを用いた標識条件を確認するためのＦＡＣＳ解析。図３Ａは、Ｃ１ｑ−ＰＥをＰＢＳ中で標識した場合の、示されたスフェロプラスト化Ｅ．ｃｏｌｉ細胞それぞれのＦＡＣＳスキャン結果を示す。図３Ｂは、抗ＬＰＳ抗体−ＰＥをＰＢＳ中で標識した場合の、示されたスフェロプラスト化Ｅ．ｃｏｌｉ細胞それぞれのＦＡＣＳスキャン結果を示す。図３Ｃは、高塩緩衝液中のＣ１ｑ−ＰＥを用いたＦＡＣＳスキャン結果を示す。図３Ｄは、ＦｃγＲＩＩＩａ−ＳＡ−ＰＥを用いたスフェロプラスト化Ｅ．ｃｏｌｉ細胞のＦＡＣＳスキャン結果を示す。各パネルの平均蛍光強度を表３に提示する。 図３Ａ〜Ｄ。Ｃ１ｑまたはＦｃγＲＩＩＩａを用いた標識条件を確認するためのＦＡＣＳ解析。図３Ａは、Ｃ１ｑ−ＰＥをＰＢＳ中で標識した場合の、示されたスフェロプラスト化Ｅ．ｃｏｌｉ細胞それぞれのＦＡＣＳスキャン結果を示す。図３Ｂは、抗ＬＰＳ抗体−ＰＥをＰＢＳ中で標識した場合の、示されたスフェロプラスト化Ｅ．ｃｏｌｉ細胞それぞれのＦＡＣＳスキャン結果を示す。図３Ｃは、高塩緩衝液中のＣ１ｑ−ＰＥを用いたＦＡＣＳスキャン結果を示す。図３Ｄは、ＦｃγＲＩＩＩａ−ＳＡ−ＰＥを用いたスフェロプラスト化Ｅ．ｃｏｌｉ細胞のＦＡＣＳスキャン結果を示す。各パネルの平均蛍光強度を表３に提示する。 図３Ａ〜Ｄ。Ｃ１ｑまたはＦｃγＲＩＩＩａを用いた標識条件を確認するためのＦＡＣＳ解析。図３Ａは、Ｃ１ｑ−ＰＥをＰＢＳ中で標識した場合の、示されたスフェロプラスト化Ｅ．ｃｏｌｉ細胞それぞれのＦＡＣＳスキャン結果を示す。図３Ｂは、抗ＬＰＳ抗体−ＰＥをＰＢＳ中で標識した場合の、示されたスフェロプラスト化Ｅ．ｃｏｌｉ細胞それぞれのＦＡＣＳスキャン結果を示す。図３Ｃは、高塩緩衝液中のＣ１ｑ−ＰＥを用いたＦＡＣＳスキャン結果を示す。図３Ｄは、ＦｃγＲＩＩＩａ−ＳＡ−ＰＥを用いたスフェロプラスト化Ｅ．ｃｏｌｉ細胞のＦＡＣＳスキャン結果を示す。各パネルの平均蛍光強度を表３に提示する。 図３Ａ〜Ｄ。Ｃ１ｑまたはＦｃγＲＩＩＩａを用いた標識条件を確認するためのＦＡＣＳ解析。図３Ａは、Ｃ１ｑ−ＰＥをＰＢＳ中で標識した場合の、示されたスフェロプラスト化Ｅ．ｃｏｌｉ細胞それぞれのＦＡＣＳスキャン結果を示す。図３Ｂは、抗ＬＰＳ抗体−ＰＥをＰＢＳ中で標識した場合の、示されたスフェロプラスト化Ｅ．ｃｏｌｉ細胞それぞれのＦＡＣＳスキャン結果を示す。図３Ｃは、高塩緩衝液中のＣ１ｑ−ＰＥを用いたＦＡＣＳスキャン結果を示す。図３Ｄは、ＦｃγＲＩＩＩａ−ＳＡ−ＰＥを用いたスフェロプラスト化Ｅ．ｃｏｌｉ細胞のＦＡＣＳスキャン結果を示す。各パネルの平均蛍光強度を表３に提示する。

図４Ａ〜Ｂ。Ｆｃライブラリー選別および再選別後の、Ｃ１ｑに結合する高親和性クローンの富化を示すＦＡＣＳ解析ヒストグラム。図４Ａは、７ラウンドのライブラリー選別および再選別のそれぞれの後の、細胞のＣ１ｑ−ＰＥ結合強度を示す。第１ラウンドを例外として、各ヒストグラムにおいて、一番右のピークは「選別後」条件を表す。図４Ｂは、７ラウンドのライブラリー選別および再選別の間のライブラリーのＣ１ｑ−ＰＥまたはＦｃγＲＩＩＩａ−ＳＡ−ＰＥ結合強度を示す。各ヒストグラムの一番右のピークは「選別後」条件を表す。

ＦＡＣＳを使用した、２２種の単離されたＩｇＧバリアントのＣ１ｑ−ＰＥまたはＦｃγＲＩＩＩａ−ＳＡ−ＰＥに対する結合解析。左側のヒストグラムは、単離されたＩｇＧバリアントのＣ１ｑに対するＣ１ｑ結合強度を示す。右側のヒストグラムは、単離されたＩｇＧバリアントのＦｃγＲＩＩＩａ−ＳＡ−ＰＥに対するＦｃγＲＩＩＩａ−ＳＡ−ＰＥ結合強度を示す。平均蛍光強度を表４に列挙する。

図６Ａ〜Ｂ。野生型ＩｇＧ、リツキシマブ、および選択されたＩｇＧバリアントＲＡＩ（抗ＣＤ２０リツキシマブＦａｂおよび非グリコシル化Ｆｃ８０２）、ＲＡＩＩ（抗ＣＤ２０リツキシマブＦａｂおよび非グリコシル化Ｆｃ８０１）、およびＲＡＩＩＩ（抗ＣＤ２０リツキシマブＦａｂおよび非グリコシル化Ｆｃ８０５）の精製後の、還元条件下（図６Ａ）または非還元条件下（図６Ｂ）でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析。Ｍ：タンパク質サイズマーカー；１：リツキシマブ；２：ＲＡＩ；３：ＲＡＩＩ；３：ＲＡＩＩＩ。

溶液中に単量体として存在する精製されたＩｇＧバリアントを確認するためのサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）解析。

図８Ａ〜Ｆ。非グリコシル化リツキシマブ（Ａｇｌｙｃｏ ＩｇＧ１）、グリコシル化リツキシマブ（Ｇｌｙｃｏ ＩｇＧ１）、および選択されたＩｇＧバリアントＲＡＩ、ＲＡＩＩ、およびＲＡＩＩＩの、ＦｃγＲ；単量体ＦｃγＲＩ（図８Ａ）、二量体ＦｃγＲＩＩａ_Ｈ１３１（図８Ｂ）、二量体ＦｃγＲＩＩａ_Ｒ１３１（図８Ｃ）、二量体ＦｃγＲＩＩｂ（図８Ｄ）、二量体ＦｃγＲＩＩＩａ_Ｖ１５７（図８Ｅ）、および二量体ＦｃγＲＩＩＩａ_Ｆ１５７（図８Ｆ）に対するＥＬＩＳＡ結果。 図８Ａ〜Ｆ。非グリコシル化リツキシマブ（Ａｇｌｙｃｏ ＩｇＧ１）、グリコシル化リツキシマブ（Ｇｌｙｃｏ ＩｇＧ１）、および選択されたＩｇＧバリアントＲＡＩ、ＲＡＩＩ、およびＲＡＩＩＩの、ＦｃγＲ；単量体ＦｃγＲＩ（図８Ａ）、二量体ＦｃγＲＩＩａ_Ｈ１３１（図８Ｂ）、二量体ＦｃγＲＩＩａ_Ｒ１３１（図８Ｃ）、二量体ＦｃγＲＩＩｂ（図８Ｄ）、二量体ＦｃγＲＩＩＩａ_Ｖ１５７（図８Ｅ）、および二量体ＦｃγＲＩＩＩａ_Ｆ１５７（図８Ｆ）に対するＥＬＩＳＡ結果。 図８Ａ〜Ｆ。非グリコシル化リツキシマブ（Ａｇｌｙｃｏ ＩｇＧ１）、グリコシル化リツキシマブ（Ｇｌｙｃｏ ＩｇＧ１）、および選択されたＩｇＧバリアントＲＡＩ、ＲＡＩＩ、およびＲＡＩＩＩの、ＦｃγＲ；単量体ＦｃγＲＩ（図８Ａ）、二量体ＦｃγＲＩＩａ_Ｈ１３１（図８Ｂ）、二量体ＦｃγＲＩＩａ_Ｒ１３１（図８Ｃ）、二量体ＦｃγＲＩＩｂ（図８Ｄ）、二量体ＦｃγＲＩＩＩａ_Ｖ１５７（図８Ｅ）、および二量体ＦｃγＲＩＩＩａ_Ｆ１５７（図８Ｆ）に対するＥＬＩＳＡ結果。 図８Ａ〜Ｆ。非グリコシル化リツキシマブ（Ａｇｌｙｃｏ ＩｇＧ１）、グリコシル化リツキシマブ（Ｇｌｙｃｏ ＩｇＧ１）、および選択されたＩｇＧバリアントＲＡＩ、ＲＡＩＩ、およびＲＡＩＩＩの、ＦｃγＲ；単量体ＦｃγＲＩ（図８Ａ）、二量体ＦｃγＲＩＩａ_Ｈ１３１（図８Ｂ）、二量体ＦｃγＲＩＩａ_Ｒ１３１（図８Ｃ）、二量体ＦｃγＲＩＩｂ（図８Ｄ）、二量体ＦｃγＲＩＩＩａ_Ｖ１５７（図８Ｅ）、および二量体ＦｃγＲＩＩＩａ_Ｆ１５７（図８Ｆ）に対するＥＬＩＳＡ結果。 図８Ａ〜Ｆ。非グリコシル化リツキシマブ（Ａｇｌｙｃｏ ＩｇＧ１）、グリコシル化リツキシマブ（Ｇｌｙｃｏ ＩｇＧ１）、および選択されたＩｇＧバリアントＲＡＩ、ＲＡＩＩ、およびＲＡＩＩＩの、ＦｃγＲ；単量体ＦｃγＲＩ（図８Ａ）、二量体ＦｃγＲＩＩａ_Ｈ１３１（図８Ｂ）、二量体ＦｃγＲＩＩａ_Ｒ１３１（図８Ｃ）、二量体ＦｃγＲＩＩｂ（図８Ｄ）、二量体ＦｃγＲＩＩＩａ_Ｖ１５７（図８Ｅ）、および二量体ＦｃγＲＩＩＩａ_Ｆ１５７（図８Ｆ）に対するＥＬＩＳＡ結果。 図８Ａ〜Ｆ。非グリコシル化リツキシマブ（Ａｇｌｙｃｏ ＩｇＧ１）、グリコシル化リツキシマブ（Ｇｌｙｃｏ ＩｇＧ１）、および選択されたＩｇＧバリアントＲＡＩ、ＲＡＩＩ、およびＲＡＩＩＩの、ＦｃγＲ；単量体ＦｃγＲＩ（図８Ａ）、二量体ＦｃγＲＩＩａ_Ｈ１３１（図８Ｂ）、二量体ＦｃγＲＩＩａ_Ｒ１３１（図８Ｃ）、二量体ＦｃγＲＩＩｂ（図８Ｄ）、二量体ＦｃγＲＩＩＩａ_Ｖ１５７（図８Ｅ）、および二量体ＦｃγＲＩＩＩａ_Ｆ１５７（図８Ｆ）に対するＥＬＩＳＡ結果。

図９Ａ〜Ｄ。リツキシマブ、ＲＡＩ、ＲＡＩＩ、ＲＧＩ、およびＲＧＩＩのＣ１ｑに対する動態学的性質および表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）センサーグラム。図９Ａ〜Ｄは、リツキシマブ（図９Ａ）、ＲＡＩ（図９Ｂ）、ＲＡＩＩ（図９Ｃ）、およびＲＧＩＩ（図９Ｄ）のＳＰＲセンサーグラムを示す。ＳＰＲセンサーグラム解析からの詳細な動態学的値を表５に提示する。 図９Ａ〜Ｄ。リツキシマブ、ＲＡＩ、ＲＡＩＩ、ＲＧＩ、およびＲＧＩＩのＣ１ｑに対する動態学的性質および表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）センサーグラム。図９Ａ〜Ｄは、リツキシマブ（図９Ａ）、ＲＡＩ（図９Ｂ）、ＲＡＩＩ（図９Ｃ）、およびＲＧＩＩ（図９Ｄ）のＳＰＲセンサーグラムを示す。ＳＰＲセンサーグラム解析からの詳細な動態学的値を表５に提示する。 図９Ａ〜Ｄ。リツキシマブ、ＲＡＩ、ＲＡＩＩ、ＲＧＩ、およびＲＧＩＩのＣ１ｑに対する動態学的性質および表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）センサーグラム。図９Ａ〜Ｄは、リツキシマブ（図９Ａ）、ＲＡＩ（図９Ｂ）、ＲＡＩＩ（図９Ｃ）、およびＲＧＩＩ（図９Ｄ）のＳＰＲセンサーグラムを示す。ＳＰＲセンサーグラム解析からの詳細な動態学的値を表５に提示する。 図９Ａ〜Ｄ。リツキシマブ、ＲＡＩ、ＲＡＩＩ、ＲＧＩ、およびＲＧＩＩのＣ１ｑに対する動態学的性質および表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）センサーグラム。図９Ａ〜Ｄは、リツキシマブ（図９Ａ）、ＲＡＩ（図９Ｂ）、ＲＡＩＩ（図９Ｃ）、およびＲＧＩＩ（図９Ｄ）のＳＰＲセンサーグラムを示す。ＳＰＲセンサーグラム解析からの詳細な動態学的値を表５に提示する。

ＲＧＩＩのＦｃγＲＩとの結合動態学的性質および表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）センサーグラム。ＲＧＩＩの単量体ＦｃγＲＩに対する動態学的値を表６に要約する。

図１１Ａ〜Ｆ。ＲＡＩＩＩのＣ１ｑおよびＦｃγＲに対するＳＰＲ結果。図１１Ａ〜Ｆは、ＲＡＩＩＩのＳＰＲセンサーグラムを示す；Ｃ１ｑ（図１１Ａ）、単量体ＦｃγＲＩ（図１１Ｂ）、二量体ＦｃγＲＩＩａ_Ｈ１３１（図１１Ｃ）、二量体ＦｃγＲＩＩａ_Ｒ１３１（図１１Ｄ）、二量体ＦｃγＲＩＩＩａ_Ｖ１５７（図１１Ｅ）、および二量体ＦｃγＲＩＩＩａ_Ｆ１５７（図１１Ｆ）。ＳＰＲセンサーグラム解析からの詳細な動態学的値を表８に提示する。 図１１Ａ〜Ｆ。ＲＡＩＩＩのＣ１ｑおよびＦｃγＲに対するＳＰＲ結果。図１１Ａ〜Ｆは、ＲＡＩＩＩのＳＰＲセンサーグラムを示す；Ｃ１ｑ（図１１Ａ）、単量体ＦｃγＲＩ（図１１Ｂ）、二量体ＦｃγＲＩＩａ_Ｈ１３１（図１１Ｃ）、二量体ＦｃγＲＩＩａ_Ｒ１３１（図１１Ｄ）、二量体ＦｃγＲＩＩＩａ_Ｖ１５７（図１１Ｅ）、および二量体ＦｃγＲＩＩＩａ_Ｆ１５７（図１１Ｆ）。ＳＰＲセンサーグラム解析からの詳細な動態学的値を表８に提示する。 図１１Ａ〜Ｆ。ＲＡＩＩＩのＣ１ｑおよびＦｃγＲに対するＳＰＲ結果。図１１Ａ〜Ｆは、ＲＡＩＩＩのＳＰＲセンサーグラムを示す；Ｃ１ｑ（図１１Ａ）、単量体ＦｃγＲＩ（図１１Ｂ）、二量体ＦｃγＲＩＩａ_Ｈ１３１（図１１Ｃ）、二量体ＦｃγＲＩＩａ_Ｒ１３１（図１１Ｄ）、二量体ＦｃγＲＩＩＩａ_Ｖ１５７（図１１Ｅ）、および二量体ＦｃγＲＩＩＩａ_Ｆ１５７（図１１Ｆ）。ＳＰＲセンサーグラム解析からの詳細な動態学的値を表８に提示する。 図１１Ａ〜Ｆ。ＲＡＩＩＩのＣ１ｑおよびＦｃγＲに対するＳＰＲ結果。図１１Ａ〜Ｆは、ＲＡＩＩＩのＳＰＲセンサーグラムを示す；Ｃ１ｑ（図１１Ａ）、単量体ＦｃγＲＩ（図１１Ｂ）、二量体ＦｃγＲＩＩａ_Ｈ１３１（図１１Ｃ）、二量体ＦｃγＲＩＩａ_Ｒ１３１（図１１Ｄ）、二量体ＦｃγＲＩＩＩａ_Ｖ１５７（図１１Ｅ）、および二量体ＦｃγＲＩＩＩａ_Ｆ１５７（図１１Ｆ）。ＳＰＲセンサーグラム解析からの詳細な動態学的値を表８に提示する。 図１１Ａ〜Ｆ。ＲＡＩＩＩのＣ１ｑおよびＦｃγＲに対するＳＰＲ結果。図１１Ａ〜Ｆは、ＲＡＩＩＩのＳＰＲセンサーグラムを示す；Ｃ１ｑ（図１１Ａ）、単量体ＦｃγＲＩ（図１１Ｂ）、二量体ＦｃγＲＩＩａ_Ｈ１３１（図１１Ｃ）、二量体ＦｃγＲＩＩａ_Ｒ１３１（図１１Ｄ）、二量体ＦｃγＲＩＩＩａ_Ｖ１５７（図１１Ｅ）、および二量体ＦｃγＲＩＩＩａ_Ｆ１５７（図１１Ｆ）。ＳＰＲセンサーグラム解析からの詳細な動態学的値を表８に提示する。 図１１Ａ〜Ｆ。ＲＡＩＩＩのＣ１ｑおよびＦｃγＲに対するＳＰＲ結果。図１１Ａ〜Ｆは、ＲＡＩＩＩのＳＰＲセンサーグラムを示す；Ｃ１ｑ（図１１Ａ）、単量体ＦｃγＲＩ（図１１Ｂ）、二量体ＦｃγＲＩＩａ_Ｈ１３１（図１１Ｃ）、二量体ＦｃγＲＩＩａ_Ｒ１３１（図１１Ｄ）、二量体ＦｃγＲＩＩＩａ_Ｖ１５７（図１１Ｅ）、および二量体ＦｃγＲＩＩＩａ_Ｆ１５７（図１１Ｆ）。ＳＰＲセンサーグラム解析からの詳細な動態学的値を表８に提示する。

正常ヒト血清およびＣＤ２０陽性Ｒａｊｉ細胞を標的として使用した、ＩｇＧバリアントの補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）アッセイ。ＥＣ_５０値および変化倍率を表１１に示す。

正常ヒト血清およびＡＬＬ患者由来の初代細胞を使用した、ＩｇＧバリアントのＣＤＣアッセイ。各バリアントについてのカラムは、左から右に、１００ｎＭのＩｇＧ；１０ｎＭのＩｇＧ；および１ｎＭのＩｇＧを表す。

正常ヒト血清およびＣＤ２０陽性Ｒａｊｉ細胞を標的として使用した、プレインキュベートしたＩｇＧバリアントのＣ１ｑとのＣＤＣアッセイ。各ＩｇＧバリアントについてのカラムは、左から右に、１００ｎＭのＩｇＧ、１００ｎＭのＩｇＧ＋１００ｎＭのＣ１ｑ；１０ｎＭのＩｇＧ；１０ｎＭのＩｇＧ＋１０ｎＭのＣ１ｑ；１ｎＭのＩｇＧ；および１ｎＭのＩｇＧ＋１ｎＭのＣ１ｑである。

図１５Ａ〜Ｂ。ＣＤ２０陽性Ｒａｊｉ細胞を標的として、およびＰＢＭＣ（図１５Ａ）またはＰＭＮ（図１５Ｂ）を使用した、ＩｇＧバリアントのＡＤＣＣアッセイ。三角形：アイソタイプ対照；薄い灰色の四角：リツキシマブ；ひし形：ＲＡＩ；丸；ＲＡＩＩ；濃い灰色の四角：ＲＡＩＩＩ。 図１５Ａ〜Ｂ。ＣＤ２０陽性Ｒａｊｉ細胞を標的として、およびＰＢＭＣ（図１５Ａ）またはＰＭＮ（図１５Ｂ）を使用した、ＩｇＧバリアントのＡＤＣＣアッセイ。三角形：アイソタイプ対照；薄い灰色の四角：リツキシマブ；ひし形：ＲＡＩ；丸；ＲＡＩＩ；濃い灰色の四角：ＲＡＩＩＩ。

正常なヒト血液、およびＣＤ２０陽性Ｒａｊｉ細胞を標的として使用した、ＩｇＧバリアントの全血アッセイ。各ＩｇＧの濃度についてのカラムは、左から右に、アイソタイプ対照、リツキシマブ、ＲＡＩ、ＲＡＩＩ、およびＲＡＩＩＩを表す。

ＮＯＤ ＳＣＩＤ ＩＬ２Ｒ^−／−マウスにおける、Ｒａｊｉ細胞を用いた、リツキシマブおよびＲＡＩＩのｉｎ ｖｉｖｏ有効性の評価。

図１８Ａ〜Ｄ。ｐＨ６．０またはｐＨ７．４におけるＲＡＩおよびＲＡＩＩのＦｃＲｎに対するＳＰＲ結果。図１８Ａ〜Ｃは、ｐＨ６．０におけるリツキシマブ（図１８Ａ）、ＲＡＩ（図１８Ｂ）、およびＲＡＩＩ（図１８Ｃ）のＳＰＲセンサーグラムを示す。図１８Ｄは、ｐＨ７．４におけるリツキシマブ、ＲＡＩ、およびＲＡＩＩのＳＰＲセンサーグラムを示す。ＳＰＲセンサーグラム解析の詳細な動態学的値を表７に提示する。 図１８Ａ〜Ｄ。ｐＨ６．０またはｐＨ７．４におけるＲＡＩおよびＲＡＩＩのＦｃＲｎに対するＳＰＲ結果。図１８Ａ〜Ｃは、ｐＨ６．０におけるリツキシマブ（図１８Ａ）、ＲＡＩ（図１８Ｂ）、およびＲＡＩＩ（図１８Ｃ）のＳＰＲセンサーグラムを示す。図１８Ｄは、ｐＨ７．４におけるリツキシマブ、ＲＡＩ、およびＲＡＩＩのＳＰＲセンサーグラムを示す。ＳＰＲセンサーグラム解析の詳細な動態学的値を表７に提示する。 図１８Ａ〜Ｄ。ｐＨ６．０またはｐＨ７．４におけるＲＡＩおよびＲＡＩＩのＦｃＲｎに対するＳＰＲ結果。図１８Ａ〜Ｃは、ｐＨ６．０におけるリツキシマブ（図１８Ａ）、ＲＡＩ（図１８Ｂ）、およびＲＡＩＩ（図１８Ｃ）のＳＰＲセンサーグラムを示す。図１８Ｄは、ｐＨ７．４におけるリツキシマブ、ＲＡＩ、およびＲＡＩＩのＳＰＲセンサーグラムを示す。ＳＰＲセンサーグラム解析の詳細な動態学的値を表７に提示する。 図１８Ａ〜Ｄ。ｐＨ６．０またはｐＨ７．４におけるＲＡＩおよびＲＡＩＩのＦｃＲｎに対するＳＰＲ結果。図１８Ａ〜Ｃは、ｐＨ６．０におけるリツキシマブ（図１８Ａ）、ＲＡＩ（図１８Ｂ）、およびＲＡＩＩ（図１８Ｃ）のＳＰＲセンサーグラムを示す。図１８Ｄは、ｐＨ７．４におけるリツキシマブ、ＲＡＩ、およびＲＡＩＩのＳＰＲセンサーグラムを示す。ＳＰＲセンサーグラム解析の詳細な動態学的値を表７に提示する。

ＲＡＩＩＩライブラリーの富化を示すＦＡＣＳ解析ヒストグラム。１ラウンド目および４ラウンド目に、ライブラリーを発現レベルによってスクリーニングした。２ラウンド目、３ラウンド目、および５ラウンド目に、ライブラリーをＦｃγＲＩＩＩａによってスクリーニングした。

ＦＡＣＳを使用した、ＲＡＩＩＩ−Ｆｃライブラリーから単離された１０種のＩｇＧバリアントの結合解析。左側のヒストグラムは、ＦＩＴＣでの抗ｃ−ｍｙｃ ＩｇＧによる発現レベルを示す。第２のヒストグラムは、Ｃ１ｑ結合強度を示す。第３のヒストグラムは、ＦｃγＲＩＩＩａ−ＧＳＴ−ＰＥ結合強度を示す。第４のヒストグラムは、ＦｃγＲＩＩｂ−ＧＳＴ−ＰＥ結合強度を示す。平均蛍光強度を表１０に列挙する。

各抗体オプソニン化ＣＤ２０陽性Ｒａｊｉ細胞におけるＣ１ｑ結合解析。Ｃ１ｑを各抗体オプソニン化ＣＤ２０陽性Ｒａｊｉ細胞と一緒にインキュベートした後、Ｃ１ｑ結合強度を抗Ｃ１ｑ−ＦＩＴＣ抗体によって検出した。

ＲＡＩＩによるＣＤ２０陽性ＤＡＵＤＩおよびＤＢ細胞におけるＣ３ｂ沈着アッセイ。寄託されたＣ３ｂをＦＩＴＣ ｍＡｂ ７Ｃ１２（抗Ｃ３ｂマウスＩｇＧ）によって検出した。

液相補体活性化アッセイ。腫瘍細胞の非存在下での補体活性化を、Ｃ４ｄ濃度を測定することによって決定した。Ｃ４ｄ濃度をＥＬＩＳＡ（ＭｉｃｒｏＶｕｅ Ｃ４ｄ ＥＩＡ ｋｉｔ、Ｑｕｉｄｅｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＵＳ）において製造者の説明書に従って測定した。

正常ヒト血清、およびＣＤ２０陽性Ｒａｍｏｓ細胞を標的として使用した、ＩｇＧバリアントの補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）アッセイ。ＥＣ_５０値および変化倍率を表１１に示す。

図２５Ａ〜Ｄ。ＣＤ２０陽性Ｒａｊｉ細胞を標的として、およびＰＢＭＣ（図２５Ａ）もしくはＰＭＮ（図２５Ｂ）を使用した、または、ＣＤ２０陽性Ｒａｍｏｓ細胞を標的として、およびＰＢＭＣ（図２５Ｃ）もしくはＰＭＮ（図２５Ｄ）を使用した、ＩｇＧバリアントのＣＤＣＣアッセイ。ＥＣ_５０値および変化倍率を表１２に示す。 図２５Ａ〜Ｄ。ＣＤ２０陽性Ｒａｊｉ細胞を標的として、およびＰＢＭＣ（図２５Ａ）もしくはＰＭＮ（図２５Ｂ）を使用した、または、ＣＤ２０陽性Ｒａｍｏｓ細胞を標的として、およびＰＢＭＣ（図２５Ｃ）もしくはＰＭＮ（図２５Ｄ）を使用した、ＩｇＧバリアントのＣＤＣＣアッセイ。ＥＣ_５０値および変化倍率を表１２に示す。 図２５Ａ〜Ｄ。ＣＤ２０陽性Ｒａｊｉ細胞を標的として、およびＰＢＭＣ（図２５Ａ）もしくはＰＭＮ（図２５Ｂ）を使用した、または、ＣＤ２０陽性Ｒａｍｏｓ細胞を標的として、およびＰＢＭＣ（図２５Ｃ）もしくはＰＭＮ（図２５Ｄ）を使用した、ＩｇＧバリアントのＣＤＣＣアッセイ。ＥＣ_５０値および変化倍率を表１２に示す。 図２５Ａ〜Ｄ。ＣＤ２０陽性Ｒａｊｉ細胞を標的として、およびＰＢＭＣ（図２５Ａ）もしくはＰＭＮ（図２５Ｂ）を使用した、または、ＣＤ２０陽性Ｒａｍｏｓ細胞を標的として、およびＰＢＭＣ（図２５Ｃ）もしくはＰＭＮ（図２５Ｄ）を使用した、ＩｇＧバリアントのＣＤＣＣアッセイ。ＥＣ_５０値および変化倍率を表１２に示す。

ＣＤ２０陽性Ｒａｊｉ細胞を標的として、およびＭ１−マクロファージを使用した、ＩｇＧバリアントのＣＤＣＰアッセイ。ＥＣ_５０値および変化倍率を表１３に示す。

図２７Ａ〜Ｄ。ＣＤ２０陽性Ｒａｊｉ細胞を標的として、およびＰＢＭＣ（図２７Ａ）もしくはＰＭＮ（図２７Ｂ）を使用した、または、ＣＤ２０陽性Ｒａｍｏｓ細胞を標的として、およびＰＢＭＣ（図２７Ｃ）もしくはＰＭＮ（図２７Ｄ）を使用した、ＩｇＧバリアントのＣＭＣアッセイ。ＥＣ_５０値および変化倍率を表１４に示す。 図２７Ａ〜Ｄ。ＣＤ２０陽性Ｒａｊｉ細胞を標的として、およびＰＢＭＣ（図２７Ａ）もしくはＰＭＮ（図２７Ｂ）を使用した、または、ＣＤ２０陽性Ｒａｍｏｓ細胞を標的として、およびＰＢＭＣ（図２７Ｃ）もしくはＰＭＮ（図２７Ｄ）を使用した、ＩｇＧバリアントのＣＭＣアッセイ。ＥＣ_５０値および変化倍率を表１４に示す。 図２７Ａ〜Ｄ。ＣＤ２０陽性Ｒａｊｉ細胞を標的として、およびＰＢＭＣ（図２７Ａ）もしくはＰＭＮ（図２７Ｂ）を使用した、または、ＣＤ２０陽性Ｒａｍｏｓ細胞を標的として、およびＰＢＭＣ（図２７Ｃ）もしくはＰＭＮ（図２７Ｄ）を使用した、ＩｇＧバリアントのＣＭＣアッセイ。ＥＣ_５０値および変化倍率を表１４に示す。 図２７Ａ〜Ｄ。ＣＤ２０陽性Ｒａｊｉ細胞を標的として、およびＰＢＭＣ（図２７Ａ）もしくはＰＭＮ（図２７Ｂ）を使用した、または、ＣＤ２０陽性Ｒａｍｏｓ細胞を標的として、およびＰＢＭＣ（図２７Ｃ）もしくはＰＭＮ（図２７Ｄ）を使用した、ＩｇＧバリアントのＣＭＣアッセイ。ＥＣ_５０値および変化倍率を表１４に示す。

図２８Ａ〜Ｂ。ＴＭＤ８（図２８Ａ）またはおよびＨＢＬ−１（図２８Ｂ）におけるＦｃγＲＩＩｂ媒介性内部移行アッセイ。腫瘍細胞と一緒に０時間、２時間、４時間、および６時間インキュベートした後、腫瘍細胞表面に結合した抗体を抗ヒトＦｃ−ＦＩＴＣによって検出した。 図２８Ａ〜Ｂ。ＴＭＤ８（図２８Ａ）またはおよびＨＢＬ−１（図２８Ｂ）におけるＦｃγＲＩＩｂ媒介性内部移行アッセイ。腫瘍細胞と一緒に０時間、２時間、４時間、および６時間インキュベートした後、腫瘍細胞表面に結合した抗体を抗ヒトＦｃ−ＦＩＴＣによって検出した。

Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスにおけるアナフィラキシーアッセイ。熱凝集した抗体をマウス（ｎ＝３）に注射し、５分毎に深部体温を検出した。

ヌードマウスにおける、Ｒａｍｏｓ細胞を用いた、ＲＡＩＩのｉｎ ｖｉｖｏ有効性の評価。

（例示的な実施形態の説明）
Ｃ１ｑへの改善された結合を呈する操作された抗体Ｆｃドメインを有するポリペプチドが関与する方法および組成物が、本明細書に提供されている。かかるポリペプチドは、ネイティブＦｃドメイン（配列番号１）と比較して１個または複数の置換を含む、非グリコシル化Ｆｃドメインを含むことができる。その上、一部のＦｃドメインは、Ｃ１ｑに、またはＣ１ｑおよびある特定のＦｃ受容体に選択的に結合することができるが、他のＦｃ受容体には結合しない。例えば、ポリペプチドは、Ｃ１ｑに選択的に結合するが、いかなるＦｃγＲにも検出可能に結合しない非グリコシル化Ｆｃドメインを含むことができる。Ｃ１ｑおよび活性化ＦｃγＲに選択的に結合するが、阻害性ＦｃγＲＩＩｂには検出可能に結合しない非グリコシル化Ｆｃドメインを含む、別のポリペプチドを提供することができる。Ｃ１ｑおよび活性化ＦｃγＲの一部または全てに選択的に結合するが、阻害性ＦｃγＲＩＩＢには検出可能に結合しないグリコシル化されたＦｃドメインを含む、さらに別のポリペプチドを提供することができる。さらに、改変された非グリコシル化抗体を使用して、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）および抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を促進するための方法および組成物が提供される。

Ｉ．補体依存性細胞傷害
抗体が、認識した標的細胞を死滅させる重要な機構の１つは、補体系のタンパク質の動員および活性化によるものである。病原性細胞に対する免疫複合体は、抗体分子のＦｃドメインに結合する補体タンパク質Ｃ１ｑによって認識される。病原性細胞に結合された抗体のＦｃドメインおよびＣ１ｑの間の複合体は、補体膜侵襲複合体（ＭＡＣ）により直接、または細胞表面に補体分子Ｃ３ｂを沈着させ、次いでこれが、病原性細胞に破壊の「合図を出す（flag）」ことにより細胞を死滅させる、生化学的反応のカスケードを活性化する。抗体が、補体活性化により病原性細胞を死滅させるプロセスは、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）と呼ばれる。

ＣＤＣの効力は、Ｃ１ｑに結合する抗体の能力に依存する。続いてこの能力は、抗体のＦｃドメインおよびＣ１ｑの間の相互作用に依存する。この相互作用は通常、Ｆｃポリペプチドに付加された単一の糖鎖が除去された場合、すなわち、非グリコシル化（ａｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ）抗体において、完全に消失される。

しかし、タンパク質工学を使用して、Ｃ１ｑに結合するだけではなく、ヒトグリコシル化Ｆｃ対応物よりもはるかに高い親和性でＣ１ｑに結合するＦｃドメインを作製した。さらにより注目すべきことには、このＦｃドメインは、Ｃ１ｑに特異的である。通常、ＩｇＧ Ｆｃドメインは、白血球の表面における種々のＦｃ受容体タンパク質に結合する。ＦｃドメインとのＦｃ受容体の結合は、病原性細胞のクリアランスに一般に役立つ、免疫学的効果をもたらす一連のシグナル伝達事象を誘発する。しかし、例えば、隣接する細胞におけるＦｃ受容体への、がん細胞の表面における抗体分子の結合が、がん細胞表面分子のクラスター形成と、続いて増殖するようにがん細胞へとシグナル伝達を媒介する場合など、Ｆｃ受容体の会合が有害であることがある。よって、Ｆｃ受容体に結合することなく、ＣＤＣによりがん細胞死滅のみを誘導することができるＦｃドメインは、ある特定の抗体薬物の治療効力を大幅に増強することができる。

ＩＩ．抗体Ｆｃドメイン
ある特定の実施形態では、ネイティブまたは野生型タンパク質と比べて改変されたタンパク質性分子を含む組成物が存在する。一部の実施形態では、このタンパク質性化合物は、アミノ酸残基が欠失されている；他の実施形態では、タンパク質性化合物のアミノ酸残基は、置き換えられている；一方、なおさらなる実施形態では、タンパク質性化合物におけるアミノ酸残基の欠失および置き換えの両方がなされている。さらに、タンパク質性化合物は、２個以上のポリペプチド実体を含むアミノ酸分子を含むことができる。本明細書において使用する場合、「タンパク質性分子」、「タンパク質性組成物」、「タンパク質性化合物」、「タンパク質性鎖」または「タンパク質性材料」は、約２００アミノ酸を超えるタンパク質もしくは遺伝子から翻訳された全長内在性配列；１００アミノ酸もしくはそれを超えるポリペプチド；および／または３〜１００アミノ酸のペプチドを一般に指すが、これらに限定されない。上述のあらゆる「タンパク質性」用語は、本明細書において互換的に使用することができる；しかし、実施形態が、ポリペプチド等、特定の種類のタンパク質性化合物に限定され得ることが特に企図される。さらに、これらの用語は、融合タンパク質またはタンパク質コンジュゲートにも同様に適用することができる。タンパク質は、２個以上のポリペプチドを含むことができる。例えば、ＩｇＧ抗体は、ジスルフィド結合により互いに繋がれた２本の重鎖ポリペプチドおよび２本の軽鎖ポリペプチドを有する。

本明細書において使用する場合、タンパク質またはペプチドは、約２００アミノ酸を超えるタンパク質から、遺伝子から翻訳された全長配列まで；約１００アミノ酸を超えるポリペプチド；および／または約３〜約１００アミノ酸のペプチドを一般に指すが、これらに限定されない。便宜上、用語「タンパク質」、「ポリペプチド」および「ペプチド」は、本明細書において互換的に使用される。

本明細書において使用する場合、「アミノ酸残基」は、当業者に公知であろういずれかのアミノ酸、アミノ酸誘導体またはアミノ酸模倣物を指す。ある特定の実施形態では、タンパク質性分子の残基は、アミノ酸残基の配列を中断するいかなる非アミノ酸残基も含まず連続的である。他の実施形態では、配列は、１個または複数の非アミノ酸部分を含むことができる。特定の実施形態では、タンパク質性分子の残基の配列は、１個または複数の非アミノ酸部分で中断されていてよい。

本明細書において使用する場合、「別個のＦｃドメイン」は、別のＦｃと僅か１個のアミノ酸が異なるドメインとして規定することができる。別個の抗体Ｆｃドメインまたは抗体をコードする核酸のライブラリーを作製するための方法は、本技術分野で周知である。例えば、場合によっては、Ｆｃドメインは、エラープローンＰＣＲによって増幅することができる。さらに、ある特定の事例において、複数の抗体Ｆｃドメインは、ランダム化されたひと続き（１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個またはそれを超える）のアミノ酸を含むことができる。ある特定の事例において、特異的変異が、Ｆｃドメインに操作され得る。例えば、一部の態様では、抗体Ｆｃドメインにおける正常にグリコシル化された残基が変異されていてよい。さらに、ある特定の態様では、正常にグリコシル化された残基（または隣接する残基）は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個またはそれを超えるアミノ酸の挿入のための部位として使用することができる。

ポリペプチドは、ＦｃＲポリペプチドに結合することができる非グリコシル化抗体Ｆｃドメインを含むことができる。一部の態様では、非グリコシル化Ｆｃドメインは、生理的条件下でＦｃＲポリペプチドに特異的な親和性を有するとさらに規定することができる。例えば、Ｆｃドメインは、生理的条件下で約１０^−６Ｍ〜約１０^−９Ｍの間の平衡解離定数を有することができる。さらに、一部の態様では、非グリコシル化Ｆｃドメインは、ヒト野生型配列等の野生型配列と比べて、１個または複数のアミノ酸置換または挿入を含むと規定することができる。

かかるポリペプチドを調製する手段は、参照により本明細書に組み込むＰＣＴ公開ＷＯ２００８／１３７４７５に記される手段を含む。あるいは、例えば、公知のＦｃバックグラウンドに選択されたアミノ酸置換または挿入を導入することによる等、遺伝子工学技法によって直接的にかかるポリペプチドを調製することができ、挿入または置換は、上に記す通り、非グリコシル化Ｆｃ領域に改善されたＦｃＲ結合能をもたらす。一部の実施形態では、Ｆｃドメインは、１種または複数の特異的なＦｃ受容体に結合するように操作されている。その上またはそれに代えて、Ｆｃドメインは、１種または複数の特異的なＦｃ受容体に特異的に結合しないように、操作され得る。

一部の実施形態では、非グリコシル化Ｆｃドメインは、ヒトＦｃγＲＩａ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩｃ、ＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩＩＩｂ、ＦｃαＲＩ等のＦｃＲにまたはＣ１ｑに特異的な結合親和性を含む。よって、一部の態様では、本発明の非グリコシル化Ｆｃドメインは、Ｃ１ｑに特異的な親和性を有するＦｃドメインとして規定される。他の態様では、本発明の非グリコシル化Ｆｃドメインは、Ｃ１ｑおよび活性化Ｆｃ受容体に特異的な親和性を有するが、阻害性ＦｃγＲＩＩｂに対する親和性がないＦｃドメインとして規定される。抗体Ｆｃまたは他の結合タンパク質の結合親和性は、例えば、MunsonおよびPollard（１９８０年）のスキャッチャード（Scatchard）解析によって決定することができる。あるいは、結合親和性は、表面プラズモン共鳴またはタンパク質：タンパク質相互作用の動態および平衡定数を決定するための他のいずれかの周知の方法によって決定することができる。

野生型Ｆｃ（配列番号１）と比べて示す変化と共に、Ｃ１ｑに特異的な親和性を有する単離されたＩｇＧバリアントのＦｃドメインのアミノ酸配列を次に示す：Ｆｃ７０１（配列番号２；Ｄ２７０Ｈ；Ｅ３８２Ｖ；Ｍ４２８Ｉ；Ｌ４４３Ｐ；Ｓ４４４Ｖ）、Ｆｃ７０２（配列番号３；Ｌ３５１Ｑ）、Ｆｃ７０３（配列番号４；Ｅ２３３Ｌ；Ｇ２３６Ｅ；Ｖ２４０Ａ；Ｆ２７５Ｙ；Ｖ３０３Ａ；Ｌ３５１Ｑ）、Ｆｃ７０４（配列番号５；Ｅ２３３Ｌ；Ｇ２３６Ｅ；Ｖ２４０Ａ；Ｆ２７５Ｙ；Ｖ３０３Ａ）、Ｆｃ７０５（配列番号６；Ｇ２３７Ｖ；Ｅ３１８Ｇ；Ｌ３２８Ｐ；Ｉ３３６Ｆ；Ｓ３３７Ｌ；Ｋ３３８Ｓ；Ａ３３９Ｖ；Ｋ３４０Ｌ；Ｇ３４１Ｒ Ｑ３４２Ｌ；Ｒ３４４Ｌ；Ｒ３５５Ｑ；Ｄ３５６Ｇ）、Ｆｃ８０１（配列番号７；Ｋ３２０Ｅ；Ｑ３８６Ｒ）、Ｆｃ７０７（配列番号８；Ｌ２５１Ｆ；Ｖ２６２Ｍ；Ｓ２６７Ｇ；Ｐ２９１Ｓ；Ｉ３３６Ｌ；Ｓ３３７Ａ；Ｋ３３８Ｈ；Ｋ３４０Ｒ；Ｑ３４２Ｐ；Ｌ３６８Ｐ；Ｆ３７２Ｌ；Ｗ３８１Ｒ；Ｎ４２１Ｓ）、Ｆｃ７０８（配列番号９；Ｌ３０９Ｑ；Ｌ３２８Ｐ；Ｌ３６８Ｐ；Ｈ４２９Ｌ；Ｅ４３０Ｇ）、Ｆｃ８０２（配列番号１０；Ｌ２３５Ｋ；Ｇ２３６Ｍ；Ｇ２３７Ｒ；Ｌ３５１Ｑ）、Ｆｃ７１０（配列番号１１；Ｌ２３４Ｉ；Ｌ２３５Ｖ；Ｓ２６７Ｇ；Ｋ３３８Ｉ；Ｋ３４０Ｒ；Ｑ３４２Ｐ；Ｆ４０４Ｓ；Ｋ４３９Ｒ）、Ｆｃ７１１（配列番号１２；Ｄ２７０Ｇ；Ｉ３３６Ｒ；Ｋ３４０Ｒ；Ｑ３４２Ｐ；Ｒ３４４Ｌ；Ｅ３４５Ｄ；Ｒ４１６Ｇ）、およびＦｃ７１２（配列番号１３；Ｅ３８２Ｖ；Ｍ４２８Ｉ）。

野生型Ｆｃ（配列番号１）と比べて示す変化と共に、Ｃ１ｑおよび活性化Ｆｃ受容体に特異的な親和性を有するが、阻害性ＦｃγＲＩＩｂに対する親和性がない単離されたＩｇＧバリアントのＦｃドメインのアミノ酸配列を次に示す：Ｆｃ７１３（配列番号１４；Ｅ２３３Ｄ；Ｌ２３４Ｙ；Ｌ２３５Ｑ；Ｇ２３６Ｋ；Ｇ２３７Ｒ；Ｔ２５０Ａ；Ｉ２５３Ｖ；Ｄ２６５Ｇ；Ｈ２８５Ｌ；Ｎ２９７Ｓ；Ｋ３３８Ｐ；Ａ３３９Ｙ；Ｇ３４１Ｒ；Ｑ３４２Ｋ；Ｅ３４５Ａ；Ｋ３６０Ｒ；Ｑ４１８Ｒ；Ｔ４３７Ａ）、Ｆｃ７１４（配列番号１５；Ｅ２３３Ｄ；Ｌ２３４Ｙ；Ｌ２３５Ｑ；Ｇ２３６Ｋ；Ｇ２３７Ｒ；Ｉ２５３Ｖ；Ｎ２９７Ｓ；Ｋ３３８Ｐ；Ａ３３９Ｙ；Ｇ３４１Ｒ；Ｑ３４２Ｋ；Ｅ３４５Ａ；Ｋ３６０Ｒ）、Ｆｃ７１５（配列番号１６；Ｅ２３３Ｄ；Ｌ２３４Ｙ；Ｌ２３５Ｑ；Ｇ２３６Ｋ；Ｇ２３７Ｒ；Ｐ２３８Ｌ；Ｉ２５３Ｖ；Ｄ２７０Ｎ；Ｔ３０７Ｐ；Ｎ３１５Ｉ；Ｌ３２８Ｐ；Ｑ３４２Ｈ；Ｔ３５０Ｐ；Ｖ３７９Ａ；Ｅ３８８Ｇ；Ｑ４１９Ｒ）、Ｆｃ７１６（配列番号１７；Ｅ２３３Ｄ；Ｌ２３４Ｙ；Ｌ２３５Ｑ；Ｇ２３６Ｋ；Ｇ２３７Ｒ；Ｉ２５３Ｖ；Ｋ３２６Ｒ；Ｆ３７２Ｃ；Ｄ４０１Ｇ；Ｆ４０４Ｌ；Ｌ４０６Ｆ；Ｋ４１４Ｒ；Ｙ４３６Ｃ）、Ｆｃ７１７（配列番号１８；Ｅ２３３Ｇ；Ｌ２３４Ｐ；Ｌ２３５Ｐ；Ｇ２３６Ｒ）、Ｆｃ７１９（配列番号１９；Ｌ２３５Ｍ；Ｇ２３６Ｗ；Ｇ２３７Ｒ；Ｖ２４０Ｉ；Ｖ２６３Ｍ；Ｋ２９０Ｅ；Ｓ３２４Ｐ；Ｔ３５０Ａ；Ｃ４２５Ｙ）、Ｆｃ８０３（配列番号２０；Ｔ２９９Ｋ；Ｓ３５４Ｐ；Ｐ４４５Ｓ）、Ｆｃ７２０（配列番号２１；Ｍ２５２Ｖ；Ｎ３１５Ｓ；Ｉ３３６Ｍ；Ｋ３４０Ｒ；Ｑ３４２Ｄ）、Ｆｃ８０５（配列番号２２；Ｖ３０８Ａ；Ｓ３３７Ｐ；Ｋ３３８Ｑ；Ｋ３４０Ｒ；Ｑ３４２Ｐ；Ｒ３４４Ｇ；Ｅ３４５Ｙ；Ｆ３７２Ｌ）、Ｆｃ７２２（配列番号２３；Ｇ２３６Ｗ；Ｇ２３７Ｌ；Ｖ２８４Ｅ；Ｉ３３２Ｖ；Ｉ３３６Ａ；Ｋ３４０Ｅ；Ｐ３４３Ｌ；Ｒ３４４Ｓ；Ｔ３９４Ｐ）、Ｆｃ−Ｖ１（配列番号３６；Ｍ２５２Ｖ）、Ｆｃ−Ｖ１１（配列番号３７；Ｋ２４６Ｎ；Ｋ３２２Ｅ；Ｇ４０２Ｄ）、Ｆｃ−Ｖ１２（配列番号３８；Ｆ２４２Ｌ；Ｎ３１５Ｓ；Ｉ３３６Ｍ；Ｋ３４０Ｒ；Ｑ３４２Ｄ；Ａ３７８Ｔ；Ｑ３８６Ｒ）；Ｆｃ−Ｖ１５（配列番号３９；Ｋ３３４Ｅ；Ｌ３５１Ｑ；Ｎ４２１Ｄ）；Ｆｃ−Ｖ１７（配列番号４０；Ｇ３４１Ａ；Ｌ３５１Ｑ）；Ｆｃ−Ｖ１８（配列番号４１；Ｍ２５２Ｖ；Ｇ３４１Ａ；Ｌ３５１Ｑ）；Ｆｃ−Ｖ１９（配列番号４２；Ｋ２４６Ｑ；Ｔ２６０Ａ；Ｎ３１５Ｓ；Ｑ３８６Ｒ）；Ｆｃ−Ｖ２３（配列番号４３；Ｋ２４６Ｎ；Ｍ２５２Ｖ；Ｋ３２２Ｅ；Ｒ３４４Ｇ；Ｅ３４５Ｙ；Ｆ３７２Ｌ）；Ｆｃ−Ｖ２４（配列番号４４；Ｆ２４２Ｌ；Ｍ２５２Ｖ；Ｋ３３８Ｑ；Ｇ３４１Ａ；Ｅ３４５Ｙ）；およびＦｃ−Ｖ２６（配列番号４５；Ｋ３３４Ｅ；Ｇ４０２Ｄ；Ｋ３３８Ｑ；Ｑ３４２Ｐ；Ｒ３４４Ｇ；Ｅ３４５Ｙ；Ｆ３７２Ｌ）。

本明細書において使用される「ポジション」とは、タンパク質の配列中の位置を意味する。ポジションは、連続的に、または確立されたフォーマット、例えば、抗体ナンバリングのためのＥＵ指標に従ってナンバリングすることができる。

本発明に記す全ポジションに関して、ナンバリングは、ＥＵ指標に従う。「ＥＵ指標」または「ＫａｂａｔにおけるＥＵ指標」または「ＥＵナンバリングスキーム」は、ＥＵ抗体のナンバリングを指す（Edelmanら、１９６９年；Kabatら、１９９１年；どちらもその全体を参照により本明細書に組み込む）。よって、配列番号１に提示する配列のポジション１は、ＫａｂａｔにおけるＥＵ指標のポジション２３１に対応する。

ある特定の実施形態では、少なくとも１種のＦｃポリペプチドタンパク質性分子のサイズは、約または少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２７５、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００またはそれを超えるアミノ分子残基、およびそこから導くことができるいずれかの範囲を含むことができるがこれらに限定されない。化合物は、配列番号１（ヒトＩｇＧ Ｆｃポリペプチド）または配列番号２〜２３由来の上述の数の連続アミノ酸を含むことができ、これらは、配列番号１（下に記す）に対しパーセント同一性または相同性を有するとさらに認定することができる。

Ａ．改変されたタンパク質およびポリペプチド
一部の実施形態は、改変されたタンパク質およびポリペプチド、特に、無改変バージョンに匹敵する少なくとも１種の機能活性を示す改変されたタンパク質またはポリペプチドに関係し、さらに、改変されたタンパク質またはポリペプチドは、ＣＤＣを誘発すること、産生がより容易もしくはより安価であること、より少ない副作用を誘発すること、および／またはより優れたもしくはより長い有効性もしくはバイオアベイラビリティを有すること等、無改変バージョンを上回る追加的な利点を保有する。よって、本願が、「改変されたタンパク質」または「改変されたポリペプチド」の機能または活性について言う場合、当業者であれば、これが、例えば、１）無改変タンパク質またはポリペプチドと同じ活性のうち少なくとも１種を実行する、または同じ特異性のうち少なくとも１種を有するが、別の活性または特異性の異なるレベルを有することができ；２）無改変タンパク質またはポリペプチドを上回る追加的な利点を保有する、タンパク質またはポリペプチドを含むことを理解するであろう。活性の決定は、特に、タンパク質の活性に関する、当業者によく知られたアッセイを使用して達成することができ、比較目的で、例えば、改変または無改変タンパク質またはポリペプチドのいずれかのネイティブおよび／または組換えバージョンの使用を含むことができる。「改変されたタンパク質」に関係する実施形態を、「改変されたポリペプチド」に関して実行することができ、逆もまた同じであることが特に企図される。本明細書に記す改変されたタンパク質およびポリペプチドに加えて、実施形態は、特に参照により本明細書に組み込むＰＣＴ公開ＷＯ２００８／１３７４７５に記載されているドメイン、ポリペプチドおよびタンパク質が関与することができる。

改変されたタンパク質は、アミノ酸の欠失および／または置換を保有することができ；よって、欠失を有するタンパク質、置換を有するタンパク質ならびに欠失および置換を有するタンパク質は、改変されたタンパク質である。一部の実施形態では、これらの改変されたタンパク質は、例えば、融合タンパク質またはリンカーを有するタンパク質による等、挿入または付加されたアミノ酸をさらに含むことができる。これは、標的化ペプチドもしくはポリペプチドまたは単に単一残基の挿入を含むことができる。融合タンパク質と呼ばれる末端付加については、下に記す。

「改変された欠失されたタンパク質」は、ネイティブタンパク質の１個または複数の残基を欠くが、ネイティブタンパク質の特異性および／または活性を保有する。「改変された欠失されたタンパク質」は、低下した免疫原性または抗原性を有することもできる。改変された欠失されたタンパク質の例は、少なくとも１種の抗原性領域（すなわち、改変されたタンパク質を投与され得る生物の種類等、特定の生物において抗原性であると決定されたタンパク質の領域）からアミノ酸残基を欠失したタンパク質である。

置換または置き換えバリアントは典型的には、タンパク質内の１個または複数の部位においてあるアミノ酸から別のアミノ酸への交換を含有し、ポリペプチドの１種または複数の特性、特に、そのエフェクター機能および／またはバイオアベイラビリティをモジュレートするように設計することができる。置換は、保存的であってもそうでなくてもよい、つまり、あるアミノ酸が、同様の形状および電荷のアミノ酸に置き換えられる。保存的置換は、本技術分野で周知であり、例えば、次の変化を含む：アラニンからセリン；アルギニンからリシン；アスパラギンからグルタミンまたはヒスチジン；アスパラギン酸からグルタミン酸；システインからセリン；グルタミンからアスパラギン；グルタミン酸からアスパラギン酸；グリシンからプロリン；ヒスチジンからアスパラギンまたはグルタミン；イソロイシンからロイシンまたはバリン；ロイシンからバリンまたはイソロイシン；リシンからアルギニン；メチオニンからロイシンまたはイソロイシン；フェニルアラニンからチロシン、ロイシンまたはメチオニン；セリンからスレオニン；スレオニンからセリン；トリプトファンからチロシン；チロシンからトリプトファンまたはフェニルアラニン；およびバリンからイソロイシンまたはロイシン。

用語「生物学的に機能的等価」は、本技術分野で十分に理解されており、本明細書で詳細にさらに規定されている。したがって、タンパク質の生物学的活性が維持されるのであれば、ネイティブポリペプチドのアミノ酸と同一または機能的に等価なアミノ酸の約７０％〜約８０％の間または約８１％〜約９０％の間またはさらには約９１％〜約９９％の間を有する配列が含まれる。改変されたタンパク質は、そのネイティブ対応物と生物学的に機能的に等価であり得る。

配列が、タンパク質発現が関係する生物学的タンパク質活性の維持を含む、上に表記されている基準を満たす限りにおいて、アミノ酸および核酸配列が、追加的なＮもしくはＣ末端アミノ酸または５’もしくは３’配列等、追加的な残基を含み、依然として基本的に、本明細書に開示されている配列の１種に表記される通りのものであることも理解されるであろう。末端配列の付加は、特に、例えば、コード領域の５’もしくは３’部分のいずれかに隣接する様々な非コード配列を含むことができる、または様々な内部配列、すなわち、遺伝子内で生じることが公知のイントロンを含むことができる、核酸配列に適用される。

次に、等価なまたはさらには改善された第二世代分子を作製するためのタンパク質のアミノ酸の変化に基づく記述を示す。例えば、ある特定のアミノ酸は、例えば、基質分子への結合部位等の構造との相互作用的結合能の認識できる損失を伴いまたは伴うことなく、タンパク質構造における他のアミノ酸に代えて置換することができる。タンパク質の生物学的機能活性を規定するのは、そのタンパク質の相互作用的能力および性質であるため、タンパク質配列およびその根底にあるＤＮＡコード配列においてある特定のアミノ酸置換をなすことができ、そうであるにもかかわらず、同様の特性を有するタンパク質を産生することができる。よって、下に記す通り、その生物学的有用性または活性の認識できる損失を伴うことなく、遺伝子のＤＮＡ配列において様々な変化をなすことができることが企図される。次の「相同性基準」のうち１つが満たされる場合、タンパク質性分子は、第２のタンパク質性分子と「相同性」を有する、またはそれと「相同」であると考慮される：１）タンパク質性分子の少なくとも３０％が、第２のタンパク質性分子と同じポジションにおいて配列同一性を有する；２）第２のタンパク質性分子と同じポジションにおいてある程度の配列同一性があり、非同一残基において、その少なくとも３０％が、第２のタンパク質性分子に対して、本明細書に記載されている保存的な差である；または３）タンパク質性分子の少なくとも３０％が、第２のタンパク質性分子と配列同一性を有するが、同一残基の間に非同一残基のギャップがあり得る。本明細書において使用する場合、用語「相同」は、分子全体の代わりに、タンパク質性分子の領域に等しく適用することができる。用語「相同性」または「相同」が、数、例えば、「５０％相同性」または「５０％相同」によって認定される場合、１）、２）および３）に関する相同性基準は、「少なくとも３０％」から「少なくとも５０％」に調整される。よって、２種のタンパク質性分子またはタンパク質性分子の部分の間に、少なくとも３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％またはそれを超える相同性が存在し得ることが企図される。

あるいは、改変されたポリペプチドは、配列番号１〜２３のいずれかを含む、無改変ポリペプチドまたは本明細書に開示されているいずれかのポリペプチド配列に対し、ある特定のパーセンテージの同一性を有すると特徴付けることができる。パーセンテージ同一性は、２種のタンパク質性分子またはタンパク質性分子の部分の間で、多くてもまたは少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％（またはそこから導くことができるいずれかの範囲）であり得る。上に記す同一性のパーセンテージが、ポリペプチドの無改変領域と比較して、ポリペプチドの特定の領域に関係し得ることが企図される。例えば、ポリペプチドは、同じ種由来の無改変または変異体Ｆｃドメインに対する改変されたまたは変異体Ｆｃドメインのアミノ酸配列の同一性に基づき特徴付けされ得る改変されたまたは変異体Ｆｃドメインを含有することができる。例えば、無改変Ｆｃドメインに対し９０％同一性を有すると特徴付けされた改変されたまたは変異体ヒトＦｃドメインは、そのドメインにおけるアミノ酸の９０％が、無改変ヒトＦｃドメイン（配列番号１）におけるアミノ酸と同一であることを意味する。

かかる変化を生じる際に、アミノ酸の疎水性親水性指標（ｈｙｄｒｏｐａｔｈｉｃ ｉｎｄｅｘ）を考慮することができる。タンパク質における相互作用的生物学的機能の付与における疎水性親水性アミノ酸指標の重要性は、本技術分野で一般に理解される（KyteおよびDoolittle、１９８２年）。アミノ酸の相対的疎水性親水性特徴が、その結果得られるタンパク質の二次構造に寄与し、続いてこれが、他の分子、例えば、酵素、基質、受容体、ＤＮＡ、抗体、抗原等とのタンパク質の相互作用を規定することが受け入れられる。

本技術分野において、同様のアミノ酸の置換を親水性に基づいて有効になすことができることも理解される。参照により本明細書に組み込む米国特許第４，５５４，１０１号は、その隣接アミノ酸の親水性によって支配されるタンパク質の最大局所的平均親水性が、タンパク質の生物学的特性と相関することを記述する。米国特許第４，５５４，１０１号に詳述される通り、次の親水性値がアミノ酸残基に割り当てられた：アルギニン（＋３．０）；リシン（＋３．０）；アスパラギン酸（＋３．０±１）；グルタミン酸（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；スレオニン（−０．４）；プロリン（−０．５±１）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）；トリプトファン（−３．４）。あるアミノ酸を、同様の親水性値を有する別のアミノ酸に代えて置換し、生物学的に等価かつ免疫学的に等価なタンパク質を依然として産生することができることが理解される。かかる変化において、その親水性値が±２以内であるアミノ酸の置換が好ましく、±１以内であるものが特に好ましく、±０．５以内であるものがさらにより特に好ましい。

上に概要を述べる通り、アミノ酸置換は一般に、アミノ酸側鎖置換基、例えば、その疎水性、親水性、電荷、サイズ等の相対的類似性に基づく。様々な前述の特徴を考慮に入れる例示的な置換は、当業者に周知であり、次のものを含む：アルギニンおよびリシン；グルタミン酸およびアスパラギン酸；セリンおよびスレオニン；グルタミンおよびアスパラギン；ならびにバリン、ロイシンおよびイソロイシン。

Ｂ．異種領域により改変された抗体およびタンパク質性化合物
Ｆｃドメインが単離されると、分子を少なくとも１種の作用物質に連結して、この分子の有用性を増強するためのコンジュゲートを形成することが望ましいことがある。例えば、診断または治療用作用物質としてのＦｃドメインまたは抗体分子の有効性を増加させるために、従来、少なくとも１種の所望の分子または部分を連結または共有結合または複合体形成させる。かかる分子または部分は、少なくとも１種のエフェクターまたはレポーター分子であってよいがこれらに限定されない。エフェクター分子は、所望の活性、例えば、細胞傷害活性を有する分子を含む。抗体に取り付けられたエフェクター分子の非限定例として、毒素、抗腫瘍剤、治療用酵素、放射標識ヌクレオチド、抗ウイルス剤、キレート剤、サイトカイン、増殖因子およびオリゴまたはポリヌクレオチドが挙げられる。対照的に、レポーター分子は、アッセイを使用して検出され得るいずれかの部分として規定される。抗体にコンジュゲートされたレポーター分子の非限定例として、酵素、放射標識、ハプテン、蛍光標識、リン光分子、化学発光分子、発色団、発光分子、光親和性分子、着色粒子またはビオチン等のリガンドが挙げられる。別のかかる例は、細胞傷害性または抗細胞剤に連結された抗体を含むコンジュゲートの形成であり、「免疫毒素」と命名することができる。かかる分子を標識するための技法は、当業者に公知であり、本明細書に上述されている。

次いで、本発明に従って調製されたＦｃドメイン等、標識されたタンパク質を、例えば、タンパク質（単数または複数）、ポリペプチド（単数または複数）またはペプチド（単数または複数）等、生物学的構成成分を結合、精製、除去、定量化および／または他の仕方で一般に検出するための免疫検出方法において用いることもできる。一部の免疫検出方法は、いくつか挙げると、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、免疫放射線アッセイ、フルオロイムノアッセイ、化学発光アッセイ、生物発光アッセイおよびウエスタンブロットを含む。様々な有用な免疫検出方法のステップは、例えば、それぞれ参照により本明細書に組み込むDoolittleおよびBen-Zeev、１９９９年；GulbisおよびGaland、１９９３年；ならびにDe Jagerら、１９９３年等、科学文献に記載されている。

抗体を含むＦｃドメイン分子は、例えば、免疫組織化学検査（ＩＨＣ）による研究のために調製された新鮮凍結したおよび／またはホルマリン固定し、パラフィン包埋した組織ブロックの両方と併せて使用することができる。このような粒子状検体から組織ブロックを調製する方法は、様々な予後因子の以前のＩＨＣ研究において首尾よく使用された、および／または当業者に周知である（Abbondanzoら、１９９０年）。

一部の実施形態は、２種以上の天然起源またはネイティブポリペプチドまたはタンパク質由来のアミノ酸配列を含むことができるＦｃポリペプチドタンパク質性化合物に関係する。上に記す実施形態は、本セクションへの適用が企図され、逆もまた同じである。例えば、改変された抗体は、抗原結合ドメインを有する改変されたＦｃドメインを含有する抗体である。さらに、抗体は、２本の重鎖のそれぞれにおける異なる領域等、２個の異なる抗原結合領域を有することができる。それに代えてまたはその上、一部の実施形態では、複数の異種ペプチドおよび／またはポリペプチドを含むポリペプチドが存在する（「異種」は、これらが同じポリペプチドに由来しないことを意味する）。タンパク質性化合物または分子は、例えば、抗体に由来しないタンパク質結合領域を有する改変されたＦｃドメインを含むことができる。一部の実施形態では、細胞表面受容体に結合するタンパク質結合領域を有する改変されたＦｃドメインを含むポリペプチドが存在する。複数の機能ドメインを含むこれらのタンパク質性分子は、互いに化学的にコンジュゲートされた２個もしくはそれを超えるドメインであり得る、または同じ核酸分子によってコードされた２個もしくはそれを超えるポリペプチドの融合タンパク質であり得る。タンパク質またはポリペプチドが、２個またはそれを超える異種ポリペプチドの全体または部分を含むことができることが企図される。

よって、マルチポリペプチドタンパク質性化合物は、第１のポリペプチドの全体または部分と、第２のポリペプチド、第３のポリペプチド、第４のポリペプチド、第５のポリペプチド、第６のポリペプチド、第７のポリペプチド、第８の（eight）ポリペプチド、第９のポリペプチド、第１０のポリペプチドまたはさらに高次のポリペプチドの全体または部分とで構成され得る。

選択的に切断可能なリンカー、合成リンカーまたは他のアミノ酸配列等、アミノ酸を使用して、タンパク質性部分を分離することができる。

抗体の抗原結合ドメインまたは領域および非グリコシル化Ｆｃドメインを有するポリペプチドまたはタンパク質（抗体を含む）は、次の標的リストに属するタンパク質、サブユニット、ドメイン、モチーフおよび／またはエピトープが挙げられるがこれらに限定されない、いずれかの抗原またはエピトープに対して使用することができる：１７−ＩＡ、４−１ＢＢ、４Ｄｃ、６−ケト−ＰＧＦ１ａ、８−イソ−ＰＧＦ２ａ、８−オキソ−ｄＧ、Ａ１アデノシン受容体、Ａ３３、ＡＣＥ、ＡＣＥ−２、アクチビン、アクチビンＡ、アクチビンＡＢ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＲＩＡ、アクチビンＲＩＡ ＡＬＫ−２、アクチビンＲＩＢ ＡＬＫ−４、アクチビンＲＩＩＡ、アクチビンＲＩＩＢ、ＡＤＡＭ、ＡＤＡＭ１０、ＡＤＡＭ１２、ＡＤＡＭ１５、ＡＤＡＭ１７／ＴＡＣＥ、ＡＤＡＭ８、ＡＤＡＭ９、ＡＤＡＭＴＳ、ＡＤＡＭＴＳ４、ＡＤＡＭＴＳ５、アドレシン、ａＦＧＦ、ＡＬＣＡＭ、ＡＬＫ、ＡＬＫ−１、ＡＬＫ−７、アルファ−１−アンチトリプシン、アルファ−Ｖ／ベータ−１アンタゴニスト、ＡＮＧ、Ａｎｇ、ＡＰＡＦ−１、ＡＰＥ、ＡＰＪ、ＡＰＰ、ＡＰＲＩＬ、ＡＲ、ＡＲＣ、ＡＲＴ、アルテミン（Artemin）、抗Ｉｄ、ＡＳＰＡＲＴＩＣ、心房性ナトリウム利尿因子、ａｖ／ｂ３インテグリン、Ａｘｌ、ｂ２Ｍ、Ｂ７−１、Ｂ７−２、Ｂ７−Ｈ、Ｂ−リンパ球刺激因子（ＢｌｙＳ）、ＢＡＣＥ、ＢＡＣＥ−１、Ｂａｄ、ＢＡＦＦ、ＢＡＦＦ−Ｒ、Ｂａｇ−１、ＢＡＫ、Ｂａｘ、ＢＣＡ−１、ＢＣＡＭ、Ｂｃｌ、ＢＣＭＡ、ＢＤＮＦ、ｂ−ＥＣＧＦ、ｂＦＧＦ、ＢＩＤ、Ｂｉｋ、ＢＩＭ、ＢＬＣ、ＢＬ−ＣＡＭ、ＢＬＫ、ＢＭＰ、ＢＭＰ−２ ＢＭＰ−２ａ、ＢＭＰ−３オステオゲニン（Ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｎ）、ＢＭＰ−４ ＢＭＰ−２ｂ、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６ Ｖｇｒ−１、ＢＭＰ−７（ＯＰ−１）、ＢＭＰ−８（ＢＭＰ−８ａ、ＯＰ−２）、ＢＭＰＲ、ＢＭＰＲ−ＩＡ（ＡＬＫ−３）、ＢＭＰＲ−ＩＢ（ＡＬＫ−６）、ＢＲＫ−２、ＲＰＫ−１、ＢＭＰＲ−ＩＩ（ＢＲＫ−３）、ＢＭＰ、ｂ−ＮＧＦ、ＢＯＫ、ボンベシン、骨由来神経栄養因子、ＢＰＤＥ、ＢＰＤＥ−ＤＮＡ、ＢＴＣ、補体因子３（Ｃ３）、Ｃ３ａ、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ５ａ、Ｃ１０、ＣＡ１２５、ＣＡＤ−８、カルシトニン、ｃＡＭＰ、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、癌関連抗原、カテプシンＡ、カテプシンＢ、カテプシンＣ／ＤＰＰＩ、カテプシンＤ、カテプシンＥ、カテプシンＨ、カテプシンＬ、カテプシンＯ、カテプシンＳ、カテプシンＶ、カテプシンＸ／ＺＩＰ、ＣＢＬ、ＣＣＩ、ＣＣＫ２、ＣＣＬ、ＣＣＬ１、ＣＣＬ１１、ＣＣＬ１２、ＣＣＬ１３、ＣＣＬ１４、ＣＣＬ１５、ＣＣＬ１６、ＣＣＬ１７、ＣＣＬ１８、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２、ＣＣＬ２０、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ２２、ＣＣＬ２３、ＣＣＬ２４、ＣＣＬ２５、ＣＣＬ２６、ＣＣＬ２７、ＣＣＬ２８、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５、ＣＣＬ６、ＣＣＬ７、ＣＣＬ８、ＣＣＬ９／１０、ＣＣＲ、ＣＣＲ１、ＣＣＲ１０、ＣＣＲ１０、ＣＣＲ２、ＣＣＲ３、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＣＲ６、ＣＣＲ７、ＣＣＲ８、ＣＣＲ９、ＣＤ１、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ３Ｅ、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ６、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１０、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１３、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ２７Ｌ、ＣＤ２８、ＣＤ２９、ＣＤ３０、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ３２、ＣＤ３３（ｐ６７タンパク質）、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ４６、ＣＤ４９ａ、ＣＤ５２、ＣＤ５４、ＣＤ５５、ＣＤ５６、ＣＤ６１、ＣＤ６４、ＣＤ６６ｅ、ＣＤ７４、ＣＤ８０（Ｂ７−１）、ＣＤ８９、ＣＤ９５、ＣＤ１２３、ＣＤ１３７、ＣＤ１３８、ＣＤ１４０ａ、ＣＤ１４６、ＣＤ１４７、ＣＤ１４８、ＣＤ１５２、ＣＤ１６４、ＣＥＡＣＡＭ５、ＣＦＴＲ、ｃＧＭＰ、ＣＩＮＣ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ毒素、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ毒素、ＣＫｂ８−１、ＣＬＣ、ＣＭＶ、ＣＭＶ ＵＬ、ＣＮＴＦ、ＣＮＴＮ−１、ＣＯＸ、Ｃ−Ｒｅｔ、ＣＲＧ−２、ＣＴ−１、ＣＴＡＣＫ、ＣＴＧＦ、ＣＴＬＡ−４、ＣＸ３ＣＬ１、ＣＸ３ＣＲ１、ＣＸＣＬ、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ４、ＣＸＣＬ５、ＣＸＣＬ６、ＣＸＣＬ７、ＣＸＣＬ８、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＬ１４、ＣＸＣＬ１５、ＣＸＣＬ１６、ＣＸＣＲ、ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ３、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ５、ＣＸＣＲ６、サイトケラチン腫瘍関連抗原、ＤＡＮ、ＤＣＣ、ＤｃＲ３、ＤＣ−ＳＩＧＮ、崩壊促進因子、デス（１−３）−ＩＧＦ−Ｉ（脳ＩＧＦ−１）、Ｄｈｈ、ジゴキシン、ＤＮＡＭ−１、Ｄｎａｓｅ、Ｄｐｐ、ＤＰＰＩＶ／ＣＤ２６、Ｄｔｋ、ＥＣＡＤ、ＥＤＡ、ＥＤＡ−Ａ１、ＥＤＡ−Ａ２、ＥＤＡＲ、ＥＧＦ、ＥＧＦＲ（ＥｒｂＢ−１）、ＥＭＡ、ＥＭＭＰＲＩＮ、ＥＮＡ、エンドセリン受容体、エンケファリナーゼ、ｅＮＯＳ、Ｅｏｔ、エオタキシン１、ＥｐＣＡＭ、エフリンＢ２／ＥｐｈＢ４、ＥＰＯ、ＥＲＣＣ、Ｅ−セレクチン、ＥＴ−１、第ＩＩａ因子、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩｃ因子、第ＩＸ因子、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、Ｆａｓ、ＦｃＲ１、ＦＥＮ−１、フェリチン、ＦＧＦ、ＦＧＦ−１９、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ３、ＦＧＦ−８、ＦＧＦＲ、ＦＧＦＲ−３、フィブリン、ＦＬ、ＦＬＩＰ、Ｆｌｔ−３、Ｆｌｔ−４、卵胞刺激ホルモン、フラクタルカイン、ＦＺＤ１、ＦＺＤ２、ＦＺＤ３、ＦＺＤ４、ＦＺＤ５、ＦＺＤ６、ＦＺＤ７、ＦＺＤ８、ＦＺＤ９、ＦＺＤ１０、Ｇ２５０、Ｇａｓ ６、ＧＣＰ−２、ＧＣＳＦ、ＧＤ２、ＧＤ３、ＧＤＦ、ＧＤＦ−１、ＧＤＦ−３（Ｖｇｒ−２）、ＧＤＦ−５（ＢＭＰ−１４、ＣＤＭＰ−１）、ＧＤＦ−６（ＢＭＰ−１３、ＣＤＭＰ−２）、ＧＤＦ−７（ＢＭＰ−１２、ＣＤＭＰ−３）、ＧＤＦ−８（ミオスタチン）、ＧＤＦ−９、ＧＤＦ−１５（ＭＩＣ−１）、ＧＤＮＦ、ＧＤＮＦ、ＧＦＡＰ、ＧＦＲａ−１、ＧＦＲ−アルファ１、ＧＦＲ−アルファ２、ＧＦＲ−アルファ３、ＧＩＴＲ、グルカゴン、Ｇｌｕｔ４、糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａ（ＧＰ ＩＩｂ／ＩＩＩａ）、ＧＭ−ＣＳＦ、ｇｐ１３０、ｇｐ７２、ＧＲＯ、成長ホルモン放出因子、ハプテン（ＮＰ−ｃａｐまたはＮＩＰ−ｃａｐ）、ＨＢ−ＥＧＦ、ＨＣＣ、ＨＣＭＶ ｇＢエンベロープ糖タンパク質、ＨＣＭＶ）ｇＨエンベロープ糖タンパク質、ＨＣＭＶ ＵＬ、造血性増殖因子（ＨＧＦ）、Ｈｅｐ Ｂ ｇｐ１２０、ヘパラナーゼ、Ｈｅｒ２、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ（ＥｒｂＢ−２）、Ｈｅｒ３（ＥｒｂＢ−３）、Ｈｅｒ４（ＥｒｂＢ−４）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ｇＢ糖タンパク質、ＨＳＶ ｇＤ糖タンパク質、ＨＧＦＡ、高分子量メラノーマ関連抗原（ＨＭＷ−ＭＭ）、ＨＩＶ ｇｐ１２０、ＨＩＶ ＩＩＩＢ ｇｐ１２０ Ｖ３ループ、ＨＬＡ、ＨＬＡ−ＤＲ、ＨＭ１．２４、ＨＭＦＧ ＰＥＭ、ＨＲＧ、Ｈｒｋ、ヒト心筋ミオシン、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）、ヒト成長ホルモン（ＨＧＨ）、ＨＶＥＭ、Ｉ−３０９、ＩＡＰ、ＩＣＡＭ、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−３、ＩＣＥ、ＩＣＯＳ、ＩＦＮｇ、Ｉｇ、ＩｇＡ受容体、ＩｇＥ、ＩＧＦ、ＩＧＦ結合タンパク質、ＩＧＦ−１Ｒ、ＩＧＦＢＰ、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ＩＬ、ＩＬ−１、ＩＬ−１Ｒ、ＩＬ−２、ＩＬ−２Ｒ、ＩＬ−４、ＩＬ−４Ｒ、ＩＬ−５、ＩＬ−５Ｒ、ＩＬ−６、ＩＬ−６Ｒ、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＩＬ−１８Ｒ、ＩＬ−２３、インターフェロン（ＩＮＦ）−アルファ、ＩＮＦ−ベータ、ＩＮＦ−ガンマ、インヒビン、ｉＮＯＳ、インスリンＡ−鎖、インスリンＢ−鎖、インスリン様増殖因子１、インテグリンアルファ２、インテグリンアルファ３、インテグリンアルファ４、インテグリンアルファ４／ベータ１、インテグリンアルファ４／ベータ７、インテグリンアルファ５（アルファＶ）、インテグリンアルファ５／ベータ１、インテグリンアルファ５／ベータ３、インテグリンアルファ６、インテグリンベータ１、インテグリンベータ２、インターフェロンガンマ、ＩＰ−１０、Ｉ−ＴＡＣ、ＪＥ、カリクレイン２、カリクレイン５、カリクレイン６、カリクレイン１１、カリクレイン１２、カリクレイン１４、カリクレイン１５、カリクレインＬ１、カリクレインＬ２、カリクレインＬ３、カリクレインＬ４、ＫＣ、ＫＤＲ、ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）、ラミニン５、ＬＡＭＰ、ＬＡＰ、ＬＡＰ（ＴＧＦ−１）、潜在型ＴＧＦ−１、潜在型ＴＧＦ−１ ｂｐ１、ＬＢＰ、ＬＤＧＦ、ＬＥＣＴ２、レフティー、ルイス−Ｙ抗原、ルイス−Ｙ関連抗原、ＬＦＡ−１、ＬＦＡ−３、Ｌｆｏ、ＬＩＦ、ＬＩＧＨＴ、リポタンパク質、ＬＩＸ、ＬＫＮ、Ｌｐｔｎ、Ｌ−セレクチン、ＬＴ−ａ、ＬＴ−ｂ、ＬＴＢ４、ＬＴＢＰ−１、肺サーファクタント、黄体形成ホルモン、リンホトキシンベータ受容体、Ｍａｃ−１、ＭＡｄＣＡＭ、ＭＡＧ、ＭＡＰ２、ＭＡＲＣ、ＭＣＡＭ、ＭＣＡＭ、ＭＣＫ−２、ＭＣＰ、Ｍ−ＣＳＦ、ＭＤＣ、Ｍｅｒ、メタロプロテアーゼ、ＭＧＤＦ受容体、ＭＧＭＴ、ＭＨＣ（ＨＬＡ−ＤＲ）、ＭＩＦ、ＭＩＧ、ＭＩＰ、ＭＩＰ−１−α、ＭＫ、ＭＭＡＣ１、ＭＭＰ、ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−１０、ＭＭＰ−１１、ＭＭＰ−１２、ＭＭＰ−１３、ＭＭＰ−１４、ＭＭＰ−１５、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−２４、ＭＭＰ−３、ＭＭＰ−７、ＭＭＰ−８、ＭＭＰ−９、ＭＰＩＦ、Ｍｐｏ、ＭＳＫ、ＭＳＰ、ムチン（Ｍｕｃ１）、ＭＵＣ１８、ミュラー管阻害（Muellerian-inhibitin）物質、Ｍｕｇ、ＭｕＳＫ、ＮＡＩＰ、ＮＡＰ、ＮＣＡＤ、Ｎ−カドヘリン、ＮＣＡ９０、ＮＣＡＭ、ＮＣＡＭ、ネプリライシン、ニューロトロフィン−３、−４または−６、ニュールツリン、神経細胞増殖因子（ＮＧＦ）、ＮＧＦＲ、ＮＧＦ−ベータ、ｎＮＯＳ、ＮＯ、ＮＯＳ、Ｎｐｎ、ＮＲＧ−３、ＮＴ、ＮＴＮ、ＯＢ、ＯＧＧ１、ＯＰＧ、ＯＰＮ、ＯＳＭ、ＯＸ４０Ｌ、ＯＸ４０Ｒ、ｐ１５０、ｐ９５、ＰＡＤＰｒ、副甲状腺ホルモン、ＰＡＲＣ、ＰＡＲＰ、ＰＢＲ、ＰＢＳＦ、ＰＣＡＤ、Ｐ−カドヘリン、ＰＣＮＡ、ＰＤＧＦ、ＰＤＧＦ、ＰＤＫ−１、ＰＥＣＡＭ、ＰＥＭ、ＰＦ４、ＰＧＥ、ＰＧＦ、ＰＧＩ２、ＰＧＪ２、ＰＩＮ、ＰＬＡ２、胎盤アルカリホスファターゼ（ＰＬＡＰ）、ＰＩＧＦ、ＰＬＰ、ＰＰ１４、プロインスリン、プロリラキシン（Prorelaxin）、プロテインＣ、ＰＳ、ＰＳＡ、ＰＳＣＡ、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、ＰＴＥＮ、ＰＴＨｒｐ、Ｐｔｋ、ＰＴＮ、Ｒ５１、ＲＡＮＫ、ＲＡＮＫＬ、ＲＡＮＴＥＳ、ＲＡＮＴＥＳ、リラキシンＡ−鎖、リラキシンＢ−鎖、レニン、呼吸器多核体ウイルス（ＲＳＶ）Ｆ、ＲＳＶ Ｆｇｐ、Ｒｅｔ、リウマトイド因子、ＲＬＩＰ７６、ＲＰＡ２、ＲＳＫ、Ｓ１００、ＳＣＦ／ＫＬ、ＳＤＦ−１、ＳＥＲＩＮＥ、血清アルブミン、ｓＦＲＰ−３、Ｓｈｈ、ＳＩＧＩＲＲ、ＳＫ−１、ＳＬＡＭ、ＳＬＰＩ、ＳＭＡＣ、ＳＭＤＦ、ＳＭＯＨ、ＳＯＤ、ＳＰＡＲＣ、Ｓｔａｔ、ＳＴＥＡＰ、ＳＴＥＡＰ−ＩＩ、ＴＡＣＥ、ＴＡＣＩ、ＴＡＧ−７２（腫瘍関連糖タンパク質−７２）、ＴＡＲＣ、ＴＣＡ−３、Ｔ細胞受容体（例えば、Ｔ細胞受容体アルファ／ベータ）、ＴｄＴ、ＴＥＣＫ、ＴＥＭ１、ＴＥＭ５、ＴＥＭ７、ＴＥＭ８、ＴＥＲＴ、精巣ＰＬＡＰ様アルカリホスファターゼ、ＴｆＲ、ＴＧＦ、ＴＧＦ−アルファ、ＴＧＦ−ベータ、ＴＧＦ−ベータＰａｎ特異的、ＴＧＦ−ベータＲＩ（ＡＬＫ−５）、ＴＧＦ−ベータＲＩＩ、ＴＧＦ−ベータＲＩＩｂ、ＴＧＦ−ベータＲＩＩＩ、ＴＧＦ−ベータ１、ＴＧＦ−ベータ２、ＴＧＦ−ベータ３、ＴＧＦ−ベータ４、ＴＧＦ−ベータ５、トロンビン、胸腺Ｃｋ−１、甲状腺刺激ホルモン、Ｔｉｅ、ＴＩＭＰ、ＴＩＱ、組織因子、ＴＭＥＦＦ２、Ｔｍｐｏ、ＴＭＰＲＳＳ２、ＴＮＦ、ＴＮＦ−アルファ、ＴＮＦ−アルファベータ、ＴＮＦ−ベータ２、ＴＮＦｃ、ＴＮＦ−ＲＩ、ＴＮＦ−ＲＩＩ、ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ（ＴＲＡＩＬ Ｒ１ Ａｐｏ−２、ＤＲ４）、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ（ＴＲＡＩＬ Ｒ２ ＤＲ５、ＫＩＬＬＥＲ、ＴＲＩＣＫ−２Ａ、ＴＲＩＣ



Ｋ−Ｂ）、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｃ（ＴＲＡＩＬ Ｒ３ ＤｃＲ１、ＬＩＴ、ＴＲＩＤ）、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｄ（ＴＲＡＩＬ Ｒ４ ＤｃＲ２、ＴＲＵＮＤＤ）、ＴＮＦＲＳＦ１１Ａ（ＲＡＮＫ ＯＤＦ Ｒ、ＴＲＡＮＣＥ Ｒ）、ＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ（ＯＰＧ ＯＣＩＦ、ＴＲ１）、ＴＮＦＲＳＦ１２（ＴＷＥＡＫ Ｒ ＦＮ１４）、ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ（ＴＡＣＩ）、ＴＮＦＲＳＦ１３Ｃ（ＢＡＦＦ Ｒ）、ＴＮＦＲＳＦ１４（ＨＶＥＭ ＡＴＡＲ、ＨｖｅＡ、ＬＩＧＨＴ Ｒ、ＴＲ２）、ＴＮＦＲＳＦ１６（ＮＧＦＲ ｐ７５ＮＴＲ）、ＴＮＦＲＳＦ１７（ＢＣＭＡ）、ＴＮＦＲＳＦ１８（ＧＩＴＲ ＡＩＴＲ）、ＴＮＦＲＳＦ１９（ＴＲＯＹ ＴＡＪ、ＴＲＡＤＥ）、ＴＮＦＲＳＦ１９Ｌ（ＲＥＬＴ）、ＴＮＦＲＳＦ１Ａ（ＴＮＦ ＲＩ ＣＤ１２０ａ、ｐ５５−６０）、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ（ＴＮＦ ＲＩＩ ＣＤ１２０ｂ、ｐ７５−８０）、ＴＮＦＲＳＦ２６（ＴＮＦＲＨ３）、ＴＮＦＲＳＦ３（ＬＴｂＲ ＴＮＦ ＲＩＩＩ、ＴＮＦＣ Ｒ）、ＴＮＦＲＳＦ４（ＯＸ４０ ＡＣＴ３５、ＴＸＧＰ１ Ｒ）、ＴＮＦＲＳＦ５（ＣＤ４０ ｐ５０）、ＴＮＦＲＳＦ６（Ｆａｓ Ａｐｏ−１、ＡＰＴ１、ＣＤ９５）、ＴＮＦＲＳＦ６Ｂ（ＤｃＲ３ Ｍ６８、ＴＲ６）、ＴＮＦＲＳＦ７（ＣＤ２７）、ＴＮＦＲＳＦ８（ＣＤ３０）、ＴＮＦＲＳＦ９（４−１ＢＢ ＣＤ１３７、ＩＬＡ）、ＴＮＦＲＳＦ２１（ＤＲ６）、ＴＮＦＲＳＦ２２（ＤｃＴＲＡＩＬ Ｒ２ ＴＮＦＲＨ２）、ＴＮＦＲＳＴ２３（ＤｃＴＲＡＩＬ Ｒ１ ＴＮＦＲＨ１）、ＴＮＦＲＳＦ２５（ＤＲ３ Ａｐｏ−３、ＬＡＲＤ、ＴＲ−３、ＴＲＡＭＰ、ＷＳＬ−１）、ＴＮＦＳＦ１０（ＴＲＡＩＬ Ａｐｏ−２リガンド、ＴＬ２）、ＴＮＦＳＦ１１（ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫリガンドＯＤＦ、ＯＰＧリガンド）、ＴＮＦＳＦ１２（ＴＷＥＡＫ Ａｐｏ−３リガンド、ＤＲ３リガンド）、ＴＮＦＳＦ１３（ＡＰＲＩＬ ＴＡＬＬ２）、ＴＮＦＳＦ１３Ｂ（ＢＡＦＦ ＢＬＹＳ、ＴＡＬＬ１、ＴＨＡＮＫ、ＴＮＦＳＦ２０）、ＴＮＦＳＦ１４（ＬＩＧＨＴ ＨＶＥＭリガンド、ＬＴｇ）、ＴＮＦＳＦ１５（ＴＬ１Ａ／ＶＥＧＩ）、ＴＮＦＳＦ１８（ＧＩＴＲリガンドＡＩＴＲリガンド、ＴＬ６）、ＴＮＦＳＦ１Ａ（ＴＮＦ−ａコネクチン（Conectin）、ＤＩＦ、ＴＮＦＳＦ２）、ＴＮＦＳＦ１Ｂ（ＴＮＦ−ｂ ＬＴａ、ＴＮＦＳＦ１）、ＴＮＦＳＦ３（ＬＴｂ ＴＮＦＣ、ｐ３３）、ＴＮＦＳＦ４（ＯＸ４０リガンドｇｐ３４、ＴＸＧＰ１）、ＴＮＦＳＦ５（ＣＤ４０リガンドＣＤ１５４、ｇｐ３９、ＨＩＧＭ１、ＩＭＤ３、ＴＲＡＰ）、ＴＮＦＳＦ６（ＦａｓリガンドＡｐｏ−１リガンド、ＡＰＴ１リガンド）、ＴＮＦＳＦ７（ＣＤ２７リガンドＣＤ７０）、ＴＮＦＳＦ８（ＣＤ３０リガンドＣＤ１５３）、ＴＮＦＳＦ９（４−１ＢＢリガンドＣＤ１３７リガンド）、ＴＰ−１、ｔ−ＰＡ、Ｔｐｏ、ＴＲＡＩＬ、ＴＲＡＩＬ Ｒ、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＴＲＡＮＣＥ、トランスフェリン（transferring）受容体、ＴＲＦ、Ｔｒｋ、ＴＲＯＰ−２、ＴＳＧ、ＴＳＬＰ、腫瘍関連抗原ＣＡ１２５、腫瘍関連抗原発現ルイスＹ関連炭水化物、ＴＷＥＡＫ、ＴＸＢ２、Ｕｎｇ、ｕＰＡＲ、ｕＰＡＲ−１、ウロキナーゼ、ＶＣＡＭ、ＶＣＡＭ−１、ＶＥＣＡＤ、ＶＥ−カドヘリン、ＶＥ−カドヘリン−２、ＶＥＦＧＲ−１（ｆｌｔ−１）、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ−３（ｆｉｔ−４）、ＶＥＧＩ、ＶＩＭ、ウイルス抗原、ＶＬＡ、ＶＬＡ−１、ＶＬＡ−４、ＶＮＲインテグリン、フォン・ヴィルブランド因子、ＷＩＦ−１、ＷＮＴ１、ＷＮＴ２、ＷＮＴ２Ｂ／１３、ＷＮＴ３、ＷＮＴ３Ａ、ＷＮＴ４、ＷＮＴ５Ａ、ＷＮＴ５Ｂ、ＷＮＴ６、ＷＮＴ７Ａ、ＷＮＴ７Ｂ、ＷＮＴ８Ａ、ＷＮＴ８Ｂ、ＷＮＴ９Ａ、ＷＮＴ９Ａ、ＷＮＴ９Ｂ、ＷＮＴ１０Ａ、ＷＮＴ１０Ｂ、ＷＮＴ１１、ＷＮＴ１６、ＸＣＬ１、ＸＣＬ２、ＸＣＲ１、ＸＣＲ１、ＸＥＤＡＲ、ＸＩＡＰ、ＸＰＤ、ならびにホルモンおよび増殖因子の受容体。一部の実施形態では、ポリペプチドまたはタンパク質は、１種または複数の細胞表面腫瘍抗原に特異的な抗原結合ドメインを有する。方法および組成物は、ＣＤＣのための腫瘍細胞を標的にするために用いることができる。

抗体コンジュゲートの基盤として、十分な選択性、特異性または親和性のいかなる抗体を用いてもよい。かかる特性は、当業者に公知の従来の免疫学的スクリーニング方法論を使用して評価することができる。抗体分子における生物学的活性分子への結合のための部位は、標準的な抗原結合部位に加えて、病原体、Ｂ細胞スーパー抗原、Ｔ細胞共受容体ＣＤ４およびＨＩＶ−１エンベロープに結合することができる可変ドメインに存在する部位を含む（Sassoら、１９８９年；Shorkiら、１９９１年；Silvermannら、１９９５年；Clearyら、１９９４年；Lenertら、１９９０年；Berberianら、１９９３年；Kreierら、１９９１年）。加えて、可変ドメインは、抗体自己結合に関与し（Kangら、１９８８年）、抗抗体によって認識されるエピトープ（イディオトープ）を含有する（Kohlerら、１９８９年）。

Ｆｃドメインは、Ｃ１ｑおよびＦｃＲに結合することができるが、ＣＤＣが、Ｆｃドメインを含有するポリペプチドにおける抗原結合ドメインによってだけではなく、他のいくつかのタンパク質結合ドメインによって方向づけられ得ることが企図される。結果的に、実施形態は、Ｆｃドメインおよび異種非抗原結合ドメインに関係する。ある特定の実施形態では、非抗原結合ドメインは、細胞表面に結合する。したがって、これらの作用物質は、特異的標的細胞へと結合することができる作用物質／タンパク質への化学的コンジュゲートまたはそれとの融合のいずれかを必要とする。実施形態は、非グリコシル化Ｆｃドメインの全体または部分を、表１に収載されているタンパク質のいずれかの全体または部分に接続することをさらに含む。実施形態として、表１および本明細書の記載に提示されている例が挙げられるがこれらに限定されないことが企図される。

受容体のリガンドを用いて、リガンドの受容体をその表面において発現する細胞を標的とすることができる。リガンドは、例えば、ＣＤ９５リガンド、ＴＲＡＩＬ、ＴＮＦ（ＴＮＦ−αまたはＴＮＦ−β等）、ＶＥＧＦ等の上に記すものを含む増殖因子、およびインターフェロンまたはインターロイキン等のサイトカイン、ならびにこれらのバリアントも含む。ＶＥＧＦ受容体１（Ｆｌｔ−１）の第２の細胞外ドメインとＶＥＧＦ受容体２（ＫＤＲ／ＦＩＫ−１）の第３のドメインおよびＩｇＧ Ｆｃ領域を含むＶＥＧＦ Ｔｒａｐ融合タンパク質等、複数のドメインを有する実施形態も企図される。

Ｃ．抗体Ｆｃライブラリー
多様な抗体Ｆｃドメインおよび／またはかかるドメインを含む抗体の作製のための実施形態と併せて用いることができる技法の例は、米国特許第５，８２４，５２０号に記載されている免疫グロブリン重鎖ライブラリーの発現のための技法と同様の技法を用いることができる。以前に用いられたＦｃライブラリーは、特に参照により本明細書に組み込むＰＣＴ公開ＷＯ２００８／１３７４７５に記されている。

ＩＩＩ．抗体結合ポリペプチド
種々の抗体結合ドメイン（例えば、ＦｃＲポリペプチド）は、本技術分野で公知であり、本発明の方法および組成物において使用することができる。例えば、一部の態様では、ＦｃＲは、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥまたはＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４）等、Ｉｇの特定の型または亜型に特異性を有することができる。よって、一部の実施形態では、抗体結合ドメインは、ＩｇＧ結合ドメインとして規定することができる。ＦｃＲポリペプチドは、真核生物、原核生物または合成ＦｃＲドメインを含むことができる。例えば、抗体Ｆｃ結合ドメインは、哺乳動物、細菌または合成結合ドメインとして規定することができる。本発明における使用のための一部のＦｃ結合ドメインとして、表２のポリペプチドのうち１種由来の結合ドメインが挙げられるがこれらに限定されない。例えば、Ｆｃ結合ポリペプチドは、ＦＣＧＲ２Ａ、ＦＣＧＲ２Ｂ、ＦＣＧＲ２Ｃ、ＦＣＧＲ３Ａ、ＦＣＧＲ３Ｂ、ＦＣＧＲ１Ａ、Ｆｃｇｒ１、ＦＣＧＲ２、ＦＣＧＲ２、Ｆｃｇｒ２、Ｆｃｇｒ２、ＦＣＧＲ３、ＦＣＧＲ３、Ｆｃｇｒ３、ＦＣＧＲ３、Ｆｃｇｒ３、ＦＣＧＲＴ、ｍｒｐ４、ｓｐａまたはｓｐｇ遺伝子によってコードされ得る。好ましくは、本発明に係る使用のためのＦｃＲポリペプチドは、ヒトＦｃγＲＩａ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩｃ、ＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩＩＩｂ、ＦｃαＲＩまたはＣ１ｑ由来のＦｃ結合領域であり得る。Ｆｃドメインが結合する種々のＦｃ受容体は、本技術分野で周知であり、受容体の一部の例を下表２に収載する。

ＩＶ．抗体Ｆｃドメインをスクリーニングするための方法
ある特定の態様では、標的リガンド（例えば、Ｆｃ受容体等、抗体結合ポリペプチド）に特異的な親和性を有する抗体Ｆｃドメインを識別するための方法が存在する。かかる方法は、本明細書、ならびにその全体を特に参照により本明細書に組み込むＰＣＴ公開ＷＯ２００８／１３７４７５に記載されている。

スクリーニングされたポリペプチドは、多様な候補Ｆｃドメインの大型のライブラリーを含むことができる、あるいは、標的リガンドに結合する可能性を高くすると考えられる構造的性状に目を向けて選択されたＦｃドメイン（例えば、操作された点変異またはアミノ酸挿入）の特定のクラスを含むことができる。一実施形態では、候補ポリペプチドは、インタクト抗体またはＦｃドメインを含むその断片もしくは部分であり得る。

標的リガンドに結合することができる候補Ｆｃドメインを識別するために、それぞれ別個の抗体Ｆｃドメインを発現するグラム陰性細菌細胞の集団を用意するステップと、細菌と、抗体Ｆｃドメインに接触することができる少なくとも第１の標識または固定化された標的リガンド（ＦｃＲポリペプチド）とを混合するステップと、標的リガンドに結合することができる分子を発現する少なくとも第１の細菌を識別するステップとを行うことができる。

上述の方法の一部の態様では、抗体Ｆｃドメインおよび標識されたＦｃＲポリペプチドの間の結合は、細菌細胞からの拡散を防止する。このようにして、標識されたリガンドの分子は、透過処理された外膜を含む細菌のペリプラズムに保持され得る。あるいは、Ｆｃドメインは、内膜に会合することが示されるため、ペリプラズムを除去し、それにより、Ｆｃドメインが、結合した候補分子の保持を引き起こすことができるであろう。次いで、標識を使用して、ＦｃＲポリペプチドに結合することができる結合ポリペプチドを発現する細胞を単離することができ、Ｆｃドメインポリペプチドをコードする遺伝子を単離することができる。続いて、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｅｘ ｖｉｖｏ発現方法を使用して、標的リガンドに結合することができる分子を多量に産生し、次いで、いずれかの所望の適用、例えば、診断または治療適用に使用することができる。さらに、識別された単離された抗体Ｆｃドメインを使用して、抗原結合ドメインを含む抗体断片または全長抗体を構築することができることが理解され得る。

さらなる実施形態では、スクリーニング方法は、少なくとも２ラウンドの選択を含むことができ、第１ラウンドの選択で得られた細菌細胞の亜集団は、ＦｃＲへの候補抗体Ｆｃドメインの結合に基づく少なくとも第２ラウンドの選択に付す。さらに、一部の態様では、第１ラウンドの選択で得られた細菌細胞の亜集団は、第２の選択に先立ち許容的条件下で育成（して、細胞総数を増やすことが）できる。よって、一部の態様では、方法は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれを超えるラウンドの選択を含むことができる。さらに、一部の態様では、各ラウンドの選択から得られた細菌細胞の亜集団は、その後のラウンドの選択の前に、許容的条件下で育成される。１または複数のかかるラウンドの選択の後に単離された細胞は、追加的なラウンドの変異誘発に付すことができる。場合によっては、選択は、抗体に結合していないＦｃＲポリペプチドを除去した後に行われる。さらに、場合によっては、選択のストリンジェンシーは、抗体を提示する細菌を含む溶液のｐＨ、塩濃度または温度を調整することにより変えることができる。よって、一部の態様では、本発明の細菌細胞が、約２５℃等、生理的条件に満たない（sub-physiological）温度で育成されることが好ましい場合がある。

さらにさらなる態様では、本発明に係る細菌細胞を産生する方法は、少なくとも第１のＦｃＲに結合するＦｃドメインをコードする核酸配列を産生する方法としてさらに規定することができる。よって、本明細書における方法によって産生される細菌細胞を使用して、ＦｃＲポリペプチドに特異的な親和性を有するＦｃドメインをコードする核酸配列をクローニングすることができる。例えば、ＰＣＲによって細胞からかかる核酸を単離および増幅するための方法は、本技術分野で周知であり、さらに後述する。よって、前述の方法によって産生された核酸配列は、本発明の一部として含まれる。さらに、かかる配列は、細胞において発現されて、ＦｃＲに特異的な親和性を有するＦｃドメインを産生することができる。よって、一部の態様では、本発明は、ＦｃＲに特異的な親和性を有するＦｃドメインを産生するための方法を提供する。さらに、本発明は、本発明の方法によって産生された抗体Ｆｃドメインを含む。しかし、かかるスクリーニングによって産生された抗体Ｆｃドメインを、特定の標的リガンドに対し親和性を有する抗体可変領域と組み合わせることができ、これらの抗体も本発明の一部として含まれることが理解できよう。

Ａ．抗体Ｆｃドメインのペリプラズム発現
一部の実施形態では、抗体Ｆｃドメインを含むポリペプチドは、グラム陰性細菌の細胞膜周辺腔において発現させることができる。さらに、一部の態様では、抗体Ｆｃドメインは、内膜の周辺面に繋留することができる。グラム陰性細菌の内膜にポリペプチドを繋留するための方法および組成物は、以前に記載されている（米国特許第７，０９４，５７１号、同第７，４１９，７８３号、同第７，６１１，８６６号および米国特許出願公開第２００３／０２１９８７０号）。例えば、Ｆｃドメインは、膜貫通もしくは膜結合ポリペプチドに直接融合することができる、または膜貫通もしくは膜結合ポリペプチドと相互作用することができる（例えば、タンパク質−タンパク質相互作用により）。かかる技法は、「繋留型ペリプラズム発現」または「ＡＰＥｘ」と命名されてよい。場合によっては、グラム陰性細菌細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞として規定することができる。さらに、一部の態様では、グラム陰性細菌細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉのＪｕｄｅ−１株等、遺伝子操作された細菌細胞として規定することができる。

融合タンパク質は、ＦｃドメインとのＮ末端またはＣ末端融合を含むことができ、場合により、膜繋留ポリペプチドおよびＦｃドメインの間に追加的なリンカーアミノ酸を含むことができる。ある特定の具体的な事例において、膜繋留ポリペプチドは、Ｅ．ｃｏｌｉ ＮｌｐＡ遺伝子によってコードされる最初の６アミノ酸、Ｅ．ｃｏｌｉ内膜タンパク質由来の１種もしくは複数の膜貫通α−ヘリックス、繊維状ファージの遺伝子ＩＩＩタンパク質もしくはその断片、または内膜リポタンパク質もしくはその断片であり得る。よって、一例として、膜繋留ポリペプチドは、ＡｒａＨ、ＭｇｌＣ、ＭａｌＦ、ＭａｌＧ、ＭａｌＣ、ＭａｌＤ、ＲｂｓＣ、ＲｂｓＣ、ＡｒｔＭ、ＡｒｔＱ、ＧｌｎＰ、ＰｒｏＷ、ＨｉｓＭ、ＨｉｓＱ、ＬｉｖＨ、ＬｉｖＭ、ＬｉｖＡ、ＬｉｖＥ、ＤｐｐＢ、ＤｐｐＣ、ＯｐｐＢ、ＡｍｉＣ、ＡｍｉＤ、ＢｔｕＣ、ＴｈｕＤ、ＦｅｃＣ、ＦｅｃＤ、ＦｅｃＲ、ＦｅｐＤ、ＮｉｋＢ、ＮｉｋＣ、ＣｙｓＴ、ＣｙｓＷ、ＵｇｐＡ、ＵｇｐＥ、ＰｓｔＡ、ＰｓｔＣ、ＰｏｔＢ、ＰｏｔＣ、ＰｏｔＨ、Ｐｏｄ、ＭｏｄＢ、ＮｏｓＹ、ＰｈｎＭ、ＬａｃＹ、ＳｅｃＹ、ＴｏｌＣ、ＤｓｂＢ、ＤｓｂＤ、ＴｏｕＢ、ＴａｔＣ、ＣｈｅＹ、ＴｒａＢ、ＥｘｂＤ、ＥｘｂＢまたはＡａｓ由来等、内膜リポタンパク質またはその断片であり得る。

さらにさらなる事例において、本発明に係るグラム陰性細菌の集団は、少なくとも約１×１０^３、１×１０^４、１×１０^５、１×１０^６、１×１０^７、１×１０^８、１０×１０^９種またはそれを超える別個の抗体Ｆｃドメインを含むものとして規定することができる。一部の具体的な事例において、グラム陰性細菌細胞の集団は、（ａ）複数の別個の抗体Ｆｃドメインをコードする複数の核酸配列を調製するステップと、（ｂ）前記核酸によりグラム陰性細菌の集団を形質転換するステップであって、グラム陰性細菌が、ペリプラズムにおいて発現された複数の抗体Ｆｃドメインを含むステップとを含む方法によって産生することができる。

Ｂ．外膜の透過処理
細菌の外膜を破壊、透過処理または除去するための方法は、本技術分野で周知であり、例えば、米国特許第７，０９４，５７１号を参照されたい。例えば、細菌細胞をＦｃＲポリペプチドと接触させる前に、細菌細胞の外膜は、高浸透圧条件、物理的ストレス、リゾチーム、ＥＤＴＡ、消化酵素、外膜を破壊する化学物質、細菌をファージに感染させることにより、または前述の方法の組合せにより処理することができる。よって、場合によっては、外膜は、リゾチームおよびＥＤＴＡ処理によって破壊することができる。さらに、ある特定の実施形態では、細菌外膜は、完全に除去することができる。

１種または複数の標識されたリガンドに対する外膜の透過性を増加させるための方法を用いることができる。これは、こうしなければ外膜を通過することができない標識されたリガンドのアクセスのスクリーニングを可能にすることができる。しかし、ある特定のクラスの分子、例えば、６５０Ｄａの排除限界よりも大きい疎水性抗生物質は、膜ポリンに依存せず、細菌外膜それ自体を通して拡散することができる（Farmerら、１９９９年）。プロセスは、そのようにして膜を実際に透過処理することができる（JouenneおよびJunter、１９９０年）。また、ある特定の長鎖リン酸塩ポリマー（１００Ｐｉ）は、外膜の正
常な分子ふるい活性をまとめて迂回するようである（RaoおよびTorriani、１９８８年）。

生存率を損なうことなくまたは細胞からの発現されたタンパク質を放出することなく、ペリプラズムへのリガンドの透過をもたらす条件が識別されたが、本発明は、外膜を維持することなく実施することができる。細胞膜周辺腔において発現または繋留されたＦｃドメインのため、結合した標識されたリガンドを検出するための、外膜の維持の必要性（細胞からの結合タンパク質の漏出を防止するための障壁としての）は除かれる。結果として、細胞膜の外（ペリプラズム）面に繋留された結合タンパク質を発現する細胞は、部分的に透過処理された膜またはほぼ完全に除去された外膜のいずれかを有する細胞において、標識されたリガンドの溶液と単にインキュベートすることにより標識することができる。

高浸透圧ショック等の処理は、標識を有意に改善することができる。カルシウムイオン（Bukauら、１９８５年）およびさらにはトリス緩衝液（Irvinら、１９８１年）を含む多くの作用物質が、外膜の透過性を変更することが公知である。さらに、ファージ感染は、標識プロセスを刺激する。繊維状ファージ内膜タンパク質ｐＩＩＩおよび大型の多量体外膜タンパク質ｐＩＶの両方が、膜透過性を変更することができ（Boekeら、１９８２年）、ｐＩＶにおける変異体は、正常であれば除外されるマルトデキストリンに対するアクセスを改善することが公知である（Marcianoら、１９９９年）。株、塩およびファージの賢明な組合せを含む本発明の技法を使用して、高度な透過性を達成することができる（Daughertyら、１９９９年）。次いで、フローサイトメトリーまたは他の関連技法を使用して、標識されたリガンドに結合した、繋留またはペリプラズム会合されたポリペプチドを含む細胞を、標識されたリガンドに対する親和性がない結合タンパク質を発現する細胞から容易に単離することができる。しかし、場合によっては、細胞の生存率を維持するために、破壊性の低い技法を使用することが望まれ得る。この点において、ＥＤＴＡおよびリゾチーム処理も有用であり得る。

Ｃ．標識された標的リガンド
上に示す通り、典型的には、１種または複数の検出可能な作用物質（単数または複数）で標識されたＦｃＲポリペプチドを提供することが望まれ。これは、例えば、リガンドを少なくとも１種の検出可能な作用物質に連結して、コンジュゲートを形成することにより行うことができる。例えば、従来、少なくとも１種の検出可能な分子または部分を連結または共有結合または複合体形成させる。「標識」または「検出可能な標識」は、特異的な機能特性および／または化学的特徴により検出することができる化合物および／またはエレメントであり、その使用は、それが取り付けられるリガンドの検出および／または所望であればさらなる定量化を可能にする。使用することができる標識の例として、酵素、放射標識、ハプテン、蛍光標識、リン光分子、化学発光分子、発色団、発光分子、光親和性分子、着色粒子またはビオチン等のリガンドが挙げられるがこれらに限定されない。

本発明の一実施形態では、標識に関する細胞の自動スクリーニングを行うことができるように、視覚的に検出可能なマーカーが使用される。適切な機器による可視化によって検出することができる作用物質の例は、本技術分野で公知であり、これは、所望のリガンドへの作用物質の取り付けのための方法も同様である（例えば、それぞれ参照により本明細書に組み込む米国特許第５，０２１，２３６号；同第４，９３８，９４８号；および同第４，４７２，５０９号を参照）。かかる作用物質は、常磁性イオン；放射性同位元素；蛍光色素；ＮＭＲ検出可能物質；およびＸ線イメージングのための物質を含むことができる。特に、所望の結合タンパク質または抗体を発現する細胞の単離のためにフローサイトメトリーの使用を可能にするという点において、蛍光標識が有益である。

別の種類のＦｃＲコンジュゲートは、リガンドが、発色基質との接触後に着色産物を生成するであろう二次結合分子および／または酵素（酵素タグ）に連結されたコンジュゲートである。かかる酵素の例として、ウレアーゼ、アルカリホスファターゼ、（西洋わさび）水素ペルオキシダーゼまたはグルコースオキシダーゼが挙げられる。このような場合、選択された細胞が生存可能なままであることが望まれ得る。好ましい二次結合リガンドは、ビオチン、および／またはアビジンおよびストレプトアビジン化合物である。かかる標識の使用は、当業者に周知であり、例えば、それぞれ参照により本明細書に組み込む米国特許第３，８１７，８３７号；同第３，８５０，７５２号；同第３，９３９，３５０号；同第３，９９６，３４５号；同第４，２７７，４３７号；同第４，２７５，１４９号；および同第４，３６６，２４１号に記載されている。

アジド基を含有する分子を使用して、低強度紫外光によって生成される反応性ニトレン中間体を介したタンパク質への共有結合を形成することができる（PotterおよびHaley、１９８３年）。特に、プリンヌクレオチドの２−および８−アジドアナログは、粗細胞抽出物におけるヌクレオチド結合タンパク質を識別するための部位特異的フォトプローブ（photoprobe）として使用されてきた（OwensおよびHaley、１９８７年；Athertonら、１９８５年）。２−および８−アジドヌクレオチドは、精製されたタンパク質のヌクレオチド結合ドメインをマッピングするためにも使用されており（Khatoonら、１９８９年；Kingら、１９８９年；Dholakiaら、１９８９年）、リガンド結合剤として使用することができる。

標識は、当業者に周知の技法のいずれかによって行うことができる。例えば、ＦｃＲポリペプチドは、リガンドを所望の標識および化学的酸化剤、例えば、次亜塩素酸ナトリウムまたは酵素的酸化剤、例えば、ラクトペルオキシダーゼと接触させることにより標識することができる。同様に、リガンド交換プロセスを使用することができる。あるいは、例えば、標識、ＳＮＣｌ_２等の還元剤、フタル酸ナトリウム・カリウム（sodium-potassium phthalate）溶液等の緩衝溶液およびリガンドをインキュベートすることにより、直接標識技法を使用することができる。リガンドにおける中間官能基を使用して、例えば、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）またはエチレンジアミン四酢酸（ethylene diaminetetracetic acid）（ＥＤＴＡ）の存在下で標識をリガンドに結合することもできる。

そのコンジュゲート部分へのリガンドの取り付けまたはコンジュゲートのための他の方法も本技術分野で公知である。一部の取り付け方法は、リガンドに取り付けられたジエチレントリアミン五酢酸無水物（ＤＴＰＡ）；エチレントリアミン四酢酸（ethylenetriaminetetraacetic acid）；Ｎ−クロロ−ｐ−トルエンスルホンアミド；および／またはテトラクロロ−３α−６α−ジフェニルグリコウリル（glycouril）−３等、有機キレート剤の使用が関与する（それぞれ参照により本明細書に組み込む米国特許第４，４７２，５０９号および同第４，９３８，９４８号）。ＦｃＲポリペプチドは、グルタルアルデヒドまたは過ヨウ素酸塩等のカップリング剤の存在下で酵素と反応させることもできる。フルオレセインマーカーとのコンジュゲートは、これらのカップリング剤の存在下で、またはイソチオシアネートとの反応により調製することができる。米国特許第４，９３８，９４８号では、モノクローナル抗体を使用して、乳腺腫瘍のイメージングが達成され、検出可能イメージング部分が、メチル−ｐ−ヒドロキシベンズイミド酸塩（benzimidate）またはＮ−スクシンイミジル−３−（４−ヒドロキシフェニル）プロピオン酸塩等のリンカーを使用して抗体に結合される。さらにさらなる態様では、上記参照の酵素または蛍光タンパク質等のレポータータンパク質にＦｃＲポリペプチドを融合させることができる。

Ｄ．標識された標的リガンドに結合された細菌細胞の単離
１．カラムまたはビーズに基づく固定化
当業者であれば、そのＦｃＲとの相互作用（結合）に基づき細胞を選択するための方法が、本技術分野で周知であることを理解するであろう。例えば、ＦｃＲを、カラムまたはビーズ（例えば、磁気ビーズ）に固定化し、ＦｃＲに結合する細菌細胞を、ビーズ（例えば、磁気分離）またはカラムの反復した洗浄によって分離することができる。さらに、一部の態様では、標的リガンドは、フルオロフォア、放射性同位元素または酵素等により標識することができる。よって、細菌細胞は、場合によっては、結合したＦｃＲにおける標識を検出することにより選択することができる。さらに、一部の態様では、細菌細胞は、２種またはそれを超えるＦｃＲポリペプチドへの結合または結合の欠如に基づき選択することができる。例えば、２種のＦｃＲポリペプチドに結合する抗体を提示する細菌を選択することができ、この場合、各ＦｃＲは、細菌の選択に逐次使用される。逆に、ある特定の態様では、第２のＦｃＲ（例えば、第２の標識を含む）にではなく、１種のＦｃＲ（第１の標識を含むＦｃＲ等）に結合する抗体Ｆｃドメインを表示する細菌を選択することができる。前述の方法を使用して、例えば、第２の特異的ＦｃＲではなく特異的ＦｃＲに結合する抗体Ｆｃドメインを識別することができる。

２．フローサイトメトリー
本発明の一実施形態では、Ｆｃドメインに結合された標識されたリガンドを含む細菌細胞の効率的な単離のために、蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）スクリーニングまたは他の自動フローサイトメトリー技法を使用することができる。フローサイトメトリーを行うための機器は、当業者に公知であり、一般向けに市販されている。かかる機器の例として、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）製のＦＡＣＳ Ｓｔａｒ Ｐｌｕｓ、ＦＡＣＳｃａｎおよびＦＡＣＳｏｒｔ機器、Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｅｐｉｃｓ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ（Ｈｉａｌｅａｈ、ＦＬ）製のＥｐｉｃｓ Ｃ、ならびにＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ（Ｃｏｌｏｒａｄｏ Ｓｐｒｉｎｇｓ、ＣＯ）製のＭＯＦＬＯ（商標）が挙げられる。

フローサイトメトリー技法は一般に、液体試料中の細胞または他の粒子の分離が関与する。典型的には、フローサイトメトリーの目的は、その１種または複数の特徴、例えば、標識されたリガンドまたは他の分子の存在に関して分離された粒子を解析することである。フローサイトメトリーの基本ステップは、液体流がセンシング領域を通過するような、装置による流体試料の誘導が関与する。粒子は、１つずつセンサーを通過する必要があり、サイズ、屈折、光散乱、乳白度、粗さ、形状、蛍光等に基づきカテゴリー化される。

フローサイトメトリーによって行われるのは、細胞解析だけではなく、細胞の選別も行われる。米国特許第３，８２６，３６４号では、機能的に異なる細胞型等、粒子を物理的に分離する装置が開示されている。この機械では、レーザーが、その中の粒子由来の高度に局在化された散乱が存在するように、適したレンズまたはレンズシステムによって粒子の流れに焦点を合わせた照射を与える。加えて、流れの中の蛍光粒子の励起のために、高強度照射源が、粒子の流れに方向づけられる。流れの中のある特定の粒子を選択的に帯電し、次いでこれを指定されたレセプタクルに偏向させることにより分離することができる。この分離の古典的な形態は、分離のための１種または複数の細胞型のマークに使用される蛍光タグ付けされた抗体による。

フローサイトメトリーのための方法の他の例として、それぞれ特に参照により本明細書に組み込む、米国特許第４，２８４，４１２号；同第４，９８９，９７７号；同第４，４９８，７６６号；同第５，４７８，７２２号；同第４，８５７，４５１号；同第４，７７４，１８９号；同第４，７６７，２０６号；同第４，７１４，６８２号；同第５，１６０，９７４号；および同第４，６６１，９１３号に記載されている方法が挙げられるがこれらに限定されない。

本発明のため、フローサイトメトリーの重要な態様は、複数ラウンドのスクリーニングを逐次に行うことができることである。細胞は、選別の初期ラウンドから単離し、フローサイトメーターに直ちに再導入し、再度スクリーニングして、スクリーニングのストリンジェンシーを改善することができる。当業者に公知の別の利点は、フローサイトメトリーを使用して、非生存細胞を回収することができることである。フローサイトメトリーは、基本的に粒子選別技術であるため、成長または繁殖する細胞の能力は必要ない。かかる非生存細胞から核酸を回収するための技法は、本技術分野で周知であり、例えば、ＰＣＲを含む鋳型依存性増幅技法の使用を含むことができる。

Ｅ．Ｆｃドメインコード配列のクローニング
所望の特異性、親和性および／または活性の分子を産生する細菌細胞が識別された後に、対応するコード配列をクローニングすることができる。この様式では、従来手順（例えば、抗体または結合タンパク質をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを使用することにより）を使用して、分子をコードするＤＮＡを単離し、配列決定することができる。当業者であれば、生存細胞または生存不能細胞から核酸をクローニングすることができることを理解できる。生存不能細胞の場合、例えば、ＰＣＲを使用して、例えば、クローニングされたＤＮＡの増幅を使用することが望まれ得る。これは、さらなる細胞育成ありまたはなしのいずれかで、生存細胞を使用して行うこともできる。

単離されると、抗体ＦｃドメインＤＮＡを発現ベクターに加え、次いでこれを細菌等の宿主細胞にトランスフェクトすることができる。ＤＮＡは、例えば、ヒト重および軽鎖可変ドメインの配列の付加により、または非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の全体もしくは部分を免疫グロブリンコード配列に共有結合により繋ぐことにより改変されていてもよい。この様式では、「キメラ」または「ハイブリッド」結合タンパク質は、所望の結合特異性を有するように調製される。例えば、識別された抗体Ｆｃドメインは、治療用ポリペプチドまたは毒素に融合し、特定のＦｃＲを発現する細胞を標的にするため（ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏ）に使用することができる。

キメラまたはハイブリッドＦｃドメインは、架橋剤が関与する方法を含む、合成タンパク質化学における公知の方法を使用してｉｎ ｖｉｔｒｏで調製することもできる。例えば、標的化毒素は、ジスルフィド交換反応を使用してまたはチオエーテル結合を形成することにより構築することができる。この目的に適した試薬の例として、イミノチオレートおよびメチル−４−メルカプトブチルイミデート（butyrimidate）が挙げられる。

Ｖ．核酸に基づく発現系
核酸に基づく発現系は、本発明のある特定の実施形態では、組換えタンパク質の発現に使用を見出すことができる。例えば、本発明の一実施形態は、抗体Ｆｃドメインまたは好ましくは、複数の別個のＦｃドメインのコード配列によるグラム陰性細菌の形質転換が関与する。

Ａ．核酸送達方法
本発明のある特定の態様は、標的細胞（例えば、グラム陰性細菌）への核酸の送達を含むことができる。例えば、細菌宿主細胞は、ＦｃＲに結合する可能性がある候補Ｆｃドメインをコードする核酸により形質転換することができる。本発明の特定の実施形態では、細菌のペリプラズムへの発現を標的化することが望まれ得る。真核生物宿主細胞の形質転換は、同様に、標的リガンドに結合することができると識別される様々な候補分子の発現における使用を見出すことができる。

細胞の形質転換のための核酸送達に適した方法は、細胞またはさらにはそのオルガネラに核酸（例えば、ＤＮＡ）を導入することができる実質的にいかなる方法も含むと考えられる。かかる方法として、次のものが挙げられるがこれらに限定されない；マイクロインジェクション（HarlandおよびWeintraub、１９８５年；参照により本明細書に組み込む米国特許第５，７８９，２１５号）を含めた注射等によるＤＮＡの直接送達（それぞれ参照により本明細書に組み込む米国特許第５，９９４，６２４号；第５，９８１，２７４号；第５，９４５，１００号；第５，７８０，４４８号；第５，７３６，５２４号；第５，７０２，９３２号；第５，６５６，６１０号；第５，５８９，４６６号；および第５，５８０，８５９号）；エレクトロポレーション（参照により本明細書に組み込む米国特許第５，３８４，２５３号）；リン酸カルシウム沈殿（GrahamおよびVan Der Eb、１９７３年；ChenおよびOkayama、１９８７年；Rippeら、１９９０年）；ＤＥＡＥ−デキストランに続くポリエチレングリコールの使用（Gopal、１９８５年）；直接音波負荷（Fechheimerら、１９８７年）；リポソーム媒介性トランスフェクション（NicolauおよびSene、１９８２年；Fraleyら、１９７９年；Nicolauら、１９８７年；Wongら、１９８０年；Kanedaら、１９８９年；Katoら、１９９１年）；微粒子銃（それぞれ参照により本明細書に組み込むＰＣＴ公開番号ＷＯ９４／０９６９９および９５／０６１２８；米国特許第５，６１０，０４２号；同第５，３２２，７８３号；同第５，５６３，０５５号；同第５，５５０，３１８号；同第５，５３８，８７７号；および同第５，５３８，８８０号）；またはシリコンカーバイド繊維による揺動（Kaepplerら、１９９０年；それぞれ参照により本明細書に組み込む米国特許第５，３０２，５２３号および同第５，４６４，７６５号）；乾燥／阻害媒介性ＤＮＡ取込み（Potrykusら、１９８５年）によるもの。これらのもの等の技法の適用により、細胞を安定にまたは一過的に形質転換することができる。

Ｂ．ベクター
ベクターは、本発明による、例えば、候補Ｆｃドメインをコードする核酸配列による細胞の形質転換における使用を見出すことができる。本発明の一実施形態では、ポリペプチドをコードする核酸配列の不均一「ライブラリー」全体を細胞の集団に導入し、これにより、ライブラリー全体のスクリーニングを可能にすることができる。用語「ベクター」は、それが複製され得る細胞への導入のために核酸配列を挿入することができる担体核酸分子を指すように使用される。核酸配列は、ベクターが導入されている細胞に対し外来性であること、または配列が、細胞における配列に対し相同であるが、宿主細胞核酸内の配列が通常は存在しないポジションに存在することを意味する「外因性」または「異種」であり得る。ベクターは、プラスミド、コスミドおよびウイルス（例えば、バクテリオファージ）を含む。当業者は、いずれも参照により本明細書に組み込むManiatisら、１９８８年およびAusubelら、１９９４年に記載されている標準組換え技法によりベクターを構築することができる。

用語「発現ベクター」は、転写され得る遺伝子産物の少なくとも部分をコードする核酸配列を含有するベクターを指す。場合によっては、次いでＲＮＡ分子が、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドに翻訳される。発現ベクターは、特定の宿主生物における作動可能に連結されたコード配列の転写および場合により翻訳に必要な核酸配列を指す種々の「制御配列」を含有することができる。転写および翻訳を支配する制御配列に加えて、ベクターおよび発現ベクターは、同様に他の機能を果たす核酸配列を含有することができる。

１．プロモーターおよびエンハンサー
「プロモーター」は、転写の開始および速度が制御される核酸配列の領域である制御配列である。これは、ＲＮＡポリメラーゼおよび他の転写因子等、調節タンパク質および分子が結合することができる遺伝的エレメントを含有することができる。語句「作動可能に配置される」、「作動可能に連結される」、「制御下にある」および「転写制御下にある」は、プロモーターが、核酸配列との関連において、この配列の転写開始および／または発現を制御するために、正確で機能的な位置および／または配向にあることを意味する。プロモーターは、核酸配列の転写活性化に関与するシス作用性調節配列を指す「エンハンサー」と併せて使用されても使用されなくてもよい。分子生物学分野の当業者は一般に、タンパク質発現のためのプロモーター、エンハンサーおよび細胞型組合せの使用についてよく知っており、例えば、参照により本明細書に組み込むSambrookら（１９８９年）を参照されたい。

２．開始シグナル
特異的な開始シグナルが、コード配列の効率的な翻訳に必要とされる場合もある。これらのシグナルは、ＡＴＧ開始コドンまたは隣接配列を含む。ＡＴＧ開始コドンを含む外因性翻訳制御シグナルが配備される必要がある場合もある。当業者であれば、容易にこれを決定し、必要なシグナルを配備することができるであろう。挿入配列全体の翻訳を確実にするために、開始コドンが、所望のコード配列の読み枠と「インフレーム」でなければならないことが周知である。外因性翻訳制御シグナルおよび開始コドンは、天然または合成のいずれであってもよい。発現の効率は、適切な転写エンハンサーエレメントの包接によって増強され得る。

３．多重クローニング部位
ベクターは、そのいずれもベクターを消化するための標準組換え技術と併せて使用することができる、複数の制限酵素部位を含有する核酸領域である多重クローニング部位（ＭＣＳ）を含むことができる（参照により本明細書に組み込むCarbonelliら、１９９９年、Levensonら、１９９８年およびCocea、１９９７年を参照）。「制限酵素消化」は、核酸分子中の特異的な位置のみに機能する酵素による核酸分子の触媒による切断を指す。これらの制限酵素の多くは市販されている。頻繁に、外因性配列がベクターにライゲーションされることを可能にするために、ベクターは、ＭＣＳ内をカットする制限酵素を使用して直鎖化または断片化される。「ライゲーション」は、互いに近接していても近接していなくてもよい２本の核酸断片の間にホスホジエステル結合を形成するプロセスを指す。制限酵素およびライゲーション反応が関与する技法は、組換え技術分野の当業者に周知である。

４．終結シグナル
本発明に従って調製されるベクターまたは構築物は一般に、少なくとも１種の終結シグナルを含み得る。「終結シグナル」または「ターミネーター」は、ＲＮＡポリメラーゼによるＲＮＡ転写物の特異的な終結に関与するＤＮＡ配列で構成される。よって、ある特定の実施形態では、ＲＮＡ転写物の産生を終了する終結シグナルが企図される。ターミネーターは、所望のメッセージレベルの達成のためにｉｎ ｖｉｖｏで必要となる場合がある。本発明における使用に企図されるターミネーターは、当業者に公知のいずれか公知の転写ターミネーターを含み、ｒｈｏ依存性またはｒｈｏ非依存性ターミネーターが挙げられるがこれらに限定されない。ある特定の実施形態では、終結シグナルは、配列トランケーションによる等、転写可能または翻訳可能配列を欠いていてよい。

５．複製起点
宿主細胞においてベクターを繁殖させるために、複製が開始される特異的核酸配列である、１個または複数の複製起点部位（「ｏｒｉ」と命名されることが多い）を含有することができる。

６．選択可能およびスクリーニング可能マーカー
本発明のある特定の実施形態では、本発明の核酸構築物を含有する細胞は、発現ベクター中にマーカーを含むことにより、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで識別することができる。かかるマーカーは、細胞に識別可能な変化を付与し、発現ベクターを含有する細胞の容易な識別を可能にすることができる。一般に、選択可能マーカーは、選択を可能にする特性を付与するマーカーである。正の選択可能マーカーは、マーカーの存在がその選択を可能にするマーカーである一方、負の選択可能マーカーは、その存在がその選択を防止するマーカーである。正の選択可能マーカーの例は、薬物抵抗性マーカーである。

通常、薬物選択マーカーを含めることは、形質転換体のクローニングおよび識別に役立ち、例えば、ネオマイシン、ピューロマイシン、ハイグロマイシン、ＤＨＦＲ、ＧＰＴ、ゼオシン（zeocin）およびヒスチジノールに対する抵抗性を付与する遺伝子が、有用な選択可能マーカーである。条件の実行に基づく形質転換体の識別を可能にする表現型を付与するマーカーに加えて、その基盤が比色解析であるＧＦＰ等のスクリーニング可能マーカーを含む他の種類のマーカーも企図される。あるいは、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）等、スクリーニング可能酵素を利用することができる。当業者であれば、場合によりＦＡＣＳ解析と併せて、免疫性マーカーを用いる仕方も知っているであろう。遺伝子産物をコードする核酸と同時に発現されることが可能である限り、使用されるマーカーは、重要であるとは考えられない。選択可能およびスクリーニング可能マーカーのさらなる例は、当業者に周知である。

Ｃ．宿主細胞
異種核酸配列の発現の文脈において、「宿主細胞」は、原核細胞を指し、ベクターを複製することができるおよび／またはベクターによってコードされた異種遺伝子を発現することができるいずれかの形質転換可能な生物を含む。宿主細胞は、ベクターのレシピエントとして使用することができ、そのように使用されてきた。宿主細胞は、「トランスフェクト」または「形質転換」することができ、これは、外因性核酸が宿主細胞に移入または導入されるプロセスを指す。形質転換された細胞は、初代対象細胞およびその後代を含む。

本発明の特定の実施形態では、宿主細胞は、グラム陰性細菌細胞である。これらの細菌は、内膜および外膜の間に細胞膜周辺腔を保有するという点において、本発明による使用に適しており、特に、上述の内膜は、ペリプラズムと細胞質との間にあり、これは、細胞膜としても公知である。したがって、かかる細胞膜周辺腔を有する他のいずれかの細胞を本発明に従って使用することができる。本発明による使用を見出すことができるグラム陰性細菌の例として、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ、Ｂｏｒｄｏｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉ、Ｅｒｗｉｎｉａ ａｍｙｌｏｖｏｒａ、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｓｐ．を挙げることができるがこれらに限定されない。

適切な宿主は、ベクター骨格および所望の結果に基づき、当業者によって決定することができる。プラスミドまたはコスミドは、例えば、多くのベクターの複製のために原核生物宿主細胞に導入することができる。ベクター複製および／または発現のための宿主細胞として使用される細菌細胞は、ＤＨ５α、ＪＭ１０９およびＫＣ８、ならびにＳＵＲＥ（登録商標）コンピテント細胞およびＳＯＬＯＰＡＣＫ（商標）Ｇｏｌｄ細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（登録商標）、Ｌａ Ｊｏｌｌａ）等の多数の市販の細菌宿主を含む。あるいは、Ｅ．ｃｏｌｉ ＬＥ３９２等の細菌細胞は、バクテリオファージの宿主細胞として使用することができる。

哺乳動物宿主細胞の例として、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ−Ｋ１；ＡＴＣＣ ＣＣＬ６１）、ラット下垂体細胞（ＧＨ１；ＡＴＣＣ ＣＣＬ８２）、ＨｅＬａ Ｓ３細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ２．２）、ラットヘパトーマ細胞（Ｈ−４−ＩＩ−Ｅ；ＡＴＣＣＣＲＬ １５４８）、ＳＶ４０形質転換サル腎臓細胞（ＣＯＳ−１；ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５０）およびマウス胚細胞（ＮＩＨ−３Ｔ３；ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５８）が挙げられる。前述は、本技術分野で公知の多くの可能な宿主生物の限定ではなく例示を目的とする。

ポリペプチドを発現する哺乳動物宿主細胞は、親細胞株の培養に典型的に用いられる条件下で培養される。一般に、細胞は、典型的には、５％〜１０％のウシ胎仔血清等の血清を補充した、標準ＲＰＭＩ、ＭＥＭ、ＩＭＥＭまたはＤＭＥＭ等、生理的な塩および栄養素を含有する標準培地において培養される。培養条件も標準であり、例えば、培養物は、所望のレベルのタンパク質が達成されるまで、静置または回転培養において３７℃でインキュベートされる。

様々な細胞型および生物由来の多くの宿主細胞を利用することができ、当業者に公知であろう。同様に、特に、ベクターの複製または発現に許容的なウイルスベクターを原核生物宿主細胞と併せて使用することができる。一部のベクターは、原核および真核細胞の両方におけるその複製および／または発現を可能にする制御配列を用いることができる。当業者であれば、上述の宿主細胞の全てをインキュベートして、これらを維持し、ベクターの複製を可能にするための条件をさらに理解するであろう。ベクターの大規模産生、ならびにベクターによってコードされる核酸およびその同族ポリペプチド、タンパク質またはペプチドの産生を可能にするであろう技法および条件も理解され公知である。

Ｄ．発現系
上に記す組成物の少なくとも部分または全部を含む、多数の発現系が存在する。かかる系は、例えば、特定のリガンドに結合することができると本発明に従って識別されたポリペプチド産物の産生に使用することができる。原核生物に基づく系は、本発明による使用に用いて、核酸配列またはその同族ポリペプチド、タンパク質およびペプチドを産生することができる。多くのかかる系は、市販されており、広く入手できる。発現系の他の例は、Ｔ７、Ｔａｃ、Ｔｒｃ、ＢＡＤ、ラムダｐＬ、テトラサイクリンまたはＬａｃプロモーター等、強い原核生物プロモーターを含有するベクター、ｐＥＴ発現系およびＥ．ｃｏｌｉ発現系を含む。

本発明のある特定の態様では、ポリペプチドをコードする核酸配列が開示される。いずれの発現系が使用されるかに応じて、従来方法に基づき核酸配列を選択することができる。例えば、ポリペプチドが、ヒトポリペプチドに由来し、Ｅ．ｃｏｌｉではめったに利用されない複数のコドンを含有する場合、これは、Ｅ．ｃｏｌｉにおける発現に干渉し得る。したがって、それぞれの遺伝子またはそのバリアントは、Ｅ．ｃｏｌｉ発現のためにコドン最適化することができる。様々なベクターを使用して、目的のタンパク質を発現させることもできる。例示的なベクターとして、プラスミドベクター、ウイルスベクター、トランスポゾンまたはリポソームに基づくベクターが挙げられるがこれらに限定されない。

ＶＩ．タンパク質精製
タンパク質精製技法は、当業者に周知である。これらの技法は、あるレベルにおいて、細胞、組織または器官のポリペプチドおよび非ポリペプチド画分へのホモジナイゼーションおよび粗分画が関与する。他に指定がなければ、目的のタンパク質またはポリペプチドは、クロマトグラフィーおよび電気泳動技法を使用してさらに精製して、部分的または完全な精製（または均一になるまで精製）を達成することができる。純粋ペプチドの調製に特に適する分析方法は、イオン交換クロマトグラフィー、分子ふるいクロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、親和性クロマトグラフィー、免疫親和性クロマトグラフィーおよび等電点電気泳動である。ペプチドを精製する特に効率的な方法は、高速性能（fast-performance）液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）またはさらには高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）である。本技術分野で一般に公知の通り、様々な精製ステップの実施順序を変化させても、またはある特定のステップを省略しても、依然として、実質的に精製されたタンパク質またはペプチドの調製に適した方法をもたらすことができることが考えられる。

精製されたタンパク質またはペプチドは、他の構成成分から単離することができる組成物を指すことが意図され、タンパク質またはペプチドは、その天然に得ることができる状態と比べたいずれかの程度まで精製される。単離または精製されたタンパク質またはペプチドは、したがって、それが天然に生じ得る環境を含まないタンパク質またはペプチドも指す。一般に、「精製された」は、分画に付されて様々な他の構成成分が除去されたタンパク質またはペプチド組成物を指し、この組成物は、その発現された生物学的活性を実質的に保持するであろう。用語「実質的に精製された」が使用される場合、この命名は、タンパク質またはペプチドが、組成物中のタンパク質の約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％またはそれ超を構成する等、組成物の主要な構成成分を形成する組成物を指し得る。

タンパク質またはペプチドの精製の程度を定量化するための様々な方法は、本開示を踏まえることにより当業者に公知である。これらの方法は、例えば、活性画分の比活性の決定、またはＳＤＳ／ＰＡＧＥ解析による画分内のポリペプチドの量の評価を含む。画分の純度を評価するための好ましい方法は、画分の比活性を計算し、初期抽出物の比活性とこれを比較し、これにより、「精製倍率数」によって評価される、その中の純度の程度を計算することである。活性の量を表すために使用される実際の単位は、当然ながら、精製を追跡するために選択された特定のアッセイ技法、および発現されたタンパク質またはペプチドが検出可能な活性を示すか否かに依存し得る。

タンパク質またはペプチドがその最も精製された状態で常に提供されることの一般要件はない。実際には、ある特定の実施形態では、実質的に精製度が低い産物が、有用性を有する場合があることが企図される。部分的な精製は、より少ない精製ステップを組み合わせて使用することにより、または同じ一般精製スキームの異なる形態を利用することにより達成することができる。例えば、ＨＰＬＣ装置を利用して行われたカチオン交換カラムクロマトグラフィーは、一般に、低圧クロマトグラフィー系を利用した同じ技法よりも大きい「倍数」の精製をもたらすことが認められる。より低い程度の相対的精製を示す方法は、タンパク質産物の総回収量または発現されたタンパク質の活性の維持において利点を有することができる。

親和性クロマトグラフィーは、単離しようとする物質と、それが特異的に結合することができる分子との間の特異的な親和性に頼るクロマトグラフィー手順である。これは、受容体−リガンド型の相互作用である。カラム材料は、結合パートナーの一方を不溶性マトリックスに共有結合によりカップリングすることにより合成される。すると、カラム材料は、溶液から物質を特異的に吸着することができる。溶出は、結合が起こらないように条件を変化させることにより起こる（例えば、ｐＨ、イオン強度、温度等の変更）。マトリックスは、いかなる有意な程度にも分子を吸着しない、広範囲の化学的、物理的および熱安定性を有する物質となるべきである。リガンドは、その結合特性に影響を与えないような仕方でカップリングされるべきである。リガンドはまた、相対的に緊密な結合をもたらすべきである。試料またはリガンドを破壊することなく物質を溶出することが可能となるべきである。

サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）は、溶液中の分子が、そのサイズまたはより専門的な用語では、その流体力学的容積に基づき分離されるクロマトグラフィー方法である。これは通常、タンパク質および工業用ポリマー等、大分子または高分子複合体に適用される。典型的には、水溶液が、カラムを通した試料の輸送に使用される場合、この技法は、ゲル濾過クロマトグラフィーとして公知であるのに対し、名称、ゲル浸透クロマトグラフィーは、移動相として有機溶媒が使用される場合に使用される。ＳＥＣの根底にある原理は、異なる速度で固定相を通って異なるサイズの粒子が溶出（濾過）することである。これは、サイズに基づく粒子の溶液の分離をもたらす。全粒子が、同時にまたはほぼ同時にロードされるのであれば、同じサイズの粒子は、一緒に溶出するはずである。

高速液体クロマトグラフィー（または高圧液体クロマトグラフィー、ＨＰＬＣ）は、化合物を分離、識別および定量化するために、生化学および分析化学において頻繁に使用されるカラムクロマトグラフィーの一形態である。ＨＰＬＣは、クロマトグラフィーパッキング材料（固定相）を保持するカラム、カラムを通して移動相（単数または複数）を動かすポンプ、および分子の保持時間を示す検出器を利用する。保持時間は、固定相、解析されている分子および使用されている溶媒（単数または複数）の間の相互作用に応じて変動する。

ＶＩＩ．医薬組成物
ポリペプチドまたは抗体を含有する医薬組成物の臨床適用が行われる場合、意図される適用に適切な医薬または治療組成物を調製することが一般に有益であり得る。一般に、医薬組成物は、薬学的に許容される担体に溶解または分散された、有効量の１種または複数のポリペプチドまたは追加的な作用物質を含むことができる。ある特定の実施形態では、医薬組成物は、例えば、少なくとも約０．１％のポリペプチドまたは抗体を含むことができる。他の実施形態では、ポリペプチドまたは抗体は、例えば約２％〜約７５％の間の重量の単位または約２５％〜約６０％の間、およびそこから導くことができるいずれかの範囲を含むことができる。各治療的に有用な組成物における活性化合物（単数または複数）の量は、いずれかの所定の単位用量の化合物の適した投与量が得られるような仕方で調製することができる。溶解度、バイオアベイラビリティ、生物学的半減期、投与経路、製品有効期間、ならびに他の薬理学的考察等の因子は、かかる医薬品製剤を調製する分野の当業者によって企図され、したがって、種々の投与量および処置レジメンが所望され得る。

語句「薬学的または薬理学的に許容される」は、必要に応じてヒト等の動物に投与されたときに、有害、アレルギーまたは他の不都合な反応を生じない分子実体および組成物を指す。参照により本明細書に組み込むRemington’s Pharmaceutical Sciences、第１８版、１９９０年によって例示される通り、抗体または追加的な活性成分を含む医薬組成物の調製は、本開示を踏まえることにより当業者に公知であろう。さらに、動物（例えば、ヒト）投与のため、調製物が、ＦＤＡ Ｏｆｆｉｃｅ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｔａｎｄａｒｄｓによって要求される無菌性、発熱性、一般的安全性および純度標準を満たすべきであることが理解される。

さらに、本発明のある特定の態様に従って、投与に適した組成物は、不活性希釈剤ありまたはなしの薬学的に許容される担体中に提供することができる。担体は、同化可能となるべきであり、液体、半固体、すなわち、ペーストまたは固体担体を含む。担体または希釈剤の例として、脂肪、油、水、生理食塩水溶液、脂質、リポソーム、樹脂、結合剤、フィラー等またはこれらの組合せが挙げられる。本明細書において使用する場合、「薬学的に許容される担体」は、当業者に公知の通り、ありとあらゆる水性溶媒（例えば、水、アルコール／水溶液、エタノール、生理食塩水溶液、非経口的ビヒクル、例えば、塩化ナトリウム、リンゲルのデキストロース等）、非水性溶媒（例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油および注射用有機エステル、例えば、エチルオレエート）、分散媒、コーティング（例えば、レシチン）、界面活性剤、抗酸化剤、保存料（例えば、抗細菌剤または抗真菌剤、抗酸化剤、キレート剤、不活性ガス、パラベン（例えば、メチルパラベン、プロピルパラベン）、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール）、等張剤（例えば、糖、塩化ナトリウム）、吸収遅延剤（例えば、モノステアリン酸アルミニウム、ゼラチン）、塩、薬物、薬物安定剤（例えば、緩衝液、アミノ酸、例えば、グリシンおよびリシン、炭水化物、例えば、デキストロース、マンノース、ガラクトース、フルクトース、ラクトース、スクロース、マルトース、ソルビトール、マンニトール等）、ゲル、結合剤、賦形剤、崩壊剤、潤滑剤、甘味剤、香料剤、色素、流体および栄養素補充薬、そのような材料およびこれらの組合せを含む。任意の従来の培地、作用物質、希釈剤または担体が、レシピエントまたはそれが含有される組成物の治療有効性にとって有害である場合を除いて、本方法の実施における使用のための投与可能な組成物におけるその使用は適切である。医薬組成物におけるｐＨおよび様々な構成成分の正確な濃度は、周知のパラメータに従って調整される。本発明のある特定の態様に従って、組成物は、いずれかの簡便かつ実用的な様式で、すなわち、溶解、懸濁、乳化、混合、カプセル被包、吸収、粉砕等により、担体と組み合わされる。かかる手順は、当業者にとってルーチンである。

本発明のある特定の実施形態は、固体、液体またはエアロゾル形態で投与されるべきか、および注射等の投与経路のために無菌である必要があるかに応じて異なる種類の担体を含むことができる。組成物は、当業者に公知の通り、静脈内、皮内、経皮、くも膜下腔内、動脈内、腹腔内、鼻腔内、腟内、直腸内、筋肉内、皮下、粘膜、経口、外用、局所的、吸入による（例えば、エアロゾル吸入）、注射による、注入による、持続注入による、標的細胞を直接浸す局在化灌流による、カテーテルによる、洗浄による、脂質組成物（例えば、リポソーム）における、または他の方法もしくは前述のいずれかの組合せによる投与のために製剤化することができる（例えば、参照により本明細書に組み込むRemington’s Pharmaceutical Sciences、第１８版、１９９０年を参照）。典型的には、かかる組成物は、液体の溶液または懸濁液のいずれかとして調製することができ；注射に先立つ液体の添加により溶液または懸濁液を調製するための使用に適した固体形態を調製することもでき；調製物は、乳化することができる。

ポリペプチドは、遊離塩基、中性または塩形態で組成物中に製剤化することができる。薬学的に許容される塩は、酸付加塩、例えば、タンパク質性組成物の遊離アミノ基により生成される塩、あるいは例えば、塩酸もしくはリン酸等の無機酸または酢酸、シュウ酸、酒石酸もしくはマンデル酸等の有機酸により生成される塩を含む。遊離カルボキシル基により生成された塩は、例えば、水酸化ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウムもしくは第二鉄等、無機塩基；またはイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジンもしくはプロカイン等、有機塩基に由来することができる。

さらなる実施形態では、本発明は、ポリペプチド、１種または複数の脂質および水性溶媒を含む医薬脂質媒体組成物の使用に関係することができる。本明細書において使用する場合、用語「脂質」は、水に特徴的に不溶性であり、有機溶媒で抽出することができる広範囲の物質のいずれかを含むと規定され得る。この広範なクラスの化合物は、当業者に周知であり、本明細書で用語「脂質」が使用される場合、いずれかの特定の構造に限定されない。例として、長鎖脂肪族炭化水素およびその誘導体を含有する化合物が挙げられる。脂質は、天然起源または合成（すなわち、人の手により設計または産生）であり得る。しかし、脂質は通常、生物学的物質である。生物学的脂質は、本技術分野で周知であり、例えば、中性脂肪、リン脂質、ホスホグリセリド、ステロイド、テルペン、リゾ脂質（lysolipid）、スフィンゴ糖脂質、糖脂質、スルファチド（sulphatide）、エーテルおよびエステル連結した脂肪酸を有する脂質、重合可能脂質ならびにこれらの組合せを含む。当然ながら、当業者によって脂質として理解されている、特に本明細書に記載されている以外の化合物も、本組成物および方法によって包含される。

当業者であれば、脂質ビヒクルにおける組成物の分散に用いることができる技法の範囲についてよく知っているであろう。例えば、ポリペプチドまたはその融合タンパク質は、脂質を含有する溶液中に分散させ、脂質により溶解し、脂質により乳化し、脂質と混合し、脂質と組み合わせ、脂質に共有結合し、脂質における懸濁液として含有し、ミセルもしくはリポソームと共に含有もしくは複合体形成させ、または当業者に公知のいずれかの手段により他の仕方で脂質もしくは脂質構造と会合させることができる。分散は、リポソームの形成をもたらしてももたらさなくてもよい。

用語「単位用量」または「投与量」は、対象における使用に適した物理的に別々の単位を指し、各単位は、その投与、すなわち、適切な経路および処置レジメンに関連して上に記す所望の応答を生じると計算された治療組成物の既定の量を含有する。処置回数および単位用量の両方に従って投与するべき量は、所望の効果に依存する。患者または対象に投与される本実施形態の組成物の実際の投与量は、対象の体重、年齢、健康および性別、処置されている疾患の種類、疾患浸透の程度、以前のまたは同時発生的な治療介入、患者の特発性、投与経路、ならびに特定の治療用物質の効力、安定性および毒性等、身体的および生理的因子によって決定することができる。他の非限定例において、用量は、投与当たり約１マイクログラム／ｋｇ／体重、約５マイクログラム／ｋｇ／体重、約１０マイクログラム／ｋｇ／体重、約５０マイクログラム／ｋｇ／体重、約１００マイクログラム／ｋｇ／体重、約２００マイクログラム／ｋｇ／体重、約３５０マイクログラム／ｋｇ／体重、約５００マイクログラム／ｋｇ／体重、約１ミリグラム／ｋｇ／体重、約５ミリグラム／ｋｇ／体重、約１０ミリグラム／ｋｇ／体重、約５０ミリグラム／ｋｇ／体重、約１００ミリグラム／ｋｇ／体重、約２００ミリグラム／ｋｇ／体重、約３５０ミリグラム／ｋｇ／体重、約５００ミリグラム／ｋｇ／体重から約１０００ミリグラム／ｋｇ／体重またはそれ超およびそこから導くことができるいずれかの範囲を含むこともできる。ここに収載されている数から導くことができる範囲の非限定例において、約５ミリグラム／ｋｇ／体重〜約１００ミリグラム／ｋｇ／体重、約５マイクログラム／ｋｇ／体重〜約５００ミリグラム／ｋｇ／体重等の範囲を上述の数に基づき投与することができる。投与に責任がある医師は、いかなる場合でも、組成物における活性成分（単数または複数）の濃度および個々の対象に適切な用量（単数または複数）を決定し得る。

本発明は、治療用調製物の特定の性質によって限定されることは意図されない。例えば、かかる組成物は、生理的に許容できる液体、ゲルまたは固体担体、希釈剤および賦形剤と一緒に製剤中に提供することができる。これらの治療用調製物は、飼育動物による等の獣医学的使用および他の治療剤と同様の様式でのヒトにおける臨床使用のために哺乳動物に投与することができる。一般に、治療有効性に必要とされる投与量は、使用の種類および投与機序、ならびに個々の対象の特定化された要件に応じて変動し得る。動物患者に投与される組成物の実際の投与量は、体重、状態の重症度、処置されている疾患の種類、以前のまたは同時発生的な治療介入、患者の特発性、および投与経路等、身体的および生理的因子によって決定することができる。投与量および投与経路に依存して、好まれる投薬量および／または有効量の投与の回数は、対象の応答に応じて変動し得る。投与に責任がある医師は、いかなる場合でも、組成物における活性成分（単数または複数）の濃度および個々の対象に適切な用量（単数または複数）を決定し得る。

ＶＩＩＩ．処置方法
本発明のある特定の態様は、腫瘍等、疾患を処置するためのポリペプチドを提供する。特に、ポリペプチドは、ヒトポリペプチド配列を有することができ、よって、ヒト患者におけるアレルギー反応を防止し、反復投与を可能にし、治療有効性を増加させることができる。

「処置」および「処置する」は、疾患または健康関連の状態の治療利益を得る目的で、対象への治療剤の投与もしくは適用、または対象における手順もしくはモダリティの実行を指す。例えば、処置は、がん細胞増殖を誘発することなくがん細胞にＣＤＣを標的化する、薬学的有効量の抗体の投与を含むことができる。

「対象」および「患者」は、霊長類、哺乳動物および脊椎動物等、ヒトまたは非ヒトのいずれかを指す。特定の実施形態では、対象は、ヒトである。

用語「治療利益」または「治療上有効」は、本願を通して使用される場合、この状態の医学的処置に関して対象の福祉を促進または増強する任意のものを指す。したがってこうしたものとしては、疾患の徴候または症状の頻度または重症度の低下が挙げられるがこれらに限定されない。例えば、がんの処置は、例えば、腫瘍サイズの低下、腫瘍侵襲性の低下、がん成長速度の低下、または転移の防止が関与し得る。がんの処置は、がんを有する対象の生存延長を指すこともできる。

本処置方法が有用な腫瘍は、固形腫瘍または血液学的腫瘍に見出されるもの等、任意の悪性細胞型を含む。例示的な固形腫瘍として、膵臓、結腸、盲腸、胃、脳、頭部、頸部、卵巣、腎臓、喉頭、肉腫、肺、膀胱、メラノーマ、前立腺および乳房からなる群から選択される臓器の腫瘍を挙げることができるがこれらに限定されない。例示的な血液学的腫瘍は、骨髄の腫瘍、ＴまたはＢ細胞悪性病変、白血病、リンパ腫、芽腫、骨髄腫等を含む。本明細書に提供されている方法を使用して処置することができるがんのさらなる例として、癌腫、リンパ腫、芽腫、肉腫、白血病、扁平上皮がん、肺がん（小細胞肺がん、非小細胞肺がん、肺の腺癌および肺の扁平上皮癌を含む）、腹膜のがん、肝細胞がん、胃（gastric）または胃（stomach）がん（胃腸管がんおよび胃腸管間質がんを含む）、膵がん、神経膠芽腫、子宮頸部がん、卵巣がん、肝臓がん、膀胱がん、乳がん、結腸がん、結腸直腸がん、子宮内膜または子宮癌、唾液腺癌、腎臓または腎がん、前立腺がん、外陰部がん、甲状腺がん、様々な種類の頭頸部がん、メラノーマ、表在拡大型メラノーマ、悪性黒子メラノーマ、末端黒子型メラノーマ、結節性メラノーマおよびＢ細胞リンパ腫（低悪性度／濾胞性非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）；小リンパ球性（ＳＬ）ＮＨＬ；中悪性度／濾胞性ＮＨＬ；中悪性度びまん性ＮＨＬ；高悪性度免疫芽球性ＮＨＬ；高悪性度リンパ芽球性ＮＨＬ；高悪性度小型非切れ込み核細胞性ＮＨＬ；巨大腫瘤病変ＮＨＬ；マントル細胞リンパ腫；ＡＩＤＳ関連リンパ腫；およびワルデンストレーム高ガンマグロブリン血症を含む）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、ヘアリー細胞白血病、多発性骨髄腫、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）ならびに慢性骨髄芽球性白血病が挙げられるがこれらに限定されない。

がんは、特に、次の組織学的な型のものであり得るが、これらに限定されない：新生物、悪性；癌腫；癌腫、未分化；巨細胞および紡錘細胞癌；小細胞癌；乳頭癌；扁平上皮癌；リンパ上皮癌；基底細胞癌；石灰化上皮（pilomatrix）癌；移行細胞癌；乳頭移行細胞癌；腺癌；ガストリノーマ、悪性；胆管細胞癌；肝細胞癌；肝細胞癌および胆管細胞癌の組合せ；線維柱帯腺癌；腺様嚢胞癌；腺腫性ポリープにおける腺癌；腺癌、家族性大腸ポリポーシス；固形癌；カルチノイド腫瘍、悪性；細気管支肺胞（branchiolo-alveolar）
腺癌；乳頭腺癌；嫌色素性癌；好酸球癌；好酸性腺癌；好塩基球癌；明細胞腺癌；顆粒細胞癌；濾胞性腺癌；乳頭および濾胞性腺癌；非被包性硬化性癌；副腎皮質癌；類内膜（endometroid）癌；皮膚付属器癌；アポクリン腺癌；皮脂腺癌；耳道腺癌；粘膜表皮癌；嚢胞腺癌；乳頭嚢胞腺癌；乳頭漿液性嚢胞腺癌；粘液性嚢胞腺癌；粘液性腺癌；印環細胞癌；浸潤性乳管癌；髄様癌；小葉癌；炎症性癌；パジェット病、乳腺；腺房細胞癌；腺扁平上皮癌；腺癌ｗ／扁平上皮異形成；胸腺腫、悪性；卵巣間質腫瘍、悪性；莢膜細胞腫、悪性；顆粒膜細胞腫瘍、悪性；アンドロブラストーマ、悪性；セルトリ細胞癌；ライディッヒ細胞腫瘍、悪性；脂質細胞腫瘍、悪性；パラガングリオーマ、悪性；乳房外パラガングリオーマ、悪性；褐色細胞腫；血管球血管肉腫（glomangiosarcoma）；悪性メラノーマ；無色素性メラノーマ；表在拡大型メラノーマ；巨大色素性母斑における悪性メラノーマ；類上皮細胞メラノーマ；青色母斑、悪性；肉腫；線維肉腫；線維性組織球腫、悪性；粘液肉腫；脂肪肉腫；平滑筋肉腫；横紋筋肉腫；胚性横紋筋肉腫；肺胞横紋筋肉腫；間質肉腫；混合腫瘍、悪性；ミュラー管混合腫瘍；腎芽腫；肝芽腫；癌肉腫；間葉腫、悪性；ブレンナー腫瘍、悪性；葉状腫瘍、悪性；滑膜肉腫；中皮腫、悪性；未分化胚細胞腫；胚性癌；奇形腫、悪性；卵巣甲状腺腫、悪性；絨毛癌；中腎腫、悪性；血管肉腫；血管内皮腫、悪性；カポジ肉腫；血管外皮腫、悪性；リンパ管肉腫；骨肉腫；傍骨性骨肉腫；軟骨肉腫；軟骨芽細胞腫、悪性；間葉性軟骨肉腫；骨の巨細胞腫瘍；ユーイング肉腫；歯原性腫瘍、悪性；エナメル上皮肉腫；アメロブラストーマ、悪性；エナメル芽細胞線維肉腫；松果体腫、悪性；脊索腫；神経膠腫、悪性；上衣腫；星状細胞腫；原形質星状細胞腫；線維性星状細胞腫；星状芽細胞腫；神経膠芽腫；乏突起神経膠腫；乏突起膠細胞芽腫（oligodendroblastoma）；原始神経外胚葉性；小脳肉腫；神経節芽細胞腫；ニューロブラストーマ；網膜芽細胞腫；嗅覚神経原性腫瘍；髄膜腫、悪性；神経線維肉腫；神経鞘腫、悪性；顆粒細胞腫瘍、悪性；悪性リンパ腫；ホジキン病；ホジキン型；側肉芽腫；悪性リンパ腫、小リンパ球性；悪性リンパ腫、大細胞型、びまん性；悪性リンパ腫、濾胞性；菌状息肉腫；他の指定された非ホジキンリンパ腫；悪性組織球増殖症；多発性骨髄腫；マスト細胞肉腫；免疫増生性小腸性疾患；白血病；リンパ系白血病；形質細胞白血病；赤白血病；リンパ肉腫細胞白血病；骨髄性白血病；好塩基球性白血病；好酸球性白血病；単球性白血病；マスト細胞白血病；巨核芽球性白血病；骨髄性肉腫；およびヘアリー細胞白血病。

ポリペプチドは、本明細書において、腫瘍組織における補体活性化を誘発するためまたはそれが望ましいと考慮される場合に補体活性化を誘発するための、種々のモダリティにおける抗腫瘍剤として使用することができる。特定の実施形態では、本発明は、抗腫瘍剤としてポリペプチドを使用する方法を企図し、したがって、腫瘍細胞成長の阻害に十分な期間、腫瘍細胞の集団を治療有効量のポリペプチドと接触することを含む。

一実施形態では、ｉｎ ｖｉｖｏでの接触は、患者に本発明のポリペプチドを含む治療有効量の生理的に許容できる組成物を静脈内、腹腔内または腫瘍内注射により投与することにより達成される。ポリペプチドは、注射または時間をかけた漸進的注入により非経口的に投与することができる。ポリペプチドは、静脈内、腹腔内、経口、筋肉内、皮下、腔内、経皮、真皮投与することができ、蠕動手段によって送達することができる、または腫瘍細胞を含有する組織に直接注射することができる。

ポリペプチドを含む治療組成物は従来、例えば単位用量の注射による等、静脈内投与される。用語「単位用量」は、治療組成物を参照して使用される場合、対象に対する単位投与量として適した物理的に別々の単位を指し、各単位は、要求される希釈剤、すなわち、担体またはビヒクルに関連して所望の治療効果を生じるように計算される既定の量の活性材料を含有する。

組成物は、剤形と適合性の様式でかつ治療有効量で投与される。投与されるべき量は、処置されるべき対象、活性成分を利用する対象の系の能力、および所望の治療効果の程度に依存する。投与が必要とされる活性成分の正確な量は、医師の判断に依存し、各個体に特有である。しかし、全身性適用に適した投与量範囲は、本明細書に開示されており、投与経路に依存する。初回およびブースター投与に適したレジメンも企図され、初回投与に続く、その後の注射または他の投与による１または複数の時間間隔（ｈｏｕｒ ｉｎｔｅｒｖａｌ）での反復用量によって典型的に表される。例示的な複数の投与は、本明細書に記載されており、ポリペプチドの連続的に高い血清および組織レベルの維持に特に好ましい。あるいは、ｉｎ ｖｉｖｏ治療法に指定された範囲内の血中濃度の維持に十分な連続的静脈内注入が企図される。

局所的に進行したまたは転移性がんを有するがん患者において、本発明のポリペプチドを全身または局所的に投与して、腫瘍細胞成長の阻害またはがん細胞の死滅等、疾患を処置することができることが企図される。これは、静脈内、くも膜下腔内および／または腹腔内投与することができる。これは、単独でまたは抗増殖薬と組み合わせて投与することができる。一実施形態では、これは、外科手術または他の手順に先立ち患者におけるがん負荷を低下するために投与することができる。あるいは、これは、いかなる残存するがん（例えば、外科手術が排除できなかったがん）も生存しないことを確実にするために、外科手術後に投与することができる。

治療有効量のポリペプチドは、所望の効果を達成するように、すなわち、腫瘍組織においてＣＤＣを誘発し、これにより、腫瘍切除炎症促進性応答を媒介するように計算された既定の量である。よって、本発明のポリペプチドの投与の投与量範囲は、腫瘍細胞分裂および細胞周期進行の症状が低下する所望の効果を生じるのに十分な多さの投与量範囲である。投与量は、過粘稠度症候群、肺水腫、うっ血性心不全、神経学的効果等、有害副作用を引き起こすほどに多くなるべきではない。一般に、投与量は、患者の年齢、状態、性別および患者における疾患の程度と共に変動し、当業者によって決定することができる。何らかの合併症の場合には、投与量は、個々の医師によって調整することができる。

ＩＸ．併用療法
ある特定の実施形態では、本実施形態の組成物および方法は、第２のまたは追加的な治療法と組み合わせたポリペプチドまたは抗体の投与が関与する。かかる治療法は、ＣＤＣに応答性のいずれかの疾患の処置において適用することができる。例えば、疾患は、がんであり得る。

併用療法を含む方法および組成物は、治療もしくは保護効果を増強する、および／または別の抗がんもしくは抗過剰増殖療法の治療効果を増加する。治療および予防的な方法および組成物は、がん細胞の死滅および／または細胞過剰増殖の阻害等、所望の効果の達成に有効な組み合わせた量で提供することができる。このプロセスは、ポリペプチドまたは抗体および第２の治療法の投与が関与し得る。第２の治療法は、直接の細胞傷害性効果を有しても有さなくてもよい。例えば、第２の治療法は、直接の細胞傷害性効果がない、免疫系を上方調節する作用物質であり得る。組織、腫瘍または細胞は、作用物質（例えば、ポリペプチドまたは抗がん剤）のうち１種または複数を含む１種または複数の組成物または薬理学的製剤（単数または複数）に曝露することができ、あるいは組織、腫瘍および／または細胞を２種またはそれを超える別個の組成物または製剤に曝露することができ、１種の組成物が、１）ポリペプチドもしくは抗体、２）抗がん剤、または３）ポリペプチドもしくは抗体および抗がん剤の両方を提供する。また、かかる併用療法を、化学療法、放射線療法、外科療法または免疫療法と併せて使用することができることが企図される。

用語「接触される」および「曝露される」は、細胞に適用される場合、治療用ポリペプチドもしくは抗体および化学療法もしくは放射線療法剤が標的細胞に送達される、または標的細胞と直接並立して設置されるプロセスを説明するように本明細書において使用される。細胞死滅を達成するために、例えば、両方の作用物質が、細胞の死滅またはその分裂の防止に有効な組み合わせた量で細胞に送達される。

ポリペプチドまたは抗体は、抗がん処置と比べてその前に、その最中に、その後に、または様々な組合せで投与することができる。投与は、同時発生的から数分間から数日間から数週間に及ぶ間隔であり得る。ポリペプチドまたは抗体が、抗がん剤とは別々に患者に与えられる実施形態では、一般に、２種の化合物が依然として、患者に対して、有利に組み合わされた効果を発揮することができるように、各送達時の間でかなりの期間が経ち有効期限を越えてしまわなかったことを確実にするであろう。かかる場合、互いに約１２〜２４または７２時間以内に、より詳細には、互いに約６〜１２時間以内に、ポリペプチドおよび抗がん療法を患者に与えることができることが企図される。ある状況では、有意に処置の期間を延長することが望ましいことがあり、その場合、それぞれの投与間で数日間（２、３、４、５、６または７）から数週間（１、２、３、４、５、６、７または８）が経過する。

ある特定の実施形態では、処置の経過は、１〜９０日間またはそれを超えて（このかかる範囲は、介在する日数を含む）持続し得る。１種の作用物質は、１日目から９０日目（このかかる範囲は、介在する日数を含む）のいずれかの日またはそのいずれかの組合せに与えることができ、別の作用物質は、１日目から９０日目（このかかる範囲は、介在する日数を含む）のいずれかの日またはそのいずれかの組合せに与えられることが企図される。１日間以内（２４時間期間）に、患者に、作用物質（単数または複数）の１回または複数回の投与を与えることができる。さらに、処置の経過後に、抗がん処置が投与されない期間を設けることが企図される。この期間は、その予後、強さ、健康等、患者の状態に依存して、１〜７日間および／または１〜５週間および／または１〜１２カ月間またはそれを超えて（このかかる範囲は、介在する日数を含む）持続することができる。必要に応じて処置サイクルが反復されることが予想される。

様々な組合せを用いることができる。下の例に関して、ポリペプチドまたは抗体は「Ａ」であり、抗がん療法は「Ｂ」である：
A/B/A B/A/B B/B/A A/A/B A/B/B B/A/A A/B/B/B B/A/B/B
B/B/B/A B/B/A/B A/A/B/B A/B/A/B A/B/B/A B/B/A/A
B/A/B/A B/A/A/B A/A/A/B B/A/A/A A/B/A/A A/A/B/A

患者への本実施形態のいずれかのポリペプチドまたは治療法の投与は、作用物質の毒性があるとすればそれを考慮に入れつつ、かかる化合物の投与の一般プロトコールに従い得る。したがって、一部の実施形態では、併用療法に起因し得る毒性をモニタリングするステップが存在する。

Ａ．化学療法
多種多様な化学療法剤を、本実施形態に従って使用することができる。用語「化学療法」は、がんを処置するための薬物の使用を指す。「化学療法剤」は、がんの処置において投与される化合物または組成物を暗示するように使用される。これらの作用物質または薬物は、細胞内におけるその活性機序によって、例えば、これが細胞周期に影響を与えるか否かおよびいずれのステージでそれが為されるかによってカテゴリー化される。あるいは、作用物質は、ＤＮＡを直接架橋する、ＤＮＡ内にインターカレートする、または核酸合成に影響を与えることにより染色体および有糸分裂異常を誘導するその能力に基づき特徴付けることができる。

化学療法剤の例として、チオテパおよびシクロホスファミド（cyclosphosphamide）等のアルキル化剤；ブスルファン、インプロスルファンおよびピポスルファン（piposulfan）等のスルホン酸アルキル；ベンゾドパ（benzodopa）、カルボコン、メツレドパ（meturedopa）およびウレドパ（uredopa）等のアジリジン；アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド（trietylenephosphoramide）、トリエチレン（triethiylene）チオホスホラミドおよびトリメチロールメラミン（trimethylolomelamine）を含むエチレンイミンおよびメチロールメラミン（methylamelamine）；アセトゲニン（特に、ブラタシンおよびブラタシノン（bullatacinone））；カンプトテシン（合成アナログトポテカンを含む）；ブリオスタチン；カリスタチン（callystatin）；ＣＣ−１０６５（そのアドゼレシン、カルゼレシン（carzelesin）およびビセレシン合成アナログを含む）；クリプトフィシン（特に、クリプトフィシン１およびクリプトフィシン８）；ドラスタチン；デュオカルマイシン（合成アナログ、ＫＷ−２１８９およびＣＢ１−ＴＭ１を含む）；エリュテロビン；パンクラチスタチン（pancratistatin）；サルコジクチイン（sarcodictyin）；スポンジスタチン（spongistatin）；クロラムブシル、クロルナファジン（chlornaphazine）、チョロホスファミド（cholophosphamide）、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキサイド塩酸塩、メルファラン、ノベンビキン（novembichin）、フェネステリン（phenesterine）、プレドニムスチン、トロホスファミドおよびウラシルマスタード等のナイトロジェンマスタード；カルムスチン、クロロゾトシン、ホテムスチン、ロムスチン、ニムスチンおよびラニムスチン（ranimnustine）等のニトロソウレア（nitrosurea）；エンジイン抗生物質（例えば、カリチアマイシン、特に、カリチアマイシンガンマｌＩおよびカリチアマイシンオメガＩ１）等の抗生物質；ジネマイシンＡを含むジネマイシン（dynemicin）；クロドロネート等のビスホスホネート；エスペラミシン；ならびにネオカルチノスタチン発色団および関連する色素タンパク質エンジイン抗生物質（antiobiotic）発色団、アクラシノマイシン（aclacinomysin）、アクチノマイシン、アントラマイシン（authrarnycin）、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン（cactinomycin）、カルビシン（carabicin）、カルミノマイシン（carminomycin）、カルジノフィリン（carzinophilin）、クロモマイシン（chromomycinis）、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン（detorubicin）、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ドキソルビシン（モルフォリノ−ドキソルビシン、シアノモルフォリノ−ドキソルビシン、２−ピロリノ（pyrrolino）−ドキソルビシンおよびデオキシドキソルビシンを含む）、エピルビシン、エソルビシン（esorubicin）、イダルビシン、マルセロマイシン（marcellomycin）、マイトマイシンＣ等のマイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン（potfiromycin）、ピューロマイシン、クエラマイシン（quelamycin）、ロドルビシン（rodorubicin）、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチンおよびゾルビシン；メトトレキセートおよび５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）等の代謝拮抗薬；デノプテリン、プテロプテリンおよびトリメトレキセート等の葉酸アナログ；フルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン（thiamiprine）およびチオグアニン等のプリンアナログ；アンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビンおよびフロクスウリジン等のピリミジンアナログ；カルステロン（calusterone）、ドロモスタノロンプロピオン酸塩、エピチオスタノール、メピチオスタンおよびテストラクトン等のアンドロゲン；ミトタンおよびトリロスタン等の抗副腎（anti-adrenals）；フロリン酸（frolinic acid）等の葉酸補充薬；アセグラトン；アルドホスファミド（aldophosphamide）グリコシド；アミノレブリン酸；エニルウラシル；アムサクリン；ベストラブシル（bestrabucil）；ビサントレン（bisantrene）；エダトレキセート（edatraxate）；デフォファミン（defofamine）；デメコルチン；ジアジコン（diaziquone）；エルフォルミシン（elformithine）；エリプチニウム（elliptinium）酢酸塩；エポチロン；エトグルシド；ガリウム硝酸塩；ヒドロキシウレア；レンチナン；ロニダイニン（lonidainine）；マイタンシンおよびアンサマイトシン（ansamitocin）等のマイタンシノイド；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダンモール（mopidanmol）；ニトラエリン（nitraerine）；ペントスタチン；フェナメット（phenamet）；ピラルビシン；ロソキサントロン（losoxantrone）；ポドフィリン酸（podophyllinic acid）；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ多糖複合体；ラゾキサン；リゾキシン（rhizoxin）；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジコン；２，２’，２”−トリクロロトリエチルアミン；トリコテシン（特に、Ｔ−２毒素、ベラキュリン（verracurin）Ａ、ロリジン（roridin）Ａおよびアングイジン（anguidine））；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン（gacytosine）；アラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）；シクロホスファミド；タキソイド、例えば、パクリタキセルおよびドセタキセルゲムシタビン；６−チオグアニン；メルカプトプリン；シスプラチン、オキサリプラチンおよびカルボプラチン等の白金配位複合体；ビンブラスチン；白金；エトポシド（ＶＰ−１６）；イホスファミド；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ビノレルビン；ノバントロン（novantrone）；テニポシド；エダトレキセート；ダウノマイシン；アミノプテリン；ゼローダ；イバンドロネート；イリノテカン（例えば、ＣＰＴ−１１）；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（difluorometlhylornithine）（ＤＭＦＯ）；レチノイン酸等のレチノイド；カペシタビン；カルボプラチン、プロカルバジン、プリカマイシン（plicomycin）、ゲムシタビン（gemcitabien）、ナベルビン、ファルネシル−タンパク質トランスフェラーゼ（tansferase）阻害剤、トランス白金（transplatinum）、ならびに上述のいずれかの薬学的に許容される塩、酸または誘導体が挙げられる。

Ｂ．放射線療法
ＤＮＡ損傷を生じる、広範に使用されてきた他の因子は、γ線、Ｘ線および／または腫瘍細胞への放射性同位元素の定方向送達として一般的に公知のものを含む。マイクロ波、陽子線照射（米国特許第５，７６０，３９５号および同第４，８７０，２８７号）およびＵＶ照射等、他の形態のＤＮＡ損傷因子も企図される。これらの因子の全てが、ＤＮＡ、ＤＮＡの前駆体、ＤＮＡの複製および修復、ならびに染色体のアセンブリおよび維持における広範囲の損傷に影響を与える可能性が最も高い。Ｘ線の線量範囲は、延長された期間にわたる（３〜４週間）５０〜２００レントゲンの一日線量から、２０００〜６０００レントゲンの単一線量に及ぶ。放射性同位元素の線量範囲は、広く変動し、同位元素の半減期、放射する放射線の強度および種類、ならびに新生物細胞による取込みに依存する。

Ｃ．免疫療法
当業者であれば、本実施形態の方法と組み合わせてまたは併せて、免疫療法を使用することができることを理解し得る。がん処置の文脈において、免疫療法は、一般に、がん細胞を標的および破壊するための免疫エフェクター細胞および分子の使用に頼る。リツキシマブ（ＲＩＴＵＸＡＮ（登録商標））は、かかる一例である。例えば、イピリムマブ（ipilumimab）等、チェックポイント阻害剤は、別のかかる例である。免疫エフェクターは、例えば、腫瘍細胞の表面におけるあるマーカーに特異的な抗体であり得る。抗体は単独で、治療法のエフェクターとして機能することができる、または他の細胞を動員して、細胞死滅に実際に影響させることができる。抗体は、薬物または毒素（化学療法薬、放射性核種、リシン（ricin）Ａ鎖、コレラ毒素、百日咳毒素等）にコンジュゲートし、単に標的化作用物質として機能することもできる。あるいは、エフェクターは、直接的または間接的のいずれかで、腫瘍細胞標的と相互作用する表面分子を有するリンパ球であり得る。様々なエフェクター細胞は、細胞傷害性Ｔ細胞およびＮＫ細胞を含む。

免疫療法の一態様では、腫瘍細胞は、標的することに受け入れられる、すなわち、他の細胞の大部分には存在しない、特定のマーカーを有する必要がある。多くの腫瘍マーカーが存在し、そのうちのいずれかが、本実施形態の文脈における標的化に適することができる。共通腫瘍マーカーは、ＣＤ２０、癌胎児性抗原、チロシナーゼ（ｐ９７）、ｇｐ６８、ＴＡＧ−７２、ＨＭＦＧ、シアリルルイス抗原、ＭｕｃＡ、ＭｕｃＢ、ＰＬＡＰ、ラミニン受容体、ｅｒｂ Ｂおよびｐ１５５を含む。免疫療法の代替的な態様は、抗がん効果を免疫刺激効果と組み合わせることである。免疫刺激分子も存在し、次のものを含む：サイトカイン、例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１２、ＧＭ−ＣＳＦ、ガンマ−ＩＦＮ、ケモカイン、例えば、ＭＩＰ−１、ＭＣＰ−１、ＩＬ−８および増殖因子、例えば、ＦＬＴ３リガンド。

現在研究中または使用されている免疫療法の例は、免疫アジュバント、例えば、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｏｖｉｓ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ、ジニトロクロロベンゼンおよび芳香族化合物（米国特許第５，８０１，００５号および同第５，７３９，１６９号；HuiおよびHashimoto、１９９８年；Christodoulidesら、１９９８年）；サイトカイン療法、例えば、インターフェロンα、βおよびγ、ＩＬ−１、ＧＭ−ＣＳＦならびにＴＮＦ（Bukowskiら、１９９８年；Davidsonら、１９９８年；Hellstrandら、１９９８年）；遺伝子療法、例えば、ＴＮＦ、ＩＬ−１、ＩＬ−２およびｐ５３（Qinら、１９９８年；Austin-WardおよびVillaseca、１９９８年；米国特許第５，８３０，８８０号および同第５，８４６，９４５号）；ならびにモノクローナル抗体、例えば、抗ＣＤ２０、抗ガングリオシドＧＭ２および抗ｐ１８５（Hollander、２０１２年；Hanibuchiら、１９９８年；米国特許第５，８２４，３１１号）である。１種または複数の抗がん療法を、本明細書に記載されている抗体療法と共に用いることができることが企図される。

Ｄ．外科手術
がんを有する人のおよそ６０％は、予防的、診断的または進行度診断的、根治的および姑息的外科手術を含むある種の外科手術を受ける。根治的外科手術は、がん性組織の全体または部分が物理的に除去される、切り取られるおよび／または破壊される切除を含み、本実施形態の処置、化学療法、放射線療法、ホルモン療法、遺伝子療法、免疫療法および／または代替的治療法等、他の治療法と併せて使用することができる。腫瘍切除は、腫瘍の少なくとも部分の物理的除去を指す。腫瘍切除に加えて、外科手術による処置は、レーザー外科手術、凍結外科手術、電気外科手術および顕微鏡により制御された外科手術（モース外科手術）を含む。

がん性細胞、組織または腫瘍の部分または全体を切り取ると、身体に腔が形成され得る。処置は、追加的な抗がん療法によるこの区域の灌流、直接注射または局所的適用により達成することができる。かかる処置は、例えば、１、２、３、４、５、６もしくは７日毎に、または１、２、３、４および５週毎に、または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１もしくは１２カ月毎に反復することができる。これらの処置はまた、変動する投与量のものとなることもできる。

Ｅ．他の作用物質
本実施形態のある特定の態様と組み合わせて他の作用物質を使用して、処置の治療有効性を改善することができることが企図される。これらの追加的な作用物質は、細胞表面受容体およびＧＡＰ結合の上方調節に影響を与える作用物質、細胞分裂阻害および分化剤、細胞接着の阻害剤、アポトーシス誘導物質に対する過剰増殖細胞の感受性を増加させる作用物質、または他の生物学的作用物質を含む。ＧＡＰ結合の数を上昇させることによる細胞間シグナル伝達の増加は、隣接する過剰増殖細胞集団における抗過剰増殖効果を増加させるであろう。他の実施形態では、細胞分裂阻害または分化剤は、本実施形態のある特定の態様と組み合わせて使用して、処置の抗過剰増殖有効性を改善することができる。細胞接着の阻害剤は、本実施形態の有効性を改善することが企図される。細胞接着阻害剤の例は、接着斑キナーゼ（ＦＡＫ）阻害剤およびロバスタチンである。抗体ｃ２２５等、アポトーシスに対する過剰増殖細胞の感受性を増加させる他の作用物質は、本実施形態のある特定の態様と組み合わせて使用して、処置有効性を改善することができることがさらに企図される。

Ｘ．キット
本発明のある特定の態様は、治療用キット等、キットを提供することができる。例えば、キットは、本明細書に記載されている１種または複数の医薬組成物と、任意選択で、その使用のための説明書とを含むことができる。キットは、かかる組成物の投与を達成するための１種または複数のデバイスを含むこともできる。例えば、対象キットは、医薬組成物と、がん性腫瘍への組成物の直接静脈内注射を達成するためのカテーテルとを含むことができる。他の実施形態では、対象キットは、送達装置による使用のための、任意選択で医薬品として製剤化されたまたは凍結乾燥されたポリペプチドの予め充填されたアンプルを含むことができる。

キットは、ラベルを付けた容器を含むことができる。適した容器は、例えば、ボトル、バイアルおよび試験管を含む。容器は、ガラスまたはプラスチック等、種々の材料でできていてよい。容器は、上述のもの等、治療または非治療適用に有効なポリペプチドを含む組成物を保持することができる。容器のラベルは、組成物が、特異的な治療または非治療適用に使用されることを示すことができ、また、上述のもの等、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏ使用のいずれかのための指示を示すこともできる。本発明のキットは、典型的には、上述の容器と、緩衝液、希釈剤、フィルター、針、注射器および使用説明書を有する添付文書を含む、商業的および使用者の観点から望ましい材料を含む１種または複数の他の容器とを含み得る。

ＸＩ．実施例
以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を実証するために含まれる。以下の実施例に開示されている技法は、本発明者により、本発明の実施においてよく機能することが発見された技法であり、したがって、それを実施するための好ましいモードを構成するとみなすことができることが当業者には理解されるべきである。しかし、当業者は、本開示に照らして、開示されている特定の実施形態に多くの変更を行うことができ、それでもなお、本発明の主旨および範囲から逸脱することなく同様または類似の結果が得られることを理解するべきである。

（実施例１）
Ｆｃドメインを操作するためのライブラリーの戦略
Ｅ．ｃｏｌｉは、タンパク質グリコシル化機構をコードせず、したがって、Ｅ．ｃｏｌｉのペリプラズムにおいて発現されるＩｇＧのＦｃドメインはグリコシル化されておらず、通常はＦｃドメインのＮ２９７に付加されているグリカンを欠く。非グリコシル化Ｆｃドメインは、立体構造上の柔軟性の程度が高く、その結果、エフェクターＦｃγＲ（ＦｃγＲＩＡ、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢ、ＦｃγＲＩＩｃ、ＦｃγＲＩＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＩＢ）およびＣ１ｑへの検出可能な結合が減弱するか、または検出可能な結合が存在しない（Jefferisら、２００５年；Borrokら、２０１２年）。Ｎ２９７グリカンが存在しないにもかかわらずＣ１ｑへの結合を可能にする変異を含有する非グリコシル化Ｆｃドメインバリアントを単離するために、３つの異なるライブラリーを構築した。第１のライブラリー（Ｓ−ライブラリー）では、約５０％の野生型アミノ酸配列を保存するためのコドンを有するスパイクしたオリゴヌクレオチドを使用して、Ｇｌｕ２３１、Ｌｅｕ２３２、Ｌｅｕ２３３、Ｇｌｙ２３４、Ｇｌｙ２３５、Ｉｌｅ３３４、Ｓｅｒ３３５、Ｌｙｓ３３６、Ａｌａ３３７、Ｌｙｓ３３８、Ｇｌｙ３３９、Ｇｌｎ３４０、Ｐｒｏ３４１、Ａｒｇ３４２、およびＧｌｕ３４３にランダムなアミノ酸を導入した（Lanioら、１９９８年）。これらのランダムな１５アミノ酸を導入するために、８種のプライマー（配列番号２４〜３１）を設計した（表１５）。第２のライブラリー（ＳＥ−ライブラリー）は、エラープローンＰＣＲを使用して、Ｓ−ライブラリーに基づいて追加的なランダム変異体を有する（Fromantら、１９９５年）。Ｓ−ライブラリーのＣＨ２ドメインに追加的なランダム変異を導入するために、２種のプライマーＰＣＨ０１８（配列番号２６）およびＰＣＨ０２３（配列番号３１）を設計した。第３のライブラリー（Ｅ−ライブラリー）を構築するために、野生型Ｆｃ鋳型および２種のプライマーＰＣＨ０１８（配列番号２６）およびＰＣＨ０２１（配列番号２９）を使用した標準のエラープローンＰＣＲを用いた。

（実施例２）
Ｆｃドメインを操作するためのライブラリーの構築
全てのプラスミドおよびプライマーを表１０および１１に記載する。プライマーは全て、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓにより合成されたものである。ＩｇＧポリペプチドを、２種のベクター：ｐＢＡＤ３０−ＰｅｌＢ−ＶＬ−Ｃｋ−ＮｌｐＡ−ＶＬ−Ｃｋ−Ｈｉｓ−ｃＭｙｃおよびｐＭｏｐａｃ１２−ｐｅｌＢ−ＩｇＧ−ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３−ＦＬＡＧ（Jungら、２０１２年）を使用してＥ．ｃｏｌｉの内膜上にディスプレイさせた（図１）。Ｓ−ライブラリーを構築するために、８種のプライマー（配列番号２４〜３１）を使用した（表１５および図２）。８種のプライマーの中で２種の特異的なプライマー（ＰＣＨ０１７およびＰＣＨ０２０；それぞれ配列番号２５および２８）は、野生型アミノ酸配列をおよそ５０％の可能性で保存するため、スパイクしたオリゴヌクレオチドを使用することで縮重コドンを含有する。ＩｇＧ１の重鎖遺伝子の３つの断片を、ＰＣＨ０１６（配列番号２４）およびＰＣＨ０２１（配列番号２９）と重複する８種のプライマーを用いて増幅した（Ｓ−ライブラリー、表１５および図２）。別のサブライブラリーのために、Ｓ−ライブラリーからのＦｃライブラリー遺伝子を有するＣＨ２ドメインに対して、ＰＣＨ０１８（配列番号２６）およびＰＣＨ０２３（配列番号３１）を用いて標準のエラープローンＰＣＲを用いた（ＳＥ−ライブラリー）。結果として、ＳＥ−ライブラリーは、Ｓ−ライブラリー構築の間に生成した１５個のランダムなアミノ酸、およびＣＨ２ドメインに追加的な１％ランダム変異を含有する。Ｅ−ライブラリーに関しては、野生型Ｆｃ遺伝子を有するＦｃドメインに対して、ＰＣＨ０１８（配列番号２６）およびＰＣＨ０２１（配列番号２９）を用いて標準のエラープローンＰＣＲを用いた。３つの増幅された重鎖ライブラリー遺伝子を、ＳｆｉＩ消化した細菌ディスプレイベクター、ｐＭｏｐａｃ１２−ｐｅｌＢ−ＩｇＧ−ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３−ＦＬＡＧにインフレームでライゲーションした。得られたプラスミドをＥ．ｃｏｌｉ ＪＵＤＥ−１−ｐＢＡＤ３０−ＰｅｌＢ−ＶＬ−Ｃｋ−ＮｌｐＡ−ＶＬ−Ｃｋ−Ｈｉｓ−ｃＭｙｃ中に形質転換した（Jungら、２０１０年；Jungら、２０１２年）。サブライブラリーのサイズは、２×１０^８（Ｓ−ライブラリー）、３×１０^８（ＳＥ−ライブラリー）、および１×１０^９（Ｅ−ライブラリー）であった。

（実施例３）
Ｃ１ｑ、二量体ＦｃγＲ、四量体ＦｃγＲ、および二量体ＦｃＲｎの調製
ヒト血清由来のＣ１ｑタンパク質をＡｂｃａｍから購入した。Ｆｃ受容体の哺乳動物での発現のためのプラスミドを以前に記載されている通り構築した（Jungら、２０１２年）。ＦｃγＲＩ−Ｈｉｓ、ＦｃγＲＩＩａ−_Ｈ１３１−ＧＳＴ、ＦｃγＲＩＩａ−_Ｒ１３１−ＧＳＴ、ＦｃγＲＩＩｂ−ＧＳＴ、ＦｃγＲＩＩＩａ−_Ｖ１５８−ＧＳＴ、ＦｃγＲＩＩＩａ−_Ｆ１５８−ＧＳＴ、およびＦｃγＲＩＩＩａ−_Ｖ１５８−ストレプトアビジン（ＦｃγＲＩＩＩａ−_Ｖ１５８−ＳＡ）、ならびにＦｃＲｎ−ＧＳＴを、表１６に記載されているｐＭＡＺ−ＩｇＨ（米国特許第８，０４３，６２１号）に由来する発現ベクターを使用したＨＥＫ２９３Ｆ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の一過性トランスフェクションによって作製した。トランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｆ細胞を、５％ＣＯ_２インキュベーター中、３７℃で５日間培養した。４，０００×ｇで１０分間遠心分離することによって上清を採取し、０．２２μｍのポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）メンブランフィルター（ＰＡＬＬ）によって濾過した。ＦｃγＲＩ−Ｈｉｓを、Ｎｉ−ＮＴＡ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）アフィニティーカラムを用い、製造者の説明書に従って精製した。Ｆｃ受容体−ＧＳＴ融合タンパク質を、グルタチオンセファロース（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）アフィニティーカラムを用い、製造者の説明書に従って精製した。ＦｃγＲＩＩＩａ−_Ｖ１５８−ＳＡを、Ｓｔｒｅｐ−Ｔａｃｔｉｎ（ＩＢＡ−Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）アフィニティーカラムを用い、製造者の説明書に従って精製した。リポ多糖（ＬＰＳ）および非特異的に結合したタンパク質を除去するために、ＦｃγＲ結合樹脂を、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１１４（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を含有するＰＢＳ、５０ｍＬおよびＰＢＳ、５０ｍＬを用いて洗浄した。ＦｃγＲＩ−Ｈｉｓを、２５０ｍＭのイミダゾールを含有するＰＢＳを用いて溶出し、Ｆｃ受容体−ＧＳＴを、１０ｍＭの還元型Ｌ−グルタチオンを含有するＰＢＳを用いて溶出し、ＦｃγＲＩＩＩａ_Ｖ１５８−ＳＡを、溶出緩衝液（ｐＨ８．０、１００ｍＭのトリス−ＨＣｌ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、２．５ｍＭのデスチオビオチン、および１ｍＭのＥＤＴＡ）を用いて溶出した。全ての溶出したＦｃ受容体の緩衝液をＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−４（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）によってＰＢＳと交換した。ヒトＣ１ｑ（Ａｂｃａｍ）または精製ＦｃγＲＩＩＩａ_Ｖ１５８−ＳＡをＥａｓｙ Ｌｉｎｋ Ｒ−ＰＥ Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ａｂｃａｍ）を製造者の説明書に従って使用して、Ｒ−フィコエリトリン（Ｒ−ＰＥ）で標識した。

（実施例４）
Ｃ１ｑ結合についてのＦｃライブラリーのスクリーニング
Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＵＤＥ−１を、クロラムフェニコール（４０μｇ／ｍＬ）およびカナマイシン（５０μｇ／ｍＬ）を伴うＴｅｒｒｉｆｉｃ Ｂｒｏｔｈ（ＴＢ）中、３７℃、２５０ｒｐｍで一晩培養した。一晩育成させた後、細胞を、２種の抗生物質を伴う新鮮なＴＢ培地１００ｍＬ中、１：５０に希釈した。Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＵＤＥ−１細胞を３７℃、２５０ｒｐｍでＯＤ_６００がおよそ０．４の値に達するまで培養した。次いで、タンパク質の発現を容易にするために、１ｍＭのイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）および２％Ｌ−アラビノース（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）をＥ．ｃｏｌｉ ＪＵＤＥ−１細胞に添加し、次いで、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＵＤＥ−１細胞を２５℃で２０時間さらにインキュベートした。Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＵＤＥ−１細胞（８ｍＬ）を遠心分離によって収集し、氷で冷却した１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＬで２回洗浄した。洗浄した細胞を氷で冷却したＳＴＥ溶液（０．５Ｍのスクロース、１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、１０ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）、１ｍＬに再懸濁させ、３７℃で３０分間インキュベートした。細胞を１３，０００ｒｐｍで１分間遠心分離し、溶液Ａ（０．５Ｍのスクロース、２０ｍＭのＭｇＣｌ_２、１０ｍＭのＭＯＰＳ、ｐＨ６．８）、１ｍＬで洗浄した。洗浄した細胞を、溶液Ａ、１ｍＬ中、１ｍｇ／ｍＬのニワトリ卵白リゾチーム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）と一緒に３７℃で１５分間インキュベートした。１３，０００ｒｐｍで１分間遠心分離した後、ペレット化したスフェロプラストを冷たいＰＢＳ、１ｍＬに再懸濁させた（Jungら、２０１０年；Jungら、２０１２年）。

スクリーニングのための標的タンパク質の最適な濃度を決定するために、スフェロプラストを、１０ｎＭのヒトＣ１ｑ−ＰＥまたは１０ｎＭのＦｃγＲＩＩＩａ_Ｖ１５８−ＳＡ−ＰＥで標識した。対照として、ＰＡドメイン４を発現するスフェロプラスト（Leysathら、２００９年）を高親和性のグリコシル化抗ＰＡ抗体Ｍ１８と一緒にインキュベートした。対照グリコシル化Ｍ１８ ＩｇＧに結合したスフェロプラストは、Ｃ１ｑでの標識後に、非標識対照スフェロプラストと比較して、非常に高いシグナルを示した（図３Ａ；表３）。

Ｃ１ｑは、Ｅ．ｃｏｌｉの外膜上に発現するリポ多糖（ＬＰＳ）に結合する能力を有する（Zohairら、１９８９年）。予測通り、全てのスフェロプラストにおいて、抗ＬＰＳ ＩｇＧ−ＰＥ（Ａｂｃａｍ）によりＬＰＳが検出された（図３Ｂ；表３）。ＬＰＳへのＣ１ｑのバックグラウンド結合を排除するために、いくつかの異なる緩衝液を試験し、高塩濃度（５０ｍＭのリン酸、３３０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４）により、Ｃ１ｑ−ＰＥとＬＰＳの相互作用が阻害されることが見出された。ＩｇＧは、この高塩濃度の緩衝液条件の下でＣ１ｑに対して正常な結合を示す（図３Ｃ；表３）。次に、３つのＦｃライブラリーからの非グリコシル化ＩｇＧまたはグリコシル化Ｍ１８ ＩｇＧをディスプレイするスフェロプラストのＦｃγＲＩＩＩＡ_Ｖ１５８−ＳＡ−ＰＥ結合能を調査した。１０ｎＭのＦｃγＲＩＩＩＡ_Ｖ１５８−ＳＡ−ＰＥを用いた標識条件下では、グリコシル化Ｍ１８ ＩｇＧをディスプレイするスフェロプラストでは結合シグナルが示されたたが、非グリコシル化ＩｇＧまたは３つのＦｃライブラリーをディスプレイするスフェロプラストでは結合シグナルは示されなかった（図３Ｄ；表３）。

Ｃ１ｑに特異的な非グリコシル化ＩｇＧバリアントを単離するために、実施例１および２に記載の３つのサブライブラリーを発現する細胞を、競合剤として１μＭのＦｃγＲの存在下、１０ｎＭのＣ１ｑ−ＰＥで標識し、ＦＡＣＳＡｒｉａ（商標）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）でスクリーニングした。各ラウンドにおいて、最も高い蛍光を示す集団の上位１％を回収し、これらのスフェロプラストを再選別して偽陽性をすぐに除去した。選別されたスフェロプラスト中の重鎖遺伝子を、５分間煮沸した後、２種のプライマー（ＰＣＨ１６およびＰＣＨ２１）を使用してＰＣＲによってレスキューし、ＳｆｉＩにより切断したｐＭｏｐａｃ１２ベクターにライゲーションした。ライゲーションしたプラスミドをＥ．ｃｏｌｉ ＪＵＤＥ−１細胞中に形質転換した。クロラムフェニコール含有培地およびカナマイシン含有培地において形質転換体を選択し、次のラウンドのスクリーニングのためにスフェロプラストを調製した。１０ｎＭのＣ１ｑ−ＰＥを用いて７ラウンドのスクリーニングを行った（図４Ａ）。Ｃ１ｑ結合ＩｇＧバリアントおよびＦｃγＲＩＩＩａ結合ＩｇＧバリアントを単離するために、３つのサブライブラリーを、１０ｎＭのＣ１ｑ−ＰＥまたは１０ｎＭのＦｃγＲＩＩＩａ_Ｖ１５８−ＳＡ−ＰＥを用い、同じ方法で逐次的にスクリーニングした。スクリーニングの第１ラウンド、第３ラウンド、第５ラウンド、および第７ラウンドは１０ｎＭのＣ１ｑ−ＰＥを用いて行い、スクリーニングの第２ラウンド、第４ラウンド、および第６ラウンドは１０ｎＭのＦｃγＲＩＩＩａ_Ｖ１５８−ＳＡ−ＰＥを用いて行った（図４Ｂ）。

（実施例５）
ＩｇＧバリアントのＦＡＣＳ解析
Ｃ１ｑ−ＰＥを用いてスクリーニングしたライブラリーからの選別の最後のラウンドからランダムに選択した１２種のＩｇＧバリアントについて配列決定した（配列番号２〜１３）。同様に、Ｃ１ｑ−ＰＥおよびＦｃγＲＩＩＩａ_Ｖ１５８−ＳＡ−ＰＥを用いてスクリーニングしたライブラリーからランダムに選択した１０種のＩｇＧバリアントについて配列決定した（配列番号１４〜２３）。それぞれの遺伝子をＥ．ｃｏｌｉ ＪＵＤＥ−１細胞中に形質転換し、それを、スフェロプラスト化し、１０ｎＭのＣ１ｑ−ＰＥおよび１０ｎＭのＦｃγＲＩＩＩａ_Ｖ１５８−ＳＡ−ＰＥを用いてＦＡＣＳによって解析した。図５および表４に示されている通り、２２種のＩｇＧバリアント全てで、Ｃ１ｑに関して、野生型非グリコシル化ＩｇＧと比較して２４〜１１３倍の平均蛍光強度（ＭＦＩ）値の増大が示された。特に、Ｆｃ８０１、Ｆｃ８０２、およびＦｃ８０３では、Ｃ１ｑに関して、野生型非グリコシル化ＩｇＧと比較してそれぞれ１１３．１倍、５６．５倍、および９２．８倍のＭＦＩ値の増大が示された。さらに、これらの３種のＩｇＧクローンでは、１０ｎＭのＦｃγＲＩＩＩａ_Ｖ１５８−ＳＡ−ＰＥに対して、ＦｃγＲＩＩＩａに対する親和性を有さない非グリコシル化ＩｇＧと比較的類似したＭＦＩ値が示された。さらに、Ｆｃ７０２、Ｆｃ７１３、Ｆｃ７２０、およびＦｃ８０５では、１０ｎＭのＦｃγＲＩＩＩａ_Ｖ１５８−ＳＡ−ＰＥを用いて標識した場合には、野生型非グリコシル化ＩｇＧと比較して、それぞれ３．４倍、３．２倍、４倍、および４．８倍のＭＦＩ値の増強が示され、Ｃ１ｑ−ＰＥに関しては野生型非グリコシル化ＩｇＧと比較して２４．６〜４８．６倍のＭＦＩ値の増強が示された（図５）。Ｆｃ８０１およびＦｃ８０２をさらなる試験のために選択した。Ｆｃ８０１は２つの変異、Ｋ３２０ＥおよびＱ３８６Ｒを有し、Ｆｃ８０２は４つの変異、Ｌ２３５Ｋ、Ｇ２３６Ｍ、Ｇ２３７Ｒ、およびＬ３５１Ｑを有する。Ｃ１ｑおよびＦｃγＲＩＩＩａに対する結合物質としてＦｃ８０５が選択され、これは８つの変異、Ｖ３０８Ａ、Ｓ３３７Ｐ、Ｋ３３８Ｑ、Ｋ３４０Ｒ、Ｑ３４２Ｐ、Ｒ３４４Ｇ、Ｅ３４５Ｙ、およびＦ３７２Ｌを有することが見出された。

（実施例６）
選択されたＩｇＧバリアントの発現および精製
ＩｇＧを哺乳動物発現ベクターｐｃＤＮＡ３．４（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＵＳＡ）にＧｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙ（登録商標）クローニングキット（ＮＥＢ）を使用してインフレームでクローニングした（Jungら、２０１２年）。ＦｃがＦｃ８０１、Ｆｃ８０２、およびＦｃ８０５で置き換わったリツキシマブを構築するために、３種のＦｃ遺伝子を、ｐＭｏｐａｃ１２−ｐｅｌＢ−ＩｇＧ−ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３−ＦＬＡＧからプライマーＰＣＨ００１（配列番号３２）およびＴＨ０８４（配列番号３３）を使用して増幅した。３種のＦｃ遺伝子を、ｐｃＤＮＡ３．４へのクローニングのためにプラスミドｐｃＤＮＡ３．４−リツキシマブ重鎖をＤＮＡ鋳型として使用してＰＣＲによって増幅した。ＤｐｎＩ（ＮＥＢ、ＵＫ）を用いて処理した後、ＰＣＲ産物をＥ．ｃｏｌｉ ＪＵＤＥ−１細胞中に形質転換し、それらの配列を確認した。新しく構築されたリツキシマブ−ＦｃバリアントをＲＧＩ（Ｆｃ８０２）、ＲＧＩＩ（Ｆｃ８０１）、およびＲＧＩＩＩ（Ｆｃ８０５）と名付けた。これらの３種のＦｃバリアントは、なおＣＨ２ドメインにＮ−グリコシル化部位を有する。それらの非グリコシル化形式を構築するために、以前に記載されている通り（Jungら、２０１２年）、２つの特異的なプライマー（ＷＫ６８（配列番号３４）およびＷＫ６９（配列番号３５））を使用して、ＦｃドメインのＦｃγＲまたはＣ１ｑとの結合能に影響を及ぼさないＴ２９９Ｌ変異を導入した。これらの新しく構築されたリツキシマブ−Ｆｃバリアントを、新しくＲＡＩ（Ｆｃ８０２）、ＲＡＩＩ（Ｆｃ８０１）、およびＲＡＩＩＩ（Ｆｃ８０５）と名付けた。ＲＡＩ、ＲＡＩＩ、およびＲＡＩＩＩの重鎖遺伝子を、等質量の軽鎖プラスミドを用いてＨＥＫ２９３Ｆ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に一過性にトランスフェクトした。５％ＣＯ_２インキュベーター中、３７℃で６日間インキュベートした後、４，０００×ｇで１０分間遠心分離することによって上清を採取し、０．２２μｍのＰＥＳメンブランフィルター（ＰＡＬＬ）を使用して濾過した。濾過した上清を、プロテインＡ大容量アガロース樹脂（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を３回通過させた。ＬＰＳおよび非特異的に結合したタンパク質を除去するために、ＩｇＧ結合樹脂を０．１％Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１１４（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を含有するＰＢＳ、５０ｍＬおよびＰＢＳ、５０ｍＬで洗浄した。全てのＩｇＧバリアントを、１００ｍＭのグリシン緩衝液（ｐＨ３．０）を用いて溶出し、１Ｍのトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）を用いてすぐに中和した。溶出したリツキシマブ−Ｆｃバリアントの全ての緩衝液をＡｍｉｃｏｎ（登録商標）Ｕｌｔｒａ−４（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）によってＰＢＳと交換した。ＲＡＩ、ＲＡＩＩ、およびＲＡＩＩＩおよびリツキシマブの還元タンパク質または非還元タンパク質の純度を、還元条件下（図６Ａ）および非還元条件下（図６Ｂ）で４％〜２０％勾配ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（ＮｕＳｅｐ）によって査定した。リツキシマブと同様に、ＲＡＩ、ＲＡＩＩ、およびＲＡＩＩＩは適正にアセンブルされ、純度は９５％を超えた。ＲＡＩ、ＲＡＩＩ、およびＲＡＩＩＩが溶液中で単量体として存在するか多量体として存在するかを決定するために、ＲＡＩ、ＲＡＩＩ、ＲＡＩＩＩ、およびリツキシマブをサイズ排除クロマトグラフィー（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ（商標）２００ １０／３００ＧＣ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によって解析した。サイログロブリン（６７０ｋＤａ）、ウシガンマグロブリン（１５８ｋＤａ）、およびニワトリオボアルブミン（４４ｋＤａ）をタンパク質サイズマーカーとして使用した。ＲＡＩ、ＲＡＩＩ、およびＲＡＩＩＩの溶出プロファイルはリツキシマブと同様であり、凝集体のピークはなかった。全てのＩｇＧバリアントの溶出時間は１５８ｋＤａタンパク質サイズマーカーと近く、したがって、単量体ＩｇＧの存在が示される（図７）。結果から、ＲＡＩ、ＲＡＩＩ、およびＲＡＩＩＩが溶液中で多量体ＩｇＧを構成せず、アセンブルされた単量体として存在することが示唆される。

（実施例７）
選択されたＩｇＧバリアントのＣ１ｑ、ＦｃγＲ、およびＦｃＲｎに対する結合性質
ＲＡＩ、ＲＡＩＩ、およびＲＡＩＩＩのＣ１ｑおよびＦｃγＲに対する親和性を、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）および表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を使用して評価した。

ＲＡＩ、ＲＡＩＩ、およびＲＡＩＩＩのＦｃγＲを用いたＥＬＩＳＡ測定：１μｇのＲＡＩ、ＲＡＩＩ、ＲＡＩＩＩ、非グリコシル化リツキシマブ、およびグリコシル化リツキシマブを９６ウェルＥＩＡ／ＲＩＡプレート（Ｑｉａｇｅｎ）上に４℃で一晩にわたってコーティングし、プレートを、０．０５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０（ＰＢＳＴ）を含有するＰＢＳで３回洗浄した。プレートを、ＰＢＳ中３％脱脂乳を用いて室温で１時間ブロッキングし、ＰＢＳＴで３回洗浄した。次いで、５０ｎＭおよび５００ｎＭの単量体ＦｃγＲＩ、二量体ＦｃγＲＩＩａＲ１３１、二量体ＦｃγＲＩＩａＨ１３１、二量体ＦｃγＲＩＩｂ、二量体ＦｃγＲＩＩＩａＶ１３１、および二量体ＦｃγＲＩＩＩａＦ１３１をプレートに添加した。室温で１時間インキュベートした後、プレートをＰＢＳＴで洗浄し、１：５０００のヤギ抗Ｈｉｓまたは抗ＧＳＴ ＨＲＰ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を含有するＰＢＳ、５０μＬと一緒に１時間インキュベートした。ＰＢＳＴで３回洗浄した後、ＴＭＢ基質５０μＬをウェル（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）ごとに添加し、１ＭのＨ_２ＳＯ_４、５０μＬを添加して中和し、４５０ｎｍにおける吸光度を記録した。ＲＡＩおよびＲＡＩＩでは、いずれのＦｃγＲとの結合シグナルも示されなかったが、ＲＡＩＩＩでは、ＦｃγＲＩＩｂ以外の全てのＦｃγＲと同様またはわずかに低下した結合強度が示された（図８Ａ〜Ｆ）。

ＳＰＲ測定：ＳＰＲ測定をＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）３０００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）計器で実施した。ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）をＣＭ５センサーチップの参照チャネル内に固定化して緩衝液の影響および非特異的結合シグナルを差し引いた。リツキシマブ、ＲＡＩ、ＲＡＩＩ、ＲＧＩ、およびＲＧＩＩをｐＨ５．０においてアミンカップリングによってＣＭ５センサーチップ上に固定化した。段階的に希釈したＣ１ｑ（１ｎＭ〜４０ｎＭ）、単量体ＦｃγＲＩ（１ｎＭ〜４０ｎＭ）、二量体ＦｃγＲＩＩａ_Ｒ１３１（５０ｎＭ〜４００ｎＭ）、二量体ＦｃγＲＩＩａ_Ｈ１３１（５０ｎＭ〜４００ｎＭ）、二量体ＦｃγＲＩＩｂ（１００ｎＭ〜１０００ｎＭ）、二量体ＦｃγＲＩＩＩａ_Ｖ１３１（５０ｎＭ〜４００ｎＭ）、および二量体ＦｃγＲＩＩＩａ_Ｆ１３１（５０ｎＭ〜４００ｎＭ）をＣＭ５チップに３０μＬ／分で２分間注入した。各結合事象後に１０ｍＭのグリシン（ｐＨ３．０）を接触時間１分で用いてチップを再生させた。得られたセンサーグラムを、Ｂｉａｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ３．０ソフトウェアを使用し、Ｃ１ｑについてはグローバル２状態結合モデルを用い、単量体ＦｃγＲＩについては１：１ラングミュア等温線モデルを用い、二量体ＦｃγＲについては二価モデルを用いてフィッティングした（図９Ａ〜Ｄおよび１０；表５〜６）。興味深いことに、ＲＡＩでは、ＳＰＲ解析からＣ１ｑ特異的結合プロファイルが示されたが、ＲＡＩのグリコシル化バージョンであるＲＧＩではＣ１ｑ結合能が失われた。ＲＡＩの全体的なＫ_Ｄは１４５±１ｐＭであり、野生型リツキシマブの１５９倍の増大である（図９Ａ〜Ｂ；表５）。ＲＡＩＩでも同様にＳＰＲ解析からＣ１ｑ特異的結合プロファイルが示されたが、ＲＡＩＩとは異なり、ＲＡＩＩのグリコシル化バージョンであるＲＧＩＩは、Ｃ１ｑ結合能を維持し、ＦｃγＲＩに対する親和性を有した。ＲＡＩＩの全体的なＫ_Ｄは１０８±１ｐＭであり、野生型リツキシマブの２１３倍である（図９ＡおよびＣ；表５）。ＲＧＩＩのＫ_ＤはＣ１ｑに対して３８５±４ｐＭであり、野生型リツキシマブの６０倍である（図９ＡおよびＤ；表５）。ＲＧＩＩはまた、ＦｃγＲＩに対して６４８±１６ｎＭのＫ_Ｄも有した（図１０；表６）。他のＦｃγＲについては、応答はなかった（表６）。

ＲＡ８０１およびＲＡ８０２のｐＨ依存性結合を解析するために、ＦｃＲｎ−ＧＳＴ融合タンパク質（７３０ｎＭ）をＣＭ５チップに３０μｌ／分のｐＨ７．４のＨＢＳ−ＥＰ（ＧＥ−Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で９０秒間注入した。各結合事象後に１０ｍＭのグリシンｐＨ３．０を接触時間１分で用いてチップを再生させた。単量体ＦｃＲｎ（５０〜４００ｎＭ）を用いたＳＰＲ測定はＣＭ５チップにｐＨ６．０のＰＢＳを３０μｌ／分で９０秒間注射し、各結合事象後に１０ｍＭのグリシン、ｐＨ３．０を１分間用いてチップを再生させた。ＲＡＩおよびＲＡＩＩではｐＨ依存性結合性質が示された。ｐＨ６．０におけるＲＡＩのＫ_ＤはＦｃＲｎとで１１０±８ｎＭであり、野生型リツキシマブの５．６６倍の増大である（図１８Ｂ；表７）。ｐＨ６．０におけるＲＡＩＩのＦｃＲｎとのＫ_Ｄは９５９±６９ｎＭ、または野生型リツキシマブの０．６５倍である（図１８Ｃ；表７）。ｐＨ７．４では結合は観察されなかった（図１８Ｄ；表７）。

ＲＡＩＩＩのＳＰＲ測定：同じ方法を使用して、ＲＡＩＩＩを固定化した後、段階的に希釈したＣ１ｑおよびＦｃγＲをＣＭ５センサーチップに注入した。上記と同じ方法を使用してＳＰＲセンサーグラムをフィッティングした。ＲＡＩＩＩは、Ｃ１ｑおよびＦｃγＲＩＩｂ以外のＦｃγＲに対して以下の通り親和性を有した：Ｃ１ｑに対して１．６０±０．０３ｎＭ（図１１Ａ；表８）、単量体ＦｃγＲＩに対して１３．４±０．４ｎＭ（図１１Ｂ；表８）、二量体ＦｃγＲＩＩａ_Ｒ１３１に対して１２７±１ｎＭ（図１１Ｃ；表８）、二量体ＦｃγＲＩＩａ_Ｈ１３１に対して１０２±２ｎＭ（図１１Ｄ；表８）、二量体ＦｃγＲＩＩＩａ_Ｖ１３１に対して７９．８±０．９ｎＭ（図１１Ｅ；表８）、および二量体ＦｃγＲＩＩＩａ_Ｆ１３１に対して３９０±８ｎＭ（図１１Ｆ；表８）。表９は、ネイティブＩｇＧ１と比較したＩｇＧバリアントの結合プロファイルの要約を示す。

（実施例８）
ＲＡＩＩＩのさらなる操作
ＲＡＩＩＩの収率および安定性を増強するために、ＲＡＩＩＩのランダム変異のライブラリーを、実施例２におけるものと同じ方法を使用して、変異率が１％になる条件下でエラープローンＰＣＲによって構築した。ライブラリーを２つの異なるやり方でスクリーニングした。第１に、ライブラリーを、抗体の発現レベルを検出することが可能な抗ｍｙｃ Ａｂ−ＦＩＴＣを用いて標識し、１ラウンド目および４ラウンド目にＦＡＣＳＡｒｉａ（商標）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）によってスクリーニングして、発現レベルの増強について選択した。第２に、ライブラリーを、１００ｎＭのＦｃγＲＩＩＩａ−ＧＳＴ−ＰＥを用いて標識し、２ラウンド後、３ラウンド後および５ラウンド後に、競合剤として１μＭのＦｃγＲＩＩｂの存在下でＦＡＣＳＡｒｉａ（商標）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）によってスクリーニングして、ＲＡＩＩＩと同じ結合特性を維持するが、ＲＡＩＩＩよりも高レベルで発現させることができるＲＡＩＩＩバリアントを単離した。スクリーニング中の蛍光プロファイルを図１９に示す。

（実施例９）
ＩｇＧバリアントのＦＡＣＳ解析
ライブラリー選別の最後（第５）のラウンドからランダムに選択したＩｇＧバリアント５０種について配列決定し（配列番号３６〜４５）、１０種の異なるＦｃバリアントのみがコードされることが見出された（５０種の選択されたクローンのプール中の多数のコピーを代表する）。Ｆｃ−Ｖ１は、単一の変異、Ｍ２５２Ｖを有する（配列番号３６）。Ｆｃ−Ｖ１１は、３つの変異、Ｋ２４６Ｎ、Ｋ３２２Ｅ、およびＧ４０２Ｄを有する（配列番号３７）。Ｆｃ−Ｖ１２は、７つの変異、Ｆ２４２Ｌ、Ｎ３１５Ｓ、Ｉ３３６Ｍ、Ｋ３４０Ｒ、Ｑ３４２Ｄ、Ａ３７８Ｔ、およびＱ３８６Ｒを有する（配列番号３８）。Ｆｃ−Ｖ１５は、３つの変異、Ｋ３３４Ｅ、Ｌ３５１Ｑ、およびＮ４２１Ｄを有する（配列番号３９）。Ｆｃ−Ｖ１７は、２つの変異、Ｇ３４１ＡおよびＬ３５１Ｑを有する（配列番号４０）。Ｆｃ−Ｖ１８は、３つの変異、Ｍ２５２Ｖ、Ｇ３４１Ａ、およびＬ３５１Ｑを有する（配列番号４１）。Ｆｃ−Ｖ１９は、４つの変異、Ｋ２４６Ｑ、Ｔ２６０Ａ、Ｎ３１５Ｓ、およびＱ３８６Ｒを有する（配列番号４２）。Ｆｃ−Ｖ２３は、６つの変異、Ｋ２４６Ｎ、Ｍ２５２Ｖ、Ｋ３２２Ｅ、Ｒ３４４Ｇ、Ｅ３４５Ｙ、およびＦ３７２Ｌを有する（配列番号４３）。Ｆｃ−Ｖ２４は、５つの変異、Ｆ２４２Ｌ、Ｍ２５２Ｖ、Ｋ３３８Ｑ、Ｇ３４１Ａ、およびＥ３４５Ｙを有する（配列番号４４）。Ｆｃ−Ｖ２６は、７つの変異、Ｋ３３４Ｅ、Ｇ４０２Ｄ、Ｋ３３８Ｑ、Ｑ３４２Ｐ、Ｒ３４４Ｇ、Ｅ３４５Ｙ、およびＦ３７２Ｌを有する（配列番号４５）。Ｆｃバリアント発現細胞を、１０ｎＭのＣ１ｑ、１００ｎＭのＦｃγＲＩＩＩａ_Ｖ１５８−ＧＳＴ−ＰＥまたはＦｃγＲＩＩｂ−ＧＳＴ−ＰＥを用いて標識し、解析した（図２０および表１０）。単離された１０種のＩｇＧバリアントでは、ＲＡＩＩＩと比較して発現レベルの１．５〜３．９倍の増強、同様のＣ１ｑ結合活性（１．３〜１．６倍）、およびＦｃγＲＩＩＩａ_Ｖ１５８−ＧＳＴ結合活性の３．５〜５．１倍の増強が示された。１０種のＩｇＧバリアント全てで、二量体ＦｃγＲＩＩｂ−ＧＳＴ融合物に対する検出可能な結合活性は示されなかった。

（実施例１０）
選択されたＩｇＧバリアントを用いてオプソニン化したＲａｊｉ細胞におけるＣ１ｑ結合およびＣ３ｂ沈着活性
Ｃ１ｑ結合アッセイを完全ＲＰＭＩ１６４０培地（１０％ＦＢＳ）において行った。ＣＤ２０陽性Ｒａｊｉ細胞（ヒトバーキットリンパ腫、ＡＴＣＣ ＣＣＬ−８６；Golay、２０００年）を氷上、細胞１×１０^７個／ｍｌに懸濁した。Ｃ１ｑを添加して最終濃度を１０μｇ／ｍｌにし、次いで、ハーセプチン、リツキシマブ、またはＲＡＩＩを添加し、反応混合物をすぐに３７℃の水浴に移した。種々の時点（０〜６０分）で一定分量を取り出し、２０体積の氷冷ＢＳＡ−ＰＢＳを用いてクエンチした。次いで、細胞をＰＢＳ中１％ＢＳＡで３回洗浄し、ＦＩＴＣ抗Ｃ１ｑを用いて室温で３０分間プローブし、次いで、ＰＢＳ中１％ＢＳＡで洗浄し、２％パラホルムアルデヒドを含有するＰＢＳ中で固定した。ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）でフローサイトメトリーを実施し、平均蛍光強度を、較正したビーズ（Ｓｐｈｅｒｏｔｅｃｈ）を使用して可溶性蛍光色素分子等量（ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｏｆ ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ ｓｏｌｕｂｌｅ ｆｌｕｏｒｏｃｈｒｏｍｅ）（ＭＥＳＦ）に変換した。ＲＡＩＩにより、ＲＡＩＩオプソニン化Ｒａｊｉ細胞表面上のリツキシマブよりも強力なＣ１ｑに対する結合活性が示された（図２１）。

ＣＤ２０陽性ＤＡＵＤＩ（ヒトバーキットリンパ腫、ＡＴＣＣ ＣＣＬ−２１３）およびＤＢがん細胞（ヒト大細胞型リンパ腫、ＡＴＣＣ ＣＲＬ２２８９）におけるリツキシマブおよびＲＡＩＩによるＣ３ｂ沈着のレベルを決定した。完全ＲＰＭＩ１６４０培地中の細胞を等体積のＮＨＳ（正常ヒト血清）と混合し、次いで、ｍＡｂを最終濃度１０μｇ／ｍｌまで添加した。３７℃で３０分間インキュベートした後、細胞を１％（ＢＳＡ−ＰＢＳ）で２回洗浄し、ＦＩＴＣ ｍＡｂ ７Ｃ１２（抗Ｃ３ｂマウスＩｇＧ）を用いて展開した。ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）でフローサイトメトリーを実施した。結果を図２２に示す。Ｃ３ｂ沈着のレベルは、血清のみの対照と比較した差異の倍率として表される。ＲＡＩＩにより、リツキシマブと比較して、ＤＡＵＤＩがん細胞では同様のＣ３ｂ沈着のレベルが示され、ＤＢ細胞ではより高レベルのＣ３ｂ沈着が示された。

（実施例１１）
液相補体活性化
がん細胞の非存在下での補体活性化を、抗体１００μｇを９０％正常ヒト血清１ｍＬ、３７℃で１時間インキュベートした後に、補体活性化の古典経路についてのマーカーであるＣ４ｄ濃度を測定することによって決定した。Ｃ４ｄ濃度をＥＬＩＳＡ（ＭｉｃｒｏＶｕｅ Ｃ４ｄ ＥＩＡ ｋｉｔ、Ｑｕｉｄｅｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＵＳ）において製造者の説明書に従って測定した。熱凝集したＩｇＧ（ＨＡＧ）では、正常ヒト血清対照と比較して２．８倍のＣ４ｄ濃度の増大が示された。リツキシマブ、ＲＡＩ、およびＲＡＩＩでは、正常ヒト血清対照と同じＣ４ｄ形成が示された（図２３）。この結果は、ＲＡＩおよびＲＡＩＩは、溶液中、標的細胞の非存在下で（免疫複合体が形成されない）古典的な補体活性化経路を活性化することができないことを明らかにするものである。

（実施例１２）
選択されたＩｇＧバリアントによるがん細胞死滅についての補体依存性細胞傷害アッセイ
ＣＤＣアッセイ：ＲＡＩ、ＲＡＩＩ、またはＲＡＩＩＩ媒介性補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）の有効性を評価するために、Ｒａｊｉ細胞およびＲａｍｏｓ細胞（ヒトバーキットリンパ腫、ＡＴＣＣ ＣＣＬ−８６）を、標的細胞として使用した。Ｒａｊｉ細胞およびＲａｍｏｓ細胞を、１０％ＦＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）を補充したＲＰＭＩ１６４０培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）で培養し、３００×ｇで５分にわたって遠心分離することによって採取した。収集した細胞をＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ中４μＭのカルセインＡＭ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＵＳＡ）を用いて、３７℃、５％ＣＯ_２で３０分にわたって標識した。標識したＲａｊｉ細胞をＰＢＳで２回洗浄し、１０％ＦＢＳを含有するＲＰＭＩ１６４０培地に再懸濁し、９６ウェルプレートに細胞５，０００個／ウェルで播種した。健康なドナー由来の正常なヒト血液を、ゲルを伴う赤色／灰色血餅活性化因子チューブ中に採取し、３０分静置し、１５００×ｇで１５分にわたって遠心分離した。次いで、正常ヒト血清２５μＬを各ウェルに添加した。ＩｇＧバリアントを様々な濃度で各ウェルに添加し、混合し、３７℃、５％ＣＯ_２で１時間インキュベートした。プレートを２０００ｒｐｍで１０分にわたって遠心分離し、次いで、上清を採取した。放出されたカルセインＡＭを励起波長および放出波長それぞれ４８５ｎｍおよび５３５ｎｍにおいて検出した。腫瘍細胞溶解のパーセントを次式に従って算出した：１００×（Ｅ−Ｓ）／（Ｍ−Ｓ）（式中、Ｅは実験ウェルの蛍光であり、Ｓは抗体の非存在下での蛍光であり（腫瘍細胞を培地および補体単独と一緒にインキュベートした）、Ｍは、溶解緩衝液（２％ｖ／ｖのＴｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００、１％ｗ／ｖのＳＤＳ、１００ｍＭのＮａＣｌ、および１ｍＭのＥＤＴＡ）を用いた腫瘍細胞の蛍光である）。ＲＡＩのＥＣ_５０は９．０５±０．９０ｎＭであり、これは、Ｒａｊｉ細胞における野生型リツキシマブに対して３．７７倍の増大であった。ＲＡＩＩのＥＣ_５０は４．４８±０．２６ｎＭであり、これは、Ｒａｊｉ細胞における野生型リツキシマブに対して７．６２倍の増大であった。ＲＡＩＩＩのＥＣ_５０は７．３５±０．２２ｎＭであり、これは、Ｒａｊｉ細胞における野生型リツキシマブに対して４．６４倍の増大であった（図１２；表１１）。ＲＡＩのＥＣ_５０は０．４６±０．０２ｎＭであり、これは、Ｒａｍｏｓ細胞における野生型リツキシマブに対して２．０倍の増大であった。ＲＡＩＩのＥＣ_５０は０．１６±０．０１ｎＭであり、これは、Ｒａｍｏｓ細胞における野生型リツキシマブに対して５．７倍の増大であった（図２４；表１１）。アイソタイプ対照抗体であるハーセプチンでは、Ｒａｊｉ細胞およびＲａｍｏｓ細胞においていかなる有意な応答も示されなかった（図１２；表１１）。同様にヒト急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）患者ドナー由来のＡＬＬ初代細胞（ＭＤ Ａｎｄｅｒｓｏｎより）を用いて同じＣＤＣアッセイを実施した。補体によるＩｇＧバリアント媒介性細胞溶解により、前のＣＤＣアッセイの結果と同様のプロファイルが示された（図１３）。ＲＡＩ、ＲＡＩＩ、およびＲＡＩＩＩにより、濃度依存性ＣＤＣ媒介性腫瘍細胞溶解がリツキシマブよりも良好に誘導された。

Ｃ１ｑとともにプレインキュベートしたＩｇＧのＣＤＣアッセイ：ＩｇＧは、補体タンパク質と一緒にヒト血液中を循環する。したがって、ＲＡ ＩおよびＲＡ ＩＩのＣＤＣ活性を、同じモル濃度のＣ１ｑタンパク質と一緒に室温で１時間プレインキュベートした後に測定した。図１４の結果から示される通り、ＩｇＧバリアントとＣ１ｑのプレインキュベーションにより、ＩｇＧ単独でおよそ４０％超の死滅活性を有する場合には有意差は示されなかった。しかし、ＩｇＧ単独で２０％未満の死滅活性を有する場合には、プレインキュベーションにより、それらの有効性が有意に増大した。ＲＡ ＩまたはＲＡ ＩＩバリアントとＣ１ｑのプレインキュベーションにより、Ｃ１ｑのみをより低い抗体濃度で用いたプレインキュベーションなしと比較して高い細胞溶解が示された。

（実施例１３）
ＩｇＧバリアントによるがん細胞死滅についての抗体依存性細胞傷害アッセイ
ＡＤＣＣアッセイ：ＡＤＣＣアッセイの前日に、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）および多形核白血球（ＰＭＮ）を健康なドナー由来のヒト血液から単離した。ヒト血液５０ｍＬをヘパリン添加バイアル（ＢＤ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）中に採取し、チューブを数回穏やかに反転させることによって十分に混合した。血液２５ｍＬを５０ｍＬ円錐管中の室温のフィコール（Ｆｉｃｏｌｌ）Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）２５ｍＬ上に層状に重ねた。チューブを、スイングバケットローター中、ブレーキなしで、２，５００ｒｐｍで３０分にわたって遠心分離した。ヒトＰＢＭＣをｈｉｓｔｏｐａｑｕｅと培地との界面相に吸引し、ヒトＰＭＮをペレットから採取した。ヒトＰＢＭＣおよびＰＭＮを赤血球（ＲＢＣ）溶解緩衝液（１５５ｍＭのＮＨ_４Ｃｌ、１２ｍＭのＮａＨＣＯ_３、および０．１ｍＭのＥＤＴＡ）に再懸濁させ、ＰＢＳで２回洗浄した。単離されたヒトＰＢＭＣまたはＰＭＮを、９６ウェルプレート中、カルセインＡＭで標識したＲａｊｉ細胞および様々な濃度のＩｇＧバリアントと混合した。ＰＭＮを１０ｎｇ／ｍＬのＧＭ−ＣＳＦ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によって活性化した。腫瘍対エフェクター細胞の比を１：１０とし、プレートを３７℃、５％ＣＯ_２で４時間インキュベートした。溶解した腫瘍細胞の量を、ＣＤＣアッセイを使用して同じ方法によって検出した。腫瘍細胞溶解のパーセントを次式に従って算出した：１００×（Ｅ−Ｓ）／（Ｍ−Ｓ）（式中、Ｅは実験ウェルの蛍光であり、Ｓは抗体の非存在下での蛍光であり（腫瘍細胞を培地およびエフェクター細胞と一緒にインキュベートした）、Ｍは溶解緩衝液を用いた腫瘍細胞の蛍光である）。実施例７に記載の通り、ＲＡＩおよびＲＡＩＩでは、ＰＢＭＣまたはＰＭＮとともにいかなるＡＤＣＣ活性も示されず、これは、ＲＡＩおよびＲＡＩＩがＦｃγＲに対して親和性を有さないからである（図９Ａ〜Ｄおよび１５Ａ〜Ｂ）。しかし、ＲＡＩＩＩは、ＦｃγＲＩＩｂ以外のＦｃγＲに対して親和性を有し、したがって、ＲＡＩＩＩでは、リツキシマブとほぼ同じＡＤＣＣ活性が示された（図１１Ａ〜Ｆおよび１５Ａ〜Ｂ）。ＰＢＭＣにおけるＲＡＩＩＩのＥＣ_５０値は２．０１±０．０２ｎＭであり、ＰＢＭＣにおけるリツキシマブのＥＣ_５０値は２．１１±０．０２ｎＭであった。

（実施例１４）
がん細胞死滅についての補体依存性細胞傷害アッセイ
ＣＤＣＣおよびＣＭＣアッセイの前日に、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）および多形核白血球（ＰＭＮ）を健康なドナー由来のヒト血液から単離した。血清および免疫細胞の存在下で、抗体は、ＡＤＣＣ、ならびに、ＣＤＣおよび補体依存性細胞傷害（ＣＤＣＣ）の両方に起因する細胞溶解の結果である補体媒介性細胞傷害（ＣＭＣ）を活性化することが可能である。Ｃ１ｑに特異的なＩｇＧバリアントはＡＤＣＣ活性を示さないので、ＣＭＣのみを誘導することができる。さらに、細胞溶解の非存在下でのＣＤＣＣ単独の効果（終末補体複合体ＴＣＣの形成に起因する）を、Ｃ９枯渇血清を使用して決定することができる。Ｃ９タンパク質は、ＴＣＣの形成に重要なものであり、その非存在下では、Ｆｃ受容体に結合しない抗体による細胞溶解がＣＤＣＣ経由のみによって起こり得る。ＣＤＣＣアッセイのために、ＣＤ２０＋がん細胞を、抗体、２５％Ｃ９枯渇血清、およびＰＢＭＣまたは多形核（ＰＭＮ）細胞と一緒にインキュベートした。ＰＭＮを１０ｎｇ／ｍＬのＧＭ−ＣＳＦ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によって活性化した。腫瘍対エフェクター細胞の比を１：１０とし、プレートを３７℃、５％ＣＯ_２で４時間インキュベートした。溶解した腫瘍細胞の量を、実施例１２におけるＣＤＣアッセイに使用したのと同じ方法によって検出した。腫瘍細胞溶解のパーセントを次式に従って算出した：１００×（Ｅ−Ｓ）／（Ｍ−Ｓ）（式中、Ｅは実験ウェルの蛍光であり、Ｓは、抗体の非存在下での蛍光であり（腫瘍細胞を培地およびエフェクター細胞と一緒にインキュベートした）、Ｍは溶解緩衝液を用いた腫瘍細胞の蛍光である）。Ｃ９枯渇血清および免疫細胞を用いると、ＲＡＩおよびＲＡＩＩはＣＤＣＣのみを活性化したが、リツキシマブはＡＤＣＣとＣＤＣＣの両方を活性化することができる。ＲＡＩおよびＲＡＩＩにより、Ｒａｊｉ細胞およびＲａｍｏｓ細胞において、リツキシマブのＡＤＣＣおよびＣＤＣＣによるものと同様のＣＤＣＣによる腫瘍細胞死滅活性が示された（図２５Ａ〜Ｄ；表１２）。

（実施例１５）
選択されたＩｇＧバリアントによるがん細胞死滅についての補体依存性細胞ファゴサイトーシスアッセイ
ＰＢＭＣを、新鮮なヒト血液からＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ密度勾配遠心分離によって精製し、ＣＤ１４＋単球を磁気ビーズ分離によって単離した。単球を、１５％ＦＢＳおよび５０ｎｇ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦを含有するＲＰＭＩ培地で７日間培養することによってマクロファージに分化させ、次いで、それらをエフェクター：腫瘍細胞比１０：１で、カルセインで標識したＲａｊｉ細胞および示されている抗体と混合した。補体依存性細胞ファゴサイトーシス（ＣＤＣＰ）アッセイのために、Ｒａｊｉ細胞を、２５％Ｃ９枯渇血清、抗体およびマクロファージと一緒にインキュベートした。３７℃で２時間後に、細胞を抗ＣＤ１１ｂ−ＡＰＣおよび抗ＣＤ１４−ＡＰＣで標識した。ファゴサイトーシスをＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）でＦＡＣＳによって評価し、試料中の腫瘍細胞の総数に対する２重陽性細胞の画分として報告した。ＲＡＩおよびＲＡＩＩによりＣＤＣＰを誘導することができ、また、ＡＤＣＰとＣＤＣＰの両方を誘導することができるリツキシマブよりも良好な腫瘍細胞貪食活性が示された。ＲＡＩのＥＣ_５０は４．６１±０．０５ｎＭであり、これは、Ｒａｊｉ細胞における野生型リツキシマブに対して３．７８倍の増大である。ＲＡＩＩのＥＣ_５０は３．７２±０．０４ｎＭであり、これは、Ｒａｊｉ細胞における野生型リツキシマブに対して４．６９倍の増大である（図２６；表１３）。

（実施例１６）
がん細胞死滅についての補体媒介性細胞傷害アッセイ
ＣＤＣＣ、およびＣＭＣアッセイの前日に、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）および多形核白血球（ＰＭＮ）を健康なドナー由来のヒト血液から単離した。ＣＭＣアッセイのために、がん細胞を、抗体、２５％のプールしたヒト血清（ＰＨＳ）、およびＰＢＭＣ（またはＰＭＮ）と一緒にインキュベートした。ＰＭＮを１０ｎｇ／ｍＬのＧＭ−ＣＳＦ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によって活性化した。腫瘍対エフェクター細胞の比を１：１０とし、プレートを３７℃、５％ＣＯ_２で４時間インキュベートした。溶解した腫瘍細胞の量を、ＣＤＣアッセイと同じ方法によって検出した。ＰＨＳおよび免疫細胞を用いると、ＲＡＩおよびＲＡＩＩはＣＭＣのみを媒介することができるが、リツキシマブは、ＣＭＣに加えてＡＤＣＣの全てのエフェクター機能により細胞死滅を媒介することができる。ＲＡＩおよびＲＡＩＩでは、ＰＢＭＣまたはＰＭＮを用いると、Ｒａｊｉ細胞およびＲａｍｏｓ細胞でＥＣ_５０値の増強が示された。ＲＡＩでは、Ｒａｊｉを用い、ＰＢＭＣをエフェクター細胞として使用するとＥＣ_５０値の１．４倍の増強が示され、Ｒａｊｉ細胞を用い、ＰＭＮをエフェクター細胞として使用するとＥＣ_５０値の１．３倍の増強が示され、Ｒａｍｏｓ細胞を用い、ＰＢＭＣを使用するとＥＣ_５０値の２．７倍の増強が示され、ＲａｍｏｓおよびＰＭＮを用いるとＥＣ_５０値の１．８倍の増強が示された（全てリツキシマブと比較して）。ＲＡＩＩでも同様に、全てリツキシマブと比較して、ＲａｊｉおよびエフェクターとしてＰＢＭＣを用いるとＥＣ_５０値の２．１倍の増強が示され、ＲａｊｉおよびＰＭＮを用いるとＥＣ_５０値の１．９倍の増強が示され、ＲａｍｏｓおよびＰＢＭＣを用いるとＥＣ_５０値の６．９倍の増強が示され、ＲａｍｏｓおよびＰＭＮを用いるとＥＣ_５０値の６．１倍の増強が示された（図２７Ａ〜Ｄ；表１４）。

（実施例１７）
補体結合が増強されたＩｇＧバリアントによるがん細胞死滅についての全血アッセイ
健康なドナー由来の全血を、ＩｇＧバリアントおよびカルセインＡＭで標識したＲａｊｉ細胞と一緒に、９６ウェルプレート中、３７℃、５％ＣＯ_２で４時間インキュベートした。腫瘍細胞死滅活性を実施例８におけるものと同じＣＤＣアッセイによって測定した。腫瘍細胞溶解のパーセントを、実施例８におけるものと同じ式を使用して算出した。図１６に示されている通り、ＲＡＩおよびＲＡＩＩのＣＤＣ有効性については、リツキシマブではＡＤＣＣおよびＣＤＣが濃度依存的に媒介されるにもかかわらず、リツキシマブよりも良好な腫瘍細胞死滅活性が示された。ＡＤＣＣとＣＤＣの両方を誘導することができるＲＡＩＩＩでも同様に、リツキシマブよりも高い腫瘍細胞溶解活性が示された。

（実施例１８）
選択されたＩｇＧバリアントによるＣＤ２０およびＦｃγＲＩＩＢ媒介性内部移行アッセイ
リツキシマブとＦｃγＲＩＩＢおよびＣＤ２０の共ライゲーションにより、ＣＤ２０−抗体複合体の内部移行（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ）が誘導され、その後、リソソーム内経路によりＣＤ２０リガンドが分解される。この機構により、標的細胞上のＣＤ２０発現が低減し、この機構は、リツキシマブに対するがん細胞の抵抗性に関する重大な機構であると考えられる。ＴＭＤ８細胞（ヒトＡＢＣ−ＤＬＢＣＬ細胞株）およびＨＢＬ−１細胞（ヒトびまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫）におけるＣＤ２０陽性の内部移行を評価した。ＴＭＤ８細胞およびＨＢＬ−１細胞を、１０％ＦＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）を補充したＲＰＭＩ１６４０培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）で培養し、次いで、細胞を、アイソタイプ対照、リツキシマブ、またはＲＡＩＩと一緒に０時間、２時間、４時間、または６時間インキュベートした。細胞表面に結合した抗体のレベルを、ＦＩＴＣを伴うヤギ抗ヒトＦｃ（Ａｂｃａｍ）によって検出した。リツキシマブでは、どちらの細胞株においても時間に応じてＭＦＩ値の低下が示された。対照的に、ＲＡＩＩと一緒にインキュベートすることにより標的細胞におけるＣＤ２０内部移行はもたらされず、したがって、両方の細胞株について全ての時点において同様のＭＦＩ値が示された（図２８Ａ〜Ｂ）。これらの実験を独立して３回繰り返した。

（実施例１９）
アナフィラキシーアッセイ
動物実験は全て、施設のＡｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｔｅｘａｓ ａｔ Ａｕｓｔｉｎにより承認されたプロトコールの下で実施した（ここではタンパク質の熱凝集）。免疫複合体により、ＦｃγＲ発現細胞によって媒介されるアナフィラキシー応答が引き起こされる可能性がある。アナフィラキシー応答を評価するために、免疫複合体を、陰性対照として調製した熱凝集したＦａｂによって、ならびに陽性対照としてマウスリツキシマブによって、およびＲＡＩＩによっても、６３℃で１時間インキュベートすることによって形成した。各熱凝集した抗体６００μｇをＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（ｎ＝３）（Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）に静脈内注射した。アナフィラキシー応答の一般的な症状の１つは、体温の低下である。したがって、マウス深部体温を、直腸サーモプローブを使用して５分ごとに測定した。ｍリツキシマブで処置したマウスについては、深部体温が最初の２０分で約２．４℃低下し、３８℃まで徐々に回復した。対照的に、ＲＡＩＩで処置したマウスでは、ＲＡＩＩはＦｃγＲに結合しないので、Ｆａｂのような深部体温のいかなる変化も示されなかった。

（実施例２０）
ＲＡＩＩによるｉｎ ｖｉｖｏ抗腫瘍有効性の評価
ＲＡＩＩのｉｎ ｖｉｖｏ抗腫瘍有効性を、異種移植モデルにおいてＲａｊｉ細胞およびＲａｍｏｓ細胞を用いて評価した。細胞を、１０％ウシ胎仔血清（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ペニシリン、およびストレプトマイシンを伴うＲＰＭＩ１６４０培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で培養した。次いで、５０％マトリゲル（ＢＤ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を伴うＲＰＭＩ１６４０培地２００μＬ中２．５×１０^５個のＲａｊｉ細胞を各ＮＯＤ−ＳＣＩＤ ＩＬ２Ｒ^−／−マウス（ｎ＝３）の右側腹部に皮下注射した。腫瘍の発生を、カリパス測定によって決定した。平均腫瘍サイズが５０ｍｍ^２になった時に（２１日目）、ＰＢＳ、リツキシマブ、およびＲＡＩＩを、マウス当たり抗体４００μｇ（２０ｍｇ／ｋｇ）の単一用量で２１日目、２４日目、および２７日目に腹腔内（ｉ．ｐ．）注射することによって投与した。腫瘍を、腫瘍体積が２００ｍｍ^２になるまで少なくとも週２回、カリパスを使用して測定した。ＲＡＩＩにより、ＰＢＳと比較して腫瘍の成長が有意に阻害され（一元配置ＡＮＯＶＡ；ｐ＜０．０００５）、また、ＲＡＩＩにより、ＡＤＣＣの完全な欠如にもかかわらず、リツキシマブと同等の抗腫瘍活性が示された（図１７）。

次に、５０％マトリゲル（ＢＤ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を伴うＲＰＭＩ１６４０培地２００μＬ中１×１０^６個のＲａｍｏｓ細胞を、各胸腺欠損ヌードマウス（ｎ＝６、Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）の右側腹部に皮下注射した。腫瘍領域のサイズが１０〜５０ｍｍ^２に達したところで抗体またはＰＢＳの投与を開始し、１５日目、１８日目、および２１日目に、全部で３回繰り返した。腫瘍直径を３〜４日毎にカリパスを用いて測定し、それぞれ腫瘍領域を式（長さ）×（幅）×πによって算出した。腫瘍サイズが２５００ｍｍ^３の体積に達したところでマウスを安楽死させた。ＲＡＩＩにより、腫瘍の成長がＰＢＳと比較して有意に阻害され（一元配置ＡＮＯＶＡ；ｐ＜０．００００１）、また、ＲＡＩＩにより、ＡＤＣＣの完全な欠如にもかかわらず、ｍリツキシマブよりも良好な抗腫瘍活性が示された（図３０）。

本明細書において開示され、特許請求されている方法は全て、本開示に照らして、過度な実験を伴わずに準備し実行することができる。本発明の組成物および方法は好ましい実施形態に関して記載されているが、本発明の概念、主旨および範囲から逸脱することなく本明細書に記載の方法および方法のステップまたは一連のステップに変形を適用することができることが当業者には明らかになろう。より詳細には、本明細書に記載の作用物質を化学的かつ生理的に関連するある特定の作用物質で置換することができるが、同じまたは同様の結果が実現されることが明らかになろう。当業者に対して明らかであるそのような同様の置換および改変は全て、添付の特許請求の範囲によって規定される本発明の主旨、範囲および概念の範囲内であるとみなされる。
参考文献
以下の参考文献は、本明細書に記載のものを補足する例示的な手続き上のまたは他の詳細をもたらすものである限りでは、参照により本明細書に具体的に組み込まれる。
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Claims (14)

1. 非グリコシル化野生型ヒトＩｇＧ Ｆｃドメインの結合と比較してヒトＣ１ｑに改善された結合をすることができる非グリコシル化バリアントヒトＩｇＧ Ｆｃドメインを含むポリペプチドであって、前記Ｆｃドメインが、配列番号１に対し少なくとも９０％の配列同一性を含み、前記Ｆｃドメインが、Ｋ３２０ＥおよびＱ３８６Ｒのアミノ酸置換を含み、前記Ｆｃドメインにおける前記残基のナンバリングが、ＫａｂａｔにおけるＥＵ指標のナンバリングであるポリペプチド。
2. ヒトＣ１ｑの結合に特異的な親和性を有する、または
   Ｆｃγ受容体に検出可能に結合しない、または
   ヒトＣ１ｑおよび活性化Ｆｃ受容体の結合に特異的な親和性を有する、
   好ましくは、ＦｃγＲＩＩｂに検出可能に結合しない、請求項１に記載のポリペプチド。
3. 前記非グリコシル化バリアントヒトＩｇＧ Ｆｃドメインが、Ｆｃ８０１（配列番号７）である、請求項１または２に記載のポリペプチド。
4. アミノ酸２９９におけるロイシン置換（Ｔ２９９Ｌ）をさらに含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
5. 非Ｆｃ受容体（非ＦｃＲ）結合ドメインをさらに含み、
   好ましくは、前記非ＦｃＲ結合ドメインが、Ｉｇ可変ドメインであり、
   より好ましくは、前記ポリペプチドが全長抗体として規定されている、請求項１〜４のいずれか一項に記載のポリペプチド。
6. 前記非ＦｃＲ結合領域が、抗体の抗原結合部位ではない、または
   前記非ＦｃＲ結合領域が、細胞表面タンパク質に結合する、または
   前記非ＦｃＲ結合領域が、可溶性タンパク質に結合する、請求項５に記載のポリペプチド。
7. 請求項１〜６のいずれかに記載のポリペプチドをコードする核酸であって、
   好ましくは、ＤＮＡセグメントである、または
   好ましくは、発現ベクターである、核酸。
8. 請求項７に記載の核酸を含む宿主細胞であって、
   好ましくは、前記核酸を発現する、宿主細胞。
9. 非グリコシル化ポリペプチドを調製するための方法であって、
   ａ）請求項８に記載の宿主細胞を得るステップと、
   ｂ）前記非グリコシル化ポリペプチドの発現を促進するための条件下で、培養において前記宿主細胞をインキュベートするステップと、
   ｃ）前記宿主細胞から、発現された前記ポリペプチドを精製するステップと
   を含み、
   好ましくは、前記宿主細胞が、真核細胞であり、前記ポリペプチドが、アミノ酸２９９にロイシン置換（Ｔ２９９Ｌ）を含む、または
   好ましくは、前記宿主細胞が、原核細胞である、方法。
10. 薬学的に許容される担体中に、請求項１〜６のいずれか一項に記載のポリペプチドまたは請求項７に記載の核酸を含む医薬品製剤。
11. 抗体を含む、対象における免疫応答を誘導するための組成物であって、前記抗体が、非グリコシル化されており、かつ請求項１〜４のいずれか一項に記載のＦｃドメインを含む、組成物。
12. 前記非グリコシル化抗体が、ヒトＣ１ｑに特異的に結合することができる、または
    前記非グリコシル化抗体が、ヒトＣ１ｑおよびヒト活性化Ｆｃ受容体に特異的に結合することができる、
    好ましくは、前記非グリコシル化抗体が、グリコシル化された野生型バージョンの抗体の少なくとも５０分の１のレベルで、ＦｃγＲＩＩｂポリペプチドに特異的に結合することができる、または
    前記抗体が、非グリコシル化バージョンの治療抗体である、請求項１１に記載の組成物。
13. 請求項１〜６のいずれか一項に記載のポリペプチドまたは請求項７に記載の核酸を含む組成物であって、該組成物は、標的細胞に対する補体依存性細胞傷害を誘導することによって対象を処置するための、好ましくは腫瘍を有する対象を処置するための組成物であり、
    より好ましくは、前記腫瘍が、固形腫瘍である、または
    より好ましくは、前記腫瘍が、血液学的腫瘍である、
    好ましくは、前記対象が、ヒト患者である、または
    好ましくは、前記組成物が、腫瘍内に、静脈内に、皮内に、動脈内に、腹腔内に、病巣内に、頭蓋内に、関節内に、前立腺内に、胸膜内に、気管内に、眼球内に、鼻腔内に、硝子体内に、腟内に、直腸内に、筋肉内に、皮下に、結膜下、小胞内に、粘膜に、心膜内に、臍帯内に、経口によって、吸入によって、注射によって、注入によって、持続注入によって、標的細胞を直接浸す局在化灌流によって、カテーテルにより、または洗浄により投与されることを特徴とする、または
    好ましくは、前記組成物が、少なくとも第２の抗がん療法と組み合わせて前記対象に投与されることを特徴とし、
    さらにより好ましくは、前記第２の抗がん療法が、外科療法、化学療法、放射線療法、寒冷療法、ホルモン療法、免疫療法またはサイトカイン療法である、組成物。
14. 前記組成物が、補体依存性細胞傷害を誘導し、
    好ましくは、抗体依存性細胞傷害を誘導する、または
    好ましくは、抗体依存性細胞傷害を誘導しない、請求項１３に記載の組成物。

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