JP6913089B2 - Ｄｎａライブラリーの高効率構築 - Google Patents

Ｄｎａライブラリーの高効率構築 Download PDF

Info

Publication number
JP6913089B2
JP6913089B2 JP2018524250A JP2018524250A JP6913089B2 JP 6913089 B2 JP6913089 B2 JP 6913089B2 JP 2018524250 A JP2018524250 A JP 2018524250A JP 2018524250 A JP2018524250 A JP 2018524250A JP 6913089 B2 JP6913089 B2 JP 6913089B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
dna
oligonucleotide
repair
adapter
ligation
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
JP2018524250A
Other languages
English (en)
Other versions
JP2019504618A5 (ja
JP2019504618A (ja
Inventor
クリストファー ケー． レイモンド，
クリストファー ケー． レイモンド，
リー ピー． リム，
リー ピー． リム，
Original Assignee
レゾリューション バイオサイエンス， インコーポレイテッド
レゾリューション バイオサイエンス， インコーポレイテッド
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by レゾリューション バイオサイエンス， インコーポレイテッド, レゾリューション バイオサイエンス， インコーポレイテッド filed Critical レゾリューション バイオサイエンス， インコーポレイテッド
Publication of JP2019504618A publication Critical patent/JP2019504618A/ja
Publication of JP2019504618A5 publication Critical patent/JP2019504618A5/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP6913089B2 publication Critical patent/JP6913089B2/ja
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
    • C12N15/1093—General methods of preparing gene libraries, not provided for in other subgroups
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/66—General methods for inserting a gene into a vector to form a recombinant vector using cleavage and ligation; Use of non-functional linkers or adaptors, e.g. linkers containing the sequence for a restriction endonuclease
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6827—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6853—Nucleic acid amplification reactions using modified primers or templates
    • C12Q1/6855—Ligating adaptors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6869—Methods for sequencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
    • C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
    • C40B50/00—Methods of creating libraries, e.g. combinatorial synthesis
    • C40B50/06—Biochemical methods, e.g. using enzymes or whole viable microorganisms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2525/00—Reactions involving modified oligonucleotides, nucleic acids, or nucleotides
    • C12Q2525/10—Modifications characterised by
    • C12Q2525/191—Modifications characterised by incorporating an adaptor

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１５年１１月１１日に出願された米国仮出願第６２／２５４，１１０号の優先権を主張し、その全体が参照により本書に組み込まれる。
電子提出するテキストファイルの説明
本明細書と共に電子提出するテキストファイル、すなわち配列表のコンピューター可読フォーマットコピー（ファイル名：ＣＬＦＫ＿００３＿０１ＷＯ＿ＳＴ２５、記録日：２０１６年１１月１０日、ファイルサイズ：２３ｋＢ）の内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
技術分野
本発明は概して、ＤＮＡライブラリーを構築するための改良された組成物及び方法に関する。詳細には、本発明は、定量的遺伝子解析のためのＤＮＡクローンライブラリーの効率的な構築に関するものである。
下流解析の対象となる様々なＤＮＡ検体は、ほんのわずかな量で収集される。例として、全血の血漿画分から収集されるセルフリーＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）は、概して、血漿１ｍＬ当たりナノグラムレベルの量で存在する。１つの２倍体ヒトゲノムの重さが６ピコグラムであるとすれば、このことは、１回の採取血から単離され得る総ゲノムの情報が数百から数千存在することを意味する。
がん患者において、腫瘍ＤＮＡは、全循環ＤＮＡの≦０．１％から≧１０％の範囲の変動性が高い量で血流に流れる。採取血にはわずか数ナノグラムのＤＮＡしか含まれず、腫瘍ゲノムが全循環ＤＮＡの０．１％存在する場合には、腫瘍ゲノムは全部で１〜１０コピーしか存在しない。配列解析によって腫瘍ＤＮＡを明確に同定するためには、２コピー以上の腫瘍特異的遺伝子病変を観察することが必要である。しかし、ＤＮＡの検出感度を最大化する必要性、つまり０．１％という範囲での腫瘍ＤＮＡを正確に検出する必要性はまだ達成されていない。
これらの考慮事項は、血液を用いての信頼性の高い固形腫瘍の遺伝子解析が、ゲノム断片を単離及び解析する能力によって部分的に左右されるという、根本的な問題を浮かび上がらせるものである。その上、多くの治療的に実行可能な腫瘍病変は、遺伝子融合、ＤＮＡ配列の顕著な挿入もしくは欠失、及び／または遺伝子コピー数の変化を伴う。このような改変は、ＰＣＲによる解析では対応が困難である。というのも、ＰＣＲは、２つの隣接するプライマー結合部位が既知でなければならず、かつ多数回ラウンドのターゲット増幅によりコピーバリエーションが不明瞭になるからである。
現在は、循環腫瘍ＤＮＡにおける潜在的病変を包括的に解析するためにターゲット検索法が使用されている。このようなターゲット検索法は、ＤＮＡクローンライブラリーの創出に依存する。残念ながら、こういったＤＮＡライブラリーの現状の創出方法は非効率的であり、有用なライブラリークローンに首尾よく変換されるＤＮＡ断片はわずかなパーセンテージに過ぎない。
本発明は、概して、ＤＮＡアダプターをＤＮＡ断片に高効率に接着して、定量的遺伝子解析用のＤＮＡライブラリーを生成するための、組成物及び方法に関する。
様々な実施形態では、１つ以上のＤＮＡ断片に対するアダプターライゲーションの効率を高める方法であって、１つ以上のＤＮＡ断片の末端リン酸残基を除去すること；脱リン酸化ＤＮＡ断片を１種以上の末端修復酵素で処理して、末端修復ＤＮＡを生成すること；１つ以上の二重鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）プレアダプターを末端修復ＤＮＡの各鎖の３’末端に対しライゲーションして、プレアダプター／末端修復ＤＮＡ複合体を形成することであって、各ｄｓＤＮＡプレアダプターが、末端修復ＤＮＡの各鎖の３’末端にライゲーションされたライゲーション鎖オリゴヌクレオチドと非ライゲーションパートナー鎖オリゴヌクレオチドとを含む、ライゲーションすること；プレアダプター／末端修復ＤＮＡ複合体から非ライゲーションパートナー鎖オリゴヌクレオチドを離し、修復オリゴヌクレオチドで置き換えてアダプター／末端修復ＤＮＡ複合体を形成することであって、各アダプターがライゲーション鎖オリゴヌクレオチド及び修復オリゴヌクレオチドを含む、置き換えること；ならびに、アダプター／末端修復ＤＮＡ複合体を１種以上の酵素で処理して、連続した二重鎖のＤＮＡライブラリーを形成することを含み、アダプターライゲーションの効率が、脱リン酸化アダプター分子がリン酸化ＤＮＡ断片に対しライゲーションされる方法よりも高められる、方法が提供される。
様々な実施形態では、ＤＮＡライブラリーを構築する方法であって、１つ以上のＤＮＡ断片の末端リン酸残基を除去すること；脱リン酸化ＤＮＡ断片を１種以上の末端修復酵素で処理して、末端修復ＤＮＡを生成すること；１つ以上の二重鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）プレアダプターを末端修復ＤＮＡの各鎖の３’末端に対しライゲーションして、プレアダプター／末端修復ＤＮＡ複合体を形成することであって、各ｄｓＤＮＡプレアダプターが、末端修復ＤＮＡの各鎖の３’末端にライゲーションされたライゲーション鎖オリゴヌクレオチドと非ライゲーションパートナー鎖オリゴヌクレオチドとを含む、ライゲーションすること；プレアダプター／末端修復ＤＮＡ複合体から非ライゲーションパートナー鎖オリゴヌクレオチドを離し、修復オリゴヌクレオチドで置き換えてアダプター／末端修復ＤＮＡ複合体を形成することであって、各アダプターがライゲーション鎖オリゴヌクレオチド及び修復オリゴヌクレオチドを含む、置き換えること；ならびに、アダプター／末端修復ＤＮＡ複合体を１種以上の酵素で処理して、連続した二重鎖のＤＮＡライブラリーを形成すること、を含む方法が提供される。
特定の実施形態では、非ライゲーションパートナー鎖オリゴヌクレオチドは、３’末端において、末端修復ＤＮＡの５’末端に対するライゲーション及び／またはアダプターダイマー形成を防止する修飾を含む。
あるいくつかの実施形態では、１つ以上のＤＮＡ断片の供与源は、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）、相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、及びセルフリーＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）からなる群から選択されるＤＮＡである。
さらなる実施形態では、ＤＮＡの供与源は、血液、皮膚、毛髪、毛包、唾液、口腔粘液、腟粘液、汗、涙、上皮組織、尿、精液、精漿、前立腺液、射精前液（カウパー腺液）、排泄物、生検、腹水、脳脊髄液、リンパ液、及び組織抽出物試料または生検試料からなる群から選択される生体試料である。
特定の実施形態では、ＤＮＡの供与源は、羊水、血液、血漿、血清、精液、リンパ液、脳脊髄液、眼球液、尿、唾液、便、粘液、及び汗からなる群から選択される生体試料である。
さらなる実施形態では、当該方法は、対象の生体試料からＤＮＡを単離することをさらに含む。
一部の実施形態では、当該方法は、対象の生体試料からＤＮＡを断片化することをさらに含む。
あるいくつかの実施形態では、当該方法は、ライゲーションの前に１つ以上のＤＮＡ断片の損傷を修復することをさらに含む。
特定の実施形態では、当該損傷は、脱アミノ化シトシン（ウラシル）、脱塩基部位、グアニンのＯ６ＭｅＧへのメチル化、ＤＮＡニック、ギャップ、またはチミンダイマーである。
様々な実施形態では、ｃｆＤＮＡライブラリーを構築する方法であって、対象の生体試料からｃｆＤＮＡを単離または取得すること；ｃｆＤＮＡの末端リン酸残基を除去すること；脱リン酸化ｃｆＤＮＡを１種以上の末端修復酵素で処理して、末端修復ｃｆＤＮＡを生成し、任意選択によりＤＮＡ損傷を修復すること；１つ以上の二重鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）プレアダプターを末端修復ｃｆＤＮＡの各鎖の３’末端に対しライゲーションして、プレアダプター／末端修復ｃｆＤＮＡ複合体を形成することであって、各ｄｓＤＮＡプレアダプターが、末端修復ｃｆＤＮＡの各鎖の３’末端にライゲーションされたライゲーション鎖オリゴヌクレオチドと非ライゲーションパートナー鎖オリゴヌクレオチドとを含む、ライゲーションすること；プレアダプター／末端修復ｃｆＤＮＡ複合体から非ライゲーションパートナー鎖オリゴヌクレオチドを離し、修復オリゴヌクレオチドで置き換えてアダプター／末端修復ｃｆＤＮＡ複合体を形成することであって、各アダプターがライゲーション鎖オリゴヌクレオチド及び修復オリゴヌクレオチドを含む、置き換えること；アダプター／末端修復ｃｆＤＮＡ複合体を１種以上の酵素で処理して、連続した二重鎖のｃｆＤＮＡライブラリーを形成すること；ならびにｃｆＤＮＡライブラリーを増幅して、セルフリーＤＮＡクローンライブラリーを生成すること、を含む方法が提供される。
特定の実施形態では、ライゲーション鎖オリゴヌクレオチドはアダプターダイマー形成を防止する１つ以上の修飾を含み、任意選択により、非ライゲーションパートナー鎖オリゴヌクレオチドの３’末端の修飾がアダプターダイマー形成を防止する。
あるいくつかの実施形態では、ライゲーション鎖オリゴヌクレオチドは、アンカー配列、リードコード、またはＰＣＲプライマー結合部位を含む。
さらなる実施形態では、ライゲーション鎖オリゴヌクレオチドは、アンカー配列、リードコード、及びＰＣＲプライマー結合部位を含む。
一部の実施形態では、ライゲーション鎖オリゴヌクレオチドは、１つ以上の連続した二重鎖のＤＮＡライブラリー分子をＰＣＲ増幅するための１つ以上のＰＣＲプライマー結合部位を含む。
特定の実施形態では、ライゲーション鎖オリゴヌクレオチドは、１つ以上のユニークリードコードを含む。
特定の実施形態では、ライゲーション鎖オリゴヌクレオチドは、試料多重化用の１つ以上の試料コードを含む。
あるいくつかの実施形態では、ライゲーション鎖オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡシークエンシング用の１つ以上の配列を含む。
さらなる実施形態では、ライゲーション鎖オリゴヌクレオチドは、アンカー配列を含む。
さらなる実施形態では、修復オリゴヌクレオチドは、アンカー配列、リードコード、またはＰＣＲプライマー結合部位を含む。
あるいくつかの実施形態では、修復オリゴヌクレオチドは、アンカー配列、リードコード、及びＰＣＲプライマー結合部位を含む。
特定の実施形態では、修復オリゴヌクレオチドは、１つ以上の連続した二重鎖のＤＮＡライブラリー分子をＰＣＲ増幅するための１つ以上のプライマー結合部位を含む。
一部の実施形態では、修復オリゴヌクレオチドは、１つ以上のユニークリードコードを含む。
あるいくつかの実施形態では、修復オリゴヌクレオチドは、試料多重化用の１つ以上の試料コードを含む。
特定の実施形態では、修復オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡシークエンシング用の１つ以上の配列を含む。
さらなる実施形態では、ライゲーション鎖オリゴヌクレオチドは、修復オリゴヌクレオチドに対し相補的である。
特定の実施形態では、ライゲーション鎖オリゴヌクレオチドのアンカー配列は、修復オリゴヌクレオチドのアンカー配列に対し相補的である。
さらなる実施形態では、ライゲーション鎖オリゴヌクレオチドのＰＣＲプライマー結合部位は、修復オリゴヌクレオチドのＰＣＲプライマー結合部位に対し相補的である。
特定の実施形態では、１つ以上のアダプターは、複数のライゲーション鎖オリゴヌクレオチド種を含む。
一部の実施形態では、１つ以上のアダプターは、複数の修復オリゴヌクレオチド種を含む。
特定の実施形態では、ライゲーション鎖オリゴヌクレオチドのプライマー結合部位は、修復オリゴヌクレオチドのプライマー結合部位に対し相補的ではない。
あるいくつかの実施形態では、ライゲーション鎖オリゴヌクレオチドのプライマー結合部位は、修復オリゴヌクレオチドのプライマー結合部位とは実質的に異なる。
あるいくつかの実施形態では、ライゲーション鎖オリゴヌクレオチドのプライマー結合部位に結合するプライマーは、修復オリゴヌクレオチドのプライマー結合部位に実質的に結合しない。
特定の実施形態では、ＤＮＡライブラリーを増幅してＤＮＡクローンライブラリーを生成する。
さらなる実施形態では、ｑＰＣＲをＤＮＡクローンライブラリー上で実施し、ｑＰＣＲ測定値を既知のゲノム当量の標準物質と比較して、ＤＮＡクローンライブラリーのゲノム当量を決定する。
特定の実施形態では、ｑＰＣＲを、Ａｌｕ配列に結合するプライマー及びアダプター内の配列に結合するプライマーを用いて実施する。
一部の実施形態では、定量的遺伝子解析を、ＤＮＡクローンライブラリーにおける複数の遺伝子座上で実施する。
特定の実施形態では、定量的遺伝子解析を、複数のＤＮＡクローンライブラリーにおける複数の遺伝子座上で実施する。
特定の実施形態では、定量的遺伝子解析は、１つ以上のキャプチャープローブをターゲット遺伝子座とハイブリダイズして、キャプチャープローブモジュール−ＤＮＡクローン複合体を形成することを含む。
あるいくつかの実施形態では、定量的遺伝子解析は、キャプチャープローブ−ＤＮＡクローン複合体を単離することを含む。
さらなる実施形態では、定量的遺伝子解析は、単離したキャプチャープローブ−ＤＮＡクローン複合体内のＤＮＡクローン配列を増幅することを含む。
特定の実施形態では、定量的遺伝子解析は、複数のシークエンシングリードを生成するためのＤＮＡシークエンシングを含む。
さらなる実施形態では、当該方法は、複数のシークエンシングリードのバイオインフォマティクス解析をさらに含む。
特定の実施形態では、定量的遺伝子解析はＤＮＡクローンライブラリーにおける複数の遺伝子座上で実施し、バイオインフォマティクス解析は、ＤＮＡクローンライブラリーにおいて解析されるゲノム当量数の定量化；ターゲット遺伝子座における遺伝子バリアントの検出；ターゲット遺伝子座における突然変異の検出；ターゲット遺伝子座における遺伝子融合の検出、及び／またはターゲット遺伝子座におけるコピー数変動測定のために使用する。
あるいくつかの実施形態では、定量的遺伝子解析を、遺伝子疾患の原因となるまたは遺伝子疾患に関連する、１つ以上の遺伝子病変を識別または検出するために使用する。
特定の実施形態では、遺伝子病変は、ヌクレオチドのトランジションもしくはトランスバージョン、ヌクレオチドの挿入もしくは欠失、ゲノム再編成、コピー数の変化、または遺伝子融合を含む。
あるいくつかの実施形態では、遺伝子疾患はがんである。
さらなる実施形態では、定量的遺伝子解析を、胎児ｃｆＤＮＡ内の１つ以上のターゲット遺伝子座における１つ以上の遺伝子バリアントまたは遺伝子病変を識別または検出するために使用する。
一部の実施形態では、キャプチャープローブは、任意選択によりハプテン標識パートナーオリゴヌクレオチドと共に二重鎖形成されたキャプチャープローブモジュールの構成成分であり、当該ハプテン標識パートナーオリゴヌクレオチドはキャプチャープローブモジュール内のテール配列とハイブリダイズする。
様々な実施形態では、対象における遺伝子疾患の予測、診断、またはモニターの方法であって、対象の生体試料からＤＮＡを単離または取得すること；ＤＮＡの末端リン酸残基を除去すること；脱リン酸化ＤＮＡを１種以上の末端修復酵素で処理して、末端修復ＤＮＡを生成すること；１つ以上の二重鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）プレアダプターを末端修復ＤＮＡの各鎖の３’末端に対しライゲーションして、プレアダプター／末端修復ＤＮＡ複合体を形成することであって、各ｄｓＤＮＡプレアダプターが、末端修復ＤＮＡの各鎖の３’末端にライゲーションされたライゲーション鎖オリゴヌクレオチドと非ライゲーションパートナー鎖オリゴヌクレオチドとを含む、ライゲーションすること；プレアダプター／末端修復ＤＮＡ複合体から非ライゲーションパートナー鎖オリゴヌクレオチドを離し、修復オリゴヌクレオチドで置き換えてアダプター／末端修復ＤＮＡ複合体を形成することであって、各アダプターがライゲーション鎖オリゴヌクレオチド及び修復オリゴヌクレオチドを含む、置き換えること；アダプター／末端修復ＤＮＡ複合体を１種以上の酵素で処理して、連続した二重鎖のＤＮＡライブラリーを形成すること；ＤＮＡライブラリーを増幅してＤＮＡクローンライブラリーを生成すること；ＤＮＡクローンライブラリーにおけるゲノム当量数を決定すること；ならびに、ＤＮＡクローンライブラリーにおける遺伝子疾患に関連する１つ以上のターゲット遺伝子座の定量的遺伝子解析を実施することを含み、１つ以上のターゲット遺伝子座における１つ以上の遺伝子病変の識別または検出が、遺伝子疾患の予後判定、診断、または進行のモニターである、方法が提供される。
あるいくつかの実施形態では、当該ＤＮＡは、ゲノムＤＮＡ、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）試料からのＤＮＡ、ｃＤＮＡ、またはｃｆＤＮＡである。
特定の実施形態では、ｃｆＤＮＡは、羊水、血液、血漿、血清、精液、リンパ液、脳脊髄液、眼球液、尿、唾液、便、粘液、及び汗の群から選択される生体試料から単離される。
さらなる実施形態では、遺伝子病変は、ヌクレオチドのトランジションもしくはトランスバージョン、ヌクレオチドの挿入もしくは欠失、ゲノム再編成、コピー数の変化、または遺伝子融合を含む。
特定の実施形態では、遺伝子疾患はがんである。
様々な実施形態では、遺伝子疾患のコンパニオン診断であって、対象の生体試料からＤＮＡを単離または取得すること；ＤＮＡの末端リン酸残基を除去すること；脱リン酸化ＤＮＡを１種以上の末端修復酵素で処理して、末端修復ＤＮＡを生成すること；１つ以上の二重鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）プレアダプターを末端修復ＤＮＡの各鎖の３’末端に対しライゲーションして、プレアダプター／末端修復ＤＮＡ複合体を形成することであって、各ｄｓＤＮＡプレアダプターが、末端修復ＤＮＡの各鎖の３’末端にライゲーションされたライゲーション鎖オリゴヌクレオチドと非ライゲーションパートナー鎖オリゴヌクレオチドとを含む、ライゲーションすること；プレアダプター／末端修復ＤＮＡ複合体から非ライゲーションパートナー鎖オリゴヌクレオチドを離し、修復オリゴヌクレオチドで置き換えてアダプター／末端修復ＤＮＡ複合体を形成することであって、各アダプターがライゲーション鎖オリゴヌクレオチド及び修復オリゴヌクレオチドを含む、置き換えること；アダプター／末端修復ＤＮＡ複合体を１種以上の酵素で処理して、連続した二重鎖のＤＮＡライブラリーを形成すること；ＤＮＡライブラリーを増幅してＤＮＡクローンライブラリーを生成すること；ＤＮＡクローンライブラリーにおけるゲノム当量数を決定すること；ならびに、ＤＮＡクローンライブラリーにおける遺伝子疾患に関連する１つ以上のバイオマーカーの定量的遺伝子解析を実施することであって、１つ以上のバイオマーカーのうちの少なくとも１つの検出または検出失敗が、対象に遺伝子疾患の治療をすべきかどうかを指示するものである、実施すること、を含むコンパニオン診断が提供される。
さらなる実施形態では、当該ＤＮＡは、ゲノムＤＮＡ、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）試料からのＤＮＡ、ｃＤＮＡ、またはｃｆＤＮＡである。
特定の実施形態では、ｃｆＤＮＡは、羊水、血液、血漿、血清、精液、リンパ液、脳脊髄液、眼球液、尿、唾液、便、粘液、及び汗からなる群から選択される生体試料から単離される。
特定の実施形態では、バイオマーカーは遺伝子病変である。
さらなる実施形態では、遺伝子病変は、ヌクレオチドのトランジションもしくはトランスバージョン、ヌクレオチドの挿入もしくは欠失、ゲノム再編成、コピー数の変化、または遺伝子融合を含む。
あるいくつかの実施形態では、遺伝子疾患はがんである。
特定の実施形態では、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
１つ以上のＤＮＡ断片に対するアダプターライゲーションの効率を高める方法であって、
（ａ）１つ以上のＤＮＡ断片の末端リン酸残基を除去すること；
（ｂ）前記脱リン酸化ＤＮＡ断片を１種以上の末端修復酵素で処理して、末端修復ＤＮＡを生成すること；
（ｃ）１つ以上の二重鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）プレアダプターを前記末端修復ＤＮＡの各鎖の３’末端に対しライゲーションして、プレアダプター／末端修復ＤＮＡ複合体を形成することであって、各ｄｓＤＮＡプレアダプターが、前記末端修復ＤＮＡの各鎖の３’末端にライゲーションされたライゲーション鎖オリゴヌクレオチドと、非ライゲーションパートナー鎖オリゴヌクレオチドとを含む、前記ライゲーションすること；
（ｄ）前記プレアダプター／末端修復ＤＮＡ複合体から前記非ライゲーションパートナー鎖オリゴヌクレオチドを離し、修復オリゴヌクレオチドで置き換えてアダプター／末端修復ＤＮＡ複合体を形成することであって、各アダプターが前記ライゲーション鎖オリゴヌクレオチド及び前記修復オリゴヌクレオチドを含む、前記置き換えること；ならびに
（ｅ）前記アダプター／末端修復ＤＮＡ複合体を１種以上の酵素で処理して、連続した二重鎖のＤＮＡライブラリーを形成すること；
を含み、
アダプターライゲーションの効率が、脱リン酸化アダプター分子がリン酸化ＤＮＡ断片に対しライゲーションされる方法よりも高められる、前記方法。
（項目２）
ＤＮＡライブラリーを構築する方法であって、
（ａ）１つ以上のＤＮＡ断片の末端リン酸残基を除去すること；
（ｂ）前記脱リン酸化ＤＮＡ断片を１種以上の末端修復酵素で処理して、末端修復ＤＮＡを生成すること；
（ｃ）１つ以上の二重鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）プレアダプターを前記末端修復ＤＮＡの各鎖の３’末端に対しライゲーションして、プレアダプター／末端修復ＤＮＡ複合体を形成することであって、各ｄｓＤＮＡプレアダプターが、前記末端修復ＤＮＡの各鎖の３’末端にライゲーションされたライゲーション鎖オリゴヌクレオチドと、非ライゲーションパートナー鎖オリゴヌクレオチドとを含む、前記ライゲーションすること；
（ｄ）前記プレアダプター／末端修復ＤＮＡ複合体から前記非ライゲーションパートナー鎖オリゴヌクレオチドを離し、修復オリゴヌクレオチドで置き換えてアダプター／末端修復ＤＮＡ複合体を形成することであって、各アダプターが前記ライゲーション鎖オリゴヌクレオチド及び前記修復オリゴヌクレオチドを含む、前記置き換えること；ならびに
（ｅ）前記アダプター／末端修復ＤＮＡ複合体を１種以上の酵素で処理して、連続した二重鎖のＤＮＡライブラリーを形成すること；
を含む、前記方法。
（項目３）
前記非ライゲーションパートナー鎖オリゴヌクレオチドが、３’末端において、前記末端修復ＤＮＡの５’末端に対するライゲーション及び／またはアダプターダイマー形成を防止する修飾を含む、項目１または項目２に記載の方法。
（項目４）
前記１つ以上のＤＮＡ断片の供与源が、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）、相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、及びセルフリーＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）からなる群から選択されるＤＮＡである、項目１〜３のいずれか１項に記載の方法。
（項目５）
前記ＤＮＡの供与源が、血液、皮膚、毛髪、毛包、唾液、口腔粘液、腟粘液、汗、涙、上皮組織、尿、精液、精漿、前立腺液、射精前液（カウパー腺液）、排泄物、生検、腹水、脳脊髄液、リンパ液、及び組織抽出物試料または生検試料からなる群から選択される生体試料である、項目４に記載の方法。
（項目６）
前記ＤＮＡの供与源が、羊水、血液、血漿、血清、精液、リンパ液、脳脊髄液、眼球液、尿、唾液、便、粘液、及び汗からなる群から選択される生体試料である、項目４に記載の方法。
（項目７）
対象の生体試料から前記ＤＮＡを単離することをさらに含む、項目５または項目６に記載の方法。
（項目８）
対象の生体試料から前記ＤＮＡを断片化することをさらに含む、項目５または項目６に記載の方法。
（項目９）
ステップ（ｃ）の前に前記１つ以上のＤＮＡ断片の損傷を修復することをさらに含む、先行項目のいずれか１項に記載の方法。
（項目１０）
前記損傷が、脱アミノ化シトシン（ウラシル）、脱塩基部位、グアニンのＯ ６ ＭｅＧへのメチル化、ＤＮＡニック、ギャップ、またはチミンダイマーである、項目９に記載の方法。
（項目１１）
ｃｆＤＮＡライブラリーを構築する方法であって、
（ａ）対象の生体試料からｃｆＤＮＡを単離または取得すること；
（ａ）前記ｃｆＤＮＡの末端リン酸残基を除去すること；
（ｂ）前記脱リン酸化ｃｆＤＮＡを１種以上の末端修復酵素で処理して、末端修復ｃｆＤＮＡを生成し、任意選択によりＤＮＡ損傷を修復すること；
（ｃ）１つ以上の二重鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）プレアダプターを前記末端修復ｃｆＤＮＡの各鎖の３’末端に対しライゲーションして、プレアダプター／末端修復ｃｆＤＮＡ複合体を形成することであって、各ｄｓＤＮＡプレアダプターが、前記末端修復ｃｆＤＮＡの各鎖の３’末端にライゲーションされたライゲーション鎖オリゴヌクレオチドと非ライゲーションパートナー鎖オリゴヌクレオチドとを含む、前記ライゲーションすること；
（ｄ）前記プレアダプター／末端修復ｃｆＤＮＡ複合体から前記非ライゲーションパートナー鎖オリゴヌクレオチドを離し、修復オリゴヌクレオチドで置き換えてアダプター／末端修復ｃｆＤＮＡ複合体を形成することであって、各アダプターが前記ライゲーション鎖オリゴヌクレオチド及び前記修復オリゴヌクレオチドを含む、前記置き換えること；
（ｅ）前記アダプター／末端修復ｃｆＤＮＡ複合体を１種以上の酵素で処理して、連続した二重鎖のｃｆＤＮＡライブラリーを形成すること；ならびに
（ｆ）前記ｃｆＤＮＡライブラリーを増幅して、セルフリーＤＮＡクローンライブラリーを生成すること；
を含む、前記方法。
（項目１２）
前記ライゲーション鎖オリゴヌクレオチドがアダプターダイマー形成を防止する１つ以上の修飾を含み、任意選択により、前記非ライゲーションパートナー鎖オリゴヌクレオチドの３’末端の修飾がアダプターダイマー形成を防止する、先行項目のいずれか１項に記載の方法。
（項目１３）
前記ライゲーション鎖オリゴヌクレオチドが、アンカー配列、リードコード、またはＰＣＲプライマー結合部位を含む、先行項目のいずれか１項に記載の方法。
（項目１４）
前記ライゲーション鎖オリゴヌクレオチドが、アンカー配列、リードコード、及びＰＣＲプライマー結合部位を含む、先行項目のいずれか１項に記載の方法。
（項目１５）
前記ライゲーション鎖オリゴヌクレオチドが、１つ以上の連続した二重鎖のＤＮＡライブラリー分子をＰＣＲ増幅するための１つ以上のＰＣＲプライマー結合部位を含む、先行項目のいずれか１項に記載の方法。
（項目１６）
前記ライゲーション鎖オリゴヌクレオチドが、１つ以上のユニークリードコードを含む、先行項目のいずれか１項に記載の方法。
（項目１７）
前記ライゲーション鎖オリゴヌクレオチドが、試料多重化のための１つ以上の試料コードを含む、先行項目のいずれか１項に記載の方法。
（項目１８）
前記ライゲーション鎖オリゴヌクレオチドが、ＤＮＡシークエンシングのための１つ以上の配列を含む、先行項目のいずれか１項に記載の方法。
（項目１９）
前記ライゲーション鎖オリゴヌクレオチドが、アンカー配列を含む、先行項目のいずれか１項に記載の方法。
（項目２０）
前記修復オリゴヌクレオチドが、アンカー配列、リードコード、またはＰＣＲプライマー結合部位を含む、先行項目のいずれか１項に記載の方法。
（項目２１）
前記修復オリゴヌクレオチドが、アンカー配列、リードコード、及びＰＣＲプライマー結合部位を含む、先行項目のいずれか１項に記載の方法。
（項目２２）
前記修復オリゴヌクレオチドが、１つ以上の連続した二重鎖のＤＮＡライブラリー分子をＰＣＲ増幅するための１つ以上のプライマー結合部位を含む、先行項目のいずれか１項に記載の方法。
（項目２３）
前記修復オリゴヌクレオチドが、１つ以上のユニークリードコードを含む、先行項目のいずれか１項に記載の方法。
（項目２４）
前記修復オリゴヌクレオチドが、試料多重化のための１つ以上の試料コードを含む、先行項目のいずれか１項に記載の方法。
（項目２５）
前記修復オリゴヌクレオチドが、ＤＮＡシークエンシングのための１つ以上の配列を含む、先行項目のいずれか１項に記載の方法。
（項目２６）
前記ライゲーション鎖オリゴヌクレオチドが、前記修復オリゴヌクレオチドに対し相補的である、先行項目のいずれか１項に記載の方法。
（項目２７）
前記ライゲーション鎖オリゴヌクレオチドの前記アンカー配列が、前記修復オリゴヌクレオチドの前記アンカー配列に対し相補的である、先行項目のいずれか１項に記載の方法。
（項目２８）
前記ライゲーション鎖オリゴヌクレオチドの前記ＰＣＲプライマー結合部位が、前記修復オリゴヌクレオチドの前記ＰＣＲプライマー結合部位に対し相補的である、先行項目のいずれか１項に記載の方法。
（項目２９）
前記１つ以上のアダプターが、複数のライゲーション鎖オリゴヌクレオチド種を含む、先行項目のいずれか１項に記載の方法。
（項目３０）
前記１つ以上のアダプターが、複数の修復オリゴヌクレオチド種を含む、先行項目のいずれか１項に記載の方法。
（項目３１）
前記ライゲーション鎖オリゴヌクレオチドの前記プライマー結合部位が、前記修復オリゴヌクレオチドの前記プライマー結合部位に対し相補的ではない、項目１〜２６のいずれか１項に記載の方法。
（項目３２）
前記ライゲーション鎖オリゴヌクレオチドの前記プライマー結合部位が、前記修復オリゴヌクレオチドの前記プライマー結合部位とは実質的に異なる、項目３１に記載の方法。
（項目３３）
前記ライゲーション鎖オリゴヌクレオチドの前記プライマー結合部位に結合するプライマーが、前記修復オリゴヌクレオチドの前記プライマー結合部位に実質的に結合しない、項目３１に記載の方法。
（項目３４）
前記ＤＮＡライブラリーを増幅してＤＮＡクローンライブラリーを生成する、先行項目のいずれか１項に記載の方法。
（項目３５）
ｑＰＣＲを前記ＤＮＡクローンライブラリー上で実施し、ｑＰＣＲ測定値を既知のゲノム当量の標準物質と比較して、前記ＤＮＡクローンライブラリーのゲノム当量を決定する、項目１〜３４のいずれか１項に記載の方法。
（項目３６）
前記ｑＰＣＲを、Ａｌｕ配列に結合するプライマー及びアダプター内の配列に結合するプライマーを用いて実施する、項目３４に記載の方法。
（項目３７）
定量的遺伝子解析を、前記ＤＮＡクローンライブラリーにおける複数の遺伝子座上で実施する、先行項目のいずれか１項に記載の方法。
（項目３８）
定量的遺伝子解析を、複数のＤＮＡクローンライブラリーにおける複数の遺伝子座上で実施する、先行項目のいずれか１項に記載の方法。
（項目３９）
定量的遺伝子解析が、１つ以上のキャプチャープローブをターゲット遺伝子座とハイブリダイズして、キャプチャープローブモジュール−ＤＮＡクローン複合体を形成することを含む、先行項目のいずれか１項に記載の方法。
（項目４０）
定量的遺伝子解析が、前記キャプチャープローブ−ＤＮＡクローン複合体を単離することを含む、項目３９に記載の方法。
（項目４１）
前記定量的遺伝子解析が、前記単離したキャプチャープローブ−ＤＮＡクローン複合体内のＤＮＡクローン配列を増幅することを含む、項目４９に記載の方法。
（項目４２）
定量的遺伝子解析が、複数のシークエンシングリードを生成するためのＤＮＡシークエンシングを含む、先行項目のいずれか１項に記載の方法。
（項目４３）
前記複数のシークエンシングリードのバイオインフォマティクス解析をさらに含む、項目４２に記載の方法。
（項目４４）
定量的遺伝子解析を、前記ＤＮＡクローンライブラリーにおける複数の遺伝子座上で実施し、バイオインフォマティクス解析を、以下の目的：
（ａ）前記ＤＮＡクローンライブラリー内で解析されるゲノム当量数の定量化；
（ｂ）ターゲット遺伝子座における遺伝子バリアントの検出；
（ｃ）ターゲット遺伝子座の中の突然変異の検出；
（ｄ）ターゲット遺伝子座の中の遺伝子融合の検出；及び／または
（ｅ）ターゲット遺伝子座の中のコピー数変動の測定；
で使用する、先行項目のいずれか１項に記載の方法。
（項目４５）
前記定量的遺伝子解析を、遺伝子疾患の原因となるまたは遺伝子疾患に関連する、１つ以上の遺伝子病変を識別または検出するために使用する、項目４４に記載の方法。
（項目４６）
前記遺伝子病変が、ヌクレオチドのトランジションもしくはトランスバージョン、ヌクレオチドの挿入もしくは欠失、ゲノム再編成、コピー数の変化、または遺伝子融合を含む、項目４５に記載の方法。
（項目４７）
前記遺伝子疾患ががんである、項目４５に記載の方法。
（項目４８）
前記定量的遺伝子解析を、胎児ｃｆＤＮＡ内の１つ以上のターゲット遺伝子座における１つ以上の遺伝子バリアントまたは遺伝子病変を識別または検出するために使用する、項目４４に記載の方法。
（項目４９）
前記キャプチャープローブが、任意選択によりハプテン標識パートナーオリゴヌクレオチドと共に二重鎖形成されたキャプチャープローブモジュールの構成成分であり、前記ハプテン標識パートナーオリゴヌクレオチドが前記キャプチャープローブモジュール内のテール配列とハイブリダイズする、項目３８〜４８のいずれか１項に記載の方法。
（項目５０）
対象における遺伝子疾患の予測、診断、またはモニターの方法であって、
（ａ）対象の生体試料からＤＮＡを単離または取得すること；
（ｂ）前記ＤＮＡの末端リン酸残基を除去すること；
（ｃ）前記脱リン酸化ＤＮＡを１種以上の末端修復酵素で処理して、末端修復ＤＮＡを生成すること；
（ｄ）１つ以上の二重鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）プレアダプターを前記末端修復ＤＮＡの各鎖の３’末端に対しライゲーションして、プレアダプター／末端修復ＤＮＡ複合体を形成することであって、各ｄｓＤＮＡプレアダプターが、前記末端修復ＤＮＡの各鎖の３’末端にライゲーションされたライゲーション鎖オリゴヌクレオチドと、非ライゲーションパートナー鎖オリゴヌクレオチドとを含む、前記ライゲーションすること；
（ｅ）前記プレアダプター／末端修復ＤＮＡ複合体から前記非ライゲーションパートナー鎖オリゴヌクレオチドを離し、修復オリゴヌクレオチドで置き換えてアダプター／末端修復ＤＮＡ複合体を形成することであって、各アダプターが前記ライゲーション鎖オリゴヌクレオチド及び前記修復オリゴヌクレオチドを含む、前記置き換えること；
（ｆ）前記アダプター／末端修復ＤＮＡ複合体を１種以上の酵素で処理して、連続した二重鎖のＤＮＡライブラリーを形成すること；
（ｇ）前記ＤＮＡライブラリーを増幅してＤＮＡクローンライブラリーを生成すること；
（ｈ）前記ＤＮＡクローンライブラリーにおけるゲノム当量数を決定すること；ならびに
（ｉ）前記ＤＮＡクローンライブラリーにおける前記遺伝子疾患に関連する１つ以上のターゲット遺伝子座の定量的遺伝子解析を実施することであって、前記１つ以上のターゲット遺伝子座における１つ以上の遺伝子病変の識別または検出が、前記遺伝子疾患の予後判定、診断、または進行のモニターである、前記実施すること；
を含む、前記方法。
（項目５１）
前記ＤＮＡが、ゲノムＤＮＡ、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）試料からのＤＮＡ、ｃＤＮＡ、またはｃｆＤＮＡである、項目５０に記載の方法。
（項目５２）
前記ｃｆＤＮＡが、羊水、血液、血漿、血清、精液、リンパ液、脳脊髄液、眼球液、尿、唾液、便、粘液、及び汗の群から選択される生体試料から単離される、項目５１に記載の方法。
（項目５３）
前記遺伝子病変が、ヌクレオチドのトランジションもしくはトランスバージョン、ヌクレオチドの挿入もしくは欠失、ゲノム再編成、コピー数の変化、または遺伝子融合を含む、項目５１に記載の方法。
（項目５４）
前記遺伝子疾患ががんである、項目５０に記載の方法。
（項目５５）
遺伝子疾患のコンパニオン診断であって、
（ａ）対象の生体試料からＤＮＡを単離または取得すること；
（ｂ）前記ＤＮＡの末端リン酸残基を除去すること；
（ｃ）前記脱リン酸化ＤＮＡを１種以上の末端修復酵素で処理して、末端修復ＤＮＡを生成すること；
（ｄ）１つ以上の二重鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）プレアダプターを前記末端修復ＤＮＡの各鎖の３’末端に対しライゲーションして、プレアダプター／末端修復ＤＮＡ複合体を形成することであって、各ｄｓＤＮＡプレアダプターが、前記末端修復ＤＮＡの各鎖の３’末端にライゲーションされたライゲーション鎖オリゴヌクレオチドと、非ライゲーションパートナー鎖オリゴヌクレオチドとを含む、前記ライゲーションすること；
（ｅ）前記プレアダプター／末端修復ＤＮＡ複合体から前記非ライゲーションパートナー鎖オリゴヌクレオチドを離し、修復オリゴヌクレオチドで置き換えてアダプター／末端修復ＤＮＡ複合体を形成することであって、各アダプターが前記ライゲーション鎖オリゴヌクレオチド及び前記修復オリゴヌクレオチドを含む、前記置き換えること；
（ｆ）前記アダプター／末端修復ＤＮＡ複合体を１種以上の酵素で処理して、連続した二重鎖のＤＮＡライブラリーを形成すること；
（ｇ）前記ＤＮＡライブラリーを増幅してＤＮＡクローンライブラリーを生成すること；
（ｈ）前記ＤＮＡクローンライブラリーにおけるゲノム当量数を決定すること；ならびに
（ｉ）前記ＤＮＡクローンライブラリーにおける遺伝子疾患に関連する１つ以上のバイオマーカーの定量的遺伝子解析を実施することであって、前記１つ以上のバイオマーカーのうちの少なくとも１つの検出または検出失敗が、前記対象に前記遺伝子疾患の治療をすべきかどうかを指示するものである、前記実施すること；
を含む、前記コンパニオン診断。
（項目５６）
前記ＤＮＡが、ゲノムＤＮＡ、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）試料からのＤＮＡ、ｃＤＮＡ、またはｃｆＤＮＡである、項目５５に記載の方法。
（項目５７）
前記ｃｆＤＮＡが、羊水、血液、血漿、血清、精液、リンパ液、脳脊髄液、眼球液、尿、唾液、便、粘液、及び汗からなる群から選択される生体試料から単離される、項目５６に記載の方法。
（項目５８）
前記バイオマーカーが遺伝子病変である、項目５５に記載の方法。
（項目５９）
前記遺伝子病変が、ヌクレオチドのトランジションもしくはトランスバージョン、ヌクレオチドの挿入もしくは欠失、ゲノム再編成、コピー数の変化、または遺伝子融合を含む、項目５８に記載の方法。
（項目６０）
前記遺伝子疾患ががんである、項目５５に記載の方法。
従来のライゲーション技術及び高効率（ＨＥ）ライゲーション技術を対比して示す図である。（Ａ）ターゲットＤＮＡ断片を５’リン酸化してから非リン酸化二重鎖アダプターとのＤＮＡライゲーションを行う。（Ｂ）従来のライゲーション手法による共通の非効率性は、５’ターゲットＤＮＡ断片の末端がリン酸基を欠いており、非リン酸化二重鎖アダプターとライゲーションすることができないことである。（Ｃ）ターゲットＤＮＡ断片の相互のライゲーション。（Ｄ）必要とされる５’リン酸基を含む二重鎖アダプターをターゲットＤＮＡ断片の３’末端にライゲーションする。アダプターのパートナー鎖オリゴヌクレオチドにおける綾目の入った丸は、３’ブロッキング基を表す。（Ｅ）３’ブロッキング基は、アダプターが互いにライゲーションすることも防止する。（Ｆ）時折生じる５’リン酸基を欠いたアダプター二重鎖は、ターゲット断片にライゲーションすることができない。 ＲｓａＩに消化された脱リン酸化ｐＵＣ１９プラスミドによる一連の９つの異なるＨＥアダプターに対する完全なライゲーションが行われた、アガロースゲルの代表的な画像を示している。ライゲーションしていない断片は、７４０、５００、３００、及び１５０ｂｐ（上から下に）の分子量（ＭＷ）マーカーの隣にある対照レーンに示されている。３つのベクター断片（矢印）の完全な移動シフトは、アダプターが９つ全てのアダプターにわたる両方の末端に完全にライゲーションしたことを示している。これらの結果は、ＨＥライゲーション技術が一般化可能であることを示すものである。 ＨＥライゲーション構築物を完成する例示的な方法を示す図である。（Ａ）ＨＥライゲーション産物は、断片の３’末端に接着した３’伸長アダプターオリゴヌクレオチドである。（Ｂ）初期のライゲーション産物を「修復」する戦略の１つは、修復オリゴヌクレオチド（上の鎖、緑色）を加えることであり、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼはターゲット断片の５’末端にリン酸（Ｐ）を付加することができ、そしてＴａｑ ＤＮＡリガーゼのようなニック封止リガーゼを使用して、修復オリゴヌクレオチドをターゲット断片にライゲーションすることができる。（Ｃ）代替的戦略は、相補的アダプターオリゴヌクレオチド、５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼ（例えば、ＢｓｔＩ ＤＮＡポリメラーゼ）、及びＴａｑ ＤＮＡリガーゼを組み合わせることである。ＢｓｔＩ ＤＮＡポリメラーゼは、ターゲット断片から５’塩基を除去することにより修復オリゴヌクレオチドを伸長して、Ｔａｑ ＤＮＡリガーゼによるニック封止ライゲーションを可能にする５’リン酸を露出させる。（Ｄ）相補的アダプターオリゴヌクレオチドは、ＢｓｔＩ ＤＮＡポリメラーゼを用いて、追加的な配列の特徴を元のＨＥライゲーション鎖に導入するように設計することもできる。 ＨＥライゲーション技術を用いたＤＮＡライブラリーの調製を示す図である。（Ａ）ＤＮＡ断片は、リン酸基（Ｐ）を所持する場合も所持しない場合もある異種の「タグ付き」末端を所持することができる。ホスファターゼによるＤＮＡ断片の処理により、露出した５’及び３’リン酸が除去される。次にＤＮＡを酵素で処理し、脱アミノ化シトシン（Ｕ）、脱塩基部位（↑）、及びチミンダイマーなどのＤＮＡ損傷を修復し、５’または３’オーバーハングを磨いてブラントエンドにすることができる。（Ｂ）アダプターを２つのステップでＤＮＡ断片に付加する。第１に、５’リン酸化ライゲーション鎖及び３’ブロック化パートナー鎖を含む二重鎖アダプターをターゲット断片にライゲーションする。約３０℃の融解温度を有するパートナー鎖は、≧３７℃の温度で生じる後続のステップで除去される。第２に、修復オリゴヌクレオチドをアダプターライゲーション断片にアニールする。修復オリゴヌクレオチドは、キナーゼ／リガーゼ戦略またはポリメラーゼ／エキソヌクレアーゼ／リガーゼ戦略を用いて、ターゲット断片の５’末端に共有結合的に接着する（図３）。初期のライゲーション鎖のプライマー伸長により修復オリゴ情報が複製され、下流解析に好適な全長アダプター二重鎖になる。 二重のＰＣＲプライマーを適合させたＤＮＡ断片を生成するためのＨＥライゲーション技術戦略を示す図である。このスキームでは、ライゲーション鎖は、独立したプライマー結合部位として働く追加的な配列（プライマー２）を保有する。修復オリゴヌクレオチドは、ライゲーション鎖の一部に対し相補的である一方で、第２のＰＣＲプライマー結合部位として働く（プライマー１）独自の異なる配列を有する。十分に完成したアダプターにより、より従来的、汎用的な二重プライマーＰＣＲ法を用いたＤＮＡ検体断片の増幅が可能になる。
Ａ．概要
本発明は、その一部として、定量的遺伝子解析の分野における、このような下流解析用ＤＮＡ断片をクローニングする改良された効率の高い方法への深刻な必要性に対処するための、組成物及び方法を企図している。
現状のＤＮＡ解析方法は、専用のアダプターをＤＮＡ断片にライゲーションすることを含む（図１）。従来の技術では、ＤＮＡライゲーションの前にターゲットＤＮＡ断片を５’リン酸化して、非リン酸化二重鎖アダプターとの共有結合的ライゲーションができるようにする。ターゲットＤＮＡ断片及びアダプターは、ブラントエンドであり得るか、または相補的オーバーハング（例えば、Ｔ／Ａ）を共有し得る（図１Ａ）。これは重篤な欠陥である。なぜなら、全てのターゲットＤＮＡ断片の両端をリン酸化することを保証できず、非リン酸化末端のライゲーションが不可能となり、これらのターゲット断片が後続のライブラリーから失われるからである（図１Ｂ）。非限定的な例として、ターゲットＤＮＡ断片末端の７０％が５’リン酸を所持する場合、断片の両端にライゲーションされ得るのは、最大で断片の４９％（０．７ｘ０．７ｘ１００％）に過ぎないと考えられるが、クローニングには両端へのライゲーションが必要である。さらに、ターゲットＤＮＡ断片上に５’リン酸が存在することで、ＤＮＡ断片が互いにライゲーションする恐れのある、ばらばらになった望ましくないアーティファクトが促進される（図１Ｃ）。これにより、疾患特有の染色体再編の検出と混同する可能性のある、人為的な染色体配列融合事象がもたらされる。
様々な実施形態では、本発明は、その一部として、効率的にアダプター配列をターゲットＤＮＡ断片に接着するための組成物及び方法を企図している。特定の実施形態では、ターゲットＤＮＡ断片の５’及び３’末端両方からリン酸が除去される。次に、この脱リン酸化断片を、ＤＮＡのブラントエンドを創出する酵素と、任意選択により、ＤＮＡが受けた可能性のある多数のタイプのＤＮＡ損傷（例えば、脱アミノ化シトシン（ウラシル）、脱塩基部位、グアニンのＯ６ＭｅＧへのメチル化、ニック、二重鎖切断、またはチミンダイマー）を修復する酵素と、を用いて処理する。アダプターは、非ライゲーションパートナー鎖オリゴヌクレオチドと共に二重鎖形成されたライゲーション鎖オリゴヌクレオチドを含む。アダプターのライゲーション鎖は、ターゲットＤＮＡ断片に対するライゲーションに必要となる５’リン酸基を保有し、パートナー鎖は３’ブロッキング基を含む（図１Ｄ）。３’ブロッキング基は、アダプター：アダプターダイマーの形成を防止する（図１Ｅ）。ＤＮＡ断片と同様、全てのアダプター配列が５’リン酸を所持することになるわけではない（溶媒に曝露された末端のリン酸結合は、本来化学的に不安定である）。このような非リン酸化アダプターが存在することにはなるが、これらは一時的にライゲーション機構に関与するに過ぎず（図１Ｆ）、このようなアダプターと断片との非生産的ペアリングは急速に分離し、生産的な共有結合的接着をもたらし得るアダプター：ターゲットＤＮＡ断片ペアリングに置き換えられる。最終的には、約１００％のターゲットＤＮＡ断片の両端がアダプター分子と接着する。これは、本明細書で企図するＤＮＡライブラリー構築用の組成物及び方法の高効率性を説明するものである。
様々な実施形態では、本明細書で企図するＤＮＡライブラリーの高効率構築のための組成物及び方法は、様々な生物供与源から入手可能なＤＮＡを用いて分子遺伝子解析に対処する、新規の包括的フレームワークを提供する。精製されたＤＮＡのクローニングで、タグ付きのＤＮＡ配列が導入される。これは、下流解析に情報を与え、また得られたクローンライブラリーの増幅を可能にする。ターゲット特異的オリゴヌクレオチドによるハイブリッドキャプチャーが、後続の解析用の特定配列を捕捉するために使用される。ライブラリー内に存在するゲノム数の単独測定が各試料に適用される。これらのアッセイにより、アッセイの感度を推定するための手段が提供される。本明細書で企図するアッセイは、遺伝子の様相、状態、または疾患における解析、検出、診断、またはモニターのための、信頼性が高く再生可能でありロバストな方法を提供する。
反対のことが明示されない限り、本発明における特定の実施形態の実施には、化学、生化学、有機化学、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ技術、遺伝学、免疫学、及び細胞生物学における当業者の技能範囲内の従来的な方法が用いられることになり、これらの多くを、例示の目的で後に説明する。このような技術は、文献で十分に説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，２００１）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９８９）；Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９８２）；Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，ｕｐｄａｔｅｄ Ｊｕｌｙ ２００８）；Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｒｏｍ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ；Ｇｌｏｖｅｒ，ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ｖｏｌ．Ｉ ＆ ＩＩ（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９８５）；Ａｎａｎｄ，Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｃｏｍｐｌｅｘ Ｇｅｎｏｍｅｓ，（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９２）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｈａｍｅｓ ＆ Ｓ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｅｄｓ．，１９８４）；Ｐｅｒｂａｌ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）；及びＨａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９９８）を参照。
Ｂ．定義
別途定義されない限り、本明細書で使用する技術的用語及び科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されている意味と同じ意味を有する。本発明の実施または試験の際に、本明細書に記載の方法及び材料に類似したまたは同等の、任意の方法及び材料を使用することは可能であるが、好ましい実施形態の組成物、方法、及び材料について説明する。本発明の目的のために、以下の用語は下記のように定義する。
冠詞「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、本明細書では、冠詞の文法的対象の１つまたは複数（すなわち、少なくとも１つ）を指すように使用している。例として、「要素」は、１つの要素または複数の要素を意味する。
選択肢（例えば、「または」）の使用は、選択肢のうちの１つ、両方、またはその任意の組合せのいずれかを意味するものと理解されたい。
「及び／または」という用語は、選択肢のうちの１つまたは両方のいずれかを意味するものと理解されたい。
本明細書で使用する「約」または「およそ」という用語は、参照の数量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量、または長さに対し、１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、または１％の分変動する数量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量、または長さを指す。一実施形態では、「約」または「およそ」という用語は、参照の数量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量、または長さについて、±１５％、±１０％、±９％、±８％、±７％、±６％、±５％、±４％、±３％、±２％、または±１％の数量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量、または長さの範囲を指す。
本明細書全体において、文脈上他の意味が要求されない限り、「ｃｏｍｐｒｉｓｅ（含む）」、「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ（含む）」、及び「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ（含む）」という語は、述べられるステップまたは要素またはステップもしくは要素の群を含むことを意味し、ただし任意の他のステップまたは要素またはステップもしくは要素の群を除外することを意味するものではないことを理解されたい。特定の実施形態では、「ｉｎｃｌｕｄｅ（含む）」、「有する」、「含有する」、及び「ｃｏｍｐｒｉｓｅ（含む）」は同義語として使用される。
「〜からなる」は、「〜からなる」というフレーズの後に来る任意のものを含み、かつそれに限定することを意味する。したがって、「〜からなる」というフレーズは、挙げられる要素が必要または必須であり、かつ他の要素は存在しない場合があることを示す。
「本質的に〜からなる」は、このフレーズの後に挙げられる任意の要素を含み、他の要素については、挙げられる要素の開示内容で指定された活性または作用を妨げず、寄与もしない要素に限定することを意味する。したがって、「本質的に〜からなる」というフレーズは、挙げられる要素は必要または必須であるが、他の要素については任意選択ではなく、挙げられる要素の活性または作用に影響を及ぼすかどうかに応じて、他の要素が存在する場合もあれば存在しない場合もあることを示す。
本明細書全体における「ｏｎｅ ｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔ（一実施形態）」、「ａｎ ｅｎｂｏｄｉｍｅｎｔ（一実施形態）」、「特定の実施形態」、「あるいくつかの実施形態」、「追加的な実施形態」、もしくは「さらなる実施形態」、またはこれらの組合せに対する言及は、実施形態に関連して記載されている特定の特徴、構造、または特色が本発明の少なくとも１つの実施形態に含まれていることを意味する。したがって、本明細書全体の様々な箇所で出現する上記フレーズが、必ずしも全て同じ実施形態を言及しているわけではない。さらに、特定の特徴、構造、または特色は、１つ以上の実施形態における任意の好適な方法で組み合わせることができる。
本明細書で使用する「単離した」という用語は、天然の状態において通常は付随する構成要素を実質的または本質的に含まない材料を意味する。特定の実施形態では、「取得した」または「導き出した」という用語は、「単離した」の同義語として使用される。
本明細書で使用する「ＤＮＡ」という用語は、デオキシリボ核酸を指す。様々な実施形態では、ＤＮＡという用語は、ゲノムＤＮＡ、組換えＤＮＡ、合成ＤＮＡ、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、またはセルフリーＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）を指す。一実施形態では、ＤＮＡはゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡを指す。一実施形態では、ＤＮＡはｃＤＮＡを指す。特定の実施形態では、当該ＤＮＡは、「ターゲット領域」を含むＤＮＡ断片であり、あるいくつかの実施形態ではターゲット領域はターゲットＤＮＡ断片とも呼ばれる。本明細書で企図するＤＮＡライブラリーには、ゲノムＤＮＡライブラリー、ｃｆＤＮＡライブラリー、及びＲＮＡから構築するｃＤＮＡライブラリー（例えば、ＲＮＡ発現ライブラリー）が含まれる。様々な実施形態では、ＤＮＡライブラリーは１つ以上の追加的なＤＮＡ配列及び／またはタグを含む。
「ターゲット遺伝子座」または「ＤＮＡターゲット領域」とは、ＤＮＡ配列内の対象となる領域を指す。様々な実施形態では、ターゲット遺伝子座に対しターゲット遺伝子解析を実施する。特定の実施形態では、ＤＮＡターゲット領域は、特定の遺伝子様相、遺伝子状態、遺伝子疾患、胎児試験、遺伝子モザイク、父子鑑定、薬物治療に対する応答の予測、医学的状態の診断またはモニター、マイクロバイオームプロファイリング、病原体スクリーニング、または臓器移植モニタリングに関連する遺伝子の領域である
本明細書で使用する「循環ＤＮＡ」、「循環セルフリーＤＮＡ」、及び「セルフリーＤＮＡ」という用語は、しばしば互換的に使用され、細胞外ＤＮＡであるＤＮＡ、細胞から押し出されたＤＮＡ、またはネクローシス性細胞もしくはアポトーシス性細胞から放出されたＤＮＡを指す。
本明細書で使用する「対象」、「個体」、または「患者」には、本明細書で企図する組成物により検出または識別され得る状態の症状を示す任意の動物が含まれる。好適な対象としては、実験動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、またはモルモット）、家畜（例えば、ウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ）、飼育動物、すなわちペット（例えば、ネコまたはイヌ）が挙げられる。特定の実施形態では、対象は哺乳類である。あるいくつかの実施形態では、対象は非ヒト霊長類であり、好ましい実施形態では、対象はヒトである。
「反応容器」とは、本明細書で企図する反応のうちの１つを実行するのに好適な容器を意味する。特定の実施形態での使用に好適な反応容器の例示的な例としては、以下に限定するものではないが、試験管、マイクロチューブ（例えば、ＰＣＲチューブ）、マイクロタイタープレート（例えば、９６ウェルプレート、３８４ウェルプレート、１５３６ウェルプレート）、スライド、プレート、アレイ、及びマイクロアレイが挙げられる。
Ｃ．ＤＮＡライブラリーの高効率構築
特定の実施形態では、本明細書で企図するＤＮＡライブラリーの構築方法は、ターゲットＤＮＡ断片に対するアダプターの高効率ライゲーションを含む。
（ａ）ＤＮＡ供与源
本明細書で企図する方法及び組成物は、ＤＮＡをアナライトに使用して、遺伝子様相、遺伝子状態、遺伝子疾患、遺伝子モザイク、胎児診断、父子鑑定、マイクロバイオームプロファイリング、病原体スクリーニング、及び臓器移植モニタリングを、効率的に解析、検出、診断、及び／またはモニターするように設計されている。本明細書で企図する組成物及び方法での使用に好適なＤＮＡは、当業者に既知の任意の供与源に由来することができる。特定の実施形態では、当該ＤＮＡは、任意の供与源から単離されたゲノムＤＮＡ、ＲＮＡから合成されたコピーＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、またはセルフリーＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）である。
一部の実施形態では、当該ＤＮＡは、高分子量ＤＮＡ（＞１０００ｂｐ）である。本明細書で企図する組成物及び方法における高分子量ＤＮＡの使用は、断片化ステップを含む場合が多い。高分子量ＤＮＡは、約２５〜約７５０塩基対、約２５〜約５００塩基対、約２５〜約２５０塩基対、約２５〜約２００塩基対、約２５〜約１５０塩基対、約２５〜約１００塩基対、約２５〜約５０塩基対、約１００〜約２００塩基対、約１５０〜約１８０塩基対、約１５０塩基対、約１５５塩基対、約１６０塩基対、約１６５塩基対、約１７０塩基対、約１７５塩基対、または約１８０塩基対に断片化され得る。
本明細書で企図する組成物及び方法における特定の実施形態での使用に好適な、ＤＮＡ断片化の例示的な方法としては、以下に限定するものではないが、剪断、超音波処理、酵素消化（制限消化を含む）、さらに他の方法も挙げられる。特定の実施形態では、当技術分野で公知の任意のＤＮＡ断片化方法を本発明と共に用いることができる。
本明細書で企図する組成物及び方法における特定の実施形態での使用に好適な、ゲノムＤＮＡ及び（ｃＤＮＡ生成用の）ＲＮＡの例示的な供与源としては、以下に限定するものではないが、脳組織、骨組織、眼組織、嗅覚組織、筋肉組織、心臓組織、肺組織、肝組織、膵組織、腎組織、胃組織、腸組織、結腸組織、血液、皮膚、毛髪、毛包、唾液、口腔粘液、腟粘液、汗、涙、上皮組織、尿、精液、精漿、前立腺液、射精前液（カウパー腺液）、排泄物、生検、腹水、脳脊髄液、リンパ液、及び組織抽出物試料または生検試料などからなる群から選択される生体試料が挙げられる。
特定の実施形態では、当該ＤＮＡはｃｆＤＮＡである。ｃｆＤＮＡのサイズ分布は、約１５０ｂｐ〜約１８０ｂｐ断片の範囲である。断片化は、エンドヌクレアーゼ及び／またはエキソヌクレアーゼ活性の結果であり得るものであり、この断片化により、正確で信頼性の高いロバストなｃｆＤＮＡ解析に対する困難な課題が提示される。ｃｆＤＮＡ解析に関するもう１つの課題は、血流における半減期が約１５分程度と短いことである。いかなる特定の理論にも拘泥されることは望まないが、本発明は、その一部として、ｃｆＤＮＡの解析が「リキッドバイオプシー」に類似するものであり、現在の生体プロセスのリアルタイムスナップショットであることを企図している。
一部の実施形態では、血漿画分から単離したｃｆＤＮＡは、収集プロトコル中に溶解する有核血球から遊離した長い（＞１０キロ塩基対）高分子量ゲノムＤＮＡにより、実質的に混入され得る。この長い混入ＤＮＡは、断片化されないままであれば、十分にクローニング及び増幅しないため、下流ライブラリー調製中に失われる。しかし、特定の実施形態では、ＤＮＡ断片化がない場合、本明細書で企図する高効率ＤＮＡライブラリー構築法は、ＤＮＡ検体に存在する断片サイズの集合から、より短い（＜１０００ｂｐ）断片を選択的にクローニングする。いかなる特定の理論にも拘泥されることは望まないが、長い断片と短い断片とのブレンドであるＤＮＡ検体から短いｃｆＤＮＡ断片を選択的にクローニングすることは、リキッドバイオプシーの構築に有利である。
特定の実施形態においてｃｆＤＮＡを単離するための好適な供与源となる生体試料の例示的な例としては、以下に限定するものではないが、羊水、血液、血漿、血清、精液、リンパ液、脳脊髄液、眼球液、尿、唾液、便、粘液、及び汗が挙げられる。
特定の実施形態では、生体試料は血液または血漿である。
あるいくつかの実施形態では、ＤＮＡ試料は、包埋組織（例えば、ＦＦＰＥまたは穿刺吸引物）、存在するマイクロバイオーム配列を調べる目的でのスワブ、法医学的試料（例えば、毛髪、衣服、指紋など）、または低入力ＤＮＡ試料からのライブラリー構築に特に効率的な、本明細書で企図するライブラリー構築法を必要とする任意の他のＤＮＡ供与源に由来し得る。
あるいくつかの実施形態では、市販されているキット及び当業者に知られた他の方法を使用して、患者の生体試料から、または過去に取得し、任意選択により安定化させた生体試料（例えば、凍結及び／または酵素キレート剤（ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、または２価カチオンに特異的な他のキレート剤を含むが、これに限定されない）の添加による安定化）から、直接ｃｆＤＮＡを単離することができる。
（ｂ）インプットＤＮＡの脱リン酸化
特定の実施形態では、インプットＤＮＡ（例えばターゲットＤＮＡ断片）を、まず、末端のリン酸残基を除去する熱不安定性ホスファターゼで処理する。例えば、図４Ａを参照。
本明細書で企図する組成物及び方法における特定の実施形態での使用に好適な、熱不安定性ホスファターゼの例示的な例としては、以下に限定するものではないが、ＡＰｅｘ（商標）熱不安定性アルカリホスファターゼ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＮＴＰｈｏｓ（商標）熱不安定性ホスファターゼ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＨＫ（商標）熱不安定性ホスファターゼ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、及びエビ由来アルカリホスファターゼ（ＳＡＰ；ＮＥＢ）が挙げられる。
一実施形態では、熱不安定性ホスファターゼはＳＡＰである。
（ｃ）ターゲットＤＮＡ断片内のＤＮＡ損傷の回復
特定の実施形態では、インプットＤＮＡまたは脱リン酸化ＤＮＡに対し１種以上の酵素による処理も行い、ＤＮＡ損傷の一般的原因（例えば、シトシンのウラシルへの脱アミノ化、グアニンの酸化的付加、チミジンダイマー、脱塩基部位をもたらす塩基の喪失、二重鎖ＤＮＡの１本鎖におけるニックまたはギャップなど）を回復させる。例えば、図４Ａを参照。
一実施形態では、ＤＮＡに対する内部損傷を、以下の酵素のうちの１種以上を含む組成物を用いて回復させる：Ｔａｑ ＤＮＡリガーゼ、エンドヌクレアーゼＩＶ、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｆｐｇ（８−オキソグアニンＤＮＡグリコシラーゼ）、ウラシル−ＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）、Ｔ４ ＰＤＧ（Ｔ４エンドヌクレアーゼＶ）、エンドヌクレアーゼＶＩＩＩ、及びＴ４ ＤＮＡポリメラーゼ。
一実施形態では、ＤＮＡに対する内部損傷を、Ｔａｑ ＤＮＡリガーゼ、エンドヌクレアーゼＩＶ、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｆｐｇ、ウラシル−ＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）、Ｔ４ ＰＤＧ（Ｔ４エンドヌクレアーゼＶ）、エンドヌクレアーゼＶＩＩＩ、及びＴ４ ＤＮＡポリメラーゼを含む組成物を用いて回復させる。
（ｄ）末端修復ＤＮＡの生成
特定の実施形態では、本明細書で企図する組成物及び方法は、末端修復ＤＮＡ断片を生成することを含む。あるいくつかの実施形態では、ＤＮＡ断片を末端修復して、ブラントエンド、５’−オーバーハング、または３’−オーバーハングを有する末端修復ＤＮＡ断片を生成する。例えば、図４Ａを参照。特定の実施形態では、当該ＤＮＡはｃｆＤＮＡである。
一部の実施形態では、末端修復ＤＮＡはブラントエンドを含有する。一部の実施形態では、末端修復ＤＮＡがブラントエンドを含有するように処理を行う。好ましい実施形態では、ＤＮＡ断片を１種以上の末端修復酵素で末端修復して、ブラントエンドを有する末端修復ＤＮＡ断片を生成する。
本明細書で企図する組成物及び方法の特定の実施形態における、ブランドエンドＤＮＡ断片の生成に好適な末端修復酵素の例示的な例としては、重合活性及び３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を保持するが、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性が欠如しているＤＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片など）が挙げられる。ＤＮＡポリメラーゼは、５’オーバーハングを満たすか、または３’オーバーハングを「チューバック」し、ブラントエンドを有するＤＮＡ断片のままにする。
一部の実施形態では、末端修復ＤＮＡのブラントエンドが単一塩基対オーバーハングを含有するように、さらに修飾する。一部の実施形態では、ブラントエンドを含む末端修復ＤＮＡがアデニン（Ａ）／チミン（Ｔ）オーバーハングを含有するようにさらに処理してもよい。一部の実施形態では、ブラントエンドを含む末端修復ＤＮＡが、単一塩基対オーバーハングとしてアデニン（Ａ）／チミン（Ｔ）オーバーハングを含有するように、さらに処理してもよい。一部の実施形態では、末端修復ＤＮＡは非鋳型化３’オーバーハングを有する。一部の実施形態では、末端修復ＤＮＡが３’オーバーハングを含有するように処理を行う。一部の実施形態では、末端修復ＤＮＡが３’オーバーハングを含有するように末端トランスフェラーゼ（ＴｄＴ）で処理を行う。一部の実施形態では、ＴｄＴによりＧテールを付加してもよい。一部の実施形態では、末端修復ＤＮＡがオーバーハング末端を含有するように、任意の公知の制限酵素（例えば、Ｓａｕ３Ａ酵素など）による部分的消化を用いて処理を行う。
（ｅ）末端修復ＤＮＡに対するプレアダプターのライゲーション
特定の実施形態では、本明細書で企図する組成物及び方法は、二重鎖ＤＮＡプレアダプターを末端修復ＤＮＡの各末端にライゲーションすることを含む。
本明細書で使用する「プレアダプター」という用語は、ライゲーション鎖オリゴヌクレオチド及びパートナー鎖オリゴヌクレオチドを含む二重鎖ＤＮＡ分子またはＤＮＡ二重鎖を指す。プレアダプターは、任意の好適なリガーゼを用いて末端修復ＤＮＡ断片にライゲーションすることができる。一実施形態では、当該リガーゼはＴ４ ＤＮＡリガーゼである。例えば、図４Ｂ及び５を参照。
「ライゲーション鎖オリゴヌクレオチド」とは、５’リン酸を含み、末端修復ＤＮＡ断片の各３’末端にライゲーション可能なポリヌクレオチドである。
「パートナー鎖オリゴヌクレオチド」は、ライゲーション鎖オリゴヌクレオチドのヌクレオチドの一部または全てに対し相補的であり、かつそれにアニーリングする。パートナー鎖オリゴヌクレオチドは自らの３’末端に修飾を含み、この修飾は、パートナー鎖オリゴヌクレオチドが他のアダプターまたはターゲットＤＮＡ断片のリン酸化５’末端にライゲーションすることを防止または実質的に阻害する。ライゲーションをブロックすることができる、パートナー鎖の３’末端における化学的修飾としては、以下に限定するものではないが、ジデオキシリボースヌクレオチド類似体、２−ヒドロキシデオキシリボースリボース類似体、及びリボース糖に対する広範にわたる化学的修飾が挙げられる。
プレアダプターで使用するライゲーション鎖オリゴヌクレオチドの配列設計及び内容について、いくつかの考慮事項を検討する。ライゲーション鎖オリゴヌクレオチドの長さは、ＤＮＡリガーゼの活性温度における安定なＤＮＡ二重鎖形成に必要な最小の長さ（約５ｎｔ）から、現状の合成能力の限界に及ぶオリゴヌクレオチド（＞２００ｎｔ）まで、様々であり得る。特定の実施形態では、ライゲーション鎖オリゴヌクレオチドは、約８〜約６０ヌクレオチドまたは約８〜約１５ヌクレオチドである。
ＤＮＡ断片のＮＧＳ解析に関するさらなる考慮事項として、ライゲーション鎖により組み込まれるＤＮＡ塩基は、シークエンシング装置がＤＮＡシークエンシング実行時全体にわたってＤＮＡ塩基コールを校正するのに使用される。装置及びこのような装置のソフトウェアは、シークエンシングする最初の８〜１５ヌクレオチドの長さにわたって各塩基位置に４つ全てのＤＮＡ塩基が存在することを必要とし、これにはライゲーションアダプター鎖に埋め込まれた塩基が含まれる場合が多い。このため、ライゲーション鎖配列の全体にわたって４つ全ての塩基を相互に所持する４つのライゲーション鎖のセットがしばしば使用される。このようなライゲーション鎖オリゴヌクレオチドの非限定的な例を表１及び２に示す。
様々な他の実施形態では、ライゲーション鎖オリゴヌクレオチドは、以下の要素を含む：（ｉ）単一プライマーライブラリー増幅用のＰＣＲプライマー結合部位；（ｉｉ）一意に識別される各シークエンシングリードに作用する５ヌクレオチドのリードコード；（ｉｉｉ）試料識別配列として作用し、シークエンシング実行中の試料多重化を可能にし、シークエンシングリードにおける適正な塩基コールの校正を可能にし、パートナー鎖オリゴヌクレオチドとのハイブリダイズ用のアンカーとして作用する、８〜１５ヌクレオチドのアンカー配列。
様々な他の実施形態では、ライゲーション鎖オリゴヌクレオチドは、試料識別配列として作用し、シークエンシング実行中の試料多重化を可能にし、シークエンシングリードにおける適正な塩基コールの校正を可能にし、パートナー鎖オリゴヌクレオチドとのハイブリダイズ用のアンカーとして作用する、８〜１５ヌクレオチドのアンカー配列を含む。
特定の実施形態では、ライゲーション鎖オリゴヌクレオチドは、１つ以上のＰＣＲプライマー配列、１つ以上のリードコード、１つ以上の試料コード、１つ以上のアンカー配列、または効率的なライゲーション基質である２つ以上の３’ヌクレオチドを含む。追加的な実施形態では、ライゲーション鎖オリゴヌクレオチドはさらに、１つ以上のシークエンシングプライマー結合部位を含む。
特定の実施形態では、ライゲーション鎖オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡライブラリー増幅用の１つ以上のＰＣＲプライマー結合配列を含む。一実施形態では、ＰＣＲプライマー結合配列は、約１２〜約４０ヌクレオチド、約１８〜約４０ヌクレオチド、約２０〜約３５ヌクレオチド、または約２０〜約３０ヌクレオチドである。別の実施形態では、ＰＣＲプライマー結合配列は、約１２ヌクレオチド、約１３ヌクレオチド、約１４ヌクレオチド、約１５ヌクレオチド、約１６ヌクレオチド、約１７ヌクレオチド、約１８ヌクレオチド、約１９ヌクレオチド、約２０ヌクレオチド、約２１ヌクレオチド、約２２ヌクレオチド、約２３ヌクレオチド、約２４ヌクレオチド、約２５ヌクレオチド、約２６ヌクレオチド、約２７ヌクレオチド、約２８ヌクレオチド、約２９ヌクレオチド、約３０ヌクレオチド、約３１ヌクレオチド、約３２ヌクレオチド、約３３ヌクレオチド、約３４ヌクレオチド、約３５ヌクレオチド、約３６ヌクレオチド、約３７ヌクレオチド、約３８ヌクレオチド、約３９ヌクレオチド、または約４０ヌクレオチド、またはそれ以上である。
一実施形態では、ＰＣＲプライマー結合配列は約２５ヌクレオチドである。
特定の実施形態では、ライゲーション鎖オリゴヌクレオチドは、１つ以上のリードコード配列を含む。本明細書で使用する「リードコード」という用語は、ユニークシークエンシングリードの識別に使用するポリヌクレオチドを指す。一実施形態では、リードコードはヌクレオチドのランダム配列である。一実施形態では、リードコードは、約１ヌクレオチド、約２ヌクレオチド、約３ヌクレオチド、約４ヌクレオチド、約５ヌクレオチド、約６ヌクレオチド、約７ヌクレオチド、約８ヌクレオチド、約９ヌクレオチド、約１０ヌクレオチド、またはそれ以上である。
非限定的な例として、５ヌクレオチドのリードコードは２５６の可能な一意の配列からなり、選ばれる各コードは、セット内の他の全てのコードとは２ヌクレオチド異なる。この特徴により、一意で別々のリードと、コード領域におけるシークエンシングエラーに起因して一意であるように見えるリードとを区別することが可能となる。特定の実施形態では、特定の配列の組合せに起因して実験上アダプター機能を妨害することが特定されているコードを使用から除外することができる。例えば２５６のうちの７コードはＧヌクレオチドの過剰出現があり、これらを除外した。
他の実施形態では、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上のヌクレオチドの各リードコードは、他の全てのリードコードに対し２、３、４、または５ヌクレオチド分異なり得る。
一実施形態では、リードコードは約５ヌクレオチドであり、任意選択により、他の全てのコードに対し２ヌクレオチド分異なる。
特定の実施形態では、ライゲーション鎖オリゴヌクレオチドは、１つ以上の試料コード配列を含む。本明細書で使用する「試料コード」という用語は、試料の識別に使用するポリヌクレオチドを指す。試料コードは、多重シークエンシング反応の確立にも有用である。なぜなら、各試料コードは試料に対し一意であることから、多重化シークエンシング反応中に特定の試料からリードを識別するために使用することができるからである。
一実施形態では、試料コードは、約１、約２ヌクレオチド、約３ヌクレオチド、約４ヌクレオチド、または約５ヌクレオチド、またはそれ以上である配列を含む。別の実施形態では、２、３、４、５、またはそれ以上のヌクレオチドの各試料コードは、他の全ての試料コードに対し２、３、４、または５ヌクレオチド分異なり得る。
一実施形態では、試料コードは約３ヌクレオチドであり、他の試料で使用される他の全てのコードに対し、２ヌクレオチド分異なる。
特定の実施形態では、ライゲーション鎖オリゴヌクレオチドは、１つ以上のアンカー配列を含む。本明細書で使用する「アンカー配列」とは、少なくとも８ヌクレオチド、少なくとも１０ヌクレオチド、少なくとも１２ヌクレオチド、少なくとも１４ヌクレオチド、または少なくとも１６ヌクレオチドを有し、パートナー鎖オリゴヌクレオチドとハイブリダイズし、以下の特性を含むヌクレオチド配列を指す：（１）各アンカー配列が、一括的に伸長中の各部位における４つの可能なＤＮＡ塩基の各々に相当する、４つのアンカー配列のファミリーの一部であること（このバランスの取れた塩基提示の特徴は、特定の実施形態においてシークエンシングリード内の適正な塩基コーリングを校正するのに有用である）；（２）各アンカー配列が同じ数のＡ＋Ｃ及びＧ＋Ｔから構成され、そのために各アンカー配列が、４つからなるセット内の他の全てのアンカー配列とおおよそ同じ融解温度及び二重鎖安定性を共有すること。一実施形態では、アンカー配列またはその一部は、試料を識別する働きをしたり、シークエンシング実行中の試料多重化を可能にしたり、シークエンシングリードにおける適正な塩基コールの校正を可能にしたり、パートナー鎖オリゴヌクレオチドに対するハイブリダイズ用のアンカーとして作用したりもする。
加えて、非ライゲーションパートナー鎖オリゴヌクレオチドの設計にはいくつかの考慮を伴う。パートナー鎖オリゴヌクレオチドは、リン酸化されたブラントエンドを形成する領域内のライゲーション鎖オリゴヌクレオチドに対し、少なくとも部分的に相補的（＞５ｎｔ）である。第二に、パートナー鎖オリゴヌクレオチドの３’末端を修飾して、オリゴヌクレオチドが（特に、自己ライゲーションされたアダプターダイマー形成で）ライゲーション基質になるのをブロックまたは実質的に阻害するようにする。パートナー鎖オリゴヌクレオチドは、ライゲーションを実施する温度（≦２２℃）で、ライゲーション鎖と共に安定した二重鎖を形成するように設計し、それと同時に、修復オリゴヌクレオチドをアダプターに組み込む温度（≧３７℃）では、ライゲーション鎖オリゴヌクレオチドから分離するように設計する。この設計考慮は、図４Ｂ及び５に示す、アダプター／末端修復ＤＮＡ複合体の生成において、反応がライゲーションから修復オリゴヌクレオチドが介在するアダプター完成ステップにシフトする際の、分離したパートナー鎖オリゴヌクレオチドとして表されている。
特定の実施形態では、本明細書で企図する組成物及び方法は、プレアダプターを末端修復ＤＮＡにライゲーションして「タグ付き」ＤＮＡライブラリーを生成するライゲーションステップを含む。一部の実施形態では、単一種のプレアダプターを用いる。一部の実施形態では、２種、３種、４種、または５種のプレアダプターを用いる。一部の実施形態では、同一配列のプレアダプターを、断片化した末端修復ＤＮＡの各末端にライゲーションする。
一実施形態では、複数種のプレアダプターを末端修復ＤＮＡライブラリーにライゲーションする。この複数種のプレアダプターのそれぞれは、１つ以上のＤＮＡライブラリー増幅用プライマー結合部位、１つ以上のリードコード配列、１つ以上の試料多重化用配列、１つ以上のアンカー配列、または１つ以上のＤＮＡシークエンシング用配列を含み得る。
（ｆ）アダプター／末端修復ＤＮＡ複合体の形成
特定の実施形態では、本明細書で企図する組成物及び方法は、プレアダプター／末端修復ＤＮＡ複合体からパートナー鎖オリゴヌクレオチドを離し、離したパートナー鎖オリゴヌクレオチドの代わりに修復オリゴヌクレオチドで置き換えてアダプター／末端修復ＤＮＡ複合体を生成することを含む。例えば、図３を参照。特定の実施形態では、アダプターの設計は、単一プライマーまたは二重プライマーの増幅戦略を可能にするように操作することができる。例えば、図４Ａ及び５を参照。
特定の実施形態では、本明細書で企図する組成物及び方法は、ライゲーション鎖オリゴヌクレオチド及び修復オリゴヌクレオチドを含むアダプターを末端修復ＤＮＡにライゲーションして「タグ付き」ＤＮＡライブラリーを生成するライゲーションステップを含む。一部の実施形態では、単一種のアダプターを用いる。一部の実施形態では、２種、３種、４種、または５種のアダプターを用いる。一部の実施形態では、同一配列のプレアダプターを、断片化した末端修復ＤＮＡの各末端にライゲーションする。
パートナー鎖オリゴヌクレオチドの設計考慮により、パートナー鎖オリゴヌクレオチドは、修復オリゴヌクレオチドがライゲーション鎖オリゴヌクレオチドにアニールする温度（例えば、＞３７℃）や、酵素ステップを行って修復オリゴヌクレオチドをアダプター／末端修復ＤＮＡ複合体に組み込み連続した二重鎖ＤＮＡライブラリーモジュールを生成する温度（例えば、＞３７℃）で、ライゲーション鎖オリゴヌクレオチドから分離するため、プレアダプター／末端修復ＤＮＡ複合体から離れることが可能となる。
本明細書で使用する「修復オリゴヌクレオチド」という用語は、ライゲーション鎖オリゴヌクレオチドのヌクレオチドの一部または全てに対し相補的であり、かつそれにアニーリングするポリヌクレオチド配列を指す。修復オリゴヌクレオチドの長さは、ＤＮＡリガーゼの活性温度における安定なＤＮＡ二重鎖形成に必要な最小の長さ（約８ｎｔ）から、現状の合成能力の限界に及ぶオリゴヌクレオチド（＞２００ｎｔ）まで、様々であり得る。特定の実施形態では、「修復オリゴヌクレオチド」は、ライゲーション鎖オリゴヌクレオチドには必ずしも存在するわけではない付加的な機能的ＤＮＡ配列を含む。
特定の実施形態では、ライゲーション鎖オリゴヌクレオチドは約８〜約１５ヌクレオチドであり、修復オリゴヌクレオチドは３５〜６０ヌクレオチドである。この設計では、リガンド鎖オリゴヌクレオチドの配列をプライマー伸長によって伸長し、修復オリゴヌクレオチドに対し相補的なヌクレオチド配列を生成する。この設計であれば、同一のＰＣＲプライマー結合部位がもたらされると考えられる。同一のＰＣＲプライマー結合部位は、単一プライマーライブラリー増幅戦略を可能にする。例えば、図３Ｄ及び４Ａを参照。
特定の実施形態では、ライゲーション鎖オリゴヌクレオチドは約３５〜約６０ヌクレオチドであり、修復オリゴヌクレオチドはライゲーション鎖オリゴヌクレオチドに対し完全に相補的である。同一のＰＣＲプライマー結合部位は、単一プライマーライブラリーの増幅戦略を可能にする。例えば、図４Ａを参照。
特定の実施形態では、ライゲーション鎖オリゴヌクレオチドは約３５〜約６０ヌクレオチドであり、修復オリゴヌクレオチドは約３５〜約６０ヌクレオチドであり、この２つのオリゴヌクレオチドはＰＣＲプライマー結合部位を除いて相補的である。相違するＰＣＲプライマー結合部位は、二重プライマーライブラリー増幅戦略を可能にする。例えば、図５を参照。
好ましい実施形態では、ライゲーション鎖オリゴヌクレオチドは、以下の要素を含む：（ｉ）単一プライマーライブラリー増幅用のＰＣＲプライマー結合部位；（ｉｉ）一意に識別される各シークエンシングリードに作用する５ヌクレオチドのリードコード；（ｉｉｉ）ライゲーション鎖オリゴヌクレオチドのアンカー配列に対し部分的にまたは完全に相補的な、８〜１５ヌクレオチドのアンカー配列。
他の実施形態では、ライゲーション鎖オリゴヌクレオチドは、ライゲーション鎖オリゴヌクレオチドのアンカー配列に対し部分的にまたは完全に相補的な、８〜１５ヌクレオチドのアンカー配列を含む。
特定の実施形態では、修復オリゴヌクレオチドは、１つ以上のＰＣＲプライマー配列、１つ以上のリードコード、１つ以上の試料コード、１つ以上のアンカー配列、または効率的なライゲーション基質である２つ以上の３’ヌクレオチドを含む。追加的な実施形態では、修復オリゴヌクレオチドはさらに、１つ以上のシークエンシングプライマー結合部位を含む。
特定の実施形態では、修復オリゴヌクレオチドは、（ｉ）ライゲーション鎖オリゴヌクレオチド内のＰＣＲプライマー結合部位に対し相補的な１つ以上のＰＣＲプライマー結合配列（単一プライマーＤＮＡライブラリー増幅を可能にする）、または（ｉｉ）ライゲーション鎖オリゴヌクレオチド内のＰＣＲプライマー結合部位に対し相補的ではない１つ以上のＰＣＲプライマー結合配列（二重プライマーＤＮＡライブラリー増幅を可能にする）を含む。一実施形態では、ＰＣＲプライマー結合配列は、約１２〜約４０ヌクレオチド、約１８〜約４０ヌクレオチド、約２０〜約３５ヌクレオチド、または約２０〜約３０ヌクレオチドである。別の実施形態では、ＰＣＲプライマー結合配列は、約１２ヌクレオチド、約１３ヌクレオチド、約１４ヌクレオチド、約１５ヌクレオチド、約１６ヌクレオチド、約１７ヌクレオチド、約１８ヌクレオチド、約１９ヌクレオチド、約２０ヌクレオチド、約２１ヌクレオチド、約２２ヌクレオチド、約２３ヌクレオチド、約２４ヌクレオチド、約２５ヌクレオチド、約２６ヌクレオチド、約２７ヌクレオチド、約２８ヌクレオチド、約２９ヌクレオチド、約３０ヌクレオチド、約３１ヌクレオチド、約３２ヌクレオチド、約３３ヌクレオチド、約３４ヌクレオチド、約３５ヌクレオチド、約３６ヌクレオチド、約３７ヌクレオチド、約３８ヌクレオチド、約３９ヌクレオチド、または約４０ヌクレオチド、またはそれ以上である。
一実施形態では、ＰＣＲプライマー結合配列は約２５ヌクレオチドである。
特定の実施形態では、修復オリゴヌクレオチドは、１つ以上のリードコード配列を含む。一実施形態では、リードコードはヌクレオチドのランダム配列である。一実施形態では、リードコードは、約１ヌクレオチド、約２ヌクレオチド、約３ヌクレオチド、約４ヌクレオチド、約５ヌクレオチド、約６ヌクレオチド、約７ヌクレオチド、約８ヌクレオチド、約９ヌクレオチド、約１０ヌクレオチド、またはそれ以上である。
非限定的な例として、５ヌクレオチドのリードコードは２５６の可能な一意の配列からなり、選ばれる各コードは、セット内の他の全てのコードとは２ヌクレオチド異なる。この特徴により、一意で別々のリードと、コード領域におけるシークエンシングエラーに起因して一意であるように見えるリードとを区別することが可能となる。特定の実施形態では、特定の配列の組合せに起因して実験上アダプター機能を妨害することが特定されているコードを使用から除外することができる。例えば２５６のうちの７コードはＧヌクレオチドの過剰出現があり、これらを除外した。
他の実施形態では、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上のヌクレオチドの各リードコードは、他の全てのリードコードに対し２、３、４、または５ヌクレオチド分異なり得る。
一実施形態では、リードコードは約５ヌクレオチドであり、任意選択により、他の全てのコードに対し２ヌクレオチド分異なる。
特定の実施形態では、修復オリゴヌクレオチドは、１つ以上の試料コード配列を含む。一実施形態では、試料コードは、約１、約２ヌクレオチド、約３ヌクレオチド、約４ヌクレオチド、または約５ヌクレオチド、またはそれ以上である配列を含む。別の実施形態では、２、３、４、５、またはそれ以上のヌクレオチドの各試料コードは、他の全ての試料コードに対し２、３、４、または５ヌクレオチド分異なり得る。
一実施形態では、試料コードは約３ヌクレオチドであり、他の試料で使用される他の全てのコードに対し、２ヌクレオチド分異なる。
特定の実施形態では、修復オリゴヌクレオチドは、ライゲーション鎖オリゴヌクレオチドの１つ以上のアンカー配列に対し相補的な１つ以上のアンカー配列を含む。
いかなる特定の理論にも拘泥されることは望まないが、修復オリゴヌクレオチドをアダプター／末端修復ＤＮＡ複合体に組み込むための少なくとも２つの代表的な戦略が企図されている。
一実施形態では、パートナー鎖オリゴヌクレオチドをプレアダプター／末端修復ＤＮＡ複合体から離し、修復オリゴヌクレオチドを付加しライゲーション鎖にアニールさせ、ポリヌクレオチドキナーゼ（例えば、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ）を使用して末端修復ＤＮＡ断片の５’末端にリン酸基を付加し、そしてＤＮＡリガーゼを使用して、修復オリゴヌクレオチドの５’末端と末端修復ＤＮＡ断片の３’末端との間に存在するニックを修復する。特定の実施形態では、ＤＮＡリガーゼは、広範囲の温度にわたり活性を有する熱安定性のニック特異的リガーゼであり、以下に限定するものではないが、Ｔａｑ ＤＮＡリガーゼ、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡリガーゼ、９°Ｎｏｒｔｈリガーゼ（ＮＥＢ）、及びリン酸化されたニックを塞ぐことができる他の任意のリガーゼがこれに含まれる。例えば、図３Ａ及び３Ｂを参照。
別の実施形態では、パートナー鎖オリゴヌクレオチドをプレアダプター／末端修復ＤＮＡ複合体から離し、修復オリゴヌクレオチドを付加しライゲーション鎖にアニールさせ、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する（そして内在的３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有しない）低処理能力ＤＮＡポリメラーゼによってライゲーション鎖オリゴヌクレオチドの３’末端を伸長させ、さらに５’→３’エキソヌクレアーゼ活性により、脱リン酸化された５’末端ヌクレオチド及び隣接するヌクレオチドを除去し、それによってライゲーション可能な５’リン酸基を露出し、酵素が分離する際にニックを残す組み込まれた塩基でこれらを置き換え、そしてＤＮＡリガーゼ（例えば、Ｔａｑ ＤＮＡリガーゼ）を使用してニックを修復する。
本明細書で企図する組成物及び方法の特定の実施形態における使用に好適な、低処理能力ＤＮＡポリメラーゼの例示的な例としては、以下に限定するものではないが、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ及びＢｓｔＩ ＤＮＡポリメラーゼが挙げられる。
Ｄ．ＤＮＡライブラリー増幅
特定の実施形態では、本明細書で企図する方法は、ＤＮＡクローンライブラリー、すなわちＤＮＡクローンのライブラリーを生成するためのＤＮＡライブラリーの増幅を含む。特定の実施形態では、当該ＤＮＡはｃｆＤＮＡである。ＤＮＡライブラリーの各分子は、末端修復ＤＮＡの各末端にライゲーションしたアダプターを含み、各アダプターは１つ以上のＰＣＲプライマー結合部位を含む。一実施形態では、異なるアダプターを末端修復ＤＮＡの異なる末端にライゲーションする。
一実施形態では、ＤＮＡの両方の末端に同じアダプターをライゲーションする。末端修復ＤＮＡの両方の末端に同じアダプターをライゲーションすることで、単一プライマー配列によるＰＣＲ増幅が可能になる。特定の実施形態では、アダプターをライゲーションしたＤＮＡライブラリーの一部を、単一プライマー配列駆動増幅による標準的なＰＣＲ手法を用いて増幅することになる。一実施形態では、単一プライマー配列は、約２５ヌクレオチドであり、任意選択により、標準的なイオン強度条件下で≧５５℃の推定Ｔｍを有する。
一実施形態では、末端修復ＤＮＡ断片の３’末端にライゲーションしたアダプターは、末端修復ＤＮＡ断片の５’末端にライゲーションしたアダプターとは異なるＰＣＲプライマー結合部位を含む。特定の実施形態では、アダプターをライゲーションしたＤＮＡライブラリーの一部を、２つのプライマー駆動増幅による標準的なＰＣＲ手法を用いて増幅することになる。
特定の実施形態では、ピコグラム単位の初期ＤＮＡライブラリーをマイクログラム単位のＤＮＡクローンに増幅、つまり１０，０００倍に増幅する。増幅産物の量は、当技術分野で公知の方法（例えば、Ｑｕｂｉｔ２．０またはＮａｎｏｄｒｏｐ装置での定量化）を用いて測定することができる。
Ｅ．ＤＮＡの遺伝子解析方法
様々な実施形態では、ＤＮＡの遺伝子解析方法が提供される。特定の実施形態では、当該ＤＮＡはｃｆＤＮＡである。ｃｆＤＮＡは、血漿または他の体液に見いだされるセルフリーＤＮＡである。
特定の実施形態では、ＤＮＡの遺伝子解析方法は、ＤＮＡライブラリーを生成及び増幅すること、ＤＮＡライブラリーにおけるゲノム当量数を決定すること、ならびに１つ以上のゲノムターゲット座位の定量的遺伝子解析を実施することを含む。
１．ゲノム当量数の決定
様々な実施形態では、ＤＮＡの遺伝子解析方法は、ＤＮＡクローンライブラリーにおけるゲノム当量数を決定することを含む。本明細書で使用する「ゲノム当量」という用語は、各ライブラリーにおけるゲノムコピー数を指す。本明細書で企図する組成物及び方法が遭遇する重要な課題は、遺伝子配列における希少な遺伝子突然変異または相違を検出し解析するのに十分なアッセイ感度を達成することである。試料ごとのアッセイ感度の値を決定するために、シークエンシングライブラリー内に存在するゲノム当量数を測定することにより、各試料内に存在する異なる別々の配列の数を測定する。感度を確立するため、ゲノム当量数は試料ライブラリーごとに測定しなければならない。
ゲノム当量数は、ｑＰＣＲアッセイにより、またはシークエンシング実施後のバイオインフォマティクスに基づくカウントにより決定することができる。臨床試料のプロセスフローでは、ゲノム当量のｑＰＣＲ測定は、ＤＮＡライブラリーのＱＣステップとして使用する。ｑＰＣＲにより、配列解析の前にアッセイ感度の期待値を確立させ、試料に対応するＤＮＡクローンライブラリーがゲノム当量の要求深度を欠く場合は、その試料を解析から除外することが可能になる。最終的には、バイオインフォマティクスに基づくゲノム当量カウントも使用してゲノム当量を特定する。そのため、それぞれの所与のＤＮＡクローンライブラリーに対するアッセイ感度及び偽陰性推定値も特定される。
実験的ｑＰＣＲアッセイ及び統計的カウントアッセイは十分に相互関係を有するべきである。シークエンシングによってＤＮＡクローンライブラリーにおける配列深度が明らかにならない場合は、ＤＮＡクローンライブラリーの再処理及び／または追加的なシークエンシングが必要となり得る。
一実施形態では、ＤＮＡクローンライブラリーにおけるゲノム当量は、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）アッセイを用いて決定する。特定の実施形態では、既知濃度の標準的なライブラリーを使用して標準曲線を構築し、この得られた標準曲線にｑＰＣＲアッセイの測定値を適合させ、適合度からゲノム当量の値を導き出す。反復に基づくアッセイにより測定されるゲノム当量数は、より一貫したライブラリー間パフォーマンスをもたらし、またゲノム当量のｑＰＣＲ推定値とシークエンシング実行時にバイオインフォマティクス的にカウントしたタグ当量との間のアラインメントをより良好なものにする。
本明細書で企図する反復に基づくゲノム当量アッセイでの使用に好適な、反復の例示的な例としては、以下に限定するものではないが、短散在型核内反復配列（ＳＩＮＥ）（例えば、Ａｌｕ反復）、長散在型反復配列（ＬＩＮＥ）（例えば、ＬＩＮＥ１、ＬＩＮＥ２、ＬＩＮＥ３）、マイクロサテライト反復配列（例えば、短いタンデム反復（ＳＴＲ）、単純反復配列（ＳＳＲ））、及び哺乳類散在型反復（ＭＩＲ）が挙げられる。
一実施形態では、当該反復はＡｌｕ反復である。
２．定量的遺伝子解析
様々な実施形態では、ＤＮＡの遺伝子解析方法は、ＤＮＡライブラリークローンにおける１つ以上のターゲット遺伝子座の定量的遺伝子解析を含む。定量的遺伝子解析は、以下のステップの１つ以上、または全てを含む：ターゲット遺伝子座を含むＤＮＡクローンのキャプチャー；キャプチャーしたターゲット遺伝子座の増幅；キャプチャーし増幅したターゲット遺伝子座のシークエンシング；及び得られたシークエンスリードのバイオインフォマティクス解析。
（ａ）ターゲット遺伝子座のキャプチャー
本発明は、その一部として、多機能であり、比較的大きいプローブの効率及び信頼性を保持するように設計され、ただしＤＮＡクローンライブラリーにおける情報価値のない配列の生成を最小限にとどめる、キャプチャープローブモジュールを企図している。「キャプチャープローブモジュール」とは、キャプチャープローブ配列及びテール配列を含むポリヌクレオチドを指す。特定の実施形態では、キャプチャープローブモジュール配列またはその一部は、１つ以上のシークエンシングプライマーのためのプライマー結合部位として働く。
特定の実施形態では、キャプチャープローブモジュールはキャプチャープローブを含む。本明細書で使用する「キャプチャープローブ」とは、特定のＤＮＡターゲット領域とハイブリダイズする領域を含むポリヌクレオチドを指す。ＤＮＡの平均サイズが比較的小さく、また高度に断片化しているため、本明細書で企図する組成物及び方法は、対象となるＤＮＡターゲット領域を調べるための高密度及び比較的短いキャプチャープローブの使用を含む。
特定の実施形態では、キャプチャープローブモジュールを、任意選択によりハプテンを含み、かつテール配列とハイブリダイズするパートナーオリゴヌクレオチドと組み合わせて、キャプチャープローブモジュール複合体を生成する。
高密度キャプチャープローブの使用に関する特定の懸念の１つは、概して、キャプチャープローブが明確な「配列規則」を用いて設計されていることである。例えば、冗長な配列の領域、または極端な塩基組成バイアスを示す領域は、概して、キャプチャープローブの設計では除外される。しかし、発明者らは、キャプチャープローブの設計規則が柔軟性に欠けることで、プローブの性能に対する実質的影響が生じるわけではないことを発見した。対照的に、位置的な制約により厳密に選ばれたキャプチャープローブは、的確な配列情報を提供し、的確でないマッピング不可能なリードキャプチャーはごくわずかしか示さず、少数の例外を除いて均一で有用で的確なリードをもたらす。その上、近接したプローブ間隔での高冗長性は、時として低性能となるキャプチャープローブを補って余りあるものである。
特定の実施形態では、１つのターゲット領域を複数のキャプチャープローブがターゲットとし、任意の２つ以上のキャプチャープローブは、当該ターゲット領域に対し、互いの１０ヌクレオチド以内、互いの１５ヌクレオチド以内、互いの２０ヌクレオチド以内、互いの２５ヌクレオチド以内、互いの３０ヌクレオチド以内、互いの３５ヌクレオチド以内、互いの４０ヌクレオチド以内、互いの４５ヌクレオチド以内、または互いの５０ヌクレオチド以内、またはそれ以上の数のヌクレオチド以内、さらにこれらの間にある全てのヌクレオチド長で結合するように設計する。
一実施形態では、キャプチャープローブは、約２５ヌクレオチド、約２６ヌクレオチド、約２７ヌクレオチド、約２８ヌクレオチド、約２９ヌクレオチド、約３０ヌクレオチド、約３１ヌクレオチド、約３２ヌクレオチド、約３３ヌクレオチド、約３４ヌクレオチド、約３５ヌクレオチド、約３６ヌクレオチド、約３７ヌクレオチド、約３８ヌクレオチド、約３９ヌクレオチド、約４０ヌクレオチド、約４１ヌクレオチド、約４２ヌクレオチド、約４３ヌクレオチド、約４４ヌクレオチド、または約４５ヌクレオチドである。
一実施形態では、キャプチャープローブは、約１００ヌクレオチド、約２００ヌクレオチド、約３００ヌクレオチド、約４００ヌクレオチド、または約１００ヌクレオチドである。別の実施形態では、キャプチャープローブは、約１００ヌクレオチド〜約５００ヌクレオチド、約２００ヌクレオチド〜約５００ヌクレオチド、約３００ヌクレオチド〜約５００ヌクレオチド、もしくは約４００ヌクレオチド〜約５００ヌクレオチド、またはこれらの間にある任意の範囲である。
特定の実施形態では、キャプチャープローブは６０ヌクレオチドである。
特定の実施形態では、キャプチャープローブは６０ヌクレオチドではない。
別の実施形態では、キャプチャープローブは、実質的に６０ヌクレオチドより小さいが、同じＤＮＡターゲット領域をターゲットとする６０ヌクレオチドのキャプチャープローブと同等に、同様に、またはより良好にハイブリダイズする。
あるいくつかの実施形態では、キャプチャープローブは４０ヌクレオチドである。
あるいくつかの実施形態では、キャプチャープローブモジュールはテール配列を含む。本明細書で使用する「テール配列」という用語は、キャプチャープローブモジュールの５’末端におけるポリヌクレオチドを指し、これは特定の実施形態においてプライマー結合部位として働き得る。特定の実施形態では、シークエンシングプライマーは、テール領域内のプライマー結合部位に結合する。
特定の実施形態では、テール配列は、約５〜約１００ヌクレオチド、約１０〜約１００ヌクレオチド、約５〜約７５ヌクレオチド、約５〜約５０ヌクレオチド、約５〜約２５ヌクレオチド、または約５〜約２０ヌクレオチドである。あるいくつかの実施形態では、第３の領域は、約１０〜約５０ヌクレオチド、約１５〜約４０ヌクレオチド、約２０〜約３０ヌクレオチド、もしくは約２０ヌクレオチド、または間にある任意の数のヌクレオチドである。
特定の実施形態では、テール配列は、約３０ヌクレオチド、約３１ヌクレオチド、約３２ヌクレオチド、約３３ヌクレオチド、約３４ヌクレオチド、約３５ヌクレオチド、約３６ヌクレオチド、約３７ヌクレオチド、約３８ヌクレオチド、約３９ヌクレオチド、または約４０ヌクレオチドである。
様々な実施形態では、キャプチャープローブモジュールは、キャプチャープローブとハイブリダイズするタグ付き及び／または増幅したＤＮＡライブラリーにおける１つ以上のキャプチャーした断片の単離及び／または精製を可能にする、特定のメンバーの結合ペアを含む。特定の実施形態では、キャプチャープローブモジュールは、ビオチンまたは他の好適なハプテン（例えば、ジニトロフェノール、ジゴキシゲニン）に結合する。
様々な実施形態では、キャプチャープローブモジュールを、タグ付きの、任意選択により増幅したＤＮＡライブラリーとハイブリダイズして、複合体を形成する。一部の実施形態では、多機能のキャプチャープローブモジュールは、ＤＮＡライブラリーにおける特定のゲノムターゲット領域と実質的にハイブリダイズする。
ハイブリダイズまたはハイブリダイズ条件には、２つのヌクレオチド配列が安定した複合体を形成する（例えば、タグ付きＤＮＡライブラリー及びキャプチャープローブモジュールが安定したタグ付きＤＮＡライブラリー−キャプチャープローブモジュール複合体を形成する）任意の反応条件が含まれ得る。このような反応条件は、当技術分野において周知であり、当業者であれば、このような条件は、例えばアニーリング温度を低くし長さの短いキャプチャープローブを用いるというように、必要に応じて、かつ本発明の範囲内で改変することができることを理解することになる。キャプチャープローブ複合体の第２の領域が、タグ付きＤＮＡライブラリーの領域に対し、１００％、９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％ ９１％、９０％、８９％、８８％、８５％、８０％、７５％、または７０％の配列同一性、相同性、または相補性を示す場合、実質的なハイブリダイズが起こり得る。
特定の実施形態では、キャプチャープローブは約４０ヌクレオチドであり、約４４℃〜約４７℃の最適アニーリング温度を有する。
あるいくつかの実施形態では、本明細書で企図する方法は、タグ付きＤＮＡライブラリー−キャプチャープローブモジュール複合体を単離することを含む。特定の実施形態では、ＤＮＡ複合体を単離する方法は当業者に周知であり、当業者が適切とみなす任意の方法を本発明の方法で用いることができる（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２００７−２０１２）。特定の実施形態では、ビオチン−ストレプトアビジン単離技術を用いて複合体を単離する。一部の実施形態では、多機能キャプチャープローブモジュールのテール配列とハイブリダイズ可能なキャプチャーパートナーオリゴヌクレオチドを修飾して、５’末端または３’末端にビオチンを含有するようにする。このビオチンは、ＤＮＡ複合体の単離方法で使用するカラム、ビーズ、または基質に連結させたストレプトアビジンと相互作用可能である。
一実施形態では、多機能キャプチャープローブモジュールのテール配列とハイブリダイズ可能なキャプチャーパートナーオリゴヌクレオチドを修飾して、３’末端にビオチンを含有するようにする。このビオチンは、ＤＮＡ複合体の単離方法で使用するカラム、ビーズ、または基質に連結させたストレプトアビジンと相互作用可能である。
特定の実施形態では、多機能キャプチャープローブモジュールのテール配列をキャプチャーパートナーオリゴヌクレオチドに結合する。一部の実施形態では、タグ付きＤＮＡライブラリー−多機能キャプチャープローブモジュール複合体を形成する前に、多機能キャプチャープローブモジュールをキャプチャーパートナーオリゴヌクレオチドに結合する。一部の実施形態では、タグ付きＤＮＡライブラリー−多機能キャプチャープローブモジュール複合体を形成した後に、多機能キャプチャープローブモジュールをキャプチャーパートナーオリゴヌクレオチドに結合する。一部の実施形態では、タグ付きＤＮＡライブラリー−多機能キャプチャープローブモジュール複合体を形成するのと同時に、多機能キャプチャープローブモジュールをキャプチャーパートナーオリゴヌクレオチドに結合する。一部の実施形態では、キャプチャーパートナーオリゴヌクレオチドを化学的に修飾する。一実施形態では、ハプテンを５’または３’末端に付加することによりキャプチャーパートナーオリゴヌクレオチドを修飾する。一実施形態では、当該ハプテンはビオチンである。
特定の実施形態では、単離したタグ付きＤＮＡライブラリー−キャプチャープローブモジュール複合体からの１本鎖の３’末端除去を企図している。あるいくつかの実施形態では、当該方法は、１本鎖の３’末端を除去するための、単離したタグ付きＤＮＡライブラリー−多機能キャプチャープローブモジュール複合体の３’−５’エキソヌクレアーゼ酵素処理を含む。
あるいくつかの他の実施形態では、当該方法は、単離したタグ付きＤＮＡライブラリー断片を鋳型として利用して多機能キャプチャープローブの５’−３’ＤＮＡポリメラーゼ伸長を実施することを含む。
あるいくつかの他の実施形態では、当該方法は、５’ＦＬＡＰエンドヌクレアーゼ、ＤＮＡ重合、及びＤＮＡリガーゼによるニック閉鎖の協調作用を通じて、ハイブリッドキャプチャープローブ−単離したタグ付きＤＮＡターゲット分子を創出することを含む。
単離したタグ付きＤＮＡライブラリー−多機能キャプチャープローブモジュール複合体の３’−５’エキソヌクレアーゼ酵素処理用に様々な酵素を用いることができる。３’−５’エキソヌクレアーゼ酵素活性を示し、特定の実施形態で使用することができる好適な酵素の例示的例としては、以下に限定するものではないが、Ｔ４またはエキソヌクレアーゼＩ、ＩＩＩ、Ｖが挙げられる（Ｓｈｅｖｅｌｅｖ ＩＶ，Ｈｕｂｓｃｈｅｒ Ｕ．，“Ｔｈｅ ３’ ５’ ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅｓ，”Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．３（５）：３６４−７６（２００２）も参照）。特定の実施形態では、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を備える酵素はＴ４である。特定の実施形態では、３’−５’エキソヌクレアーゼ酵素活性を示し、プライマー鋳型伸長が可能な酵素を使用することができ、これには、例えばＴ４またはエキソヌクレアーゼＩ、ＩＩＩ、Ｖ（同上）が含まれる。
一部の実施形態では、本明細書で企図する方法は、上記または本明細書の他の箇所で論じられている３’−５’エキソヌクレアーゼ酵素処理をした複合体に、シークエンシング及び／またはＰＣＲを実施することを含む。特定の実施形態では、ハイブリッド核酸分子を生成するために、キャプチャープローブ分子のテール部分を複製する。一実施形態では、生成したハイブリッド核酸分子は、キャプチャープローブモジュールとハイブリダイズ可能なターゲット領域と、キャプチャープローブモジュールテール配列の相補配列とを含む。
特定の実施形態では、遺伝子解析は、ａ）１つ以上のキャプチャープローブモジュールを複数のＤＮＡライブラリークローンにおける１つ以上のターゲット遺伝子座とハイブリダイズして、１つ以上のキャプチャープローブモジュール−ＤＮＡクローン複合体を形成すること；ｂ）ａ）からの１つ以上のキャプチャープローブモジュール−ＤＮＡライブラリークローン複合体を単離すること；ｃ）ステップｂ）からの１つ以上の単離したキャプチャープローブモジュール−ＤＮＡライブラリークローン複合体を酵素処理すること；ｄ）ｃ）からの酵素処理した複合体にＰＣＲを実施することであって、増幅したハイブリッド核酸分子を生成するためにキャプチャープローブ分子のテール部分を複製し、増幅したハイブリッド核酸分子が、キャプチャープローブとハイブリダイズ可能なターゲットゲノム座位内のターゲット配列と、キャプチャープローブモジュールテール配列の相補配列とを含む、実施すること；及びｅ）ｄ）からの増幅したハイブリッド核酸分子に定量的遺伝子解析を実施すること、を含む。
特定の実施形態では、特定のターゲット遺伝子座のコピー数を決定する方法が企図され、当該方法は、ａ）１つ以上のキャプチャープローブモジュールを複数のＤＮＡライブラリークローンにおける１つ以上のターゲット遺伝子座とハイブリダイズして、１つ以上のキャプチャープローブモジュール−ＤＮＡライブラリークローン複合体を形成すること；ｂ）ａ）からの１つ以上のキャプチャープローブモジュール−ＤＮＡライブラリークローン複合体を単離すること；ｃ）ステップｂ）からの１つ以上の単離したキャプチャープローブモジュール−ＤＮＡライブラリークローン複合体を酵素処理すること；ｄ）ｃ）からの酵素処理した複合体にＰＣＲを実施することであって、増幅したハイブリッド核酸分子を生成するためにキャプチャープローブ分子のテール部分を複製し、増幅したハイブリッド核酸分子が、キャプチャープローブとハイブリダイズ可能なターゲット遺伝子座内のターゲット配列と、キャプチャープローブモジュールテール配列の相補配列とを含む、実施すること；ｅ）ｄ）における増幅したハイブリッド核酸分子にＰＣＲ増幅を実施すること；及びｆ）ｅ）におけるＰＣＲ反応を定量化すること、を含み、当該定量化によって、特定のターゲット領域のコピー数を決定することができる。
一実施形態では、ステップｃ）の酵素処理は、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素を用いて、ｂ）からの１つ以上のキャプチャープローブモジュール−ＤＮＡライブラリークローン複合体に３’−５’エキソヌクレアーゼ酵素処理を実施して１本鎖の３’末端を除去すること；５’ＦＬＡＰエンドヌクレアーゼ、ＤＮＡ重合、及びＤＮＡリガーゼによるニック閉鎖の協調作用を通じて、１つ以上のハイブリッドキャプチャープローブモジュール−ＤＮＡライブラリークローン分子を創出すること；または、複合体内の単離したＤＮＡクローンを鋳型として用いてキャプチャープローブの５’−３’ＤＮＡポリメラーゼ伸長を実施すること、を含む。
一実施形態では、ステップｃ）の酵素処理は、複合体内の単離したＤＮＡクローンを鋳型として用いてキャプチャープローブの５’−３’ＤＮＡポリメラーゼ伸長を実施することを含む。
特定の実施形態では、当業者に周知である任意の標準的なＰＣＲ反応条件を用いてＰＣＲを実施することができる。あるいくつかの実施形態では、ｅ）におけるＰＣＲ反応は、２つのＰＣＲプライマーを用いる。一実施形態では、ｅ）におけるＰＣＲ反応は、ターゲット遺伝子座内の反復とハイブリダイズする第１のＰＣＲプライマーを用いる。特定の実施形態では、ｅ）におけるＰＣＲ反応は、ターゲット遺伝子座／テール接合部におけるハイブリッド核酸分子とハイブリダイズする第２のＰＣＲプライマーを用いる。あるいくつかの実施形態では、ｅ）におけるＰＣＲ反応は、ターゲット遺伝子座とハイブリダイズする第１のＰＣＲプライマーを用い、第２のＰＣＲプライマーはターゲット遺伝子座／テール接合部における増幅したハイブリッド核酸分子とハイブリダイズする。特定の実施形態では、第２のプライマーはターゲット遺伝子座／テール接合部とハイブリダイズして、プライマーの少なくとも１つ以上のヌクレオチドがターゲット遺伝子座とハイブリダイズし、プライマーの少なくとも１つ以上のヌクレオチドがテール配列とハイブリダイズする。
あるいくつかの実施形態では、ステップｅ）から取得する増幅したハイブリッド核酸分子をシークエンシングし、配列を水平方向にアラインメントする。すなわち、参照配列に対してではなく、互いに対しアラインメントする。特定の実施形態では、ａ）〜ｅ）のステップを１つ以上のキャプチャープローブモジュールで１回以上反復する。キャプチャープローブモジュールは同じであっても異なっていてもよく、ターゲット遺伝子座のいずれかのＤＮＡ鎖をターゲットとするように設計され得る。一部の実施形態では、キャプチャープローブが異なる場合、これらのキャプチャープローブは、タグ付きＤＮＡクローンライブラリーにおけるターゲット遺伝子座内のオーバーラップまたは隣接するターゲット配列でハイブリダイズする。一実施形態では、高密度キャプチャープローブ戦略を使用し、複数のキャプチャープローブはターゲット遺伝子座にハイブリダイズし、複数のキャプチャープローブのそれぞれは、タグ付きＤＮＡクローンライブラリーにおけるターゲット遺伝子座とハイブリダイズする任意の他のキャプチャープローブから約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、１００、２００ｂｐ以内（間にある全ての距離を含む）のターゲット遺伝子座とハイブリダイズする。
一部の実施形態では、当該方法は、ターゲット遺伝子座ごとに２つのキャプチャープローブモジュールを用いて実施することができ、この一方がターゲット領域の上流にある「ワトソン」鎖（非コード鎖または鋳型鎖）とハイブリダイズし、一方がターゲット領域の下流にある「クリック」鎖（コード鎖または非鋳型鎖）とハイブリダイズする。
特定の実施形態では、本明細書で企図する方法はさらに、ターゲット遺伝子座ごとに、任意の組合せでワトソン鎖またはクリック鎖とハイブリダイズする任意の数のキャプチャープローブモジュール、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０、またはそれ以上のキャプチャープローブモジュールを用いて、複数回実施することができる。一部の実施形態では、取得した配列は、複数の相違のいずれかを識別するために相互にアラインメントすることができる。
あるいくつかの実施形態では、複数のターゲット遺伝子座を、１つ以上のキャプチャープローブモジュールを用いた１回の反応で、例えば１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００、１００００、５００００、１０００００、５０００００またはそれ以上調べる。
（ｂ）シークエンシング
特定の実施形態では、定量的遺伝子解析は、本明細書の他の箇所、上記で論じているように複数のハイブリッド核酸分子をシークエンシングして、複数のユニークシークエンシングリードを取得するのに十分なシークエンシング深度を生成することを含む。ユニークリードは、いずれもがＤＮＡ内で同じリードコード及び配列開始点を共有するリードの「ファミリー」からの単一の共通リードとして定義される。各キャプチャープローブは、ファミリーに分類することにより全リードから計算的に抽出されるユニークリードのセットをもたらす。次に所与の試料におけるユニークリードを、プローブごとに観察される全てのユニークリードの平均値として計算する。明らかなコピー数の変化がある場合は、平均値の計算に使用するデータセットから除外する。ユニークリードは、それぞれがユニークＤＮＡクローンから導き出されなければならないため、重要である。それぞれのユニークリードは、ゲノムＤＮＡの半数体相当物の入力及び解析を表す。ユニークリードの和は、解析した半数体ゲノムの和である。そして解析したゲノムの数は、シークエンシングアッセイの感度を定義する。非限定的な例として、ユニークリードの平均カウントが１００ゲノム当量である場合、この特定のアッセイは１００のうちの１つの突然変異リード、すなわち１％を検出することができる感度を有する。これを下回るいかなる観察も防御可能ではない。
特定の実施形態では、定量的遺伝子解析は複数の試料に由来するハイブリッド核酸分子の多重シークエンシングを含む。
様々な実施形態では、定量的遺伝子解析は、それぞれが第１のＤＮＡ配列及び第２のＤＮＡ配列を含む、１つ以上または複数のタグ付きＤＮＡライブラリーのクローンを取得することであって、第１のＤＮＡ配列がターゲットとする遺伝子座内に配列を含み、第２のＤＮＡ配列がキャプチャープローブ配列を含む、取得すること；１つ以上のクローンに対し、ペアリングした末端のシークエンス反応を実施し１つ以上のシークエンシングリードを取得すること、または、１つ以上のクローンに対し、約１００、２００、３００、４００、５００またはそれ以上のヌクレオチドを上回る単一の長いシークエンシングリードを取得するシークエンシング反応を実施することであって、リードが第１のＤＮＡ配列及び第２のＤＮＡ配列の両方を識別するのに十分である、実施すること；ならびに、１つ以上のクローンのシークエンシングリードをシークエンシングリードのプローブ配列に従って序列化またはクラスター化すること、を含む。
（ｃ）バイオインフォマティクス解析
様々な実施形態では、定量的遺伝子解析はさらに、シークエンシングリードのバイオインフォマティクス解析を含む。バイオインフォマティクス解析により、シークエンシングのための組成物または方法が不在の場合に実施されるいかなる純粋な精神的解析も除外される。あるいくつかの実施形態では、バイオインフォマティクス解析には、以下に限定するものではないが、配列アラインメント、ゲノム当量解析、一塩基変異（ＳＮＶ）解析、遺伝子コピー数多型（ＣＮＶ）解析、及び遺伝子病変の検出が含まれる。特定の実施形態では、バイオインフォマティクス解析は、ＤＮＡクローンライブラリーにおいて解析するゲノム当量数の定量化、ターゲット遺伝子座における遺伝子様相の検出、ターゲット遺伝子座における遺伝子病変の検出、及びターゲット遺伝子座におけるコピー数変動の測定に有用である。
配列アラインメントは、配列リードと１つ以上のヒト参照ＤＮＡ配列との間で実施することができる。特定の実施形態では、シークエンシングアラインメントは、ターゲット遺伝子座における遺伝子病変の検出に使用することができ、遺伝子病変の検出には、以下に限定するものではないが、ヌクレオチドのトランジションもしくはトランスバージョン、ヌクレオチドの挿入もしくは欠失、ゲノム再編成、コピー数の変化、または遺伝子融合の検出が含まれる。原因または予後の指標である遺伝子病変の検出は、特定の遺伝子の状態または疾患に対する診断、予後判定、治療、及び／またはモニターに有用であり得る。
本明細書では、参照配列に対するアラインメントの必要なしに実施することができる配列アラインメント解析の方法も企図されており、本明細書ではこの方法を水平配列解析と呼ぶ。このような解析は、本明細書で企図する方法または他の任意の方法によって生成した任意の配列に対し実施することができる。特定の実施形態では、当該配列解析は、本明細書で企図する方法によって取得したリードに対し、配列アラインメントを実施することを含む。
一実施形態では、ＤＮＡクローンライブラリーにおけるゲノム当量は、シークエンシングの実施後にバイオインフォマティクスに基づくカウントを用いて決定する。各シークエンシングリードは特定のキャプチャープローブに関連づけられており、各キャプチャープローブに割り当てられたリードの集合を構文解析して群に分ける。群内における個々のリードのセットは、ゲノム配列内で同じリードコード及び同じＤＮＡ配列の開始位置を共有する。これらの個々のリードは「ファミリー」に分類され、このファミリーを代表する１つのコンセンサスを「ユニークリード」として進める。ファミリーを構成する個々のリードの全ては、１つのライゲーション事象から導き出されるため、これらは互いに増幅由来の「兄弟」である。それぞれのユニークリードは一意のライゲーション事象とみなされ、ユニークリードの和は、解析ゲノム当量数に相当するとみなされる。
ユニーククローンの数が、可能な配列組合せの総数に近づくにつれ、独立した事象により同じコード及び開始部位の組合せが創出され、これらの独立した事象が不適切な形で１つのファミリーに分類される可能性が生じる。最終結果は、解析ゲノム当量より少ない見積もりとなり、希少な突然変異リードは、同じ識別子を有する野生型リードと重複するという理由からシークエンシングエラーとして廃棄される場合がある。
特定の実施形態では、ＤＮＡクローンライブラリーの正確な解析を提供するため、解析ゲノム当量数は、可能なユニーククローンの数の約１／１０、約１／１２、約１／１４、約１／１６、約１／１８、約１／２０、約１／２５またはそれ以下である。上で概説されている手順は例示的なものに過ぎず、非限定的であることを理解されたい。
一部の実施形態では、解析するゲノム当量数を増加させる必要があり得る。ゲノム当量の深度を拡大するため、少なくとも２つの解決策が企図されている。第１の解決策は、試料ごとに２つ以上のアダプターセットを使用することである。アダプターを組み合わせることにより、可能なクローンの総数を乗法的に拡大し、そのためゲノム入力の無理のない限界を拡大することが可能である。第２の解決策は、リードコードを１つ、２つ、３つ、４つ、もしくは５つ、またはそれ以上の塩基の分拡大することである。他の全てのリードコードから少なくとも２塩基の分異なる可能なリードコードの数は、４（ｎ−１）のスケールであり、式中、ｎはリードコード内の塩基の数である。したがって、非限定的な例において、リードコードが５ヌクレオチドであれば４（５−１）＝２５６であるから、追加的な塩基を含めることで、利用可能なレパートリーは追加塩基１つにつき４倍拡大する。
一実施形態では、定量的遺伝子解析は、希少な一塩基変異（ＳＮＶ）を識別するための、シークエンシングリードのバイオインフォマティクス解析を含む。
次世代シークエンシングは、大まかに０．０２〜０．０２％の固有のエラー率を有し、これは１／２００〜１／５００のいずれかの塩基コールが不正確であることを意味する。これより低い頻度（例えば、１０００配列当たり１の頻度）で発生するバリアント及び他の突然変異を検出するため、分子アノテーション戦略を援用する必要がある。非限定的な例として、ターゲット化配列キャプチャー技術を用いて５０００の一意の分子を解析すれば、＞５０，０００リードの十分なシークエンシング深度で、５０００ユニークリードの集合（各ユニークリードは、いずれもが同じリードコードを所持しているリードの「ファミリー」に属する）が生成されることになる。ファミリー内で発生するＳＮＶは、希少バリアントとしての候補である。この同じバリアントが２つ以上のファミリーで観察される場合、開始試料内に存在する希少バリアントとしての非常に有力な候補となる。これに対し、複数ファミリー内で散発的に生じるバリアントはシークエンシングエラーである可能性があり、１つのみのファミリー内で生じるバリアントは、希少であるかまたはｅｘ ｖｉｖｏで生じる塩基変更（例えば、ＤＮＡ塩基の酸化またはＰＣＲにより導入されたエラー）の結果である。
一実施形態では、ＳＮＶを検出する方法は、アッセイにおける所望ターゲット感度の１０倍多いゲノム入力（ゲノムまたはゲノム当量）を導入することを含む。非限定的な一例では、所望の感度が２％（１００のうち２）である場合、実験的ターゲットは２０００ゲノムの入力である。
特定の実施形態では、シークエンシングデータのバイオインフォマティクス解析は、遺伝子の様相、状態、または疾患、遺伝子モザイク、胎児試験、父子鑑定、薬物治療に対する応答の予測、医学的状態の診断またはモニター、マイクロバイオームプロファイリング、病原体スクリーニング、及び臓器移植のモニターに関連するＳＮＶの検出または識別に使用する。
様々な実施形態では、コピー数決定解析の方法であって、それぞれが第１のＤＮＡ配列及び第２のＤＮＡ配列を含む、１つ以上または複数のクローンを取得することを含み、第１のＤＮＡ配列がターゲットとする遺伝子座内に配列を含み、第２のＤＮＡ配列がキャプチャープローブ配列を含む、方法が提供される。関係する実施形態では、１つ以上のクローンに対し、ペアリングした末端のシークエンシング反応を実施し、１つ以上のシークエンシングリードを取得する。別の実施形態では、１つ以上のクローンに対し、約１００のヌクレオチドを上回る単一の長いシークエンシングリードを取得するシークエンシング反応を実施し、このリードは、第１のＤＮＡ配列及び第２のＤＮＡ配列の両方を識別するのに十分である。１つ以上のクローンのシークエンシングリードは、シークエンシングリードのプローブ配列に従って序列化またはクラスター化することができる。
コピー数解析には、以下に限定するものではないが、所与のゲノムＤＮＡ試料で生じる特定の遺伝子または突然変異のコピー数を調べる解析が含まれ、またさらに、所与の遺伝子のコピー数または所与の試料における配列相違数の定量的決定も含まれ得る。特定の実施形態では、コピー数解析は、遺伝子の様相、状態、または疾患、胎児試験、遺伝子モザイク、父子鑑定、薬物治療に対する応答の予測、医学的状態の診断またはモニター、マイクロバイオームプロファイリング、病原体スクリーニング、及び臓器移植のモニターに関連する遺伝子増幅の検出または識別に使用する。
特定の実施形態では、シークエンシングデータのバイオインフォマティクス解析は、ターゲット座位における１つ以上の配列または遺伝子病変の検出または識別に使用することができ、これらの検出には、以下に限定するものではないが、ヌクレオチドのトランジションもしくはトランスバージョン、ヌクレオチドの挿入もしくは欠失、ゲノム再編成、コピー数の変化、または遺伝子融合の検出が含まれる。原因または予後の指標である遺伝子病変の検出は、特定の遺伝子の状態または疾患に対する診断、予後判定、治療、及び／またはモニターに有用であり得る。一実施形態では、遺伝子病変は、遺伝子の様相、状態、または疾患、胎児試験、遺伝子モザイク、父子鑑定、薬物治療に対する応答の予測、医学的状態の診断またはモニター、マイクロバイオームプロファイリング、病原体スクリーニング、及び臓器移植のモニターに関連する。
Ｆ．定量的遺伝子解析の臨床応用
様々な実施形態では、本発明は、対象における状態または疾患を検出、識別、予測、診断、またはモニターする方法を企図している。
特定の実施形態では、対象における遺伝子の様相、状態、または疾患を検出、識別、予測、診断、またはモニターする方法は、ＤＮＡクローンライブラリーにおける１つ以上のターゲット遺伝子座の定量的遺伝子解析を実施して、１つ以上のターゲット遺伝子座の配列における変化を検出または識別することを含む。一実施形態では、当該ＤＮＡはｃｆＤＮＡである。
特定の実施形態では、遺伝子疾患、遺伝子モザイク、胎児試験、父子鑑定、薬物治療に対する応答の予測、医学的状態の診断またはモニター、マイクロバイオームプロファイリング、病原体スクリーニング、及び臓器移植のモニターからなる群から選択される、遺伝子様相、または遺伝子の状態もしくは疾患を検出、識別、予測、診断、またはモニターする方法は、ＤＮＡクローンライブラリーにおける１つ以上のターゲット遺伝子座の定量的遺伝子解析を実施して、１つ以上のターゲット遺伝子座の配列におけるヌクレオチドのトランジションもしくはトランスバージョン、ヌクレオチドの挿入もしくは欠失、ゲノム再構成、コピー数の変化、または遺伝子融合を検出または識別することを含む。
本明細書で企図する組成物及び方法により検出、識別、予測、診断、またはモニターすることができる遺伝子疾患の例示的な例としては、以下に限定するものではないが、がん、アルツハイマー病（ＡＰＯＥ１）、シャルコー・マリー・トゥース病、レーバー遺伝性視覚性ニューロパシー（ＬＨＯＮ）、アンジェルマン症候群（ＵＢＥ３Ａ、ユビキチン−タンパク質リガーゼＥ３Ａ）、プラダー・ウィリー症候群（１５番染色体における領域）、β−地中海貧血症（ＨＢＢ、β−グロビン）、ゴーシェ病（Ｉ型）（ＧＢＡ、グルコセレブロシダーゼ）、嚢胞性線維症（ＣＦＴＲ上皮性塩素イオンチャネル）、鎌状赤血球症（ＨＢＢ、β−グロビン）、テイ・サックス病（ＨＥＸＡ、ヘキソサミニダーゼＡ）、フェニルケトン尿症（ＰＡＨ、フェニルアラニンヒドロリアーゼ）、家族性高コレステロール血症（ＬＤＬＲ、低密度リポタンパク質受容体）、成人型嚢胞腎（ＰＫＤ１、ポリシスチン）、ハンチントン病（ＨＤＤ、ハンチンチン）、神経線維腫症Ｉ型（ＮＦ１、ＮＦ１腫瘍抑制遺伝子）、筋緊張性ジストロフィー（ＤＭ、ミオトニン）、結節性硬化症（ＴＳＣ１、ツベリン）、軟骨形成不全（ＦＧＦＲ３、線維芽細胞増殖因子受容体）、脆弱Ｘ染色体症候群（ＦＭＲ１、ＲＮＡ結合タンパク質）、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ、ジストロフィン）、血友病Ａ（Ｆ８Ｃ、血液血液凝固第ＶＩＩＩ因子）、レッシュ・ナイハン症候群（ＨＰＲＴ１、ヒポキサンチングアニンリボシルトランスフェラーゼ１）、及び副腎白質ジストロフィー（ＡＢＣＤ１）が挙げられる。
本明細書で企図する組成物及び方法により検出、識別、予測、診断、またはモニターすることができるがんの例示的な例としては、以下に限定するものではないが、Ｂ細胞がん（例えば、多発骨髄腫）、黒色腫、乳がん、肺がん（例えば、非小細胞肺がん、すなわちＮＳＣＬＣ）、気管支がん、結腸直腸がん、前立腺がん、膵臓がん、胃がん、卵巣がん、膀胱がん、脳または中枢神経系のがん、末梢神経系がん、食道がん、子宮頸がん、子宮または子宮内膜のがん、口腔または咽頭のがん、肝臓がん、腎臓がん、精巣がん、胆道がん、小腸または虫垂のがん、唾液腺がん、甲状腺がん、副腎がん、骨肉腫、軟骨肉腫、血液組織のがん、腺がん、炎症性筋線維芽細胞腫瘍、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、結腸がん、多発骨髄腫（ＭＭ）、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、骨髄増殖性障害（ＭＰＤ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、真性多血症、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、軟部組織肉腫、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、骨肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、扁平上皮細胞がん、基底細胞がん、腺がん、汗腺がん、皮脂腺がん、乳頭がん、乳頭腺がん、髄様がん、気管支原性肺がん、腎細胞がん、肝臓がん、胆管がん、絨毛がん、精上皮腫、胚性がん、ウィルムス腫瘍、膀胱がん、上皮がん、膠腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、脳室上皮腫、松果体腫、血管芽腫、聴神経腫、乏突起神経膠腫、髄膜腫、神経芽腫、網膜芽腫、濾胞性リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、肝細胞がん、甲状腺がん、胃がん、頭頚部がん、小細胞がん、本態性血小板血症、特発性骨髄線維症、好酸球増加症候群、全身性肥満細胞症、家族性過好酸球増加症、慢性好酸球性白血病、神経内分泌がん、カルチノイド腫瘍などが挙げられる。
一実施形態では、遺伝子病変は、Ｃｏｓｍｉｃデータベースで注釈が付けられた病変（病変及び配列データはｃａｎｃｅｒ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／ｃｏｓｍｉｃ／ｃｅｎｓｕｓからダウンロード可能）またはＣａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｔｌａｓで注釈が付けられた病変（病変及び配列データはｔｃｇａ−ｄａｔａ．ｎｃｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｔｃｇａ／ｔｃｇａＤｏｗｎｌｏａｄ．ｊｓｐからダウンロード可能）である。
本明細書で企図する組成物及び方法により検出、識別、予測、診断、またはモニターすることができるがんに関連する１つ以上の遺伝子病変を有する遺伝子の例示的な例としては、以下に限定するものではないが、ＡＢＣＢ１、ＡＢＣＣ２、ＡＢＣＣ４、ＡＢＣＧ２、ＡＢＬ１、ＡＢＬ２、ＡＫＴ１、ＡＫＴ２、ＡＫＴ３、ＡＬＤＨ４Ａ１、ＡＬＫ、ＡＰＣ、ＡＲ、ＡＲＡＦ、ＡＲＦＲＰ１、ＡＲＩＤ１Ａ、ＡＴＭ、ＡＴＲ、ＡＵＲＫＡ、ＡＵＲＫＢ、ＢＣＬ２、ＢＣＬ２Ａ１、ＢＣＬ２Ｌ１、ＢＣＬ２Ｌ２、ＢＣＬ６、ＢＲＡＦ、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、Ｃｌｏｒｆ１４４、ＣＡＲＤ１１、ＣＢＬ、ＣＣＮＤ１、ＣＣＮＤ２、ＣＣＮＤ３、ＣＣＮＥ１、ＣＤＨ１、ＣＤＨ２、ＣＤＨ２０、ＣＤＨ５、ＣＤＫ４、ＣＤＫ６、ＣＤＫ８、ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＤＫＮ２Ｂ、ＣＤＫＮ２Ｃ、ＣＥＢＰＡ、ＣＨＥＫ１、ＣＨＥＫ２、ＣＲＫＬ、ＣＲＬＦ２、ＣＴＮＮＢ１、ＣＹＰ１Ｂ１、ＣＹＰ２Ｃ１９、ＣＹＰ２Ｃ８、ＣＹＰ２Ｄ６、ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ３Ａ５、ＤＮＭＴ３Ａ、ＤＯＴ１Ｌ、ＤＰＹＤ、ＥＧＦＲ、ＥＰＨＡ３、ＥＰＨＡ５、ＥＰＨＡ６、ＥＰＨＡ７、ＥＰＨＢ１、ＥＰＨＢ４、ＥＰＨＢ６、ＥＰＨＸ１、ＥＲＢＢ２、ＥＲＢＢ３、ＥＲＢＢ４、ＥＲＣＣ２、ＥＲＧ、ＥＳＲ１、ＥＳＲ２、ＥＴＶ１、ＥＴＶ４、ＥＴＶ５、ＥＴＶ６、ＥＷＳＲ１、ＥＺＨ２、ＦＡＮＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＦＣＧＲ３Ａ、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＦＧＦＲ４、ＦＬＴ１、ＦＬＴ３、ＦＬＴ４、ＦＯＸＰ４、ＧＡＴＡ１、ＧＮＡ１１、ＧＮＡＱ、ＧＮＡＳ、ＧＰＲ１２４、ＧＳＴＰ１、ＧＵＣＹ１Ａ２、ＨＯＸＡ３、ＨＲＡＳ、ＨＳＰ９０ＡＡ１、ＩＤＨ１、ＩＤＨ２、ＩＧＦ１Ｒ、ＩＧＦ２Ｒ、ＩＫＢＫＥ、ＩＫＺＦ１、ＩＮＨＢＡ、ＩＲＳ２、ＩＴＰＡ、ＪＡＫ１、ＪＡＫ２、ＪＡＫ３、ＪＵＮ、ＫＤＲ、ＫＩＴ、ＫＲＡＳ、ＬＲＰ１Ｂ、ＬＲＰ２、ＬＴＫ、ＭＡＮ１Ｂ１、ＭＡＰ２Ｋ１、ＭＡＰ２Ｋ２、ＭＡＰ２Ｋ４、ＭＣＬ１、ＭＤＭ２、ＭＤＭ４、ＭＥＮ１、ＭＥＴ、ＭＩＴＦ、ＭＬＨ１、ＭＬＬ、ＭＰＬ、ＭＲＥ１１Ａ、ＭＳＨ２、ＭＳＨ６、ＭＴＨＦＲ、ＭＴＯＲ、ＭＵＴＹＨ、ＭＹＣ、ＭＹＣＬ１、ＭＹＣＮ、ＮＦ１、ＮＦ２、ＮＫＸ２−１、ＮＯＴＣＨ１、ＮＰＭ１、ＮＱＯ１、ＮＲＡＳ、ＮＲＰ２、ＮＴＲＫ１、ＮＴＲＫ３、ＰＡＫ３、ＰＡＸ５、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＤＧＦＲＢ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＩＫ３Ｒ１、ＰＫＨＤ１、ＰＬＣＧ１、ＰＲＫＤＣ、ＰＴＣＨ１、ＰＴＥＮ、ＰＴＰＮ１１、ＰＴＰＲＤ、ＲＡＦ１、ＲＡＲＡ、ＲＢ１、ＲＥＴ、ＲＩＣＴＯＲ、ＲＰＴＯＲ、ＲＵＮＸ１、ＳＬＣ１９Ａ１、ＳＬＣ２２Ａ２、ＳＬＣＯ１Ｂ３、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ３、ＳＭＡＤ４、ＳＭＡＲＣＡ４、ＳＭＡＲＣＢ１、ＳＭＯ、ＳＯＤ２、ＳＯＸ１０、ＳＯＸ２、ＳＲＣ、ＳＴＫ１１、ＳＵＬＴ１Ａ１、ＴＢＸ２２、ＴＥＴ２、ＴＧＦＢＲ２、ＴＭＰＲＳＳ２、ＴＮＦＲＳＦ１４、ＴＯＰ１、ＴＰ５３、ＴＰＭＴ、ＴＳＣ１、ＴＳＣ２、ＴＹＭＳ、ＵＧＴ１Ａ１、ＵＭＰＳ、ＵＳＰ９Ｘ、ＶＨＬ、及びＷＴ１が挙げられる。
特定の実施形態では、遺伝子病変は、ヌクレオチドのトランジションもしくはトランスバージョン、ヌクレオチドの挿入もしくは欠失、ゲノム再編成、コピー数の変化、または遺伝子融合を含む。
一実施形態では、遺伝子病変は、ＡＬＫ遺伝子の３’コード領域を別の遺伝子に融合させる遺伝子融合である。
一実施形態では、遺伝子病変は、ＡＬＫ遺伝子の３’コード領域をＥＭＬ４遺伝子に融合させる遺伝子融合である。
本明細書で企図する組成物及び方法により検出、識別、予測、診断、またはモニターすることができる胎児試験に好適な条件の例示的な例としては、以下に限定するものではないが、ダウン症候群（トリソミー２１）、エドワード症候群（トリソミー１８）、パトー症候群（トリソミー１３）、クラインフェルター症候群（ＸＸＹ）、トリプルＸ症候群、ＸＹＹ症候群、トリソミー８、トリソミー１６、ターナー症候群（ＸＯ）、ロバートソン転座、ディジョージ症候群、及びウォルフ・ヒルショルン症候群が挙げられる。
本明細書で企図する組成物及び方法により検出、識別、予測、診断、またはモニターすることができる父子鑑定に好適なアレルの例示的な例としては、以下に限定するものではないが、Ｄ２０Ｓ１０８２、Ｄ６Ｓ４７４、Ｄ１２ＡＴＡ６３、Ｄ２２Ｓ１０４５、Ｄ１０Ｓ１２４８、Ｄ１Ｓ１６７７、Ｄ１１Ｓ４４６３、Ｄ４Ｓ２３６４、Ｄ９Ｓ１１２２、Ｄ２Ｓ１７７６、Ｄ１０Ｓ１４２５、Ｄ３Ｓ３０５３、Ｄ５Ｓ２５００、Ｄ１Ｓ１６２７、Ｄ３Ｓ４５２９、Ｄ２Ｓ４４１、Ｄ１７Ｓ９７４、Ｄ６Ｓ１０１７、Ｄ４Ｓ２４０８、Ｄ９Ｓ２１５７、アメロゲニン、Ｄ１７Ｓ１３０１、Ｄ１ＧＡＴＡ１１３、Ｄ１８Ｓ８５３、Ｄ２０Ｓ４８２、及びＤ１４Ｓ１４３４のうちの１６以上が挙げられる。
本明細書で企図する組成物及び方法により検出、識別、予測、診断、またはモニターすることができる、薬物に対する応答の予測に好適な遺伝子の例示的な例としては、以下の遺伝子のうちの１つ以上が挙げられるが、これに限定されない：ＡＢＣＢ１（ＡＴＰ結合カセット、サブファミリーＢ（ＭＤＲ／ＴＡＰ）、メンバー１）、ＡＣＥ（アンギオテンシンＩ変換酵素）、ＡＤＨ１Ａ（アルコールデヒドロゲナーゼ１Ａ（クラスＩ）、アルファポリペプチド）、ＡＤＨ１Ｂ（アルコールデヒドロゲナーゼＩＢ（クラスＩ）、ベータポリペプチド）、ＡＤＨ１Ｃ（アルコールデヒドロゲナーゼ１Ｃ（クラスＩ）、ガンマポリペプチド）、ＡＤＲＢ１（アドレナリン性、ベータ１−、受容体）、ＡＤＲＢ２（アドレナリン性、ベータ２−、受容体、表面）、ＡＨＲ（アリール炭化水素受容体）、ＡＬＤＨ１Ａ１（アルデヒドデヒドロゲナーゼ１ファミリー、メンバーＡ１）、ＡＬＯＸ５（アラキドン酸５−リポキシゲナーゼ）、ＢＲＣＡ１（乳がん１、早発性）、ＣＯＭＴ（カテコール−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ）、ＣＹＰ２Ａ６（シトクロムＰ４５０、ファミリー２、サブファミリーＡ、ポリペプチド６）、ＣＹＰ２Ｂ６（シトクロムＰ４５０、ファミリー２、サブファミリーＢ、ポリペプチド６）、ＣＹＰ２Ｃ９（シトクロムＰ４５０、ファミリー２、サブファミリーＣ、ポリペプチド９）、ＣＹＰ２Ｃ１９（シトクロムＰ４５０、ファミリー２、サブファミリーＣ、ポリペプチド１９）、ＣＹＰ２Ｄ６（シトクロムＰ４５０、ファミリー２、サブファミリーＤ、ポリペプチド６）、ＣＹＰ２Ｊ２（シトクロムＰ４５０、ファミリー２、サブファミリーＪ、ポリペプチド２）、ＣＹＰ３Ａ４（シトクロムＰ４５０、ファミリー３、サブファミリーＡ、ポリペプチド４）、ＣＹＰ３Ａ５（シトクロムＰ４５０、ファミリー３、サブファミリーＡ、ポリペプチド５）、ＤＰＹＤ（ジヒドロピリミジンデヒドロゲナーゼ）、ＤＲＤ２（ドーパミン受容体Ｄ２）、Ｆ５（凝固因子Ｖ）、ＧＳＴＰ１（グルタチオンＳ−トランスフェラーゼパイ）、ＨＭＧＣＲ（３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−コエンザイムＡレダクターゼ）、ＫＣＮＨ２（カリウム電位開口型チャネル、サブファミリーＨ（ｅａｇ関連）、メンバー２）、ＫＣＮＪ１１（カリウム内向き整流性チャネル、サブファミリーＪ、メンバー１１）、ＭＴＨＦＲ（５，１０−メチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼ（ＮＡＤＰＨ））、ＮＱＯ１（ＮＡＤ（Ｐ）Ｈデヒドロゲナーゼ、キノン１）、Ｐ２ＲＹ１（プリン性受容体Ｐ２Ｙ、Ｇタンパク質共役、１）、Ｐ２ＲＹ１２（プリン性受容体Ｐ２Ｙ、Ｇタンパク質共役、１２）、ＰＴＧＩＳ（プロスタグランジンＩ２（プロスタサイクリン）シンターゼ）、ＳＣＮ５Ａ（ナトリウムチャネル、電位開口型、Ｖ型、アルファ（ＱＴ延長症候群３））、ＳＬＣ１９Ａ１（溶質担体ファミリー１９（葉酸輸送体）、メンバー１）、ＳＬＣＯ１Ｂ１（溶質担体有機アニオン輸送体ファミリー、メンバー１Ｂ１）、ＳＵＬＴ１Ａ１（スルホトランスフェラーゼファミリー、細胞基質、１Ａ、フェノール選好、メンバー１）、ＴＰＭＴ（チオプリンＳ−メチルトランスフェラーゼ）、ＴＹＭＳ（チミジル酸シンターゼ）、ＵＧＴ１Ａ１（ＵＤＰグルクロノシルトランスフェラーゼ１ファミリー、ポリペプチドＡ１）、ＶＤＲ（ビタミンＤ（１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３）受容体）、ＶＫＯＲＣ１（ビタミンＫエポキシドレダクターゼ複合体、サブユニット１）。
本明細書で企図する組成物及び方法により検出、識別、予測、診断、またはモニターすることができる医学的状態の例示的な例としては、以下に限定するものではないが、脳卒中、一過性脳虚血発作、外傷性脳損傷、心疾患、心臓発作、アンギナ、粥状動脈硬化、及び高血圧が挙げられる。
本明細書で企図する組成物及び方法によりスクリーンすることができる病原体の例示的な例としては、以下に限定するものではないが、細菌、真菌、及びウイルスが挙げられる。
本明細書で企図する組成物及び方法によりスクリーンすることができる細菌種の例示的な例としては、以下に限定するものではないが、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種、Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓ種、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ種、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ種、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ種、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ種、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ種、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種、Ｓｈｉｇｅｌｌａ種、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ種、またはＳａｌｍｏｎｅｌｌａ種が挙げられる。
本明細書で企図する組成物及び方法によりスクリーンすることができる真菌種の例示的な例としては、以下に限定するものではないが、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｉｓ種、Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ種、Ｃａｎｄｉｄａ種、Ｃｏｃｃｉｃｉｏｉｄｅｓ種、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ種、皮膚糸状菌、Ｔｉｎｅａ種、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ種、Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ種、Ｆｕｓａｒｉｕｍ種、Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ種、Ｍｕｃｏｒｏｍｙｃｏｔｉｎａ種、Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ種、Ｓｐｏｒｏｔｈｒｉｘ種、Ｅｘｓｅｒｏｐｈｉｌｕｍ種、またはＣｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ種が挙げられる。
本明細書で企図する組成物及び方法によりスクリーンすることができるウイルスの例示的な例としては、以下に限定するものではないが、Ａ型インフルエンザ（例えば、Ｈ１Ｎ１、Ｈ１Ｎ２、Ｈ３Ｎ２、及びＨ５Ｎ１（トリインフルエンザ））、Ｂ型インフルエンザ、Ｃ型インフルエンザウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、Ｄ型肝炎ウイルス、Ｅ型肝炎ウイルス、ロタウイルス、ノーウォークウイルス群の任意のウイルス、腸管アデノウイルス、パルボウイルス、デング熱ウイルス、サル痘、モノネガウイルス目、リッサウイルス（例えば、狂犬病ウイルス、ラゴスコウモリウイルス、モコラウイルス、ドゥーベンハーゲウイルス、ヨーロッパコウモリウイルス１＆２、及びオーストラリアコウモリウイルス）、エフェメロウイルス、ベシクロウイルス、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、ヘルペスウイルス（例えば、単純ヘルペスウイルス１型及び２型、水痘帯状疱疹、サイトメガロウイルス、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、ヒトヘルペスウイルス（ＨＨＶ）、ヒトヘルペスウイルス６型及び８型）、モロニーマウス白血病ウイルス（Ｍ−ＭｕＬＶ）、モロニーマウス肉腫ウイルス（ＭｏＭＳＶ）、ハーベイマウス肉腫ウイルス（ＨａＭｕＳＶ）、マウス乳がんウイルス（ＭｕＭＴＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）、ネコ白血病ウイルス（ＦＬＶ）、スプーマウイルス、フレンドマウス白血病ウイルス、マウス幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）及びラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、ＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス；１型ＨＩＶ及び２型ＨＩＶを含む）、ビスナ・マエディウイルス（ＶＭＶ）ウイルス、ヤギ関節炎脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）、ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）、及びサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、パピローマウイルス、マウスガンマヘルペスウイルス、アレナウイルス（例えば、アルゼンチン出血熱ウイルス、ボリビア出血熱ウイルス、サビア関連出血熱ウイルス、ベネズエラ出血熱ウイルス、ラッサ熱ウイルス、マチュポウイルス、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ））、Ｂｕｎｙａｖｉｒｉｄｉａｅ（例えば、クリミア・コンゴ出血熱ウイルス、ハンタウイルス、腎症候性出血熱の原因ウイルス、リフトバレー出血熱ウイルス）、Ｆｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ（フィロウイルス）（エボラ出血熱及びマールブルグ出血熱を含む）、Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ（キャサヌール森林病ウイルス、オムスク出血熱ウイルス、ダニ媒介脳炎ウイルスを含む）、ならびにＰａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ（例えば、ヘンドラウイルス及びニパーウイルス、大痘瘡及び小痘瘡（天然痘））、アルファウイルス（例えば、ベネズエラウマ脳炎、東部ウマ脳炎、西部ウマ脳炎）、ＳＡＲＳ関連コロナウイルス（ＳＡＲＳ−ＣｏＶ）、西ナイルウイルス、ならびに任意の脳炎原因ウイルスが挙げられる。
本明細書で企図する組成物及び方法により検出、識別、予測、診断、またはモニターすることができる、被移植者における臓器移植のモニターに好適な遺伝子の例示的な例としては、以下の遺伝子のうちの１つ以上が挙げられるが、これに限定されない：ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡ−ＤＰ、及びＨＬＡ−ＤＱ。
特定の実施形態では、バイオインフォマティクス解析は、ＤＮＡクローンライブラリーにおいて解析されるゲノム当量数の定量化；ターゲット遺伝子座における遺伝子バリアントの検出；ターゲット遺伝子座における突然変異の検出；ターゲット遺伝子座における遺伝子融合の検出、またはターゲット遺伝子座におけるコピー数変動測定のために使用する。
Ｇ．コンパニオン診断
様々な実施形態では、遺伝子疾患のコンパニオン診断であって、対象の生体試料からＤＮＡ（例えば、ｃｆＤＮＡ）を単離または取得すること；ＤＮＡの末端リン酸残基を除去すること；脱リン酸化ＤＮＡを１種以上の末端修復酵素で処理して、末端修復ＤＮＡを生成すること；１つ以上の二重鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）プレアダプターを末端修復ＤＮＡの各鎖の３’末端に対しライゲーションして、プレアダプター／末端修復ＤＮＡ複合体を形成することであって、各ｄｓＤＮＡプレアダプターが、末端修復ＤＮＡの各鎖の３’末端にライゲーションされたライゲーション鎖オリゴヌクレオチドと非ライゲーションパートナー鎖オリゴヌクレオチドとを含む、ライゲーションすること；プレアダプター／末端修復ＤＮＡ複合体から非ライゲーションパートナー鎖オリゴヌクレオチドを離し、修復オリゴヌクレオチドで置き換えてアダプター／末端修復ＤＮＡ複合体を形成することであって、各アダプターがライゲーション鎖オリゴヌクレオチド及び修復オリゴヌクレオチドを含む、置き換えること；アダプター／末端修復ＤＮＡ複合体を１種以上の酵素で処理して、連続した二重鎖のＤＮＡライブラリーを形成すること；ＤＮＡライブラリーを増幅してＤＮＡクローンライブラリーを生成すること；ＤＮＡクローンライブラリーにおけるゲノム当量数を決定すること；ならびに、ＤＮＡクローンライブラリーにおける遺伝子疾患に関連する１つ以上のバイオマーカーの定量的遺伝子解析を実施することであって、１つ以上のバイオマーカーのうちの少なくとも１つの検出または検出失敗が、対象に遺伝子疾患の治療をすべきかどうかを指示するものである、実施すること、を含むコンパニオン診断が提供される。
本明細書で使用する「コンパニオン診断」という用語は、特定の抗がん療法に結びついた診断検査を指す。特定の実施形態では、当該診断方法は、生体試料に関連するバイオマーカーにおける遺伝子病変の検出を含み、これによって患者を抗がん療法で治療すべきかそうでないかの迅速な識別が可能になる。
抗がん療法としては、以下に限定するものではないが、手術、放射線照射、化学療法、抗がん剤、及び免疫調節剤が挙げられる。
抗がん薬の例示的な例としては、以下に限定するものではないが、アルキル化剤、例えば、チオテパ及びシクロホスファミド（ＣＹＴＯＸＡＮ（商標））；アルキルスルホネート、例えば、ブスルファン、インプロスルファン、及びピポスルファン；アジリジン、例えば、ベンゾドーパ、カルボコン、メツレドーパ、及びウレドーパ；エチレンイミン及びメチラメラミン（アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミド、及びトリメチルオロメラミンレジュームを含む）；ナイトロジェンマスタード（例えば、クロラムブシル、クロルナファジン、コロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシド塩酸塩、メルファラン、ノベンビチン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタード）；ニトロソウレア（例えば、カルムスチン、クロロゾトシン、ホテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチン）；抗生剤（例えば、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、アントラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カリケアミシン、カラビシン、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ドキソルビシン及びそのペグ化製剤、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、ミトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン、ピュロマイシン、ケラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシン）；代謝拮抗薬（例えば、メトトレキサート及び５−フルオロウラシル（５−ＦＵ））；葉酸類似体（例えば、デノプテリン、メトトレキサート、プテロプテリン、トリメトレキサート）；プリン類似体（例えば、フルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニン）；ピリミジン類似体（例えば、アンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジン、５−ＦＵ）；アンドロゲン（例えば、カルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン）；抗アドレナリン剤（例えば、アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタン）；葉酸補充物（例えば、フォリン酸）；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；アムサクリン；ベストラブシル；ビサントレン；エダトレキサート；デフォファミン；デメコルチン；ジアジクオン；エルホルミチン；酢酸エリプチニウム；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシウレア；レンチナン；ロニダミン；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダモール；ニトラクリン；ペントスタチン；フェナメット；ピラルビシン；ポドフィリン酸；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ（登録商標）；ラゾキサン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジコン；２，２’，２”−トリクロロトリエチルアミン；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン；アラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）；シクロホスファミド；チオテパ；タキソイド（例えば、パクリタキセル（ＴＡＸＯＬ（登録商標）、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，Ｎ．Ｊ．）及びドセタキセル（ＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標）、Ｒｈｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ Ｒｏｒｅｒ，Ａｎｔｏｎｙ，Ｆｒａｎｃｅ））；クロラムブシル；ゲムシタビン；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；白金類似体（例えば、シスプラチン及びカルボプラチン）；ビンブラスチン；白金；エトポシド（ＶＰ−１６）；イホスファミド；ミトマイシンＣ；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ビノレルビン；ナベルビン；ノバントロン；テニポシド；アミノプテリン；ゼローダ；イバンドロネート；ＣＰＴ−１１；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイン酸誘導体（例えば、Ｔａｒｇｒｅｔｉｎ（商標）（ベキサロテン）、Ｐａｎｒｅｔｉｎ（商標）（アリトレチノイン））；ＯＮＴＡＫ（商標）（デニロイキンジフチトクス）；エスペラミシン；カペシタビン；ならびに上記のいずれかの医薬的に許容される塩、酸、または誘導体、が挙げられる。この定義にさらに含まれるものとして、がんに対するホルモン作用を調節または阻害するように作用する抗ホルモン剤、例えば、抗エストロゲン剤（例えば、タモキシフェン、ラロキシフェン、アロマターゼ阻害４（５）−イミダゾール、４−ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン、ＬＹ１１７０１８、オナプリストン、及びトレミフェン（Ｆａｒｅｓｔｏｎ）を含む）、ならびに抗アンドロゲン剤（例えば、フルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、ロイプロリド、及びゴセレリン）、ならびに上記のいずれかの医薬的に許容される塩、酸、または誘導体がある。
免疫調節剤の例示的な例としては、以下に限定するものではないが、シクロスポリン、タクロリムス、トレスペリムス、ピメクロリムス、シロリムス、ベロリムス、ラフルニムス、ラキニモド及びイミキモド、ならびにこれらの類似体、誘導体、塩、イオン、及び複合体が挙げられる。
本明細書で引用された全ての刊行物、特許出願及び発行された特許は、個々の刊行物、特許出願、または発行された特許が、明確に及び個々に参照により組み込まれていると示されているかのように、参照により本明細書に組み込まれる。２０１３年１２月１０日に出願された米国特許出願第１４／１０２，２８５号及び２０１４年８月２２日に出願された同第１４／４６６，７４１号はそれぞれ、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
上記の発明を、明快に理解するための例示及び例を通じてある程度詳細に説明してきたが、本発明の教示を踏まえた上で、添付の請求項の趣旨及び範囲から逸脱することなく、本発明にあるいくつかの変化及び変更を施してもよいことは、当業者には直ちに明らかになることである。以下の実施例は、単に例として提供するものであり、限定として提供するものではない。当業者であれば、本質的に同様な結果をもたらすために変化または変更ができるであろう様々な重要性の低いパラメーターがあることを容易に認識することになる。
実施例１
高効率アダプターライゲーションの原理証明
本実施例では、本明細書で企図する高効率ライゲーション戦略が、アダプターダイマーを形成することなくＤＮＡ断片の両方の末端にライゲーションをもたらすという、直接的な定量的根拠を提供する（図２）。
クローニングベクターｐＵＣ１９からのプラスミドＤＮＡを、制限酵素ＲｓａＩで消化させてブラントエンドを生成し、Ａｎｔａｒｃｔｉｃアルカリホスファターゼで脱リン酸化した。これらのブラントエンドの脱リン酸化ＤＮＡ断片を、９つの異なる高効率アダプターの集合にライゲーションした（表１）。全ての場合において、ライゲーション反応（矢印）の後に断片移動の定量的シフトが観察され、移動シフトは、各ＤＮＡ断片の各末端に対するアダプター接着と同等であった。本実施例では、本明細書で企図する組成物及び方法が、ＤＮＡ断片に対するアダプターの高効率ライゲーションをもたらし、それによってＤＮＡライブラリー構築の全体的効率を高めるという原理証明を提供する。
Figure 0006913089
実施例２
高効率ＤＮＡライブラリー構築
Ｉ．断片末端の修復
セルフリーＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）断片の末端を脱リン酸化し、ＤＮＡ二重鎖に対する内部損傷を修復し、ＤＮＡ末端を「磨いて」ブラントエンドにした。得られた断片を「末端修復断片」と称する。
８１μｌの精製ｃｆＤＮＡ、１０μｌのＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（ＮＥＢ）のＣｕｔＳｍａｒｔ緩衝液（Ｂ７２０４Ｓ）、及び５μｌのＮＥＢのエビ由来アルカリホスファターゼ（Ｍ０３７１）を合わせることにより、ｃｆＤＮＡ断片の末端を脱リン酸化した。反応混合物を３７℃で１５分間インキュベートし、次に６５℃で５分間インキュベートした。
氷上で調製した４μｌの以下の混合物：１．１μｌの１０ｍＭ ｄＮＴＰ混合物（ＮＥＢ Ｎ０４４７）、２．２μｌのＰｒｅＣＲ酵素混合物（Ｍ０３０９）、及び１．１μｌのＴ４ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｍ０２０３）、を添加することにより、脱リン酸化ｃｆＤＮＡ断片に対する内部損傷を修復した。この反応混合物を２０℃で１５分間インキュベートし、次に７０℃で１０分間インキュベートした。このようにして修復し磨いたｃｆＤＮＡ断片は、ＤＮＡライゲーション反応に直接使用することができる。
ＩＩ．プレアダプター設計
いくつかの設計考慮事項を用いて、ライゲーション鎖オリゴヌクレオチド及び３’末端がブロックされた相補的なパートナー鎖オリゴヌクレオチドから構成されるプレアダプターを生成した。
本実施例で使用するプレアダプターは、以下の特徴を有するように設計した：長さ１０ｎｔのライゲーション鎖オリゴヌクレオチド；同じバランスのＡ／ＴまたはＧ／Ｃ残基；４つのＤＮＡ塩基のそれぞれが、プレアダプター各セット内の各塩基位置に表される；１０塩基配列の予測融解温度が５０ｍＭ Ｎａ＋（またはＫ＋）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２において約３７℃である；Ａ／Ｔ及びＧ／Ｃ ｎｔの両方が各プレアダプター配列における最初の２つの塩基である；相補的パートナーオリゴヌクレオチド配列は、長さが８ｎｔであり、２−ヒドロキシリボース修飾ＤＮＡ塩基（ＭＷＧ Ｅｕｒｏｆｉｎｓ）を使用することにより化学的にブロックされ、融解温度が５０ ｍＭ Ｎａ＋またはＫ＋、１０ ｍＭ ＭｇＣｌ２において約２５℃である。
設計制約を施した上で、アダプターセットの実験的性能スクリーニングを実施した。本実験において、許容される性能を有する５セットのアダプター４つを特定した（例えば、表２を参照）。「スコア」と表示された列は、各アダプターを最良の性能のアダプター（セット６−２）と比較したときのクローニング効率パーセントを示す。
Figure 0006913089
ＩＩＩ．プレアダプターのライゲーション
プレアダプターを、本実施例のステップＩで生成した末端修復断片にライゲーションした。２５μｌの末端修復断片を１０μｌの１０μＭアダプターと合わせた。典型的には、反応物に添加する個別のアダプターの数に応じて、１〜４のライゲーション反応を実施した。１５μｌのライゲーションカクテル（５μｌの１０Ｘ Ｔ４−ＤＮＡライゲーション緩衝液、７．５μｌの５０％ ＰＥＧ８０００、及び２．５μｌのＨＣ Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ；Ｍ０２０２））を、最終体積５０μｌで各ライゲーション反応物に添加した。反応物を混合し、２０℃で６０分間インキュベートし、次に６５℃で１０分間インキュベートし、次に室温まで冷却した。
ライゲーション反応後、５０μｌのＴＥｚｅｒｏ（１０ｍＭトリスｐＨ ８．０、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０）及び１２０μｌのＤＮＡ精製ビーズを各反応物に添加し、十分に混合した。反応物を１０分間室温でインキュベートし、次にビーズを２００μｌの７０％エタノール／水（ｖ／ｖ）で２回洗浄し、短時間（約５分）風乾し、２０μｌのＴＥｚｅｒｏで溶離した。
ＩＶ．修復オリゴヌクレオチド
本実施例で使用した修復オリゴヌクレオチドの完全なリストを表３に示す。各修復オリゴヌクレオチドは、２４９の個別オリゴヌクレオチドのプールである。各修復オリゴヌクレオチドの不変の配列はＰＣＲプライマー結合部位に相当し、表３の左側に示されている。
２４９オリゴヌクレオチドのそれぞれは、修復オリゴヌクレオチド配列内に「ＸＸＸＸＸ」として示されている５ヌクレオチドの試料コードを含む。５ヌクレオチド試料は、表３の右側に示されている。５ヌクレオチドコードは、セット内の他の全てのコードと異なる２塩基の変化となるように選ばれた、２５６の可能な一意の配列からなる。この特徴により、一意で別々のリードと、コード領域におけるシークエンシングエラーに起因して一意であるように見えるリードとを区別することが可能となった。Ｇ残基が過剰出現し、かつアダプター機能を妨害することが実験的に示された７つのコードを除去し、２４９のランダムコードを残した。
Figure 0006913089
Figure 0006913089
Figure 0006913089
Ｖ．修復オリゴヌクレオチドのプレアダプターライブラリーへの付加
修復オリゴヌクレオチドをアダプターに付加することにより、ライブラリー構築を完成した。本実施例で例示する修復オリゴヌクレオチドは、ＰＣＲプライマー結合部位、試料コード、及びアンカー配列を含有する。アンカー配列は、ランダム配列標識であり、配列を識別する手段として作用し、シークエンシングリードにおける適正な塩基コールの校正を可能にし、ライゲーション鎖オリゴヌクレオチドとのハイブリダイズのためのアンカーとして作用する。
４μｌの１μＭプールの修復オリゴヌクレオチド（例えば、表３を参照）を、本実施例のステップＩＩＩからの２０μｌの精製したライゲーション混合物に添加した。
次に、２４μｌの修復オリゴヌクレオチド／リガーゼ混合物を、１６μｌの以下の混合物：１１μｌの水、４．４μｌの緩衝液「Ｂ」（１９０μｌのＣｕｔＳｍａｒｔ緩衝液（ＮＥＢ；Ｂ７２０４）及び１０μｌの１Ｍ ジチオトレイトール（ＤＴＴ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ ６４６５６３））、１．３２μｌのヌクレオチド混合物「Ｎ」（５０μｌの１０ ｍＭ ｄＮＴＰ混合物（ＮＥＢ；Ｎ０４４７）を２５μｌの１００Ｘ ＮＡＤ＋（ＮＥＢ；Ｂ９００７）と合わせる）、ならびに０．８８μｌの酵素混合物「Ｅ」（２０μｌのＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ＮＥＢ；Ｍ０２０１）、１０μｌの全長ＢｓｔＩポリメラーゼ（ＮＥＢ；Ｍ０３２８）、及び１０μｌのＴａｑ ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ；Ｍ０２０８）を合わせる）と、氷上で合わせることにより、４０μｌの修復オリゴヌクレオチド反応物を調製した。反応物を混合し、３７℃で１５分間インキュベートし、次に６０℃で１５分間インキュベートした。
反応物をサーマルサイクラーから取り出し、４８ｕｌのビーズ再懸濁溶液（１９％ ＰＥＧ８０００、２Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０）を反応物に添加し、室温で１０分間インキュベートした。ビーズを２００μｌの７０％エタノールで２回洗浄し、短時間（約５分）風乾し、２５μｌのＴＥｚｅｒｏに再懸濁した。マグネットを使用してビーズを局在化し、清澄化したＤＮＡライブラリーを新たな反応容器に移した。
ＶＩ．概括
本明細書の全体にわたって企図し実施例１で説明した方法を用いて構築した、得られたＤＮＡライブラリーは増幅可能であり、１つ以上のターゲット遺伝子座に対する次世代シークエンシング、ｑＰＣＲ解析、及び他の定量的遺伝子解析に好適である。
概して、以下の請求項において、使用する用語は、明細書及び請求項で開示する特定の実施形態に請求項を限定するように解釈すべきではなく、請求項が権利を有する全ての範囲の相当物と共に、全ての可能な実施形態を含めるように解釈すべきである。したがって、請求項は本開示による限定を受けない。

Claims (23)

  1. ＤＮＡライブラリーを構築する方法であって、
    （ａ）１つ以上のＤＮＡ断片の末端リン酸残基を除去すること；
    （ｂ）前記脱リン酸化ＤＮＡ断片を１種以上の末端修復酵素で処理して、末端修復ＤＮＡを生成すること；
    （ｃ）１つ以上の二重鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）プレアダプターを前記末端修復ＤＮＡ断片の各鎖の３’末端に対しライゲーションして、プレアダプター／末端修復ＤＮＡ複合体を形成することであって、各ｄｓＤＮＡプレアダプターが、（ｉ）前記末端修復ＤＮＡの各鎖の３’末端にライゲーションされ、アンカー配列を含むライゲーション鎖オリゴヌクレオチドと、（ｉｉ）非ライゲーションパートナー鎖オリゴヌクレオチドとを含む、前記ライゲーションすること；
    （ｄ）前記プレアダプター／末端修復ＤＮＡ複合体から前記非ライゲーションパートナー鎖オリゴヌクレオチドを離し、修復オリゴヌクレオチドで置き換えてアダプター／末端修復ＤＮＡ複合体を形成することであって、各アダプターが前記ライゲーション鎖オリゴヌクレオチド及び前記修復オリゴヌクレオチドを含む、前記置き換えること；ならびに
    （ｅ）前記アダプター／末端修復ＤＮＡ複合体をポリヌクレオチドキナーゼおよびＤＮＡリガーゼで処理して、連続したｄｓＤＮＡ断片のライブラリーを形成することであって、前記修復オリゴヌクレオチドが、前記末端修復ＤＮＡ断片の各鎖の５’末端に対しライゲーションする、前記処理すること；
    を含む、前記方法。
  2. 前記非ライゲーションパートナー鎖オリゴヌクレオチドが、３’末端において、前記末端修復ＤＮＡ断片の５’末端に対するライゲーション及び／またはアダプターダイマー形成を防止する修飾を含む、請求項１に記載の方法。
  3. 前記１つ以上のＤＮＡ断片の供与源が、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）、相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、及びセルフリーＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）からなる群から選択されるＤＮＡである、請求項１または請求項２に記載の方法。
  4. 前記ＤＮＡの供与源が、羊水試料、血液試料、皮膚試料、毛髪試料、毛包試料、唾液試料、粘液試料、口腔粘液試料、腟粘液試料、汗試料、涙試料、上皮組織試料、尿試料、精液試料、精漿試料、前立腺液試料、射精前液（カウパー腺液）試料、排泄物試料、生検試料、腹水試料、脳脊髄液試料、リンパ液試料、組織抽出物試料、生検試料、血漿試料、血清試料、リンパ液試料、眼球液試料、便試料、及びホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）試料からなる群から選択される生体試料である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
  5. 前記生体試料から前記ＤＮＡを単離すること、前記ＤＮＡを断片化すること、及びステップ（ｃ）の前に前記１つ以上のＤＮＡ断片の損傷を修復することをさらに含む、請求項４に記載の方法。
  6. 前記損傷が、脱アミノ化シトシン（ウラシル）、脱塩基部位、グアニンのＯ６ＭｅＧへのメチル化、ＤＮＡニック、ギャップ、またはチミンダイマーである、請求項５に記載の方法。
  7. 前記ライゲーション鎖オリゴヌクレオチドが、
    （ｉ）１つ以上のユニークリードコード；
    （ｉｉ）１つ以上の連続したｄｓＤＮＡライブラリー分子をＰＣＲ増幅するためのＰＣＲプライマー結合部位；
    （ｉｉｉ）試料多重化のための１つ以上の試料コード；
    （ｉｖ）ＤＮＡシークエンシングのための１つ以上のプライマー結合部位
    の１つ以上をさらに含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
  8. 前記修復オリゴヌクレオチドがアンカー配列と、
    （ｉ）１つ以上のユニークリードコード
    （ｉｉ）１つ以上の連続したｄｓＤＮＡライブラリー分子をＰＣＲ増幅するための１つ以上のプライマー結合部位
    （ｉｉｉ）試料多重化のための１つ以上の試料コード
    （ｉｖ）ＤＮＡシークエンシングのための１つ以上のプライマー結合部位
    の１つ以上とを含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
  9. 前記ライゲーション鎖オリゴヌクレオチドおよび前記修復オリゴヌクレオチドのそれぞれがアンカー配列を含み、前記ライゲーション鎖の前記アンカー配列が、前記修復オリゴヌクレオチドの前記アンカー配列の少なくとも一部に対し相補的である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
  10. 前記ライゲーション鎖オリゴヌクレオチドおよび前記修復オリゴヌクレオチドのそれぞれが、１つ以上のタグ付きｄｓＤＮＡ断片を増幅させるためのＰＣＲプライマー結合部位をさらに含み、前記ライゲーション鎖オリゴヌクレオチドの前記ＰＣＲプライマー結合部位が、前記修復オリゴヌクレオチドの前記ＰＣＲプライマー結合部位に対し相補的である、請求項９に記載の方法。
  11. 前記１つ以上のアダプターが、複数のライゲーション鎖オリゴヌクレオチド種及び／または複数の修復オリゴヌクレオチド種を含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
  12. 前記ライゲーション鎖オリゴヌクレオチドおよび前記修復オリゴヌクレオチドのそれぞれが、１つ以上のタグ付きｄｓＤＮＡ断片を増幅させるためのＰＣＲプライマー結合部位をさらに含み、前記ライゲーション鎖オリゴヌクレオチドの前記ＰＣＲプライマー結合部位が、前記修復オリゴヌクレオチドの前記ＰＣＲプライマー結合部位に対し相補的ではない、請求項９に記載の方法。
  13. 前記ライゲーション鎖オリゴヌクレオチドの前記ＰＣＲプライマー結合部位に結合するプライマーが、前記修復オリゴヌクレオチドの前記ＰＣＲプライマー結合部位に実質的に結合しない、請求項１２に記載の方法。
  14. アダプターライゲーションの効率が、脱リン酸化アダプター分子がリン酸化ＤＮＡ断片にライゲーションされる方法と比較して増大する、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
  15. 前記ＤＮＡライブラリーを増幅してＤＮＡクローンライブラリーを生成し、定量的遺伝子解析を、前記ＤＮＡクローンライブラリーにおける複数の遺伝子座上で実施する、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
  16. 定量的遺伝子解析が、複数のシークエンシングリードを生成するためのＤＮＡシークエンシングを含み、前記複数のシークエンシングリードのバイオインフォマティクス解析をさらに含む、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
  17. 前記複数のシークエンシングリードのバイオインフォマティクス解析をさらに含み、前記バイオインフォマティクス解析を、以下の目的：
    （ａ）前記ＤＮＡクローンライブラリー内で解析されるゲノム当量数の定量化；
    （ｂ）ターゲット遺伝子座における遺伝子バリアントの検出；
    （ｃ）ターゲット遺伝子座の中の突然変異の検出；
    （ｄ）ターゲット遺伝子座の中の遺伝子融合の検出；及び／または
    （ｅ）ターゲット遺伝子座の中のコピー数変動の測定；
    で使用する、請求項１６に記載の方法。
  18. 前記定量的遺伝子解析を、遺伝子疾患の原因となるまたは遺伝子疾患に関連する、１つ以上の遺伝子病変を識別または検出するために使用する、請求項１７に記載の方法であって、前記遺伝子病変が、ヌクレオチドのトランジションもしくはトランスバージョン、ヌクレオチドの挿入もしくは欠失、ゲノム再編成、コピー数の変化、または遺伝子融合を含む、方法。
  19. １つ以上のターゲット遺伝子座における１つ以上の遺伝子病変を、対象における遺伝子疾患の予測、診断、またはモニターのための指標とする方法であって、
    （ａ）対象の生体試料からＤＮＡを単離または取得すること；
    （ｂ）前記ＤＮＡの末端リン酸残基を除去すること；
    （ｃ）前記脱リン酸化ＤＮＡを１種以上の末端修復酵素で処理して、末端修復ＤＮＡを生成すること；
    （ｄ）１つ以上の二重鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）プレアダプターを前記末端修復ＤＮＡの各鎖の３’末端に対しライゲーションして、プレアダプター／末端修復ＤＮＡ複合体を形成することであって、各ｄｓＤＮＡプレアダプターが、前記末端修復ＤＮＡの各鎖の３’末端にライゲーションされたライゲーション鎖オリゴヌクレオチドと、非ライゲーションパートナー鎖オリゴヌクレオチドとを含む、前記ライゲーションすること；
    （ｅ）前記プレアダプター／末端修復ＤＮＡ複合体から前記非ライゲーションパートナー鎖オリゴヌクレオチドを離し、修復オリゴヌクレオチドで置き換えてアダプター／末端修復ＤＮＡ複合体を形成することであって、各アダプターが前記ライゲーション鎖オリゴヌクレオチド及び前記修復オリゴヌクレオチドを含む、前記置き換えること；
    （ｆ）前記アダプター／末端修復ＤＮＡ複合体をポリヌクレオチドキナーゼおよびＤＮＡリガーゼで処理して、連続した二重鎖のＤＮＡ断片のライブラリーを形成することであって、前記修復オリゴヌクレオチドが、前記末端修復ＤＮＡ断片の各鎖の５’末端に対しライゲーションする、前記処理すること；
    （ｇ）前記ＤＮＡライブラリーを増幅してＤＮＡクローンライブラリーを生成すること；
    （ｈ）前記ＤＮＡクローンライブラリーにおけるゲノム当量数を決定すること；ならびに
    （ｉ）前記ＤＮＡクローンライブラリーにおける前記遺伝子疾患に関連する１つ以上のターゲット遺伝子座の定量的遺伝子解析を実施することであって、前記１つ以上のターゲット遺伝子座における１つ以上の遺伝子病変の識別または検出が、前記遺伝子疾患の予後判定、診断、または進行のモニターである、前記実施すること；
    を含む、前記方法。
  20. ＤＮＡクローンライブラリーにおける遺伝子疾患に関連する１つ以上のバイオマーカーを、対象に遺伝子疾患の治療をすべきかどうかの指標とする方法であって、
    （ａ）対象の生体試料からＤＮＡを単離または取得すること；
    （ｂ）前記ＤＮＡの末端リン酸残基を除去すること；
    （ｃ）前記脱リン酸化ＤＮＡを１種以上の末端修復酵素で処理して、末端修復ＤＮＡを生成すること；
    （ｄ）１つ以上の二重鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）プレアダプターを前記末端修復ＤＮＡの各鎖の３’末端に対しライゲーションして、プレアダプター／末端修復ＤＮＡ複合体を形成することであって、各ｄｓＤＮＡプレアダプターが、前記末端修復ＤＮＡの各鎖の３’末端にライゲーションされたライゲーション鎖オリゴヌクレオチドと、非ライゲーションパートナー鎖オリゴヌクレオチドとを含む、前記ライゲーションすること；
    （ｅ）前記プレアダプター／末端修復ＤＮＡ複合体から前記非ライゲーションパートナー鎖オリゴヌクレオチドを離し、修復オリゴヌクレオチドで置き換えてアダプター／末端修復ＤＮＡ複合体を形成することであって、各アダプターが前記ライゲーション鎖オリゴヌクレオチド及び前記修復オリゴヌクレオチドを含む、前記置き換えること；
    （ｆ）前記アダプター／末端修復ＤＮＡ複合体をポリヌクレオチドキナーゼおよびＤＮＡリガーゼで処理して、連続した二重鎖のＤＮＡライブラリーを形成することであって、前記修復オリゴヌクレオチドが、前記末端修復ＤＮＡ断片の各鎖の５’末端に対しライゲーションする、前記処理すること；
    （ｇ）前記ＤＮＡライブラリーを増幅してＤＮＡクローンライブラリーを生成すること；
    （ｈ）前記ＤＮＡクローンライブラリーにおけるゲノム当量数を決定すること；ならびに
    （ｉ）前記ＤＮＡクローンライブラリーにおける遺伝子疾患に関連する１つ以上のバイオマーカーの定量的遺伝子解析を実施することであって、前記１つ以上のバイオマーカーのうちの少なくとも１つの検出または検出失敗が、前記対象に前記遺伝子疾患の治療をすべきかどうかを指示するものである、前記実施すること；
    を含む、前記方法。
  21. 前記ＤＮＡが、ゲノムＤＮＡ、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）試料からのＤＮＡ、ｃＤＮＡ、またはｃｆＤＮＡである、請求項１９または２０に記載の方法。
  22. 前記バイオマーカーが、ヌクレオチドのトランジションもしくはトランスバージョン、ヌクレオチドの挿入もしくは欠失、ゲノム再編成、コピー数の変化、または遺伝子融合から選択される遺伝子病変である、請求項２０に記載の方法。
  23. 前記遺伝子疾患ががんである、請求項１８〜２２のいずれか１項に記載の方法。
JP2018524250A 2015-11-11 2016-11-10 Ｄｎａライブラリーの高効率構築 Active JP6913089B2 (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201562254110P 2015-11-11 2015-11-11
US62/254,110 2015-11-11
PCT/US2016/061395 WO2017083562A1 (en) 2015-11-11 2016-11-10 High efficiency construction of dna libraries

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2021010196A Division JP7223788B2 (ja) 2015-11-11 2021-01-26 Ｄｎａライブラリーの高効率構築

Publications (3)

Publication Number Publication Date
JP2019504618A JP2019504618A (ja) 2019-02-21
JP2019504618A5 JP2019504618A5 (ja) 2019-12-19
JP6913089B2 true JP6913089B2 (ja) 2021-08-04

Family

ID=58695623

Family Applications (4)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2018524250A Active JP6913089B2 (ja) 2015-11-11 2016-11-10 Ｄｎａライブラリーの高効率構築
JP2021010196A Active JP7223788B2 (ja) 2015-11-11 2021-01-26 Ｄｎａライブラリーの高効率構築
JP2022070030A Active JP7318054B2 (ja) 2015-11-11 2022-04-21 Ｄｎａライブラリーの高効率構築
JP2023099273A Pending JP2023113960A (ja) 2015-11-11 2023-06-16 Ｄｎａライブラリーの高効率構築

Family Applications After (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2021010196A Active JP7223788B2 (ja) 2015-11-11 2021-01-26 Ｄｎａライブラリーの高効率構築
JP2022070030A Active JP7318054B2 (ja) 2015-11-11 2022-04-21 Ｄｎａライブラリーの高効率構築
JP2023099273A Pending JP2023113960A (ja) 2015-11-11 2023-06-16 Ｄｎａライブラリーの高効率構築

Country Status (13)

Country Link
US (2) US11339391B2 (ja)
EP (2) EP3374525B1 (ja)
JP (4) JP6913089B2 (ja)
KR (1) KR102788327B1 (ja)
CN (2) CN108431233B (ja)
AU (1) AU2016353133B2 (ja)
CA (1) CA3004435A1 (ja)
DK (1) DK3374525T3 (ja)
ES (1) ES2856598T3 (ja)
IL (2) IL285202B2 (ja)
MX (2) MX2018005858A (ja)
RU (1) RU2018121254A (ja)
WO (1) WO2017083562A1 (ja)

Families Citing this family (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
HK1213944A1 (zh) 2012-12-10 2016-07-15 Resolution Bioscience, Inc. 用於靶向基因组分析
US20160053301A1 (en) 2014-08-22 2016-02-25 Clearfork Bioscience, Inc. Methods for quantitative genetic analysis of cell free dna
JP6913089B2 (ja) 2015-11-11 2021-08-04 レゾリューション バイオサイエンス， インコーポレイテッド Ｄｎａライブラリーの高効率構築
KR102850460B1 (ko) * 2016-08-25 2025-08-27 레졸루션 바이오사이언스, 인크. Dna 샘플 중 게놈 카피 변화의 검출을 위한 방법
CA3068446A1 (en) * 2017-06-30 2019-01-02 The Regents Of The University Of California Methods and systems for evaluating dna methylation in cell-free dna
US11946043B2 (en) 2017-09-11 2024-04-02 Ludwig Institute For Cancer Research Ltd Selective labeling of 5-methylcytosine in circulating cell-free DNA
KR20200085783A (ko) 2017-10-27 2020-07-15 주노 다이어그노스틱스, 인크. 초저용량 액체 생검을 위한 장치, 시스템 및 방법
US11767562B2 (en) 2018-03-08 2023-09-26 St. John's University Circulating serum cell-free DNA biomarkers and methods
US12462935B2 (en) 2018-03-30 2025-11-04 Nucleix Ltd. Deep learning-based methods, devices, and systems for prenatal testing
GB2587939B (en) 2018-04-02 2023-06-14 Grail Llc Methylation markers and targeted methylation probe panels
PL3827011T3 (pl) 2018-07-24 2024-10-14 Salish Bioscience Inc. Sposoby i kompozycje do celowanej analizy genomowej
CA3111887A1 (en) 2018-09-27 2020-04-02 Grail, Inc. Methylation markers and targeted methylation probe panel
US11781169B2 (en) * 2018-10-05 2023-10-10 Microsoft Technology Licensing, Llc Enzymatic DNA repair
CN111074353B (zh) * 2018-10-18 2023-10-13 深圳华大智造科技股份有限公司 全基因组甲基化文库单链建库方法和得到的全基因组甲基化文库
US11926821B2 (en) * 2018-10-22 2024-03-12 The Chinese University Of Hong Kong Cell-free DNA quality
CN109576799B (zh) * 2018-11-30 2022-04-26 深圳安吉康尔医学检验实验室 Fh测序文库的构建方法和引物组及试剂盒
US20220162591A1 (en) * 2019-03-27 2022-05-26 Juno Diagnostics, Inc. Optimized ultra-low volume liquid biopsy methods, systems, and devices
GB202013141D0 (en) * 2020-08-21 2020-10-07 Univ College Cardiff Consultants Ltd A screening method for the detection of DNA damage
AU2021340632A1 (en) * 2020-09-08 2023-03-16 Resolution Bioscience, Inc. Adaptors and methods for high efficiency construction of genetic libraries and genetic analysis
CN114317528A (zh) * 2020-09-30 2022-04-12 北京吉因加科技有限公司 特异分子标签umi组、混合特异分子标签接头及应用
CN114438184B (zh) * 2022-04-08 2022-07-12 昌平国家实验室 游离dna甲基化测序文库构建方法及应用

Family Cites Families (106)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5591582A (en) 1985-07-23 1997-01-07 The Board Of Rijks Universiteit Leiden Methods for detecting activated RAS oncogenes
US5888731A (en) 1995-08-30 1999-03-30 Visible Genetics Inc. Method for identification of mutations using ligation of multiple oligonucleotide probes
AU731069B2 (en) 1997-08-28 2001-03-22 Applied Biosystems, Llc Improved detection of mutations in nucleic acids by chemical cleavage
US6480791B1 (en) 1998-10-28 2002-11-12 Michael P. Strathmann Parallel methods for genomic analysis
US6812341B1 (en) 2001-05-11 2004-11-02 Ambion, Inc. High efficiency mRNA isolation methods and compositions
AU2002365028A1 (en) 2001-07-17 2003-06-30 Stratagene Methods for detection of a target nucleic acid using multi-subunit probes
AU2002322518A1 (en) 2001-08-31 2003-03-18 Rosetta Inpharmactis Llc Methods for preparing nucleic acid samples
US7361821B2 (en) 2002-09-20 2008-04-22 Intel Corporation Controlled alignment of nanobarcodes encoding specific information for scanning probe microscopy (SPM) reading
WO2004053127A1 (ja) * 2002-12-11 2004-06-24 Keio University 対応付け分子およびその構成要素のライブラリーの製造方法および利用方法
TW200506052A (en) 2003-05-07 2005-02-16 Takara Bio Inc Method of analyzing DNA region
US7393665B2 (en) 2005-02-10 2008-07-01 Population Genetics Technologies Ltd Methods and compositions for tagging and identifying polynucleotides
CN101501215A (zh) 2005-07-07 2009-08-05 阿什洛米克斯控股有限公司 用于诊断内毒素血症的多核苷酸标记基因及它们的表达
GB0522310D0 (en) 2005-11-01 2005-12-07 Solexa Ltd Methods of preparing libraries of template polynucleotides
JP5106416B2 (ja) 2006-01-06 2012-12-26 アジレント・テクノロジーズ・インク 濃縮（ｐａｃｋｅｄ）ＤＮＡポリメラーゼを含む核酸複製のための反応緩衝液組成物
WO2007087312A2 (en) 2006-01-23 2007-08-02 Population Genetics Technologies Ltd. Molecular counting
US8383338B2 (en) 2006-04-24 2013-02-26 Roche Nimblegen, Inc. Methods and systems for uniform enrichment of genomic regions
US7754429B2 (en) 2006-10-06 2010-07-13 Illumina Cambridge Limited Method for pair-wise sequencing a plurity of target polynucleotides
US8568979B2 (en) 2006-10-10 2013-10-29 Illumina, Inc. Compositions and methods for representational selection of nucleic acids from complex mixtures using hybridization
US12180549B2 (en) 2007-07-23 2024-12-31 The Chinese University Of Hong Kong Diagnosing fetal chromosomal aneuploidy using genomic sequencing
US8067164B2 (en) 2007-08-12 2011-11-29 Integrated Dna Technologies, Inc. Microarray system with improved sequence specificity
US9388457B2 (en) 2007-09-14 2016-07-12 Affymetrix, Inc. Locus specific amplification using array probes
EP2227563B1 (en) * 2007-12-05 2012-06-06 Complete Genomics, Inc. Efficient base determination in sequencing reactions
WO2009091798A1 (en) 2008-01-16 2009-07-23 Helicos Biosciences Corporation Quantitative genetic analysis
US8202691B2 (en) 2008-01-25 2012-06-19 Illumina, Inc. Uniform fragmentation of DNA using binding proteins
WO2011025477A1 (en) 2009-08-25 2011-03-03 Illumina, Inc. Methods for selecting and amplifying polynucleotides
CN102203273A (zh) * 2008-09-09 2011-09-28 生命技术公司 生成基因特异性的文库的方法
US8383345B2 (en) 2008-09-12 2013-02-26 University Of Washington Sequence tag directed subassembly of short sequencing reads into long sequencing reads
US8728764B2 (en) 2008-10-02 2014-05-20 Illumina Cambridge Limited Nucleic acid sample enrichment for sequencing applications
WO2010068856A1 (en) 2008-12-11 2010-06-17 Trustees Of Boston University Isolation of rna
EP2789694A1 (en) 2009-04-02 2014-10-15 Fluidigm Corporation Microfluidic device with reaction product recovery system
WO2010127186A1 (en) 2009-04-30 2010-11-04 Prognosys Biosciences, Inc. Nucleic acid constructs and methods of use
US20110003301A1 (en) 2009-05-08 2011-01-06 Life Technologies Corporation Methods for detecting genetic variations in dna samples
US9315857B2 (en) 2009-12-15 2016-04-19 Cellular Research, Inc. Digital counting of individual molecules by stochastic attachment of diverse label-tags
US8835358B2 (en) 2009-12-15 2014-09-16 Cellular Research, Inc. Digital counting of individual molecules by stochastic attachment of diverse labels
US10388403B2 (en) 2010-01-19 2019-08-20 Verinata Health, Inc. Analyzing copy number variation in the detection of cancer
US10378064B1 (en) 2010-04-16 2019-08-13 Chronix Biomedical Analyzing circulating nucleic acids to identify a biomarker representative of cancer presented by a patient population
US9677118B2 (en) 2014-04-21 2017-06-13 Natera, Inc. Methods for simultaneous amplification of target loci
US8828688B2 (en) 2010-05-27 2014-09-09 Affymetrix, Inc. Multiplex amplification methods
CN103119439A (zh) 2010-06-08 2013-05-22 纽亘技术公司 用于多重测序的方法和组合物
EP2426217A1 (en) 2010-09-03 2012-03-07 Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS) Analytical methods for cell free nucleic acids and applications
CN103228798B (zh) 2010-09-24 2015-12-09 斯坦福大学托管董事会 使用固定的引物直接捕获、扩增及测序靶标dna
CN114678128B (zh) 2010-11-30 2026-01-09 香港中文大学 与癌症相关的遗传或分子畸变的检测
EP3564395B1 (en) 2010-12-30 2025-06-25 Foundation Medicine, Inc. Optimization of multigene analysis of tumor samples
CA2824387C (en) 2011-02-09 2019-09-24 Natera, Inc. Methods for non-invasive prenatal ploidy calling
US9260753B2 (en) 2011-03-24 2016-02-16 President And Fellows Of Harvard College Single cell nucleic acid detection and analysis
PT3078752T (pt) 2011-04-12 2018-11-22 Verinata Health Inc Resolução de fracções do genoma utilizando contagens de polimorfismos
PL3246416T3 (pl) 2011-04-15 2024-09-30 The Johns Hopkins University Bezpieczny system sekwencjonowania
WO2013056178A2 (en) 2011-10-14 2013-04-18 Foundation Medicine, Inc. Novel estrogen receptor mutations and uses thereof
CN103103624B (zh) * 2011-11-15 2014-12-31 深圳华大基因科技服务有限公司 高通量测序文库的构建方法及其应用
US10227587B2 (en) 2012-01-10 2019-03-12 Berry Genomics Co., Ltd. Method for constructing a plasma DNA sequencing library
US9892230B2 (en) 2012-03-08 2018-02-13 The Chinese University Of Hong Kong Size-based analysis of fetal or tumor DNA fraction in plasma
DK2828218T3 (da) 2012-03-20 2020-11-02 Univ Washington Through Its Center For Commercialization Methods of lowering the error rate of massively parallel dna sequencing using duplex consensus sequencing
US20130288915A1 (en) 2012-04-27 2013-10-31 Htg Molecular Diagnostics, Inc. Compositions and methods for alk molecular testing
AU2013267609C1 (en) 2012-05-31 2019-01-03 Board Of Regents, The University Of Texas System Method for accurate sequencing of DNA
ES2769796T3 (es) 2012-07-03 2020-06-29 Integrated Dna Tech Inc Oligonucleótidos de bloqueo aumentados en Tm y señuelos para un enriquecimiento de diana mejorado y una selección fuera de diana reducida
PT2880447T (pt) 2012-07-31 2019-08-02 Novartis Ag Marcadores associados à sensibilidade a inibidores de minuto duplo humano 2 (mdm2)
AU2013296237B2 (en) 2012-08-03 2019-05-16 Foundation Medicine, Inc. Human papilloma virus as predictor of cancer prognosis
US10876152B2 (en) 2012-09-04 2020-12-29 Guardant Health, Inc. Systems and methods to detect rare mutations and copy number variation
US20160040229A1 (en) 2013-08-16 2016-02-11 Guardant Health, Inc. Systems and methods to detect rare mutations and copy number variation
IL269097B2 (en) 2012-09-04 2024-01-01 Guardant Health Inc Systems and methods to detect rare mutations and copy number variation
CA2886605A1 (en) 2012-09-28 2014-04-03 Cepheid Two-primer pcr for microrna multiplex assay
WO2014055790A2 (en) 2012-10-04 2014-04-10 Sequenom, Inc. Methods and processes for non-invasive assessment of genetic variations
US10482994B2 (en) 2012-10-04 2019-11-19 Sequenom, Inc. Methods and processes for non-invasive assessment of genetic variations
WO2014071295A1 (en) 2012-11-02 2014-05-08 Enzymatics Inc. Methods and kits for nucleic acid sample preparation for sequencing
AU2013337277B2 (en) 2012-11-05 2018-03-08 Foundation Medicine, Inc. Novel NTRK1 fusion molecules and uses thereof
HK1213944A1 (zh) 2012-12-10 2016-07-15 Resolution Bioscience, Inc. 用於靶向基因组分析
EP2931922B1 (en) 2012-12-14 2018-10-17 Chronix Biomedical Personalized biomarkers for cancer
US11158425B2 (en) 2013-01-05 2021-10-26 Foundation Medicine, Inc. System and method for managing genomic information
WO2014116881A1 (en) 2013-01-23 2014-07-31 Reproductive Genetics And Technology Solutions, Llc Compositions and methods for genetic analysis of embryos
US10745686B2 (en) 2013-02-08 2020-08-18 Qiagen Gmbh Method for separating DNA by size
EP2971097B1 (en) 2013-03-15 2018-08-01 Verinata Health, Inc Generating cell-free dna libraries directly from blood
EP3795696B1 (en) 2013-03-15 2023-04-26 The Board of Trustees of the Leland Stanford Junior University Identification and use of circulating nucleic acid tumor markers
CA2912059A1 (en) 2013-05-10 2014-11-13 Foundation Medicine, Inc. Analysis of genetic variants
US20150072344A1 (en) 2013-09-10 2015-03-12 Imdaptive Incorporated Barcoded Universal Marker Indicator (BUMI) Tags
US10851414B2 (en) 2013-10-18 2020-12-01 Good Start Genetics, Inc. Methods for determining carrier status
WO2015073711A1 (en) 2013-11-13 2015-05-21 Nugen Technologies, Inc. Compositions and methods for identification of a duplicate sequencing read
CN103668471B (zh) * 2013-12-19 2015-09-30 上海交通大学 一种构建dna高通量测序文库的方法及其配套试剂盒
EP3378952B1 (en) 2013-12-28 2020-02-05 Guardant Health, Inc. Methods and systems for detecting genetic variants
KR102482592B1 (ko) * 2014-01-31 2022-12-30 인티그레이티드 디엔에이 테크놀로지스 아이엔씨. Dna 기질을 처리하는 개선 방법
WO2015134552A1 (en) 2014-03-03 2015-09-11 Swift Biosciences, Inc. Enhanced adaptor ligation
US10975371B2 (en) 2014-04-29 2021-04-13 Illumina, Inc. Nucleic acid sequence analysis from single cells
MX2016016904A (es) 2014-06-26 2017-03-27 10X Genomics Inc Analisis de secuencias de acidos nucleicos.
JP6803327B2 (ja) 2014-08-06 2020-12-23 ニューゲン テクノロジーズ， インコーポレイテッド 標的化されたシークエンシングからのデジタル測定値
US20160053301A1 (en) 2014-08-22 2016-02-25 Clearfork Bioscience, Inc. Methods for quantitative genetic analysis of cell free dna
HUE068191T2 (hu) * 2014-08-22 2024-12-28 Resolution Bioscience Inc A sejtmentes dns kvantitatív genetikai elemzésére szolgáló eljárások
EP3842544A1 (en) * 2014-09-05 2021-06-30 QIAGEN GmbH Preparation of adapter-ligated amplicons
ES2925014T3 (es) * 2014-09-12 2022-10-13 Univ Leland Stanford Junior Identificación y uso de ácidos nucleicos circulantes
AU2014406026B2 (en) * 2014-09-12 2018-08-23 Mgi Tech Co., Ltd. Isolated oligonucleotide and use thereof in nucleic acid sequencing
WO2016090273A1 (en) 2014-12-05 2016-06-09 Foundation Medicine, Inc. Multigene analysis of tumor samples
EP3567120B1 (en) 2014-12-12 2020-08-19 Verinata Health, Inc. Using cell-free dna fragment size to determine copy number variations
EP3240911B1 (en) 2014-12-31 2020-08-26 Guardant Health, Inc. Detection and treatment of disease exhibiting disease cell heterogeneity and systems and methods for communicating test results
JP6829211B2 (ja) 2015-02-10 2021-02-10 ザ チャイニーズ ユニバーシティ オブ ホンコン 癌スクリーニング及び胎児分析のための変異検出
PT3325664T (pt) 2015-07-23 2022-03-03 Univ Hong Kong Chinese Análise de padrões de fragmentação de adn sem células
EP4462438A3 (en) 2015-10-09 2025-02-26 Guardant Health, Inc. Population based treatment recommender using cell free dna
US20180300449A1 (en) 2015-10-10 2018-10-18 Guardant Health, Inc. Methods and applications of gene fusion detection in cell-free dna analysis
JP6913089B2 (ja) 2015-11-11 2021-08-04 レゾリューション バイオサイエンス， インコーポレイテッド Ｄｎａライブラリーの高効率構築
US10095831B2 (en) 2016-02-03 2018-10-09 Verinata Health, Inc. Using cell-free DNA fragment size to determine copy number variations
AU2017225876B2 (en) 2016-02-29 2021-03-04 Foundation Medicine, Inc. Methods and systems for evaluating tumor mutational burden
US11708574B2 (en) 2016-06-10 2023-07-25 Myriad Women's Health, Inc. Nucleic acid sequencing adapters and uses thereof
KR102850460B1 (ko) 2016-08-25 2025-08-27 레졸루션 바이오사이언스, 인크. Dna 샘플 중 게놈 카피 변화의 검출을 위한 방법
US9850523B1 (en) 2016-09-30 2017-12-26 Guardant Health, Inc. Methods for multi-resolution analysis of cell-free nucleic acids
KR20240155386A (ko) 2016-09-30 2024-10-28 가던트 헬쓰, 인크. 무세포 핵산의 다중-해상도 분석 방법
IL266654B2 (en) * 2016-11-17 2024-03-01 Lgc Clinical Diagnostics Inc Methods for preparing dna reference material and controls
US11268137B2 (en) 2016-12-09 2022-03-08 Boreal Genomics, Inc. Linked ligation
CN110546272B (zh) 2017-04-14 2024-06-07 夸登特健康公司 将衔接子附接至样品核酸的方法
WO2020106906A1 (en) 2018-11-21 2020-05-28 Avida Biomed, Inc. Methods for targeted nucleic acid library formation

Also Published As

Publication number Publication date
KR20180113973A (ko) 2018-10-17
IL285202B2 (en) 2025-03-01
WO2017083562A1 (en) 2017-05-18
US20180245072A1 (en) 2018-08-30
US20220267763A1 (en) 2022-08-25
EP3374525A1 (en) 2018-09-19
JP2022105062A (ja) 2022-07-12
JP7223788B2 (ja) 2023-02-16
CA3004435A1 (en) 2017-05-18
KR102788327B1 (ko) 2025-03-27
JP2021073252A (ja) 2021-05-13
CN115044645A (zh) 2022-09-13
IL285202A (en) 2021-08-31
IL259237B (en) 2021-08-31
MX2023008338A (es) 2023-07-25
BR112018009606A8 (pt) 2019-02-26
EP3374525A4 (en) 2019-05-29
IL259237A (en) 2018-07-31
US11339391B2 (en) 2022-05-24
AU2016353133B2 (en) 2022-12-08
MX2018005858A (es) 2019-02-20
ES2856598T3 (es) 2021-09-27
EP3889257A1 (en) 2021-10-06
BR112018009606A2 (pt) 2018-11-06
EP3374525B1 (en) 2021-01-20
JP2019504618A (ja) 2019-02-21
JP7318054B2 (ja) 2023-07-31
CN108431233A (zh) 2018-08-21
CN108431233B (zh) 2022-04-01
JP2023113960A (ja) 2023-08-16
AU2016353133A1 (en) 2018-05-24
IL285202B1 (en) 2024-11-01
RU2018121254A (ru) 2019-12-16
NZ742379A (en) 2024-12-20
DK3374525T3 (da) 2021-04-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6913089B2 (ja) Ｄｎａライブラリーの高効率構築
JP6709778B2 (ja) 無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）の定量的遺伝子解析のための方法
KR102505122B1 (ko) Dna 샘플 중 게놈 카피 변화의 검출을 위한 방법
US20240191293A1 (en) Compositions and methods for simultaneous genetic analysis of multiple libraries
ES3045482T3 (en) Adaptors and methods for high efficiency construction of genetic libraries and genetic analysis
JP7441584B2 (ja) 無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）の定量的遺伝子解析のための方法
HK40096223A (en) Adaptors and methods for high efficiency construction of genetic libraries and genetic analysis
HK40096223B (en) Adaptors and methods for high efficiency construction of genetic libraries and genetic analysis
HK40105139A (zh) 用於检测dna样品中基因组拷贝变化的方法
BR112018009606B1 (pt) Método para construir uma biblioteca de dna e de previsão, diagnóstico ou monitoramento de doença genética

Legal Events

Date Code Title Description
A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20191108

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20191108

A977 Report on retrieval

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007

Effective date: 20201021

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20201026

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20210126

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20210615

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20210709

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Ref document number: 6913089

Country of ref document: JP

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150

RD02 Notification of acceptance of power of attorney

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R3D02

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250