JP6910947B2 - 核酸含有脂質ナノ粒子 - Google Patents

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Description

本発明は、例えば、医薬として有用な核酸含有脂質ナノ粒子、および該脂質ナノ粒子の製造方法等に関する。また、本発明は、該脂質ナノ粒子の製造に有用な脂質等に関する。
プラスミドDNA (pDNA)、アンチセンスオリゴデオキシ核酸 (ODN)およびshort interfering RNA (siRNA)等の核酸をin vivoにおいて細胞内へ効率的に送達する手段として、核酸をカチオン性脂質およびその他の脂質と複合体を形成させ、その複合体を投与する方法が知られている。
特許文献1および非特許文献1では、核酸等を含有するリポソームの製造方法として、例えば、乾燥させたカチオン性脂質とsiRNAのクエン酸ナトリウム水溶液および中性脂質とポリエチレングリコール化リン脂質をヘペス緩衝生理食塩水(HEPES [N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N'-(2-ethanesulfonic acid)] Bufferd Saline, 以下、「HBS」)およびエタノールに溶解させた溶液をジエチルエーテルに加えて、油中水型(W/O)エマルジョンを形成させた後、溶液を混和させ、逆相蒸発法で処理してsiRNA内包リポソームを製造する方法が報告されている。
特許文献2および非特許文献2では、ODNを、pH3.8のクエン酸水溶液に溶解し、脂質のエタノール溶液を加え、エタノール濃度を20v/v%まで下げてODN内包リポソームを調製し、サイジング膜でろ過し、透析によって過剰のエタノールを除去した後、試料をさらにpH7.5にて透析してリポソーム表面に付着したODNを除去してODN内包リポソームを製造する方法が報告されている。
また、特許文献3では、例えば、pDNAをクエン酸水溶液に溶解した溶液と、脂質をエタノール中に溶解した溶液とを、T字ミキサーで混和し、エタノール濃度を45v/v%まで下げた後、さらにクエン酸緩衝剤溶液を加えて20v/v%までエタノール濃度を下げることでpDNA内包リポソームを調製し、陰イオン交換樹脂で余ったpDNAを除き、限外ろ過によって、過剰のエタノールを除去してpDNA内包リポソームを製造する方法が報告されている。
さらに、特許文献4では、水を含む有機溶媒中において、pDNAをカチオン性脂質とミセルとして複合体化させ、さらに脂質を追加した後に、透析によって有機溶媒を除去することによってpDNA内包リポソームを製造する方法が報告されている。
特許文献5では、同様に界面活性剤の水溶液中において、pDNAをカチオン性脂質とミセルとして複合体化させ、さらに脂質を追加した後に、透析によって界面活性剤を除去することによってpDNA内包リポソームを製造する方法が報告されている。
上記の複合体形成に用いるカチオン性脂質は、通常１〜複数本の炭化水素基を含む脂質親和性領域と、少なくとも一つの1級アミン、2級アミン、3級アミンまたは4級アンモニウム基を含むカチオン性の親水性領域を有する両親媒性分子であるが、2つの炭化水素基を有するものが汎用される。
一方で特許文献6では3つの炭化水素基を有するカチオン性脂質を、2つの炭化水素基を有するカチオン性脂質の代わりに用いて、特許文献3と同様の方法で粒子径が82-95 nmの脂質粒子が得られたと開示されている。この文献中で、3つの炭化水素基を有するカチオン性脂質として具体的には
Figure 0006910947
 で表される１３−Ｂ２等が開示されている。
これらの方法で作成された核酸封入リポソームは約50-100 nmのサイズを有している。
一方、非特許文献2では、粒子径30-100 nmのジクロロ（1，2‐ジアミノシクロヘキサン）白金（II）を封入したポリマーミセルを用いた試験で、より小さい粒子径を有するポリマーミセルほど腫瘍への送達量がより多く、抗腫瘍効果がより強いことを報告している。また、非特許文献3では量子ドットを用いた浸透性評価実験により、100 nmの量子ドットに比べて10 nmの量子ドットの方が腫瘍内で広く分布することが報告されている。すなわち、脂質粒子においても、腫瘍への効率のよい送達にはより小さい粒子径が求められているが、前述のいずれの方法でもより小さい粒子径を有する安定性の高い脂質粒子を効率的に調製することは困難であった。
このような中で、特許文献7および非特許文献4〜7では、エタノール中にカチオン性脂質と中性脂質とポリエチレングリコール化脂質を溶解させた溶液と酢酸緩衝液に溶解させたsiRNAをヘリッジボーン構造であるマイクロフルイディクスにより混合し、エタノールを除去することでsiRNA含有脂質ナノ粒子が得られることを報告している。該方法においては、極性有機溶媒中のカチオン性脂質が核酸と静電的相互作用を起こすことにより核酸を内封した逆ミセル構造を経るのと並行して、極性有機溶媒の割合が減少することで核酸を有する逆ミセル構造が脂質膜で被覆された脂質ナノ粒子が製造されている。該脂質ナノ粒子の粒子径は脂質が溶解した極性有機溶媒と核酸を溶解した水溶液をマイクロフルイディクスに流す速度やPEG含有量によって変動するが、非常に小さいことが報告されている。この方法で得られたsiRNA封入リポソームは、静脈内だけでなく皮下に投与した場合でも肝臓で薬効を発現したと報告されている。
米国特許出願公開第2013/0149374号明細書 特表2002-501511号公報 国際公開第2004/002453号 国際公開第96/40964号 米国特許出願公開第2010/0041152号明細書 米国特許出願公開第2012/0172411号明細書 国際公開2011/140627号
バイオキミカ エト バイオフィジカ アクタ（Biochimica et Biophysica Acta）， 2012年, 第1818巻, 1633-1641頁 バイオキミカ エト バイオフィジカ アクタ（Biochimica et Biophysica Acta）, 2001年， 第1510巻, 152-166頁 プロシーディングズ オブ ザ ナショナル アカデミー オブ サイエンス（Proceedings of the National Academy of Sciences）, 2011年， 第108巻, 第6号, 2426-2431頁 ザ ジャーナル オブ フィジカル ケミストリー（The Journal of Physical Chemistry）, 2012年， 第116巻, 18440-18450頁 モレキュラ― セラピー−ヌクレイック アシッズ（Molecular therapy-Nucleic acids）, 2012年， 第1巻, e37 ラングミュア（Langmuir）, 2012年， 第28巻, 3633-3640頁 ジャーナル オブ コントロールド リリース（Journal of Controlled Release）, 2014年， 第196巻， 106-112頁
本発明の目的は、医薬として有用で、従来の粒子に比して、安定かつ小型化された核酸含有脂質ナノ粒子、および該脂質ナノ粒子の製造方法等を提供することにある。また、本発明の目的は、該脂質ナノ粒子の製造に有用な脂質等を提供することである。
本発明は以下の(1)〜(91)に関する。
(1)
1つの4級アンモニウム基を有する親水部および置換基を有していても良い独立した3つの炭化水素基を有する脂質(脂質A)、水溶性高分子の脂質誘導体または脂肪酸誘導体、ならびに核酸を含む、核酸含有脂質ナノ粒子。
(2)
脂質A中の4級アンモニウム基のモル数が核酸中のリン原子のモル数に対して0.01倍モル量以上である、(1)記載の脂質ナノ粒子。
(3)
脂質Aが、
式(I)
Figure 0006910947
 （式中、
R1〜R3は同一または異なって直鎖もしくは分枝状の置換されていても良いC8-C24アルキル、C8-C24アルケニルまたはC8-C24アルキニルであり、
L1〜L3は同一または異なって存在しないか、-Z1-(CY1Y2)p1-または-Z2-(CY3Y4)p2-Z3-(CY5Y6)p3-（式中、Y1〜Y6は同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルであり、Z1〜Z3は同一または異なって、-O-、-NY7A-、-CO-O-、-O-CO-、-CO-NY7B-、-NY7C-CO-または-NY7D-CO-0-であり（式中、Y7A〜Y7Dは同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルである）、p1〜p3は同一または異なって1〜5の整数である）であり、
X1は置換されていても良いC1-C4アルキルであり、
A1は薬学的に許容される陰イオンである）、
式(II)
Figure 0006910947
 （式中、
R4〜R6は同一または異なって直鎖もしくは分枝状の置換されていても良いC8-C24アルキル、C8-C24アルケニルまたはC8-C24アルキニルであり、
L4〜L6は同一または異なって存在しないか、-Z4-(CY8Y9)p4-または-Z5-(CY10Y11)p5-Z6-(CY12Y13)p6-（式中、Y8〜Y13は同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルであり、Z4〜Z6は同一または異なって、-O-、-NY14A-、-CO-O-、-O-CO-、-CO-NY14B-、-NY14C-CO-または-NY14D-CO-0-であり（式中、Y14A〜Y14Dは同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルである）、p4は0〜5の整数であり、p5は1〜5の整数であり、p6は0〜5の整数である）であり、
L7は存在しないか、-(CY15Y16)p7-、-(CY17Y18)p8-Z7-(CY19Y20)p9-または-(CY21Y22)p10-Z8-(CY23Y24)p11-Z9-(CY25Y26)p12-（式中、Y15〜Y26は同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルであり、Z7〜Z9は同一または異なって、-O-、-NY27A-、-CO-O-、-O-CO-、-CO-NY27B-、-NY27C-CO-または-NY27D-CO-0-であり（式中、Y27A〜Y27Dは同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルである）、p7は1〜5の整数であり、p8は0〜5の整数であり、p9は1〜5の整数であり、p10は0〜5の整数であり、p11は1〜5の整数であり、p12は1〜5の整数である）であり、
B1は、
Figure 0006910947
 （式中、X2およびX3は同一または異なって置換されていても良いC1-C4アルキルであるか、または一緒になって隣接する窒素原子とともに置換されていても良いC4-C6ヘテロ環を形成し、X4は置換されていても良いC1-C4アルキルであり、X5およびX6は同一または異なって置換されていても良いC1-C4アルキルであるか、または一緒になって隣接する窒素原子とともに置換されていても良いC4-C6ヘテロ環を形成し、X7は置換されていても良いC1-C4アルキルであり、Y28〜Y37は同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルであり、Z10およびZ11は同一または異なって-O-、-NY38A-、-CO-O-、-O-CO-、-CO-NY38B-、-NY38C-CO-または-NY38D-CO-0-であり（式中、Y38A〜Y38Dは同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルである）、p13は0〜5の整数であり、p14〜p17は同一または異なって1〜5の整数である）であり、
A2は薬学的に許容される陰イオンである）、
式(III)
Figure 0006910947
 （式中、
R7〜R9は同一または異なって直鎖もしくは分枝状の置換されていても良いC8-C24アルキル、C8-C24アルケニルまたはC8-C24アルキニルであり、
L8〜L10は同一または異なって存在しないか、-Z12-(CY39Y40)p18-または-Z13-(CY41Y42)p19-Z14-(CY43Y44)p20-（式中、Y39〜Y44は同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルであり、Z12〜Z14は同一または異なって、-O-、-NY45A-、-CO-O-、-O-CO-、-CO-NY45B-、-NY45C-CO-、-NY45D-CO-0-または-CO-であり（式中、Y45A〜Y45Dは同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルである）、p18は0〜5の整数であり、p19は1〜5の整数であり、p20は0〜5の整数である）であり、
L11は存在しないか、-(CY46Y47)p21-、-(CY48Y49)p22-Z15-(CY50Y51)p23-または-(CY52Y53)p24-Z16-(CY54Y55)p25-Z17-(CY56Y57)p26-（式中、Y46〜Y57は同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルであり、Z15〜Z17は同一または異なって、-O-、-NY58A-、-CO-O-、-O-CO-、-CO-NY58B-、-NY58C-CO-、-NY58D-CO-0-または-CO-であり（式中、Y58A〜Y58Dは同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルである）、p21は1〜5の整数であり、p22は0〜5の整数であり、p23は1〜5の整数であり、p24は0〜5の整数であり、p25は1〜5の整数であり、p26は1〜5の整数である）であり、
L12は存在しないか、-(CY59Y60)p27-、-(CY61Y62)p28-Z18-(CY63Y64)p29-または-(CY65Y66)p30-Z19-(CY67Y68)p31-Z20-(CY69Y70)p32-（式中、Y59〜Y70は同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルであり、Z18〜Z20は同一または異なって、-O-、-NY71A-、-CO-O-、-O-CO-、-CO-NY71B-、-NY71C-CO-、-NY71D-CO-0-または-CO-であり（式中、Y71A〜Y71Dは同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルである）、p27は1〜5の整数であり、p28は0〜5の整数であり、p29は0〜5の整数であり、p30は0〜5の整数であり、p31は1〜5の整数であり、p32は0〜5の整数である）であり、
J1およびJ2は同一または異なってCY72またはN(式中、Y72は水素原子、ヒドロキシ、置換されていても良いC1-C4アルキル、置換されていても良いC1-C4アルコキシ、または置換されていても良いC1-C4アシルオキシである)であり、
B2は、
Figure 0006910947
 （式中、X8およびX9は同一または異なって置換されていても良いC1-C4アルキルであるか、または一緒になって隣接する窒素原子とともに置換されていても良いC4-C6ヘテロ環を形成し、X10は置換されていても良いC1-C4アルキルであり、X11およびX12は同一または異なって置換されていても良いC1-C4アルキルであるか、または一緒になって隣接する窒素原子とともに置換されていても良いC4-C6ヘテロ環を形成し、X13は置換されていても良いC1-C4アルキルであり、Y73〜Y82は同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルであり、Z21およびZ22は同一または異なって-O-、-NY83A-、-CO-O-、-O-CO-、-CO-NY83B-、-NY83C-CO-または-NY83D-CO-0-であり（式中、Y83A〜Y83Dは同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルである）、p33は0〜5の整数であり、p34〜p37は同一または異なって1〜5の整数である）であり、
A3は薬学的に許容される陰イオンである）、
式(IV)
Figure 0006910947
 （式中、
R10〜R12は同一または異なって直鎖もしくは分枝状の置換されていても良いC8-C24アルキル、C8-C24アルケニルまたはC8-C24アルキニルであり、
L13は存在しないか、-Z23-(CY83Y84)p38-または-Z24-(CY85Y86)p39-Z25-(CY87Y88)p40-（式中、Y83〜Y88は同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルであり、Z23〜Z25は同一または異なって、-O-、-NY89A-、-CO-O-、-O-CO-、-CO-NY89B-、-NY89C-CO-または-NY89D-CO-0-であり（式中、Y89A〜Y89Dは同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルである）、p38〜p40は同一または異なって1〜5の整数である）であり、
L14およびL15は同一または異なって存在しないか、-Z26-(CY90Y91)p41-または-Z27-(CY92Y93)p42-Z28-(CY94Y95)p43-（式中、Y90〜Y95は同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルであり、Z26〜Z28は同一または異なって、-O-、-NY96A-、-CO-O-、-O-CO-、-CO-NY96B-、-NY96C-CO-、-NY96D-CO-0-または-CO-であり（式中、Y96A〜Y96Dは同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルである）、p41は0〜5の整数であり、p42は1〜5の整数であり、p43は0〜5の整数である）であり、
L16は存在しないか、-(CY97Y98)p44-、-(CY99Y100)p45-Z29-(CY101Y102)p46-または-(CY103Y104)p47-Z30-(CY105Y106)p48-Z31-(CY107Y108)p49-（式中、Y97〜Y108は同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルであり、Z29〜Z31は同一または異なって、-O-、-NY109A-、-CO-O-、-O-CO-、-CO-NY109B-、-NY109C-CO-、-NY109D-CO-0-または-CO-であり（式中、Y109A〜Y109Dは同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルである）、p44は1〜5の整数であり、p45は0〜5の整数であり、p46は1〜5の整数であり、p47は0〜5の整数であり、p48は1〜5の整数であり、p49は1〜5の整数である）であり、
J3はCY110またはN(式中、Y110は水素原子、ヒドロキシ、置換されていても良いC1-C4アルキル、置換されていても良いC1-C4アルコキシ、または置換されていても良いC1-C4アシルオキシである)であり、
X14およびX15は同一または異なって置換されていても良いC1-C4アルキルであるか、または一緒になって隣接する窒素原子とともに置換されていても良いC4-C6ヘテロ環を形成し、
A4は薬学的に許容される陰イオンである）、または
式(V’)もしくは式(V’’)
Figure 0006910947
 （式中、
R13〜R18は同一または異なって直鎖もしくは分枝状の置換されていても良いC8-C24アルキル、C8-C24アルケニルまたはC8-C24アルキニルであり、
Y111〜Y114は同一または異なって水素原子、ヒドロキシまたは置換されていても良いC1-C4アルキルであり、
L17〜L19およびL22〜L24は同一または異なって存在しないか、-Z32-(CY115Y116)p51-または-Z33-(CY117Y118)p52-Z34-(CY119Y120)p53-（式中、Y115〜Y120は同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルであり、Z32〜Z34は同一または異なって、-O-、-NY121A-、-CO-O-、-O-CO-、-CO-NY121B-、-NY121C-CO-、-NY121D-CO-0-または-CO-であり（式中、Y121A〜Y121Dは同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルである）、p51は0〜5の整数であり、p52は1〜5の整数であり、p53は0〜5の整数である）であり、
L20およびL25は同一または異なって存在しないか、-(CY122Y123)p54-、-(CY124Y125)p55-Z35-(CY126Y127)p56-または-(CY128Y129)p57-Z36-(CY130Y131)p58-Z37-(CY132Y133)p59-（式中、Y122〜Y133は同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルであり、Z35〜Z37は同一または異なって、-O-、-NY134A-、-CO-O-、-O-CO-、-CO-NY134B-、-NY134C-CO-、-NY134D-CO-0-または-CO-であり（式中、Y134A〜Y134Dは同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルである）、p54は1〜5の整数であり、p55は0〜5の整数であり、p56は1〜5の整数であり、p57は0〜5の整数であり、p58は1〜5の整数であり、p59は1〜5の整数である）であり、
L21およびL26は同一または異なって存在しないか、-(CY135Y136)p60-、-(CY137Y138)p61-Z38-(CY139Y140)p62-または-(CY141Y142)p63-Z39-(CY143Y144)p64-Z40-(CY145Y146)p65-（式中、Y135〜Y146は同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルであり、Z38〜Z40は同一または異なって、-O-、-NY147A-、-CO-O-、-O-CO-、-CO-NY147B-、-NR147C-CO-、-NY147D-CO-0-または-CO-であり（式中、Y147A〜Y147Dは同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルである）、p60は1〜5の整数であり、p61は0〜5の整数であり、p62は0〜5の整数であり、p63は0〜5の整数であり、p64は1〜5の整数であり、p65は0〜5の整数である）であり、
B3およびB4は同一または異なって、
Figure 0006910947
 （式中、X16およびX17は同一または異なって置換されていても良いC1-C4アルキルであるか、または一緒になって隣接する窒素原子とともに置換されていても良いC4-C6ヘテロ環を形成し、X18は置換されていても良いC1-C4アルキルであり、X19およびX20は同一または異なって置換されていても良いC1-C4アルキルであるか、または一緒になって隣接する窒素原子とともに置換されていても良いC4-C6ヘテロ環を形成し、X21は置換されていても良いC1-C4アルキルであり、Y148〜Y157は同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルであり、Z41およびZ42は同一または異なって-O-、-NY158A-、-CO-O-、-O-CO-、-CO-NY158B-、-NY158C-CO-または-NY158D-CO-0-であり（式中、Y158A〜Y158Dは同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルである）、p66は0〜5の整数であり、p67〜p70は同一または異なって1〜5の整数である）であり、
A5およびA6は同一または異なって薬学的に許容される陰イオンである）
で表される脂質またはそれらの組み合わせである、(1)または(2)記載の脂質ナノ粒子。
(4)
脂質Aが式（I）で表される脂質であり、式(I)において、L1〜L3のうち1つが-CO-O-(CY1Y2)p1-または-O-CO-(CY1Y2)p1-であるか、L1〜L3のうち2つ以上が同一または異なって-CO-O-(CY1Y2)p1-または-O-CO-(CY1Y2)p1-であり、R1〜R3が直鎖または分枝状のC15-C20アルケニルまたはC9-C18アルキルであり、かつ同一である、(3)記載の脂質ナノ粒子。
(5)
脂質Aが式（II）で表される脂質であり、式(II)において、L4〜L6のうち1つが-CO-O-(CY8Y9)p4-、-O-CO-(CY8Y9)p4-、または-O-CO-(CY10Y11)p5-O-(CY12Y13)p6-であるか、L4〜L6のうち2つ以上が同一または異なって-CO-O-(CY8Y9)p4-、-O-CO-(CY8Y9)p4-、または-O-CO-(CY10Y11)p5-O-(CY12Y13)p6-であり、R4〜R6が直鎖または分枝状のC15-C20アルケニルまたはC9-C18アルキルであり、かつ同一である、(3)記載の脂質ナノ粒子。
(6)
脂質Aが式（III）で表される脂質であり、式(III)において、L8〜L10のうち1つが-CO-O-(CY39Y40)p18-または-O-CO-(CY39Y40)p18-であるか、L8〜L10のうち2つ以上が同一または異なって-CO-O-(CY39Y40)p18または-O-CO-(CY39Y40)p18-であり、R7〜R9が直鎖または分枝状のC15-C20アルケニルまたはC9-C18アルキルである、(3)記載の脂質ナノ粒子。
(7)
脂質Aが式（IV）で表される脂質であり、式(IV)において、L13が-CO-O-(CY83Y84)p38-あるいは-O-CO-(CY83Y84)p38-であるか、L14およびL15のうち1つが-CO-O-(CY90Y91)p41-あるいは-O-CO-(CY90Y91)p41-であるか、L13が-CO-O-(CY83Y84)p38-あるいは-O-CO-(CY83Y84)p38-であり、かつL14およびL15のうち1つが-CO-O-(CY90Y91)p41-あるいは-O-CO-(CY90Y91)p41-であるか、L14およびL15が同一あるいは異なって-CO-O-(CY90Y91)p41-あるいは-O-CO-(CY90Y91)p41-であるか、またはL13が-CO-O-(CY83Y84)p38-あるいは-O-CO-(CY83Y84)p38-であり、かつL14およびL15が同一あるいはは異なって-CO-O-(CY90Y91)p41-または-O-CO-(CY90Y91)p41-であり、R10〜R12が直鎖または分枝状のC15-C20アルケニルまたはC9-C18アルキルである、(3)記載の脂質ナノ粒子。
(8)
脂質Aが式（V’）で表される脂質であり、式(V’)において、L17〜L19のうち1つが-CO-O-または-O-であるか、L17〜L19のうち2つ以上が同一または異なって-CO-O-または-O-であり、R13〜R15が直鎖または分枝状のC15-C20アルケニルまたはC9-C18アルキルである、(3)記載の脂質ナノ粒子。
(9)
水溶性高分子の脂質誘導体または脂肪酸誘導体の含有量が総脂質のモル数に対して0.005倍モル量以上である、(1)〜(8)のいずれか1項に記載の脂質ナノ粒子。
(10)
水溶性高分子の脂質誘導体または脂肪酸誘導体の水溶性高分子部分が、ポリエチレングリコール、ポリグリセリン、ポリエチレンイミン、ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸およびポリアクリルアミドからなる群より選ばれる、(1)〜(9)のいずれか1項に記載の脂質ナノ粒子。
(11)
核酸のモル数に対する総脂質のモル数の比率（総脂質のモル数／核酸のモル数）が50以上である、(1)〜(10)のいずれか1項に記載の脂質ナノ粒子。
(12)
核酸がRNA干渉(RNAi)を利用した標的遺伝子の発現抑制作用を有する核酸である、(1)〜(11)のいずれか1項に記載の脂質ナノ粒子。
(13)
標的遺伝子が、腫瘍または炎症に関連する遺伝子である、(12)記載の脂質ナノ粒子。
(14)
置換基を有していても良い1つのアミノ基または1つの4級アンモニウム基を有する親水部および置換基を有していても良い独立した2つの炭化水素基を有する疎水部を有する脂質(脂質B)をさらに含む、(1)〜(13)のいずれか1項に記載の脂質ナノ粒子。
(15)
脂質Bの含有量が総脂質のモル数に対して0.1倍モル量以上である、(14)記載の脂質ナノ粒子。
(16)
脂質B中の親水部のアミノ基または4級アンモニウム基のモル数が核酸中のリン酸原子のモル数に対して0.01倍モル量以上である、(14)または(15)記載の脂質ナノ粒子。
(17)
脂質Bが、
式(CL-I)
Figure 0006910947
 (式中、
R101およびR102は同一または異なって直鎖もしくは分枝状のC10-C24アルキル、C10-C24アルケニルまたはC10-C24アルキニルであり、
L101およびL102は水素原子であるか、または一緒になって単結合もしくはC1-C3アルキレンを形成し、
L103は単結合、-CO-または-CO-O-であり、
L103が単結合である場合には、
X101は水素原子、C1-C6アルキル、C3-C6アルケニル、ピロリジン-3-イル、ピペリジン-3-イル、ピペリジン-4-イル、または同一もしくは異なって1〜3つのアミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、トリアルキルアンモニオ、ヒドロキシ、アルコキシ、カルバモイル、モノアルキルカルバモイル、ジアルキルカルバモイル、ピロリジニル、ピペリジルもしくはモルホリニルで置換されたC1-C6アルキルもしくはC3-C6アルケニルであり、
L103が-CO-または-CO-O-である場合には、
X101はピロリジン-2-イル、ピロリジン-3-イル、ピペリジン-2-イル、ピペリジン-3-イル、ピペリジン-4-イル、モルホリン-2-イル、モルホリン-3-イル、または同一もしくは異なって1〜3つのアミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、トリアルキルアンモニオ、ヒドロキシ、アルコキシ、カルバモイル、モノアルキルカルバモイル、ジアルキルカルバモイル、ピロリジニル、ピペリジルもしくはモルホリニルで置換されたC1-C6アルキルもしくはC3-C6のアルケニルであり、該置換基の少なくとも1つは、アミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、トリアルキルアンモニオ、ピロリジニル、ピペリジルまたはモルホリニルである)、
式(CL-II)
Figure 0006910947
 (式中、
R103およびR104は同一または異なって直鎖もしくは分枝状のC12-C24アルキル、C12-C24アルケニルまたはC12-C24アルキニルであり、
p101およびp102は同一または異なって0〜3の整数であり、
L106およびL107は水素原子であるか、または一緒になって単結合もしくはC1-C3アルキレンを形成し、
L104およびL105は同一または異なって-O-、-CO-O-または-O-CO-であり、
L108は単結合、-CO-または-CO-O-であり、
L108が単結合である場合には、
X102は水素原子、C1-C6アルキル、C3-C6アルケニル、ピロリジン-2-イル、ピロリジン-3-イル、ピペリジン-3-イル、ピペリジン-4-イル、または同一もしくは異なって1〜3つのアミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、トリアルキルアンモニオ、ヒドロキシ、アルコキシ、カルバモイル、モノアルキルカルバモイル、ジアルキルカルバモイル、ピロリジニル、ピペリジルもしくはモルホリニルで置換されたC1-C6アルキルもしくはC3-C6アルケニルであり、
L108が-CO-または-CO-O-である場合には、
X102はピロリジン-2-イル、ピロリジン-3-イル、ピペリジン-2-イル、ピペリジン-3-イル、ピペリジン-4-イル、モルホリン-2-イル、モルホリン-3-イル、または同一もしくは異なって1〜3つのアミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、トリアルキルアンモニオ、ヒドロキシ、アルコキシ、カルバモイル、モノアルキルカルバモイル、ジアルキルカルバモイル、ピロリジニル、ピペリジルもしくはモルホリニルで置換されたC1-C6アルキルもしくはC3-C6アルケニルであり、該置換基の少なくとも1つは、アミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、トリアルキルアンモニオ、ピロリジニル、ピペリジルまたはモルホリニルである)、
式(CL-III)
Figure 0006910947
 (式中、
R105は直鎖もしくは分枝状のC8-C24アルキル、C8-C24アルケニルまたはC8-C24アルキニルであり、
R106は直鎖または分枝状のC8-C24アルキル、C8-C24アルケニル、C8-C24アルキニル、C8-C24アルコキシエチル、C8-C24アルコキシプロピル、C8-C24アルケニルオキシエチル、C8-C24アルケニルオキシプロピル、C8-C24アルキニルオキシエチルまたはC8-C24アルキニルオキシプロピルであり、
X103およびX104は同一または異なってC1-C3アルキルであるか、または一緒になってC2-C8アルキレンを形成するか、またはX103はL111と一緒になってC2-C8アルキレンを形成し、
L111は水素原子、C1-C6アルキル、C3-C6アルケニル、アミノ、モノアルキルアミノ、ヒドロキシ、アルコキシ、カルバモイル、モノアルキルカルバモイル、ジアルキルカルバモイル、または同一もしくは異なって1〜3つのアミノ、モノアルキルアミノ、ヒドロキシ、アルコキシ、カルバモイル、モノアルキルカルバモイルもしくはジアルキルカルバモイルで置換されたC1-C6アルキルもしくはC3-C6アルケニルであるか、またはX103と一緒になってC2-C8アルキレンを形成し、
L109はC1-C6アルキレンであり、
L110は単結合であるか、またはC1-C6アルキレンであり、ただし、L109とL110の炭素数の和は7以下であり、L111が水素原子の場合、L110は単結合であり、L111がX103と一緒になってC2-C6アルキレンを形成する場合、L110は単結合であるか、またはメチレンもしくはエチレンである)、
式(CL-IV)
Figure 0006910947
 (式中、
R107は直鎖もしくは分枝状のC8-C24アルキル、C8-C24アルケニルまたはC8-C24アルキニルであり、
R108は直鎖もしくは分枝状のC8-C24アルキル、C8-C24アルケニル、C8-C24アルキニル、C8-C24アルコキシエチル、C8-C24アルコキシプロピル、C8-C24アルケニルオキシエチル、C8-C24アルケニルオキシプロピル、C8-C24アルキニルオキシエチルまたはC8-C24アルキニルオキシプロピルである)、
式(CL-V)
Figure 0006910947
 (式中、
R109は直鎖もしくは分枝状のC8-C24アルキル、C8-C24アルケニルまたはC8-C24アルキニルであり、
R110は直鎖もしくは分枝状のC8-C24アルキル、C8-C24アルケニル、C8-C24アルキニル、C8-C24アルコキシエチル、C8-C24アルコキシプロピル、C8-C24アルケニルオキシエチル、C8-C24アルケニルオキシプロピル、C8-C24アルキニルオキシエチルまたはC8-C24アルキニルオキシプロピルであり、
L112はC1-C3アルキレンであり、
X105は水素原子またはC1-C3アルキルである)、
式(CL-VI)
Figure 0006910947
 (式中、
R111およびR112は同一または異なって直鎖もしくは分枝状の置換されていても良いC8-C24アルキル、C8-C24アルケニルまたはC8-C24アルキニルであり、
X106およびX107は、同一または異なってC1-C3アルキルであるか、または一緒になってC2-C8アルキレンを形成し、
p103〜p105は同一または異なって0または1であり、ただしp103〜p105は同時には0ではなく、
L113およびL114は同一または異なってO、SまたはNHである)、または
式(CL-VII)
Figure 0006910947
 (式中、
R113およびR114は同一または異なって直鎖もしくは分枝状の置換されていても良いC8-C24アルキル、C8-C24アルケニルまたはC8-C24アルキニルであり、
X109およびX110は同一または異なってC1-C3アルキルであるか、または一緒になってC2-C8アルキレンを形成し、
X108は水素原子、ヒドロキシ、置換されていても良いC1-C4アルキル、置換されていても良いC1-C4アルコキシ、または置換されていても良いC1-C4アシルオキシであり、
L115は-CO-O-または-O-CO-であり、
p106は0〜3の整数であり、p107は1〜4の整数である）である、(14)〜(16)のいずれか1項に記載の脂質ナノ粒子。
(18)
さらに中性脂質を含む、(1)〜(17)のいずれか1項に記載の脂質ナノ粒子。
(19)
中性脂質の含有量が、総脂質のモル数に対して0.05倍モル量以上である、(18)記載の脂質ナノ粒子。
(20)
中性脂質が、リン脂質、ステロール、グリセロ糖脂質、スフィンゴ糖脂質およびスフィンゴイドからなる群より選ばれる、(18)または(19)記載の脂質ナノ粒子。
(21)
平均粒子径が20〜65 nmである、(1)〜(20)のいずれか1項に記載の脂質ナノ粒子。
(22)
核酸含有脂質ナノ粒子の製造方法であって、
(a)水に混和可能な有機溶媒と水との混合溶媒中で、1つの4級アンモニウム基を有する親水部および置換基を有していても良い独立した3つの炭化水素基を有する脂質(脂質A)と、核酸とを混合して、脂質Aと核酸を含む第1の脂質溶液を調製する工程、
(b)第1の脂質溶液に、水溶性高分子の脂質誘導体または脂肪酸誘導体を含む第2の脂質溶液を加えて、第3の脂質溶液を調製する工程、および
(c)第3の脂質溶液に、水または緩衝剤水溶液を添加する工程
を含む、前記製造方法。
(23)
工程（a）において、脂質Aおよび核酸とともに、水溶性高分子の脂質誘導体もしくは脂肪酸誘導体、中性脂質、および置換基を有していても良い1つのアミノ基を有する親水部および置換基を有していても良い独立した2つの炭化水素基を有する疎水部を有する脂質(脂質B)の1つ以上を混合することを含む、(22)記載の製造方法。
(24)
工程（b）における第2の脂質溶液が、さらに中性脂質、および／または置換基を有していても良い1つのアミノ基を有する親水部および置換基を有していても良い独立した2つの炭化水素基を有する疎水部を有する脂質(脂質B)を含む、(22)記載の製造方法。
(25)
水に混和可能な有機溶媒がアルコール、ジメチルスルホキシド、テトラヒドロフラン、アセトン、アセトニトリルまたはこれらの混合物である、(22)〜(24)のいずれか1項に記載の製造方法。
(26)
水に混和可能な有機溶媒がアルコールである、(22)〜(24)のいずれか1項に記載の製造方法。
(27)
アルコールがメタノール、エタノール、プロパノール、ブタノールまたはこれらの混合物である、(25)または(26)記載の製造方法。
(28)
工程(b)で得られる第3の脂質溶液中の水に混和可能な有機溶媒の含有量を、該溶液に対して50% (v/v)以上とする、(22)〜(27)のいずれか1項に記載の製造方法。
(29)
工程(c)において、水または緩衝剤水溶液を添加することにより、工程(b)で得られる第3の脂質溶液中の水に混和可能な有機溶媒濃度を50% (v/v)以下とする、(22)〜(28)のいずれか1項に記載の製造方法。
(30)
工程(b)で得られる第3の脂質溶液中の水に混和可能な有機溶媒濃度を、1分以内で50% (v/v)以下とする、(29)記載の製造方法。
(31)
脂質A中の4級アンモニウム基のモル数が核酸中のリン原子のモル数に対して0.01倍モル量以上である、(22)〜(30)のいずれか1項に記載の製造方法。
(32)
工程(a)で得られる第1の脂質溶液中の水に混和可能な有機溶媒の含有量を、該溶液に対して50% (v/v)以上とする、(22)〜(31)のいずれか1項に記載の製造方法。
(33)
緩衝剤水溶液がリン酸緩衝水溶液、クエン酸緩衝水溶液または酢酸緩衝水溶液である、(22)〜(32)のいずれか1項に記載の製造方法。
(34)
工程(C)で得られる溶液中の核酸のモル数に対する総脂質のモル数の比率（総脂質のモル数／核酸のモル数）が50以上である、(22)〜(33)のいずれか1項に記載の製造方法。
(35)
核酸がRNA干渉(RNAi)を利用した標的遺伝子の発現抑制作用を有する核酸である、(22)〜(34)のいずれか1項に記載の製造方法。
(36)
標的遺伝子が腫瘍または炎症に関連する遺伝子である、(35)に記載の製造方法。
(37)
脂質Aが、
式(I)
Figure 0006910947
 （式中、
R1〜R3は同一または異なって直鎖もしくは分枝状の置換されていても良いC8-C24アルキル、C8-C24アルケニルまたはC8-C24アルキニルであり、
L1〜L3は同一または異なって存在しないか、-Z1-(CY1Y2)p1-または-Z2-(CY3Y4)p2-Z3-(CY5Y6)p3-（式中、Y1〜Y6は同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルであり、Z1〜Z3は同一または異なって、-O-、-NY7A-、-CO-O-、-O-CO-、-CO-NY7B-、-NY7C-CO-または-NY7D-CO-0-であり（式中、Y7A〜Y7Dは同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルである）、p1〜p3は同一または異なって1〜5の整数である）であり、
X1は置換されていても良いC1-C4アルキルであり、
A1は薬学的に許容される陰イオンである）、
式(II)
Figure 0006910947
 （式中、
R4〜R6は同一または異なって直鎖もしくは分枝状の置換されていても良いC8-C24アルキル、C8-C24アルケニルまたはC8-C24アルキニルであり、
L4〜L6は同一または異なって存在しないか、-Z4-(CY8Y9)p4-または-Z5-(CY10Y11)p5-Z6-(CY12Y13)p6-（式中、Y8〜Y13は同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルであり、Z4〜Z6は同一または異なって、-O-、-NY14A-、-CO-O-、-O-CO-、-CO-NY14B-、-NY14C-CO-または-NY14D-CO-0-であり（式中、Y14A〜Y14Dは同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルである）、p4は0〜5の整数であり、p5は1〜5の整数であり、p6は0〜5の整数である）であり、
L7は存在しないか、-(CY15Y16)p7-、-(CY17Y18)p8-Z7-(CY19Y20)p9-または-(CY21Y22)p10-Z8-(CY23Y24)p11-Z9-(CY25Y26)p12-（式中、Y15〜Y26は同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルであり、Z7〜Z9は同一または異なって、-O-、-NY27A-、-CO-O-、-O-CO-、-CO-NY27B-、-NY27C-CO-または-NY27D-CO-0-であり（式中、Y27A〜Y27Dは同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルである）、p7は1〜5の整数であり、p8は0〜5の整数であり、p9は1〜5の整数であり、p10は0〜5の整数であり、p11は1〜5の整数であり、p12は1〜5の整数である）であり、
B1は、
Figure 0006910947
 （式中、X2およびX3は同一または異なって置換されていても良いC1-C4アルキルであるか、または一緒になって隣接する窒素原子とともに置換されていても良いC4-C6ヘテロ環を形成し、X4は置換されていても良いC1-C4アルキルであり、X5およびX6は同一または異なって置換されていても良いC1-C4アルキルであるか、または一緒になって隣接する窒素原子とともに置換されていても良いC4-C6ヘテロ環を形成し、X7は置換されていても良いC1-C4アルキルであり、Y28〜Y37は同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルであり、Z10およびZ11は同一または異なって-O-、-NY38A-、-CO-O-、-O-CO-、-CO-NY38B-、-NY38C-CO-または-NY38D-CO-0-であり（式中、Y38A〜Y38Dは同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルである）、p13は0〜5の整数であり、p14〜p17は同一または異なって1〜5の整数である）であり、
A2は薬学的に許容される陰イオンである）、
式(III)
Figure 0006910947
 （式中、
R7〜R9は同一または異なって直鎖もしくは分枝状の置換されていても良いC8-C24アルキル、C8-C24アルケニルまたはC8-C24アルキニルであり、
L8〜L10は同一または異なって存在しないか、-Z12-(CY39Y40)p18-または-Z13-(CY41Y42)p19-Z14-(CY43Y44)p20-（式中、Y39〜Y44は同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルであり、Z12〜Z14は同一または異なって、-O-、-NY45A-、-CO-O-、-O-CO-、-CO-NY45B-、-NY45C-CO-、-NY45D-CO-0-または-CO-であり（式中、Y45A〜Y45Dは同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルである）、p18は0〜5の整数であり、p19は1〜5の整数であり、p20は0〜5の整数である）であり、
L11は存在しないか、-(CY46Y47)p21-、-(CY48Y49)p22-Z15-(CY50Y51)p23-または-(CY52Y53)p24-Z16-(CY54Y55)p25-Z17-(CY56Y57)p26-（式中、Y46〜Y57は同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルであり、Z15〜Z17は同一または異なって、-O-、-NY58A-、-CO-O-、-O-CO-、-CO-NY58B-、-NY58C-CO-、-NY58D-CO-0-または-CO-であり（式中、Y58A〜Y58Dは同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルである）、p21は1〜5の整数であり、p22は0〜5の整数であり、p23は1〜5の整数であり、p24は0〜5の整数であり、p25は1〜5の整数であり、p26は1〜5の整数である）であり、
L12は存在しないか、-(CY59Y60)p27-、-(CY61Y62)p28-Z18-(CY63Y64)p29-または-(CY65Y66)p30-Z19-(CY67Y68)p31-Z20-(CY69Y70)p32-（式中、Y59〜Y70は同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルであり、Z18〜Z20は同一または異なって、-O-、-NY71A-、-CO-O-、-O-CO-、-CO-NY71B-、-NY71C-CO-、-NY71D-CO-0-または-CO-であり（式中、Y71A〜Y71Dは同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルである）、p27は1〜5の整数であり、p28は0〜5の整数であり、p29は0〜5の整数であり、p30は0〜5の整数であり、p31は1〜5の整数であり、p32は0〜5の整数である）であり、
J1およびJ2は同一または異なってCY72またはN(式中、Y72は水素原子、ヒドロキシ、置換されていても良いC1-C4アルキル、置換されていても良いC1-C4アルコキシ、または置換されていても良いC1-C4アシルオキシである)であり、
B2は、
Figure 0006910947
 （式中、X8およびX9は同一または異なって置換されていても良いC1-C4アルキルであるか、または一緒になって隣接する窒素原子とともに置換されていても良いC4-C6ヘテロ環を形成し、X10は置換されていても良いC1-C4アルキルであり、X11およびX12は同一または異なって置換されていても良いC1-C4アルキルであるか、または一緒になって隣接する窒素原子とともに置換されていても良いC4-C6ヘテロ環を形成し、X13は置換されていても良いC1-C4アルキルであり、Y73〜Y82は同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルであり、Z21およびZ22は同一または異なって-O-、-NY83A-、-CO-O-、-O-CO-、-CO-NY83B-、-NY83C-CO-または-NY83D-CO-0-であり（式中、Y83A〜Y83Dは同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルである）、p33は0〜5の整数であり、p34〜p37は同一または異なって1〜5の整数である）であり、
A3は薬学的に許容される陰イオンである）、
式(IV)
Figure 0006910947
 （式中、
R10〜R12は同一または異なって直鎖もしくは分枝状の置換されていても良いC8-C24アルキル、C8-C24アルケニルまたはC8-C24アルキニルであり、
L13は存在しないか、-Z23-(CY83Y84)p38-または-Z24-(CY85Y86)p39-Z25-(CY87Y88)p40-（式中、Y83〜Y88は同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルであり、Z23〜Z25は同一または異なって、-O-、-NY89A-、-CO-O-、-O-CO-、-CO-NY89B-、-NY89C-CO-または-NY89D-CO-0-であり（式中、Y89A〜Y89Dは同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルである）、p38〜p40は同一または異なって1〜5の整数である）であり、
L14およびL15は同一または異なって存在しないか、-Z26-(CY90Y91)p41-または-Z27-(CY92Y93)p42-Z28-(CY94Y95)p43-（式中、Y90〜Y95は同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルであり、Z26〜Z28は同一または異なって、-O-、-NY96A-、-CO-O-、-O-CO-、-CO-NY96B-、-NY96C-CO-、-NY96D-CO-0-または-CO-であり（式中、Y96A〜Y96Dは同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルである）、p41は0〜5の整数であり、p42は1〜5の整数であり、p43は0〜5の整数である）であり、
L16は存在しないか、-(CY97Y98)p44-、-(CY99Y100)p45-Z29-(CY101Y102)p46-または-(CY103Y104)p47-Z30-(CY105Y106)p48-Z31-(CY107Y108)p49-（式中、Y97〜Y108は同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルであり、Z29〜Z31は同一または異なって、-O-、-NY109A-、-CO-O-、-O-CO-、-CO-NY109B-、-NY109C-CO-、-NY109D-CO-0-または-CO-であり（式中、Y109A〜Y109Dは同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルである）、p44は1〜5の整数であり、p45は0〜5の整数であり、p46は1〜5の整数であり、p47は0〜5の整数であり、p48は1〜5の整数であり、p49は1〜5の整数である）であり、
J3はCY110またはN(式中、Y110は水素原子、ヒドロキシ、置換されていても良いC1-C4アルキル、置換されていても良いC1-C4アルコキシ、または置換されていても良いC1-C4アシルオキシである)であり、
X14およびX15は同一または異なって置換されていても良いC1-C4アルキルであるか、または一緒になって隣接する窒素原子とともに置換されていても良いC4-C6ヘテロ環を形成し、
A4は薬学的に許容される陰イオンである）、または
式(V’)もしくは式(V’’)
Figure 0006910947
 （式中、
R13〜R18は同一または異なって直鎖もしくは分枝状の置換されていても良いC8-C24アルキル、C8-C24アルケニルまたはC8-C24アルキニルであり、
Y111〜Y114は同一または異なって水素原子、ヒドロキシまたは置換されていても良いC1-C4アルキルであり、
L17〜L19およびL22〜L24は同一または異なって存在しないか、-Z32-(CY115Y116)p51-または-Z33-(CY117Y118)p52-Z34-(CY119Y120)p53-（式中、Y115〜Y120は同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルであり、Z32〜Z34は同一または異なって、-O-、-NY121A-、-CO-O-、-O-CO-、-CO-NY121B-、-NY121C-CO-、-NY121D-CO-0-または-CO-であり（式中、Y121A〜Y121Dは同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルである）、p51は0〜5の整数であり、p52は1〜5の整数であり、p53は0〜5の整数である）であり、
L20およびL25は同一または異なって存在しないか、-(CY122Y123)p54-、-(CY124Y125)p55-Z35-(CY126Y127)p56-または-(CY128Y129)p57-Z36-(CY130Y131)p58-Z37-(CY132Y133)p59-（式中、Y122〜Y133は同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルであり、Z35〜Z37は同一または異なって、-O-、-NY134A-、-CO-O-、-O-CO-、-CO-NY134B-、-NY134C-CO-、-NY134D-CO-0-または-CO-であり（式中、Y134A〜Y134Dは同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルである）、p54は1〜5の整数であり、p55は0〜5の整数であり、p56は1〜5の整数であり、p57は0〜5の整数であり、p58は1〜5の整数であり、p59は1〜5の整数である）であり、
L21およびL26は同一または異なって存在しないか、-(CY135Y136)p60-、-(CY137Y138)p61-Z38-(CY139Y140)p62-または-(CY141Y142)p63-Z39-(CY143Y144)p64-Z40-(CY145Y146)p65-（式中、Y135〜Y146は同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルであり、Z38〜Z40は同一または異なって、-O-、-NY147A-、-CO-O-、-O-CO-、-CO-NY147B-、-NR147C-CO-、-NY147D-CO-0-または-CO-であり（式中、Y147A〜Y147Dは同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルである）、p60は1〜5の整数であり、p61は0〜5の整数であり、p62は0〜5の整数であり、p63は0〜5の整数であり、p64は1〜5の整数であり、p65は0〜5の整数である）であり、
B3およびB4は同一または異なって、
Figure 0006910947
 （式中、X16およびX17は同一または異なって置換されていても良いC1-C4アルキルであるか、または一緒になって隣接する窒素原子とともに置換されていても良いC4-C6ヘテロ環を形成し、X18は置換されていても良いC1-C4アルキルであり、X19およびX20は同一または異なって置換されていても良いC1-C4アルキルであるか、または一緒になって隣接する窒素原子とともに置換されていても良いC4-C6ヘテロ環を形成し、X21は置換されていても良いC1-C4アルキルであり、Y148〜Y157は同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルであり、Z41およびZ42は同一または異なって-O-、-NY158A-、-CO-O-、-O-CO-、-CO-NY158B-、-NY158C-CO-または-NY158D-CO-0-であり（式中、Y158A〜Y158Dは同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルである）、p66は0〜5の整数であり、p67〜p70は同一または異なって1〜5の整数である）であり、
A5およびA6は同一または異なって薬学的に許容される陰イオンである）
で表される脂質またはそれらの組み合わせである、(22)〜(36)のいずれか1項に記載の製造方法。
(38)
脂質Aが式（I）で表される脂質であり、式(I)において、L1〜L3のうち1つが-CO-O-(CY1Y2)p1-または-O-CO-(CY1Y2)p1-であるか、L1〜L3のうち2つ以上が同一または異なって-CO-O-(CY1Y2)p1-または-O-CO-(CY1Y2)p1-であり、R1〜R3が直鎖または分枝状のC15-C20アルケニルまたはC9-C18アルキルであり、かつ同一である、(37)記載の製造方法。
(39)
脂質Aが式（II）で表される脂質であり、式(II)において、L4〜L6のうち1つが-CO-O-(CY8Y9)p4-、-O-CO-(CY8Y9)p4-、または-O-CO-(CY10Y11)p5-O-(CY12Y13)p6-であるか、L4〜L6のうち2つ以上が同一または異なって-CO-O-(CY8Y9)p4-、-O-CO-(CY8Y9)p4-、または-O-CO-(CY10Y11)p5-O-(CY12Y13)p6-であり、R4〜R6が直鎖または分枝状のC15-C20アルケニルまたはC9-C18アルキルであり、かつ同一である、(37)記載の製造方法。
(40)
脂質Aが式（III）で表される脂質であり、式(III)において、L8〜L10のうち1つが-CO-O-(CY39Y40)p18-または-O-CO-(CY39Y40)p18-であるか、L8〜L10のうち2つ以上が同一または異なって-CO-O-(CY39Y40)p18または-O-CO-(CY39Y40)p18-であり、R7〜R9が直鎖または分枝状のC15-C20アルケニルまたはC9-C18アルキルである、(37)記載の製造方法。
(41)
脂質Aが式（IV）で表される脂質であり、式(IV)において、L13が-CO-O-(CY83Y84)p38-あるいは-O-CO-(CY83Y84)p38-であるか、L14およびL15のうち1つが-CO-O-(CY90Y91)p41-あるいは-O-CO-(CY90Y91)p41-であるか、L13が-CO-O-(CY83Y84)p38-あるいは-O-CO-(CY83Y84)p38-であり、かつL14およびL15のうち1つが-CO-O-(CY90Y91)p41-あるいは-O-CO-(CY90Y91)p41-であるか、L14およびL15が同一あるいは異なって-CO-O-(CY90Y91)p41-あるいは-O-CO-(CY90Y91)p41-であるか、またはL13が-CO-O-(CY83Y84)p38-あるいは-O-CO-(CY83Y84)p38-であり、かつL14およびL15が同一あるいはは異なって-CO-O-(CY90Y91)p41-または-O-CO-(CY90Y91)p41-であり、R10〜R12が直鎖または分枝状のC15-C20アルケニルまたはC9-C18アルキルである、(37)記載の製造方法。
(42)
脂質Aが式（V’）で表される脂質であり、式(V’)において、L17〜L19のうち1つが-CO-O-または-O-であるか、L17〜L19のうち2つ以上が同一または異なって-CO-O-または-O-であり、R13〜R15が直鎖または分枝状のC15-C20アルケニルまたはC9-C18アルキルである、(37)記載の製造方法。
(43)
工程（a）において、脂質Aおよび核酸とともに、置換基を有していても良い1つのアミノ基を有する親水部および置換基を有していても良い独立した2つの炭化水素基を有する疎水部を有する脂質(脂質B)を混合することを含む、(22)〜(42)のいずれか1項に記載の製造方法。
(44)
脂質Bが、
式(CL-I)
Figure 0006910947
 (式中、R101およびR102は、同一または異なって直鎖もしくは分枝状のC10-C24アルキル、C10-C24アルケニルまたはC10-C24アルキニルであり、
L101およびL102は、水素原子であるか、または一緒になって単結合もしくはC1-C3アルキレンを形成し、
L103は単結合、-CO-または-CO-O-であり、
L103が単結合である場合には、
X101は水素原子、C1-6アルキル、C3-6アルケニル、ピロリジン-3-イル、ピペリジン-3-イル、ピペリジン-4-イル、または同一もしくは異なって1〜3つのアミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、トリアルキルアンモニオ、ヒドロキシ、アルコキシ、カルバモイル、モノアルキルカルバモイル、ジアルキルカルバモイル、ピロリジニル、ピペリジルもしくはモルホリニルで置換されたC1-C6キルもしくはC3-C6のアルケニルであり、
L103が-CO-または-CO-O-である場合には、
X101はピロリジン-2-イル、ピロリジン-3-イル、ピペリジン-2-イル、ピペリジン-3-イル、ピペリジン-4-イル、モルホリン-2-イル、モルホリン-3-イル、または同一もしくは異なって1〜3つのアミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、トリアルキルアンモニオ、ヒドロキシ、アルコキシ、カルバモイル、モノアルキルカルバモイル、ジアルキルカルバモイル、ピロリジニル、ピペリジルもしくはモルホリニルで置換されたC1-C6アルキルもしくはC3-C6のアルケニルであり、該置換基の少なくとも1つは、アミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、トリアルキルアンモニオ、ピロリジニル、ピペリジルまたはモルホリニルである)、
式(CL-II)
Figure 0006910947
 (式中、R103およびR104は同一または異なって直鎖もしくは分枝状のC12-C24アルキル、C12-C24アルケニルまたはC12-C24アルキニルであり、
p101およびp102は、同一または異なって0〜3の整数であり、
L106およびL107は水素原子であるか、または一緒になって単結合もしくはC2-C8アルキレンを形成し、
L104およびL105は同一または異なって-O-、-CO-O-または-O-CO-であり、
L108は単結合、-CO-または-CO-O-であり、
L108が単結合である場合には、
X102は水素原子、C1-C6アルキル、C3-C6アルケニル、ピロリジン-2-イル、ピロリジン-3-イル、ピペリジン-3-イル、ピペリジン-4-イル、または同一もしくは異なって1〜3つのアミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、トリアルキルアンモニオ、ヒドロキシ、アルコキシ、カルバモイル、モノアルキルカルバモイル、ジアルキルカルバモイル、ピロリジニル、ピペリジルもしくはモルホリニルで置換されたC1-C6アルキルもしくはC3-C6アルケニルであり、
L108が-CO-または-CO-O-である場合には、
X102はピロリジン-2-イル、ピロリジン-3-イル、ピペリジン-2-イル、ピペリジン-3-イル、ピペリジン-4-イル、モルホリン-2-イル、モルホリン-3-イル、または同一もしくは異なって1〜3つのアミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、トリアルキルアンモニオ、ヒドロキシ、アルコキシ、カルバモイル、モノアルキルカルバモイル、ジアルキルカルバモイル、ピロリジニル、ピペリジルもしくはモルホリニルで置換されたC1-C6アルキルもしくはC3-C6アルケニルであり、該置換基の少なくとも1つは、アミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、トリアルキルアンモニオ、ピロリジニル、ピペリジルまたはモルホリニルである)、
式(CL-III)
Figure 0006910947
 (式中、R105は直鎖もしくは分枝状のC8-C24アルキル、C8-C24アルケニルまたはC8-C24アルキニルであり、
R106は直鎖または分枝状のC8-C24アルキル、C8-C24アルケニル、C8-C24アルキニル、C8-C24アルコキシエチル、C8-C24アルコキシプロピル、C8-C24アルケニルオキシエチル、C8-C24アルケニルオキシプロピル、C8-C24アルキニルオキシエチルまたはC8-C24アルキニルオキシプロピルであり、
X103およびX104は、同一または異なってC1-C3アルキルであるか、または一緒になってC2-C8アルキレンを形成するか、またはX103はL111と一緒になってC2-C8アルキレンを形成し、
L111は、水素原子、C1-C6アルキル、C3-C6アルケニル、アミノ、モノアルキルアミノ、ヒドロキシ、アルコキシ、カルバモイル、モノアルキルカルバモイル、ジアルキルカルバモイル、または同一もしくは異なって1〜3つのアミノ、モノアルキルアミノ、ヒドロキシ、アルコキシ、カルバモイル、モノアルキルカルバモイルもしくはジアルキルカルバモイルで置換されたC1-C6アルキルもしくはC3-C6アルケニルであるか、またはX103と一緒になってC2-C8アルキレンを形成し、
L109は、C1-C6アルキレンであり、
L110は、単結合であるか、またはC1-C6アルキレンであり、ただし、L109とL110の炭素数の和は7以下であり、L111が、水素原子の場合、L110は単結合であり、L111がX103と一緒になってC2-C6アルキレンを形成する場合、L110は単結合であるか、またはメチレンもしくはエチレンである)、
式(CL-IV)
Figure 0006910947
 (式中、R107は直鎖もしくは分枝状のC8-C24アルキル、C8-C24アルケニルまたはC8-C24アルキニルであり、
R108は直鎖もしくは分枝状のC8-C24アルキル、C8-C24アルケニル、C8-C24アルキニル、C8-C24アルコキシエチル、C8-C24アルコキシプロピル、C8-C24アルケニルオキシエチル、C8-C24アルケニルオキシプロピル、C8-C24アルキニルオキシエチルまたはC8-C24アルキニルオキシプロピルである)、
式(CL-V)
Figure 0006910947
 (式中、R109は直鎖もしくは分枝状のC8-C24アルキル、C8-C24アルケニルまたはC8-C24アルキニルであり、
R110は直鎖もしくは分枝状のC8-C24アルキル、C8-C24アルケニル、C8-C24アルキニル、C8-C24アルコキシエチル、C8-C24アルコキシプロピル、C8-C24アルケニルオキシエチル、C8-C24アルケニルオキシプロピル、C8-C24アルキニルオキシエチルまたはC8-C24アルキニルオキシプロピルであり、
L112は、C1-C3アルキレンであり、
X105は、水素原子またはC1-C3アルキルである)、
式(CL-VI)
Figure 0006910947
 (式中、R111およびR112は、同一または異なって直鎖もしくは分枝状の置換されていても良いC8-C24アルキル、C8-C24アルケニルまたはC8-C24アルキニルであり、
X106およびX107は、同一または異なってC1-C3アルキルであるか、または一緒になってC2-C8アルキレンを形成し、
p103, p104およびp105は同一または異なって0または1であり、ただしp103, p104およびp105は同時には0ではなく、
L113およびL114は、同一または異なってO,SまたはNHである)、または
式(CL-VII)
Figure 0006910947
 (式中、R113およびR114は、同一または異なって直鎖もしくは分枝状の置換されていても良いC8-C24アルキル、C8-C24アルケニルまたはC8-C24アルキニルであり、
X109およびX110は、同一または異なってC1-C3アルキルであるか、または一緒になってC2-C8アルキレンを形成し、
X108は水素原子、ヒドロキシ、置換されていても良いC1-C4アルキル、置換されていても良いC1-C4アルコキシ、または置換されていても良いC1-C4アシルオキシであり、
L115は、-CO-O-または-O-CO-であり、
p106は、0〜3の整数であり、
p107は、1〜4の整数である）である、(43)記載の製造方法。
(45)
核酸含有脂質ナノ粒子の製造方法であって、
(a)水に混和可能な有機溶媒と水との混合溶媒中で、1つの4級アンモニウム基を有する親水部および置換基を有していても良い独立した3つの炭化水素基を有する脂質(脂質A)と、核酸と、水溶性高分子の脂質誘導体または脂肪酸誘導体とを混合して、脂質と核酸を含む第1の脂質溶液を調製する工程、および
(b)第1の脂質溶液に、水または緩衝剤水溶液を添加する工程
を含む、前記製造方法。
(46)
工程（a）において、中性脂質、および／または置換基を有していても良い1つのアミノ基を有する親水部および置換基を有していても良い独立した2つの炭化水素基を有する疎水部を有する脂質(脂質B)を混合することを含む、(45)記載の製造方法。
(47)
水に混和可能な有機溶媒がアルコール、ジメチルスルホキシド、テトラヒドロフラン、アセトン、アセトニトリルまたはこれらの混合物である、(45)または(46)記載の製造方法。
(48)
水に混和可能な有機溶媒がアルコールである、(45)または(46)記載の製造方法。
(49)
アルコールがメタノール、エタノール、プロパノール、ブタノールまたはこれらの混合物である、(47)または(48)記載の製造方法。
(50)
工程(a)で得られる第1の脂質溶液中の水に混和可能な有機溶媒の含有量が、該溶液に対して50% (v/v)以上である、(45)〜(49)のいずれか1項に記載の製造方法。
(51)
工程(b)において、水または緩衝剤水溶液を添加することにより、工程(a)で得られた第1の脂質溶液中の水に混和可能な有機溶媒濃度を50% (v/v)以下とする、(45)〜(50)のいずれか1項に記載の製造方法。
(52)
工程(a)で得られる第1の脂質溶液中の水に混和可能な有機溶媒濃度を、1分以内で50% (v/v)以下とする、(51)記載の製造方法。
(53)
脂質A中の4級アンモニウム基モル数が核酸中のリン酸原子のモル数に対して0.01倍モル量以上である、(45)〜(52)のいずれか1項に記載の製造方法。
(54)
工程(a)で得られる第1の脂質溶液中の水に混和可能な有機溶媒の含有量を、該溶液に対して50% (v/v)以上とする、(45)〜(53)のいずれか1項に記載の製造方法。
(55)
緩衝剤水溶液がリン酸緩衝水溶液、クエン酸緩衝水溶液または酢酸緩衝水溶液である、(45)〜(54)のいずれか1項に記載の製造方法。
(56)
工程（a）で用いる核酸のモル数に対する総脂質のモル数の比率（総脂質のモル数／核酸のモル数）が50以上である、(45)〜(55)のいずれか1項に記載の製造方法。
(57)
核酸がRNA干渉(RNAi)を利用した標的遺伝子の発現抑制作用を有する核酸である、(45)〜(56)のいずれか1項に記載の製造方法。
(58)
標的遺伝子が腫瘍または炎症に関連する遺伝子である、(57)記載の製造方法。
(59)
脂質Aが、
式(I)
Figure 0006910947
 （式中、
R1〜R3は同一または異なって直鎖もしくは分枝状の置換されていても良いC8-C24アルキル、C8-C24アルケニルまたはC8-C24アルキニルであり、
L1〜L3は同一または異なって存在しないか、-Z1-(CY1Y2)p1-または-Z2-(CY3Y4)p2-Z3-(CY5Y6)p3-（式中、Y1〜Y6は同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルであり、Z1〜Z3は同一または異なって、-O-、-NY7A-、-CO-O-、-O-CO-、-CO-NY7B-、-NY7C-CO-または-NY7D-CO-0-であり（式中、Y7A〜Y7Dは同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルである）、p1〜p3は同一または異なって1〜5の整数である）であり、
X1は置換されていても良いC1-C4アルキルであり、
A1は薬学的に許容される陰イオンである）、
式(II)
Figure 0006910947
 （式中、
R4〜R6は同一または異なって直鎖もしくは分枝状の置換されていても良いC8-C24アルキル、C8-C24アルケニルまたはC8-C24アルキニルであり、
L4〜L6は同一または異なって存在しないか、-Z4-(CY8Y9)p4-または-Z5-(CY10Y11)p5-Z6-(CY12Y13)p6-（式中、Y8〜Y13は同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルであり、Z4〜Z6は同一または異なって、-O-、-NY14A-、-CO-O-、-O-CO-、-CO-NY14B-、-NY14C-CO-または-NY14D-CO-0-であり（式中、Y14A〜Y14Dは同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルである）、p4は0〜5の整数であり、p5は1〜5の整数であり、p6は0〜5の整数である）であり、
L7は存在しないか、-(CY15Y16)p7-、-(CY17Y18)p8-Z7-(CY19Y20)p9-または-(CY21Y22)p10-Z8-(CY23Y24)p11-Z9-(CY25Y26)p12-（式中、Y15〜Y26は同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルであり、Z7〜Z9は同一または異なって、-O-、-NY27A-、-CO-O-、-O-CO-、-CO-NY27B-、-NY27C-CO-または-NY27D-CO-0-であり（式中、Y27A〜Y27Dは同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルである）、p7は1〜5の整数であり、p8は0〜5の整数であり、p9は1〜5の整数であり、p10は0〜5の整数であり、p11は1〜5の整数であり、p12は1〜5の整数である）であり、
B1は、
Figure 0006910947
 （式中、X2およびX3は同一または異なって置換されていても良いC1-C4アルキルであるか、または一緒になって隣接する窒素原子とともに置換されていても良いC4-C6ヘテロ環を形成し、X4は置換されていても良いC1-C4アルキルであり、X5およびX6は同一または異なって置換されていても良いC1-C4アルキルであるか、または一緒になって隣接する窒素原子とともに置換されていても良いC4-C6ヘテロ環を形成し、X7は置換されていても良いC1-C4アルキルであり、Y28〜Y37は同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルであり、Z10およびZ11は同一または異なって-O-、-NY38A-、-CO-O-、-O-CO-、-CO-NY38B-、-NY38C-CO-または-NY38D-CO-0-であり（式中、Y38A〜Y38Dは同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルである）、p13は0〜5の整数であり、p14〜p17は同一または異なって1〜5の整数である）であり、
A2は薬学的に許容される陰イオンである）、
式(III)
Figure 0006910947
 （式中、
R7〜R9は同一または異なって直鎖もしくは分枝状の置換されていても良いC8-C24アルキル、C8-C24アルケニルまたはC8-C24アルキニルであり、
L8〜L10は同一または異なって存在しないか、-Z12-(CY39Y40)p18-または-Z13-(CY41Y42)p19-Z14-(CY43Y44)p20-（式中、Y39〜Y44は同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルであり、Z12〜Z14は同一または異なって、-O-、-NY45A-、-CO-O-、-O-CO-、-CO-NY45B-、-NY45C-CO-、-NY45D-CO-0-または-CO-であり（式中、Y45A〜Y45Dは同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルである）、p18は0〜5の整数であり、p19は1〜5の整数であり、p20は0〜5の整数である）であり、
L11は存在しないか、-(CY46Y47)p21-、-(CY48Y49)p22-Z15-(CY50Y51)p23-または-(CY52Y53)p24-Z16-(CY54Y55)p25-Z17-(CY56Y57)p26-（式中、Y46〜Y57は同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルであり、Z15〜Z17は同一または異なって、-O-、-NY58A-、-CO-O-、-O-CO-、-CO-NY58B-、-NY58C-CO-、-NY58D-CO-0-または-CO-であり（式中、Y58A〜Y58Dは同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルである）、p21は1〜5の整数であり、p22は0〜5の整数であり、p23は1〜5の整数であり、p24は0〜5の整数であり、p25は1〜5の整数であり、p26は1〜5の整数である）であり、
L12は存在しないか、-(CY59Y60)p27-、-(CY61Y62)p28-Z18-(CY63Y64)p29-または-(CY65Y66)p30-Z19-(CY67Y68)p31-Z20-(CY69Y70)p32-（式中、Y59〜Y70は同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルであり、Z18〜Z20は同一または異なって、-O-、-NY71A-、-CO-O-、-O-CO-、-CO-NY71B-、-NY71C-CO-、-NY71D-CO-0-または-CO-であり（式中、Y71A〜Y71Dは同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルである）、p27は1〜5の整数であり、p28は0〜5の整数であり、p29は0〜5の整数であり、p30は0〜5の整数であり、p31は1〜5の整数であり、p32は0〜5の整数である）であり、
J1およびJ2は同一または異なってCY72またはN(式中、Y72は水素原子、ヒドロキシ、置換されていても良いC1-C4アルキル、置換されていても良いC1-C4アルコキシ、または置換されていても良いC1-C4アシルオキシである)であり、
B2は、
Figure 0006910947
 （式中、X8およびX9は同一または異なって置換されていても良いC1-C4アルキルであるか、または一緒になって隣接する窒素原子とともに置換されていても良いC4-C6ヘテロ環を形成し、X10は置換されていても良いC1-C4アルキルであり、X11およびX12は同一または異なって置換されていても良いC1-C4アルキルであるか、または一緒になって隣接する窒素原子とともに置換されていても良いC4-C6ヘテロ環を形成し、X13は置換されていても良いC1-C4アルキルであり、Y73〜Y82は同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルであり、Z21およびZ22は同一または異なって-O-、-NY83A-、-CO-O-、-O-CO-、-CO-NY83B-、-NY83C-CO-または-NY83D-CO-0-であり（式中、Y83A〜Y83Dは同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルである）、p33は0〜5の整数であり、p34〜p37は同一または異なって1〜5の整数である）であり、
A3は薬学的に許容される陰イオンである）、
式(IV)
Figure 0006910947
 （式中、
R10〜R12は同一または異なって直鎖もしくは分枝状の置換されていても良いC8-C24アルキル、C8-C24アルケニルまたはC8-C24アルキニルであり、
L13は存在しないか、-Z23-(CY83Y84)p38-または-Z24-(CY85Y86)p39-Z25-(CY87Y88)p40-（式中、Y83〜Y88は同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルであり、Z23〜Z25は同一または異なって、-O-、-NY89A-、-CO-O-、-O-CO-、-CO-NY89B-、-NY89C-CO-または-NY89D-CO-0-であり（式中、Y89A〜Y89Dは同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルである）、p38〜p40は同一または異なって1〜5の整数である）であり、
L14およびL15は同一または異なって存在しないか、-Z26-(CY90Y91)p41-または-Z27-(CY92Y93)p42-Z28-(CY94Y95)p43-（式中、Y90〜Y95は同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルであり、Z26〜Z28は同一または異なって、-O-、-NY96A-、-CO-O-、-O-CO-、-CO-NY96B-、-NY96C-CO-、-NY96D-CO-0-または-CO-であり（式中、Y96A〜Y96Dは同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルである）、p41は0〜5の整数であり、p42は1〜5の整数であり、p43は0〜5の整数である）であり、
L16は存在しないか、-(CY97Y98)p44-、-(CY99Y100)p45-Z29-(CY101Y102)p46-または-(CY103Y104)p47-Z30-(CY105Y106)p48-Z31-(CY107Y108)p49-（式中、Y97〜Y108は同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルであり、Z29〜Z31は同一または異なって、-O-、-NY109A-、-CO-O-、-O-CO-、-CO-NY109B-、-NY109C-CO-、-NY109D-CO-0-または-CO-であり（式中、Y109A〜Y109Dは同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルである）、p44は1〜5の整数であり、p45は0〜5の整数であり、p46は1〜5の整数であり、p47は0〜5の整数であり、p48は1〜5の整数であり、p49は1〜5の整数である）であり、
J3はCY110またはN(式中、Y110は水素原子、ヒドロキシ、置換されていても良いC1-C4アルキル、置換されていても良いC1-C4アルコキシ、または置換されていても良いC1-C4アシルオキシである)であり、
X14およびX15は同一または異なって置換されていても良いC1-C4アルキルであるか、または一緒になって隣接する窒素原子とともに置換されていても良いC4-C6ヘテロ環を形成し、
A4は薬学的に許容される陰イオンである）、または
式(V’)もしくは式(V’’)
Figure 0006910947
 （式中、
R13〜R18は同一または異なって直鎖もしくは分枝状の置換されていても良いC8-C24アルキル、C8-C24アルケニルまたはC8-C24アルキニルであり、
Y111〜Y114は同一または異なって水素原子、ヒドロキシまたは置換されていても良いC1-C4アルキルであり、
L17〜L19およびL22〜L24は同一または異なって存在しないか、-Z32-(CY115Y116)p51-または-Z33-(CY117Y118)p52-Z34-(CY119Y120)p53-（式中、Y115〜Y120は同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルであり、Z32〜Z34は同一または異なって、-O-、-NY121A-、-CO-O-、-O-CO-、-CO-NY121B-、-NY121C-CO-、-NY121D-CO-0-または-CO-であり（式中、Y121A〜Y121Dは同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルである）、p51は0〜5の整数であり、p52は1〜5の整数であり、p53は0〜5の整数である）であり、
L20およびL25は同一または異なって存在しないか、-(CY122Y123)p54-、-(CY124Y125)p55-Z35-(CY126Y127)p56-または-(CY128Y129)p57-Z36-(CY130Y131)p58-Z37-(CY132Y133)p59-（式中、Y122〜Y133は同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルであり、Z35〜Z37は同一または異なって、-O-、-NY134A-、-CO-O-、-O-CO-、-CO-NY134B-、-NY134C-CO-、-NY134D-CO-0-または-CO-であり（式中、Y134A〜Y134Dは同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルである）、p54は1〜5の整数であり、p55は0〜5の整数であり、p56は1〜5の整数であり、p57は0〜5の整数であり、p58は1〜5の整数であり、p59は1〜5の整数である）であり、
L21およびL26は同一または異なって存在しないか、-(CY135Y136)p60-、-(CY137Y138)p61-Z38-(CY139Y140)p62-または-(CY141Y142)p63-Z39-(CY143Y144)p64-Z40-(CY145Y146)p65-（式中、Y135〜Y146は同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルであり、Z38〜Z40は同一または異なって、-O-、-NY147A-、-CO-O-、-O-CO-、-CO-NY147B-、-NR147C-CO-、-NY147D-CO-0-または-CO-であり（式中、Y147A〜Y147Dは同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルである）、p60は1〜5の整数であり、p61は0〜5の整数であり、p62は0〜5の整数であり、p63は0〜5の整数であり、p64は1〜5の整数であり、p65は0〜5の整数である）であり、
B3およびB4は同一または異なって、
Figure 0006910947
 （式中、X16およびX17は同一または異なって置換されていても良いC1-C4アルキルであるか、または一緒になって隣接する窒素原子とともに置換されていても良いC4-C6ヘテロ環を形成し、X18は置換されていても良いC1-C4アルキルであり、X19およびX20は同一または異なって置換されていても良いC1-C4アルキルであるか、または一緒になって隣接する窒素原子とともに置換されていても良いC4-C6ヘテロ環を形成し、X21は置換されていても良いC1-C4アルキルであり、Y148〜Y157は同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルであり、Z41およびZ42は同一または異なって-O-、-NY158A-、-CO-O-、-O-CO-、-CO-NY158B-、-NY158C-CO-または-NY158D-CO-0-であり（式中、Y158A〜Y158Dは同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルである）、p66は0〜5の整数であり、p67〜p70は同一または異なって1〜5の整数である）であり、
A5およびA6は同一または異なって薬学的に許容される陰イオンである）
で表される脂質またはそれらの組み合わせである、(45)〜(58)のいずれか1項に記載の製造方法。
(60)
脂質Aが式（I）で表される脂質であり、式(I)において、L1〜L3のうち1つが-CO-O-(CY1Y2)p1-または-O-CO-(CY1Y2)p1-であるか、L1〜L3のうち2つ以上が同一または異なって-CO-O-(CY1Y2)p1-または-O-CO-(CY1Y2)p1-であり、R1〜R3が直鎖または分枝状のC15-C20アルケニルまたはC9-C18アルキルであり、かつ同一である、(59)記載の製造方法。
(61)
脂質Aが式（II）で表される脂質であり、式(II)において、L4〜L6のうち1つが-CO-O-(CY8Y9)p4-、-O-CO-(CY8Y9)p4-、または-O-CO-(CY10Y11)p5-O-(CY12Y13)p6-であるか、L4〜L6のうち2つ以上が同一または異なって-CO-O-(CY8Y9)p4-、-O-CO-(CY8Y9)p4-、または-O-CO-(CY10Y11)p5-O-(CY12Y13)p6-であり、R4〜R6が直鎖または分枝状のC15-C20アルケニルまたはC9-C18アルキルであり、かつ同一である、(59)記載の製造方法。
(62)
脂質Aが式（III）で表される脂質であり、式(III)において、L8〜L10のうち1つが-CO-O-(CY39Y40)p18-または-O-CO-(CY39Y40)p18-であるか、L8〜L10のうち2つ以上が同一または異なって-CO-O-(CY39Y40)p18または-O-CO-(CY39Y40)p18-であり、R7〜R9が直鎖または分枝状のC15-C20アルケニルまたはC9-C18アルキルである、(59)記載の製造方法。
(63)
脂質Aが式（IV）で表される脂質であり、式(IV)において、L13が-CO-O-(CY83Y84)p38-あるいは-O-CO-(CY83Y84)p38-であるか、L14およびL15のうち1つが-CO-O-(CY90Y91)p41-あるいは-O-CO-(CY90Y91)p41-であるか、L13が-CO-O-(CY83Y84)p38-あるいは-O-CO-(CY83Y84)p38-であり、かつL14およびL15のうち1つが-CO-O-(CY90Y91)p41-あるいは-O-CO-(CY90Y91)p41-であるか、L14およびL15が同一あるいは異なって-CO-O-(CY90Y91)p41-あるいは-O-CO-(CY90Y91)p41-であるか、またはL13が-CO-O-(CY83Y84)p38-あるいは-O-CO-(CY83Y84)p38-であり、かつL14およびL15が同一あるいはは異なって-CO-O-(CY90Y91)p41-または-O-CO-(CY90Y91)p41-であり、R10〜R12が直鎖または分枝状のC15-C20アルケニルまたはC9-C18アルキルである、(59)記載の製造方法。
(64)
脂質Aが式（V’）で表される脂質であり、式(V’)において、L17〜L19のうち1つが-CO-O-または-O-であるか、L17〜L19のうち2つ以上が同一または異なって-CO-O-または-O-であり、R13〜R15が直鎖または分枝状のC15-C20アルケニルまたはC9-C18アルキルである、(59)記載の製造方法。
(65)
工程（a）において、脂質A、核酸および水溶性高分子の脂質誘導体または脂肪酸誘導体とともに、置換基を有していても良い1つのアミノ基を有する親水部および置換基を有していても良い独立した2つの炭化水素基を有する疎水部を有する脂質(脂質B)を混合することを含む、(45)〜(64)のいずれか1項に記載の製造方法。
(66)
脂質Bが、
式(CL-I)
Figure 0006910947
 (式中、R101およびR102は、同一または異なって直鎖もしくは分枝状のC10-C24アルキル、C10-C24アルケニルまたはC10-C24アルキニルであり、
L101およびL102は、水素原子であるか、または一緒になって単結合もしくはC1-C3アルキレンを形成し、
L103は単結合、-CO-または-CO-O-であり、
L103が単結合である場合には、
X101は水素原子、C1-C6のアルキル、C3-C6のアルケニル、ピロリジン-3-イル、ピペリジン-3-イル、ピペリジン-4-イル、または同一もしくは異なって1〜3つのアミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、トリアルキルアンモニオ、ヒドロキシ、アルコキシ、カルバモイル、モノアルキルカルバモイル、ジアルキルカルバモイル、ピロリジニル、ピペリジルもしくはモルホリニルで置換されたC1-C6のアルキルもしくはC3-C6のアルケニルであり、
L103が-CO-または-CO-O-である場合には、
X101はピロリジン-2-イル、ピロリジン-3-イル、ピペリジン-2-イル、ピペリジン-3-イル、ピペリジン-4-イル、モルホリン-2-イル、モルホリン-3-イル、または同一もしくは異なって1〜3つのアミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、トリアルキルアンモニオ、ヒドロキシ、アルコキシ、カルバモイル、モノアルキルカルバモイル、ジアルキルカルバモイル、ピロリジニル、ピペリジルもしくはモルホリニルで置換されたC1-C6のアルキルもしくはC3-C6のアルケニルであり、該置換基の少なくとも1つは、アミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、トリアルキルアンモニオ、ピロリジニル、ピペリジルまたはモルホリニルである)、
式(CL-II)
Figure 0006910947
 (式中、R103およびR104は同一または異なって直鎖もしくは分枝状のC12-C24アルキル、C12-C24アルケニルまたはC12-C24アルキニルであり、
p101およびp102は、同一または異なって0〜3の整数であり、
L106およびL107は水素原子であるか、または一緒になって単結合もしくはC2-C8アルキレンを形成し、
L104およびL105は同一または異なって-O-、-CO-O-または-O-CO-であり、
L108は単結合、-CO-または-CO-O-であり、
L108が単結合である場合には、
X102は水素原子、C1-C6アルキル、C3-C6アルケニル、ピロリジン-2-イル、ピロリジン-3-イル、ピペリジン-3-イル、ピペリジン-4-イル、または同一もしくは異なって1〜3つのアミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、トリアルキルアンモニオ、ヒドロキシ、アルコキシ、カルバモイル、モノアルキルカルバモイル、ジアルキルカルバモイル、ピロリジニル、ピペリジルもしくはモルホリニルで置換されたC1-C6アルキルもしくはC3-C6アルケニルであり、
L108が-CO-または-CO-O-である場合には、
X102はピロリジン-2-イル、ピロリジン-3-イル、ピペリジン-2-イル、ピペリジン-3-イル、ピペリジン-4-イル、モルホリン-2-イル、モルホリン-3-イル、または同一もしくは異なって1〜3つのアミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、トリアルキルアンモニオ、ヒドロキシ、アルコキシ、カルバモイル、モノアルキルカルバモイル、ジアルキルカルバモイル、ピロリジニル、ピペリジルもしくはモルホリニルで置換されたC1-C6アルキルもしくはC3-C6アルケニルであり、該置換基の少なくとも1つは、アミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、トリアルキルアンモニオ、ピロリジニル、ピペリジルまたはモルホリニルである)、
式(CL-III)
Figure 0006910947
 (式中、R105は直鎖もしくは分枝状のC8-C24アルキル、C8-C24アルケニルまたはC8-C24アルキニルであり、
R106は直鎖または分枝状のC8-C24アルキル、C8-C24アルケニル、C8-C24アルキニル、C8-C24アルコキシエチル、C8-C24アルコキシプロピル、C8-C24アルケニルオキシエチル、C8-C24アルケニルオキシプロピル、C8-C24アルキニルオキシエチルまたはC8-C24アルキニルオキシプロピルであり、
X103およびX104は、同一または異なってC1-C3アルキルであるか、または一緒になってC2-C8アルキレンを形成するか、またはX103はL111と一緒になってC2-C8アルキレンを形成し、
L111は、水素原子、C1-C6アルキル、C3-C6アルケニル、アミノ、モノアルキルアミノ、ヒドロキシ、アルコキシ、カルバモイル、モノアルキルカルバモイル、ジアルキルカルバモイル、または同一もしくは異なって1〜3つのアミノ、モノアルキルアミノ、ヒドロキシ、アルコキシ、カルバモイル、モノアルキルカルバモイルもしくはジアルキルカルバモイルで置換されたC1-C6アルキルもしくはC3-C6アルケニルであるか、またはX103と一緒になってC2-C8アルキレンを形成し、
L109は、C1-C6アルキレンであり、
L110は、単結合であるか、またはC1-C6アルキレンであり、ただし、L109とL110の炭素数の和は7以下であり、L111が、水素原子の場合、L110は単結合であり、L111がX103と一緒になってC2-C6アルキレンを形成する場合、L110は単結合であるか、またはメチレンもしくはエチレンである)、
式(CL-IV)
Figure 0006910947
 (式中、R107は直鎖もしくは分枝状のC8-C24アルキル、C8-C24アルケニルまたはC8-C24アルキニルであり、
R108は直鎖もしくは分枝状のC8-C24アルキル、C8-C24アルケニル、C8-C24アルキニル、C8-C24アルコキシエチル、C8-C24アルコキシプロピル、C8-C24アルケニルオキシエチル、C8-C24アルケニルオキシプロピル、C8-C24アルキニルオキシエチルまたはC8-C24アルキニルオキシプロピルである)、
式(CL-V)
Figure 0006910947
 (式中、R109は直鎖もしくは分枝状のC8-C24アルキル、C8-C24アルケニルまたはC8-C24アルキニルであり、
R110は直鎖もしくは分枝状のC8-C24アルキル、C8-C24アルケニル、C8-C24アルキニル、C8-C24アルコキシエチル、C8-C24アルコキシプロピル、C8-C24アルケニルオキシエチル、C8-C24アルケニルオキシプロピル、C8-C24アルキニルオキシエチルまたはC8-C24アルキニルオキシプロピルであり、
L112は、C1-C3アルキレンであり、
X105は、水素原子またはC1-C3アルキルである)、
式(CL-VI)
Figure 0006910947
 (式中、R111およびR112は、同一または異なって直鎖もしくは分枝状の置換されていても良いC8-C24アルキル、C8-C24アルケニルまたはC8-C24アルキニルであり、
X106およびX107は、同一または異なってC1-C3アルキルであるか、または一緒になってC2-C8アルキレンを形成し、
p103, p104およびp105は同一または異なって0または1であり、ただしp103, p104およびp105は同時には0ではなく、
L113およびL114は、同一または異なってO,SまたはNHである)、または
式(CL-VII)
Figure 0006910947
 (式中、R113およびR114は、同一または異なって直鎖もしくは分枝状の置換されていても良いC8-C24アルキル、C8-C24アルケニルまたはC8-C24アルキニルであり、
X109およびX110は、同一または異なってC1-C3アルキルであるか、または一緒になってC2-C8アルキレンを形成し、
X108は水素原子、ヒドロキシ、置換されていても良いC1-C4アルキル、置換されていても良いC1-C4アルコキシ、または置換されていても良いC1-C4アシルオキシであり、
L115は、-CO-O-または-O-CO-であり、
p106は、0〜3の整数であり、
p107は、1〜4の整数である）である、(65)に記載の製造方法。
(67)
(22)〜(66)のいずれか1項に記載の製造方法で得られる、核酸含有脂質ナノ粒子。
(68)
核酸含有脂質ナノ粒子を構成する脂質膜に、1つの4級アンモニウム基を有する親水部、および置換基を有していても良い独立した3つの炭化水素基を有する脂質(脂質A)を使用する、核酸含有脂質ナノ粒子を安定化する方法。
(69)
脂質A中の4級アンモニウム基のモル数が核酸中のリン原子のモル数に対して0.01倍モル量以上である、(68)記載の方法。
(70)
脂質Aが、
式(I)
Figure 0006910947
 （式中、
R1〜R3は同一または異なって直鎖もしくは分枝状の置換されていても良いC8-C24アルキル、C8-C24アルケニルまたはC8-C24アルキニルであり、
L1〜L3は同一または異なって存在しないか、-Z1-(CY1Y2)p1-または-Z2-(CY3Y4)p2-Z3-(CY5Y6)p3-（式中、Y1〜Y6は同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルであり、Z1〜Z3は同一または異なって、-O-、-NY7A-、-CO-O-、-O-CO-、-CO-NY7B-、-NY7C-CO-または-NY7D-CO-0-であり（式中、Y7A〜Y7Dは同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルである）、p1〜p3は同一または異なって1〜5の整数である）であり、
X1は置換されていても良いC1-C4アルキルであり、
A1は薬学的に許容される陰イオンである）、
式(II)
Figure 0006910947
 （式中、
R4〜R6は同一または異なって直鎖もしくは分枝状の置換されていても良いC8-C24アルキル、C8-C24アルケニルまたはC8-C24アルキニルであり、
L4〜L6は同一または異なって存在しないか、-Z4-(CY8Y9)p4-または-Z5-(CY10Y11)p5-Z6-(CY12Y13)p6-（式中、Y8〜Y13は同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルであり、Z4〜Z6は同一または異なって、-O-、-NY14A-、-CO-O-、-O-CO-、-CO-NY14B-、-NY14C-CO-または-NY14D-CO-0-であり（式中、Y14A〜Y14Dは同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルである）、p4は0〜5の整数であり、p5は1〜5の整数であり、p6は0〜5の整数である）であり、
L7は存在しないか、-(CY15Y16)p7-、-(CY17Y18)p8-Z7-(CY19Y20)p9-または-(CY21Y22)p10-Z8-(CY23Y24)p11-Z9-(CY25Y26)p12-（式中、Y15〜Y26は同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルであり、Z7〜Z9は同一または異なって、-O-、-NY27A-、-CO-O-、-O-CO-、-CO-NY27B-、-NY27C-CO-または-NY27D-CO-0-であり（式中、Y27A〜Y27Dは同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルである）、p7は1〜5の整数であり、p8は0〜5の整数であり、p9は1〜5の整数であり、p10は0〜5の整数であり、p11は1〜5の整数であり、p12は1〜5の整数である）であり、
B1は、
Figure 0006910947
 （式中、X2およびX3は同一または異なって置換されていても良いC1-C4アルキルであるか、または一緒になって隣接する窒素原子とともに置換されていても良いC4-C6ヘテロ環を形成し、X4は置換されていても良いC1-C4アルキルであり、X5およびX6は同一または異なって置換されていても良いC1-C4アルキルであるか、または一緒になって隣接する窒素原子とともに置換されていても良いC4-C6ヘテロ環を形成し、X7は置換されていても良いC1-C4アルキルであり、Y28〜Y37は同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルであり、Z10およびZ11は同一または異なって-O-、-NY38A-、-CO-O-、-O-CO-、-CO-NY38B-、-NY38C-CO-または-NY38D-CO-0-であり（式中、Y38A〜Y38Dは同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルである）、p13は0〜5の整数であり、p14〜p17は同一または異なって1〜5の整数である）であり、
A2は薬学的に許容される陰イオンである）、
式(III)
Figure 0006910947
 （式中、
R7〜R9は同一または異なって直鎖もしくは分枝状の置換されていても良いC8-C24アルキル、C8-C24アルケニルまたはC8-C24アルキニルであり、
L8〜L10は同一または異なって存在しないか、-Z12-(CY39Y40)p18-または-Z13-(CY41Y42)p19-Z14-(CY43Y44)p20-（式中、Y39〜Y44は同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルであり、Z12〜Z14は同一または異なって、-O-、-NY45A-、-CO-O-、-O-CO-、-CO-NY45B-、-NY45C-CO-、-NY45D-CO-0-または-CO-であり（式中、Y45A〜Y45Dは同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルである）、p18は0〜5の整数であり、p19は1〜5の整数であり、p20は0〜5の整数である）であり、
L11は存在しないか、-(CY46Y47)p21-、-(CY48Y49)p22-Z15-(CY50Y51)p23-または-(CY52Y53)p24-Z16-(CY54Y55)p25-Z17-(CY56Y57)p26-（式中、Y46〜Y57は同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルであり、Z15〜Z17は同一または異なって、-O-、-NY58A-、-CO-O-、-O-CO-、-CO-NY58B-、-NY58C-CO-、-NY58D-CO-0-または-CO-であり（式中、Y58A〜Y58Dは同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルである）、p21は1〜5の整数であり、p22は0〜5の整数であり、p23は1〜5の整数であり、p24は0〜5の整数であり、p25は1〜5の整数であり、p26は1〜5の整数である）であり、
L12は存在しないか、-(CY59Y60)p27-、-(CY61Y62)p28-Z18-(CY63Y64)p29-または-(CY65Y66)p30-Z19-(CY67Y68)p31-Z20-(CY69Y70)p32-（式中、Y59〜Y70は同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルであり、Z18〜Z20は同一または異なって、-O-、-NY71A-、-CO-O-、-O-CO-、-CO-NY71B-、-NY71C-CO-、-NY71D-CO-0-または-CO-であり（式中、Y71A〜Y71Dは同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルである）、p27は1〜5の整数であり、p28は0〜5の整数であり、p29は0〜5の整数であり、p30は0〜5の整数であり、p31は1〜5の整数であり、p32は0〜5の整数である）であり、
J1およびJ2は同一または異なってCY72またはN(式中、Y72は水素原子、ヒドロキシ、置換されていても良いC1-C4アルキル、置換されていても良いC1-C4アルコキシ、または置換されていても良いC1-C4アシルオキシである)であり、
B2は、
Figure 0006910947
 （式中、X8およびX9は同一または異なって置換されていても良いC1-C4アルキルであるか、または一緒になって隣接する窒素原子とともに置換されていても良いC4-C6ヘテロ環を形成し、X10は置換されていても良いC1-C4アルキルであり、X11およびX12は同一または異なって置換されていても良いC1-C4アルキルであるか、または一緒になって隣接する窒素原子とともに置換されていても良いC4-C6ヘテロ環を形成し、X13は置換されていても良いC1-C4アルキルであり、Y73〜Y82は同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルであり、Z21およびZ22は同一または異なって-O-、-NY83A-、-CO-O-、-O-CO-、-CO-NY83B-、-NY83C-CO-または-NY83D-CO-0-であり（式中、Y83A〜Y83Dは同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルである）、p33は0〜5の整数であり、p34〜p37は同一または異なって1〜5の整数である）であり、
A3は薬学的に許容される陰イオンである）、
式(IV)
Figure 0006910947
 （式中、
R10〜R12は同一または異なって直鎖もしくは分枝状の置換されていても良いC8-C24アルキル、C8-C24アルケニルまたはC8-C24アルキニルであり、
L13は存在しないか、-Z23-(CY83Y84)p38-または-Z24-(CY85Y86)p39-Z25-(CY87Y88)p40-（式中、Y83〜Y88は同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルであり、Z23〜Z25は同一または異なって、-O-、-NY89A-、-CO-O-、-O-CO-、-CO-NY89B-、-NY89C-CO-または-NY89D-CO-0-であり（式中、Y89A〜Y89Dは同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルである）、p38〜p40は同一または異なって1〜5の整数である）であり、
L14およびL15は同一または異なって存在しないか、-Z26-(CY90Y91)p41-または-Z27-(CY92Y93)p42-Z28-(CY94Y95)p43-（式中、Y90〜Y95は同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルであり、Z26〜Z28は同一または異なって、-O-、-NY96A-、-CO-O-、-O-CO-、-CO-NY96B-、-NY96C-CO-、-NY96D-CO-0-または-CO-であり（式中、Y96A〜Y96Dは同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルである）、p41は0〜5の整数であり、p42は1〜5の整数であり、p43は0〜5の整数である）であり、
L16は存在しないか、-(CY97Y98)p44-、-(CY99Y100)p45-Z29-(CY101Y102)p46-または-(CY103Y104)p47-Z30-(CY105Y106)p48-Z31-(CY107Y108)p49-（式中、Y97〜Y108は同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルであり、Z29〜Z31は同一または異なって、-O-、-NY109A-、-CO-O-、-O-CO-、-CO-NY109B-、-NY109C-CO-、-NY109D-CO-0-または-CO-であり（式中、Y109A〜Y109Dは同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルである）、p44は1〜5の整数であり、p45は0〜5の整数であり、p46は1〜5の整数であり、p47は0〜5の整数であり、p48は1〜5の整数であり、p49は1〜5の整数である）であり、
J3はCY110またはN(式中、Y110は水素原子、ヒドロキシ、置換されていても良いC1-C4アルキル、置換されていても良いC1-C4アルコキシ、または置換されていても良いC1-C4アシルオキシである)であり、
X14およびX15は同一または異なって置換されていても良いC1-C4アルキルであるか、または一緒になって隣接する窒素原子とともに置換されていても良いC4-C6ヘテロ環を形成し、
A4は薬学的に許容される陰イオンである）、または
式(V’)もしくは式(V’’)
Figure 0006910947
 （式中、
R13〜R18は同一または異なって直鎖もしくは分枝状の置換されていても良いC8-C24アルキル、C8-C24アルケニルまたはC8-C24アルキニルであり、
Y111〜Y114は同一または異なって水素原子、ヒドロキシまたは置換されていても良いC1-C4アルキルであり、
L17〜L19およびL22〜L24は同一または異なって存在しないか、-Z32-(CY115Y116)p51-または-Z33-(CY117Y118)p52-Z34-(CY119Y120)p53-（式中、Y115〜Y120は同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルであり、Z32〜Z34は同一または異なって、-O-、-NY121A-、-CO-O-、-O-CO-、-CO-NY121B-、-NY121C-CO-、-NY121D-CO-0-または-CO-であり（式中、Y121A〜Y121Dは同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルである）、p51は0〜5の整数であり、p52は1〜5の整数であり、p53は0〜5の整数である）であり、
L20およびL25は同一または異なって存在しないか、-(CY122Y123)p54-、-(CY124Y125)p55-Z35-(CY126Y127)p56-または-(CY128Y129)p57-Z36-(CY130Y131)p58-Z37-(CY132Y133)p59-（式中、Y122〜Y133は同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルであり、Z35〜Z37は同一または異なって、-O-、-NY134A-、-CO-O-、-O-CO-、-CO-NY134B-、-NY134C-CO-、-NY134D-CO-0-または-CO-であり（式中、Y134A〜Y134Dは同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルである）、p54は1〜5の整数であり、p55は0〜5の整数であり、p56は1〜5の整数であり、p57は0〜5の整数であり、p58は1〜5の整数であり、p59は1〜5の整数である）であり、
L21およびL26は同一または異なって存在しないか、-(CY135Y136)p60-、-(CY137Y138)p61-Z38-(CY139Y140)p62-または-(CY141Y142)p63-Z39-(CY143Y144)p64-Z40-(CY145Y146)p65-（式中、Y135〜Y146は同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルであり、Z38〜Z40は同一または異なって、-O-、-NY147A-、-CO-O-、-O-CO-、-CO-NY147B-、-NR147C-CO-、-NY147D-CO-0-または-CO-であり（式中、Y147A〜Y147Dは同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルである）、p60は1〜5の整数であり、p61は0〜5の整数であり、p62は0〜5の整数であり、p63は0〜5の整数であり、p64は1〜5の整数であり、p65は0〜5の整数である）であり、
B3およびB4は同一または異なって、
Figure 0006910947
 （式中、X16およびX17は同一または異なって置換されていても良いC1-C4アルキルであるか、または一緒になって隣接する窒素原子とともに置換されていても良いC4-C6ヘテロ環を形成し、X18は置換されていても良いC1-C4アルキルであり、X19およびX20は同一または異なって置換されていても良いC1-C4アルキルであるか、または一緒になって隣接する窒素原子とともに置換されていても良いC4-C6ヘテロ環を形成し、X21は置換されていても良いC1-C4アルキルであり、Y148〜Y157は同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルであり、Z41およびZ42は同一または異なって-O-、-NY158A-、-CO-O-、-O-CO-、-CO-NY158B-、-NY158C-CO-または-NY158D-CO-0-であり（式中、Y158A〜Y158Dは同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルである）、p66は0〜5の整数であり、p67〜p70は同一または異なって1〜5の整数である）であり、
A5およびA6は同一または異なって薬学的に許容される陰イオンである）
で表される脂質またはそれらの組み合わせである、(68)または(69)記載の方法。
(71)
脂質Aが式（I）で表される脂質であり、式(I)において、L1〜L3のうち1つが-CO-O-(CY1Y2)p1-または-O-CO-(CY1Y2)p1-であるか、L1〜L3のうち2つ以上が同一または異なって-CO-O-(CY1Y2)p1-または-O-CO-(CY1Y2)p1-であり、R1〜R3が直鎖または分枝状のC15-C20アルケニルまたはC9-C18アルキルであり、かつ同一である、(70)記載の方法。
(72)
脂質Aが式（II）で表される脂質であり、式(II)において、L4〜L6のうち1つが-CO-O-(CY8Y9)p4-、-O-CO-(CY8Y9)p4-、または-O-CO-(CY10Y11)p5-O-(CY12Y13)p6-であるか、L4〜L6のうち2つ以上が同一または異なって-CO-O-(CY8Y9)p4-、-O-CO-(CY8Y9)p4-、または-O-CO-(CY10Y11)p5-O-(CY12Y13)p6-であり、R4〜R6が直鎖または分枝状のC15-C20アルケニルまたはC9-C18アルキルであり、かつ同一である、(70)記載の方法。
(73)
脂質Aが式（III）で表される脂質であり、式(III)において、L8〜L10のうち1つが-CO-O-(CY39Y40)p18-または-O-CO-(CY39Y40)p18-であるか、L8〜L10のうち2つ以上が同一または異なって-CO-O-(CY39Y40)p18または-O-CO-(CY39Y40)p18-であり、R7〜R9が直鎖または分枝状のC15-C20アルケニルまたはC9-C18アルキルである、(70)記載の方法。
(74)
脂質Aが式（IV）で表される脂質であり、式(IV)において、L13が-CO-O-(CY83Y84)p38-あるいは-O-CO-(CY83Y84)p38-であるか、L14およびL15のうち1つが-CO-O-(CY90Y91)p41-あるいは-O-CO-(CY90Y91)p41-であるか、L13が-CO-O-(CY83Y84)p38-あるいは-O-CO-(CY83Y84)p38-であり、かつL14およびL15のうち1つが-CO-O-(CY90Y91)p41-あるいは-O-CO-(CY90Y91)p41-であるか、L14およびL15が同一あるいは異なって-CO-O-(CY90Y91)p41-あるいは-O-CO-(CY90Y91)p41-であるか、またはL13が-CO-O-(CY83Y84)p38-あるいは-O-CO-(CY83Y84)p38-であり、かつL14およびL15が同一あるいはは異なって-CO-O-(CY90Y91)p41-または-O-CO-(CY90Y91)p41-であり、R10〜R12が直鎖または分枝状のC15-C20アルケニルまたはC9-C18アルキルである、(70)記載の方法。
(75)
脂質Aが式（V’）で表される脂質であり、式(V’)において、L17〜L19のうち1つが-CO-O-または-O-であるか、L17〜L19のうち2つ以上が同一または異なって-CO-O-または-O-であり、R13〜R15が直鎖または分枝状のC15-C20アルケニルまたはC9-C18アルキルである、(70)記載の方法。
(76)
式(I)
Figure 0006910947
 （式中、
R1〜R3は同一または異なって直鎖もしくは分枝状の置換されていても良いC8-C24アルキル、C8-C24アルケニルまたはC8-C24アルキニルであり、
L1〜L3は同一または異なって存在しないか、-Z1-(CY1Y2)p1-または-Z2-(CY3Y4)p2-Z3-(CY5Y6)p3-（式中、Y1〜Y6は同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルであり、Z1〜Z3は同一または異なって、-O-、-NY7A-、-CO-O-、-O-CO-、-CO-NY7B-、-NY7C-CO-または-NY7D-CO-0-であり（式中、Y7A〜Y7Dは同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルである）、p1〜p3は同一または異なって1〜5の整数である）であり、
X1は置換されていても良いC1-C4アルキルであり、
A1は薬学的に許容される陰イオンである）、
式(II)
Figure 0006910947
 （式中、
R4〜R6は同一または異なって直鎖もしくは分枝状の置換されていても良いC8-C24アルキル、C8-C24アルケニルまたはC8-C24アルキニルであり、
L4〜L6は同一または異なって存在しないか、-Z4-(CY8Y9)p4-または-Z5-(CY10Y11)p5-Z6-(CY12Y13)p6-（式中、Y8〜Y13は同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルであり、Z4〜Z6は同一または異なって、-O-、-NY14A-、-CO-O-、-O-CO-、-CO-NY14B-、-NY14C-CO-または-NY14D-CO-0-であり（式中、Y14A〜Y14Dは同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルである）、p4は0〜5の整数であり、p5は1〜5の整数であり、p6は0〜5の整数である）であり、
L7は存在しないか、-(CY15Y16)p7-、-(CY17Y18)p8-Z7-(CY19Y20)p9-または-(CY21Y22)p10-Z8-(CY23Y24)p11-Z9-(CY25Y26)p12-（式中、Y15〜Y26は同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルであり、Z7〜Z9は同一または異なって、-O-、-NY27A-、-CO-O-、-O-CO-、-CO-NY27B-、-NY27C-CO-または-NY27D-CO-0-であり（式中、Y27A〜Y27Dは同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルである）、p7は1〜5の整数であり、p8は0〜5の整数であり、p9は1〜5の整数であり、p10は0〜5の整数であり、p11は1〜5の整数であり、p12は1〜5の整数である）であり、
B1は、
Figure 0006910947
 （式中、X2およびX3は同一または異なって置換されていても良いC1-C4アルキルであるか、または一緒になって隣接する窒素原子とともに置換されていても良いC4-C6ヘテロ環を形成し、X4は置換されていても良いC1-C4アルキルであり、X5およびX6は同一または異なって置換されていても良いC1-C4アルキルであるか、または一緒になって隣接する窒素原子とともに置換されていても良いC4-C6ヘテロ環を形成し、X7は置換されていても良いC1-C4アルキルであり、Y28〜Y37は同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルであり、Z10およびZ11は同一または異なって-O-、-NY38A-、-CO-O-、-O-CO-、-CO-NY38B-、-NY38C-CO-または-NY38D-CO-0-であり（式中、Y38A〜Y38Dは同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルである）、p13は0〜5の整数であり、p14〜p17は同一または異なって1〜5の整数である）であり、
A2は薬学的に許容される陰イオンである）、
式(III)
Figure 0006910947
 （式中、
R7〜R9は同一または異なって直鎖もしくは分枝状の置換されていても良いC8-C24アルキル、C8-C24アルケニルまたはC8-C24アルキニルであり、
L8〜L10は同一または異なって存在しないか、-Z12-(CY39Y40)p18-または-Z13-(CY41Y42)p19-Z14-(CY43Y44)p20-（式中、Y39〜Y44は同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルであり、Z12〜Z14は同一または異なって、-O-、-NY45A-、-CO-O-、-O-CO-、-CO-NY45B-、-NY45C-CO-、-NY45D-CO-0-または-CO-であり（式中、Y45A〜Y45Dは同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルである）、p18は0〜5の整数であり、p19は1〜5の整数であり、p20は0〜5の整数である）であり、
L11は存在しないか、-(CY46Y47)p21-、-(CY48Y49)p22-Z15-(CY50Y51)p23-または-(CY52Y53)p24-Z16-(CY54Y55)p25-Z17-(CY56Y57)p26-（式中、Y46〜Y57は同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルであり、Z15〜Z17は同一または異なって、-O-、-NY58A-、-CO-O-、-O-CO-、-CO-NY58B-、-NY58C-CO-、-NY58D-CO-0-または-CO-であり（式中、Y58A〜Y58Dは同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルである）、p21は1〜5の整数であり、p22は0〜5の整数であり、p23は1〜5の整数であり、p24は0〜5の整数であり、p25は1〜5の整数であり、p26は1〜5の整数である）であり、
L12は存在しないか、-(CY59Y60)p27-、-(CY61Y62)p28-Z18-(CY63Y64)p29-または-(CY65Y66)p30-Z19-(CY67Y68)p31-Z20-(CY69Y70)p32-（式中、Y59〜Y70は同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルであり、Z18〜Z20は同一または異なって、-O-、-NY71A-、-CO-O-、-O-CO-、-CO-NY71B-、-NY71C-CO-、-NY71D-CO-0-または-CO-であり（式中、Y71A〜Y71Dは同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルである）、p27は1〜5の整数であり、p28は0〜5の整数であり、p29は0〜5の整数であり、p30は0〜5の整数であり、p31は1〜5の整数であり、p32は0〜5の整数である）であり、
J1およびJ2は同一または異なってCY72またはN(式中、Y72は水素原子、ヒドロキシ、置換されていても良いC1-C4アルキル、置換されていても良いC1-C4アルコキシ、または置換されていても良いC1-C4アシルオキシである)であり、
B2は、
Figure 0006910947
 （式中、X8およびX9は同一または異なって置換されていても良いC1-C4アルキルであるか、または一緒になって隣接する窒素原子とともに置換されていても良いC4-C6ヘテロ環を形成し、X10は置換されていても良いC1-C4アルキルであり、X11およびX12は同一または異なって置換されていても良いC1-C4アルキルであるか、または一緒になって隣接する窒素原子とともに置換されていても良いC4-C6ヘテロ環を形成し、X13は置換されていても良いC1-C4アルキルであり、Y73〜Y82は同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルであり、Z21およびZ22は同一または異なって-O-、-NY83A-、-CO-O-、-O-CO-、-CO-NY83B-、-NY83C-CO-または-NY83D-CO-0-であり（式中、Y83A〜Y83Dは同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルである）、p33は0〜5の整数であり、p34〜p37は同一または異なって1〜5の整数である）であり、
A3は薬学的に許容される陰イオンである）、
式(IV)
Figure 0006910947
 （式中、
R10〜R12は同一または異なって直鎖もしくは分枝状の置換されていても良いC8-C24アルキル、C8-C24アルケニルまたはC8-C24アルキニルであり、
L13は存在しないか、-Z23-(CY83Y84)p38-または-Z24-(CY85Y86)p39-Z25-(CY87Y88)p40-（式中、Y83〜Y88は同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルであり、Z23〜Z25は同一または異なって、-O-、-NY89A-、-CO-O-、-O-CO-、-CO-NY89B-、-NY89C-CO-または-NY89D-CO-0-であり（式中、Y89A〜Y89Dは同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルである）、p38〜p40は同一または異なって1〜5の整数である）であり、
L14およびL15は同一または異なって存在しないか、-Z26-(CY90Y91)p41-または-Z27-(CY92Y93)p42-Z28-(CY94Y95)p43-（式中、Y90〜Y95は同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルであり、Z26〜Z28は同一または異なって、-O-、-NY96A-、-CO-O-、-O-CO-、-CO-NY96B-、-NY96C-CO-、-NY96D-CO-0-または-CO-であり（式中、Y96A〜Y96Dは同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルである）、p41は0〜5の整数であり、p42は1〜5の整数であり、p43は0〜5の整数である）であり、
L16は存在しないか、-(CY97Y98)p44-、-(CY99Y100)p45-Z29-(CY101Y102)p46-または-(CY103Y104)p47-Z30-(CY105Y106)p48-Z31-(CY107Y108)p49-（式中、Y97〜Y108は同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルであり、Z29〜Z31は同一または異なって、-O-、-NY109A-、-CO-O-、-O-CO-、-CO-NY109B-、-NY109C-CO-、-NY109D-CO-0-または-CO-であり（式中、Y109A〜Y109Dは同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルである）、p44は1〜5の整数であり、p45は0〜5の整数であり、p46は1〜5の整数であり、p47は0〜5の整数であり、p48は1〜5の整数であり、p49は1〜5の整数である）であり、
J3はCY110またはN(式中、Y110は水素原子、ヒドロキシ、置換されていても良いC1-C4アルキル、置換されていても良いC1-C4アルコキシ、または置換されていても良いC1-C4アシルオキシである)であり、
X14およびX15は同一または異なって置換されていても良いC1-C4アルキルであるか、または一緒になって隣接する窒素原子とともに置換されていても良いC4-C6ヘテロ環を形成し、
A4は薬学的に許容される陰イオンである）、または
式(V’)もしくは式(V’’)
Figure 0006910947
 （式中、
R13〜R18は同一または異なって直鎖もしくは分枝状の置換されていても良いC8-C24アルキル、C8-C24アルケニルまたはC8-C24アルキニルであり、
Y111〜Y114は同一または異なって水素原子、ヒドロキシまたは置換されていても良いC1-C4アルキルであり、
L17〜L19およびL22〜L24は同一または異なって存在しないか、-Z32-(CY115Y116)p51-または-Z33-(CY117Y118)p52-Z34-(CY119Y120)p53-（式中、Y115〜Y120は同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルであり、Z32〜Z34は同一または異なって、-O-、-NY121A-、-CO-O-、-O-CO-、-CO-NY121B-、-NY121C-CO-、-NY121D-CO-0-または-CO-であり（式中、Y121A〜Y121Dは同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルである）、p51は0〜5の整数であり、p52は1〜5の整数であり、p53は0〜5の整数である）であり、
L20およびL25は同一または異なって存在しないか、-(CY122Y123)p54-、-(CY124Y125)p55-Z35-(CY126Y127)p56-または-(CY128Y129)p57-Z36-(CY130Y131)p58-Z37-(CY132Y133)p59-（式中、Y122〜Y133は同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルであり、Z35〜Z37は同一または異なって、-O-、-NY134A-、-CO-O-、-O-CO-、-CO-NY134B-、-NY134C-CO-、-NY134D-CO-0-または-CO-であり（式中、Y134A〜Y134Dは同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルである）、p54は1〜5の整数であり、p55は0〜5の整数であり、p56は1〜5の整数であり、p57は0〜5の整数であり、p58は1〜5の整数であり、p59は1〜5の整数である）であり、
L21およびL26は同一または異なって存在しないか、-(CY135Y136)p60-、-(CY137Y138)p61-Z38-(CY139Y140)p62-または-(CY141Y142)p63-Z39-(CY143Y144)p64-Z40-(CY145Y146)p65-（式中、Y135〜Y146は同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルであり、Z38〜Z40は同一または異なって、-O-、-NY147A-、-CO-O-、-O-CO-、-CO-NY147B-、-NR147C-CO-、-NY147D-CO-0-または-CO-であり（式中、Y147A〜Y147Dは同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルである）、p60は1〜5の整数であり、p61は0〜5の整数であり、p62は0〜5の整数であり、p63は0〜5の整数であり、p64は1〜5の整数であり、p65は0〜5の整数である）であり、
B3およびB4は同一または異なって、
Figure 0006910947
 （式中、X16およびX17は同一または異なって置換されていても良いC1-C4アルキルであるか、または一緒になって隣接する窒素原子とともに置換されていても良いC4-C6ヘテロ環を形成し、X18は置換されていても良いC1-C4アルキルであり、X19およびX20は同一または異なって置換されていても良いC1-C4アルキルであるか、または一緒になって隣接する窒素原子とともに置換されていても良いC4-C6ヘテロ環を形成し、X21は置換されていても良いC1-C4アルキルであり、Y148〜Y157は同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルであり、Z41およびZ42は同一または異なって-O-、-NY158A-、-CO-O-、-O-CO-、-CO-NY158B-、-NY158C-CO-または-NY158D-CO-0-であり（式中、Y158A〜Y158Dは同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルである）、p66は0〜5の整数であり、p67〜p70は同一または異なって1〜5の整数である）であり、
A5およびA6は同一または異なって薬学的に許容される陰イオンである）
で表される脂質からなる群より選択される、1つの4級アンモニウム基を有する親水部および置換基を有していても良い独立した3つの炭化水素基を有する脂質(脂質A)。
(77)
脂質Aが式（I）で表される脂質であり、式(I)において、L1〜L3のうち1つが-CO-O-(CY1Y2)p1-または-O-CO-(CY1Y2)p1-であるか、L1〜L3のうち2つ以上が同一または異なって-CO-O-(CY1Y2)p1-または-O-CO-(CY1Y2)p1-であり、R1〜R3が直鎖または分枝状のC15-C20アルケニルまたはC9-C18アルキルであり、かつ同一である、(76)記載の脂質。
(78)
脂質Aが式（II）で表される脂質であり、式(II)において、L4〜L6のうち1つが-CO-O-(CY8Y9)p4-、-O-CO-(CY8Y9)p4-、または-O-CO-(CY10Y11)p5-O-(CY12Y13)p6-であるか、L4〜L6のうち2つ以上が同一または異なって-CO-O-(CY8Y9)p4-、-O-CO-(CY8Y9)p4-、または-O-CO-(CY10Y11)p5-O-(CY12Y13)p6-であり、R4〜R6が直鎖または分枝状のC15-C20アルケニルまたはC9-C18アルキルであり、かつ同一である、(76)記載の脂質。
(79)
脂質Aが式（III）で表される脂質であり、式(III)において、L8〜L10のうち1つが-CO-O-(CY39Y40)p18-または-O-CO-(CY39Y40)p18-であるか、L8〜L10のうち2つ以上が同一または異なって-CO-O-(CY39Y40)p18または-O-CO-(CY39Y40)p18-であり、R7〜R9が直鎖または分枝状のC15-C20アルケニルまたはC9-C18アルキルである、(76)記載の脂質。
(80)
脂質Aが式（IV）で表される脂質であり、式(IV)において、L13が-CO-O-(CY83Y84)p38-あるいは-O-CO-(CY83Y84)p38-であるか、L14およびL15のうち1つが-CO-O-(CY90Y91)p41-あるいは-O-CO-(CY90Y91)p41-であるか、L13が-CO-O-(CY83Y84)p38-あるいは-O-CO-(CY83Y84)p38-であり、かつL14およびL15のうち1つが-CO-O-(CY90Y91)p41-あるいは-O-CO-(CY90Y91)p41-であるか、L14およびL15が同一あるいは異なって-CO-O-(CY90Y91)p41-あるいは-O-CO-(CY90Y91)p41-であるか、またはL13が-CO-O-(CY83Y84)p38-あるいは-O-CO-(CY83Y84)p38-であり、かつL14およびL15が同一あるいはは異なって-CO-O-(CY90Y91)p41-または-O-CO-(CY90Y91)p41-であり、R10〜R12が直鎖または分枝状のC15-C20アルケニルまたはC9-C18アルキルである、(76)記載の脂質。
(81)
脂質Aが式（V’）で表される脂質であり、式(V’)において、L17〜L19のうち1つが-CO-O-または-O-であるか、L17〜L19のうち2つ以上が同一または異なって-CO-O-または-O-であり、R13〜R15が直鎖または分枝状のC15-C20アルケニルまたはC9-C18アルキルである、(76)記載の脂質。
(82)
(1)〜(21)および(67)のいずれか1項に記載の核酸含有脂質ナノ粒子を用いる、核酸を細胞内に導入する方法。
(83)
細胞がほ乳類の腫瘍または炎症部位にある細胞である、(82)記載の方法。
(84)
細胞がほ乳類の肝臓、胃、肺、腎臓、膵臓または脾臓にある細胞である、(83)記載の方法。
(85)
細胞内に導入する方法が、静脈内投与また皮下投与によって細胞内に導入する方法である、(82)〜(84)のいずれか１項に記載の方法。
(86)
(1)〜(21)および(67)のいずれか1項に記載の核酸含有脂質ナノ粒子を哺乳動物に投与することを含む、癌または炎症疾患の治療方法。
(87)
投与する方法が、静脈内投与また皮下投与である、(86)記載の方法。
(88)
(1)〜(21)および(67)のいずれか1項に記載の核酸含有脂質ナノ粒子を含む、医薬。
(89)
静脈内投与用また皮下投与用である、(88)記載の医薬。
(90)
(1)〜(21)および(67)のいずれか1項に記載の核酸含有脂質ナノ粒子を含む、癌または炎症疾患の治療剤。
(91)
静脈内投与用また皮下投与用である、(90)記載の治療剤。
本発明により、医薬として有用で、従来の粒子に比して、安定かつ小型化された核酸含有脂質ナノ粒子、および該脂質ナノ粒子の製造方法等を提供することができる。また、本発明により、該脂質ナノ粒子の製造に有用な脂質等を提供することができる。
脂質Aを含む核酸含有脂質ナノ粒子に搭載された核酸の血清ヌクレアーゼによる分解に対する耐性を示す。横軸は未処理の核酸、核酸単体、または核酸含有製剤番号を表し、縦軸は未分解の核酸と血清ヌクレアーゼにより分解された核酸の位置を表す。 脂質Aを含む核酸含有脂質ナノ粒子の遺伝子抑制評価結果を示す。横軸は用いた製剤番号および核酸濃度を表し、縦軸は遺伝子抑制率を表す。 脂質Aおよび中性脂質を含む核酸含有脂質ナノ粒子の遺伝子抑制評価結果を示す。横軸は用いた製剤番号および核酸濃度を表し、縦軸は遺伝子抑制率を表す。 脂質A、中性脂質および種々カチオン性脂質を含む核酸含有脂質ナノ粒子の遺伝子抑制評価結果を示す。横軸は用いた製剤番号および核酸濃度を表し、縦軸は遺伝子抑制率を表す。 核酸含有脂質ナノ粒子のコラーゲンゲルに対する浸透性評価結果を示す。横軸は用いた製剤番号を表し、黒色の幅は核酸含有脂質ナノ粒子の浸透幅を表す。 核酸含有脂質ナノ粒子のコラーゲンゲルに対する浸透性評価結果を示す。白色の幅は核酸含有脂質ナノ粒子の浸透幅を表す。 図6の核酸含有脂質ナノ粒子のコラーゲンゲルに対する浸透距離を評価した結果を示す。グラフ横軸は浸透した距離（mm）を表し、グラフ縦軸は正規化した蛍光強度を示す。各マーカーは核酸単体（□）、製剤197（○）、製剤199（△）を表す。
以下、本発明を実施する形態について詳細に説明する。なお、以下に説明する実施形態は、本発明を限定するものではない。
本発明の核酸含有脂質ナノ粒子は、1つの4級アンモニウム基を有する親水部および置換基を有していても良い独立した3つの炭化水素基を有する脂質(脂質A)、水溶性高分子の脂質誘導体または脂肪酸誘導体、ならびに核酸を含む。本発明においては、1つの4級アンモニウム基を有する親水部および置換基を有していても良い独立した3つの炭化水素基を有する脂質(脂質A)を用いて、水溶性高分子の脂質誘導体または脂肪酸誘導体、および核酸とともに、核酸含有脂質ナノ粒子とすることで、物理化学的安定性および生理活性においてより優れた核酸含有脂質ナノ粒子を得ることができる。
本発明における、1つの4級アンモニウム基を有する親水部および置換基を有していても良い独立した3つの炭化水素基を有する脂質(脂質A)としては、分子内に親水部として1つの4級アンモニウム基を有し、かつ置換基を有していても良い独立した3つの炭化水素基を有する分子であれば特に制限されないが、例えば、下記構造式（A）〜（C）で表される。下記構造式(A)〜（C）において、「親水部（Hydrophilic Unit）」は、1つの4級アンモニウム基を有する親水部を表し、3つの「疎水部(Hydrophobic Unit)」は、置換基を有していても良い独立した3つの炭化水素基を表す。
「親水部（Hydrophilic Unit）」を構成する4級アンモニウム基は、その4つの結合手のうちの0〜3個が、「疎水部(Hydrophobic Unit)」を形成する炭化水素基のいずれか0〜3個と結合しており、残りの結合手が、1以上の置換基を有していてもよい鎖状および／または環状炭化水素基等と結合している。「親水部（Hydrophilic Unit）」を構成する置換基を有していてもよい鎖状および／または環状炭化水素基としては、炭素原子と水素原子とからなる基であればいずれでも良いが、炭素数1〜10のものが好ましく、炭素数1〜6のものがより好ましく、炭素数1〜3のものがさらに好ましい。
また、「親水部（Hydrophilic Unit）」は、これを構成する置換基を有していてもよい鎖状および／または環状炭化水素基等中の炭素原子を介して、１以上のエーテル、エステル、アミド等を有していてもよい。さらに、置換基を有していてもよい鎖状および／または環状炭化水素基等における置換基としては、カルバマート、アミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ピロリジン-2-イル、ピロリジン-3-イル、ピペリジン-2-イル、ピペリジン-3-イル、ピペリジン-4-イル、モルホリン-2-イル、モルホリン-3-イル、ヒドロキシ、アルコキシ、アルコキシカルボニル、ヒドロキシカルボニル、カルバモイル、モノアルキルカルバモイル、ジアルキルカルバモイル、ニトロ、シアノ、フルオロ、クロロ、もしくはブロモ等が挙げられる。
また、「疎水部(Hydrophobic Unit)」を形成する炭化水素基としては、8〜24個の炭素原子と水素原子とからなる基であればいずれでも良い。炭化水素基は、トポロジーの観点から分類することができ、例えば、直鎖の炭化水素基、分枝状の炭化水素基または環状の炭化水素基（例えば、コレステリル基等）が挙げられるが、直鎖または分枝状の炭化水素基が好ましい。また、炭化水素基は、不飽和結合（２重結合または３重結合）の有無で分類することもでき、不飽和結合を有する炭化水素基は、芳香族性の有無で分類することもできるが、飽和結合のみからなる炭化水素基（アルキル）または不飽和結合を有しかつ芳香族性の無い炭化水素基（例えば、アルケニルまたはアルキニル等）が好ましい。脂質Aにおける炭化水素基としては、直鎖または分枝状のC8-C24アルキル、C8-C24アルケニル、C8-C24アルキニルが好ましい。
「疎水部(Hydrophobic Unit)」を形成する炭化水素基は、それぞれ「親水部（Hydrophilic Unit）」の4級アンモニウム基と直接結合しても良いし、エーテル、エステル、アミド等の結合および「親水部」を構成する置換基を有していてもよい鎖状ならびに／もしくは環状炭化水素基等を介して4級アンモニウム基と結合しても良い。また、構造式(B)や(C)で示されるように、2個または3個の「疎水部(Hydrophobic Unit)」を形成する炭化水素基が、炭素原子を介して結合し、その炭素原子が「親水部（Hydrophilic Unit）」の4級アンモニウム基と直接または、エーテル、エステル、アミド等の結合および「親水部」を構成する置換基を有していてもよい鎖状ならびに／もしくは環状炭化水素基等を介して4級アンモニウム基と結合しても良い。
Figure 0006910947
脂質Aとしては、
式(I)
Figure 0006910947
 （式中、
R1〜R3は同一または異なって直鎖もしくは分枝状の置換されていても良いC8-C24アルキル、C8-C24アルケニルまたはC8-C24アルキニルであり、
L1〜L3は同一または異なって存在しないか、-Z1-(CY1Y2)p1-または-Z2-(CY3Y4)p2-Z3-(CY5Y6)p3-（式中、Y1〜Y6は同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルであり、Z1〜Z3は同一または異なって、-O-、-NY7A-、-CO-O-、-O-CO-、-CO-NY7B-、-NY7C-CO-または-NY7D-CO-0-であり（式中、Y7A〜Y7Dは同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルである）、p1〜p3は同一または異なって1〜5の整数である）であり、
X1は置換されていても良いC1-C4アルキルであり、
A1は薬学的に許容される陰イオンである）、
式(II)
Figure 0006910947
 （式中、
R4〜R6は同一または異なって直鎖もしくは分枝状の置換されていても良いC8-C24アルキル、C8-C24アルケニルまたはC8-C24アルキニルであり、
L4〜L6は同一または異なって存在しないか、-Z4-(CY8Y9)p4-または-Z5-(CY10Y11)p5-Z6-(CY12Y13)p6-（式中、Y8〜Y13は同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルであり、Z4〜Z6は同一または異なって、-O-、-NY14A-、-CO-O-、-O-CO-、-CO-NY14B-、-NY14C-CO-または-NY14D-CO-0-であり（式中、Y14A〜Y14Dは同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルである）、p4は0〜5の整数であり、p5は1〜5の整数であり、p6は0〜5の整数である）であり、
L7は存在しないか、-(CY15Y16)p7-、-(CY17Y18)p8-Z7-(CY19Y20)p9-または-(CY21Y22)p10-Z8-(CY23Y24)p11-Z9-(CY25Y26)p12-（式中、Y15〜Y26は同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルであり、Z7〜Z9は同一または異なって、-O-、-NY27A-、-CO-O-、-O-CO-、-CO-NY27B-、-NY27C-CO-または-NY27D-CO-0-であり（式中、Y27A〜Y27Dは同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルである）、p7は1〜5の整数であり、p8は0〜5の整数であり、p9は1〜5の整数であり、p10は0〜5の整数であり、p11は1〜5の整数であり、p12は1〜5の整数である）であり、
B1は、
Figure 0006910947
 （式中、X2およびX3は同一または異なって置換されていても良いC1-C4アルキルであるか、または一緒になって隣接する窒素原子とともに置換されていても良いC4-C6ヘテロ環を形成し、X4は置換されていても良いC1-C4アルキルであり、X5およびX6は同一または異なって置換されていても良いC1-C4アルキルであるか、または一緒になって隣接する窒素原子とともに置換されていても良いC4-C6ヘテロ環を形成し、X7は置換されていても良いC1-C4アルキルであり、Y28〜Y37は同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルであり、Z10およびZ11は同一または異なって-O-、-NY38A-、-CO-O-、-O-CO-、-CO-NY38B-、-NY38C-CO-または-NY38D-CO-0-であり（式中、Y38A〜Y38Dは同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルである）、p13は0〜5の整数であり、p14〜p17は同一または異なって1〜5の整数である）であり、
A2は薬学的に許容される陰イオンである）、
式(III)
Figure 0006910947
 （式中、
R7〜R9は同一または異なって直鎖もしくは分枝状の置換されていても良いC8-C24アルキル、C8-C24アルケニルまたはC8-C24アルキニルであり、
L8〜L10は同一または異なって存在しないか、-Z12-(CY39Y40)p18-または-Z13-(CY41Y42)p19-Z14-(CY43Y44)p20-（式中、Y39〜Y44は同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルであり、Z12〜Z14は同一または異なって、-O-、-NY45A-、-CO-O-、-O-CO-、-CO-NY45B-、-NY45C-CO-、-NY45D-CO-0-または-CO-であり（式中、Y45A〜Y45Dは同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルである）、p18は0〜5の整数であり、p19は1〜5の整数であり、p20は0〜5の整数である）であり、
L11は存在しないか、-(CY46Y47)p21-、-(CY48Y49)p22-Z15-(CY50Y51)p23-または-(CY52Y53)p24-Z16-(CY54Y55)p25-Z17-(CY56Y57)p26-（式中、Y46〜Y57は同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルであり、Z15〜Z17は同一または異なって、-O-、-NY58A-、-CO-O-、-O-CO-、-CO-NY58B-、-NY58C-CO-、-NY58D-CO-0-または-CO-であり（式中、Y58A〜Y58Dは同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルである）、p21は1〜5の整数であり、p22は0〜5の整数であり、p23は1〜5の整数であり、p24は0〜5の整数であり、p25は1〜5の整数であり、p26は1〜5の整数である）であり、
L12は存在しないか、-(CY59Y60)p27-、-(CY61Y62)p28-Z18-(CY63Y64)p29-または-(CY65Y66)p30-Z19-(CY67Y68)p31-Z20-(CY69Y70)p32-（式中、Y59〜Y70は同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルであり、Z18〜Z20は同一または異なって、-O-、-NY71A-、-CO-O-、-O-CO-、-CO-NY71B-、-NY71C-CO-、-NY71D-CO-0-または-CO-であり（式中、Y71A〜Y71Dは同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルである）、p27は1〜5の整数であり、p28は0〜5の整数であり、p29は0〜5の整数であり、p30は0〜5の整数であり、p31は1〜5の整数であり、p32は0〜5の整数である）であり、
J1およびJ2は同一または異なってCY72またはN(式中、Y72は水素原子、ヒドロキシ、置換されていても良いC1-C4アルキル、置換されていても良いC1-C4アルコキシ、または置換されていても良いC1-C4アシルオキシである)であり、
B2は、
Figure 0006910947
 （式中、X8およびX9は同一または異なって置換されていても良いC1-C4アルキルであるか、または一緒になって隣接する窒素原子とともに置換されていても良いC4-C6ヘテロ環を形成し、X10は置換されていても良いC1-C4アルキルであり、X11およびX12は同一または異なって置換されていても良いC1-C4アルキルであるか、または一緒になって隣接する窒素原子とともに置換されていても良いC4-C6ヘテロ環を形成し、X13は置換されていても良いC1-C4アルキルであり、Y73〜Y82は同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルであり、Z21およびZ22は同一または異なって-O-、-NY83A-、-CO-O-、-O-CO-、-CO-NY83B-、-NY83C-CO-または-NY83D-CO-0-であり（式中、Y83A〜Y83Dは同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルである）、p33は0〜5の整数であり、p34〜p37は同一または異なって1〜5の整数である）であり、
A3は薬学的に許容される陰イオンである）、
式(IV)
Figure 0006910947
 （式中、
R10〜R12は同一または異なって直鎖もしくは分枝状の置換されていても良いC8-C24アルキル、C8-C24アルケニルまたはC8-C24アルキニルであり、
L13は存在しないか、-Z23-(CY83Y84)p38-または-Z24-(CY85Y86)p39-Z25-(CY87Y88)p40-（式中、Y83〜Y88は同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルであり、Z23〜Z25は同一または異なって、-O-、-NY89A-、-CO-O-、-O-CO-、-CO-NY89B-、-NY89C-CO-または-NY89D-CO-0-であり（式中、Y89A〜Y89Dは同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルである）、p38〜p40は同一または異なって1〜5の整数である）であり、
L14およびL15は同一または異なって存在しないか、-Z26-(CY90Y91)p41-または-Z27-(CY92Y93)p42-Z28-(CY94Y95)p43-（式中、Y90〜Y95は同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルであり、Z26〜Z28は同一または異なって、-O-、-NY96A-、-CO-O-、-O-CO-、-CO-NY96B-、-NY96C-CO-、-NY96D-CO-0-または-CO-であり（式中、Y96A〜Y96Dは同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルである）、p41は0〜5の整数であり、p42は1〜5の整数であり、p43は0〜5の整数である）であり、
L16は存在しないか、-(CY97Y98)p44-、-(CY99Y100)p45-Z29-(CY101Y102)p46-または-(CY103Y104)p47-Z30-(CY105Y106)p48-Z31-(CY107Y108)p49-（式中、Y97〜Y108は同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルであり、Z29〜Z31は同一または異なって、-O-、-NY109A-、-CO-O-、-O-CO-、-CO-NY109B-、-NY109C-CO-、-NY109D-CO-0-または-CO-であり（式中、Y109A〜Y109Dは同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルである）、p44は1〜5の整数であり、p45は0〜5の整数であり、p46は1〜5の整数であり、p47は0〜5の整数であり、p48は1〜5の整数であり、p49は1〜5の整数である）であり、
J3はCY110またはN(式中、Y110は水素原子、ヒドロキシ、置換されていても良いC1-C4アルキル、置換されていても良いC1-C4アルコキシ、または置換されていても良いC1-C4アシルオキシである)であり、
X14およびX15は同一または異なって置換されていても良いC1-C4アルキルであるか、または一緒になって隣接する窒素原子とともに置換されていても良いC4-C6ヘテロ環を形成し、
A4は薬学的に許容される陰イオンである）、または
式(V’)もしくは式(V’’)
Figure 0006910947
 （式中、
R13〜R18は同一または異なって直鎖もしくは分枝状の置換されていても良いC8-C24アルキル、C8-C24アルケニルまたはC8-C24アルキニルであり、
Y111〜Y114は同一または異なって水素原子、ヒドロキシまたは置換されていても良いC1-C4アルキルであり、
L17〜L19およびL22〜L24は同一または異なって存在しないか、-Z32-(CY115Y116)p51-または-Z33-(CY117Y118)p52-Z34-(CY119Y120)p53-（式中、Y115〜Y120は同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルであり、Z32〜Z34は同一または異なって、-O-、-NY121A-、-CO-O-、-O-CO-、-CO-NY121B-、-NY121C-CO-、-NY121D-CO-0-または-CO-であり（式中、Y121A〜Y121Dは同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルである）、p51は0〜5の整数であり、p52は1〜5の整数であり、p53は0〜5の整数である）であり、
L20およびL25は同一または異なって存在しないか、-(CY122Y123)p54-、-(CY124Y125)p55-Z35-(CY126Y127)p56-または-(CY128Y129)p57-Z36-(CY130Y131)p58-Z37-(CY132Y133)p59-（式中、Y122〜Y133は同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルであり、Z35〜Z37は同一または異なって、-O-、-NY134A-、-CO-O-、-O-CO-、-CO-NY134B-、-NY134C-CO-、-NY134D-CO-0-または-CO-であり（式中、Y134A〜Y134Dは同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルである）、p54は1〜5の整数であり、p55は0〜5の整数であり、p56は1〜5の整数であり、p57は0〜5の整数であり、p58は1〜5の整数であり、p59は1〜5の整数である）であり、
L21およびL26は同一または異なって存在しないか、-(CY135Y136)p60-、-(CY137Y138)p61-Z38-(CY139Y140)p62-または-(CY141Y142)p63-Z39-(CY143Y144)p64-Z40-(CY145Y146)p65-（式中、Y135〜Y146は同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルであり、Z38〜Z40は同一または異なって、-O-、-NY147A-、-CO-O-、-O-CO-、-CO-NY147B-、-NR147C-CO-、-NY147D-CO-0-または-CO-であり（式中、Y147A〜Y147Dは同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルである）、p60は1〜5の整数であり、p61は0〜5の整数であり、p62は0〜5の整数であり、p63は0〜5の整数であり、p64は1〜5の整数であり、p65は0〜5の整数である）であり、
B3およびB4は同一または異なって、
Figure 0006910947
 （式中、X16およびX17は同一または異なって置換されていても良いC1-C4アルキルであるか、または一緒になって隣接する窒素原子とともに置換されていても良いC4-C6ヘテロ環を形成し、X18は置換されていても良いC1-C4アルキルであり、X19およびX20は同一または異なって置換されていても良いC1-C4アルキルであるか、または一緒になって隣接する窒素原子とともに置換されていても良いC4-C6ヘテロ環を形成し、X21は置換されていても良いC1-C4アルキルであり、Y148〜Y157は同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルであり、Z41およびZ42は同一または異なって-O-、-NY158A-、-CO-O-、-O-CO-、-CO-NY158B-、-NY158C-CO-または-NY158D-CO-0-であり（式中、Y158A〜Y158Dは同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルである）、p66は0〜5の整数であり、p67〜p70は同一または異なって1〜5の整数である）であり、
A5およびA6は同一または異なって薬学的に許容される陰イオンである）
で表される化合物が挙げられる。
以下、式(I)〜（IV）、（V’）および（V’’）で表される化合物をそれぞれ化合物(I)〜（IV）、（V’）および（V’’）ということもある。他の式番号の化合物についても同様である。
式(I)〜(V’’)の各基の定義について、以下、説明する。
直鎖または分枝状のC8-C24アルキルとしては、例えばオクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル、トリデシル、テトラデシル、2,6,10-トリメチルウンデシル、ペンタデシル、3,7,11-トリメチルドデシル、ヘキサデシル、ヘプタデシル、オクタデシル、6,10,14-トリメチルペンタデカン-2-イル、ノナデシル、2,6,10,14-テトラメチルペンタデシル、イコシル、3,7,11,15-テトラメチルヘキサデシル、ヘニコシル、ドコシル、トリコシル、テトラコシル等が挙げられ、好ましくはノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル、トリデシル、テトラデシル、ペンタデシル、ヘキサデシル、ヘプタデシル、オクタデシル等が挙げられ、より好ましくはウンデシル、ドデシル、トリデシル、テトラデシル、ペンタデシル、ヘキサデシル等が挙げられる。
直鎖または分枝状のC9-C18アルキルとしては、例えばノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル、トリデシル、テトラデシル、2,6,10-トリメチルウンデシル、ペンタデシル、3,7,11-トリメチルドデシル、ヘキサデシル、ヘプタデシル、オクタデシル、6,10,14-トリメチルペンタデカン-2-イル等が挙げられ、好ましくはノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル、トリデシル、テトラデシル、ペンタデシル、ヘキサデシル、ヘプタデシル、オクタデシル等が挙げられ、より好ましくはウンデシル、ドデシル、トリデシル、テトラデシル、ペンタデシル、ヘキサデシル等が挙げられる。
直鎖または分枝状のC8-C24アルケニルとしては、1〜3つの2重結合を含む直鎖もしくは分枝状のC8-24アルケニルであればよく、例えば(Z)-トリデカ-8-エニル、(Z)-テトラデカ-9-エニル、(Z)-ペンタデカ-8-エニル、(Z)-ヘキサデカ-9-エニル、(Z)-ヘプタデカ-5-エニル、(Z)-オクタデカ-6-エニル、(Z)-ヘプタデカ-8-エニル、(Z)-オクタデカ-9-エニル、(E)-ヘプタデカ-8-エニル、(E)-オクタデカ-9-エニル、(Z)-ヘプタデカ-10-エニル、(Z)-オクタデカ-11-エニル、(8Z,11Z)-ヘプタデカ-8,11-ジエニル、(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニル、(8Z,11Z,14Z)-オクタデカ-8,11,14-トリエニル、(9Z,12Z,15Z)-オクタデカ-9,12,15-トリエニル、(Z)-ノナデカ-10-エニル、(Z)-イコサ-11-エニル、(10Z,13Z)-ノナデカ-10,13-ジエニル、(11Z,14Z)-イコサ-11,14-ジエニル、2,6,10-トリメチルウンデカ-1,5,9-トリエニル、3,7,11-トリメチルドデカ-2,6,10-トリエニル、2,6,10,14-テトラメチルペンタデカ-1-エニル、3,7,11,15-テトラメチルヘキサデカ-2-エニル等が挙げられ、好ましくは(Z)-ペンタデカ-8-エニル、(Z)-ヘキサデカ-9-エニル、(Z)-ヘプタデカ-5-エニル、(Z)-オクタデカ-6-エニル、(Z)-ヘプタデカ-8-エニル、(Z)-オクタデカ-9-エニル、(8Z,11Z)-ヘプタデカ-8,11-ジエニル、(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニル等が挙げられ、より好ましくは(Z)-ヘプタデカ-8-エニル、(Z)-オクタデカ-9-エニル、(8Z,11Z)-ヘプタデカ-8,11-ジエニル、(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニル等が挙げられる。
直鎖または分枝状のC15-C20アルケニルとしては、(Z)-ペンタデカ-8-エニル、(Z)-ヘキサデカ-9-エニル、(Z)-ヘプタデカ-5-エニル、(Z)-オクタデカ-6-エニル、(Z)-ヘプタデカ-8-エニル、(Z)-オクタデカ-9-エニル、(E)-ヘプタデカ-8-エニル、(E)-オクタデカ-9-エニル、(Z)-ヘプタデカ-10-エニル、(Z)-オクタデカ-11-エニル、(8Z,11Z)-ヘプタデカ-8,11-ジエニル、(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニル、(8Z,11Z,14Z)-オクタデカ-8,11,14-トリエニル、(9Z,12Z,15Z)-オクタデカ-9,12,15-トリエニル、(Z)-ノナデカ-10-エニル、(Z)-イコサ-11-エニル、(10Z,13Z)-ノナデカ-10,13-ジエニル、(11Z,14Z)-イコサ-11,14-ジエニル、3,7,11,15-テトラメチルヘキサデカ-2-エニル等が挙げられ、好ましくは(Z)-ペンタデカ-8-エニル、(Z)-ヘキサデカ-9-エニル、(Z)-ヘプタデカ-5-エニル、(Z)-オクタデカ-6-エニル、(Z)-ヘプタデカ-8-エニル、(Z)-オクタデカ-9-エニル、(8Z,11Z)-ヘプタデカ-8,11-ジエニル、(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニル等が挙げられ、より好ましくは(Z)-ヘプタデカ-8-エニル、(Z)-オクタデカ-9-エニル、(8Z,11Z)-ヘプタデカ-8,11-ジエニル、(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニル等が挙げられる。
また、本発明においては、直鎖または分枝状の置換されていても良いC8-C24アルケニルの二重結合にメチレンビラジカルが形式的に付加したシクロプロパン環を有する基もC8-C24アルケニルに包含される。例えば、(Z)-ヘキサデカ-9-エニル、(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニル、(8Z,11Z)-ヘプタデカ-8,11-ジエニルに対応する以下のシクロプロパン環を有する基
Figure 0006910947
Figure 0006910947
 および
Figure 0006910947
 等が挙げられる。
直鎖または分枝状のC8-C24アルキニルとしては、1〜3つの3重結合を含む直鎖もしくは分枝状のC8-24アルキニルであればよく、例えばドデカ-11-イニル、トリデカ-12-イニル、ペンタデカ-6-イニル、ヘキサデカ-7-イニル、ペンタデカ-4,6-ジイニル、ヘキサデカ-5,7-ジイニル、ヘプタデカ-8-イニル、オクタデカ-9-イニル等が挙げられ、好ましくはペンタデカ-6-イニル、ヘキサデカ-7-イニル、ペンタデカ-4,6-ジイニル、ヘキサデカ-5,7-ジイニル、ヘプタデカ-8-イニル、オクタデカ-9-イニル等が挙げられ、より好ましくはヘプタデカ-8-イニル、オクタデカ-9-イニル等が挙げられる。
C1-C4アルキルとしては、例えばメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、シクロプロピル、ブチル、イソブチル、sec-ブチル、tert-ブチル、シクロブチル、シクロプロピルメチル等が挙げられ、好ましくはメチル、エチル等が挙げられ、より好ましくはメチルが挙げられる。
置換されていても良いC1-C4アルコキシのアルキル部分は、前記C1-C4アルキルと同義である。
直鎖または分枝状の置換されていても良いC8-C24アルキル、C8-C24アルケニルまたはC8-C24アルキニルにおける置換基としては、ヒドロキシ、アルコキシ、アルコキシカルボニル、ニトロ、シアノ、フルオロ、クロロ、ブロモ等が挙げられる。これらの置換基のうちアルコキシおよびアルコキシカルボニルにおけるアルキル部分は、前記C1-C4アルキルと同義である。
置換されていても良いC1-C4アルキルにおける置換基としては、アミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ピロリジン-2-イル、ピロリジン-3-イル、ピペリジン-2-イル、ピペリジン-3-イル、ピペリジン-4-イル、モルホリン-2-イル、モルホリン-3-イル、ヒドロキシ、アルコキシ、アルコキシカルボニル、ヒドロキシカルボニル、カルバモイル、モノアルキルカルバモイル、ジアルキルカルバモイル、ニトロ、シアノ、フルオロ、クロロ、ブロモ等が挙げられる。これらの置換基のうちモノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アルコキシ、アルコキシカルボニル、モノアルキルカルバモイルおよびジアルキルカルバモイルにおけるアルキル部分は、前記C1-C4アルキルと同義である。ジアルキルアミノおよびジアルキルカルバモイルにおける2つのアルキルは、それぞれ同一でも異なっていてもよい。
本発明において、ピロリジン-2-イル、ピロリジン-3-イル、ピペリジン-2-イル、ピペリジン-3-イル、ピペリジン-4-イル、モルホリン-2-イルおよびモルホリン-3-イルは、それぞれ、環中の窒素原子にメチルやエチル等のC1-C3アルキルが結合したものを包含する。
C1-C3アルキルとしては、例えばメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、シクロプロピル等が挙げられ、好ましくはメチル、エチル等が挙げられ、より好ましくはメチル等が挙げられる。
X2およびX3が一緒になって隣接する窒素原子とともに形成するC4-C6ヘテロ環としては、例えばピロリジン、ピペリジン、モルホリン、アゼパン等が挙げられ、好ましくはピロリジン、ピペリジン等が挙げられる。X2およびX3が一緒になって隣接する窒素原子とともに形成する置換されても良いC4-C6ヘテロ環における置換基としては、置換されていても良いC1-C4アルキル(前記と同義)、アミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ピロリジン-2-イル、ピロリジン-3-イル、ピペリジン-2-イル、ピペリジン-3-イル、ピペリジン-4-イル、モルホリン-2-イル、モルホリン-3-イル、ヒドロキシ、アルコキシ、アルコキシカルボニル、ヒドロキシカルボニル、カルバモイル、モノアルキルカルバモイル、ジアルキルカルバモイル、ニトロ、シアノ、フルオロ、クロロ、ブロモ等が挙げられる。これらの置換基のうちモノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アルコキシ、アルコキシカルボニル、モノアルキルカルバモイルおよびジアルキルカルバモイルにおけるアルキル部分は、前記C1-C4アルキルと同義である。ジアルキルアミノおよびジアルキルカルバモイルにおける2つのアルキルは、それぞれ同一でも異なっていてもよい。
X5およびX6が一緒になって隣接する窒素原子とともに形成する置換されていても良いC4-C6ヘテロ環の、ヘテロ環部分および置換基部分は、それぞれ前記と同義である。
X8およびX9が一緒になって隣接する窒素原子とともに形成する置換されていても良いC4-C6ヘテロ環の、ヘテロ環部分および置換基部分は、それぞれ前記と同義である。
X11およびX12が一緒になって隣接する窒素原子とともに形成する置換されていても良いC4-C6ヘテロ環の、ヘテロ環部分および置換基部分は、それぞれ前記と同義である。
X14およびX15が一緒になって隣接する窒素原子とともに形成する置換されていても良いC4-C6ヘテロ環の、ヘテロ環部分および置換基部分は、それぞれ前記と同義である。
X16およびX17が一緒になって隣接する窒素原子とともに形成する置換されていても良いC4-C6ヘテロ環の、ヘテロ環部分および置換基部分は、それぞれ前記と同義である。
X19およびX20が一緒になって隣接する窒素原子とともに形成する置換されていても良いC4-C6ヘテロ環の、ヘテロ環部分および置換基部分は、それぞれ前記と同義である。
C1-C4アシルオキシにおけるアシルとしては、例えばホルミル、アセチル、プロパノイル、2-メチルプロパノイル、シクロプロパノイル、ブタノイル等が挙げられ、好ましくはアセチル等が挙げられる。
置換されていても良いC1-C4アシルオキシにおける置換基としては、アミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ピロリジン-2-イル、ピロリジン-3-イル、ピペリジン-2-イル、ピペリジン-3-イル、ピペリジン-4-イル、モルホリン-2-イル、モルホリン-3-イル、ヒドロキシ、アルコキシ、アルコキシカルボニル、ヒドロキシカルボニル、カルバモイル、モノアルキルカルバモイル、ジアルキルカルバモイル、ニトロ、シアノ、フルオロ、クロロ、ブロモ等が挙げられる。これらの置換基のうちモノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アルコキシ、アルコキシカルボニル、モノアルキルカルバモイルおよびジアルキルカルバモイルにおけるアルキル部分は、前記C1-C4アルキルと同義である。ジアルキルアミノおよびジアルキルカルバモイルにおける2つのアルキルは、それぞれ同一でも異なっていてもよい。
4級アンモニウム基とは、4つの炭素原子との間で4本の共有結合を有する窒素原子を有する基を意味する。4級アンモニウム基は、1〜3級アミンに水素原子が付加したものとは異なり、周囲のpHに関わらず正の永久電荷を有している。
薬学的に許容される陰イオンとしては、例えば、塩化物イオン、臭化物イオン、ヨウ化物イオン、硝酸イオン、硫酸イオン、リン酸イオン等の無機イオン、酢酸イオン、シュウ酸イオン、マレイン酸イオン、フマル酸イオン、クエン酸イオン、安息香酸イオン、メタンスルホン酸イオン等の有機酸イオン等が挙げられるがこれらに限定されない。
式(I)において、R1〜R3は、同一の直鎖または分枝状のC8-C24アルキル、C8-C24アルケニルまたはC8-C24アルキニルであることが好ましく、同一の直鎖または分枝状のC8-C24アルキルまたはC8-C24アルケニルであることがより好ましく、同一に直鎖もしくは分枝状のC15-C20アルケニルであるか、または同一に直鎖もしくは分枝状のC9-C18アルキルであることがさらに好ましく、同一に直鎖のC15-C20アルケニルであるか、または同一に直鎖のC9-C18アルキルであることが最も好ましい。
L1〜L3は、同一または異なって存在しないか、-Z1-(CY1Y2)p1-または-Z2-(CY3Y4)p2-Z3-(CY5Y6)p3-であり、-Z1-(CY1Y2)p1-であることが好ましい。Y1〜Y6は同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルであり、Y1〜Y6としては水素原子であることが好ましい。Z1〜Z3は同一または異なって、-O-、-NY7A-、-CO-O-、-O-CO-、-CO-NY7B-、-NY7C-CO-または-NY7D-CO-0-であり、-O-、-CO-O-、-O-CO-、-CO-NY7B-、-NY7C-CO-が好ましい。Y7A〜Y7Dは同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルであり、水素原子またはメチルであることが好ましい。p1〜p3は同一または異なって1〜5の整数であり、1または2であることが好ましい。
L1〜L3としては、同一または異なって-O-(CY1Y2)p1-、-CO-O-(CY1Y2)p1-、-O-CO-(CY1Y2)p1-、-CO-NY7B-(CY1Y2)p1-または-NY7C-CO-(CY1Y2)p1-であることが好ましく、同一または異なって-CO-O-(CY1Y2)p1-または-O-CO-(CY1Y2)p1-であることがより好ましく、同一に-CO-O-(CH2)2-であることがさらに好ましい。
式(I)において、L1〜L3のうち1つ以上が同一または異なって-CO-O-(CY1Y2)p1-もしくは-O-CO-(CY1Y2)p1-であり、R1〜R3が同一に直鎖のC15-C20アルケニルであるか、または同一に直鎖のC9-C18アルキルであることが好ましい。
L1〜L3の少なくとも1つが、存在しないか、-O-(CY1Y2)p1-、-O-CO-(CY1Y2)p1-または-NY7C-CO-(CY1Y2)p1-である場合には、正電荷を有する窒素原子(N+)、-O-(CY1Y2)p1-、-O-CO-(CY1Y2)p1-または-NR6-CO-(CY1Y2)p1-に結合するR1〜R3は同一または異なって、それぞれオクチル、デシル、ドデシル、テトラデシル、ヘキサデシル、オクタデシル、イコシル、ドコシル、テトラコシル、(Z)-テトラデカ-9-エニル、(Z)-ヘキサデカ-9-エニル、(Z)-オクタデカ-6-エニル、(Z)-オクタデカ-9-エニル、(E)-オクタデカ-9-エニル、(Z)-オクタデカ-11-エニル、(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニル、(9Z,12Z,15Z)-オクタデカ-9,12,15-トリエニル、(Z)-イコサ-11-エニル、(11Z,14Z)-イコサ-11,14-ジエニル、3,7,11-トリメチルドデカ-2,6,10-トリエニル、3,7,11,15-テトラメチルヘキサデカ-2-エニル等であることがより好ましく、ドデシル、テトラデシル、ヘキサデシル、(Z)-ヘキサデカ-9-エニル、(Z)-オクタデカ-6-エニル、(Z)-オクタデカ-9-エニル、(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニル等であることがさらに好ましい。
L1〜L3の少なくとも1つが、-CO-O-(CY1Y2)p1-または-CO-NY7B-(CY1Y2)p1-である場合には、-CO-O-(CY1Y2)p1-または-CO-NY7B-(CY1Y2)p1-に結合するR1〜R3は、同一または異なって、それぞれノニル、ウンデシル、トリデシル、ペンタデシル、ヘプタデシル、ノナデシル、ヘニコシル、トリコシル、(Z)-トリデカ-8-エニル、(Z)-ペンタデカ-8-エニル、(Z)-ヘプタデカ-5-エニル、(Z)-ヘプタデカ-8-エニル、(E)-ヘプタデカ-8-エニル、(Z)-ヘプタデカ-10-エニル、(8Z,11Z)-ヘプタデカ-8,11-ジエニル、(8Z,11Z,14Z)-オクタデカ-8,11,14-トリエニル、(Z)-ノナデカ-10-エニル、(10Z,13Z)-ノナデカ-10,13-ジエニル、(11Z,14Z)-イコサ-11,14-ジエニル、2,6,10-トリメチルウンデカ-1,5,9-トリエニル、2,6,10,14-テトラメチルペンタデカ-1-エニル等であることがより好ましく、ウンデシル、トリデシル、ペンタデシル、 (Z)-ペンタデカ-8-エニル、(Z)-ヘプタデカ-5-エニル、(Z)-ヘプタデカ-8-エニル、(8Z,11Z)-ヘプタデカ-8,11-ジエニル等であることがさらに好ましい。
X1は、メチル、ヒドロキシプロピルまたはヒドロキシエチルであることが好ましく、メチルであることがより好ましい。
式(II)において、R4〜R6は、同一の直鎖または分枝状のC8-C24アルキル、C8-C24アルケニルまたはC8-C24アルキニルであることが好ましく、同一の直鎖または分枝状のC8-C24アルキルまたはC8-C24アルケニルであることがより好ましく、同一に直鎖もしくは分枝状のC15-C20アルケニルであるか、または同一に直鎖もしくは分枝状のC9-C18アルキルであることがさらに好ましく、同一に直鎖のC15-C20アルケニルであるか、または同一に直鎖のC9-C18アルキルであることが最も好ましい。
L4〜L6は、同一または異なって存在しないか、-Z4-(CY8Y9)p4-または-Z5-(CY10Y11)p5-Z6-(CY12Y13)p6-であり、-Z4-(CY8Y9)p4-または-Z5-(CY10Y11)p5-Z6-(CY12Y13)p6-であることが好ましく、-Z4-(CY8Y9)p4-であることがより好ましい。Y8〜Y13は同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルであり、Y8〜Y13としては水素原子であることが好ましい。Z4〜Z6は同一または異なって、-O-、-NY14A-、-CO-O-、-O-CO-、-CO-NY14B-、-NY14C-CO-または-NY14D-CO-0-であり、-O-、-CO-O-、-O-CO-、-CO-NY14B-、-NY14C-CO-が好ましい。Y27A〜Y27Dは同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルであり、水素原子またはメチルであることが好ましい。p4は0〜5の整数であり、p5は1〜5の整数であり、p6は0〜5の整数であり、いずれも1または2であることが好ましい。
L4〜L6としては、同一または異なって-O-(CY8Y9)p4-、-CO-O-(CY8Y9)p4-、-O-CO-(CY8Y9)p4-、-CO-NY14B-(CY8Y9)p4-、-NY14C-CO-(CY8Y9)p4-、-NY14D-CO-O-(CY8Y9)p4-または-O-CO-(CY10Y11)p5-Z6-(CY12Y13)p6-であることが好ましく、同一または異なって-CO-O-(CY8Y9)p4-、-O-CO-(CY8Y9)p4-または-O-CO-(CY10Y11)p5-O-(CY12Y13)p6-であることがより好ましく、同一に-CO-O-CH2-であることがさらに好ましい。
式(II)において、L4〜L6のうち1つ以上が同一または異なって-CO-O-(CY8Y9)p4-、-O-CO-(CY8Y9)p4-、または-O-CO-(CY10Y11)p5-O-(CY12Y13)p6-であり、R4〜R6が同一に直鎖のC15-C20アルケニルであるか、または同一に直鎖のC9-C18アルキルであることが好ましい。
L4〜L6の少なくとも1つが、存在しないか、-O-(CY8Y9)p4-、-O-CO-(CY8Y9)p4-、-NY14C-CO-(CY8Y9)p4-、-NY14D-CO-0-または-O-CO-(CY10Y11)p5-(CY12Y13)p6-である場合には、L7に隣接する炭素原子、-O-(CY8Y9)p4-、-O-CO-(CY8Y9)p4-、-NY14C-CO-(CY8Y9)p4-、-NY14D-CO-0-または-O-CO-(CY10Y11)p5-Z6-(CY12Y13)p6-に結合するR7〜R9は、同一または異なって、それぞれオクチル、デシル、ドデシル、テトラデシル、ヘキサデシル、オクタデシル、イコシル、ドコシル、テトラコシル、(Z)-テトラデカ-9-エニル、(Z)-ヘキサデカ-9-エニル、(Z)-オクタデカ-6-エニル、(Z)-オクタデカ-9-エニル、(E)-オクタデカ-9-エニル、(Z)-オクタデカ-11-エニル、(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニル、(9Z,12Z,15Z)-オクタデカ-9,12,15-トリエニル、(Z)-イコサ-11-エニル、(11Z,14Z)-イコサ-11,14-ジエニル、3,7,11-トリメチルドデカ-2,6,10-トリエニル、3,7,11,15-テトラメチルヘキサデカ-2-エニル等であることが好ましく、ドデシル、テトラデシル、ヘキサデシル、 (Z)-ヘキサデカ-9-エニル、(Z)-オクタデカ-6-エニル、(Z)-オクタデカ-9-エニル、(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニル等であることがさらに好ましい。
L4〜L6の少なくとも1つが、-CO-O-(CY8Y9)p4-または-CO-NY14B-(CY8Y9)p4-である場合には、-CO-O-(CY8Y9)p4-または-CO-NY14B-(CY8Y9)p4-に結合するR4〜R6は、同一または異なって、それぞれノニル、ウンデシル、トリデシル、ペンタデシル、ヘプタデシル、ノナデシル、ヘニコシル、トリコシル、(Z)-トリデカ-8-エニル、(Z)-ペンタデカ-8-エニル、(Z)-ヘプタデカ-5-エニル、(Z)-ヘプタデカ-8-エニル、(E)-ヘプタデカ-8-エニル、(Z)-ヘプタデカ-10-エニル、(8Z,11Z)-ヘプタデカ-8,11-ジエニル、(8Z,11Z,14Z)-オクタデカ-8,11,14-トリエニル、(Z)-ノナデカ-10-エニル、(10Z,13Z)-ノナデカ-10,13-ジエニル、(11Z,14Z)-イコサ-11,14-ジエニル、2,6,10-トリメチルウンデカ-1,5,9-トリエニル、2,6,10,14-テトラメチルペンタデカ-1-エニル等であることが好ましく、ウンデシル、トリデシル、ペンタデシル、(Z)-ペンタデカ-8-エニル、(Z)-ヘプタデカ-5-エニル、(Z)-ヘプタデカ-8-エニル、(8Z,11Z)-ヘプタデカ-8,11-ジエニル等であることがさらに好ましい。
L7は、存在しないか、-(CY15Y16)p7-、-(CY17Y18)p8-O-CO-(CY19Y20)p9-または-(CY17Y18)p8-NY27C-CO-(CY19Y20)p9-であることが好ましく、存在しないか、-(CY15Y16)p7-であることがより好ましい。この場合、B1は、
Figure 0006910947
 であることが好ましく、-N+(CH3)3であることがより好ましい。
L7が-(CY15Y16)p7-である場合、p7は1〜3であることが好ましく、1〜2であることがより好ましく、1であることがさらに好ましく、またY15〜Y16はそれぞれ水素原子であることが好ましい。B1としては、-N+(CH3)3であることが好ましい。
L7が-(CY17Y18)p8-O-CO-(CY19Y20)p9-または-(CY17Y18)p8-NY27C-CO-(CY19Y20)p9-である場合、p8は0〜3であり、p9が1〜3であることが好ましく、p8が0〜1であり、p9が1〜3であることがより好ましくまたY17〜Y20はそれぞれ水素原子であり、Y27Cは水素原子またはメチルであることが好ましい。B1としては、-N+(CH3)3であることが好ましい。
X2およびX3は、同一または異なってメチルもしくはエチルであるか、または一緒になって隣接する窒素原子とともに置換されていても良いC4-C6ヘテロ環を形成することが好ましく、同一にメチルであるか、または一緒になって隣接する窒素原子とともにピロリジンもしくはピペリジンを形成することがより好ましく、同一にメチルであることがさらに好ましい。
X4は、メチル、エチル、ヒドロキシプロピルまたはヒドロキシエチル等であることが好ましく、メチルであることがさらに好ましい。
X2およびX3は、同一または異なってメチルもしくはエチルであり、X4は、メチル、エチル、ヒドロキシプロピルまたはヒドロキシエチル等であることが好ましく、X2〜X4は、メチルであることがさらに好ましい。
B1が、
Figure 0006910947
 であり、L7が存在しないか、-(CY15Y16)p7-、-(CY17Y18)p8-O-CO-(CY19Y20)p9-または-(CY17Y18)p8-NY27C-CO-(CY19Y20)p9-であることも本発明の好ましい形態のひとつである。この場合、B1が、
Figure 0006910947
 であり、L7が存在しないか、-NH-CO-(CH2)p9-、-O-CO-(CH2)p9-、-CH2-NH-CO-(CH2)p9-または-CH2-O-CO-(CH2)p9-であることがより好ましい。
式(III)において、R7は直鎖もしくは分枝状のC8-C24アルキルまたはC8-C24アルケニルであることが好ましく、直鎖もしくは分枝状のC15-C20アルケニルであるか、または直鎖もしくは分枝状のC9-C18アルキルであることがより好ましく、同一に直鎖のC15-C20アルケニルであるか、または同一に直鎖のC9-C18アルキルであることが最も好ましい。。R8およびR9は、直鎖もしくは分枝状のC8-C24アルキル、C8-C24アルケニルまたはC8-C24アルキニルであり、かつ同一であることが好ましく、直鎖もしくは分枝状のC15-C20アルケニルであるか、または直鎖もしくは分枝状のC9-C18アルキルであり、かつ同一であることがより好ましく、直鎖のC15-C20アルケニルであるか、または直鎖のC9-C18アルキルであり、かつ同一であることが最も好ましい。
L8は、存在しないか、-Z12-(CY39Y40)p18-または-Z13-(CY41Y42)p19-Z14-(CY43Y44)p20-であり、存在しないかまたは-Z12-(CY39Y40)p18-であることが好ましい。L9およびL10は、同一または異なって存在しないか、-Z12-(CY39Y40)p18-または-Z13-(CY41Y42)p19-Z14-(CY43Y44)p20-であり、同一または異なって存在しないかまたは-Z12-(CY39Y40)p18-であることが好ましい。Y39〜Y44は同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルであり、Y39〜Y44としては水素原子であることが好ましい。Z12〜Z14は同一または異なって、-O-、-NY45A-、-CO-O-、-O-CO-、-CO-NY45B-、-NY45C-CO-、-NY45D-CO-0-または-CO-であり、-CO-O-、-O-CO-、-CO-NY45B-、-NY45C-CO-または-CO-であることが好ましい。Y45A〜Y45Dは同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルであり、水素原子またはメチルであることが好ましい。p18は0〜5の整数であり、0または1であることが好ましい。p19は1〜5の整数であり、1または2であることが好ましい。p20は0〜5の整数であり、0または1であることが好ましい。
L8〜L10のうち1つが-CO-O-(CY39Y40)p18-または-O-CO-(CY39Y40)p18-であるか、L8〜L10のうち2つ以上が同一または異なって-CO-O-(CY39Y40)p18または-O-CO-(CY39Y40)p18-であり、R7〜R9が直鎖のC15-C20アルケニルまたはC9-C18アルキルであることが好ましく、R8〜R9が同一であることが好ましい。
L8としては、存在しないか、-CO-O-(CY39Y40)p18-、-O-CO-(CY39Y40)p18-、-CO-NY45B-(CY39Y40)p18-または-NY45C-CO-(CY39Y40)p18-であることが好ましく、存在しないか、-CO-O-(CY39Y40)p18-、-O-CO-(CY39Y40)p18-または-CO-NY45B-(CY39Y40)p18-であることがより好ましく、存在しないか、-CO-O-(CH2)p18-、-O-CO-(CH2)p18-または-CO-NH-(CH2)p18-であることがさらに好ましい。
L9およびL10としては、同一または異なって存在しないか、-CO-O-(CY39Y40)p18-、-O-CO-(CY39Y40)p18-、-CO-NY45B-(CY39Y40)p18-または-NY45C-CO-(CY39Y40)p18-であることが好ましく、同一または異なって存在しないか、-CO-O-(CY39Y40)p18-または-O-CO-(CY39Y40)p18-であることがより好ましく、同一または異なって存在しないかまたは-CO-O-(CH2)p18-であることがさらに好ましく、同一に存在しないかまたは-CO-O-(CH2)p18-であることが最も好ましい。
式(III)において、L8〜L10のうち1つが存在しないか、-CO-O-(CY39Y40)p18-、-O-CO-(CY39Y40)p18-、-CO-NY45B-(CY39Y40)p18-または-NY45C-CO-(CY39Y40)p18-であるか、L8〜L10のうち2つ以上が同一または異なって存在しないか、-CO-O-(CY39Y40)p18-、-O-CO-(CY39Y40)p18-、-CO-NY45B-(CY39Y40)p18-または-NY45C-CO-(CY39Y40)p18-であり、R7〜R9が直鎖のC15-C20アルケニルまたはC9-C18アルキルであることが好ましく、R8〜R9が同一であることが好ましい。
L8〜L10の少なくとも1つが、存在しないか、-O-(CY39Y40)p18-、-O-CO-(CY39Y40)p18-、-NY45C-CO-(CY39Y40)p18-または-NY45D-CO-0-(CY39Y40)p18-である場合には、J1もしくはJ2、-O-(CY39Y40)p18-、-O-CO-(CY39Y40)p18-、-NY45C-CO-(CY39Y40)p18-または-NY45D-CO-0-(CY39Y40)p18-に結合するR7〜R9は、同一または異なって、それぞれオクチル、デシル、ドデシル、テトラデシル、ヘキサデシル、オクタデシル、イコシル、ドコシル、テトラコシル、(Z)-テトラデカ-9-エニル、(Z)-ヘキサデカ-9-エニル、(Z)-オクタデカ-6-エニル、(Z)-オクタデカ-9-エニル、(E)-オクタデカ-9-エニル、(Z)-オクタデカ-11-エニル、(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニル、(9Z,12Z,15Z)-オクタデカ-9,12,15-トリエニル、(Z)-イコサ-11-エニル、(11Z,14Z)-イコサ-11,14-ジエニル、3,7,11-トリメチルドデカ-2,6,10-トリエニル、3,7,11,15-テトラメチルヘキサデカ-2-エニル等であることが好ましく、ドデシル、テトラデシル、ヘキサデシル、(Z)-ヘキサデカ-9-エニル、(Z)-オクタデカ-6-エニル、(Z)-オクタデカ-9-エニル、(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニル等であることがさらに好ましい。
L8〜L10の少なくとも1つが、-CO-O-(CY39Y40)p18-、-CO-NY45B-(CY39Y40)p18-または-CO-(CY39Y40)p18である場合には、-CO-O-(CY39Y40)p18-、-CO-NY45B-(CY39Y40)p18-または-CO-(CY39Y40)p18に結合するR7〜R9は、同一または異なって、それぞれノニル、ウンデシル、トリデシル、ペンタデシル、ヘプタデシル、ノナデシル、ヘニコシル、トリコシル、(Z)-トリデカ-8-エニル、(Z)-ペンタデカ-8-エニル、(Z)-ヘプタデカ-5-エニル、(Z)-ヘプタデカ-8-エニル、(E)-ヘプタデカ-8-エニル、(Z)-ヘプタデカ-10-エニル、(8Z,11Z)-ヘプタデカ-8,11-ジエニル、(8Z,11Z,14Z)-オクタデカ-8,11,14-トリエニル、(Z)-ノナデカ-10-エニル、(10Z,13Z)-ノナデカ-10,13-ジエニル、(11Z,14Z)-イコサ-11,14-ジエニル、2,6,10-トリメチルウンデカ-1,5,9-トリエニル、2,6,10,14-テトラメチルペンタデカ-1-エニルであることが好ましく、ウンデシル、トリデシル、ペンタデシル、(Z)-ペンタデカ-8-エニル、(Z)-ヘプタデカ-5-エニル、(Z)-ヘプタデカ-8-エニル、(8Z,11Z)-ヘプタデカ-8,11-ジエニル等であることがさらに好ましい。
L11は、存在しないか、-(CY46Y47)p21-、-(CY48Y49)p22-Z15-(CY50Y51)p23-または-(CY52Y53)p24-Z16-(CY54Y55)p25-Z17-(CY56Y57)p26-であり、存在しないか、-(CY46Y47)p21-または-(CY48Y49)p22-Z15-(CY50Y51)p23-であることが好ましい。Y46〜Y57は同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルであり、Y46〜Y57としては水素原子であることが好ましい。Z15〜Z17は同一または異なって、-O-、-NY58A-、-CO-O-、-O-CO-、-CO-NY58B-、-NY58C-CO-、-NY58D-CO-0-または-CO-であり、-CO-O-、-O-CO-、-CO-NY58B-、-NY58C-CO-または-CO-が好ましく、-O-CO-または-NY58C-CO-がより好ましい。p21は1〜5の整数であり、1〜3であることが好ましい。p22は0〜5の整数であり、0〜3であることが好ましい。p23は1〜5の整数であり、1または2であることが好ましい。
L11としては存在しないか、-(CY46Y47)p21-、-(CY48Y49)p22-O-CO-(CY50Y51)p23-、または-(CY48Y49)p22-NY58C-CO-(CY50Y51)p23-であることが好ましく、存在しないかまたは-(CY46Y47)p21-であることがより好ましく、存在しないかまたは-(CH2)p2-であることがさらに好ましい。
L12は、存在しないかまたは-(CY59Y60)p27-であることが好ましく、存在しないかまたは-(CH2)p27-であることが好ましく、存在しないか、-CH2-または-(CH2)2-であることがより好ましい。
J1およびJ2は同一または異なってCY72またはNであり、J1およびJ2は同一または異なってCH、C(OH)またはNが好ましい。
L11が存在しない時、J1はCHが好ましい。
L9およびL10は存在せず、L12が-CO-(CH2)p29-であり、J1がCHであり、J2がNであることも本発明の好ましい形態のひとつである。この時、L8が-CO-NY45B-(CH2)p18-であり、L11が存在しないかまたは-(CH2)p21-であることが好ましい。
L9およびL10は存在せず、L12が-O-CO-(CH2)p29-であり、J1およびJ2がCHであることも本発明の好ましい形態のひとつである。この時、L8が-O-CO-(CH2)p18-であり、L11が存在しないことが好ましい。
B2は、
Figure 0006910947
 であることが好ましく、-N+(CH3)3であることがより好ましい。
X8〜X10は、それぞれ前記X2〜X4と同義である。
式(IV)において、R10は、直鎖または分枝状のC8-C24アルキルまたはC8-C24アルケニルであることが好ましく、直鎖もしくは分枝状のC15-C20アルケニルであるか、または直鎖もしくは分枝状のC9-C18アルキルであることがより好ましく、直鎖のC15-C20アルケニルであるか、または直鎖のC9-C18アルキルであることが最も好ましい。R11およびR12は、直鎖もしくは分枝状のC8-C24アルキル、C8-C24アルケニルまたはC8-C24アルキニルであり、かつ同一であることが好ましく、直鎖もしくは分枝状のC15-C20アルケニルであるか、または直鎖もしくは分枝状のC9-C18アルキルであり、かつ同一であることがより好ましく、直鎖のC15-C20アルケニルであるか、または直鎖のC9-C18アルキルであり、かつ同一であることが最も好ましい。
L13は、存在しないか、-Z23-(CY83Y84)p38-または-Z24-(CY85Y86)p39-Z25-(CY87Y88)p40-であり、存在しないか、または-Z23-(CY83Y84)p38-であることが好ましい。Y83〜Y88は同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルであり、Y83〜Y88としては水素原子であることが好ましい。Z23〜Z25は同一または異なって、-O-、-NY89A-、-CO-O-、-O-CO-、-CO-NY89B-、-NY89C-CO-または-NY89D-CO-0-であり、-CO-O-、-O-CO-、-CO-NY89B-または-NY89C-CO-であることが好ましく、-CO-NY89B-であることがより好ましい。Y89A〜Y89Dは同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルであり、水素原子またはメチルであることが好ましい。p38〜p40は同一または異なって1〜5の整数であり、1または2であることが好ましい。
L13としては、存在しないか、-CO-O-(CY83Y84)p38-、-O-CO-(CY83Y84)p38-、-CO-NY89B-(CY83Y84)p38-、または-NY89C-CO-(CY83Y84)p38-であることが好ましく、存在しないか、-CO-O-(CH2)p38-、-O-CO-(CH2)p38-または-CO-NCH3-(CH2)p38-であることがより好ましく、存在しないか、-CO-NCH3-(CH2)p38-であることがさらに好ましい。
L14およびL15は、同一または異なって存在しないか、-Z26-(CY90Y91)p41-または-Z27-(CY92Y93)p42-Z28-(CY94Y95)p43-であり、存在しないか、または-Z26-(CY90Y91)p41-であることが好ましい。Y90〜Y95は同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルであり、Y90〜Y95としては水素原子であることが好ましい。Z26〜Z28は同一または異なって、-O-、-NY96A-、-CO-O-、-O-CO-、-CO-NY96B-、-NY96C-CO-、-NY96D-CO-0-または-CO-であり、-CO-O-、-O-CO-、-CO-NY96B-、-NY96C-CO-、または-CO-であることが好ましい。Y96A〜Y96Dは同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルであり、水素原子またはメチルであることが好ましい。p41は0〜5の整数であり、0〜2が好ましい。p42は1〜5の整数であり、1または2が好ましい。p43は0〜5の整数であり、0〜2が好ましい。
L14およびL15としては、同一または異なって、存在しないか、-CO-O-(CY90Y91)p41-、-O-CO-(CY90Y91)p41-、-CO-NY96B-(CY90Y91)p41-、-NY96C-CO-(CY90Y91)p41-、-CO-(CY90Y91)p41-であることが好ましく、同一または異なって、存在しないか、-CO-O-(CY90Y91)p41-、-O-CO-(CY90Y91)p41-または-CO-(CY90Y91)p41-であることがより好ましく、同一または異なって、存在しないか、-CO-O-(CH2)p41-、-O-CO-(CH2)p41-または-CO-であることがさらに好ましい。
式(IV)において、L13が-CO-O-(CY83Y84)p38-、-O-CO-(CY83Y84)p38-または-CO-NY89B-(CY83Y84)p38-であるか、L14およびL15のうち1つが-CO-O-(CY90Y91)p41-または-O-CO-(CY90Y91)p41-であるか、L13が-CO-O-(CY83Y84)p38-、-O-CO-(CY83Y84)p38-または-CO-NY89B-(CY83Y84)p38-であり、L14およびL15のうち1つが-CO-O-(CY90Y91)p41-または-O-CO-(CY90Y91)p41-であるか、L14およびL15が同一または異なって-CO-O-(CY90Y91)p41-または-O-CO-(CY90Y91)p41-であるか、L13が-CO-O-(CY83Y84)p38-、-O-CO-(CY83Y84)p38-または-CO-NY89B-(CY83Y84)p38-であり、L14およびL15が同一または異なって-CO-O-(CY90Y91)p41-または-O-CO-(CY90Y91)p41-であり、R10〜R12が直鎖または分枝状のC15-C20アルケニルまたはC9-C18アルキルであることがより好ましい。R11およびR12は同一であることが好ましい。
L13が、存在しないか、-O-(CY83Y84)p38-、-NY89A-(CY83Y84)p38-、-O-CO-(CY83Y84)p38-、-NY89C-CO-(CY83Y84)p38-または-NY89D-CO-0-(CY83Y84)p38-である場合には、R10はオクチル、デシル、ドデシル、テトラデシル、ヘキサデシル、オクタデシル、イコシル、ドコシル、テトラコシル、(Z)-テトラデカ-9-エニル、(Z)-ヘキサデカ-9-エニル、(Z)-オクタデカ-6-エニル、(Z)-オクタデカ-9-エニル、(E)-オクタデカ-9-エニル、(Z)-オクタデカ-11-エニル、(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニル、(9Z,12Z,15Z)-オクタデカ-9,12,15-トリエニル、(Z)-イコサ-11-エニル、(11Z,14Z)-イコサ-11,14-ジエニル、3,7,11-トリメチルドデカ-2,6,10-トリエニルまたは3,7,11,15-テトラメチルヘキサデカ-2-エニルであることが好ましく、ドデシル、テトラデシル、ヘキサデシル、(Z)-ヘキサデカ-9-エニル、(Z)-オクタデカ-6-エニル、(Z)-オクタデカ-9-エニルまたは(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニルであることがより好ましい。
L13が、-CO-O-(CY83Y84)p38-または-CO-NY89B-(CY83Y84)p38-である場合には、R10はノニル、ウンデシル、トリデシル、ペンタデシル、ヘプタデシル、ノナデシル、ヘニコシル、トリコシル、(Z)-トリデカ-8-エニル、(Z)-ペンタデカ-8-エニル、(Z)-ヘプタデカ-5-エニル、(Z)-ヘプタデカ-8-エニル、(E)-ヘプタデカ-8-エニル、(Z)-ヘプタデカ-10-エニル、(8Z,11Z)-ヘプタデカ-8,11-ジエニル、(8Z,11Z,14Z)-オクタデカ-8,11,14-トリエニル、(Z)-ノナデカ-10-エニル、(10Z,13Z)-ノナデカ-10,13-ジエニル、(11Z,14Z)-イコサ-11,14-ジエニル、2,6,10-トリメチルウンデカ-1,5,9-トリエニルまたは2,6,10,14-テトラメチルペンタデカ-1-エニルであることがより好ましく、ウンデシル、トリデシル、ペンタデシル、(Z)-ペンタデカ-8-エニル、(Z)-ヘプタデカ-5-エニル、(Z)-ヘプタデカ-8-エニルまたは(8Z,11Z)-ヘプタデカ-8,11-ジエニルであることがさらに好ましい。
また、L14およびL15の少なくとも1つが、存在しないか、-O-(CY90Y91)p41-、-NY96A-(CY90Y91)p41-、-O-CO-(CY90Y91)p41-、-NY96C-CO-(CY90Y91)p41-または-NY96D-CO-0-(CY90Y91)p41-である場合には、J3、-O-(CY90Y91)p41-、-NY96A-(CY90Y91)p41-、-O-CO-(CY90Y91)p41-、-NY96C-CO-(CY90Y91)p41-または-NY96D-CO-0-(CY90Y91)p41-に結合するR11およびR12は、同一または異なって、それぞれオクチル、デシル、ドデシル、テトラデシル、ヘキサデシル、オクタデシル、イコシル、ドコシル、テトラコシル、(Z)-テトラデカ-9-エニル、(Z)-ヘキサデカ-9-エニル、(Z)-オクタデカ-6-エニル、(Z)-オクタデカ-9-エニル、(E)-オクタデカ-9-エニル、(Z)-オクタデカ-11-エニル、(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニル、(9Z,12Z,15Z)-オクタデカ-9,12,15-トリエニル、(Z)-イコサ-11-エニル、(11Z,14Z)-イコサ-11,14-ジエニル、3,7,11-トリメチルドデカ-2,6,10-トリエニルまたは3,7,11,15-テトラメチルヘキサデカ-2-エニルであることがより好ましく、ドデシル、テトラデシル、ヘキサデシル、(Z)-ヘキサデカ-9-エニル、(Z)-オクタデカ-6-エニル、(Z)-オクタデカ-9-エニルまたは(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニルであることがさらに好ましい。
L14およびL15の少なくとも1つが、-CO-O-(CY90Y91)p41-または-CO-NY96B(CY90Y91)p41-である場合には、-CO-O-(CY90Y91)p41-または-CO-NY96B(CY90Y91)p41-に結合するR11およびR12は、同一または異なって、それぞれノニル、ウンデシル、トリデシル、ペンタデシル、ヘプタデシル、ノナデシル、ヘニコシル、トリコシル、(Z)-トリデカ-8-エニル、(Z)-ペンタデカ-8-エニル、(Z)-ヘプタデカ-5-エニル、(Z)-ヘプタデカ-8-エニル、(E)-ヘプタデカ-8-エニル、(Z)-ヘプタデカ-10-エニル、(8Z,11Z)-ヘプタデカ-8,11-ジエニル、(8Z,11Z,14Z)-オクタデカ-8,11,14-トリエニル、(Z)-ノナデカ-10-エニル、(10Z,13Z)-ノナデカ-10,13-ジエニル、(11Z,14Z)-イコサ-11,14-ジエニル、2,6,10-トリメチルウンデカ-1,5,9-トリエニルまたは2,6,10,14-テトラメチルペンタデカ-1-エニルであることがより好ましく、ウンデシル、トリデシル、ペンタデシル、(Z)-ペンタデカ-8-エニル、(Z)-ヘプタデカ-5-エニル、(Z)-ヘプタデカ-8-エニルまたは(8Z,11Z)-ヘプタデカ-8,11-ジエニルであることがさらに好ましい。
L16は存在しないか、-(CY97Y98)p44-、-(CY99Y100)p45-Z29-(CY101Y102)p46-または-(CY103Y104)p47-Z30-(CY105Y106)p48-Z31-(CY107Y108)p49-であり、存在しないか、-(CY97Y98)p44-または-(CY99Y100)p45-Z29-(CY101Y102)p46-であることが好ましく、存在しないか、-(CY97Y98)p44-、-(CY99Y100)p45-O-CO-(CY101Y102)p46-、-(CY99Y100)p45-NY109C-CO-(CY101Y102)p46-または-CO-(CY101Y102)p46-であることがより好ましく、存在しないか、-(CH2)p44-または-CO-(CH2)p46-であることがさらに好ましい。
J3はCY110またはNであり、CHまたはNが好ましい。また、J3がNである時、L14が存在せず、L15が-CO-であり、L16は存在しないか、もしくは-(CY97Y98)p44-であるか、またはL14が存在せず、L15が存在せず、L16は-CO-(CY101Y102)p46-であることがより好ましい。
X14およびX15は、それぞれ前記X2およびX3と同義である。
式(V’)において、R13は直鎖もしくは分枝状のC8-C24アルキルまたはC8-C24アルケニルであることが好ましく、直鎖もしくは分枝状のC15-C20アルケニルであるか、または直鎖もしくは分枝状のC9-C18アルキルであることがより好ましく、直鎖のC15-C20アルケニルであるか、または直鎖のC9-C18アルキルであることが最も好ましい。R14およびR15は、直鎖もしくは分枝状のC8-C24アルキル、C8-C24アルケニルまたはC8-C24アルキニルであり、かつ同一であることが好ましく、直鎖もしくは分枝状のC15-C20アルケニルであるか、または直鎖もしくは分枝状のC9-C18アルキルであり、かつ同一であることがより好ましく、直鎖のC15-C20アルケニルであるか、または直鎖のC9-C18アルキルであり、かつ同一であることが最も好ましい。
L17〜L19は、同一または異なって存在しないか、-Z32-(CY115Y116)p51-または-Z33-(CY117Y118)p52-Z34-(CY119Y120)p53-であり、-Z32-(CY115Y116)p51-であることが好ましく、-O-(CY115Y116)p51-または-CO-O-(CY115Y116)p51-であることがより好ましく、-O-または-CO-O-であることがさらに好ましい。
式(V’)において、L17〜L19が同一または異なって-O-または-CO-O-であり、R13〜R15が直鎖のC15-C20アルケニルまたはC9-C18アルキルであることが好ましい。この時、L17〜L19が同一に-O-または-CO-O-であり、R13〜R15が同一に直鎖のC15-C20アルケニルまたはC9-C18アルキルであることが好ましい。
L17〜L19の少なくとも1つが、存在しないか、-O-(CY115Y116)p51-、-O-CO-(CY115Y116)p51-、-NY121C-CO-(CY115Y116)p518-または-NY121D-CO-0-(CY115Y116)p51-である場合には、フラノース環もしくはL20に隣接する炭素、-O-(CY115Y116)p51-、-O-CO-(CY115Y116)p51-、-NY121C-CO-(CY115Y116)p518-または-NY121D-CO-0-(CY115Y116)p51-に結合するR13〜R15は、同一または異なって、それぞれオクチル、デシル、ドデシル、テトラデシル、ヘキサデシル、オクタデシル、イコシル、ドコシル、テトラコシル、(Z)-テトラデカ-9-エニル、(Z)-ヘキサデカ-9-エニル、(Z)-オクタデカ-6-エニル、(Z)-オクタデカ-9-エニル、(E)-オクタデカ-9-エニル、(Z)-オクタデカ-11-エニル、(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニル、(9Z,12Z,15Z)-オクタデカ-9,12,15-トリエニル、(Z)-イコサ-11-エニル、(11Z,14Z)-イコサ-11,14-ジエニル、3,7,11-トリメチルドデカ-2,6,10-トリエニル、3,7,11,15-テトラメチルヘキサデカ-2-エニル等であることが好ましく、ドデシル、テトラデシル、ヘキサデシル、(Z)-ヘキサデカ-9-エニル、(Z)-オクタデカ-6-エニル、(Z)-オクタデカ-9-エニル、(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニル等であることがさらに好ましい。
L17〜L19の少なくとも1つが、-CO-O-(CY115Y116)p51-、-CO-NY121B-(CY115Y116)p51-または-CO-(CY115Y116)p51-である場合には、-CO-O-(CY115Y116)p51-、-CO-NY121B-(CY115Y116)p51-または-CO-(CY115Y116)p51-に結合するR13〜R15は、同一または異なって、それぞれノニル、ウンデシル、トリデシル、ペンタデシル、ヘプタデシル、ノナデシル、ヘニコシル、トリコシル、(Z)-トリデカ-8-エニル、(Z)-ペンタデカ-8-エニル、(Z)-ヘプタデカ-5-エニル、(Z)-ヘプタデカ-8-エニル、(E)-ヘプタデカ-8-エニル、(Z)-ヘプタデカ-10-エニル、(8Z,11Z)-ヘプタデカ-8,11-ジエニル、(8Z,11Z,14Z)-オクタデカ-8,11,14-トリエニル、(Z)-ノナデカ-10-エニル、(10Z,13Z)-ノナデカ-10,13-ジエニル、(11Z,14Z)-イコサ-11,14-ジエニル、2,6,10-トリメチルウンデカ-1,5,9-トリエニル、2,6,10,14-テトラメチルペンタデカ-1-エニルであることが好ましく、ウンデシル、トリデシル、ペンタデシル、(Z)-ペンタデカ-8-エニル、(Z)-ヘプタデカ-5-エニル、(Z)-ヘプタデカ-8-エニル、(8Z,11Z)-ヘプタデカ-8,11-ジエニル等であることがさらに好ましい。
L20は、存在しないか、-(CY122Y123)p54-、-(CY124Y125)p55-Z35-(CY126Y127)p56-または-(CY128Y129)p57-Z36-(CY130Y131)p58-Z37-(CY132Y133)p59-であり、-(CY122Y123)p54-であることが好ましく、-(CH2)p54-であることがより好ましく、-CH2-であることがさらに好ましい。
L21は、存在しないか、-(CY135Y136)p60-、-(CY137Y138)p61-Z38-(CY139Y140)p62-または-(CY141Y142)p63-Z39-(CY143Y144)p64-Z40-(CY145Y146)p65-であり、存在しないかまたは-(CY135Y136)p60-であること好ましく、存在しないかまたは-(CH2)p60-であることがより好ましく、存在しないことがさらに好ましい。
B3は、
Figure 0006910947
 であることが好ましく、-N+(CH3)3であることがより好ましい。
Y111およびY112は、同一または異なって水素原子、ヒドロキシまたは置換されていても良いC1-C4アルキルであり、同一または異なって水素原子またはヒドロキシが好ましく、同一に水素原子がさらに好ましい。
式(V’’)において、R16〜R18、L22〜L26、B4、Y113〜Y114およびA6は、それぞれR13〜R15、L17〜L21、B3、Y111〜Y112およびA5と同義である。
式(V’)において、Y111が水素原子である時、ピラン環上の4つの置換基はそれぞれピラン環上の異なる炭素原子上で置換していることが好ましい。そして、式(V’)としては、
Figure 0006910947
 であることがより好ましい。この時、L17〜L19が同一または異なって-O-または-CO-O-であり、R13〜R15が直鎖のC15-C20アルケニルまたはC9-C18アルキルであることがさらに好ましく、L17〜L19が同一または異なって-O-または-CO-O-であり、R13〜R15が直鎖のC15-C20アルケニルまたはC9-C18アルキルであり、L17およびL21が存在せず、Y112が水素原子またはヒドロキシであることが最も好ましい。
式(V’’)において、フラン環上の4つの置換基はそれぞれフラン環上の異なる炭素原子上で置換していることが好ましい。そして、式(V’’)としては、
Figure 0006910947
 であることがより好ましい。この時、L22〜L24が同一または異なって-O-または-CO-O-であり、R16〜R18が直鎖のC15-C20アルケニルまたはC9-C18アルキルであることがさらに好ましく、L22〜L24が同一または異なって-O-または-CO-O-であり、R16〜R18が直鎖のC15-C20アルケニルまたはC9-C18アルキルであり、L22およびL26が存在せず、Y114が水素原子またはヒドロキシであることが最も好ましい。
なお、式B1、B2、B3およびB4の定義における、
Figure 0006910947
 の各式の定義において、p13、p33およびp66が0である場合には、N+はそれぞれZ10、Z21およびZ41に隣接する炭素と結合する。
本発明の核酸含有脂質ナノ粒子には、1つの4級アンモニウム基を有する親水部および置換基を有していても良い独立した3つの炭化水素基を有する脂質(脂質A)以外のカチオン性脂質が含まれていても良い。本発明で用いられる脂質A以外のカチオン性脂質は、１以上の置換基を有していても良い炭化水素基を含む脂質親和性領域と、少なくとも1つの1級アミノ基、2級アミノ基、3級アミノ基および／または4級アンモニウム基を含むカチオン性の親水性領域を有する両親媒性分子であれば特に限定されないが（脂質Aを除く）、置換基を有していても良い1つのアミノ基または1つの4級アンモニウム基を有する親水部および置換基を有していても良い独立した2つの炭化水素基を有する疎水部を有する脂質(脂質B)が好ましい。
本発明で用いられる脂質A以外のカチオン性脂質としては、例えば、国際公開第2013/089151号、国際公開第2011/136368号、国際公開第2014/007398号、国際公開第2010/042877号または国際公開第2010/054401号に記載のカチオン性脂質等が挙げられる。
本発明で用いられる脂質Bとしては、例えば、
式(CL-I)
Figure 0006910947
 (式中、R101およびR102は、同一または異なって直鎖もしくは分枝状のC10-C24アルキル、C10-C24アルケニルまたはC10-C24アルキニルであり、
L101およびL102は、水素原子であるか、または一緒になって単結合もしくはC2-C8アルキレンを形成し、
L103は単結合、-CO-または-CO-O-であり、
L103が単結合である場合には、
X101は水素原子、C1-C6アルキル、C3-C6アルケニル、ピロリジン-3-イル、ピペリジン-3-イル、ピペリジン-4-イル、または同一もしくは異なって1〜3つのアミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、トリアルキルアンモニオ、ヒドロキシ、アルコキシ、カルバモイル、モノアルキルカルバモイル、ジアルキルカルバモイル、ピロリジニル、ピペリジルもしくはモルホリニルで置換されたC1-C6アルキルもしくはC3-C6アルケニルであり、
L103が-CO-または-CO-O-である場合には、
X101はピロリジン-2-イル、ピロリジン-3-イル、ピペリジン-2-イル、ピペリジン-3-イル、ピペリジン-4-イル、モルホリン-2-イル、モルホリン-3-イル、または同一もしくは異なって1〜3つのアミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、トリアルキルアンモニオ、ヒドロキシ、アルコキシ、カルバモイル、モノアルキルカルバモイル、ジアルキルカルバモイル、ピロリジニル、ピペリジルもしくはモルホリニルで置換されたC1-C6アルキルもしくはC3-C6アルケニルであり、該置換基の少なくとも1つは、アミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、トリアルキルアンモニオ、ピロリジニル、ピペリジルまたはモルホリニルである)、
式(CL-II)
Figure 0006910947
 (式中、R103お ｓよびR104は同一または異なって直鎖もしくは分枝状のC12-C24アルキル、C12-C24アルケニルまたはC12-C24アルキニルであり、
p101およびp102は、同一または異なって0〜3の整数であり、
L106およびL107は水素原子であるか、または一緒になって単結合もしくはC2-C8アルキレンを形成し、
L104およびL105は同一または異なって-O-、-CO-O-または-O-CO-であり、
L108は単結合、-CO-または-CO-O-であり、
L108が単結合である場合には、
X102は水素原子、C1-C6アルキル、C3-C6アルケニル、ピロリジン-2-イル、ピロリジン-3-イル、ピペリジン-3-イル、ピペリジン-4-イル、または同一もしくは異なって1〜3つのアミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、トリアルキルアンモニオ、ヒドロキシ、アルコキシ、カルバモイル、モノアルキルカルバモイル、ジアルキルカルバモイル、ピロリジニル、ピペリジルもしくはモルホリニルで置換されたC1-C6アルキルもしくはC3-C6アルケニルであり、
L108が-CO-または-CO-O-である場合には、
X102はピロリジン-2-イル、ピロリジン-3-イル、ピペリジン-2-イル、ピペリジン-3-イル、ピペリジン-4-イル、モルホリン-2-イル、モルホリン-3-イル、または同一もしくは異なって1〜3つのアミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、トリアルキルアンモニオ、ヒドロキシ、アルコキシ、カルバモイル、モノアルキルカルバモイル、ジアルキルカルバモイル、ピロリジニル、ピペリジルもしくはモルホリニルで置換されたC1-C6アルキルもしくはC3-C6アルケニルであり、該置換基の少なくとも1つは、アミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、トリアルキルアンモニオ、ピロリジニル、ピペリジルまたはモルホリニルである)、
式(CL-III)
Figure 0006910947
 (式中、R105は直鎖もしくは分枝状のC8-C24アルキル、C8-C24アルケニルまたはC8-C24アルキニルであり、
R106は直鎖または分枝状のC8-C24アルキル、C8-C24アルケニル、C8-C24アルキニル、C8-C24アルコキシエチル、C8-C24アルコキシプロピル、C8-C24アルケニルオキシエチル、C8-C24アルケニルオキシプロピル、C8-C24アルキニルオキシエチルまたはC8-C24アルキニルオキシプロピルであり、
X103およびX104は、同一または異なってC1-C3アルキルであるか、または一緒になってC2-C8アルキレンを形成するか、またはX103はL111と一緒になってC2-C8アルキレンを形成し、
L111は、水素原子、C1-C6アルキル、C3-C6アルケニル、アミノ、モノアルキルアミノ、ヒドロキシ、アルコキシ、カルバモイル、モノアルキルカルバモイル、ジアルキルカルバモイル、または同一もしくは異なって1〜3つのアミノ、モノアルキルアミノ、ヒドロキシ、アルコキシ、カルバモイル、モノアルキルカルバモイルもしくはジアルキルカルバモイルで置換されたC1-C6アルキルもしくはC3-C6アルケニルであるか、またはX103と一緒になってC2-C8アルキレンを形成し、
L109は、C1-C6アルキレンであり、
L110は、単結合であるか、またはC1-C6アルキレンであり、ただし、L109とL110の炭素数の和は7以下であり、L111が、水素原子の場合、L110は単結合であり、L111がX103と一緒になってC2-C6アルキレンを形成する場合、L110は単結合であるか、またはメチレンもしくはエチレンである)、
式(CL-IV)
Figure 0006910947
 (式中、R107は直鎖もしくは分枝状のC8-C24アルキル、C8-C24アルケニルまたはC8-C24アルキニルであり、
R108は直鎖もしくは分枝状のC8-C24アルキル、C8-C24アルケニル、C8-C24アルキニル、C8-C24アルコキシエチル、C8-C24アルコキシプロピル、C8-C24アルケニルオキシエチル、C8-C24アルケニルオキシプロピル、C8-C24アルキニルオキシエチルまたはC8-C24アルキニルオキシプロピルである)、
式(CL-V)
Figure 0006910947
 (式中、R109は直鎖もしくは分枝状のC8-C24アルキル、C8-C24アルケニルまたはC8-C24アルキニルであり、
R110は直鎖もしくは分枝状のC8-C24アルキル、C8-C24アルケニル、C8-C24アルキニル、C8-C24アルコキシエチル、C8-C24アルコキシプロピル、C8-C24アルケニルオキシエチル、C8-C24アルケニルオキシプロピル、C8-C24アルキニルオキシエチルまたはC8-C24アルキニルオキシプロピルであり、
L112は、C1-C3アルキレンであり、
X105は、水素原子またはC1-C3アルキルである)、
式(CL-VI)
Figure 0006910947
 (式中、R111およびR112は、同一または異なって直鎖もしくは分枝状の置換されていても良いC8-C24アルキル、C8-C24アルケニルまたはC8-C24アルキニルであり、
X106およびX107は、同一または異なってC1-C3アルキルであるか、または一緒になってC2-C8アルキレンを形成し、
p103, p104およびp105は同一または異なって0または1であり、ただしp103, p104およびp105は同時には0ではなく、
L113およびL114は、同一または異なってO,SまたはNHである)、または
式(CL-VII)
Figure 0006910947
 (式中、R113およびR114は、同一または異なって直鎖もしくは分枝状の置換されていても良いC8-C24アルキル、C8-C24アルケニルまたはC8-C24アルキニルであり、
X109およびX110は、同一または異なってC1-C3アルキルであるか、または一緒になってC2-C8アルキレンを形成し、
X108は水素原子、ヒドロキシ、置換されていても良いC1-C4アルキル、置換されていても良いC1-C4アルコキシ、または置換されていても良いC1-C4アシルオキシであり、
L115は、-CO-O-または-O-CO-であり、
p106は、0〜3であり、
p107は、1〜4である）で表される脂質等が挙げられる。
式(CL-I)の各基の定義において、直鎖または分枝状のC10-C24アルキルとしては、例えばデシル、ウンデシル、ドデシル、トリデシル、6,10-ジメチルウンデカ-2-イル、テトラデシル、ペンタデシル、ヘキサデシル、ヘプタデシル、オクタデシル、6,10,14-トリメチルペンタデカン-2-イル、ノナデシル、イコシル、ヘニコシル、ドコシル、トリコシル、またはテトラコシル等が挙げられ、好ましくはデシル、ウンデシル、ドデシル、トリデシル、テトラデシル、ペンタデシル、ヘキサデシル、ヘプタデシル、またはオクタデシル等が挙げられ、より好ましくはトリデシル、テトラデシル、ペンタデシル、ヘキサデシル、ヘプタデシルまたはオクタデシル等が挙げられる。
直鎖または分枝状のC10-C24アルケニルとしては、1〜3つの2重結合を含む直鎖または分枝状のC10-C24アルケニルであればよく、例えば、(Z)-ドデカ-7-エニル、(Z)-テトラデカ-7-エニル、(Z)-テトラデカ-9-エニル、(Z)-ヘキサデカ-4-エニル、(Z)-ヘキサデカ-7-エニル、(E)-ヘキサデカ-7-エニル、(Z)-ヘキサデカ-9-エニル、(7Z,10Z)-ヘキサデカ-7,10-ジエニル、(7Z,10Z,13Z)-ヘキサデカ-7,10,13-トリエニル、(Z)-オクタデカ-6-エニル、(Z)-オクタデカ-9-エニル、(E)-オクタデカ-9-エニル、(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニル、(Z)-オクタデカ-11-エニル、(9Z,12Z,15Z)-オクタデカ-9,12,15-トリエニル、(Z)-イコサ-11-エニル、(11Z,14Z)-イコサ-11,14-ジエニル等が挙げられ、好ましくは(Z)-ドデカ-7-エニル、(Z)-テトラデカ-7-エニル、(Z)-ヘキサデカ-4-エニル、(Z)-ヘキサデカ-7-エニル、(E)-ヘキサデカ-7-エニル、(Z)-ヘキサデカ-9-エニル、(7Z,10Z)-ヘキサデカ-7,10-ジエニル、(7Z,10Z,13Z)-ヘキサデカ-7,10,13-トリエニル、(Z)-オクタデカ-9-エニル、(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニル、(11Z,14Z)-イコサ-11,14-ジエニル等が挙げられ、より好ましくは(7Z,10Z)-ヘキサデカ-7,10-ジエニルまたは(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニル等が挙げられる。
直鎖または分枝状のC10-C24アルキニルとしては、1〜3つの3重結合を含む直鎖または分枝状のC10-C24アルキニルであればよく、例えば、デカ-9-イニル、ドデカ-4-イニル、ドデカ-11-イニル、テトラデカ-5-イニル、テトラデカ-6-イニル、ヘキサデカ-7-イニル、ヘキサデカ-3,5-ジイニル、ヘキサデカ-5,7-ジイニルまたはオクタデカ-9-イニル等が挙げられ、好ましくはヘキサデカ-7-イニルまたはオクタデカ-9-イニル等が挙げられ、より好ましくはオクタデカ-9-イニル等が挙げられる。
なお、式(CL-I)において、R101およびR103は、同一の直鎖または分枝状のC10-C24アルキル、C10-C24アルケニルまたはC10-C24アルキニルであることが好ましく、同一に直鎖または分枝状のC10-C24アルキルまたはC10-C24アルケニルであることがより好ましく、同一に直鎖のC10-C24アルケニルであることがさらに好ましい。
C1-C3アルキレンとしては、例えばメチレン、エチレン、またはプロピレン等が挙げられ、好ましくはメチレンまたはエチレンが挙げられ、より好ましくはメチレンが挙げられる。
C1-C6アルキルとしては、例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、シクロプロピル、ブチル、イソブチル、sec-ブチル、tert-ブチル、シクロブチル、シクロプロピルメチル、ペンチル、イソペンチル、sec-ペンチル、ネオペンチル、tert-ペンチル、シクロペンチル、ヘキシルまたはシクロヘキシル等が挙げられ、好ましくはメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、sec-ブチル、tert-ブチル、ペンチル、イソペンチル、sec-ペンチル、tert-ペンチル、ネオペンチルまたはヘキシル等が挙げられ、より好ましくはメチル、エチルまたはプロピル等が挙げられる。
C3-C6アルケニルとしては、例えば、アリル、1-プロペニル、ブテニル、ペンテニルまたはヘキセニル等が挙げられ、好ましくはアリル等が挙げられる。
モノアルキルアミノおよびジアルキルアミノとしては、それぞれ1つ、または同一もしく異なる2つの、C1-C6アルキル(前記と同義)、またはアミノ、メチルアミノ、エチルアミノ、ジメチルアミノ、ジエチルアミノ、ピロリジニル、ピペリジルもしくはモルホリニルで置換されたC1-C6アルキル(前記と同義)で置換されたアミノであればよく、例えばメチルアミノ、エチルアミノ、プロピルアミノ、ブチルアミノ、ペンチルアミノ、ヘキシルアミノ、ジメチルアミノ、ジエチルアミノ、エチルメチルアミノ、メチルプロピルアミノ、ブチルメチルアミノ、メチルペンチルアミノ、ヘキシルメチルアミノ、アミノエチルアミノ、アミノプロピルアミノ、(アミノエチル)メチルアミノまたはビス(アミノエチル)アミノ等が挙げられ、好ましくはメチルアミノ、エチルアミノ、ジメチルアミノ、ジエチルアミノ、アミノプロピルアミノまたはビス(アミノエチル)アミノ等が挙げられ、より好ましくはメチルアミノまたはジメチルアミノ等が挙げられる。
トリアルキルアンモニオとしては、同一または異なって3つの、C1-C6アルキル(前記と同義)、またはアミノ、メチルアミノ、エチルアミノ、ジメチルアミノ、ジエチルアミノ、ピロリジニル、ピペリジルもしくはモルホリニルで置換されたC1-C6アルキル(前記と同義)で置換されたアンモニオであればよく、例えばトリメチルアンモニオ、エチルジメチルアンモニオ、ジエチルメチルアンモニオ、トリエチルアンモニオ、トリプロピルアンモニオ、トリブチルアンモニオ、トリペンチルアンモニオ、トリヘキシルアンモニオ、トリス(アミノエチル)アンモニオ、(アミノエチル)ジメチルアンモニオまたはビス(アミノエチル)メチルアンモニオ等が挙げられ、好ましくはトリメチルアンモニオ、トリエチルアンモニオ、トリス(アミノエチル)アンモニオ、(アミノエチル)ジメチルアンモニオまたはビス(アミノエチル)メチルアンモニオ等が挙げられ、より好ましくはトリメチルアンモニオ等が挙げられる。
化合物(CL-I)において、トリアルキルアンモニオは、薬学的に許容される陰イオン(前記と同義)と塩を形成していてもよい。
アルコキシとしては、C1-C6アルキル(前記と同義)または、アミノ、メチルアミノ、エチルアミノ、ジメチルアミノ、ジエチルアミノ、ピロリジニル、ピペリジルもしくはモルホリニルで置換されたC1-C6アルキル(前記と同義)で置換されたヒドロキシであればよく、例えばメトキシ、エトキシ、プロピルオキシ、ブチルオキシ、ペンチルオキシ、ヘキシルオキシ、アミノエトキシまたはメチルアミノエトキシ等が挙げられ、好ましくはメトキシ、エトキシ、アミノエトキシまたはメチルアミノエトキシ等が挙げられ、より好ましくはメトキシ等が挙げられる。
モノアルキルカルバモイルおよびジアルキルカルバモイルとしては、それぞれ1つ、または同一もしく異なる2つの、C1-C6アルキル(前記と同義)、またはアミノ、メチルアミノ、エチルアミノ、ジメチルアミノ、ジエチルアミノ、ピロリジニル、ピペリジルもしくはモルホリニルで置換されたC1-C6アルキル(前記と同義)で置換されたカルバモイルであればよく、例えば、メチルカルバモイル、エチルカルバモイル、プロピルカルバモイル、ブチルカルバモイル、ペンチルカルバモイル、ヘキシルカルバモイル、ジメチルカルバモイル、ジエチルカルバモイル、エチルメチルカルバモイル、メチルプロピルカルバモイル、ブチルメチルカルバモイル、メチルペンチルカルバモイル、ヘキシルメチルカルバモイル、アミノエチルカルバモイル、アミノプロピルカルバモイル、(アミノエチル)メチルカルバモイル、またはビス(アミノエチル)カルバモイル等が挙げられ、好ましくはメチルカルバモイル、エチルカルバモイルまたはジメチルカルバモイル等が挙げられ、より好ましくはメチルカルバモイル、またはジメチルカルバモイル等が挙げられる。
L101およびL102は、水素原子であることがより好ましい。この場合には、R101およびR102は、同一または異なって、ドデシル、テトラデシル、(Z)-ドデカ-7-エニル、(Z)-テトラデカ-7-エニル、(Z)-ヘキサデカ-4-エニル、(Z)-ヘキサデカ-7-エニル、(E)-ヘキサデカ-7-エニル、(Z)-ヘキサデカ-9-エニル、(7Z,10Z)-ヘキサデカ-7,10-ジエニル、(7Z,10Z,13Z)-ヘキサデカ-7,10,13-トリエニル、(Z)-オクタデカ-9-エニルまたは(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニルであることが好ましく、(Z)-テトラデカ-7-エニル、(Z)-ヘキサデカ-7-エニル、(7Z,10Z)-ヘキサデカ-7,10-ジエニル、または(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニルであることがより好ましく、同一に(Z)-テトラデカ-7-エニル、(Z)-ヘキサデカ-7-エニルまたは(7Z,10Z)-ヘキサデカ-7,10-ジエニルまたは(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニルであることがさらに好ましい。
なお、L101およびL102が、水素原子である場合には、X101が水素原子、メチル、ピロリジン-3-イル、ピペリジン-3-イル、ピペリジン-4-イル、または同一もしくは異なって1〜3つのアミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、トリアルキルアンモニオ、ヒドロキシ、アルコキシ、カルバモイル、モノアルキルカルバモイル、ジアルキルカルバモイル、ピロリジニル、ピペリジルもしくはモルホリニルで置換されたC1-C6アルキルもしくはC3-C6アルケニルであることがより好ましく、水素原子、メチル、または同一もしくは異なって1〜3つのアミノ、ヒドロキシもしくはカルバモイルで置換されたC1-C6アルキルもしくはC3-C6アルケニルであることがさらに好ましく、水素原子、またはメチル等であることがさらに好ましい。
L101およびL102が、一緒になって単結合またはC1-C3アルキレンを形成する場合には、R101およびR102は、同一または異なってテトラデシル、ヘキサデシル、(Z)-テトラデカ-9-エニル、(Z)-ヘキサデカ-9-エニル、(Z)-オクタデカ-6-エニル、(Z)-オクタデカ-9-エニル、(E)-オクタデカ-9-エニル、(Z)-オクタデカ-11-エニル、(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニル、(9Z,12Z,15Z)-オクタデカ-9,12,15-トリエニル、(Z)-イコサ-11-エニル、または(11Z,14Z)-イコサ-11,14-ジエニルであることが好ましく、(Z)-オクタデカ-9-エニル、または(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニルであることがより好ましく、同一に(Z)-オクタデカ-9-エニルまたは(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニルであることがさらに好ましい。
L101およびL102が、一緒になって単結合またはC1-C3アルキレンを形成する場合には、X101が水素原子、メチル、ピロリジン-3-イル、ピペリジン-3-イル、ピペリジン-4-イル、または同一もしくは異なって1〜3つのアミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、トリアルキルアンモニオ、ヒドロキシ、アルコキシ、カルバモイル、モノアルキルカルバモイル、ジアルキルカルバモイル、ピロリジニル、ピペリジルもしくはモルホリニルで置換されたC1-C6アルキルもしくはC3-C6アルケニルであることがより好ましく、水素原子、メチル、または同一もしくは異なって1〜3つのアミノ、ヒドロキシもしくはカルバモイルで置換されたC1-C6アルキルもしくはC3-C6アルケニルであることがさらに好ましく、水素原子またはメチル等であることが最も好ましい。
L101およびL102が、一緒になって単結合を形成する場合に、L103が-CO-または-CO-O-、好ましくは-CO-であることも、本発明のより好ましい形態の1つである。この場合には、X101がアミノメチル、1,2-ジアミノエチル、2-アミノエチル、1,3-ジアミノプロピル、1,4-ジアミノブチル、1,5-ジアミノペンチル、3-アミノプロピル、4-アミノブチルまたは5-アミノペンチル等がであることが好ましく、1,2-ジアミノエチル、1,3-ジアミノプロピル、1,4-ジアミノブチルまたは1,5-ジアミノペンチルであることがさらに好ましい。R101およびR102は、同一または異なって、テトラデシル、ヘキサデシル、(Z)-テトラデカ-9-エニル、(Z)-ヘキサデカ-9-エニル、(Z)-オクタデカ-6-エニル、(Z)-オクタデカ-9-エニル、(E)-オクタデカ-9-エニル、(Z)-オクタデカ-11-エニル、(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニル、(9Z,12Z,15Z)-オクタデカ-9,12,15-トリエニルまたは(Z)-イコサ-11-エニルまたは(11Z,14Z)-イコサ-11,14-ジエニルであることが好ましく、(Z)-オクタデカ-9-エニルまたは(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニルであることがより好ましく、同一に(Z)-オクタデカ-9-エニルまたは(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニルであることがさらに好ましい。
L103は単結合であることがより好ましい。
L103が単結合の場合には、X101は水素原子、メチル、ピロリジン-3-イル、ピペリジン-3-イル、ピペリジン-4-イル、または同一もしくは異なって1〜3つのアミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、トリアルキルアンモニオ、ヒドロキシ、アルコキシ、カルバモイル、モノアルキルカルバモイル、ジアルキルカルバモイル、ピロリジニル、ピペリジルもしくはモルホリニルで置換されたC1-C6アルキルもしくはC3-C6アルケニル等であることがより好ましく、水素原子、メチル、ヒドロキシメチル、2-ヒドロキシエチル、2,3-ジヒドロキシプロピル、2-ヒドロキシプロピル、3-ヒドロキシプロピル、2-ヒドロキシ-3-メトキシプロピル、アミノメチル、2-アミノエチル、3-アミノプロピル、4-アミノブチル、5-アミノペンチル、2-(N,N-ジメチルアミノ)エチル、3-(N,N-ジメチルアミノ)プロピル、2-カルバモイルエチル、2-ジメチルカルバモイルエチル、または1-メチルピペリジン-4-イル等であることがさらに好ましく、水素原子またはメチルであることが最も好ましい。
L103が-CO-または-CO-O-の場合には、X101はピロリジン-3-イル、ピペリジン-3-イル、ピペリジン-4-イル、または同一もしくは異なって1〜3つのアミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、トリアルキルアンモニオ、ヒドロキシ、アルコキシ、カルバモイル、モノアルキルカルバモイル、ジアルキルカルバモイル、ピロリジニル、ピペリジルもしくはモルホリニルで置換されたC1-C6アルキルもしくはC3-C6アルケニルであり、該置換基の少なくとも1つは、アミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、トリアルキルアンモニオ、ピロリジニル、ピペリジルまたはモルホリニル等であることがより好ましく、R3はアミノメチル、1,2-ジアミノエチル、2-アミノエチル、1,3-ジアミノプロピル、3-アミノプロピル、1,4-ジアミノブチル、4-アミノブチル、1,5-ジアミノペンチル、5-アミノペンチル、(N,N-ジメチルアミノ)メチル、2-(N,N-ジメチルアミノ)エチル、3-(N,N-ジメチルアミノ)プロピル、1-ヒドロキシ-2-アミノエチルまたは1-アミノ-2-ヒドロキシエチル等であることがさらに好ましく、1,2-ジアミノエチル、2-アミノエチル、1,3-ジアミノプロピル、3-アミノプロピル、1,4-ジアミノブチル、4-アミノブチル、1,5-ジアミノペンチルまたは5-アミノペンチル等であることが最も好ましい。
L103が単結合で、X101が水素原子であることも、本発明のより好ましい形態の1つである。この場合には、R101およびR102は、同一または異なって、ドデシル、テトラデシル、(Z)-ドデカ-7-エニル、(Z)-テトラデカ-7-エニル、(Z)-ヘキサデカ-4-エニル、(Z)-ヘキサデカ-7-エニル、(E)-ヘキサデカ-7-エニル、(Z)-ヘキサデカ-9-エニル、(7Z,10Z)-ヘキサデカ-7,10-ジエニル、(7Z,10Z,13Z)-ヘキサデカ-7,10,13-トリエニル、(Z)-オクタデカ-9-エニルまたは(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニルであることが好ましく、同一または異なって、(Z)-テトラデカ-7-エニルまたは(7Z,10Z)-ヘキサデカ-7,10-ジエニルであることがより好ましく、同一に(Z)-テトラデカ-7-エニル、(Z)-ヘキサデカ-7-エニルまたは(7Z,10Z)-ヘキサデカ-7,10-ジエニルであることがさらに好ましい。
L103が単結合で、X101がメチルであることも、本発明のより好ましい形態の1つである。この場合には、R101およびR102は、同一または異なって、ドデシル、テトラデシル、(Z)-ドデカ-7-エニル、(Z)-テトラデカ-7-エニル、(Z)-ヘキサデカ-4-エニル、(Z)-ヘキサデカ-7-エニル、(E)-ヘキサデカ-7-エニル、(Z)-ヘキサデカ-9-エニル、(7Z,10Z)-ヘキサデカ-7,10-ジエニル、(7Z,10Z,13Z)-ヘキサデカ-7,10,13-トリエニル、(Z)-オクタデカ-9-エニルまたは(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニルであることが好ましく、同一または異なって、(Z)-テトラデカ-7-エニル、(7Z,10Z)-ヘキサデカ-7,10-ジエニルまたは(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニルであることがより好ましく、同一に(Z)-テトラデカ-7-エニル、(7Z,10Z)-ヘキサデカ-7,10-ジエニルまたは(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニルであることがさらに好ましい。
式(CL-II)の各基の定義において、直鎖もしくは分枝状のC12-C24アルキルとしては、例えばドデシル、トリデシル、テトラデシル、2,6,10-トリメチルウンデシル、ペンタデシル、3,7,11-トリメチルドデシル、ヘキサデシル、ヘプタデシル、オクタデシル、6,10,14-トリメチルペンタデカン-2-イル、ノナデシル、2,6,10,14-テトラメチルペンタデシル、イコシル、3,7,11,15-テトラメチルヘキサデシル、ヘニコシル、ドコシル、トリコシルまたはテトラコシル等が挙げられ、好ましくはドデシル、トリデシル、テトラデシル、ペンタデシル、ヘキサデシル、ヘプタデシル、オクタデシル、ノナデシルまたはイコシル等が挙げられ、より好ましくはドデシル、トリデシル、テトラデシル、ペンタデシル、ヘキサデシル、ヘプタデシルまたはオクタデシル等が挙げられる。
直鎖もしくは分枝状のC12-C24アルケニルとしては、1〜3つの2重結合を含む直鎖もしくは分枝状のC12-C24アルケニルであればよく、例えば、(Z)-トリデカ-8-エニル、(Z)-テトラデカ-9-エニル、(Z)-ペンタデカ-8-エニル、(Z)-ヘキサデカ-9-エニル、(Z)-ヘプタデカ-5-エニル、(Z)-オクタデカ-6-エニル、(Z)-ヘプタデカ-8-エニル、(Z)-オクタデカ-9-エニル、(E)-ヘプタデカ-8-エニル、(E)-オクタデカ-9-エニル、(Z)-ヘプタデカ-10-エニル、(Z)-オクタデカ-11-エニル、(8Z,11Z)-ヘプタデカ-8,11-ジエニル、(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニル、(8Z,11Z,14Z)-オクタデカ-8,11,14-トリエニル、(9Z,12Z,15Z)-オクタデカ-9,12,15-トリエニル、(Z)-ノナデカ-10-エニル、(Z)-イコサ-11-エニル、(10Z,13Z)-ノナデカ-10,13-ジエニル、(11Z,14Z)-イコサ-11,14-ジエニル、2,6,10-トリメチルウンデカ-1,5,9-トリエニル、3,7,11-トリメチルドデカ-2,6,10-トリエニル、2,6,10,14-テトラメチルペンタデカ-1-エニルまたは3,7,11,15-テトラメチルヘキサデカ-2-エニル等が挙げられ、好ましくは(Z)-ペンタデカ-8-エニル、(Z)-ヘキサデカ-9-エニル、(Z)-ヘプタデカ-5-エニル、(Z)-オクタデカ-6-エニル、(Z)-ヘプタデカ-8-エニル、(Z)-オクタデカ-9-エニル、(8Z,11Z)-ヘプタデカ-8,11-ジエニルまたは(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニル等が挙げられ、より好ましくは(Z)-ヘプタデカ-8-エニル、(Z)-オクタデカ-9-エニル、(8Z,11Z)-ヘプタデカ-8,11-ジエニルまたは(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニル等が挙げられる。
直鎖もしくは分枝状のC12-C24アルキニルとしては、1〜3つの3重結合を含む直鎖もしくは分枝状のC12-C24アルキニルであればよく、例えばドデカ-11-イニル、トリデカ-12-イニル、ペンタデカ-6-イニル、ヘキサデカ-7-イニル、ペンタデカ-4,6-ジイニル、ヘキサデカ-5,7-ジイニル、ヘプタデカ-8-イニルまたはオクタデカ-9-イニル等が挙げられ、好ましくはペンタデカ-6-イニル、ヘキサデカ-7-イニル、ペンタデカ-4,6-ジイニル、ヘキサデカ-5,7-ジイニル、ヘプタデカ-8-イニルまたはオクタデカ-9-イニル等が挙げられ、より好ましくはヘプタデカ-8-イニルまたはオクタデカ-9-イニル等が挙げられる。
式(CL-II)の各基の定義におけるC1-C3アルキレン、C1-C6アルキルおよびC3-C6アルケニルは、それぞれ前記式(CL-I)におけるものと同義である。
モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、トリアルキルアンモニオ、アルコキシ、モノアルキルカルバモイルおよびジアルキルカルバモイルは、それぞれ前記式(CL-I)におけるものと同義である。
R103およびR104は、同一の直鎖もしくは分枝状のC12-C24アルキル、C12-C24アルケニルまたはC12-C24アルキニルであることが好ましく、同一の直鎖もしくは分枝状のC12-C24アルキル、またはC12-C24アルケニルであることがより好ましい。
L104およびL105は、同一の-O-、-CO-O-または-O-CO-であることがより好ましい。
L104およびL105の少なくとも1つが-O-または-O-CO-である場合には、R103およびR104は、同一または異なって、ドデシル、テトラデシル、ヘキサデシル、オクタデシル、イコシル、ドコシル、テトラコシル、(Z)-テトラデカ-9-エニル、(Z)-ヘキサデカ-9-エニル、(Z)-オクタデカ-6-エニル、(Z)-オクタデカ-9-エニル、(E)-オクタデカ-9-エニル、(Z)-オクタデカ-11-エニル、(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニル、(9Z,12Z,15Z)-オクタデカ-9,12,15-トリエニル、(Z)-イコサ-11-エニル、(11Z,14Z)-イコサ-11,14-ジエニル、3,7,11-トリメチルドデカ-2,6,10-トリエニルまたは3,7,11,15-テトラメチルヘキサデカ-2-エニルであることがより好ましく、テトラデシル、ヘキサデシル、オクタデシル、(Z)-ヘキサデカ-9-エニル、(Z)-オクタデカ-6-エニル、(Z)-オクタデカ-9-エニルまたは(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニルであることがさらに好ましい。
L104およびL105の少なくとも1つが-CO-O-である場合には、R103およびR104はそれぞれトリデシル、ペンタデシル、ヘプタデシル、ノナデシル、ヘニコシル、トリコシル、(Z)-トリデカ-8-エニル、(Z)-ペンタデカ-8-エニル、(Z)-ヘプタデカ-5-エニル、(Z)-ヘプタデカ-8-エニル、(E)-ヘプタデカ-8-エニル、(Z)-ヘプタデカ-10-エニル、(8Z,11Z)-ヘプタデカ-8,11-ジエニル、(8Z,11Z,14Z)-オクタデカ-8,11,14-トリエニル、(Z)-ノナデカ-10-エニル、(10Z,13Z)-ノナデカ-10,13-ジエニル、(11Z,14Z)-イコサ-11,14-ジエニル、2,6,10-トリメチルウンデカ-1,5,9-トリエニルまたは2,6,10,14-テトラメチルペンタデカ-1-エニルであることがより好ましく、トリデシル、ペンタデシル、ヘプタデシル、(Z)-ペンタデカ-8-エニル、(Z)-ヘプタデカ-5-エニル、(Z)-ヘプタデカ-8-エニルまたは(8Z,11Z)-ヘプタデカ-8,11-ジエニルであることがさらに好ましい。
p101およびp102は、同時に0または1であることがより好ましい。
L106およびL107は、一緒になって単結合またはC1-C3アルキレンを形成することがより好ましい。L106およびL107が、一緒になって単結合またはC1-C3アルキレンを形成する場合には、X102が水素原子、メチル、ピロリジン-2-イル、ピロリジン-3-イル、ピペリジン-2-イル、ピペリジン-3-イル、ピペリジン-4-イル、モルホリン-2-イル、モルホリン-3-イル、または同一もしくは異なって1〜3つのアミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、トリアルキルアンモニオ、ヒドロキシ、アルコキシ、カルバモイル、モノアルキルカルバモイル、ジアルキルカルバモイル、ピロリジニル、ピペリジルもしくはモルホリニルで置換されたC1-C6アルキルもしくはC3-C6アルケニルであることがより好ましく、水素原子、メチル、または同一もしくは異なって1〜3つのアミノ、トリアルキルアンモニオ、ヒドロキシもしくはカルバモイルで置換されたC1-C6アルキルもしくはC3-C6アルケニルであることがさらに好ましく、水素原子、メチル、2,3-ジヒドロキシプロピル、3-ヒドロキシプロピル、アミノメチル、1,2-ジアミノエチル、2-アミノエチル、1,3-ジアミノプロピル、1,4-ジアミノブチル、1,5-ジアミノペンチル、3-アミノプロピル、4-アミノブチル、5-アミノペンチルまたは2-カルバモイルエチルであることが最も好ましい。これらの置換基のうちモノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、トリアルキルアンモニオ、アルコキシ、モノアルキルカルバモイルおよびジアルキルカルバモイルにおけるアルキル部分は、前記C1-C4アルキルと同義である。ジアルキルアミノ、トリアルキルアンモニオおよびジアルキルカルバモイルにおける2または3つのアルキルは、それぞれ同一でも異なっていてもよい。
L106およびL107が、一緒になって単結合を形成する場合に、L108が-CO-または-CO-O-、好ましくは-CO-であることが好ましい。
L106およびL107が、一緒になって単結合を形成する場合に、p101およびp102は、同一または異なって1〜3であることが好ましい。
L106およびL107が、水素原子である場合には、X102は水素原子、メチル、ピロリジン-2-イル、ピロリジン-3-イル、ピペリジン-2-イル、ピペリジン-3-イル、ピペリジン-4-イル、モルホリン-2-イル、モルホリン-3-イルまたは同一もしくは異なって1〜3つのアミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、トリアルキルアンモニオ、ヒドロキシ、アルコキシ、カルバモイル、モノアルキルカルバモイル、ジアルキルカルバモイル、ピロリジニル、ピペリジルもしくはモルホリニルで置換されたC1-C6アルキルもしくはC3-C6のアルケニルであることが好ましく、水素原子、メチルまたは同一もしくは異なって1〜3つのアミノ、トリアルキルアンモニオ、ヒドロキシもしくはカルバモイルで置換されたC1-C6アルキルもしくはC3-C6アルケニルであることがより好ましく、水素原子、メチル、2,3-ジヒドロキシプロピル、3-ヒドロキシプロピル、アミノメチル、1,2-ジアミノエチル、2-アミノエチル、1,3-ジアミノプロピル、1,4-ジアミノブチル、1,5-ジアミノペンチル、3-アミノプロピル、4-アミノブチル、5-アミノペンチルまたは2-カルバモイルエチル等であることがさらに好ましい。これらの置換基のうちモノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、トリアルキルアンモニオ、アルコキシ、モノアルキルカルバモイルおよびジアルキルカルバモイルにおけるアルキル部分は、前記C1-C4アルキルと同義である。ジアルキルアミノ、トリアルキルアンモニオ、およびジアルキルカルバモイルにおける2または3つのアルキルは、それぞれ同一でも異なっていてもよい。
L108は単結合であることが好ましい。なお、L108が単結合の場合には、L104およびL105は-O-であることが好ましい。
L108が単結合の場合には、X102は水素原子、メチル、ピロリジン-3-イル、ピペリジン-3-イル、ピペリジン-4-イルまたは同一もしくは異なって1〜3つのアミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、トリアルキルアンモニオ、ヒドロキシ、アルコキシ、カルバモイル、モノアルキルカルバモイル、ジアルキルカルバモイル、ピロリジニル、ピペリジルもしくはモルホリニルで置換されたC1-C6アルキルもしくはC3-C6アルケニル等であることが好ましく、水素原子、メチル、ヒドロキシメチル、2-ヒドロキシエチル、2,3-ジヒドロキシプロピル、2-ヒドロキシプロピル、3-ヒドロキシプロピル、2-ヒドロキシ-3-メトキシプロピル、アミノメチル、2-アミノエチル、3-アミノプロピル、4-アミノブチル、5-アミノペンチル、2-(N,N-ジメチルアミノ)エチル、3-(N,N-ジメチルアミノ)プロピル、2-カルバモイルエチル、2-ジメチルカルバモイルエチルまたは1-メチルピペリジン-4-イル等であることがより好ましく、水素原子、メチル、2,3-ジヒドロキシプロピル、3-ヒドロキシプロピル、2-アミノエチル、3-アミノプロピル、4-アミノブチル、5-アミノペンチルまたは2-カルバモイルエチル等であることがさらに好ましい。これらの置換基のうちモノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、トリアルキルアンモニオ、アルコキシ、モノアルキルカルバモイルおよびジアルキルカルバモイルにおけるアルキル部分は、前記C1-C4アルキルと同義である。ジアルキルアミノ、トリアルキルアンモニオ、およびジアルキルカルバモイルにおける2または3つのアルキルは、それぞれ同一でも異なっていてもよい。
L104およびL105は-O-であることがより好ましい。ただし、L108が単結合で、X102が水素原子の場合には、L104およびL105が同一の-CO-O-または-O-CO-であることが好ましく、-CO-O-であることがより好ましい。
L108が-CO-または-CO-O-の場合には、L104およびL105は同一の-CO-O-または-O-CO-であることが好ましく、-CO-O-であることがより好ましい。
L108が-CO-または-CO-O-の場合には、X102はピロリジン-3-イル、ピペリジン-3-イル、ピペリジン-4-イルまたは同一もしくは異なって1〜3つのアミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、トリアルキルアンモニオ、ヒドロキシ、アルコキシ、カルバモイル、モノアルキルカルバモイル、ジアルキルカルバモイル、ピロリジニル、ピペリジルもしくはモルホリニルで置換されたC1-C6アルキルもしくはC3-C6アルケニルであることが好ましく、該置換基の少なくとも1つは、アミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、トリアルキルアンモニオ、ピロリジニル、ピペリジルもしくはモルホリニルであることが好ましく、X102はアミノメチル、1,2-ジアミノエチル、2-アミノエチル、1,3-ジアミノプロピル、3-アミノプロピル、1,4-ジアミノブチル、4-アミノブチル、1,5-ジアミノペンチル、5-アミノペンチル、(N,N-ジメチルアミノ)メチル、2-(N,N-ジメチルアミノ)エチル、3-(N,N-ジメチルアミノ)プロピルまたは1-アミノ-2-ヒドロキシエチル等であることがより好ましく、アミノメチル、1,2-ジアミノエチル、2-アミノエチル、1,3-ジアミノプロピル、3-アミノプロピル、1,4-ジアミノブチル、4-アミノブチル、1,5-ジアミノペンチルまたは5-アミノペンチル等であることがさらに好ましい。これらの置換基のうちモノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、トリアルキルアンモニオ、アルコキシ、モノアルキルカルバモイルおよびジアルキルカルバモイルにおけるアルキル部分は、前記C1-C6アルキルと同義である。ジアルキルアミノ、トリアルキルアンモニオおよびジアルキルカルバモイルにおける2または3つのアルキルは、それぞれ同一でも異なっていてもよい。
L104およびL105は同一の-CO-O-または-O-CO-であることが好ましく、-CO-O-であることがより好ましい。
式(CL-III)、(CL-IV)および(CL-V)の各基の定義において、直鎖または分枝状のC8-C24アルキル、C8-C24アルケニルおよびC8-C24アルキニルは、それぞれ前記式(I)〜(IV)におけるものと同義であり、同様の基が好ましい。
式(CL-III)、(CL-IV)および(CL-V)の各基の定義において、C8-C24アルコキシエチルおよびC8-C24アルコキシプロピルにおけるアルキル部分としては、例えば前記直鎖または分枝状のC8-C24アルキルで例示したもの等が挙げられる。
アルキニルオキシエチルおよびアルキニルオキシプロピルにおけるアルキニル部分としては、例えば、前記直鎖または分枝状のC8-C24アルキニルの例示したももの等が挙げられる。
R105およびR106は、同一または異なって直鎖もしくは分枝状のC8-C24アルキルまたはC8-C24アルケニルであることが好ましく、同一または異なって直鎖または分枝状のC8-C24アルケニルであることがより好ましく、同一または異なって直鎖のC8-C24アルケニルであることがさらに好ましい。また、R105およびR106は、同一であることがより好ましく、その場合には、直鎖もしくは分枝状のC12-C24アルキル、C12-C24アルケニルまたはC12-C24アルキニルであることが好ましく、直鎖のC12-C24アルケニルであることがより好ましい。直鎖または分枝状のC12-C24アルキル、C12-C24アルケニル、およびC12-C24アルキニルは、それぞれ前記式(CL-II)におけるものと同義である。
R105およびR106は、同一または異なって直鎖もしくは分枝状のC8-C24アルキルまたはC8-C24アルケニルであることが好ましく、同一または異なって直鎖または分枝状のC8-C24アルケニルであることがより好ましく、同一または異なって直鎖のC8-C24アルケニルであることがさらに好ましい。また、R105およびR106は、同一であることがより好ましく、その場合には、直鎖もしくは分枝状のC15-C20アルキル、C15-C20アルケニルまたはC15-C20アルキニルであることが好ましく、直鎖のC15-C20アルケニルであることがより好ましい。直鎖または分枝状のC15-C20アルキル、C15-C20アルケニル、およびC15-C20アルキニルは、それぞれ前記式(I)〜(IV)におけるものと同義であり、同様の基が好ましい。
R105およびR106が、異なる場合には、R105が直鎖または分枝状のC15-C20アルキル、C15-C20アルケニルまたはC15-C20アルキニルであり、R106が直鎖または分枝状のC8-C12アルキルであることが好ましい。ここで、直鎖または分枝状のC8-C12アルキルとしては、例えばオクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、またはドデシルが挙げられ、好ましくはオクチル、デシルまたはドデシルが挙げられる。
R105が直鎖のC15-C20アルケニルであり、R106が直鎖のC8-C12アルキルであることがより好ましく、R105が(Z)-オクタデカ-9-エニルまたは(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニルであり、R106がオクチル、デシルまたはドデシルであることがさらに好ましい。
R105およびR106が、異なる場合には、R105が、直鎖または分枝状のC8-C24アルキル、C8-C24アルケニルまたはC8-C24アルキニルであり、R106がC8-C24アルコキシエチル、C8-C24アルコキシプロピル、C8-C24アルケニルオキシエチル、C8-C24アルケニルオキシプロピル、C8-C24アルキニルオキシエチルまたはC8-C24アルキニルオキシプロピルであることも好ましい。この場合、R105が、直鎖のC8-C24アルケニルであり、R106が、C8-C24アルケニルオキシエチルであることがより好ましく、R105が、(Z)-オクタデカ-9-エニル、(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニルまたは(11Z,14Z)-イコサ-11,14-ジエニルであり、R106が、(Z)-オクタデカ-9-エニルオキシエチル、(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニルオキシエチルまたは(11Z,14Z)-イコサ-11,14-ジエニルオキシエチルであることがさらに好ましく、R105が、(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニルであり、R106が、(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニルオキシエチルであることが最も好ましい。
R105および／またはR106が、同一または異なって直鎖もしくは分枝状のC8-C24アルキルまたはC8-C24アルケニルである場合には、同一または異なってテトラデシル、ヘキサデシル、(Z)-テトラデカ-9-エニル、(Z)-ヘキサデカ-9-エニル、(Z)-オクタデカ-6-エニル、(Z)-オクタデカ-9-エニル、(E)-オクタデカ-9-エニル、(Z)-オクタデカ-11-エニル、(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニル、(9Z,12Z,15Z)-オクタデカ-9,12,15-トリエニル、(Z)-イコサ-11-エニル、(11Z,14Z)-イコサ-11,14-ジエニルまたは(Z)-ドコサ-13-エニルであることが好ましく、同一または異なってヘキサデシル、(Z)-ヘキサデカ-9-エニル、(Z)-オクタデカ-6-エニル、(Z)-オクタデカ-9-エニル、(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニル、(Z)-イコサ-11-エニルまたは(11Z,14Z)-イコサ-11,14-ジエニルであることがより好ましく、同一または異なって(Z)-オクタデカ-9-エニル、(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニルまたは(11Z,14Z)-イコサ-11,14-ジエニルであることがさらに好ましく、同一に(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニルであることが最も好ましい。
R107およびR108は、それぞれ前記R105およびR106と同義であり、前記R107およびR108と同様の基が好ましい。ただし、R107が、直鎖または分枝状のC8-C24アルキル、C8-C24アルケニルまたはC8-C24アルキニルである場合、R107およびR108は、同一に(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニルであることが好ましい。
R109およびR110は、それぞれ前記R105およびR106と同義であ、り、前記R109およびR110と同様の基が好ましい。ただし、R109およびR110は、同一に直鎖または分枝状のC15-C20アルキル、C15-C20アルケニルまたはC15-C20アルキニルであることが好ましく、同一に(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニルであることがより好ましい。
X103およびX104における、C1-C3アルキルとしては、例えばメチル、エチル、プロピル、イソプロピルまたはシクロプロピルが挙げられ、好ましくはメチルまたはエチルが挙げられ、さらに好ましくはメチルが挙げられる。
X103とX104が一緒になって形成する、C2-C8アルキレンとしては、例えばエチレン、プロピレン、ブチレン、ペンチレン、ヘキシレン、ヘプチレンまたはオクチレン等が挙げられ、好ましくはブチレン、ペンチレンまたはヘキシレン等が挙げられ、より好ましくはヘキシレン等が挙げられる。
X103がL111と一緒になって形成する、C2-C8アルキレンとしては、例えばエチレン、プロピレン、ブチレン、ペンチレン、ヘキシレン、ヘプチレンまたはオクチレン等が挙げられ、好ましくはプロピレン、ブチレンまたはペンチレン等が挙げられ、より好ましくはプロピレンまたはブチレン等が挙げられ、さらに好ましくはプロピレンが挙げられる。
X103およびX104は、同一または異なってメチルもしくはエチルであるか、一緒になってブチレン、ペンチレンもしくはヘキシレンを形成するか、またはX103がL111と一緒になってエチレン、プロピレンもしくはブチレンを形成することが好ましい。またX103およびX104は、同一または異なってメチルもしくはエチルであるか、または一緒になってブチレン、ペンチレンもしくはヘキシレンを形成することが好ましく、X103がL111と一緒になってエチレン、プロピレンもしくはブチレンを形成し、X104はメチルまたはエチルであることも好ましい。そしてX103およびX104は、同一にメチルであるか、または一緒になってヘキシレンを形成することがさらに好ましく、X103がL111と一緒になってプロピレンまたはブチレンを形成し、X104はメチルであることもさらに好ましい。
L111における、C1-C6アルキル、C3-C6アルケニル、モノアルキルアミノ、アルコキシ、モノアルキルカルバモイルおよびジアルキルカルバモイルは、それぞれ前記式(CL-I)におけるものと同義である。
L111は、水素原子、C1-C6アルキル、アミノ、モノアルキルアミノ、ヒドロキシ、アルコキシまたは同一もしくは異なって1〜3つのアミノ、モノアルキルアミノ、またはヒドロキシもしくはアルコキシで置換されたC1-C6アルキルであるか、またはX103と一緒になってC2-C6アルキレンを形成することが好ましく、水素原子、メチル、アミノ、メチルアミノ、ヒドロキシ、メ卜キシまたは同一もしくは異なって1〜3つのアミノもしくはヒドロキシで置換されたメチルであるか、またはX103と一緒になってエチレン、プロピレンもしくはブチレンを形成することがより好ましく、水素原子、C1-C3アルキル、またはヒドロキシであるか、またはX103と一緒になってプロピレンまたはブチレンを形成することがさらに好ましく、水素原子またはX103と一緒になってプロピレンを形成することが最も好ましい。
L109およびL110における、C1-C6アルキレンとしては、例えばメチレン、エチレン、プロピレン、ブチレン、ペンチレンまたはヘキシレン等が挙げられ、好ましくはメチレンまたはエチレン等が挙げられる。
L109は、メチレン、エチレンまたはプロピレン等であることが好ましく、メチレンまたはエチレン等であることがより好ましく、L110は、単結合、メチレンまたはエチレン等であることが好ましく、単結合またはメチレン等であることがより好ましい。L109とL110の炭素数の和は、1〜3が好ましく、2がさらに好ましい。これらいずれの場合にも、X103およびX104は、同一または異なってメチルもしくはエチル等であり、L111は、水素原子、メチル、アミノ、メチルアミノ、ヒドロキシ、メ卜キシまたは同一もしくは異なって1〜3つのアミノもしくはヒドロキシで置換されたメチル等であるか、X103とX104は一緒になってペンチレン、ヘキシレンもしくはヘプチレン等を形成し、L111は、水素原子、メチル、アミノ、メチルアミノ、ヒドロキシ、メ卜キシまたは同一もしくは異なって1〜3つのアミノもしくはヒドロキシで置換されたメチル等であるか、またはX103とL111は一緒になってプロピレン、ブチレンもしくはペンチレン等を形成し、X104はメチルまたはエチル等であることが好ましく、X103およびX104はメチルであり、L111は水素原子であるか、X103とX104は一緒になってペンチレンまたはヘキシレンを形成し、L111は水素原子であるか、またはX103とL111は一緒になってプロピレンを形成し、X104はメチル等であることがより好ましい。
式(CL-V)の各基の定義において、X105における、C1-C3アルキルとしては、例えばメチル、エチル、プロピル、イソプロピルまたはシクロプロピル等が挙げられ、好ましくはメチル、エチルまたはイソプロピル等が挙げられ、より好ましくはメチルまたはエチル等が挙げられる。なお、X105としては、水素原子またはメチル等がさらに好ましく、水素原子が最も好ましい。
L112における、C1-C3アルキレンとしては、例えば、メチレン、エチレンまたはプロピレン等が挙げられ、好ましくはメチレンまたはエチレン等が挙げられる。
式(CL-VI)および式(CL-VII)の各基の定義において、直鎖または分枝状の置換されていても良いC8-C24アルキル、C8-C24アルケニルおよびC8-C24アルキニルは、それぞれ前記式(I)〜(V‘’)におけるものと同義である。
式(CL-VII)のX108における、置換されていても良いC1-C4アルキル、置換されていても良いC1-C4アルコキシおよび置換されていても良いC1-C4アシルオキシは、前記式(I)〜(IV)におけるものと同義である。
式(CL-VI)において、R111およびR112は同一の直鎖もしくは分枝状のC8-C24アルキル、C8-C24アルケニルまたはC8-C24アルキニルであることが好ましく、同一の直鎖もしくは分枝状のC8-C24アルキル、またはC8-C24アルケニルであることがより好ましい。
R111およびR112は、同一または異なってオクチル、デシル、ドデシル、テトラデシル、ヘキサデシル、オクタデシル、イコシル、ドコシル、テトラコシル、(Z)-テトラデカ-9-エニル、(Z)-ヘキサデカ-9-エニル、(Z)-オクタデカ-6-エニル、(Z)-オクタデカ-9-エニル、(E)-オクタデカ-9-エニル、(Z)-オクタデカ-11-エニル、(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニル、(9Z,12Z,15Z)-オクタデカ-9,12,15-トリエニル、(Z)-イコサ-11-エニル、(11Z,14Z)-イコサ-11,14-ジエニル、3,7,11-トリメチルドデカ-2,6,10-トリエニルまたは3,7,11,15-テトラメチルヘキサデカ-2-エニル等であることが好ましく、同一または異なってドデシル、テトラデシル、(Z)-ヘキサデカ-9-エニル、(Z)-オクタデカ-6-エニル、(Z)-オクタデカ-9-エニルまたは(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニル等であることがより好ましく、同一に(Z)-ヘキサデカ-9-エニル、(Z)-オクタデカ-6-エニル、(Z)-オクタデカ-9-エニルまたは(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニル等であることがさらに好ましい。
X106とX107は、同一または異なってメチルまたはエチルであることが好ましく、同一にメチルであることがより好ましい。
X106とX107が一緒になって形成する、C2-C8アルキレンとしては、例えばエチレン、プロピレン、ブチレン、ペンチレン、ヘキシレン、ヘプチレンまたはオクチレン等が挙げられ、好ましくはブチレン、ペンチレンまたはヘキシレン等が挙げられ、より好ましくはブチレンまたはペンチレン等が挙げられる。
X106およびX107は、同一にメチルであるか、または一緒になってブチレン、ペンチレンまたはヘキシレンを形成することが好ましい。
p103および104は同時に0であることが好ましく、p105は1であることが好ましい。
L113およびL114は同時にOであることが好ましい。
R113およびR114は、同一の直鎖もしくは分枝状のC8-C24アルキル、C8-C24アルケニルまたはC8-C24アルキニルであることが好ましく、同一の直鎖もしくは分枝状のC8-C24アルキルまたはC8-C24アルケニルであることがより好ましい。
X109およびX110におけるC1-C3アルキルおよびC2-C8アルキレンは、それぞれ前記式(CL-VI)におけるものとと同義である。
X108は、水素原子、ヒドロキシ、メチルまたはメトキシ等であることが好ましく、水素原子またはヒドロキシ等であることがより好ましく、水素原子であることがさらに好ましい。
L115は、-O-CO-であることが好ましい。この場合、p106が0または1であり、p107が2〜4の整数であることが好ましく、p106が0または1であり、p107が3であることがより好ましい。
L115が、-CO-O-である場合、p106が0であり、p107が2〜4の整数であることが好ましく、p106が0であり、p107が3であることがより好ましい。
本発明で用いられる脂質Bの具体例を以下の表1〜27示すが、本発明の脂質Bはこれらに限定されるものではない。
Figure 0006910947
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本発明の核酸含有脂質ナノ粒子には、上記以外の脂質Bとして、親水部として４級アンモニウム基を有し、疎水部として置換基を有していても良い独立した2つの炭化水素基を有する脂質を用いることもできる。表28にこのような脂質の具体例をあげる。
Figure 0006910947
次に本発明の脂質Aの製造方法について説明する。なお、以下に示す製造法において、定義した基が該製造法の条件下で変化するかまたは該製造法を実施するのに不適切な場合、有機合成化学で常用される保護基の導入および除去方法[例えば、プロテクティブ・グループス・イン・オーガニック・シンセシス第3版(Protective Groups in Organic Synthesis, third edition)、グリーン(T.W.Greene)著、John Wiley＆Sons Inc.(1999年)等に記載の方法]等を用いることにより、目的化合物を得ることができる。また、必要に応じて置換基導入等の反応工程の順序を変えることもできる。
また、以下に示す製造法において記載されているエーテル化（第4版実験化学講座20 有機化合物の合成II」、第4版、p.187、丸善(1992年)等）、アミノ化（第4版実験化学講座20 有機化合物の合成II」、第4版、p.279、丸善(1992年)等）、エステル化（第4版実験化学講座22 有機化合物の合成IV」、第4版、p.43、丸善(1992年)等）、アミド化（第4版実験化学講座22 有機化合物の合成IV」、第4版、p.137、丸善(1992年)等）等の一般的な単位反応は、それぞれ既存の文献に記載されている一般的な反応条件を用いても行うことができる。
以下、合成経路1または2のいずれかの方法、あるいはこれらの方法に準じた方法等で化合物(I)を得ることができる。
化合物(I)は、アンモニアから合成経路1に従い得ることができる。
Figure 0006910947
 （式中、Msはメタンスルホニル基を表し、その他の各基は前記と同義である）
アンモニアと化合物1とを溶媒（例えば、テトラヒドロフランやメタノール等の極性溶媒等）中、高温（例えば、80℃以上）で反応させることにより化合物2を得ることができる。
化合物2と化合物3とを、塩基（例えば、水酸化ナトリウム等の無機塩基等）の存在下、高温（例えば、100℃以上）で反応させることにより化合物4が得られる。溶媒は特に必要無いが、場合により高沸点の溶媒（例えば、エチレングリコール等の極性溶媒等）を用いることもできる。
化合物4と化合物5とを塩基（例えば、水酸化ナトリウム等の無機塩基等）の存在下、高温（例えば、100℃以上）で反応させることにより化合物6が得られる。溶媒は特に必要無いが、場合により高沸点の溶媒（例えば、エチレングリコール等の極性溶媒等）を用いることもできる。
上記3つの各加熱反応ではマイクロ波反応装置を好適に用いることも出来る。また、化合物1, 化合物3および化合物5の代わりにこれらに対応する臭化物またはヨウ化物等のハロゲン化物を用いることもできる。
R1-L1とR2-L2とが同じである化合物4は、アンモニアから過剰量の化合物1を用いることでも得られる。また、R2-L2とR3-L3とが同じである化合物6は、化合物2から過剰量の化合物3を用いることでも得られる。さらにR1-L2、R2-L2およびR3-L3が同じである化合物6は、アンモニアからさらに過剰量の化合物1を用いることでも得られる。
化合物6と化合物7とを、溶媒（例えば、クロロホルム等のハロゲン系溶媒等）の存在下または非存在下、室温または高温（例えば、100℃以上）で反応させることにより化合物(I)が得られる。なお、例えば、適切な陰イオン交換樹脂で(I)を処理することにより、化合物(I)の陰イオンA1を別の陰イオンに変換することもできる。
化合物1, 化合物3, 化合物5および化合物7等の反応に使用する化合物は、市販品として、または実施例に記載の方法もしくはそれに準じた方法で、もしくは文献により既知の方法（例えば、「第5版実験化学講座13 有機化合物の合成I」、第5版、p.374、丸善(2005年)等に記載の方法）もしくはそれに準じた方法で入手することができる。
また化合物1は、対応するR1-L1-OHを無水メシル酸またはメシル酸クロリドで処理することによっても得ることができる。
さらに化合物R1-L1-OHのうち、L1が-Z1-(CY1Y2)p1- (各基は前記と同義)であるものは、R1-OMs、R1-OH、R1-NY7A-H (Y7Aは前記と同義)またはR1-CO2Hのいずれかひとつと、HO-(CY1Y2)p1-O-PRO1、MsO-(CY1Y2)p1-O-PRO1、HO2C-(CY1Y2)p1-O-PRO1またはH-NY7A-(CY1Y2)p1-O-PRO1(式中、PRO1はシリル系保護基(例えば、トリエチルシリル(TES)、tert-ブチルジメチルシリル(TBS)、tert-ブチルジフェニルシリル(TBDPS)等))のいずれかひとつとを、（例えば水素化ナトリウム等の強塩基を用いた）エーテル化、（例えば置換反応等の）アミノ化、（例えば、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩または等の縮合剤を用いた）エステル化、または（例えば、同様の縮合剤を用いた）アミド化のいずれかの反応を行った後に、脱保護することにより得ることができる。
また、化合物R1-L1-OHのうち、L1が-Z2-(CY3Y4)p2-Z3-(CY5Y6)p3- (各基は前記と同義)であるものも、同様に目的とする化合物に対応した反応基質を用い、公知の反応を１〜複数回適用することにより得ることができる
化合物3および5は、化合物1と同様の手法により調製することができる
化合物(Ia)は、化合物8から合成経路2に従い得ることができる。
Figure 0006910947
 （式中、M1〜M3は同一または異なって-(CY1Y2)p1-または-(CY3Y4)p2-Z3-(CY5Y6)p3- （式中、各基は前記と同義である）であり、その他の各基はそれぞれ前記と同義である）
化合物8と化合物9とを、溶媒（例えば、クロロホルム等のハロゲン系溶媒等）中、塩基（例えば、トリエチルアミン等の有機塩基等）、縮合剤（例えば、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩またはO-(7-アザ-1H-ベンゾトリアゾール-1-イル)-N,N,N',N'-テトラメチルウロニウム ヘキサフルオロフォスフェート等の縮合剤）および活性化剤（N,N-ジメチルアミノピリジン等の活性化剤）で処理することにより化合物10が得られる。
化合物10と化合物11とを上記と同様の方法でエステル化することにより化合物12が得られる。
さらに、化合物12と化合物13とを上記と同様の方法でエステル化することにより化合物14が得られる。
R1とR2とが同じである化合物12は、化合物8から過剰量の化合物9を用いることでも得られる。また、R2とR3とが同じである化合物14は、化合物10から過剰量の化合物11を用いることでも得られる。さらにR1、R2およびR3とが同じである化合物14は、化合物8からさらに過剰量の化合物9を用いることでも得られる。
化合物14と化合物15とを、溶媒（例えば、クロロホルム等のハロゲン系溶媒等）の存在下または非存在下、室温または高温（例えば、100℃以上）で反応させることにより化合物(Ia)が得られる。なお、例えば、適切な陰イオン交換樹脂で(Ia)を処理することにより、化合物(Ia)の陰イオンA1を別の陰イオンに変換することもできる。
化合物8, 化合物9, 化合物11, 化合物14および化合物15等の反応に使用する化合物は、市販品として、または実施例に記載の方法もしくはそれに準じた方法で、もしくは文献により既知の方法(例えば、「第5版実験化学講座14 有機化合物の合成II」、第5版、p.1、丸善(2005年)、「第4版実験化学講座22 有機化合物の合成IV」、第4版、p.1、丸善(1992年)等に記載の方法)もしくはそれに準じた方法で入手することができる。
以下、合成経路3〜17のいずれかの方法、あるいはこれらの方法に準じた方法等で化合物(II)を得ることができる。
化合物(IIa)は、化合物16から合成経路3に従い得ることができる。
Figure 0006910947
 （式中、M7は存在せずM4は-(CY8Y9)p4-であるか、M7は存在せずM4は-(CY10Y11)p5-Z6-(CY12Y13)p6-であるか、またはM7は-Z5-(CY10Y11)p5-でありM4は-(CY12Y13)p6-である（式中、各基はそれぞれ前記と同義である）。また、M8は存在せずM5は-(CY8Y9)p4-であるか、M8は存在せずM5は-(CY10Y11)p5-Z6-(CY12Y13)p6-であるか、またはM8は-Z5-(CY10Y11)p5-でありM5は-(CY12Y13)p6-である。さらに、M9は存在せずM6は-(CY8Y9)p4-であるか、M9は存在せずM6は-(CY10Y11)p5-Z6-(CY12Y13)p6-であるか、またはM9は-Z5-(CY10Y11)p5-でありM6は-(CY12Y13)p6-である。その他の各基はそれぞれ前記と同義である。）
化合物22は、化合物16と、化合物17, 化合物19および化合物21とを、合成経路2における化合物8と化合物9とのエステル化反応と同様の反応条件を適用して順に反応させることにより得られる。
化合物(IIa)は化合物22と化合物23とから、合成経路2における化合物14と化合物15との反応により化合物(Ia)を合成する際の反応条件と同様の条件を適用して反応させるすることにより得られる。なお、例えば、適切な陰イオン交換樹脂で(IIa)を処理することにより、化合物(IIa)の陰イオンA2を別の陰イオンに変換することもできる。
化合物16, 化合物17, 化合物19, 化合物21および化合物23等の反応に使用する化合物は、市販品として、または実施例に記載の方法もしくはそれに準じた方法で、もしくは文献により既知の方法(例えば、「第5版実験化学講座14 有機化合物の合成II」、第5版、p.1、丸善(2005年)、「第4版実験化学講座22 有機化合物の合成IV」、第4版、p.1、丸善(1992年)等に記載の方法)もしくはそれに準じた方法で入手することができる。
化合物16は後述の合成経路12〜16の方法でも得ることができる。
化合物17のうち、M7が-Z5-(CY10Y11)p5-であるものは、R4-OMs、R4-OH、R4-NY14A-H (Y14Aは前記と同義)またはR4-CO2Hのいずれかひとつと、HO-(CY10Y11)p5-CO-O-PRO2、MsO-(CY10Y11)p5-CO-O-PRO2、HO2C-(CY10Y11)p5-CO-O-PRO2またはH-NY14A-(CY10Y11)p5-CO-O-PRO2(式中、PRO2はカルボン酸のための保護基(例えば、メチル、tert-ブチル、ベンジル等))のいずれかひとつとを、（例えば水素化ナトリウム等の強塩基を用いた）エーテル化、（例えば置換反応等の）アミノ化、（例えば、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩等の縮合剤を用いた）エステル化、または（例えば、同様の縮合剤を用いた）アミド化のいずれかの反応を行った後に、脱保護することにより得ることができる。
化合物19および21は、化合物17と同様の手法により調製することができる。
合成経路3中、X4の導入を最初に行うこともできる。すなわち、まず化合物16に化合物23を作用させた後に、次いで化合物17, 19および21と順にエステル化を行うことでも化合物(IIa)を得ることができる。
化合物(IIb)は、化合物16から合成経路4に従い得ることができる。
Figure 0006910947
 （式中、各基はそれぞれ前記と同義である）
化合物16と化合物24とを溶媒（例えば、テトラヒドロフランまたはトルエン等の非プロトン性溶媒等）中、塩基（例えば、水素化ナトリウム等の無機塩基等）の存在下、高温（例えば、100℃以上）で反応させることにより化合物25を得ることができる。
化合物25と化合物26とを、上記と同様の方法でエーテル化すると、化合物27が得られる。
化合物27と化合物28とを、上記と同様の方法でエーテル化すると、化合物29が得られる。
上記３つの各加熱反応ではマイクロ波反応装置を好適に用いることも出来る。また、化合物24, 化合物26および化合物28の代わりにこれらに対応する臭化物またはヨウ化物等を用いることもできる。
R4-M7とR5-M8とが同じである化合物27は、化合物16から過剰量の化合物24を用いることでも得られる。また、R5-M8とR6-M9とが同じである化合物29は、化合物25から過剰量の化合物26を用いることでも得られる。さらにR4-M7、R5-M8およびR6-M9とが同じである化合物29は、化合物16からさらに過剰量の化合物24を用いることでも得られる。
化合物29と化合物23とを、溶媒（例えば、クロロホルム等のハロゲン系溶媒等）の存在下または非存在下、室温または高温（例えば、100℃以上）で反応させることにより化合物(IIb)が得られる。なお、例えば、適切な陰イオン交換樹脂で(IIb)を処理することにより、化合物(IIb)の陰イオンA2を別の陰イオンに変換することもできる。
化合物16, 化合物24, 化合物26, 化合物28および化合物23等の反応に使用する化合物は、市販品として、または実施例に記載の方法もしくはそれに準じた方法で、もしくは文献により既知の方法（例えば、「第5版実験化学講座14 有機化合物の合成II」、第5版、p.1、丸善(2005年)、「第5版実験化学講座13 有機化合物の合成I」、第5版、p.374、丸善(2005年)等に記載の方法）もしくはそれに準じた方法で入手することができる。
また化合物24は、対応するR4-M7-OHを無水メシル酸またはメシル酸クロリドで処理することによっても得ることができる。
さらに化合物R4-M7-OHのうち、M7が-Z5-(CY10Y11)p5- (各基は前記と同義)であるものは、R4-OMs、R4-OH、R4-NY14A-H (Y14Aは前記と同義)またはR4-CO2Hのいずれかひとつと、HO-(CY10Y11)p5-O-PRO1、MsO-(CY10Y11)p5-O-PRO1、HO2C-(CY10Y11)p5-O-PRO1またはH-NY14A-(CY10Y11)p5-O-PRO1(各基は前記と同義)のいずれかひとつとを、エーテル化、アミノ化、エステル化、またはアミド化のいずれかの反応を行った後に、脱保護することにより得ることができる。
化合物26および28は、化合物24と同様の手法により調製することができる
合成経路5に示すように、化合物(IIc)は、合成経路4で得られる化合物25から、合成経路3におけるエステル化等の各反応を適宜組み合わせることで得ることができる。さらに合成経路5に示すように、化合物(IId)は、合成経路4で得られる化合物27から、合成経路3におけるエステル化等の各反応を適宜組み合わせることで得ることができる。
Figure 0006910947
 （式中、各基はそれぞれ前記と同義である）
化合物(IIe)は、化合物30から合成経路6に従い得ることができる。
Figure 0006910947
 （式中、M10, M11およびM12はそれぞれ独立してOまたはNY14Aであり、その他の各基はそれぞれ前記と同義である）
化合物33は、化合物30と、化合物17, 化合物19および化合物21とを、順にエステル化またはアミド化反応させることにより得られる。
化合物(IIe)は化合物33と化合物23とから、合成経路2における化合物14と化合物15との反応により化合物(Ia)を合成する際の反応条件と同様の条件を適用して反応させるすることにより得られる。なお、例えば、適切な陰イオン交換樹脂で(IIe)を処理することにより、化合物(IIe)の陰イオンA2を別の陰イオンに変換することもできる。
化合物30は後述の合成経路12〜16の方法でも得ることができる。
化合物(IIf)は、化合物34から合成経路7に従い得ることができる。
Figure 0006910947
 （式中、各基は前記と同義である）
化合物35は、化合物34を適切な保護基で保護することにより得られる。
化合物36は、化合物35と、化合物23とを、合成経路2における化合物14と化合物15との反応により化合物(Ia)を合成する際の反応条件と同様の条件を適用して反応させたのちに、適切な条件で脱保護することにより得られる。
化合物(IIf)は、化合物36と、化合物37, 化合物39および化合物41とを、順にエステル化またはアミド化反応させることにより得られる。なお、例えば、適切な陰イオン交換樹脂で化合物(IIf)を処理することにより、化合物(IIf)の陰イオンA2を別の陰イオンに変換することもできる。
化合物34、35および36は、市販品として、または実施例に記載の方法もしくはそれに準じた方法で入手することができる。また、化合物34、35および36は後述の合成経路12または17で得られるトリオール化合物を、酸化剤で酸化することでも得ることができる。
化合物37のうち、M10がNY14Aであるものは、R4-M7-OMs (化合物24)とY14ANH2とを反応させることでも得ることができる。
化合物37および39は、化合物35と同様の手法により調製することができる。
なお、化合物(IIf)は、合成経路8に記載のように、化合物24と、化合物37, 39および41とで順にエステル化／アミド化を行い、最後に化合物23を作用させてX4を導入することでも得ることができる。
Figure 0006910947
 （式中、各基は前記と同義である）
化合物(IIg)は、シアノ酢酸エチルから合成経路9に従い得ることができる。
Figure 0006910947
 （式中、Etはエチル基を表し、LAHは水素化アルミニウムリチウムであり、その他の各基はそれぞれ前記と同義である）
シアノ酢酸エチルと化合物24とを、溶媒（例えば、テトラヒドロフラン等の非プロトン性溶媒等）中、塩基（例えば、水素化ナトリウム等の無機塩基等）および、場合によっては添加剤（例えば、ヨウ化テトラブチルアンモニウム等の添加剤）の存在下、高温（例えば、60℃以上）で反応させることにより化合物42を得ることができる。
化合物42と化合物26とを、溶媒（例えば、テトラヒドロフラン等の非プロトン性溶媒等）中、塩基（例えば、水素化ナトリウム等の無機塩基等）および、場合によっては添加剤（例えば、ヨウ化テトラブチルアンモニウム等の添加剤）の存在下、高温（例えば、60℃以上）で反応させることにより43を得ることができる。
R4とR5とが同じである化合物43は、シアノ酢酸エチルから過剰量の化合物24を用いることでも得ることができる。
化合物43を溶媒（例えば、テトラヒドロフラン等の非プロトン性溶媒等）中、過剰量の水素化アルミニウムリチウム(LAH)で還元することにより化合物44を得ることができる。
溶媒（例えば、クロロホルム等のハロゲン系溶媒等）の存在下または非存在下、化合物44に対して化合物45, 化合物46および化合物23を順次作用させることにより、化合物47を得ることができる。X2、X3およびX4が同一である化合物47は、44から過剰量の化合物45を用いることでも得ることができる。
化合物(IIg)は、化合物47と化合物21とから、合成経路2における化合物8と化合物9とのエステル化反応と同様の反応条件を適用して反応させることにより得られる。なお、例えば、適切な陰イオン交換樹脂で(IIg)を処理することにより、化合物(IIg)の陰イオンA2を別の陰イオンに変換することもできる。
化合物45および46は、化合物23と同様である。
化合物(IIh)は、マロン酸ジメチルから合成経路10に従い得ることができる。
Figure 0006910947
 （式中、Meはメチル基を表し、LAHは水素化アルミニウムリチウムであり、その他の各基はそれぞれ前記と同義である）
マロン酸ジメチルと化合物24とを、溶媒（例えば、アセトニトリル等の非プロトン性溶媒等）中、塩基（例えば、炭酸セシウム等の無機塩基等）および、場合によっては添加剤（例えば、ヨウ化テトラブチルアンモニウム等の添加剤）の存在下、加温（例えば、50℃）下で反応させることにより化合物48を得ることができる。
化合物48と化合物49とを、溶媒（例えば、アセトニトリル等の非プロトン性溶媒等）中、無水酢酸および塩基（例えば、水素化ナトリウム等の無機塩基等）の存在下で反応させることにより化合物50を得ることができる。
化合物50を溶媒（例えば、テトラヒドロフラン等の非プロトン性溶媒等）中、過剰量の水素化アルミニウムリチウム(LAH)で還元することにより化合物51を得ることができる。
化合物52は、化合物51と、化合物19および化合物21とを、合成経路2における化合物8と化合物9とのエステル化と同様の反応条件を適用して反応させることにより得られる。
化合物52と化合物53とを、溶媒（例えば、クロロホルム等のハロゲン系溶媒等）の存在下または非存在下、室温または高温（例えば、100℃以上）で反応させることにより化合物(IIh)が得られる。なお、例えば、適切な陰イオン交換樹脂で(IIh)を処理することにより、化合物(IIh)の陰イオンA2を別の陰イオンに変換することもできる。
化合物49は、市販品として、または実施例に記載の方法もしくはそれに準じた方法で、もしくは文献により既知（例えば、「ヘルベティカ・キミカ・アクタ（Helvetica Chimica Acta）、92巻、8号、1644-1656頁、2009年」等に記載の方法）の方法もしくはそれに準じた方法で入手することができる。
化合物54および56は、合成経路12に従い得ることができる。
Figure 0006910947
 （式中、各基はそれぞれ前記と同義である）
化合物54は、化合物53のヒドロキシを保護することにより得ることができる。
また、化合物53は市販品として得ることができる。
化合物55は、化合物54に、化合物45および化合物46を作用させることにより得ることができる。
化合物56は、化合物55を脱保護することにより得ることができる。
化合物58〜65は、合成経路13に従い得ることができる。
Figure 0006910947
 （式中、Halは塩素、臭素、ヨウ素等のハロゲン原子であり、その他の各基はそれぞれ前記と同義である）
化合物58は、化合物57のヒドロキシを保護することにより得ることができる。
また、化合物57は市販品として得ることができる。
化合物59は、化合物58に、ハロゲン化試薬（例えば、塩素、臭素、ヨウ素、塩化ヨウ素等）を作用させることにより得ることができる。
化合物60は、化合物59とアンモニアを反応させることにより得られる。また、化合物61は、化合物60に化合物45を作用させることにより得られる。さらに、化合物63は、化合物61に化合物46を作用させることにより得られる。
また、化合物63は、化合物59と化合物62を反応させることによっても得られる。
化合物63は、化合物62を脱保護することにより得られる。
化合物64は、化合物58を適切な酸化剤（例えば過マンガン酸カリウムや、ジョーンズ試薬等）で酸化することにより得られる。
化合物67〜73は、合成経路14に従い得ることができる。
Figure 0006910947
 （式中、各基はそれぞれ前記と同義である）
化合物66は、化合物59にシアン化物（例えば、シアン化ナトリウム、シアン化カリウム、シアン化リチウム等）を作用させることにより得られる。
化合物67は、化合物66を水素化アルミニウムリチウム等で還元することにより得られる。
化合物68は、化合物67に化合物45を作用させることにより得られる。また、化合物69は、化合物68に化合物46を作用させることにより得られる。
化合物70は、化合物69を脱保護することにより得られる。
化合物71は、化合物66を塩基（例えば水酸化ナトリウム等）で加水分解することにより得られる。
化合物72は、化合物71を還元（例えばボラン等）で還元することにより得られる。
化合物73は、化合物72に、ハロゲン化試薬（例えば、塩素、臭素、ヨウ素、塩化ヨウ素等）を作用させることにより得ることができる。
化合物73に対して、合成経路14における化合物59からの各反応を順次行うことにより、化合物67、68、69、71、72および73の、各官能基（アミノ基、モノアルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基、カルボン酸、ヒドロキシおよびハロゲン）と4級炭素との間のアルキレン鎖がさらに延長した化合物を得ることができる。またこれを繰り返すことにより各官能基と4級炭素との間のアルキレン鎖は自由に延長することができる。
化合物76は、合成経路15に従い合成できる。
Figure 0006910947
 （式中、M13は-(CH2)p201-であり、M15は-(CH2)p202-であり（式中、p201〜p202は1〜5の整数である）、M14は-O-、-CO-O-または-NY27A-であり、PRO4はM14に合わせて、ヒドロキシのための保護基PRO1、カルボン酸のための保護基PRO2、またはアミンのための保護基PRO3（例えばtert-ブトキシカルボニル等のカルバマート系保護基、またはベンジル等）のいずれかを表す）
化合物74は、合成経路12〜14に記載の方法、またはそれらに準じた方法により得られる。
化合物75は、化合物74を適切に保護・脱保護することにより得られる。
化合物76は、化合物75を原料として、合成経路12〜14に記載の方法、またはそれらに準じた方法により得られる。
化合物77〜79は、合成経路16に記載のように、化合物76を原料とし、保護ならびに脱保護、および合成経路15に準じた方法を順次行うことにより得ることができる。
Figure 0006910947
 （式中、M16およびM17は、それぞれ-(CH2)p203-および-(CH2)p204-をあらわし（式中、p203〜p204は1〜5の整数である）、その他の各基は前記と同義である）
化合物82、84、87、89、92および95は、合成経路17に従い合成できる。
Figure 0006910947
 （式中、M18は-(CY19Y20)p9-または-(CY23Y24)p11-Z9-(CY25Y26)p12-である。また、b1は
Figure 0006910947
 であり、Arはp-ニトロフェニル基であり、Halは塩素、臭素、ヨウ素等のハロゲン原子であり、その他の各基はそれぞれ前記と同義である。なお、p13が0である場合には、Nは直接Z10に隣接する炭素原子と結合する。）
化合物82は、化合物80と化合物81とをエステル化で縮合した後に、脱保護することにより得られる。
化合物84は、化合物83と化合物81とをアミド化で縮合した後に、脱保護することにより得られる。
化合物87は、化合物85と化合物86とをエステル化で縮合した後に、脱保護することにより得られる。
化合物89は、化合物85と化合物88とをアミド化で縮合した後に、脱保護することにより得られる。
化合物92は、化合物90と化合物91とを求核置換反応後に、脱保護することにより得られる。
化合物95は、化合物93と化合物94とをエステル交換反応後に、脱保護することにより得られる。
80、83、85、90および93は、合成経路13〜16またはこれらに準じた方法により得ることができる。
化合物81、86、88、91および94のうち、M18が-(CY19Y20)p9-であるものは、市販品として、または実施例に記載の方法もしくはそれに準じた方法で、もしくは市販品の官能基を定法に従って変換することで得ることできる。
この場合、b1が
Figure 0006910947
 である化合物については、それぞれ
Figure 0006910947
 （式中、M37は、-OH、-CO2HまたはNY38である（ただし、Y38は、水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルである））に、それぞれに対応する適切なフラグメントをエーテル化、アミノ化、エステル化、アミド化等で縮合することにより得ることができる。
また、化合物81、86、88、91および94のうち、M18が-(CY23Y24)p11-Z9-(CY25Y26)p12-であるものは、化合物81、86、88、91および94のうち、M18が-(CY19Y20)p9-であるものと同様の化合物に、それぞれに対応する適切なフラグメントをエーテル化、アミノ化、エステル化、アミド化等で縮合することにより得ることができる。
以下、合成経路18〜22の方法、あるいはこれらの方法に準じた方法等で化合物(III)を得ることができる。
化合物(IIIa)は、化合物96から合成経路18に従い得ることができる。
Figure 0006910947
 （式中、各基はそれぞれ前記と同義である）
化合物96と化合物97とを、溶媒（例えば、クロロホルム等のハロゲン系溶媒等）の存在下または非存在下、室温または高温（例えば、100℃以上）で反応させることにより化合物(IIIa)が得られる。なお、例えば、適切な陰イオン交換樹脂で(IIIa)を処理することにより、化合物(IIIa)の陰イオンA3を別の陰イオンに変換することもできる。
化合物96は、実施例に記載の方法もしくはそれに準じた方法で、または文献（米国特許出願公開第2012/0172411号明細書）記載の方法もしくはそれに準じた方法で入手することができる。
化合物97等の反応に使用する化合物は、市販品として、または実施例に記載の方法もしくはそれに準じた方法で、もしくは文献により既知の方法もしくはそれに準じた方法で入手することができる。
化合物(IIIb)は、グリオキシル酸エチルから合成経路19に従い得ることができる。
Figure 0006910947
 （式中、M19は-(CY50Y51)p23-または-(CY54Y55)p25-Z17-(CY56Y57)p26-（式中、各基はそれぞれ前記と同義である）であり、b2は
Figure 0006910947
 であり、その他の各基はそれぞれ前記と同義である。なお、p33が0である場合には、Nは直接Z21に隣接する炭素原子と結合する。）
溶媒(例えば、テトラヒドロフラン等のエーテル系溶媒等)中、グリオキシル酸エチルと、グリニャール試薬98、99および100とを順次反応させることにより、化合物101が得られる。なお、R7、R8およびR9が同一の化合物101は、グリオキシル酸エチルに過剰量の化合物98を作用させることによっても得られる。
化合物101と化合物102とを溶媒（例えば、クロロホルム等のハロゲン系溶媒等）中、塩基（例えば、トリエチルアミン等の有機塩基等）、縮合剤（例えば、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩等の縮合剤）および活性化剤（N,N-ジメチルアミノピリジン等の活性化剤）で処理することにより化合物103が得られる。
化合物103と化合物97、104または105とを、溶媒（例えば、クロロホルム等のハロゲン系溶媒等）の存在下または非存在下、室温または高温（例えば、100℃以上）で反応させることにより化合物(IIIb)が得られる。なお、例えば、適切な陰イオン交換樹脂で化合物(IIIb)を処理することにより、化合物(IIIb)の陰イオンA3を別の陰イオンに変換することもできる。
化合物98は、R7-OH（市販品、実施例に記載の方法もしくはそれに準じた方法で得られる）にメシル化試薬（メシル酸無水物またはメシル酸クロリド等）、臭化物塩（臭化マグネシウムまたは臭化リチウム等）、および金属マグネシウムを順次作用させることにより得られる。化合物99および100は化合物98と同様である。
化合物104および105は、化合物23と同様である。
化合物102は、化合物54と同様である。
化合物108、109、および112は、それぞれアンモニア、蟻酸エチル、および化合物99から合成経路20に従い得ることができる。
Figure 0006910947
 （式中、M21は-OHでありM22はHO-CO-でありM25は-O-CO-であるか、M21は-NY45C-HでありM22はHO-CO-でありM25は-NY45C-CO-であるか、M21は-CO-OHでありM22はHO-でありM25は-CO-O-であるか、またはM21は-CO-OHでありM22はH-NY14B-でありM25は-CO-NY14B-である。また、M20は存在せずM23は-(CY39Y40)p18-であるか、M20は存在せずM23は-(CY41Y42)p19-Z14-(CY43Y44)p20-であるか、または、M20は-Z13-(CY41Y42)p19-でありM23は-(CY43Y44)p20-である。さらにM24は-(CY63Y64)p29-、または-(CY67Y68)p31-Z20-(CY69Y70)p32-であり、その他の各基はそれぞれ前記と同義である。）
化合物108は、アンモニア、化合物106および化合物107とを、合成経路1におけるアンモニアから化合物4を合成するのと同様の反応条件を適用して反応させることにより得られる。
化合物109は、蟻酸エチル、化合物99および化合物100とを、合成経路19におけるグリオキシル酸エチルから化合物101を合成するのと同様の反応条件を適用して反応させることにより得られる。
化合物112は、化合物110と化合物111とをエステル化またはアミド化で縮合させた後に、脱保護することにより得ることができる。
化合物106および107は、化合物1と同様である。
化合物110のうちM21が-OHであるものは、合成経路1記載のR1-L1-OHと同様である。また、化合物110のうちM21が-NY45C-Hであるものは、化合物37と同様である。さらに、化合物110のうちM21が-CO-OHであるものは、化合物17と同様である。
化合物111は、市販品として、または実施例に記載の方法もしくはそれに準じた方法で、もしくは文献により既知の方法(例えば、第4版実験化学講座20 有機化合物の合成II」、第4版、p.187、丸善(1992年)等に記載の方法)もしくはそれに準じた方法で入手することができる。
化合物(IIIc)および(IIId)は、それぞれ化合物108および112、ならびに化合物109および112から合成経路21に従い得ることができる。
Figure 0006910947
 （式中、各基はそれぞれ前記と同義である）
化合物(IIIc)は、化合物108と112とをアミド化で縮合した後、化合物114、1115、または116を作用させることにより得られる。
化合物(IIId)は、化合物109と112とをエステル化で縮合した後、化合物114、1115、または116を作用させることにより得られる。
なお、例えば、適切な陰イオン交換樹脂で化合物(IIIc)または(IIId)を処理することにより、化合物(IIIc)または(IIId)の陰イオンA3を別の陰イオンに変換することもできる。
反応に用いる各化合物は前述のとおりである。
以下、合成経路12〜13の方法、あるいはこれらの方法に準じた方法等で化合物(IV)を得るることができる。
化合物127は、合成経路22に従い得ることができる。
Figure 0006910947
 (式中、M26およびM27は同一または異なって-(CY90Y91)p41-であり、M28およびM29は同一または異なって-O-CO-(CY90Y91)p41-または-CO-O-(CY90Y91)p41-であり、M30およびM31は同一または異なって存在しないか、-O-CO-(CY90Y91)p41-または-CO-O-(CY90Y91)p41-であり、その他の各基はそれぞれ前記と同義である)
化合物118と、化合物119および化合物120とをエステル化反応で順次縮合させるか、または化合物122と、化合物123および化合物124とエステル化反応で順次縮合させることにより化合物121を得ることができる。
化合物125は、化合物121に、溶媒（例えば、テトラヒドロフラン等のエーテル系溶媒等）中、脱保護試薬（例えば、フッ化テトラn-ブチルアンモニウム等の脱保護試薬）を作用させるか、または蟻酸エチルに、溶媒（例えば、テトラヒドロフラン等のエーテル系溶媒等）中、化合物126および化合物127を順次付加反応させることにより得ることができる。
化合物125に、溶媒（例えば、クロロホルム等の非プロトン性溶媒等）中、酸化剤（例えば、デス-マーチン(Dess-Martin)試薬等の有機系酸化剤またはクロロクロム酸ピリジニウム等の無機系酸化剤）を作用させることにより化合物128を得ることができる。
化合物118、化合物119、化合物120、化合物122、化合物123、化合物124、化合物126および化合物127等の反応に使用する化合物は、市販品として、または実施例に記載の方法もしくはそれに準じた方法で、もしくは文献により既知の方法(「第4版実験化学講座22 有機化合物の合成IV」、第4版、p.1、丸善(1992年)、「第4版実験化学講座20 有機化合物の合成II」、第4版、p.1、丸善(1992年)、および「第4版実験化学講座25 有機化合物の合成VII」、第4版、p.59、丸善(1991年)等)もしくはそれに準じた方法で入手することができる。
化合物(IVa)は、化合物128から、合成経路23に従い得ることができる。
Figure 0006910947
 （式中、各基はそれぞれ前記と同義である）
化合物128と化合物129とを、溶媒（例えば、1,2-ジククロエタン等のハロゲン系溶媒等）中、還元剤（例えば、水素化ホウ素ナトリウム、トリアセトキシボロヒドリド等のヒドリド化合物等）と、場合によっては添加剤（例えば、酢酸等の酸）の存在下で反応させることにより、化合物130を得ることができる。
化合物130と化合物131とを、塩基（例えば、水酸化ナトリウム等の無機塩基等）の存在下、高温（例えば、100℃以上）で反応させることにより化合物132が得られる。溶媒は特に必要無いが、場合により例えば、エチレングリコール等の溶媒を用いることもできる。
化合物132と化合物133とを、溶媒（例えば、クロロホルム等のハロゲン系溶媒等）の存在下または非存在下、室温または高温（例えば、100℃以上）で反応させることにより化合物(IVa)が得られる。なお、例えば、適切な陰イオン交換樹脂で(IVa)を処理することにより、化合物(IVa)の陰イオンA4を別の陰イオンに変換することもできる。
化合物129、化合物131および化合物133等の反応に使用する化合物は、市販品として、または実施例に記載の方法もしくはそれに準じた方法で、もしくは文献により既知の方法(例えば、国際公開第2010/042877号、国際公開第2010/054401号、「第5版実験化学講座13 有機化合物の合成I」、第5版、p.374、丸善(2005年)等に記載の方法)もしくはそれに準じた方法で入手することができる。
化合物(IVb)は、合成経路24に従い得ることができる。
Figure 0006910947
 （式中、M32は存在しないか、または-Z27-(CY92Y93)p42-であり、Nsはo-ニトロベンゼンスルホニル基を表し、その他の各基はそれぞれ前記と同義である）
化合物134、化合物135、トリフェニルホスフィン、およびアゾジカルボン酸ジエチルを反応させたのち、得られた縮合物にチオール（例えば、ドデカン-1-チオールやチオフェノール等）を作用させて脱Ns化することで化合物136が得られる。
化合物136と137をアミド化すると化合物138が得られる。
化合物(IVb)は、化合物138に139を作用させると得られる。なお、例えば、適切な陰イオン交換樹脂で化合物(IVb)を処理することにより、化合物(IVb)の陰イオンA4を別の陰イオンに変換することもできる。
化合物134はR11-L14-NH2に塩化o-ニトロベンゼンスルホニルを作用させることにより得られる。R11-L14-NH2は、市販品として、または実施例に記載の方法もしくはそれに準じた方法で、もしくは文献により既知の方法（例えば、「第4版実験化学講座20 有機化合物の合成II」、第4版、p.279、丸善(1992年)等に記載の方法）もしくはそれに準じた方法で入手することができる。
化合物135、137および139等の反応に使用する化合物は、前述のいずれかの方法により得られる。
化合物(V’a)は、合成経路25に従い得ることができる
Figure 0006910947
 （式中、DMTrは2’,2’’-ジメトキシトリチル基をあらわし、M33は、-(CY122R123)p54-、-(CY124Y125)p55-Z35-(CY126R127)p56-または-(CY128R129)p57-Z36-(CY130Y131)p58-Z37-(CY132Y133)p59-をあわらし、M34、M35、およびM36はそれぞれ独立に-O-または-CO-O-であり、その他の各基はそれぞれ前記と同様である）
化合物141は、化合物140に塩化2’,2’’-ジメトキシトリチルを作用させることにより得られる。
化合物142は、化合物141に３段階のエーテル化、またはエステル化を行うことにより得られる。
化合物143は、化合物142を酸で処理することにより得られる。
化合物144は、化合物143をハロゲン化試薬で活性化したのちに、対応するアミン化合物で処理することにより得られる。
化合物(V’a)は、化合物144に化合物145を作用させることにより得られる。なお、例えば、適切な陰イオン交換樹脂で(V’a)を処理することにより、化合物(V’a)の陰イオンA5を別の陰イオンに変換することもできる。
化合物140は、市販品として、天然物として、または実施例に記載の方法もしくはそれに準じた方法で、もしくは文献により既知の方法（例えば、「（ジ・オーガニック・ケミストリー・オブ・シュガー（The Organic Chemistry of Sugars）、ダニエル・Ｅ・レビー（Daniel E. Levy）他編、タイラー＆フランシス（Taylor & Francis）社、2005年等に記載の方法）もしくはそれに準じた方法で入手することができる。
化合物(V’’a)は、化合物146を原料として、合成経路25と同様の方法により得ることができる
Figure 0006910947
 （式中、各基はそれぞれ前記と同義である）
化合物146は、市販品として、天然物として、または実施例に記載の方法もしくはそれに準じた方法で、もしくは文献により既知の方法（例えば、「（ジ・オーガニック・ケミストリー・オブ・シュガー（The Organic Chemistry of Sugars）、ダニエル・Ｅ・レビー（Daniel E. Levy）他編、タイラー＆フランシス（Taylor & Francis）社、2005年等に記載の方法）もしくはそれに準じた方法で入手することができる。
以上の合成経路1〜26のいずれかの方法、あるいはこれらの方法に準じた方法等を適宜組み合わせることにより、化合物(I)〜(V’’)を得ることができる。
化合物(CL-I)は国際公開第2013/089151号に記載の方法、またはそれに準じた方法で得ることができる。
化合物(CL-II)は国際公開第2011/136368号に記載の方法、またはそれに準じた方法で得ることができる。
化合物(CL-III)、化合物(CL-IV)および化合物(CL-V)は国際公開第2014/007398号に記載の方法、またはそれに準じた方法で得ることができる。
化合物(CL-VI)は国際公開第2010/042877号に記載の方法、またはそれに準じた方法で得ることができる。
化合物(CL-VII)は国際公開第2010/054401号に記載の方法、またはそれに準じた方法で得ることができる。
本発明における脂質Aの具体例を表29〜表44に示すが、脂質Aはこれらに限定されるものではない。
Figure 0006910947
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本発明で用いられる核酸としては、例えば、ヌクレオチドおよび／またはヌクレオチドと同等の機能を有する分子が重合した分子であれば、いかなる分子であってもよく、例えば、リボヌクレオチドの重合体であるリボ核酸(RNA)、デオキシリボヌクレオチドの重合体であるデオキシリボ核酸(DNA)、RNAとDNAとからなるキメラ核酸、およびこれらの核酸の少なくとも一つのヌクレオチドが該ヌクレオチドと同等の機能を有する分子で置換されたヌクレオチド重合体等が挙げられる。また、ヌクレオチドおよび／またはヌクレオチドと同等の機能を有する分子が重合した分子の構造を少なくとも一部に含む誘導体も、本発明の核酸に含まれる。なお、本発明において、ウラシルUと、チミンTとは、それぞれ読み替えることができる。
ヌクレオチドと同等の機能を有する分子としては、例えば、ヌクレオチド誘導体等が挙げられる。
ヌクレオチド誘導体としては、例えば、ヌクレオチドに修飾を施した分子であればいかなる分子であってもよいが、例えば、RNAまたはDNAと比較して、ヌクレアーゼ耐性を向上させるかもしくはその他の分解因子から安定化させるため、相補鎖核酸とのアフィニティーをあげるため、細胞透過性をあげるため、または可視化させるために、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドに修飾を施した分子等が好適に用いられる。
ヌクレオチド誘導体としては、例えば、糖部修飾ヌクレオチド、リン酸ジエステル結合修飾ヌクレオチド、塩基修飾ヌクレオチド等が挙げられる。
糖部修飾ヌクレオチドとしては、例えば、ヌクレオチドの糖の化学構造の一部あるいは全てに対し、任意の置換基で修飾もしくは置換したもの、または任意の原子で置換したものであればいかなるものでもよいが、2’-修飾ヌクレオチドが好ましく用いられる。
糖部修飾ヌクレオチドにおける修飾基としては、例えば、2’-シアノ、2’-アルキル、2’-置換アルキル、2’-アルケニル、2’-置換アルケニル、2’-ハロゲン、2’-O-シアノ、2’-O-アルキル、2’-O-置換アルキル、2’-O-アルケニル、2’-O-置換アルケニル、2’-S-アルキル、2’-S-置換アルキル、2’-S-アルケニル、2’-S-置換アルケニル、2’-アミノ、2’-NH-アルキル、2’-NH-置換アルキル、2’-NH-アルケニル、2’-NH-置換アルケニル、2’-SO-アルキル、2’-SO-置換アルキル、2’-カルボキシ、2’-CO-アルキル、2’-CO-置換アルキル、2’-Se-アルキル、2’-Se-置換アルキル、2’-SiH2-アルキル、2’-SiH2-置換アルキル、2’-ONO2、2’-NO2、2’-N3、2’-アミノ酸残基(アミノ酸のカルボン酸からヒドロキシが除去されたもの)、2’-O-アミノ酸残基(前記アミノ酸残基と同義)等が挙げられる。
糖部修飾ヌクレオチドとして、例えば、2’位の修飾基が4’位の炭素原子に架橋した構造を有する架橋構造型人工核酸(Bridged Nucleic Acid)(BNA)、より具体的には、2’位の酸素原子と4’位の炭素原子がメチレンを介して架橋したロックト人工核酸(Locked Nucleic Acid)(LNA)、およびエチレン架橋構造型人工核酸(Ethylene bridged nucleic acid)(ENA)[Nucleic Acid Research, 32, e175(2004)]等も挙げられ、これらは2’-修飾ヌクレオチドに含まれる。
糖部修飾ヌクレオチドとして、ペプチド核酸(PNA)[Acc. Chem. Res., 32, 624(1999)]、オキシペプチド核酸(OPNA)[J. Am. Chem. Soc., 123, 4653(2001)]、ペプチドリボ核酸(PRNA)[J. Am. Chem. Soc., 122, 6900(2000)]等も挙げられる。
糖部修飾ヌクレオチドにおける修飾基として、2’-シアノ、2’-ハロゲン、2’-O-シアノ、2’-アルキル、2’-置換アルキル、2’-O-アルキル、2’-O-置換アルキル、2’-O-アルケニル、2’-O-置換アルケニル、2’-Se-アルキルまたは2’-Se-置換アルキル等が好ましく、2’-シアノ、2’-フルオロ、2’-クロロ、2’-ブロモ、2’-トリフルオロメチル、2’-O-メチル、2’-O-エチル、2’-O-イソプロピル、2’-O-トリフルオロメチル、2'-O-[2-(メトキシ)エチル]、2'-O-(3-アミノプロピル)、2'-O-[2-(N,N-ジメチルアミノオキシ)エチル]、2'-O-[3-(N,N-ジメチルアミノ)プロピル]、2'-O-{2-[2-(N,N-ジメチルアミノ)エトキシ]エチル}、2'-O-[2-(メチルアミノ)-2-オキソエチル]または2’-Se-メチル等がより好ましく、2’-O-メチル、2’-O-エチル、2’-フルオロ等がさらに好ましく、2’-O-メチルまたは2’-O-エチルが最も好ましい。
糖部修飾ヌクレオチドにおける修飾基は、その大きさから好ましい範囲を定義することもでき、フルオロの大きさから-O-ブチルの大きさに相当するものが好ましく、-O-メチルの大きさから-O-エチルの大きさに相当するものがより好ましい。
糖部修飾ヌクレオチドにおける修飾基におけるアルキルとしては、例えば、C1-C6アルキルが挙げられ、より具体的にはメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、sec-ブチル、tert-ブチル、ペンチル、イソペンチル、ネオペンチルまたはヘキシル等のC1-C6アルキルが挙げられる。
糖部修飾ヌクレオチドにおける修飾基におけるアルケニルとしては、例えば、C3-C6アルケニルが挙げられ、より具体的にはアリル、1-プロペニル、ブテニル、ペンテニルまたはヘキセニル等のC3-C6アルケニルが挙げられる。
糖部修飾ヌクレオチドにおける修飾基におけるハロゲンとしては、例えば、フッ素原子、塩素原子、臭素原子またはヨウ素原子等が挙げられる。
アミノ酸残基におけるアミノ酸としては、例えば、脂肪族アミノ酸(具体的には、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン等)、ヒドロキシアミノ酸(具体的には、セリン、トレオニン等)、酸性アミノ酸(具体的には、アスパラギン酸、グルタミン酸等)、酸性アミノ酸アミド(具体的には、アスパラギン、グルタミン等)、塩基性アミノ酸(具体的には、リジン、ヒドロキシリジン、アルギニン、オルニチン等)、含硫アミノ酸(具体的には、システイン、シスチン、メチオニン等)またはイミノ酸(具体的には、プロリン、4-ヒドロキシプロリン等)等が挙げられる。
糖部修飾ヌクレオチドにおける修飾基における置換アルキルおよび置換アルケニルにおける置換基としては、例えば、ハロゲン(前記と同義)、ヒドロキシ、スルファニル、アミノ、オキソ、-O-アルキル(該-O-アルキルのアルキル部分は前記修飾基におけるC1-C6アルキルと同義)、-S-アルキル(該-S-アルキルのアルキル部分は前記修飾基におけるC1-C6アルキルと同義)、-NH-アルキル(該-NH-アルキルのアルキル部分は前記修飾基におけるC1-C6アルキルと同義)、ジアルキルアミノオキシ(該ジアルキルアミノオキシの2つのアルキル部分は同一または異なって前記修飾基におけるC1-C6アルキルと同義)、ジアルキルアミノ(該ジアルキルアミノの2つのアルキル部分は同一または異なって前記修飾基におけるC1-C6アルキルと同義)またはジアルキルアミノアルキルオキシ(該ジアルキルアミノアルキルオキシの2つのアルキル部分は同一または異なって前記修飾基におけるC1-C6アルキルと同義であり、アルキレン部分は前記修飾基におけるC1-C6アルキルから水素原子が1つ除かれたものを意味する)等が挙げられ、置換数は好ましくは1〜3である。
リン酸ジエステル結合修飾ヌクレオチドとしては、ヌクレオチドのリン酸ジエステル結合の化学構造の一部あるいは全てに対し、任意の置換基で修飾もしくは置換したもの、または任意の原子で置換したものであればいかなるものでもよく、例えば、リン酸ジエステル結合がホスホロチオエート結合に置換されたヌクレオチド、リン酸ジエステル結合がホスホロジチオエート結合に置換されたヌクレオチド、リン酸ジエステル結合がアルキルホスホネート結合に置換されたヌクレオチドまたはリン酸ジエステル結合がホスホロアミデート結合に置換されたヌクレオチド等が挙げられる。
塩基修飾ヌクレオチドとしては、ヌクレオチドの塩基の化学構造の一部あるいは全てに対し、任意の置換基で修飾もしくは置換したもの、または任意の原子で置換したものであればいかなるものでもよく、例えば、塩基内の酸素原子が硫黄原子で置換されたもの、水素原子がC1-C6アルキル基で置換されたもの、メチル基が水素原子もしくはC2-C6アルキル基で置換されたもの、アミノ基がC1-C6アルキル基、C1-C6アルカノイル基等の保護基で保護されたもの等が挙げられる。
さらに、ヌクレオチド誘導体として、ヌクレオチドまたは糖部、リン酸ジエステル結合もしくは塩基の少なくとも一つが修飾されたヌクレオチド誘導体に脂質、リン脂質、フェナジン、フォレート、フェナントリジン、アントラキノン、アクリジン、フルオレセイン、ローダミン、クマリンおよび色素等、別の化学物質を付加したものも挙げられ、具体的には、5’-ポリアミン付加ヌクレオチド誘導体、コレステロール付加ヌクレオチド誘導体、ステロイド付加ヌクレオチド誘導体、胆汁酸付加ヌクレオチド誘導体、ビタミン付加ヌクレオチド誘導体、緑色蛍光色素(Cy3)付加ヌクレオチド誘導体、赤色蛍光色素(Cy5)付加ヌクレオチド誘導体、フルオロセイン(6-FAM)付加ヌクレオチド誘導体、およびビオチン付加ヌクレオチド誘導体等が挙げられる。
本発明で用いられる核酸においては、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体が、該核酸内の他のヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体とアルキレン構造、ペプチド構造、ヌクレオチド構造、エーテル構造、エステル構造およびこれらの少なくとも一つを組み合わせた構造等の架橋構造を形成してもよい。
本発明で用いられる核酸としては、分子量が1,000 kDa以下のものが好ましく、100 kDa以下のものがより好ましく、30 kDa以下のものがさらに好ましい。また、本発明で用いられる核酸としては、好ましくは標的遺伝子の発現を抑制する核酸が挙げられ、より好ましくはRNA干渉(RNAi)を利用した標的遺伝子の発現抑制作用を有する核酸が挙げられる。
本発明における標的遺伝子としては、mRNAを産生して発現する遺伝子であれば特に限定されないが、例えば、腫瘍または炎症に関連する遺伝子が好ましく、例えば、血管内皮増殖因子(vascular endothelial growth factor、以下VEGFと略す)、血管内皮増殖因子受容体(vascular endothelial growth factor receptor、以下VEGFRと略す)、線維芽細胞増殖因子、線維芽細胞増殖因子受容体、血小板由来増殖因子、血小板由来増殖因子受容体、肝細胞増殖因子、肝細胞増殖因子受容体、クルッペル様因子(Kruppel-like factor、以下KLFと略す)、エクスプレスドシーケンスタグ(Ets)転写因子、核因子、低酸素誘導因子、細胞周期関連因子、染色体複製関連因子、染色体修復関連因子、微小管関連因子、増殖シグナル経路関連因子、増殖関連転写因子またはアポトーシス関連因子等のタンパク質をコードする遺伝子等が挙げられ、具体的にはVEGF遺伝子、VEGFR遺伝子、線維芽細胞増殖因子遺伝子、線維芽細胞増殖因子受容体遺伝子、血小板由来増殖因子遺伝子、血小板由来増殖因子受容体遺伝子、肝細胞増殖因子遺伝子、肝細胞増殖因子受容体遺伝子、KLF遺伝子、Ets転写因子遺伝子、核因子遺伝子、低酸素誘導因子遺伝子、細胞周期関連因子遺伝子、染色体複製関連因子遺伝子、染色体修復関連因子遺伝子、微小管関連因子遺伝子(例えば、CKAP5遺伝子等)、増殖シグナル経路関連因子遺伝子(例えば、KRAS遺伝子等)、増殖関連転写因子遺伝子またはアポトーシス関連因子(例えば、BCL-2遺伝子等)等が挙げられる。
本発明における標的遺伝子としては、例えば、肝臓、肺、腎臓または脾臓において発現する遺伝子が好ましく、肝臓において発現する遺伝子がより好ましく、例えば、前記の腫瘍または炎症に関連する遺伝子、B型肝炎ウイルスゲノム、C型肝炎ウイルスゲノム、アポリポタンパク質(APO)、ヒドロキシメチルグルタリル(HMG)CoA還元酵素、ケキシン 9 型セリンプロテアーゼ(PCSK9)、第12因子、グルカゴン受容体、グルココルチコイド受容体、ロイコトリエン受容体、トロンボキサンA2受容体、ヒスタミンH1受容体、炭酸脱水酵素、アンギオテンシン変換酵素、レニン、p53、チロシンホスファターゼ(PTP)、ナトリウム依存性グルコース輸送担体、腫瘍壊死因子、インターロイキン、ヘプシジン、トランスサイレン、アンチトロンビン、プロテインCまたはマトリプターゼ酵素(例えば、TMPRSS6遺伝子等)等のタンパク質をコードする遺伝子等が挙げられる。
標的遺伝子の発現を抑制する核酸としては、例えば、蛋白質等をコードする遺伝子(標的遺伝子)のmRNAの一部の塩基配列に対して相補的な塩基配列を含み、かつ標的遺伝子の発現を抑制する核酸であれば、例えば、siRNA(short interference RNA)、miRNA(micro RNA)等の二本鎖核酸、shRNA(short hairpin RNA)、アンチセンス核酸、リボザイム等の一本鎖核酸等、いずれの核酸を用いてもよいが、二本鎖核酸が好ましい。
標的遺伝子のmRNAの一部の塩基配列に対して相補的な塩基配列を含む核酸をアンチセンス鎖核酸といい、アンチセンス鎖核酸の塩基配列に対して相補的な塩基配列を含む核酸をセンス鎖核酸ともいう。センス鎖核酸は、標的遺伝子の一部の塩基配列からなる核酸そのもの等、アンチセンス鎖核酸と対合して二重鎖形成部ができる核酸をいう。
二本鎖核酸とは、二本の鎖が対合し二重鎖形成部を有する核酸をいう。二重鎖形成部とは、二本鎖核酸を構成するヌクレオチドまたはその誘導体が塩基対を構成して二重鎖を形成している部分をいう。二重鎖形成部を構成する塩基対は、通常15〜27塩基対であり、15〜25塩基対が好ましく、15〜23塩基対がより好ましく、15〜21塩基対がさらに好ましく、15〜19塩基対が特に好ましい。
二重鎖形成部のアンチセンス鎖核酸としては、例えば、標的遺伝子のmRNAの一部配列からなる核酸、または該核酸において1〜3塩基、好ましくは1〜2塩基、より好ましくは1塩基が置換、欠失もしくは付加され、かつ標的蛋白質の発現抑制活性を有する核酸が好適に用いられる。二本鎖核酸を構成する一本鎖の核酸は、通常15〜30塩基(ヌクレオシド)の連なりからなるが、15〜29塩基が好ましく、15〜27塩基がより好ましく、15〜25塩基がさらに好ましく、17〜23塩基が特に好ましく、19〜21塩基が最も好ましい。
二本鎖核酸を構成するアンチセンス鎖、センス鎖のいずれか一方、または両方の核酸は、二重鎖形成部に続く3’側または5’側に二重鎖を形成しない追加の核酸を有してもよい。この二重鎖を形成しない部分を突出部(オーバーハング)ともいう。
突出部を有する二本鎖核酸としては、例えば、少なくとも一方の鎖の3’末端または5’末端に1〜4塩基、通常は1〜3塩基からなる突出部を有するものが用いられるが、2塩基からなる突出部を有するものが好ましく用いられ、dTdTまたはUUからなる突出部を有するものがより好ましく用いられる。突出部は、アンチセンス鎖のみ、センス鎖のみ、およびアンチセンス鎖とセンス鎖の両方に有することができるが、アンチセンス鎖とセンス鎖の両方に突出部を有する二本鎖核酸が好ましく用いられる。
二重鎖形成部に続いて標的遺伝子のmRNAの塩基配列と一部または全てが一致する配列、または、二重鎖形成部に続いて標的遺伝子のmRNAの相補鎖の塩基配列と一部または全てが一致する配列を用いてもよい。さらに、標的遺伝子の発現を抑制する核酸としては、例えば、Dicer等のリボヌクレアーゼの作用により前記の二本鎖核酸を生成する核酸分子(国際公開第2005/089287号)や、3’末端や5’末端の突出部を有していない二本鎖核酸等を用いることもできる。
前記の二本鎖核酸がsiRNAである場合、好ましくはアンチセンス鎖は、5’末端側から3’末端側に向って少なくとも1〜17番目の塩基(ヌクレオシド)の配列が、標的遺伝子のmRNAの連続する17塩基の配列と相補的な塩基の配列であり、より好ましくは、該アンチセンス鎖は、5’末端側から3’末端側に向って1〜19番目の塩基の配列が、標的遺伝子のmRNAの連続する19塩基の配列と相補的な塩基の配列であるか、1〜21番目の塩基の配列が、標的遺伝子のmRNAの連続する21塩基の配列と相補的な塩基の配列であるか、1〜25番目の塩基の配列が、標的遺伝子のmRNAの連続する25塩基の配列と相補的な塩基の配列である。
さらに、本発明で用いられる核酸がsiRNAである場合、好ましくは該核酸中の糖の10〜70%、より好ましくは15〜60%、さらに好ましくは20〜50%が、2’位において修飾基で置換されたリボースである。本発明における2’位において修飾基で置換されたリボースとは、リボースの2’位のヒドロキシが修飾基に置換されているものを意味し、リボースの2’位のヒドロキシと立体配置が同じであっても異なっていてもよいが、好ましくはリボースの2’位のヒドロキシと立体配置が同じである。2’位において修飾基で置換されたリボースにおける修飾基としては、糖部修飾ヌクレオチドにおける2’-修飾ヌクレオチドにおける修飾基の定義で例示したものおよび水素原子が挙げられ、2’-シアノ、2’-ハロゲン、2’-O-シアノ、2’-アルキル、2’-置換アルキル、2’-O-アルキル、2’-O-置換アルキル、2’-O-アルケニル、2’-O-置換アルケニル、2’-Se-アルキル、2’-Se-置換アルキル等が好ましく、2’-シアノ、2’-フルオロ、2’-クロロ、2’-ブロモ、2’-トリフルオロメチル、2’-O-メチル、2’-O-エチル、2’-O-イソプロピル、2’-O-トリフルオロメチル、2'-O-[2-(メトキシ)エチル]、2'-O-(3-アミノプロピル)、2'-O-[2-(N,N-ジメチル)アミノオキシ]エチル、2'-O-[3-(N,N-ジメチルアミノ)プロピル]、2'-O-{2-[2-(N,N-ジメチルアミノ)エトキシ]エチル}、2'-O-[2-(メチルアミノ)-2-オキソエチル]、2’-Se-メチル、水素原子等がより好ましく、2’-O-メチル、2’-O-エチル、2’-フルオロ、水素原子等がさらに好ましく、2’-O-メチル、2’-O-フルオロが最も好ましい。
本発明で用いられる核酸は、核酸の構造中のリン酸部、エステル部等に含まれる酸素原子等が、例えば、硫黄原子等の他の原子に置換された誘導体を包含する。
アンチセンス鎖およびセンス鎖の5’末端の塩基に結合する糖は、それぞれ5’位のヒドロキシが、リン酸基もしくは前記の修飾基、または生体内の核酸分解酵素等でリン酸基もしくは前記の修飾基に変換される基によって修飾されていてもよい。
アンチセンス鎖およびセンス鎖の3’末端の塩基に結合する糖は、それぞれ3’位のヒドロキシが、リン酸基
もしくは前記の修飾基、または生体内の核酸分解酵素等でリン酸基もしくは前記の修飾基に変換される基によって修飾されていてもよい。
一本鎖の核酸としては、例えば、標的遺伝子の連続する15〜27塩基(ヌクレオシド)、好ましくは15〜25塩基、より好ましくは15〜23塩基、さらに好ましくは15〜21塩基、特に好ましくは15〜19塩基からなる配列の相補配列からなる核酸、または該核酸において1〜3塩基、好ましくは1〜2塩基、より好ましくは1塩基が置換、欠失もしくは付加され、かつ標的蛋白質の発現抑制活性を有する核酸であればいずれでもよい。該一本鎖の核酸は、10〜30塩基(ヌクレオシド)の連なりからなることが好ましく、より好ましくは10〜27塩基、さらに好ましくは10〜25塩基、特に好ましくは10〜23塩基の一本鎖核酸が好適に用いられる。
一本鎖核酸として、上記の二本鎖核酸を構成するアンチセンス鎖およびセンス鎖を、スペーサー配列(スペーサーオリゴヌクレオチド)を介して連結したものを用いてもよい。スペーサーオリゴヌクレオチドとしては6〜12塩基の一本鎖核酸分子が好ましく、その5’末端側の配列は2個のUであるのが好ましい。スペーサーオリゴヌクレオチドの例として、UUCAAGAGAの配列からなる核酸が挙げられる。スペーサーオリゴヌクレオチドによってつながれるアンチセンス鎖およびセンス鎖の順番はどちらが5’側になってもよい。該一本鎖核酸としては、例えば、ステムループ構造によって二重鎖形成部を有するshRNA等の一本鎖核酸であることが好ましい。shRNA等の一本鎖核酸は、通常50〜70塩基長である。
リボヌクレアーゼ等の作用により、上記の一本鎖核酸または二本鎖核酸を生成するように設計した、70塩基長以下、好ましくは50塩基長以下、さらに好ましくは30塩基長以下の核酸を用いてもよい。
なお、本発明で用いられる核酸は、既知のRNAまたはDNA合成法、およびRNAまたはDNA修飾法を用いて得ることができる。
本発明の核酸含有脂質ナノ粒子は、脂質Aと核酸との複合体であるが、脂質Aは1種または2種以上を含有していてもよい。
本発明の核酸含有脂質ナノ粒子は、脂質Aと核酸に加えて、脂質A以外の1種または2種以上の脂質B、中性脂質および／または水溶性高分子の脂質誘導体もしくは脂肪酸誘導体を含有していてもよい。
本発明の核酸含有脂質ナノ粒子は、脂質Aとともに、脂質Bを1種または2種以上含有していてもよい。
なお、本発明の核酸含有脂質ナノ粒子は、核酸だけでなく、核酸と化学的に近似した化合物（アニオン性ペプチド等のアニオン性高分子等）も含有することもできる。
本発明において、核酸は、脂質Aと、必要に応じてその他の脂質(水溶性高分子の脂質誘導体もしくは脂肪酸誘導体、中性脂質、および／または置換基を有していても良い1つのアミノ基を有する親水部および置換基を有していても良い独立した2つの炭化水素基を有する疎水部を有する脂質(脂質B))とともに、水に混和可能な有機溶媒に溶解される（第1の脂質溶液）。第1の脂質溶液の調製においては、核酸を水または緩衝剤水溶液に溶解し、脂質の有機溶媒溶液に加えても良く、また、核酸の水または緩衝剤水溶液に脂質の有機溶媒溶液を加えてもよい。さらに、凍結乾燥された核酸に、脂質の有機溶媒溶液を加えてもよい。
核酸と、脂質Aと、必要に応じてその他の脂質(水溶性高分子の脂質誘導体もしくは脂肪酸誘導体、中性脂質、および／または置換基を有していても良い1つのアミノ基を有する親水部および置換基を有していても良い独立した2つの炭化水素基を有する疎水部を有する脂質(脂質B))とで一度有機溶媒溶液（第1の脂質溶液）を作成した後に、水溶性高分子の脂質誘導体または脂肪酸誘導体を含む有機溶媒溶液（第2の脂質溶液）を加えて第3の脂質溶液を調製してもよい。
本発明において、第1または第3の脂質溶液は、水または緩衝剤水溶液と混合される。この際、有機溶媒濃度を速やかに低下させることで、凝集することなく、サイズの小さい脂質ナノ粒子が得られる。
第1または第3の脂質溶液と水または緩衝剤水溶液の混合においては、前者を後者に加えても良く、後者を前者に加えてもよい。また、撹拌しながら容器に同時に前者と後者を加えてもよい。さらに、インラインにおいて前者と後者を混合することもできる。この場合、インライン混合デバイスとしては、例えば、T-コネクタ等を用いることができる。
本発明の核酸含有脂質ナノ粒子の平均粒子径は、用いる核酸、ならびに1つの4級アンモニウム基を有する親水部および置換基を有していても良い独立した3つの炭化水素基を有する脂質(脂質A)およびその他の脂質によっても影響されるが、製造プロセスにおける各種のパラメーターにより自由に制御可能である。当業者であれば、本発明の核酸含有脂質ナノ粒子の平均粒子径を制御するのに必要な製造プロセスにおける各種のパラメーターを適宜変更して粒子サンプルを調製し、得られたサンプルの平均粒子径を測定することで決定することができる。平均粒子径の制御に必要なパラメーターとして、有機溶媒溶液における核酸濃度、各脂質の濃度、温度、有機溶媒の組成等が挙げられる。また、平均粒子径の制御に必要なパラメーターとして、核酸および脂質有機溶媒溶液の水または緩衝剤水溶液による希釈操作時における、温度、水または緩衝剤水溶液の量、各液の添加速度等も挙げられる。
ホスファチジルコリン(PC)およびコレステロール(Chol)を含有しない場合における水または緩衝剤水溶液と混合される前の有機溶媒溶液中の親水部として1つの4級アンモニウム基を有し、かつ置換基を有していても良い独立した3つの炭化水素基を有する脂質(脂質A)の濃度は特に限定されないが、1〜2000 μMが好ましく、5〜400 μMがより好ましく、10〜200 μMがさらに好ましく、20〜100 μMが最も好ましい。
PCおよびCholを含有しない場合における水または緩衝剤水溶液と混合される前の有機溶媒溶液中の核酸の濃度は特に限定されないが、0.03〜15μMが好ましく、0.15〜3.0μMがより好ましく、0.3〜1.5μMがさらに好ましい。
PCおよびCholを含有しない場合における水または緩衝剤水溶液と混合される前の有機溶媒溶液中の水溶性高分子の脂質誘導体または脂肪酸誘導体の濃度は特に限定されないが、0.5〜200 μMが好ましく、2.5〜40 μMがより好ましく、5〜20 μMがさらに好ましい。
PCおよびCholを含有しない場合における水または緩衝剤水溶液と混合される前の有機溶媒溶液中のカチオン性脂質の濃度は特に限定されないが1〜2000 μMが好ましく、5〜400 μMがより好ましく、10〜200 μMがさらに好ましく、20〜100 μMが最も好ましい。
PCおよびCholを含有しない場合における水または緩衝剤水溶液と混合される前の有機溶媒溶液中のすべての脂質を合わせた濃度は特に限定されないが、5〜2000 μMが好ましく、25〜400 μMがより好ましく、50〜200 μMがさらに好ましい。
PCおよびCholを含有する場合における水または緩衝剤水溶液と混合される前の有機溶媒溶液中の親水部として1つの4級アンモニウム基を有し、かつ置換基を有していても良い独立した3つの炭化水素基を有する脂質(脂質A)の濃度は、0.2〜1800μMが好ましく、1〜360μMがより好ましく、2〜180μMがさらに好ましく、5〜100 μMが最も好ましい。
PCおよびCholを含有する場合における水または緩衝剤水溶液と混合される前の有機溶媒溶液中の核酸の濃度は、0.02〜45μMが好ましく、0.1〜10μMがより好ましく、0.2〜5μMがさらに好ましく、0.3〜3 μMが最も好ましい。
PCおよびCholを含有する場合における水または緩衝剤水溶液と混合される前の有機溶媒溶液中の水溶性高分子の脂質誘導体または脂肪酸誘導体の濃度は、0.3〜1000 μMが好ましく、1.5〜200 μMがより好ましく、3〜100 μMがさらに好ましく、5〜50 μMが最も好ましい。
PCおよびCholを含有する場合における水または緩衝剤水溶液と混合される前の有機溶媒溶液中のカチオン性脂質の濃度は、2.5〜4200 μMが好ましく、12.5〜840 μMがより好ましく、25〜420μMがさらに好ましく、50〜210 μMが最も好ましい。
PCおよびCholを含有する場合における水または緩衝剤水溶液と混合される前の有機溶媒溶液中の中性脂質の濃度は、2.5〜5000μMが好ましく、12.5〜1000μMがより好ましく、25〜500μMがさらに好ましく、50〜250 μMが最も好ましい。
PCおよびCholを含有する場合における水または緩衝剤水溶液と混合される前の有機溶媒溶液中のすべての脂質を合わせた濃度は、10〜8000μMが好ましく、50〜1600 μMがより好ましく、100〜800 μMがさらに好ましく、150〜400 μMが最も好ましい。
核酸および脂質を含有する有機溶媒溶液を調製する際の温度は核酸および脂質が溶解する限りにおいて特に限定されないが、10〜60℃が好ましく、20〜50℃がより好ましく、20〜30℃がさらに好ましい。なお、30℃以上に加温する場合は、核酸および脂質の溶解度が増し、より少ない溶媒量で脂質ナノ粒子の製造を行うことができる。
核酸および脂質を含有する有機溶媒溶液における有機溶媒としては特に限定されないが、0〜50%(v/v)の水を含むメタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール等のC1-C6アルコール類またはこれらの混合物が好ましく、0〜50%(v/v)の水を含むエタノールまたはプロパノールがより好ましく、0〜50%(v/v)の水を含むエタノールがさらに好ましい。ここで「% (v/v)」とは、溶液全体の体積に占める溶質の体積百分率を示し、以下同様である。
核酸および脂質を含有する有機溶媒溶液における溶媒に、塩酸、酢酸、リン酸等の無機酸、またはこれらの酸の塩等を加えることもできる。この場合の溶媒のpHは、1〜７とするのが好ましく、1〜5とするのがより好ましく、2〜4とするのがさらに好ましい。
核酸および脂質を含有する有機溶媒溶液に、水または緩衝剤水溶液を添加する操作において、用いる水または緩衝剤水溶液の容量は特に限定されないが、核酸および脂質の有機溶媒溶液の容量に対して、0.5〜100倍が好ましく、1.5〜20倍がより好ましく、2.0〜10倍がさらに好ましい。
この場合、水または緩衝剤水溶液を添加した後の有機溶媒濃度は特に限定されないが、得られた溶液に対して50% (v/v)以下が好ましく、40% (v/v)以下がより好ましく、30% (v/v)以下がさらに好ましく、20% (v/v)以下が最も好ましい。また、緩衝剤水溶液としては、緩衝作用を有するものであれば特に限定されるものではないが、例えば、リン酸緩衝水溶液、クエン酸緩衝水溶液、酢酸緩衝水溶液等が挙げられる。
上記添加操作を行う際の温度は特に限定されないが、10〜60℃が好ましく、20〜50℃がより好ましく、20〜30℃がさらに好ましい。
上記添加操作において、有機溶媒溶液を速やかに低下させることが重要である。具体的には、有機溶媒濃度を70% (v/v)以上から50% (v/v)以下まで、1分以内に変化させることが好ましく、0.5分以内に変化させることがより好ましく、0.1分以内に変化させることがさらに好ましく、0.05分以内に変化させるのが最も好ましい。
本発明の核酸含有脂質ナノ粒子において、脂質Aの分子の総数は特に限定されないが、脂質A中の4級アンモニウム基のモル数が、本発明の核酸含有脂質ナノ粒子を構成する核酸のリン原子数に対して0.01倍モル量以上であるのが好ましく、0.1〜10倍モル量であるのがより好ましく、0.1〜4倍モル量であるのがさらに好ましく、0.1〜2倍モル量であるのがさらにより好ましく、0.1〜1倍モル量であるのが最も好ましい。核酸含有脂質ナノ粒子が脂質Bを含む場合、脂質Bの分子の総数は特に限定されないが、脂質A中の4級アンモニウム基のモル数が、本発明の核酸含有脂質ナノ粒子を構成する核酸のリン酸原子のモル数に対して0.1〜10倍モル量であるのが好ましく、0.5〜9倍モル量であるのがより好ましく、1〜8倍モル量であるのがさらに好ましく、1.5〜6倍モル量であるのが最も好ましい。
本発明の核酸含有脂質ナノ粒子において脂質Bを含有する場合、脂質Aのモル数と脂質Bのモル数の比率（脂質Aのモル数／脂質Bのモル数）は、0.001以上であるのが好ましく、0.003〜10であるのがより好ましく、0.005〜5であるのがさらに好ましく、0.01〜3であるのがさらにより好ましく、0.01〜2であるのが最も好ましい。
本発明の核酸含有脂質ナノ粒子において、総脂質のモル数と核酸のモル数の比率 (総脂質のモル数／核酸のモル数）が50以上であるのが好ましく、100〜1000であるのがより好ましく、120〜800であるのがさらに好ましく、140〜600であるのがよりさらに好ましく、200〜500であるのが最も好ましい。
本発明の核酸含有脂質ナノ粒子が、脂質Bを含有する場合には、核酸含有脂質ナノ粒子における脂質Bの分子の総数は特に限定されないが、総脂質のモル数に対して0.1倍モル量以上であるのが好ましく、0.15倍モル量以上であるのがより好ましく、0.2倍モル量以上であるのがさらに好ましく、0.25倍モル量以上であるのがさらにより好ましい。また、核酸含有脂質ナノ粒子における脂質Bの分子の総数は特に限定されないが、総脂質のモル数に対して0.7倍モル量以下であるのが好ましく、0.65倍モル量以下であるのがより好ましく、0.6倍モル量以下であるのがさらに好ましい。
核酸含有脂質ナノ粒子における脂質Bの分子の総数は、上記の上限下限の好ましい範囲の組合せの中で、総脂質のモル数に対して0.10〜0.70倍モル量であるのがより好ましく、0.15〜0.65倍モル量であるのがさらに好ましく、0.20〜0.65倍モル量であるのがさらにより好ましく、0.25〜0.60倍モル量であるのが最も好ましい。
中性脂質としては、単純脂質、複合脂質または誘導脂質のいかなるものであってもよく、例えば、リン脂質、グリセロ糖脂質、スフィンゴ糖脂質、スフィンゴイドまたはステロール等が挙げられるがこれらに限定されない。また、中性脂質は1種また2種以上を組み合わせて使用してもよい。
本発明の核酸含有脂質ナノ粒子において中性脂質を含有する場合には、中性脂質の分子の総数は特に限定されないが、総脂質のモル数に対して0.10〜0.75倍モル量であるのが好ましく、0.20〜0.70倍モル量であるのがより好ましく、0.20〜0.65倍モル量であるのがさらに好ましく、0.30〜0.60倍モル量であるのが最も好ましい。
中性脂質におけるリン脂質としては、例えば、ホスファチジルコリン(PC)(具体的には大豆ホスファチジルコリン、卵黄ホスファチジルコリン(EPC)、ジステアロイルホスファチジルコリン、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DSPC)、ジパルミトイルホスファチジルコリン、1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DPPC)、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン(POPC)、ジミリストイルホスファチジルコリン(DMPC)、ジオレオイルホスファチジルコリン(DOPC)等)、ホスファチジルエタノールアミン(具体的にはジステアロイルホスファチジルエタノールアミン(DSPE)、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン(DPPE)、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン(DOPE)、ジミリストイルホスホエタノールアミン(DMPE)、16-0-モノメチルPE、16-0-ジメチルPE、18-1-トランスPE、パルミトイルオレオイル-ホスファチジルエタノールアミン(POPE)、1 -ステアロイル-2-オレオイル-ホスファチジルエタノールアミン(SOPE)等)、グリセロリン脂質(具体的にはホスファチジルセリン、ホスファチジン酸、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、パルミトイルオレオイルホスファチジルグリセロール(POPG)、リゾホスファチジルコリン等)、スフィンゴリン脂質(具体的にはスフィンゴミエリン、セラミドホスホエタノールアミン、セラミドホスホグリセロール、セラミドホスホグリセロリン酸等)、グリセロホスホノ脂質、スフィンゴホスホノ脂質、天然レシチン(具体的には卵黄レシチン、大豆レシチン等)または水素添加リン脂質(具体的には水素添加大豆ホスファチジルコリン等)等の天然または合成のリン脂質が挙げられるがこれらに限定されない。
中性脂質におけるグリセロ糖脂質としては、例えば、スルホキシリボシルグリセリド、ジグリコシルジグリセリド、ジガラクトシルジグリセリド、ガラクトシルジグリセリドまたはグリコシルジグリセリド等が挙げられるがこれらに限定されない。
中性脂質におけるスフィンゴ糖脂質としては、例えば、ガラクトシルセレブロシド、ラクトシルセレブロシドまたはガングリオシド等が挙げられるがこれらに限定されない。
中性脂質におけるスフィンゴイドとしては、例えば、スフィンガン、イコサスフィンガン、スフィンゴシンまたはそれらの誘導体等が挙げられるがこれらに限定されない。。誘導体としては、例えば、スフィンガン、イコサスフィンガンまたはスフィンゴシン等の-NH2を-NHCO(CH2)xCH3(式中、xは0〜18の整数であり、中でも6、12または18が好ましい)に変換したもの等が挙げられるがこれらに限定されない。
中性脂質におけるステロールとしては、例えば、コレステロール(Chol)、ジヒドロコレステロール、ラノステロール、β-シトステロール、カンペステロール、スチグマステロール、ブラシカステロール、エルゴカステロール、フコステロールまたは3β-[N-(N',N'-ジメチルアミノエチル)カルバモイル]コレステロール(DC-Chol)等が挙げられるがこれらに限定されない。
高分子としては、例えば、タンパク質、アルブミン、デキストラン、ポリフェクト(polyfect)、キトサン、デキストラン硫酸、例えば、ポリ-L-リジン、ポリエチレンイミン、ポリアスパラギン酸、スチレンマレイン酸共重合体、イソプロピルアクリルアミド-アクリルピロリドン共重合体、ポリエチレングリコール修飾デンドリマー、ポリ乳酸、ポリ乳酸ポリグリコール酸またはポリエチレングリコール化ポリ乳酸等の高分子またはそれらの塩の1以上からなるミセル等が挙げられるがこれらに限定されない。
ここで、高分子の塩は、例えば、金属塩、アンモニウム基塩、酸付加塩、有機アミン付加塩、アミノ酸付加塩等を包含する。金属塩としては、例えば、リチウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩、マグネシウム塩、カルシウム塩等のアルカリ土類金属塩、アルミニウム塩または亜鉛塩等が挙げられるがこれらに限定されない。。アンモニウム基塩としては、例えば、アンモニウム基またはテトラメチルアンモニウム基等の塩が挙げられるがこれらに限定されない。。酸付加塩としては、例えば、塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩またはリン酸塩等の無機酸塩、および酢酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩またはクエン酸塩等の有機酸塩が挙げられるがこれらに限定されない。。有機アミン付加塩としては、例えば、モルホリンまたはピペリジン等の付加塩が挙げられるがこれらに限定されない。。アミノ酸付加塩としては、例えば、グリシン、フェニルアラニン、アスパラギン酸、グルタミン酸またはリジン等の付加塩が挙げられるがこれらに限定されない。
本発明の核酸含有脂質ナノ粒子はいずれも、例えば、糖、ペプチド、核酸および水溶性高分子から選ばれる1以上の物質の脂質誘導体もしくは脂肪酸誘導体、または界面活性剤等を含有しても良い。
糖、ペプチド、核酸および水溶性高分子から選ばれる1以上の物質の脂質誘導体もしくは脂肪酸誘導体、または界面活性剤としては、好ましくは、糖脂質、または水溶性高分子の脂質誘導体もしくは脂肪酸誘導体が挙げられ、より好ましくは、水溶性高分子の脂質誘導体または脂肪酸誘導体が挙げられる。糖、ペプチド、核酸および水溶性高分子から選ばれる1以上の物質の脂質誘導体もしくは脂肪酸誘導体、または界面活性剤は、分子の一部が組成物の他の構成成分と例えば、疎水性親和力、静電的相互作用等で結合する性質をもち、他の部分が組成物の製造時の溶媒と例えば、親水性親和力、静電的相互作用等で結合する性質をもつ、2面性をもつ物質であるのが好ましい。
糖、ペプチドまたは核酸の脂質誘導体または脂肪酸誘導体としては、例えば、ショ糖、ソルビトール、乳糖等の糖、例えば、カゼイン由来ペプチド、卵白由来ペプチド、大豆由来ペプチド、グルタチオン等のペプチド、または例えば、DNA、RNA、プラスミド、siRNA、ODN等の核酸と、前記組成物の定義の中で挙げた中性脂質または例えば、ステアリン酸、パルミチン酸、ミリスチン酸、ラウリン酸等の脂肪酸とが結合してなるもの等が挙げられる。
糖の脂質誘導体または脂肪酸誘導体としては、例えば、前記組成物の定義の中で挙げたグリセロ糖脂質またはスフィンゴ糖脂質等も含まれる。
水溶性高分子の脂質誘導体または脂肪酸誘導体としては、例えば、ポリエチレングリコール、ポリグリセリン、ポリエチレンイミン、ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸、ポリアクリルアミド、オリゴ糖、デキストリン、水溶性セルロース、デキストラン、コンドロイチン硫酸、ポリグリセリン、キトサン、ポリビニルピロリドン、ポリアスパラギン酸アミド、ポリ-L-リジン、マンナン、プルラン、オリゴグリセロール等またはそれらの誘導体と、前記組成物の定義の中で挙げた中性脂質または例えば、ステアリン酸、パルミチン酸、ミリスチン酸またはラウリン酸等の脂肪酸とが結合してなるもの、それらの塩等が挙げられ、より好ましくは、ポリエチレングリコールまたはポリグリセリン等の脂質誘導体または脂肪酸誘導体およびそれらの塩が挙げられ、さらに好ましくは、ポリエチレングリコールの脂質誘導体または脂肪酸誘導体およびそれらの塩が挙げられる。
ポリエチレングリコールの脂質誘導体または脂肪酸誘導体としては、例えば、ポリエチレングリコール化脂質[具体的にはポリエチレングリコール-ホスファチジルエタノールアミン(より具体的には1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-[メトキシ(ポリエチレングリコール)-2000](PEG-DSPE)、1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-[メトキシ(ポリエチレングリコール)-2000](PEG-DPPE)、1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-[メトキシ(ポリエチレングリコール)-2000](PEG-DMPE)等)、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油60、クレモフォアイーエル(CREMOPHOR EL)等]、ポリエチレングリコールソルビタン脂肪酸エステル類(具体的にはモノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン等)またはポリエチレングリコール脂肪酸エステル類等が挙げられ、より好ましくは、ポリエチレングリコール化脂質が挙げられる。
ポリグリセリンの脂質誘導体または脂肪酸誘導体としては、例えば、ポリグリセリン化脂質(具体的にはポリグリセリン-ホスファチジルエタノールアミン等)またはポリグリセリン脂肪酸エステル類等が挙げられ、より好ましくは、ポリグリセリン化脂質が挙げられる。
界面活性剤としては、例えば、モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン(具体的にはポリソルベート80等)、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール(具体的にはプルロニックF68等)、ソルビタン脂肪酸エステル(具体的にはソルビタンモノラウレート、ソルビタンモノオレエート等)、ポリオキシエチレン誘導体(具体的にはポリオキシエチレン硬化ヒマシ油60、ポリオキシエチレンラウリルアルコール等)、グリセリン脂肪酸エステルまたはポリエチレングリコールアルキルエーテル等が挙げられ、好ましくは、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール、グリセリン脂肪酸エステルまたはポリエチレングリコールアルキルエーテル等が挙げられる。
本発明の核酸含有脂質ナノ粒子において、核酸含有脂質ナノ粒子における水溶性高分子の脂質誘導体および脂肪酸誘導体の分子の総数は特に限定されないが、総脂質のモル数に対して0.005倍モル量以上であるのが好ましく、0.01〜0.30倍モル量であるのがより好ましく、0.02〜0.25倍モル量であるのがさらに好ましく、0.03〜0.20倍モル量であるのがさらにより好ましく、0.04〜0.15倍モル量であるのがさらにより好ましく、0.04〜0.12倍モル量であるのが最も好ましい。
本発明においては、総脂質とは、脂質Aおよび水溶性高分子の脂質誘導体および脂肪酸誘導体を含み、場合により、脂質Bおよび中性脂質を含む。すなわち、脂質Aのモル数は、総脂質のモル数を1とした場合の倍モル量として、水溶性高分子の脂質誘導体および脂肪酸誘導体の倍モル量、場合により、脂質Bの倍モル量および中性脂質の倍モル量の総和を1から減じた倍モル量となる。
また、本発明の核酸含有脂質ナノ粒子には、例えば、水溶性高分子等による表面改質も任意に行うことができる[ラジック(D.D.Lasic)、マーティン(F.Martin)編,“ステルス・リポソームズ(Stealth Liposomes)”(米国),シーアールシー・プレス・インク(CRC Press Inc),1995年,p.93-102参照]。表面改質に使用し得る水溶性高分子としては、例えば、ポリエチレングリコール、ポリグリセリン、ポリエチレンイミン、ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸、ポリアクリルアミド、オリゴ糖、デキストリン、水溶性セルロース、デキストラン、コンドロイチン硫酸、ポリグリセリン、キトサン、ポリビニルピロリドン、ポリアスパラギン酸アミド、ポリ-L-リジン、マンナン、プルラン、オリゴグリセロール等が挙げられ、好ましくはポリエチレングリコール、ポリグリセリン、ポリエチレンイミン、ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸およびポリアクリルアミド等が挙げられ、より好ましくはポリエチレングリコールおよびポリグリセリン等が挙げられるがこれらに限定されない。また、表面改質には、糖、ペプチド、核酸および水溶性高分子から選ばれる1以上の物質の脂質誘導体もしくは脂肪酸誘導体(前記と同義)、または界面活性剤等を用いることができる。該表面改質は、本発明の核酸含有脂質ナノ粒子中に糖、ペプチド、核酸および水溶性高分子から選ばれる1以上の物質の脂質誘導体もしくは脂肪酸誘導体、または界面活性剤を含有させる方法の1つである。
標的化リガンドを、本発明の核酸含有脂質ナノ粒子の脂質成分の極性ヘッド残基に共有結合することにより本発明の核酸含有脂質ナノ粒子の表面に直接結合させることも任意に行うことができる(国際公開第2006/116107号参照)。
本発明の核酸含有脂質ナノ粒子の平均粒子径は、脂質ナノ粒子の調製後にさらに調節することもできる。平均粒子径を調節する方法としては、例えば、エクストルージョン法、大きな多重膜リポソーム(MLV)等を機械的に粉砕(具体的にはマントンゴウリン、マイクロフルイダイザー等を使用)する方法[ミュラー(R.H.Muller)、ベニタ(S.Benita)、ボーム(B.Bohm)編著,“エマルジョン・アンド・ナノサスペンジョンズ・フォー・ザ・フォーミュレーション・オブ・ポアリー・ソラブル・ドラッグズ(Emulsion and Nanosuspensions for the Formulation of Poorly Soluble Drugs)”,ドイツ,サイエンティフィック・パブリッシャーズ・スチュットガルト(Scientific Publishers Stuttgart),1998年,p.267-294参照]等が挙げられる。
本発明の核酸含有脂質ナノ粒子の大きさは、平均粒子径が20〜65 nmであるのが好ましく、30〜60 nmであるのがより好ましい。
本発明の核酸含有脂質ナノ粒子の大きさは、例えば、動的光散乱法で測定することができる。
本発明の核酸含有脂質ナノ粒子を、ほ乳類の細胞に導入することで、本発明の核酸含有脂質ナノ粒子中の核酸を細胞内に導入することができる。
インビボにおける本発明の核酸含有脂質ナノ粒子のほ乳類の細胞への導入は、インビボにおいて行うことのできる公知のトランスフェクションの手順に従って行えばよい。例えば、本発明の核酸含有脂質ナノ粒子を、人を含む哺乳動物に静脈内投与することで、例えば、腫瘍または炎症の生じた臓器または部位へ送達され、送達臓器または部位の細胞内に本発明の核酸含有脂質ナノ粒子中の核酸を導入することができる。腫瘍または炎症の生じた臓器または部位としては、特に限定されないが、例えば、胃、大腸、肝臓、肺、脾臓、膵臓、腎臓、膀胱、皮膚、血管、眼球等が挙げられる。また、本発明の核酸含有脂質ナノ粒子を、人を含む哺乳動物に静脈内投与することで、例えば、肝臓、胃、肺、腎臓、膵臓および／または脾臓へ送達され、送達臓器または部位の細胞内に本発明の核酸含有脂質ナノ粒子中の核酸を導入することができる。肝臓、肺、脾臓および／または腎臓の細胞は、正常細胞、腫瘍もしくは炎症に関連した細胞またはその他の疾患に関連した細胞のいずれでもよい。
本発明の核酸含有脂質ナノ粒子中の核酸が、RNA干渉(RNAi)を利用した標的遺伝子の発現抑制作用を有する核酸であれば、インビボでほ乳類の細胞内に、標的遺伝子の発現を抑制する該核酸等を導入することができ、標的遺伝子の発現の抑制ができる。投与対象は、人であることが好ましい。
本発明の核酸含有脂質ナノ粒子中の標的遺伝子が、例えば、肝臓、胃、肺、腎臓、膵臓および／または脾臓において発現する遺伝子、好ましくは肝臓において発現する遺伝子であれば、本発明の核酸含有脂質ナノ粒子を、肝臓、胃、肺、腎臓、膵臓または脾臓に関連する疾患の治療剤または予防剤、好ましくは肝臓に関連する疾患の治療剤または予防剤として使用することができる。即ち、本発明は、上記説明した本発明の核酸含有脂質ナノ粒子を哺乳動物に投与する肝臓、胃、肺、腎臓、膵臓または脾臓に関連する疾患等の治療方法も提供する。投与対象は、人であることが好ましく、肝臓、胃、肺、腎臓、膵臓または脾臓に関連する疾患等に罹患している人がより好ましい。
本発明の核酸含有脂質ナノ粒子は、肝臓、胃、肺、腎臓、膵臓または脾臓に関連する疾患等の治療剤または予防剤に関するインビボの薬効評価モデルにおいて、標的遺伝子を抑制することの有効性を検証するためのツールとして使用することもできる。
本発明の核酸含有脂質ナノ粒子は、例えば、血液成分等の生体成分(例えば、血液、消化管等)中での前記核酸の安定化、副作用の低減または標的遺伝子の発現部位を含む組織または臓器への薬剤集積性の増大等を目的とする製剤としても使用できる。
本発明の核酸含有脂質ナノ粒子を、医薬品の肝臓、肺、腎臓または脾臓に関連する疾患等の治療剤または予防剤として使用する場合、投与経路としては、治療に際し最も効果的な投与経路を使用するのが望ましく、例えば、口腔内、気道内、直腸内、皮下、筋肉内または静脈内等の非経口投与または経口投与を挙げることができ、好ましくは静脈内投与、皮下投与または筋肉内投与を挙げることができ、より好ましくは静脈内投与が挙げられる。
投与量は、投与対象の病状や年齢、投与経路等によって異なるが、例えば、核酸に換算した1日投与量が約0.1μg〜1000mgとなるように投与すればよい。
静脈内投与または筋肉内投与に適当な製剤としては、例えば、注射剤が挙げられ、上述の方法により調製した組成物の分散液をそのまま例えば、注射剤等の形態として用いることも可能であるが、該分散液から例えば、濾過、遠心分離等によって溶媒を除去して使用することも、該分散液を凍結乾燥して使用する、および／または例えば、マンニトール、ラクトース、トレハロース、マルトースもしくはグリシン等の賦形剤を加えた分散液を凍結乾燥して使用することもできる。
注射剤の場合、前記の組成物の分散液または前記の溶媒を除去または凍結乾燥した組成物に、例えば、水、酸、アルカリ、種々の緩衝液、生理食塩水またはアミノ酸輸液等を混合して注射剤を調製することが好ましい。また、例えば、クエン酸、アスコルビン酸、システインもしくはEDTA等の抗酸化剤またはグリセリン、ブドウ糖もしくは塩化ナトリウム等の等張化剤等を添加して注射剤を調製することも可能である。また、例えば、グリセリン等の凍結保存剤を加えて凍結保存することもできる。
実施例
次に、実施例、参考例、比較例および試験例により、本発明を具体的に説明する。ただし、本発明はこれら実施例、参考例、比較例および試験例に限定されるものではない。
なお、実施例および参考例に示されたプロトン核磁気共鳴スペクトル(1H NMR)は、270MHz、300MHzまたは400MHzで測定されたものであり、化合物および測定条件によっては交換性プロトンが明瞭には観測されないことがある。なお、シグナルの多重度の表記としては通常用いられるものを用いているが、brとは見かけ上幅広いシグナルであることを表す。
N-メチル-2-(オレオイルオキシ)-N,N-ビス(2-(オレオイルオキシ)エチル)エタンアミニウム クロリド (化合物I-1)
工程1
トリエタノールアミン (シグマアルドリッチ(Sigma-Aldrich)社製, 0.115 g, 0.771 mmol)のクロロホルム (5 mL)溶液にオレイン酸 (東京化成工業社製, 0.784 g, 2.78 mmol)、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩 (東京化成工業社製, 0.591 g, 3.08 mmol)、トリエチルアミン (0.430 mL, 3.08 mmol)およびN,N-ジメチルアミノピリジン (ナカライテスク社製, 0.024 g, 0.19 mmol)を加えて室温で終夜攪拌した。反応液に水を加えてクロロホルムで抽出した。有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液ついで飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、ろ過し、減圧下濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(クロロホルム/ヘキサン = 50/50〜100/0)で精製して2,2’,2’’-ニトリロトリス(エタン-2,1-ジイル) トリオレアート (0.439 g, 0.466 mmol, 収率60%)を得た。
ESI-MS m/z: 943 (M + H)+; 1H-NMR (CDCl3) δ: 0.88 (t, J = 6.9 Hz, 9H), 1.23-1.36 (m, 60H), 1.58-1.63 (m, 6H), 1.98-2.04 (m, 12H), 2.29 (t, J= 7.6 Hz, 6H), 2.83 (t, J = 6.1 Hz, 6H), 4.11 (t, J = 6.1 Hz, 6H), 5.31-5.38 (m, 6H).
工程2
工程1で得られた2,2’,2’’-ニトリロトリス(エタン-2,1-ジイル) トリオレアート (0.439 g, 0.466 mmol)にヨウ化メチル (東京化成工業社製, 3 mL)を加え、室温で終夜撹拌した。反応液を減圧下濃縮した。残渣を少量のメタノール-クロロホルム (1:1)に溶解してイオン交換樹脂 (ダウ・ケミカル(Dow Chemical)製, Dowex(TM) 1x-2 100 mesh, Cl型, 約20倍量, 水およびメタノールでプレ洗浄)にロードし、メタノール-クロロホルム (1:1)で溶出した。溶出液を減圧下濃縮し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(クロロホルム/メタノール = 100/0〜88/12)で精製して標記の化合物 (0.342 g, 0.344 mmol, 収率74%)を得た。
ESI-MS m/z: 957 (M)+; 1H-NMR (CDCl3) δ: 0.88 (t, J = 6.9 Hz, 9H), 1.25-1.35 (m, 60H), 1.59-1.63 (m, 6H), 1.99-2.03 (m, 12H), 2.35 (t, J= 7.6 Hz, 6H), 3.56 (s, 3H), 4.21 (t, J= 4.9 Hz, 6H), 4.61 (t, J = 4.9 Hz, 6H), 5.30-5.38 (m, 6H).
N-メチル-2-((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエノイルオキシ)-N,N-ビス(2-((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエノイルオキシ)エチル)エタンアミニウム クロリド (化合物I-2)
実施例1と同様の方法で、オレイン酸の代わりに(9Z, 12Z)-オクタデカ-9,12-ジエン酸 (Sigma-Aldrich社製, 0.704 g, 2.51 mmol)を用い、標記の化合物(0.100 g、通し収率22%)を得た。
ESI-MS m/z: 950 (M)+; 1H-NMR (CDCl3) 0.89 (t, J = 7.0 Hz, 9H), 1.25-1.40 (m,42H), 1.55-1.66 (m, 6H), 2.05 (q, J = 6.9 Hz, 12H), 2.35 (t, J = 7.6 Hz, 6H), 2.77 (t, J = 6.3 Hz, 6H), 3.54 (s, 3H), 4.21 (t, J = 5.1 Hz, 6H), 4.59 (br s, 6H), 5.28-5.43 (m, 12H).
(9Z,12Z)-N-メチル-N,N-ジ((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニル)オクタデカ-9,12-ジエン-1-アミニウム クロリド (化合物I-3)
工程１
アンモニア (東京化成工業社製, 約7 mol/Lメタノール溶液、8.00 mL、56.0 mmol)に (9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニル メタンスルホナート (ニューチェック・プレップ・インク (Nu-Chek Prep,Inc)社製, 3.55 g, 10.1 mmol) を加え、マイクロ波反応装置を用いて130℃で3時間攪拌した。反応液に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加えてクロロホルムで5回抽出した。有機層を合わせて飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥後ろ過し、減圧濃縮することで (9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエン-1-アミンの粗生成物を得た。
得られた粗生成物に(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニル メタンスルホナート (2.78 g, 8.07 mmol) および50%水酸化ナトリウム水溶液 (2.00 mL, 50.0 mmol) を加え、油浴上110℃で60分間攪拌した。室温まで冷却後、反応液を酢酸エチルで希釈し、水、ついで飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥後ろ過し、減圧濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (ヘキサン/酢酸エチル = 100/0〜90/10)で精製することにより、(9Z,12Z)-トリ(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニルアミン (1.09 g, 1.43 mmol, 収率18%)を得た。
ESI-MS m/z: 763 (M + H)+.
工程2
実施例1工程2と同様の方法で、2,2’,2’’-ニトリロトリス(エタン-2,1-ジイル)トリオレアートの代わりに工程1で得られた(9Z,12Z)-トリ(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニルアミン (1.05 g, 1.38 mol)を用い、標記の化合物 (1.06 g, 1.30 mol, 収率94%)を得た。
ESI-MS m/z: 777 (M)+; 1H-NMR (CDCl3) δ: 0.89 (t, J = 7.1 Hz, 9H), 1.22-1.45 (m, 48H), 1.61-1.69 (m, 6H), 2.05 (q, J = 6.8 Hz, 12H), 2.77 (t, J = 6.5 Hz, 6H), 3.35 (s, 3H), 3.44-3.50 (m, 6H), 5.29-5.42 (m, 12H).
(Z)-N-メチル-N,N-ジ((Z)-オクタデカ-9-エニル)オクタデカ-9-エン-1-アミニウム クロリド (化合物I-4)
実施例3と同様の方法で、(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニル メタンスルホナートの代わりに (Z)-オクタデカ-9-エニル メタンスルホナート (Nu-Chek Prep,Inc.製) を用い、標記の化合物 (0.410 g, 0.501 mmol, 通し収率24%) を得た。
ESI-MS m/z: 783 (M)+; 1H-NMR (CDCl3) δ: 0.88 (t, J = 6.9 Hz, 9H), 1.22-1.44 (m, 66H), 1.62-1.69 (m, 6H), 1.98-2.04 (m, 12H), 3.35 (s, 3H), 3.45-3.51 (m, 6H), 5.30-5.39 (m, 6H).
(11Z,14Z)-N,N-ジ((11Z,14Z)-イコサ-11,14-ジエニル)-N-メチルイコサ-11,14-ジエン-1-アミニウム クロリド (化合物I-5)
実施例3と同様の方法で、(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニル メタンスルホナートの代わりに (11Z,14Z)-イコサ-11,14-ジエニル メタンスルホナート (Nu-Chek Prep,Inc.製) を用い、標記の化合物 (0.323 g, 0.360 mmol, 通し収率25%) を得た。
1H-NMR (CDCl3) δ: 0.89 (t, J = 6.9 Hz, 9H), 1.24-1.43 (m, 63H), 1.61-1.69 (m, 6H), 2.05 (q, J = 6.8 Hz, 12H), 2.77 (t, J = 6.6 Hz, 6H), 3.35 (s, 3H), 3.45-3.50 (m, 6H), 5.30-5.42 (m, 12H).
(9Z,12Z)-N-(3-ヒドロキシプロピル)-N,N-ジ((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニル)オクタデカ-9,12-ジエン-1-アミニウム クロリド (化合物I-6)
実施例3の工程1で得られるトリ((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニル)アミン(0.199 g, 0.261 mmol)のクロロホルム (0.3 mL)溶液に3-ヨードプロパン-1-オール (和光純薬工業社製, 0.194 g, 1.04 mmol)を加え、マイクロ波反応装置で130℃、40分間反応させた。反応液を少量のエタノールに溶解してイオン交換樹脂(Sigma-Aldirch社製, Amberlite(R) IRA-400, Cl型, 約20倍量, 水およびエタノールでプレ洗浄)にロードし、エタノールで溶出した。溶出液を減圧下濃縮し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(クロロホルム/メタノール = 100/0〜88/12)で精製して標記の化合物 (0.146 g, 0.170 mmol, 収率65%)を得た。
ESI-MS m/z: 821 (M)+; 1H-NMR (CDCl3) δ: 0.89 (t, J = 7.0 Hz, 9H), 1.27-1.39 (m, 49H), 1.67-1.74 (m, 6H), 1.93-1.99 (m, 2H), 2.05 (q, J = 6.9 Hz, 12H), 2.77 (t, J = 6.2 Hz, 6H), 3.14-3.19 (m, 6H), 3.70-3.74 (m, 2H), 3.79 (t, J = 5.1 Hz, 2H), 5.29-5.42 (m, 12H).
(9Z,12Z)-N-(2-ヒドロキシエチル)-N,N-ジ((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニル)オクタデカ-9,12-ジエン-1-アミニウム クロリド (化合物I-7)
実施例6と同様の方法で、3-ヨードプロパン-1-オールの代わりに2-ヨードエタン-1-オール (東京化成工業社製)を用い、標記の化合物(0.211 g, 0.250 mmol, 収率85%)を得た。
ESI-MS m/z: 807 (M)+; 1H-NMR (CDCl3) δ: 0.89 (t, J = 7.0 Hz, 9H), 1.27-1.40 (m, 49H), 1.64-1.71 (m, 6H), 2.05 (q, J = 6.8 Hz, 12H), 2.77 (t, J = 6.3 Hz, 6H), 3.36-3.41 (m, 6H), 3.53-3.56 (m, 2H), 4.08-4.12 (m, 2H), 5.29-5.42 (m, 12H).
N,N,N-トリメチル-1,3-ビス((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエノイルオキシ)-2-(((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエノイルオキシ)メチル)プロパン-2-アミニウム クロリド (化合物II-1)
工程1
2-(ジメチルアミノ)-2-(ヒドロキシメチル)プロパン-1,3-ジオール (ザイレクサファーマ (Zylexa Pharma)社製, 0.252 g, 1.69 mmol) のクロロホルム (10 mL)溶液に(9Z, 12Z)-オクタデカ-9,12-ジエン酸 (2.37 g, 8.45 mmol)、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩 (１.62 g, 8.45 mmol)および N,N-ジメチルアミノピリジン(0.206 g, 1.69 mmol)を加えて60℃で終夜攪拌した。室温まで冷却後、減圧下濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (クロロホルム/メタノール = 100/0) で精製して(9Z,9'Z,12Z,12'Z)-2-(ジメチルアミノ)-2-(((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエノイルオキシ)メチル)プロパン-1,3-ジイル ジオクタデカ-9,12-ジエノアート (0.334 g, 0.356 mmol, 収率21%)を得た。
ESI-MS m/z: 937 (M + H)+.
工程2
工程1で得られた(9Z,9'Z,12Z,12'Z)-2-(ジメチルアミノ)-2-(((9Z,12Z)-オクタデク-9,12-ジエノイルオキシ)メチル)プロパン-1,3-ジイル ジオクタデク-9,12-ジエノアート (0.324 g, 0.346 mmol)のクロロホルム (3 mL)溶液にヨウ化メチル (0.216 mL)を加え、室温で5時間撹拌した。反応液にヨウ化メチル (0.216 mL)を加え、室温で終夜撹拌した。反応液を減圧下濃縮した。残渣を少量のメタノール-クロロホルム(1:1)に溶解してイオン交換樹脂 (Dow Chemical製, Dowex(TM) 1x-2 100 mesh, Cl型, 約20倍量, 水およびメタノールでプレ洗浄)にロードし、メタノール-クロロホルム(1:1)で溶出した。溶出液を減圧下濃縮し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (クロロホルム/メタノール=100/0〜90/10)で精製して標記の化合物 (0.161 g, 0.164 mmol, 収率47%)を得た。
ESI-MS m/z: 951 (M)+; 1H-NMR (CDCl3) δ: 0.86 (t, J = 6.9 Hz, 9H), 1.22-1.36 (m, 42H), 1.54-1.61 (m, 6H), 2.02 (q, J = 6.8 Hz, 12H), 2.34 (t, J = 7.7 Hz, 6H), 2.74 (t, J = 6.8 Hz, 6H), 3.69 (s, 9H), 4.57 (s, 6H), 5.26-5.39 (m, 12H).
N,N,N-トリメチル-1,3-ビス((Z)-テトラデカ-9-エノイルオキシ)-2-(((Z)-テトラデカ-9-エノイルオキシ)メチル)プロパン-2-アミニウム クロリド (化合物II-2)
実施例8と同様の方法で、(9Z, 12Z)-オクタデカ-9,12-ジエン酸の代わりにcis-9-テトラデセン酸 (Nu-Chek Prep,Inc社製) を用い、標記の化合物 (0.0854 g, 0.104 mmol, 通し収率16%)を得た。
ESI-MS m/z: 789 (M)+; 1H-NMR (CDCl3) δ: 0.89 (t, J = 7.1 Hz, 9H), 1.27-1.36 (m, 36H), 1.58-1.64 (m, 6H), 2.02 (q, J = 6.5 Hz, 12H), 2.37 (t, J = 7.6 Hz, 6H), 3.72 (s, 9H), 4.55 (s, 6H), 5.30-5.38 (m, 6H).
N,N,N-トリメチル-1,3-ビス(オレオイルオキシ)-2-(オレオイルオキシメチル)プロパン-2-アミニウム クロリド (化合物II-3)
実施例8と同様の方法で、(9Z, 12Z)-オクタデカ-9,12-ジエン酸の代わりにオレイン酸を用い、標記の化合物 (1.14 g, 1.15 mmol, 通し収率34%)を得た。
ESI-MS m/z: 957 (M)+; 1H-NMR (CDCl3) δ: 0.83 (t, J = 6.9 Hz, 9H), 1.17-1.32 (m, 60H), 1.51-1.59 (m, 6H), 1.96 (t, J = 5.5 Hz, 12H), 2.32 (t, J = 7.6 Hz, 6H), 3.70 (s, 9H), 4.56 (s, 6H), 5.25-5.34 (m, 6H).
N,N,N-トリメチル-1,3-ビス(ステアロイルオキシ)-2-(ステアロイルオキシメチル)プロパン-2-アミニウム クロリド (化合物II-4)
工程1
2-(ジメチルアミノ)-2-(ヒドロキシメチル)プロパン-1,3-ジオール (0.100g, 0.670 mmol)にトルエン (10 mL)、ステアリン酸 (東京化成工業社製, 0.763 g, 2.68 mmol)、p-トルエンスルホン酸一水和物 (0.191 g, 1.01 mmol)を順に加え、加熱還流条件下で終夜攪拌した。反応液を減圧下濃縮し、得られた残渣をアミノシリカゲルカラムクロマトグラフィー(クロロホルム)で精製して、2-(ジメチルアミノ)-2-((ステアロイルオキシ)メチル)プロパン-1,3-ジイル ジステアラート (0.120 g, 0.127 mmol, 収率19%)を得た。
ESI-MS m/z: 948 (M + H)+
工程2
工程1で得られた、2-(ジメチルアミノ)-2-((ステアロイルオキシ)メチル)プロパン-1,3-ジイル ジステアラート(0.120 g, 0.127 mmol)を用いて、実施例1工程2と同様にして、標記化合物(0.0260 g, 0.0260 mmol, 収率21%)を得た。
ESI-MS m/z: 963 (M)+； 1H-NMR (CDCl3) δ: 0.88 (t, J = 7.0 Hz, 9H), 1.22-1.36 (m, 84H), 1.56-1.65 (m, 6H), 2.37 (t, J = 7.6 Hz, 6H), 3.72 (s, 9H), 4.56 (s, 6H).
1,3-ビス((Z)-ヘキサデカ-9-エノイルオキシ)-2-(((Z)-ヘキサデカ-9-エノイルオキシ)メチル)-N,N,N-トリメチルプロパン-2-アミニウム クロリド (化合物II-5)
実施例8と同様の方法で、(9Z, 12Z)-オクタデカ-9,12-ジエン酸の代わりにcis-9-ヘキサデセン酸を用い、標記の化合物 (0.680 g, 0.748 mmol, 通し収率63%)を得た。
ESI-MS m/z: 873 (M)+; 1H-NMR (CDCl3) δ: 0.88 (t, J = 7.0 Hz, 9H), 1.24-1.36 (m, 48H), 1.56-1.67 (m, 13H), 1.98-2.05 (m, 12H), 2.37 (t, J= 7.6 Hz, 6H), 3.75 (s, 9H), 4.53 (s, 6H), 5.29-5.40 (m, 6H).
N,N,N-トリメチル-1,3-ビス((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニルオキシ)-2-(((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニルオキシ)メチル)プロパン-2-アミニウム クロリド (化合物II-6)
工程1
2-ジメチルアミノ-2-ヒドロキシメチルプロパン-1,3-ジオール (Zylexa Pharma 社製, 0.115 g, 0.768 mmol) のトルエン (5 mL) 溶液に水素化ナトリウム (ナカライテスク社製, 油性, 60%, 0.154 g, 3.84 mmol) および (9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニル メタンスルホナート (1.32 g, 3.84 mmol) を加えて加熱還流下で終夜攪拌した。室温まで冷却後、反応液に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加えてヘキサンで抽出した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、ろ過し、減圧下濃縮した。得られた残渣をアミノシリカゲルカラムクロマトグラフィー (ヘキサン/酢酸エチル = 100/0〜95/5) で精製して N,N-ジメチル-1,3-ビス((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニルオキシ)-2-(((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニルオキシ)メチル)プロパン-2-アミン (0.195 g, 0.217 mmol, 収率28%) を得た。
ESI-MS m/z: 895 (M + H)+.
工程2
工程1で得られた N,N-ジメチル-1,3-ビス((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニルオキシ)-2-(((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニルオキシ)メチル)プロパン-2-アミン (0.0849 g, 0.0949 mmol) のクロロホルム (1 mL)溶液にヨウ化メチル (0.119 mL)を加え、室温で終夜撹拌した。反応液を減圧下濃縮した。残渣を少量のメタノール-クロロホルム (1:1)に溶解してイオン交換樹脂 (Dow Chemical製, Dowex(TM) 1x-2 100 mesh, Cl型, 約20倍量, 水およびメタノールでプレ洗浄)にロードし、メタノール-クロロホルム(1:1)で溶出した。溶出液を減圧下濃縮し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (クロロホルム/メタノール = 100/0〜90/10)で精製して標記の化合物 (0.0646 g, 0.0684 mmol, 収率72%)を得た。
ESI-MS m/z: 909 (M)+; 1H-NMR (CDCl3) δ: 0.89 (t, J = 6.9 Hz, 9H), 1.25-1.40 (m, 48H), 1.55-1.63 (m, 6H), 2.02-2.09 (m, 12H), 2.77 (t, J= 6.8 Hz, 6H), 3.44 (t, J = 6.6 Hz, 6H), 3.62 (s, 9H), 3.82 (s, 6H), 5.29-5.42 (m, 12H).
N,N,N-トリメチル-1,3-ビス((Z)-テトラデカ-9-エニルオキシ)-2-(((Z)-テトラデカ-9-エニルオキシ)メチル)プロパン-2-アミニウム クロリド (化合物II-7)
実施例13と同様の方法で、(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニル メタンスルホナートの代わりにミリストレイル メタンスルホナート(Nu-Chek Prep,Inc製) を用い、標記の化合物(0.0729 g, 0.0931 mmol, 通し収率12%)を得た。
ESI-MS m/z: 747 (M)+; 1H-NMR (CDCl3) δ: 0.90 (t, J = 7.1 Hz, 9H), 1.27-1.37 (m, 42H), 1.54-1.61 (m, 6H), 2.02 (q, J = 6.5 Hz, 12H), 3.43 (t, J = 6.6 Hz, 6H), 3.64 (s, 8H), 3.81 (s, 6H), 5.31-5.39 (m, 6H).
1,3-ビス((Z)-ヘキサデカ-9-エニルオキシ)-2-(((Z)-ヘキサデカ-9-エニルオキシ)メチル)-N,N,N-トリメチルプロパンー2-アミニウム クロリド (化合物II-8)
実施例13と同様の方法で、(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニル メタンスルホナートの代わりにパルミトレイル メタンスルホナート(Nu-Chek Prep,Inc製)を用い、標記の化合物(0.466 g, 0.538 mmol, 通し収率71%)を得た。
ESI-MS m/z: 831 (M)+; 1H-NMR (CDCl3) δ: 0.88 (t, J = 6.8 Hz, 9H), 1.23-1.37 (m, 54H), 1.53-1.61 (m, 14H), 2.02 (q, J = 5.8 Hz, 12H), 3.43 (t, J = 6.5 Hz, 6H), 3.65 (s, 9H), 3.81 (s, 6H), 5.30-5.40 (m, 6H).
(6Z,9Z,40Z,43Z)-N,N,N-トリメチル-25-((3-((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニルオキシ)-3-オキソプロポキシ)メチル)-20,30-ジオキソ-19,23,27,31-テトラオキサノナテトラコンタ-6,9,40,43-テトラエン-25-アミニウム クロリド (化合物II-9)
工程1
“ジャーナル・オブ・オーガニック・ケミストリー(J.Org.Chem.)”,2002年, 第67巻, p.1411-1413に記載の方法に準じた方法で合成したジ-tert-ブチル 3,3'-((2-アミノ-2-((3-(tert-ブトキシ)-3-オキソプロポキシ)メチル)プロパン-1,3-ジイル)ビス(オキシ))ジプロパノエート (0.500 g, 0.989 mmol)をジクロロメタン(5 mL)に溶解させ、ヨウ化メチル(1.40 g, 9.89 mmol)を加えて、室温で終夜攪拌した。反応液を減圧下濃縮した。残渣を少量のメタノール-クロロホルム (1:1)に溶解してイオン交換樹脂 (Dowex(TM) 1x-2 100 mesh, Cl型, 約20倍量, 水およびメタノールでプレ洗浄)にロードし、メタノールで溶出した。溶出液を減圧下濃縮し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(クロロホルム/メタノール = 97/3〜80/20)で精製して9-((3-(tert-ブトキシ)-3-オキソプロポキシ)メチル)-N,N,N,2,2,16,16-ヘプタメチル-4,14-ジオキソ-3,7,11,15-テトラオキサヘプタデカン-9-アミニウム クロリド (0.144 g, 0.246 mmol, 収率25%)を得た。
ESI-MS m/z: 548 (M + H)+.
工程2
工程1で得られた9-((3-(tert-ブトキシ)-3-オキソプロポキシ)メチル)-N,N,N,2,2,16,16-ヘプタメチル-4,14-ジオキソ-3,7,11,15-テトラオキサヘプタデカン-9-アミニウム クロリド (0.350 g, 0.246 mmol)をジクロロメタン (2 mL)に溶解させ、トリフルオロ酢酸 (0.380 mL, 4.92 mmol)を加えて、室温で3時間攪拌した。反応液にトルエンを加えて、減圧下濃縮することで、1,3-ビス(2-カルボキシエトキシ)-2-((2-カルボキシエトキシ)メチル)-N,N,N-トリメチルプロパン-2-アミニウム クロリド トリフルオロ酢酸塩の粗生成物 (0.102 g, 0.246 mmol, 粗収率100%)を得た。
ESI-MS m/z: 422 (M + H)+
工程3
工程2で得られた1,3-ビス(2-カルボキシエトキシ)-2-((2-カルボキシエトキシ)メチル)-N,N,N-トリメチルプロパン-2-アミニウム クロリド トリフルオロ酢酸塩の粗生成物 (0.055 g, 0.13 mmol)をジクロロメタン (2 mL)に溶解させ、O-(7-アザ-1H-ベンゾトリアゾール-1-イル)-N,N,N',N'-テトラメチルウロニウム ヘキサフルオロフォスフェート (和光純薬工業社製, 0.20 g, 0.53 mmol)、N,N-ジイソプロピルエチルアミン (0.23 mL, 1.3 mmol)、および(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエン-1-オール(東京化成工業社製, 0.141 g, 0.53 mmol)を加え、室温で終夜攪拌した。反応液に水を加えて、クロロホルムで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、ろ過し、減圧下濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(クロロホルム/メタノール = 90/10〜80/20)で精製して標記の化合物 (8.0 mg, 6.9 mmol, 収率5%)を得た。
ESI-MS m/z: 1125 (MH)+; 1H-NMR (CDCl3) δ: 0.89 (t, J = 7.0 Hz, 9H), 1.25-1.39 (m, 48H), 1.58-1.66 (m, 6H), 2.05 (q, J = 6.9 Hz, 12H), 2.59 (t, J = 5.7 Hz, 6H), 2.77 (t, J = 6.7 Hz, 6H), 3.42 (s, 9H), 3.74 (t, J = 5.7 Hz, 6H), 4.00 (s, 6H), 4.07 (t, J = 6.8 Hz, 6H), 5.29-5.40 (m, 12H).
(7Z,38Z)-23-((3-((Z)-ヘキサデカ-9-エニルオキシ)-3-オキソプロポキシ)メチル)-N,N,N-トリメチル-18,28-ジオキソ-17,21,25,29-テトラオキサペンタテトラコンタ-7,38-ジエン-23-アミニウム クロリド (化合物II-10)
実施例16と同様の方法で、(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエン-1-オールの代わりに(Z)-ヘキサデカ-9-エン-1-オール (Nu-Chek Prep,Inc社製)を用い、標記の化合物(0.145 g, 0.134 mmol, 通し収率17%)を得た。
ESI-MS m/z: 1047 (M)+; 1H-NMR (CDCl3) δ: 0.88 (t, J = 7.0 Hz, 9H), 1.24-1.38 (m, 54H), 1.58-1.66 (m, 6H), 1.98-2.05 (m, 12H), 2.58 (t, J = 5.7 Hz, 6H), 3.47 (s, 9H), 3.74 (t, J = 5.7 Hz, 6H), 4.02 (s, 6H), 4.07 (t, J = 6.8 Hz, 6H), 5.30-5.40 (m, 6H).
(5Z,36Z)-N,N,N-トリメチル-16,26-ジオキソ-21-((3-オキソ-3-((Z)-テトラデカ-9-エニルオキシ)プロポキシ)メチル)-15,19,23,27-テトラオキサヘンテトラコンタ-5,36-ジエン-21-アミニウム クロリド (化合物II-11)
実施例16と同様の方法で、(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエン-1-オールの代わりに(Z)-テトラデカ-9-エン-1-オール (Nu-Chek Prep,Inc社製)を用い、標記の化合物(0.189 g, 0.189 mmol, 通し収率24%)を得た。
ESI-MS m/z: 963 (M)+；1H-NMR (CDCl3) δ: 0.87-0.92 (m, 9H), 1.25-1.38 (m, 42H), 1.55-1.66 (m, 6H), 1.98-2.05 (m, 12H), 2.58 (t, J = 5.7 Hz, 6H), 3.47 (s, 9H), 3.75 (t, J = 5.7 Hz, 6H), 4.01 (s, 6H), 4.07 (t, J= 6.8 Hz, 6H), 5.30-5.41 (m, 6H).
(11Z,14Z)-N,N,N-トリメチル-2-(((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエノイルオキシ)メチル)-2-((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニル)イコサ-11,14-ジエン-1-アミニウム クロリド (化合物II-12)
工程１
シアノ酢酸エチル (東京化成工業社製, 1.00 g, 8,84 mmol)と(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニル メタンスルホナート (7.62 g, 22.1 mmol) をテトラヒドロフラン (30 mL)に溶解させ、氷冷下水素化ナトリウム (油性, 60%, 1.06 g, 26.5 mmol)、およびヨウ化テトラ-n-ブチルアンモニウム (ナカライテスク社製, 3.27 g, 8.84 mmol)を加えた。発泡が収まった後、60℃で3時間攪拌した。反応液に水を加えて、ヘキサンで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、ろ過した。減圧下濃縮することで、(11Z,14Z)-エチル 2-シアノ-2-((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエン-1-イル)イコサ-11,14-ジエノエートの粗生成物 (3.50 g, 5.74 mmol, 粗収率65%)を得た。
工程2
工程1で得られた(11Z,14Z)-エチル 2-シアノ-2-((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエン-1-イル)イコサ-11,14-ジエノエートの粗生成物 1.50 g, 2.46 mmol)をテトラヒドロフラン(10 mL)に溶解し、氷冷下水素化アルミニウムリチウム (純正化学社製, 0.467 g, 12.3 mmol)を加え、30分間攪拌した。反応液に水 (0.5 mL), 15%水酸化ナトリウム水溶液 (0.5 mL), 水 (1.5 mL)、硫酸マグネシウムを順に加え、しばらく攪拌した後ろ過した。減圧下濃縮し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(クロロホルム/メタノール = 99/1〜85/15)で精製して(11Z,14Z)-2-(アミノエチル)-2-((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエン-1-イル)イコサ-11,14-ジエン-1-オール (1.00 g, 2.46 mmol, 収率71%)を得た。
ESI-MS m/z: 573 (M + H)+.
工程3
工程2で得られた(11Z,14Z)-2-(アミノエチル)-2-((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエン-1-イル)イコサ-11,14-ジエン-1-オール (0.350 g, 0.612 mmol)をアセトニトリル (2 mL)とテトラヒドロフラン (2 mL)に溶解し、 38%ホルムアルデヒド水溶液 (和光純薬工業社製, 0.145 mL, 1.84 mmol)、酢酸 (0.035 mL, 0.612 mmol)、およびナトリウムトリアセトキシボロヒドリド (Acros Organics(アクロスオーガニクス)社製, 0.389 g, 1.84 mmol) を加えて、室温で終夜攪拌した。反応液に水を加えて、クロロホルムで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、ろ過した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(クロロホルム/メタノール = 99/1〜85/15)で精製して(11Z,14Z)-2-((ジメチルアミノ)メチル)-2-((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエン-1-イル)イコサ-11,14-ジエン-1-オール(0.252 g, 0.420 mmol, 収率69 %)を得た。
ESI-MS m/z: 600 (M + H)+
工程4
工程3で得られた(11Z,14Z)-2-((ジメチルアミノ)メチル)-2-((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエン-1-イル)イコサ-11,14-ジエン-1-オール(0.252 g, 0.420 mmol)のジクロロメタン (4 mL)溶液に、(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエン酸 (0.141 g, 0.504 mmol)、 O-(7-アザ-1H-ベンゾトリアゾール-1-イル)-N,N,N',N'-テトラメチルウロニウム ヘキサフルオロフォスフェート (0.192 mmol, 0.504 mmol)、N,N-ジイソプロピルエチルアミン(0.147 mL, 0.840 mmol)を順に加えて、室温で4時間攪拌した。反応液に水を加えてヘキサンで抽出した。有機層を水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、ろ過し、減圧下濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(ヘキサン/酢酸エチル= 95/5〜85/15)で精製することで、(9Z,12Z)-(11Z,14Z)-2-((ジメチルアミノ)メチル)-2-((9Z,12Z)- オクタデカ-9,12-ジエン-1-イル) イコサ-11,14-ジエン-1-イル オクタデカ-9,12-ジエノアート (0.307 g, 0.356 mmol, 収率85 %)を得た。
ESI-MS m/z: 863 (M + H)+
工程5
工程4で得られた(9Z,12Z)-(11Z,14Z)-2-((ジメチルアミノ)メチル)-2-((9Z,12Z)- オクタデカ-9,12-ジエン-1-イル) イコサ-11,14-ジエン-1-イル オクタデカ-9,12-ジエノアート (0.307 g, 0.356 mmol)を用いて、実施例1工程2と同様にして標記化合物 (0.260 g, 0.285 mmol, 収率80%)を得た。
ESI-MS m/z: 877 (M)+; 1H-NMR (CDCl3) δ:0.89 (t, J = 7.0 Hz, 9H), 1.22-1.48 (m, 54H), 1.60-1.66 (m, 2H), 2.05 (q, J = 6.8 Hz, 12H), 2.38 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 2.77 (t, J= 6.3 Hz, 6H), 3.50 (s, 2H), 3.60 (s, 9H), 4.13 (s, 2H), 5.27-5.44 (m, 12H).
N,N,N-トリメチル-3-((11Z,14Z)-2-(((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエノイルオキシ)メチル)-2-((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニル)イコサ-11,14-ジエニルカルバモイルオキシ)プロパン-1-アミニウム クロリド(化合物II-13)
工程1
実施例19工程2で得られた(11Z,14Z)-2-(アミノエチル)-2-((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエン-1-イル)イコサ-11,14-ジエン-1-オール (0.918 g, 1.61 mmol)をテトラヒドロフラン(20 mL)に溶解させ、トリエチルアミン (0.671 mL, 4.81 mmol)、および二炭酸 ジ-tert-ブチル (国産化学社製, 0.373 mL, 1.61 mmol)を加えて、室温で終夜攪拌した。反応液を減圧下濃縮し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(ヘキサン/酢酸エチル = 95/5〜50/50)で精製することで、tert-ブチル ((11Z,14Z)-2-(ヒドロキシメチル)-2-((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエン-1-イル)イコサ-11,14-ジエン-1-イル)カルバマート (0.918 g, 1.37 mmol, 収率85%)を得た。
ESI-MS m/z: 672 (M + H)+.
工程2
工程1で得られたtert-ブチル ((11Z,14Z)-2-(ヒドロキシメチル)-2-((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエン-1-イル)イコサ-11,14-ジエン-1-イル)カルバマート (0.357 g, 0.531 mmol)をジクロロメタン (5 mL)に溶解させ、(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエン酸 (0.223 g, 0.797 mmol)、O-(7-アザ-1H-ベンゾトリアゾール-1-イル)-N,N,N',N'-テトラメチルウロニウム ヘキサフルオロフォスフェート (0.303 mmol, 0.797 mmol)、N,N-ジイソプロピルエチルアミン (0.186 mL, 1.06 mmol)、およびN,N-ジメチルアミノピリジン (0.0650 g, 0.531 mmol)を加えて、室温で終夜攪拌した。反応液に水を加えてクロロホルムで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、ろ過し、減圧下濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(ヘキサン/酢酸エチル = 99/1〜90/10)で精製することで、 (9Z,12Z)-(11Z,14Z)-2-(((tert-ブトキシカルボニルアミノ)メチル)-2-((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエン-1-イル)イコサ-11,14-ジエン-1-イル オクタデカ-9,12-ジエノアート(0.395 g, 0.423 mmol, 収率80%)を得た。
ESI-MS m/z: 935(M + H)+.
工程3
工程2で得られた(9Z,12Z)-(11Z,14Z)-2-(((tert-ブトキシカルボニルアミノ)メチル)-2-((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエン-1-イル)イコサ-11,14-ジエン-1-イル オクタデカ-9,12-ジエノアート (0.395 g, 0.423 mmol)をジクロロメタン(3 mL)に溶解させ、氷冷下トリフルオロ酢酸 (1.00 mL, 4.92 mmol)を加えて、0℃で2時間攪拌した。反応液に1,2-ジクロロエタンを加えて、減圧下濃縮することで、(9Z,12Z)-(11Z,14Z)-2-(アミノエチル)-2-((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエン-1-イル)イコサ-11,14-ジエン-1-イル オクタデカ-9,12-ジエノアート トリフルオロ酢酸塩の粗生成物 (0.394 g, 0.423 mmol, 粗収率100%)を得た。
ESI-MS m/z: 834 (M + H)+.
工程4
工程3で得られた(9Z,12Z)-(11Z,14Z)-2-(アミノエチル)-2-((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエン-1-イル)イコサ-11,14-ジエン-1-イル オクタデカ-9,12-ジエノアート トリフルオロ酢酸塩の粗生成物 (0.200 g, 0.215 mmol)をアセトニトリル(2 mL)に溶解させ、“ジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサイエティー(J.Am.Chem.Soc.)”,1981年,第103巻,p.4194-4199記載の方法に準じた方法で合成した3-(ジメチルアミノ)プロピル 4-ニトロフェニル カルボナート塩酸塩 (0.279 g、1.07 mmol)、トリエチルアミン (0.299 mL, 2.15 mmol)、およびN,N-ジメチルアミノピリジン (0.0520 g, 0.429 mmol)を加え、60℃で2時間攪拌した。反応液に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、クロロホルムで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、ろ過し、減圧下濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(ヘキサン/酢酸エチル = 99/1〜60/40)で精製することで、 (9Z,12Z)-(11Z,14Z)-2-((((3-(ジメチルアミノ)プロポキシ)カルボニル)アミノ)メチル)-2-((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-dien-1-yl)イコサ-11,14-ジエン-1-イル オクタデカ-9,12-ジエノアート (0.0800 g, 0.0830 mmol, 収率39%)を得た。
ESI-MS m/z: 964 (M + H)+.
工程5
工程4で得られた(9Z,12Z)-(11Z,14Z)-2-((((3-(ジメチルアミノ)プロポキシ)カルボニル)アミノ)メチル)-2-((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエン-1-イル)イコサ-11,14-ジエン-1-イル オクタデカ-9,12-ジエノアート (0.053 g, 0.055 mmol)を用いて、実施例1工程2と同様にして、標記化合物 (0.025 g, 0.025 mmol, 収率45%)を得た。
ESI-MS m/z: 978 (M)+; 1H-NMR (CDCl3) δ: 0.89 (t, J = 7.0 Hz, 9H), 1.17-1.40 (m, 54H), 1.56-1.66 (m, 2H), 2.05 (q, J = 6.8 Hz, 12H), 2.09-2.17 (m, 2H), 2.33 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 2.77 (t, J = 6.2 Hz, 6H), 3.05 (d, J = 6.6 Hz, 2H), 3.44 (s, 9H), 3.73-3.79 (m, 2H), 3.85 (s, 2H), 4.16 (t, J = 5.7 Hz, 2H), 5.27-5.44 (m, 12H), 5.72 (t, J = 6.5 Hz, 1H).
(12Z,15Z)-3-ヒドロキシ-N,N,N-トリメチル-2,2-ジ((9Z,12Z)- オクタデカ-9,12-ジエン-1-イル)ヘニコサ-12,15-ジエン-1-アミニウム クロリド (化合物II-14)
工程1
実施例19工程2で得られた(11Z,14Z)-2-(アミノエチル)-2-((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエン-1-イル)イコサ-11,14-ジエン-1-オール(1.35 g, 2.36 mmol)をテトラヒドロフラン(10 mL)に溶解させ、38%ホルムアルデヒド水溶液 (和光純薬工業社製0.559 mL, 7.08 mmol)、酢酸 (0.135 mL, 2.36 mmol)、およびナトリウムトリアセトキシボロヒドリド (1.50 g, 7.08 mmol)を加え、室温で1時間攪拌した。反応液に水を加え、クロロホルムで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、ろ過し、減圧下濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(クロロホルム/メタノール = 99/1〜85/15)で精製することで、 (11Z,14Z)-2-((ジメチルアミノ)メチル)-2-((9Z,12Z)- オクタデカ-9,12-ジエン-1-イル) イコサ-11,14-ジエン-1-オール (0.610 g, 1.02 mmol, 収率43%)を得た。
ESI-MS m/z: 600 (M + H)+.
工程2
工程1で得られた(11Z,14Z)-2-((ジメチルアミノ)メチル)-2-((9Z,12Z)- オクタデカ-9,12-ジエン-1-イル) イコサ-11,14-ジエン-1-オール (0.300 g, 0.500 mmol)をジクロロメタン (3 mL)に溶解させ、デス-マーチン試薬 (東京化成工業社製、0.233 g, 0.550 mmol)を加えて、室温で1時間攪拌した。反応液に水を加え、クロロホルムで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、ろ過し、減圧下濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(ヘキサン/酢酸エチル = 95/5〜70/30)で精製することで、(11Z,14Z)-2-((ジメチルアミノ)メチル)-2-((9Z,12Z)- オクタデカ-9,12-ジエン-1-イル) イコサ-11,14-ジエナール(0.160 g, 0.268 mmol, 収率54%)を得た。
ESI-MS m/z: 598 (M + H)+.
工程3
マグネシウム (Sigma-Ardrich社製, 0.0140 g, 0.562 mmol)にジエチルエーテル (1 mL)、およびヨウ素(ひとかけら)を加え、室温で5分間攪拌した。そこに、国際公開第2010/42877号に記載の方法に準じた方法で合成した(6Z,9Z)-18-ブロモオクタデカ-6,9-ジエン (0.176 g, 0.535 mmol)のジエチルエーテル溶液 (1 mL)を加え、加熱還流下攪拌した。ヨウ素の色が消えたことを確認した後、工程2で得られた(11Z,14Z)-2-((ジメチルアミノ)メチル)-2-((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエン-1-イル) イコサ-11,14-ジエナール (0.160 g, 0.268 mmol)のジエチルエーテル溶液 (1 mL)を加え、室温で1時間攪拌した。反応液に水を加え、ヘキサンで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、ろ過し、減圧下濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(ヘキサン/酢酸エチル = 99/1〜85/15)で精製することで、(6Z,9Z,29Z,32Z)-20-((ジメチルアミノ)メチル)-20-((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエン-1-イル)オクタトリアコンタ-6,9,29,32-テトラエン-19-オール (0.0470 g, 0.0550 mmol, 収率21%)を得た。
ESI-MS m/z: 848 (M + H)+.
工程4
工程3で得られた(6Z,9Z,29Z,32Z)-20-((ジメチルアミノ)メチル)-20-((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエン-1-イル)オクタトリアコンタ-6,9,29,32-テトラエン-19-オール (0.047 g, 0.055 mmol)を用いて、実施例1工程2と同様にして、標記化合物 (0.0012 g, 0.0013 mmol, 収率2%)を得た。
ESI-MS m/z: 863 (M)+; 1H-NMR (CDCl3) δ:0.89 (t, J = 7.0 Hz, 9H), 1.17-1.40 (m, 58H), 1.54-1.65 (m, 2H), 2.05 (q, J = 6.8 Hz, 12H), 2.77 (t, J = 6.5 Hz, 6H), 3.29 (d, J= 14.4 Hz, 1H), 3.51 (s, 9H), 3.56 (d, J= 14.2 Hz, 1H), 3.62-3.70 (m, 1H), 5.29-5.42 (m, 12H).
(11Z,14Z)-N,N,N-トリメチル-2-((9Z,12Z)- オクタデカ-9,12-ジエン-1-イル)-2-(((9Z,12Z)- オクタデカ-9,12-ジエニルオキシ)カルボニル)イコサ-11,14-ジエン-1-アミニウム クロリド (化合物II-15)
工程1
実施例20の工程1で得られたるtert-ブチル ((11Z,14Z)-2-(ヒドロキシメチル)-2-((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエン-1-イル)イコサ-11,14-ジエン-1-イル)カルバマート (0.300 g, 0.448 mmol)をアセトン (2 mL)に溶解させ、氷冷下ジョーンズ試薬 (Sigma-Ardrich社製, 2 mol/L, 0.224 mL, 0.448 mmol)を加えた後、室温で1時間攪拌した。反応液に水を加え、酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、ろ過し、減圧下濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(ヘキサン/酢酸エチル = 95/5〜50/50)で精製することで、(11Z,14Z)-2-(((tert-ブトキシカルボニル)アミノ)メチル)-2-((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエン-1-イル) イコサ-11,14-ジエン酸 (0.136 g, 0.198 mmol, 収率44%)を得た。
ESI-MS m/z: 684 (M - H)-.
工程2
工程1で得られた(11Z,14Z)-2-(((tert-ブトキシカルボニル)アミノ)メチル)-2-((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエン-1-イル) イコサ-11,14-ジエン酸 (0.120 g, 0.175 mmol)と(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエン-1-オール (Nu-Chek Prep,Inc社製, 0.0930 g, 0.350 mmol)を用いて、実施例20の工程2と同様の方法で(11Z,14Z)-(9Z,12Z)- オクタデカ-9,12-ジエン-1-イル 2-((( tert-ブトキシカルボニル)アミノ)メチル)-2-((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエン-1-イル)イコサ-11,14-ジエノアート (0.123 g, 0.132 mmol, 収率75%)を得た。
ESI-MS m/z: 935 (M + H)+.
工程3
工程2で得られた(11Z,14Z)-(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエン-1-イル 2-((( tert-ブトキシカルボニル)アミノ)メチル)-2-((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエン-1-イル)イコサ-11,14-ジエノアート (0.123 g, 0.132 mmol)をジクロロメタン(1 mL)に溶解させ、氷冷下トリフルオロ酢酸 (0.300 mL, 3.89 mmol)を加え、1時間攪拌した。反応液に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、ヘキサンで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、ろ過し、減圧下濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (ヘキサン/酢酸エチル = 99/1〜80/20)で精製することで、(11Z,14Z)-(9Z,12Z)- オクタデカ-9,12-ジエン-1-イル 2-(アミノメチル)-2-((9Z,12Z)- オクタデカ-9,12-ジエン-1-イル)イコサ-11,14-ジエノアート (0.110 g, 0.132 mmol, 収率100%)を得た。
ESI-MS m/z: 835 (M + H)+.
工程4
工程3で得られた(11Z,14Z)-(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエン-1-イル 2-(アミノメチル)-2-((9Z,12Z)- オクタデカ-9,12-ジエン-1-イル)イコサ-11,14-ジエノアート (0.110 g, 0.132 mmol)を用いて、実施例21工程1と同様の方法で(11Z,14Z)-(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエン-1-イル2-((ジメチルアミノメチル)-2-((9Z,12Z)- オクタデカ-9,12-ジエン-1-イル)イコサ-11,14-ジエノアート (0.0720 g, 0.0830 mmol, 収率63%)を得た。
ESI-MS m/z: 862 (M + H)+.
工程5
工程4で得られた(11Z,14Z)-(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエン-1-イル2-((ジメチルアミノメチル)-2-((9Z,12Z)- オクタデカ-9,12-ジエン-1-イル)イコサ-11,14-ジエノアート (0.072 g, 0.083 mmol)を用いて、実施例1工程2と同様にして、標記化合物 (0.052 g, 0.057 mmol, 収率68%)を得た。
ESI-MS m/z: 877 (M)+; 1H-NMR (CDCl3) δ:0.89 (t, J = 7.0 Hz, 9H), 1.09-1.42 (m, 52H), 1.52-1.81 (m, 6H), 2.05 (q, J = 6.8 Hz, 12H), 2.77 (t, J = 6.6 Hz, 6H), 3.46 (s, 9H), 3.79 (s, 2H), 4.14 (t, J = 6.8 Hz, 2H), 5.28-5.43 (m, 12H).
(11Z,14Z)-N,N,N-トリメチル-2,2-ビス(((9Z,12Z)- オクタデカ-9,12-ジエノイルオキシ)メチル)イコサ-11,14-ジエン-1-アミニウム クロリド (化合物II-16)
工程1
マロン酸ジメチル (東京化成工業社製,1.00 g, 7.57 mmol)をアセトニトリル (20 mL)に溶解させ、(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニル メタンスルホナート (2.61g,7.57 mmol)、炭酸セシウム (和光純薬工業社製, 4.93 g, 15.1 mmol)およびヨウ化テトラ-n-ブチルアンモニウム (2.80 g, 7.57 mmol)を加え、50℃で終夜攪拌した。反応液に水を加え、ヘキサンで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、ろ過し、減圧下濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(ヘキサン/酢酸エチル = 90/10〜70/30)で精製することで、ジメチル 2-((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエン-1-イル)マロナート (1.22 g, 3.21 mmol, 収率42%)を得た。
ESI-MS m/z: 381 (M + H)+.
工程2
工程1で得られたジメチル 2-((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエン-1-イル)マロナート (0.200 g, 0.526 mmol)をアセトニトリル(3 mL)に溶解させ、N,N,N',N'-テトラメチルジアミノメタン (東京化成工業社製, 0.0860 mL, 0.631 mmol)および無水酢酸 (0.0600 mL, 0.631 mmol)を加えた。その後、氷冷下水素化ナトリウム (油性, 60%, 0.0320 g, 0.788 mmol)を加え、室温で3時間攪拌した。反応液に飽和塩化アンモニウム水溶液を加え、酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、ろ過し、減圧下濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(ヘキサン/酢酸エチル = 100/0〜60/40)で精製することで、ジメチル 2-((ジメチルアミノ)メチル)-2-((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエン-1-イル)マロナート (0.0660 g, 0.151 mmol, 収率29%)を得た。
ESI-MS m/z: 438 (M + H)+.
工程3
工程2で得られたジメチル 2-((ジメチルアミノ)メチル)-2-((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエン-1-イル)マロナート (0.066 g, 0.15 mmol)を用いて、実施例19工程2と同様の方法にて、2-((ジメチルアミノ)メチル)-2-((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエン-1-イル)プロパン-1,3-ジオール (0.013 g, 0.034 mmol, 収率23%)を得た。
ESI-MS m/z: 382 (M + H)+.
工程4
工程3で得られた2-((ジメチルアミノ)メチル)-2-((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエン-1-イル)プロパン-1,3-ジオール (0.013 g, 0.034 mmol)を用いて、実施例20工程2と同様の方法にて、(9Z,9'Z,12Z,12')-2-((ジメチルアミノ)メチル)-2-((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエン-1-イル)プロパン-1,3-ジイル ビス(オクタデカ-9,12-ジエノアート (0.017 g, 0.019 mmol, 収率56%)を得た。
ESI-MS m/z: 906 (M + H)+.
工程5
工程4で得られた(9Z,9'Z,12Z,12'Z)-2-((ジメチルアミノ)メチル)-2-((9Z,12Z)- オクタデカ-9,12-ジエン-1-イル) プロパン-1,3-ジイル ビス(オクタデカ-9,12-ジエノアート (0.017 g, 0.019 mmol)を用いて、実施例1工程2と同様の方法にて、標記化合物 (5.5 mg, 0.0058 mmol, 収率31%)を得た。
ESI-MS m/z: 921 (M)+.1H-NMR (CDCl3) δ: 0.89 (t, J = 7.0 Hz, 9H), 1.23-1.40 (m, 48H), 1.53-1.65 (m, 4H), 2.05 (q, J = 6.9 Hz, 12H), 2.38 (t, J = 7.6 Hz, 4H), 2.77 (t, J= 6.6 Hz, 6H), 3.59 (s, 9H), 3.72 (s, 2H), 4.20 (dd, J = 22.1, 12.2 Hz, 4H), 5.28-5.44 (m, 12H).
N,N,N-トリメチル-3-((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエノイルオキシ)-2,2-ビス(((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエノイルオキシ)メチル)プロパン-1-アミニウム クロリド(化合物II-17)
工程1
2-(ブロモメチル)-2-(ヒドロキシメチル)プロパン-1,3-ジオール(0.200 g, 1.01 mmol)にジメチルアミン (Sigma-Aldrich社製, 2.0 mol/L テトラヒドロフラン溶液, 5.02 mL, 10.1 mmol)を加え、マイクロウェーブ照射下で120℃で15時間攪拌した。反応液に水酸化リチウム一水和物 (0.0290 g, 1.21 mmol)を加え、生じた沈殿をろ別した。ろ液を減圧下濃縮することで、2-((ジメチルアミノ)メチル)-2-(ヒドロキシメチル)プロパン-1,3-ジオールの粗生成物(0.200g, 1.23 mmol, 定量的)を得た。
ESI-MS m/z: 164 (M + H)+.
工程2
工程1で得られた2-((ジメチルアミノ)メチル)-2-(ヒドロキシメチル)プロパン-1,3-ジオールの粗生成物 (0.200 g, 1.23 mmol)を用い、実施例8と同様の方法にて、標題の化合物 (0.0470 g, 0.047 mmol 通し収率4.4%)を得た。
ESI-MS m/z: 965 (M)+; 1H-NMR (CDCl3) δ:0.85-0.94 (m, 9H), 1.24-1.40 (m, 42H), 1.53-1.63 (m, 6H), 2.00-2.10 (m, 12H), 2.38 (t, J = 6.9 Hz, 6H), 2.77 (t, J = 6.5 Hz, 6H), 3.64 (s, 9H), 3.95 (s, 2H), 4.30 (s, 6H), 5.27-5.43 (m, 12H).
N,N,N-トリメチル-3-(オレオイルオキシ)-2,2-ビス(オレオイルオキシメチル)プロパン-1-アミニウム クロリド (化合物II-18)
実施例8の工程1における(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエン酸の代わりにオレイン酸を用い、実施例8と同様の方法により標記の化合物 (0.663 g, 0.658 mmol, 通し収率28%) を得た。
ESI-MS m/z: 971 (M)+; 1H-NMR (CDCl3) δ: 0.88 (t, J = 6.8 Hz, 9H), 1.22-1.38 (m, 60H), 1.55-1.65 (m, 6H), 2.01 (q, J = 5.9 Hz, 12H), 2.38 (t, J = 7.6 Hz, 6H), 3.64 (s, 9H), 3.98 (s, 2H), 4.29 (s, 6H), 5.29-5.39 (m, 6H).
N,N,N-トリメチル-3-((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニルオキシ)-2,2-ビス(((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニルオキシ)メチル)プロパン-1-アミニウム クロリド (化合物II-19)
工程1
ジメチルアミン (約2 mol/Lテトラヒドロフラン溶液、15.0 mL、30.0 mmol) に2-(ブロモメチル)-2-(ヒドロキシメチル)プロパン-1,3-ジオール (1.52 g, 7.56 mmol) を加え、マイクロ波反応装置を用いて120℃で15時間加熱撹拌した。室温まで冷却後、反応液に水酸化リチウム (0.217 g, 9.07 mmol) を加え、ろ過し、減圧下濃縮することで2-((ジメチルアミノ)メチル)-2-(ヒドロキシメチル)プロパン-1,3-ジオールの粗生成物を得た。
得られた粗生成物に トルエン (30 mL)、(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニル メタンスルホナート (6.51 g, 18.9 mmol)および水素化ナトリウム (油性, 60%, 0.756 g, 18.9 mmol) を加え、加熱還流下で終夜撹拌した。室温まで冷却後、反応液に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加えてヘキサンで抽出した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、ろ過し、減圧下濃縮した。得られた残渣をアミノシリカゲルカラムクロマトグラフィー (ヘキサン/酢酸エチル = 100/0〜90/10) で精製して、N,N-ジメチル-3-((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニルオキシ)-2,2-ビス(((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニルオキシ)メチル)プロパン-1-アミン (0.196 g, 0.216 mmol, 3%) と 3-(ジメチルアミノ)-2,2-ビス(((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニルオキシ)メチル)プロパン-1-オール (1.80 g, 2.73 mmol, 収率36%) を得た。
N,N-ジメチル-3-((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニルオキシ)-2,2-ビス(((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニルオキシ)メチル)プロパン-1-アミン
ESI-MS m/z: 909 (M + H)+.
3-(ジメチルアミノ)-2,2-ビス(((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニルオキシ)メチル)プロパン-1-オール
ESI-MS m/z: 661 (M + H)+.
工程2
工程1で得られた N,N-ジメチル-3-((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニルオキシ)-2,2-ビス(((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニルオキシ)メチル)プロパン-1-アミン (0.120 g, 0.132 mmol) のクロロホルム (1 mL) 溶液にヨウ化メチル (0.500 mL) を加え、室温で3時間撹拌した。反応液を減圧下濃縮した。残渣を少量のメタノール-クロロホルム (1:1) に溶解してイオン交換樹脂 (Amberlite(R) IRA-400, Cl型, 約20倍量, 水およびエタノールでプレ洗浄)にロードし、メタノール-クロロホルム (1:1) で溶出した。溶出液を減圧下濃縮し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (クロロホルム/メタノール = 100/0〜90/10)で精製して標記の化合物 (0.0654 g, 0.0682 mmol, 収率57%) を得た。
ESI-MS m/z: 923 (M)+; 1H-NMR (CDCl3) δ: 0.89 (t, J = 6.8 Hz, 9H), 1.22-1.40 (m, 1H), 1.49-1.59 (m, 6H), 2.05 (q, J = 6.9 Hz, 12H), 2.77 (t, J = 6.7 Hz, 6H), 3.37 (t, J= 6.6 Hz, 6H), 3.45 (s, 6H), 3.55 (s, 9H), 3.58 (s, 2H), 5.28-5.42 (m, 12H).
N,N,N-トリメチル-3-((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエノイルオキシ)-2,2-ビス(((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニルオキシ)メチル)プロパン-1-アミニウム クロリド (化合物II-20)
実施例26工程1で得られた 3-(ジメチルアミノ)-2,2-ビス(((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニルオキシ)メチル)プロパン-1-オール (0.265 g, 0.401mmol) の1,2-ジロロエタン (4 mL) 溶液に (9Z, 12Z)-オクタデカ-9,12-ジエン酸 (0.169 g, 0.602 mmol)、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩 (0.154 g, 0.802 mmol) および N,N-ジメチルアミノピリジン (0.0250 g, 0.201 mmol) を加えて室温で終夜攪拌した。減圧下濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (ヘキサン/酢酸エチル = 95/5〜90/10)で精製して (9Z,12Z)-3-(ジメチルアミノ)-2,2-ビス(((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニルオキシ)メチル)プロピル オクタデカ-9,12-ジエノアートの粗生成物を得た。
得られた粗生成物にクロロホルム (2 mL) およびヨウ化メチル (東京化成工業社製, 1.00 mL) を加え、室温で5時間撹拌した。反応液を減圧下濃縮した。残渣を少量のメタノール-クロロホルム (1:1) に溶解してイオン交換樹脂 (Sigma-Aldirch社製, Amberlite(R) IRA-400, Cl型, 約20倍量, 水およびエタノールでプレ洗浄) にロードし、メタノール-クロロホルム (1:1) で溶出した。溶出液を減圧下濃縮し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (クロロホルム/メタノール = 100/0〜90/10)で精製して標記の化合物 (0.220 g, 0.226 mmol, 収率56%) を得た。
ESI-MS m/z: 937 (M)+; 1H-NMR (CDCl3) δ: 0.89 (t, J = 7.0 Hz, 9H), 1.22-1.41 (m, 51H), 1.50-1.66 (m, 6H), 2.05 (q, J = 6.9 Hz, 12H), 2.38 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 2.77 (t, J = 6.1 Hz, 6H), 3.39 (t, J = 6.6 Hz, 4H), 3.44-3.48 (m, 2H), 3.54-3.58 (m, 11H), 3.73 (s, 2H), 4.18 (s, 2H), 5.28-5.43 (m, 11H).
N,N,N-トリメチル-4-(2-(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエンアミド-3-((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエノイルオキシ)-2-(((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエノイルオキシ)メチル)プロポキシ)-4-オキシブタン-1-アミニウム クロリド (化合物II-21)
工程1
tert-ブチル (1,3-ジヒドロキシ-2-(ヒドロキシメチル)プロパン-2-イル)カルバマート (キーオーガニクス (Key Organics) 社製, 0.505 g, 2.28 mmol) のジクロロメタン (15 mL) 溶液に (9Z, 12Z)-オクタデカ-9,12-ジエン酸 (3.23 g, 11.4 mmol)、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩 (2.19 g, 11.4 mmol) および N,N-ジメチルアミノピリジン (0.279 g, 2.28 mmol) を加えて室温で1時間攪拌した。反応液に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加えてクロロホルムで抽出した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、ろ過し、減圧下濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (ヘキサン/クロロホルム = 100/0〜95/5) で精製して(9Z,9'Z,12Z,12'Z)-2-(tert-ブトキシカルボニルアミノ-2-(((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエノイルオキシ)メチル)プロパン-1,3-ジイル ジオクタデカ-9,12-ジエノアート (2.08 g, 2.06 mmol, 収率90%) を得た。
1H-NMR (CDCl3) δ: 0.89 (t, J = 6.7 Hz, 9H), 1.23-1.40 (m, 9H), 1.43 (s, 9H), 1.57-1.66 (m, 14H), 2.05 (q, J = 6.8 Hz, 12H), 2.32 (t, J = 7.6 Hz, 6H), 2.77 (t, J = 6.5 Hz, 6H), 4.34 (s, 6H), 4.81 (br s, 1H), 5.28-5.43 (m, 12H).
工程2
工程1で得られた (9Z,9'Z,12Z,12'Z)-2-(tert-ブトキシカルボニルアミノ-2-(((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエノイルオキシ)メチル)プロパン-1,3-ジイル ジオクタデカ-9,12-ジエノアート (2.05 g, 2.03 mmol, 90%) のジクロロメタン (10 mL) 溶液にトリフルオロ酢酸 (2 mL, 26.0 mmol) を加えて室温で1時間攪拌した。反応液に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加えてクロロホルムで抽出した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、ろ過し、減圧下濃縮した。得られた残渣をアミノシリカゲルカラムクロマトグラフィー (ヘキサン/酢酸エチル = 100/0〜95/5)で精製して (9Z,9'Z,12Z,12'Z)-2-(ヒドロキシメチル)-2-(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエンアミドプロパン-1,3-ジイル ジオクタデカ-9,12-ジエノアート (1.70 g, 1.84 mmol, 収率91%) を得た。
ESI-MS m/z: 909 (M + H)+.
工程3
工程2で得られた (9Z,9'Z,12Z,12'Z)-2-(ヒドロキシメチル)-2-(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエンアミドプロパン-1,3-ジイル ジオクタデカ-9,12-ジエノアート (0.8933 g, 0.983 mmol) のジクロロメタン (9 mL) 溶液に (9Z, 12Z)-オクタデカ-9,12-ジエン酸 (Sigma-Aldrich社製, 2.37 g, 8.45 mmol)、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩 (１.62 g, 8.45 mmol) および N,N-ジメチルアミノピリジン(0.206 g, 1.69 mmol) を加えて室温で2時間攪拌した。減圧下濃縮した。得られた残渣をアミノシリカゲルカラムクロマトグラフィー (ヘキサン/酢酸エチル = 90/10〜75/25) で精製して (9Z,9'Z,12Z,12'Z)-2-((4-(ジメチルアミノ)ブタノイルオキシ)メチル)-2-(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエンアミドプロパン-1,3-ジイル ジオクタデカ-9,12-ジエノアート (0.900 g, 0.881 mmol, 収率90%) を得た。
ESI-MS m/z: 1022 (M + H)+.
工程4
工程3で得られた (9Z,9'Z,12Z,12'Z)-2-((4-(ジメチルアミノ)ブタノイルオキシ)メチル)-2-(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエンアミドプロパン-1,3-ジイル ジオクタデカ-9,12-ジエノアート (0.805 g, 0.788 mmol) のクロロホルム (4 mL) 溶液にヨウ化メチル (0.493 mL) を加え、室温で終夜撹拌した。反応液を減圧下濃縮した。残渣を少量のメタノール-クロロホルム (1:1) に溶解してイオン交換樹脂 (Dowex(TM) 1x-2 100 mesh, Cl型, 約20倍量, 水およびメタノールでプレ洗浄) にロードし、メタノール-クロロホルム (1:1) で溶出した。溶出液を減圧下濃縮し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (クロロホルム/メタノール = 90/10〜80/20)で精製して標記の化合物 (0.740 g, 0.690 mmol, 収率88%)を得た。
ESI-MS m/z: 1036 (M)+; 1H-NMR (CDCl3) δ: 0.88 (t, J = 6.4 Hz, 9H), 1.21-1.40 (m, 45H), 1.54-1.65 (m, 6H), 2.01-2.08 (m, 12H), 2.09-2.19 (m, 2H), 2.24 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 2.32 (t, J= 7.5 Hz, 4H), 2.57 (t, J = 6.2 Hz, 2H), 2.77 (t, J = 6.3 Hz, 6H), 3.41 (s, 9H), 3.84 (t, J = 8.3 Hz, 2H), 4.37-4.50 (m, 6H), 5.28-5.43 (m, 12H), 6.72 (br s, 1H).
4-(1,3-ビス((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエノイルオキシ)-2-(((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエノイルオキシ)メチル)プロパン-2-イルアミノ)-N,N,N-トリメチル-4-オキソブタン-1-アミニウム クロリド (化合物II-22)
工程1
2-アミノ-2-(ヒロドキシメチル)-1,3-プロパンジオール (和光純薬工業社製, 7.41 g, 61.2 mmol) のジクロロメタン (60 mL) 溶液にtert-ブチルジメチルシリル クロリド (Sigma-Aldrich社製, 9.43 g, 60.7 mmol) およびイミダゾール (ナカライテスク社製, 5.51 g, 80.9 mmol) を加え、室温で終夜撹拌した。反応液に飽和食塩水を加えてクロロホルムで抽出した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、ろ過し、減圧下濃縮した。得られた残渣をアミノシリカゲルカラムクロマトグラフィー (ヘキサン/酢酸エチル = 100/0〜95/5) で精製して 6-((tert-ブチルジメチルシリルオキシ)メチル)-2,2,3,3,9,9,10,10-オクタメチル-4,8-ジオキサ-3,9-ジシラウンデカン-6-アミン (3.80 g, 8.19 mmol, 収率40%) を得た。
ESI-MS m/z: 464 (M + H)+.
工程2
工程1で得られた 6-((tert-ブチルジメチルシリルオキシ)メチル)-2,2,3,3,9,9,10,10-オクタメチル-4,8-ジオキサ-3,9-ジシラウンデカン-6-アミン(1.28 g, 2.76 mmol) のジクロロメタン (10 mL) 溶液に 4-(ジメチルアミノ)酪酸塩酸塩 (Sigma-Aldrich社製, 0.708 g, 4.14 mmol)、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩 (0.810 g, 4.14 mmol)、N,N-ジメチルアミノピリジン (0.0170 g, 0.138 mmol) および N,N‐ジイソプロピルエチルアミン (1.45 mL, 8.31 mmol) を加えて室温で終夜攪拌した。減圧下濃縮した。得られた残渣をアミノシリカゲルカラムクロマトグラフィー (ヘキサン/酢酸エチル = 95/5〜90/10) で精製して N-(6-((tert-ブチルジメチルシリルオキシ)メチル)-2,2,3,3,9,9,10,10-オクタメチル-4,8-ジオキサ-3,9-ジシラウンデカン-6-イル)-4-(ジメチルアミノ)ブタンアミド (1.22 g, 2.11 mmol, 収率76%) を得た。
ESI-MS m/z: 578 (M + H)+.
工程3
工程2で得られた N-(6-((tert-ブチルジメチルシリルオキシ)メチル)-2,2,3,3,9,9,10,10-オクタメチル-4,8-ジオキサ-3,9-ジシラウンデカン-6-イル)-4-(ジメチルアミノ)ブタンアミド (1.08 g, 1.87 mmol) のテトラヒドロフラン (10 mL) 溶液にテトラブチルアンモニウム フルオリド (東京化成工業社製, 約 1 mol/L テトラヒドロフラン溶液、7.49 mL、7.49 mmol) を加え、室温で2時間攪拌した。反応液に (9Z, 12Z)-オクタデカ-9,12-ジエン酸 (2.05 g, 7.31 mmol)、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩 (１.44 g, 7.51 mmol) および N,N-ジメチルアミノピリジン (0.0340 g, 0.278 mmol) を加えて室温で終夜攪拌した。減圧下濃縮した。得られた残渣をアミノシリカゲルカラムクロマトグラフィー (ヘキサン/酢酸エチル = 60/40〜50/50) で精製して (9Z,9'Z,12Z,12'Z)-2-(4-(ジメチルアミノ)ブタンアミド)-2-(((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエノイルオキシ)メチル)プロパン-1,3-ジイル ジオクタデカ-9,12-ジエノアート (0.405 g, 0.396 mmol, 収率21%) を得た。
ESI-MS m/z: 1022 (M + H)+.
工程4
工程3で得られた (9Z,9'Z,12Z,12'Z)-2-(4-(ジメチルアミノ)ブタンアミド)-2-(((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエノイルオキシ)メチル)プロパン-1,3-ジイル ジオクタデカ-9,12-ジエノアート (0.335 g, 0.328 mmol) の クロロホルム (3 mL) 溶液にヨウ化メチル (東京化成工業社製, 0.200 mL) を加え、室温で2時間撹拌した。反応液を減圧下濃縮した。残渣を少量のメタノール-クロロホルム (1:1) に溶解してイオン交換樹脂 (Dowex(TM) 1x-2 100 mesh, Cl型, 約20倍量, 水およびメタノールでプレ洗浄) にロードし、メタノール-クロロホルム (1:1) で溶出した。溶出液を減圧下濃縮し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (クロロホルム/メタノール = 90/10〜80/20) で精製して標記の化合物 (0.324 g, 0.302 mmol, 収率92%)を得た。
ESI-MS m/z: 1036 (M)+; 1H-NMR (CDCl3) δ: 0.89 (t, J = 7.0 Hz, 9H), 1.23-1.40 (m, 45H), 1.55-1.64 (m, 6H), 2.01-2.12 (m, 14H), 2.34 (t, J = 7.6 Hz, 6H), 2.43 (t, J = 6.3 Hz, 2H), 2.77 (t, J = 6.6 Hz, 6H), 3.37 (s, 9H), 3.77-3.83 (m, 2H), 4.43 (s, 6H), 5.28-5.42 (m, 12H), 6.62 (br s, 1H).
2-(1,3-ビス((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエノイルオキシ)-2-(((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエノイルオキシ)メチル)プロパン-2-イルアミノ)-N,N,N-トリメチル-2-オキソエタンアミニウム クロリド (化合物II-23)
実施例29と同様の方法で、4-(ジメチルアミノ)酪酸 塩酸塩の代わりに N,N-ジメチルグリシン (東京化成工業社製) を用い、標記の化合物 (0.356 g, 0.341 mmol, 通し収率17%)を得た。
ESI-MS m/z: 1008 (M)+; 1H-NMR (CDCl3) δ: 0.89 (t, J = 7.0 Hz, 9H), 1.23-1.40 (m, 44H), 1.54-1.64 (m, 26H), 2.01-2.08 (m, 12H), 2.35 (t, J= 7.6 Hz, 6H), 2.77 (t, J = 6.8 Hz, 6H), 3.40 (s, 9H), 4.46 (s, 6H), 4.70 (s, 2H), 5.28-5.42 (m, 12H), 9.54 (br s, 1H).
4-((6Z,9Z,29Z,32Z)-20-ヒドロキシ-20-((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニル)オクタトリアコンタ-6,9,29,32-テトラエン-19-イルオキシ)-N,N,N-トリメチル-4-オキソブタン-1-アミニウム クロリド (化合物III-1)
米国特許出願公開第2012/0172411号明細書に記載の方法に準じた方法で得られた(6Z,9Z,29Z,32Z)-20-ヒドロキシ-20-((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニル)オクタトリアコンタ-6,9,29,32-テトラエン-19-イル 4-(ジメチルアミノ)ブタノアート (0.144 g, 0.156 mmol)を用いて、実施例1の工程2と同様の方法で標記の化合物 (0.146 g, 0.150 mmol, 収率96%) を得た。
ESI-MS m/z: 935 (M)+; 1H-NMR (CDCl3) δ: 0.89 (t, J = 6.9 Hz, 9H), 1.16-1.79 (m, 60H), 1.98-2.17 (m, 15H), 2.52-2.59 (m, 2H), 2.77 (t, J = 6.6 Hz, 6H), 3.44 (s, 9H), 3.69-3.81 (m, 2H), 4.94-4.98 (m, 1H), 5.29-5.42 (m, 12H).
(6Z,9Z,28Z,31Z)-N,N-ジメチル-N-((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニル)ヘプタトリアコンタ-6,9,28,31-テトラエン-19-アミニウム クロリド (化合物IV-1)
工程1
国際公開第2010/042877号に記載の方法に準じた方法で得られた(6Z,9Z,28Z,31Z)-ヘプタトリアコンタ-6,9,28,31-テトラエン-19-オン (0.194 g, 0.368 mmol)の1,2-ジクロロエタン (2 mL)溶液にメチルアミン (東京化成工業社製, 約40%メタノール溶液, 0.110 mL, 1.1 mmol)と酢酸 (0.063 mL, 1.1 mmol)を加えた。さらにナトリウムトリアセトキシボロヒドリド (0.117 g, 0.552 mmol)を添加した後、室温で2時間撹拌した。反応液にメチルアミン (約40%メタノール溶液, 0.110 mL, 1.1 mmol)、酢酸 (0.063 mL, 1.1 mmol)、およびナトリウムトリアセトキシボロヒドリド (0.117 g, 0.552 mmol)を加え、2時間撹拌した。反応液に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加えてヘキサンで2回抽出した。有機層を合わせ、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、ろ過し、減圧下濃縮した。得られた残渣をカラムクロマトグラフィー (クロロホルム/メタノール = 100/0〜90/10) で精製して(6Z,9Z,28Z,31Z)-N-メチルヘプタトリアコンタ-6,9,28,31-テトラエン-19-アミン (0.121 g, 0.223 mmol, 収率61%)を得た。
ESI-MS m/z: 543 (M + H)+.
工程2
工程1で得られた(6Z,9Z,28Z,31Z)-N-メチルヘプタトリアコンタ-6,9,28,31-テトラエン-19-アミン (0.121 g, 0.223 mmol)に(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニル メタンスルホナート (0.154 g, 0.446 mmol) および50%水酸化ナトリウム水溶液 (0.107 g, 1.34 mmol) を加え、油浴上135℃で2時間攪拌した。反応液を室温まで冷却し、飽和食塩水を加え、ヘキサンで洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、ろ過し、減圧下濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (ヘキサン/酢酸エチル = 100/0〜85/15)で精製することにより、(6Z,9Z,28Z,31Z)-N-メチル-N-((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニル)ヘプタトリアコンタ-6,9,28,31-テトラエン-19-アミン (0.139 g, 0.175 mmol, 収率79%)を得た。
ESI-MS m/z: 792 (M + H)+.
工程3
工程2で得られた(6Z,9Z,28Z,31Z)-N-メチル-N-((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニル)ヘプタトリアコンタ-6,9,28,31-テトラエン-19-アミン (0.139 g, 0.175 mmol)を用い、実施例1工程2と同様にして、標記化合物 (0.114 g, 0.135 mmol, 収率77%)を得た。
ESI-MS m/z: 806 (M)+; 1H-NMR (CDCl3) δ: 0.89 (t, J = 7.0 Hz, 9H), 1.26-1.56 (m, 54H), 1.65-1.73 (m, 2H), 1.80-1.88 (m, 2H), 2.05 (q, J = 7.0 Hz, 12H), 2.77 (t, J = 6.3 Hz, 6H), 3.22-3.27 (m, 1H), 3.31 (s, 6H), 3.58-3.62 (m, 2H), 5.29-5.42 (m, 12H).
N,N,N-トリメチル-3-(パルミトイルオキシ)-2,2-ビス((パルミトイルオキシ)メチル)プロパン-1-アミニウム クロリド(化合物II-24)
工程1
実施例24の工程1で得られた2-((ジメチルアミノ)メチル)-2-(ヒドロキシメチル)プロパン-1,3-ジオール (0.420 g,2.57 mmol)の1,2-ジクロロエタン (5 mL)溶液に、ピリジン (3.12 mL, 38.6 mmol)を加えた後、室温にてパルミトイル クロリド (東京化成工業社製, 6.22 mL, 20.6 mmol)を加え、70℃で2時間攪拌した。反応液を室温まで冷却し、水を加え、酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、ろ過した。減圧下濃縮し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (クロロホルム)で精製することにより、2-((ジメチルアミノ)メチル)-2-((パルミトイルオキシ)メチル)プロパン-1,3-ジイル ジパルミタート (0.650 g, 0.740 mmol, 収率29%)を得た。
ESI-MS m/z: 879 (M + H)+
工程2
工程1で得られた2-((ジメチルアミノ)メチル)-2-((パルミトイルオキシ)メチル)プロパン-1,3-ジイル ジパルミタート (0.65 g, 0.74 mmol)を用い、実施例1工程2と同様にして、標記化合物 (0.056 g, 0.060 mmol, 収率8%)を得た。
ESI-MS m/z: 893 (M)+; 1H-NMR (CDCl3) δ: 0.88 (t, J= 7.0 Hz, 9H), 1.21-1.34 (m, 72H), 1.54-1.64 (m, 6H), 2.38 (t, J = 7.6 Hz, 6H), 3.62 (s, 9H), 3.95 (s, 2H), 4.29 (s, 6H).
N,N,N-トリメチル-3-(テトラデカノイルオキシ)-2,2-ビス((テトラデカノイルオキシ)メチル)プロパン-1-アミニウム クロリド(化合物II-25)
実施例33と同様の方法で、パルミトイル クロリドの代わりにミリストイル クロリド (和光純薬工業) を用い、標記の化合物 (0.045 g, 0.053 mmol, 通し収率4%)を得た。
ESI-MS m/z: 809 (M)+; 1H-NMR (CDCl3) δ: 0.88 (t, J= 6.8 Hz, 9H), 1.21-1.34 (m, 60H), 1.54-1.64 (m, 6H), 2.38 (t, J = 7.6 Hz, 6H), 3.64 (s, 9H), 3.96 (s, 2H), 4.29 (s, 6H).
3-(ドデカノイルオキシ)-2,2-ビス((ドデカノイルオキシ)メチル)-N,N,N-トリメチルプロパン-1-アミニウム クロリド(化合物II-26)
実施例33と同様の方法で、パルミトイル クロリドの代わりにラウロイル クロリド(東京化成工業社製) を用い、標記の化合物 (0.085 g, 0.112 mmol, 通し収率9%) を得た。
ESI-MS m/z: 725 (M)+; 1H-NMR (CDCl3) δ: 0.88 (t, J= 6.8 Hz, 9H), 1.19-1.34 (m, 48H), 1.54-1.64 (m, 6H), 2.38 (t, J = 7.6 Hz, 6H), 3.66 (s, 9H), 3.97 (s, 2H), 4.30 (s, 6H).
(Z)-N,N,N-トリメチル-3,3-ビス((オレオイロキシ)メチル)ヘニコサ-12-エン-1-アミニウム クロリド(化合物II-27)
工程1
マロン酸ジメチル (1.00 g, 7.57 mmol)をアセトニトリル (25 mL)に溶解させ、(Z)-オクタ-9-エン-1-イル メタンスルホナート(3.15g, 9.08 mmol)、炭酸セシウム (4.93 g, 15.1 mmol)およびヨウ化テトラブチルアンモニウム (3.35 g, 9.08 mmol)を加え、60℃で1時間攪拌した。反応液に水を加え、ヘキサンで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、ろ過し、減圧下濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (ヘキサン/酢酸エチル = 90/10〜70/30)で精製することで、(Z)-ジメチル 2-(オクタデカ-9-エン-1-イル)マロナート (2.54 g, 6.64 mmol, 収率88%)を得た。
ESI-MS m/z: 383 (M + H)+
工程2
工程1で得られた(Z)-ジメチル 2-(オクタデカ-9-エン-1-イル)マロナート (0.500 g, 1.31 mmol)をトルエン (6 mL)に溶解させ、氷冷下水素化ナトリウム (油性, 60%, 0.209 g, 5.23 mmol)を加え、発泡が無くなるまで撹拌した。次いで2-クロロ-N,N-ジメチルエタンアミン 塩酸塩 (東京化成工業社製, 0.377 g, 2.61 mmol)を加え、100℃で2時間攪拌した。氷冷下反応液に水を加え、クロロホルムで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、ろ過し、減圧下濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(クロロホルム/メタノール = 99/1〜90/10)で精製することで、(Z)-ジメチル 2-(2-(ジメチルアミノ)エチル)-2-(オクタデカ-9-エン-1-イル)マロナート (0.258 g, 0.569 mmol, 収率44%)を得た。
ESI-MS m/z: 454 (M + H)+
工程3
実施例19の工程2と同様の方法で、工程2で得られた(Z)-ジメチル 2-(2-(ジメチルアミノ)エチル)-2-(オクタデカ-9-エン-1-イル)マロナート (0.250 g, 0.551 mmol)を用い、(Z)-2-(2-(ジメチルアミノ)エチル)-2-(オクタデカ-9-エン-1-イル)プロパン-1,3-ジオール (0.220 g, 0.553mmol, 定量的)を得た。
ESI-MS m/z: 398 (M + H)+
工程4
工程3で得られた(Z)-2-(2-(ジメチルアミノ)エチル)-2-(オクタデカ-9-エン-1-イル)プロパン-1,3-ジオール (0.220 g, 0.553mmol)をジクロロメタン(2 mL)に溶解し、N,N-ジイソプロピルエチルアミン(0.386 mL, 2.21 mmol)を加え、氷冷下オレオイルクロリド (Sigma-aldrich社製, 0.457 mL, 1.38 mmol)を加え、室温で10分間撹拌した。反応液に水を加え、ヘキサンで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、ろ過し、減圧下濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(ヘキサン/酢酸エチル = 90/10〜50/50)で精製することで、(Z)-2-(2-(ジメチルアミノ)エチル)-2-((Z)-オクタデカ-9-エン-1-イル)プロパン-1,3-ジイル ジオレアート (0.280 g, 0.302 mmol, 収率55%)を得た。
ESI-MS m/z: 927 (M + H)+
工程5
工程4で得られた(Z)-2-(2-(ジメチルアミノ)エチル)-2-((Z)-オクタデカ-9-エン-1-イル)プロパン-1,3-ジイル ジオレアート (0.280 g, 0.302 mmol)を用い、実施例1工程2と同様にして、標記化合物 (0.199 g, 0.204 mmol, 収率67%)を得た。
ESI-MS m/z: 941 (M)+; 1H-NMR (CDCl3) δ: 0.88 (t, J = 7.0 Hz, 9H), 1.22-1.39 (m, 66H), 1.55-1.65 (m, 4H), 1.70-1.78 (m, 2H), 1.98-2.06 (m, 12H), 2.33 (t, J= 7.6 Hz, 4H), 3.46 (s, 9H), 3.58-3.65 (m, 2H), 3.93-4.03 (m, 4H), 5.29-5.39 (m, 6H).
(Z)-N,N,N-トリメチル-4,4-ビス((オレオイルオキシ)メチル)ドコサ-13-エン-1-アミニウム クロリド(化合物II-28)
工程1
実施例36の工程2と同様の方法で、2-クロロ-N,N-ジメチルエタンアミン 塩酸塩の代わりに3-クロロ-N,N-ジメチルプロパン-1-アミン 塩酸塩(東京化成工業社製)を
用い、(Z)-ジメチル 2-(3-(ジメチルアミノ)プロピル)-2-(オクタデカ-9-エン-1-イル)マロナート (0.210 g, 0.449 mmol, 収率34%)を得た。
ESI-MS m/z: 468 (M + H)+
工程2
実施例36の工程3、4、5と同様の方法で、(Z)-ジメチル 2-(2-(ジメチルアミノ)エチル)-2-(オクタデカ-9-エン-1-イル)マロナートの代わりに工程1で得られた(Z)-ジメチル2-(3-(ジメチルアミノ)プロピル)-2-(オクタデカ-9-エン-1-イル)マロナート (0.210 g, 0.449 mmol)を用い、標記化合物 (0.042 g, 0.042 mmol, 通し収率9%)を得た。
ESI-MS m/z: 955 (M)+; 1H-NMR (CDCl3) δ: 0.88 (t, J = 6.8 Hz, 9H), 1.22-1.36 (m, 68H), 1.56-1.64 (m, 4H), 1.72-1.82 (m, 2H),1.96-2.07 (m, 12H), 2.32 (t, J= 7.5 Hz, 4H), 3.38 (s, 9H), 3.39-3.46 (m, 2H), 3.93 (d, J = 11.2 Hz, 2H), 3.99 (d, J = 11.2 Hz, 2H), 5.28-5.40 (m, 6H).
N,N,N-トリメチル-3-(ステアロイルオキシ)-2,2-ビス((ステアロイルオキシ)メチル)プロパン-1-アミニウム クロリド(化合物II-29)
実施例33と同様の方法で、パルミトイル クロリドの代わりにステアロイル クロリド(東京化成工業社製) を用い、標記の化合物 (0.085 g, 0.112 mmol, 通し収率6%) を得た。
ESI-MS m/z: 977 (M)+; 1H-NMR (CDCl3) δ: 0.88 (t, J= 6.8 Hz, 9H), 1.21-1.37 (m, 84H), 1.54-1.64 (m, 6H), 2.38 (t, J = 7.6 Hz, 6H), 3.65 (s, 9H), 3.96 (s, 2H), 4.30 (s, 6H).
N,N,N-トリメチル-3-オレアミド-2,2-ビス((オレオイルオキシ)メチル)プロパン-1-アミニウム クロリド(化合物II-30)
工程1
実施例24の工程1で得られた2-((ジメチルアミノ)メチル)-2-(ヒドロキシメチル)プロパン-1,3-ジオール (0.410 g,2.51 mmol)をジクロロメタン (5 mL)、ピリジン (5.08 mL, 62.8 mmol)の混合溶媒に溶解した。氷冷下、オレオイル クロリド (1.25 mL, 3.77 mmol)を加えた。反応液に水を加え、クロロホルムで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、ろ過した。減圧下濃縮し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (クロロホルム/メタノール=99/1〜90/10)で精製することにより、(Z)-2-((ジメチルアミノ)メチル)-2-(ヒドロキシメチル)プロパン-1,3-ジイル ジオレアート (0.190 g, 0.275 mmol, 収率11%)を得た。
ESI-MS m/z: 693 (M + H)+
工程2
工程1で得られた(Z)-2-((ジメチルアミノ)メチル)-2-(ヒドロキシメチル)プロパン-1,3-ジイル ジオレアート (0.190 g,2.51 mmol)をトルエン (2 mL)に溶解し、室温でジフェニルリン酸アジド (東京化成工業社製, 0.118 mL, 0.549 mmol)と1,8-ジアザビシクロ[5.4.0]-7-ウンデセン(0.0830 mL,0.549 mmol)を加え、1時間撹拌した。反応の進行が不十分であったので、ジフェニルリン酸アジド (0.118 mL, 0.549 mmol)を追加し、80℃で3時間加熱撹拌した。反応液を室温まで冷却し、水を加え、酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、ろ過した。減圧下濃縮し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (ヘキサン/酢酸エチル=95/5〜60/40)で精製することにより、(Z)-2-(アジドメチル)-2-((ジメチルアミノ)メチル)プロパン-1,3-ジイル ジオレアート (0.135 g, 0.188 mmol, 収率69%)を得た。
ESI-MS m/z: 718 (M + H)+
工程3
工程2で得られた(Z)-2-(アジドメチル)-2-((ジメチルアミノ)メチル)プロパン-1,3-ジイル ジオレアート (0.135 g,2.51 mmol)をテトラヒドロフラン (1 mL)と水(0.1 mL)の混合溶液に溶解し、トリフェニルホスフィン (純正化学工業社製, 0.0740 g, 0.282 mmol)を加え、3時間撹拌した。反応液に水を加え、酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、ろ過した。減圧下濃縮することにより、(Z)-2-(アミノエチル)-2-((ジメチルアミノ)メチル)プロパン-1,3-ジイル ジオレアートの粗生成物 (0.130 g, 0.188 mmol, 収率100%)を得た。
ESI-MS m/z: 691 (M + H)+
工程4
工程3で得られた(Z)-2-(アミノエチル)-2-((ジメチルアミノ)メチル)プロパン-1,3-ジイル ジオレアート (0.130 g,0.188 mmol)のジクロロメタン (2 mL)溶液に、N,N-ジイソプロピルエチルアミン (0.0990 mL, 0.564 mmol)を加え、氷冷下オレオイルクロリド (0.0850 g, 0.282 mmol)を加えて、室温で1時間撹拌した。反応液に水を加え、ヘキサンで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、ろ過した。減圧下濃縮し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (ヘキサン/酢酸エチル=97/3〜60/40)で精製することにより、(Z)-2-((ジメチルアミノ)メチル)-2-(オレアミドメチル)プロパン-1,3-ジイル ジオレアート (0.105 g, 0.110 mmol, 収率58%)を得た。
ESI-MS m/z: 956 (M + H)+
工程5
工程4で得られた(Z)-2-((ジメチルアミノ)メチル)-2-(オレアミドメチル)プロパン-1,3-ジイル ジオレアート (0.105 g, 0.110 mmol)を用い、実施例1工程2と同様にして、標記化合物(0.0480 g, 0.0480 mmol, 収率43%)を得た。
ESI-MS m/z: 970 (M)+;1H-NMR (CDCl3) δ: 0.88 (t, J = 6.8 Hz, 9H), 1.21-1.37 (m, 60H), 1.56-1.65 (m, 6H), 1.96-2.05 (m, 12H), 2.36 (t, J= 7.6 Hz, 6H), 3.51 (s, 9H), 3.51-3.56 (m, 2H), 4.02 (s, 2H), 4.20 (d, J= 12.2 Hz, 2H), 4.30 (d, J = 12.2 Hz, 2H), 5.27-5.40 (m, 6H), 8.11-8.20 (m, 1H).
N,N,N-トリメチル-4-(オレオイルオキシ)-3,3-ビス(オレオイルオキシメチル)ブタン-1-アミニウム クロリド (化合物II-31)
工程1
2-(ブロモメチル)-2-(ヒドロキシメチル)プロパン-1,3-ジオール (東京化成工業社製, 1.00 g, 5.02 mmol) のテトラヒドロフラン (10 mL) 溶液に、tert -ブチルジメチルクロロシラン (東京化成工業社製, 3.79 g, 25.1 mmol)、イミダゾール (ナカライテスク社製, 3.42 g, 50.2 mmol)、N,N-ジメチルアミノピリジン (0.061 g, 0.502 mmol) を加えて、室温にて終夜攪拌した。反応液に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加えてヘキサンで2回抽出した。有機層を、無水硫酸マグネシウムで乾燥後、減圧下濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (ヘキサン) で精製することにより6-(ブロモメチル)-6-((tert-ブチルジメチルシリルオキシ)メチル)-2,2,3,3,9,9,10,10-オクタメチル-4,8-ジオキサ-3,9-ジシラウンデカン (2.50 g, 4.61 mmol, 92%)を得た。
1H-NMR (CDCl3) δ: 0.04 (s, 18H), 0.89 (s, 27H), 3.41 (s, 2H), 3.49 (s, 6H).
工程2
工程1で得られた6-(ブロモメチル)-6-((tert-ブチルジメチルシリルオキシ)メチル)-2,2,3,3,9,9,10,10-オクタメチル-4,8-ジオキサ-3,9-ジシラウンデカン (1.849 g, 3.41 mmol) のジメチルスルホキシド (10 mL) 溶液に、シアン化ナトリウム (ナカライテスク社製, 0.529 g, 10.8 mmol) を加えて、85℃にて3日間攪拌した。室温まで冷却後、反応液をヘキサンで希釈し、水、ついで飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥後ろ過し、減圧濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (ヘキサン/酢酸エチル = 90/10)で精製することにより、4-(tert-ブチルジメチルシリルオキシ)-3,3-ビス((tert-ブチルジメチルシリルオキシ)メチル)ブタンニトリル (1.35 g, 2.77 mmol, 収率81%)を得た。
ESI-MS m/z: 489 (M + H)+; 1H-NMR (CDCl3) δ: 0.05 (s, 18H), 0.89 (s, 27H), 2.34 (s, 2H), 3.51 (s, 6H).
工程3
工程2で得られた 4-(tert-ブチルジメチルシリルオキシ)-3,3-ビス((tert-ブチルジメチルシリルオキシ)メチル)ブタンニトリル (1.34 g, 2.75 mmol) のテトラヒドロフラン (10 mL) 溶液に、氷冷下、水素化アルミニウムリチウム (0.104 g, 2.75 mmol) を加え、室温にて2時間攪拌した。反応液に水 (0.495 mL, 27.5 mmol) とフッ化ナトリウム (3.46 g, 82.0 mmol) を加え、室温にて終夜攪拌した。不溶物をセライト濾過にて除去し、濾液を濃縮した。得られた残渣をアミノシリカゲルカラムクロマトグラフィー (酢酸エチル) で精製することにより、4-(tert-ブチルジメチルシリルオキシ)-3,3-ビス((tert-ブチルジメチルシリルオキシ)メチル)ブタン-1-アミン (0.435 g, 0.884 mmol, 収率32%) を得た。
ESI-MS m/z: 493 (M + H)+; 1H-NMR (CDCl3) δ: 0.02 (s, 18H), 0.88 (s, 27H), 1.38-1.43 (m, 2H), 2.71-2.75 (m, 2H), 3.40 (s, 6H).
工程4
工程3で得られた 4-(tert-ブチルジメチルシリルオキシ)-3,3-ビス((tert-ブチルジメチルシリルオキシ)メチル)ブタン-1-アミン (0.200 g, 0.407 mmol) の 1,2-ジクロロエタン (3 mL) 溶液に、38%ホルムアルデヒド水溶液 (0.295 mL)、ナトリウムトリアセトキシボロヒドリド (0.431 g, 2.03 mmol)を加え、室温で終夜攪拌した。反応液に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加えて、クロロホルムで2回抽出した。有機層を、無水硫酸マグネシウムで乾燥後、減圧下濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (クロロホルム/メタノール = 90/10) で精製することで、4-(tert-ブチルジメチルシリルオキシ)-3,3-ビス((tert-ブチルジメチルシリルオキシ)メチル)-N,N-ジメチルブタン-1-アミンの粗生成物を得た。
得られた粗生成物にテトラヒドロフラン (2 mL) および テトラブチルアンモニウム フルオリド (東京化成工業社製, 約 1 mol/L テトラヒドロフラン溶液, 2.06 mL, 2.06 mmol) を加え、室温で5時間攪拌した後、60℃て終夜攪拌した。反応液に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加えて、クロロホルムで2回洗浄した。水層を減圧下濃縮した。得られた残渣にアセトン (2 mL)、水酸化ナトリウム (和光純薬工業社製, 2 mol/L 水溶液, 3 mL, 6 mmol)、オレオイル クロリド ( 0.681 mL, 2.06 mmol) を加え、室温にて3時間攪拌した。反応液にオレオイル クロリド (0.681 mL, 2.06 mmol) を加え、60℃にて終夜攪拌した。室温まで冷却後、反応液に水を加え、クロロホルムで2回抽出した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥後ろ過し、減圧濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (クロロホルム/メタノール = 90/10)で精製することで、(Z)-2-(2-(ジメチルアミノ)エチル)-2-(オレイルオキシメチル)プロパン-1,3-ジイルジオレートの粗生成物を得た。得られた粗生成物を少量のメタノール-クロロホルム (9:1) に溶解してイオン交換樹脂 (ウォーターズ (Waters) 製, PoraPack Rxn CX, メタノールでプレ洗浄) にロードし、アンモニア (Sigma-Aldirch社製, 2 mol/L メタノール溶液) で溶出した。溶出液を減圧下濃縮し、(Z)-2-(2-(ジメチルアミノ)エチル)-2-(オレイルオキシメチル)プロパン-1,3-ジイルジオレート (0.387 g, 0.399 mmol, 収率98%) を得た。
ESI-MS m/z: 971 (M + H)+; 1H-NMR (CDCl3) δ: 0.88 (t, J = 7.0 Hz, 9H), 1.21-1.38 (m, 62H), 1.54-1.65 (m, 6H), 1.97-2.04 (m, 12H), 2.20 (s, 6H), 2.25-2.32 (m, 8H), 4.04 (s, 6H), 5.29-5.39 (m, 6H).
工程5
実施例1工程2と同様な方法により、2,2’,2’’-ニトリロトリス(エタン-2,1-ジイル) トリオレアートの代わりに工程4で得られた (Z)-2-(2-(ジメチルアミノ)エチル)-2-(オレイルオキシメチル)プロパン-1,3-ジイルジオレート(0.109 g, 0.112 mol)を用い、標記の化合物 (0.0642 g, 0.0630 mol, 収率56%)を得た。
ESI-MS m/z: 986 (M)+; 1H-NMR (CDCl3) δ: 0.88 (t, J = 6.8 Hz, 9H), 1.23-1.37 (m, 74H), 1.55-1.64 (m, 65H), 1.78-1.84 (m, 2H), 1.95-2.06 (m, 13H), 2.35 (t, J = 7.6 Hz, 6H), 3.42 (s, 8H), 3.70-3.77 (m, 2H), 4.08 (s, 6H), 5.29-5.39 (m, 6H).
N,N,N-トリメチル-2-(3-(オレオイルオキシ)-2,2-ビス((オレオイルオキシ)メチル)プロポキシ)-2-オキシエタン-1-アミニウム クロリド(化合物II-32)
工程1
米国登録特許8816099号明細書に記載の方法で合成した2,2-(ジメチル-1,3-ジオキサン-5,5-ジイル)ジメタノール (0.200 g, 1.14 mmol)のテトラヒドロフラン (5 mL)溶液にトリエチルアミン (0.475 mL, 3.40 mmol)を加えた後、氷冷下にてオレオイル クロリド(0.854 g, 2.84 mmol)を加え、そのまま氷冷下にて1時間撹拌した。反応液に水を加え、ヘキサンで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、ろ過した。減圧下濃縮し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (ヘキサン/酢酸エチル=95/5)で精製することにより、(2,2-ジメチル-1,3-ジオキサン-5,5-ジイル)ビス(メチレン) ジオレアート (0.500 g, 0.709 mmol, 収率63%)を得た。
ESI-MS m/z: 705 (M + H)+
工程2
工程1で得られた(2,2-ジメチル-1,3-ジオキサン-5,5-ジイル)ビス(メチレン) ジオレアート(0.500 g, 0.709 mmol)のジクロロメタン (5 mL)溶液に、氷冷下トリフルオロ酢酸 (2.00 mL, 26.0 mmol)を2回に分けて加え、そのまま氷冷下にて1時間撹拌した。反応液に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、ろ過した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (ヘキサン/酢酸エチル=90/10〜50/50)で精製することにより、2,2-ビス(ヒドロキシメチル)プロパン-1,3-ジイル ジオレアート (0.207 g, 0.311 mmol, 収率44%)を得た。
ESI-MS m/z: 665 (M + H)+
工程3
N,N-ジメチルグリシン (東京化成工業社製, 0.049 g, 0.474 mmol)に塩化チオニル (1 mL, 13.7 mmol)を加え、70℃で30分加熱撹拌した。反応液を室温まで冷却した後、減圧下で濃縮することでN,N-ジメチルグリシノイルクロリドの粗生成物を得た。工程2で得られた2,2-ビス(ヒドロキシメチル)プロパン-1,3-ジイル ジオレアート (0.207 g, 0.311 mmol)のジクロロメタン (5 mL)溶液に、氷冷下N,N-ジイソプロピルエチルアミン (0.110 mL, 0.632 mmol)、上記N,N-ジメチルグリシノイルクロリドの粗生成物を加え、室温で1時間撹拌した。反応液に水を加え、酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、ろ過した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (ヘキサン/酢酸エチル=90/10〜40/60)で精製することにより、2-(((ジメチルグリシル)オキシ)メチル)-2-(ヒドロキシメチル)プロパン-1,3-ジイル ジオレアート (0.077 g, 0.103 mmol, 収率33%)を得た。
ESI-MS m/z: 751 (M + H)+
工程4
工程3で得られた2-(((ジメチルグリシル)オキシ)メチル)-2-(ヒドロキシメチル)プロパン-1,3-ジイル ジオレアート (0.0770 g, 0.103 mmol)のジクロロメタン (3 mL)溶液にピリジン (0.0330 mL, 0.411 mmol)を加えた後、氷冷下オレオイル クロリド (0.0620 g, 0.205 mmol)を加え、室温で30分撹拌した。反応液に水を加え、ヘキサン/酢酸エチル=1/1の混合溶媒で抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、ろ過した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (ヘキサン/酢酸エチル=95/5)で精製することにより、2-(((ジメチルグリシル)オキシ)メチル)-2-((オレオイル)メチル)プロパン-1,3-ジイル ジオレアート (0.122 g, 0.0600 mmol, 収率59%)を得た。
ESI-MS m/z: 1015 (M + H)+
工程5
工程4で得られた2-(((ジメチルグリシル)オキシ)メチル)-2-((オレオイル)メチル)プロパン-1,3-ジイル ジオレアート (0.122 g, 0.060 mmol)を用い、実施例1工程2と同様にして、標記化合物 (0.017 g, 0.016 mmol, 収率27%)を得た。
ESI-MS m/z: 1029 (M)+; 1H-NMR (CDCl3) δ: 0.88 (t, J = 6.8 Hz, 9H), 1.19-1.38 (m, 58H), 1.54-1.66 (m, 6H), 1.98-2.04 (m, 12H), 2.28-2.35 (m, 6H), 3.60 (s, 9H), 4.11 (d, J = 1.8 Hz, 6H), 4.20 (s, 2H), 5.08 (s, 2H), 5.29-5.41 (m, 6H).
N,N,N-トリメチル-1,3-ビス(テトラデカノイルオキシ)-2-((テトラデカノイルオキシ)メチル)プロパン-2-アミニウム クロリド(化合物II-33)
工程1
2-(ジメチルアミノ)-2-(ヒドロキシメチル)プロパン-1,3-ジオール (1.50 g,10.1 mmol)をテトラヒドロフラン (10 mL)にピリジン (4.07 mL, 50.3 mmol)、次いでテトラデカノイルクロリド (4.09 mL, 15.1 mmol)を加え、60℃で2時間加熱撹拌した。反応液に水を加え、酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、ろ過した。減圧下濃縮し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (クロロホルム/メタノール=99/1〜90/10)で精製することにより、2-(ジメチルアミノ)-2-((テトラデカノイルオキシ)メチル)プロパン-1,3-ジイル ジテトラデカノアート (1.50 g, 1.92 mmol, 収率19%)、2-(ジメチルアミノ)-2-(ヒドロキシメチル)プロパン-1,3-ジイル ジテトラデカノアート (0.750 g, １.32 mmol, 収率13%)、および2-(ジメチルアミノ)-3-ヒドロキシ-2-(ミドロキシメチル)プロピル テトラデカノアート (0.220 g, 0.612 mmol, 収率6%)をそれぞれ得た。
ESI-MS m/z: 781 (M + H)+
ESI-MS m/z: 570 (M + H)+
ESI-MS m/z: 360 (M + H)+
工程2
工程1で得られた2-(ジメチルアミノ)-2-((テトラデカノイルオキシ)メチル)プロパン-1,3-ジイル ジテトラデカノアート (1.50 g, 1.92 mmol)を用い、実施例1工程2と同様にして、標記化合物(0.530 g, 0.638 mmol, 収率33%)を得た。
ESI-MS m/z: 795 (M)+; 1H-NMR (CDCl3) δ: 0.88 (t, J = 6.8 Hz, 9H), 1.21-1.33 (m, 60H), 1.55-1.65 (m, 6H), 2.37 (t, J = 7.6 Hz, 6H), 3.71 (s, 9H), 4.59 (s, 6H).
N,N,N-トリメチル-1,3-ビス(オレオイルオキシ)-2-((テトラデカノイルオキシ)メチル)プロパン-2-アミニウム クロリド(化合物II-34)
工程1
実施例42の工程1で得られた2-(ジメチルアミノ)-3-ヒドロキシ-2-(ミドロキシメチル)プロピル テトラデカノアート (0.220 g, 0.612 mmol)の1,2-ジクロロエタン (3 mL)溶液にピリジン (0.297 mL, 3.67 mmol)、次いでオレオイル クロリド (0.552 g, 1.84 mmol)を加え、60℃で1時間加熱撹拌した。反応液に水を加え、酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、ろ過した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (ヘキサン/酢酸エチル=98/2〜85/15)で精製することにより、2-(ジメチルアミノ)-2-((テトラデカノイルオキシ)メチル)プロパン-1,3-ジイル ジオレアート (0.250 g, 0.281 mmol, 収率46%)を得た。
ESI-MS m/z: 889 (M + H)+
工程2
工程1で得られた2-(ジメチルアミノ)-2-((テトラデカノイルオキシ)メチル)プロパン-1,3-ジイル ジオレアート (0.250 g, 0.281 mmol)を用い、実施例1工程2と同様にして、標記化合物 (0.065 g, 0.069 mmol, 収率25%)を得た。
ESI-MS m/z: 903 (M)+; 1H-NMR (CDCl3) δ: 0.88 (t, J = 7.0 Hz, 9H), 1.22-1.38 (m, 60H), 1.56-1.66 (m, 6H), 1.97-2.05 (m, 8H), 2.39 (t, J= 7.6 Hz, 6H), 3.72 (s, 9H), 4.58 (s, 6H), 5.28-5.40 (m, 4H).
N,N,N-トリメチル-1-(オレイルオキシ)-3-(テトラデカノイルオキシ)-2-((テトラデカノイルオキシ)メチル)プロパン-2-アミニウム クロリド(化合物II-35)
工程1
実施例42の工程1で得られた2-(ジメチルアミノ)-2-(ヒドロキシメチル)プロパン-1,3-ジイル ジテトラデカノアート(0.750 g, １.32 mmol)の1,2-ジクロロエタン (3 mL)溶液にピリジン (0.532 mL, 6.58 mmol)、次いでオレオイル クロリド (0.792 g, 1.84 mmol)を加え、60℃で1時間加熱撹拌した。反応液に水を加え、酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、ろ過した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (ヘキサン/酢酸エチル=95/5)で精製することにより、2-(ジメチルアミノ)-2-((オレイルオキシ)メチル)プロパン-1,3-ジイル ジテトラデカノアート (0.750 g, 0.899 mmol, 収率68%)を得た。
ESI-MS m/z: 835 (M + H)+
工程2
工程1で得られた2-(ジメチルアミノ)-2-((オレイルオキシ)メチル)プロパン-1,3-ジイル ジテトラデカノアート (0.750 g, 0.899 mmol)を用い、実施例1工程2と同様にして、標記化合物 (0.092 g, 0.104 mmol, 収率12%)を得た。
ESI-MS m/z: 849 (M)+; 1H-NMR (CDCl3) δ: 0.88 (t, J = 6.8 Hz, 9H), 1.19-1.38 (m, 60H), 1.56-1.65 (m, 6H), 1.98-2.06 (m, 4H), 2.39 (t, J= 7.6 Hz, 6H), 3.72 (s, 9H), 4.59 (s, 6H), 5.30-5.39 (m, 2H).
N,N,N-トリメチル-3-(テトラデカノイルオキシ)-2-((テトラデカオイルオキシ)メチル)-2-(((テトラデシルカルバモイル)オキシ)メチル)プロパン-1-アミニウム クロリド(化合物II-36)
工程1
実施例24の工程1で得られた2-((ジメチルアミノ)メチル)-2-(ヒドロキシメチル)プロパン-1,3-ジオール (0.820 g, 5.02 mmol)のテトラヒドロフラン (7 mL)溶液に、ピリジン (2.03 mL, 38.6 mmol)を加えた後、氷冷下にてテトラデカノイル クロリド (0.930 mL, 3.77 mmol)を加え、60℃で2時間攪拌した。反応液を室温まで冷却し、水を加え、酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、ろ過した。減圧下濃縮し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (ヘキサン/酢酸エチル=95/5〜70/30)で精製することにより、2-((ジメチルアミノ)メチル)-2-(ヒドロキシメチル)プロパン-1,3-ジイル ジテトラデカノアート (0.150 g, 0.257 mmol, 収率5%)を得た。
ESI-MS m/z: 584 (M + H)+
工程2
工程1で得られた2-((ジメチルアミノ)メチル)-2-(ヒドロキシメチル)プロパン-1,3-ジイル ジテトラデカノアート (0.060 g, 0.103 mmol)のジクロロメタン (3 mL)溶液にトリエチルアミン (0.017 mL, 0.123 mmol)を加え、氷冷下にて4-ニトロフェニルクロロフォルメート (東京化成工業社製, 0.025 g, 0.123 mmol)、次いでテトラデシルアミン (東京化成工業社製, 0.022 g, 0.103 mmol)を加えて、室温で一晩撹拌した。反応液に水を加え、酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、ろ過した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (ヘキサン/酢酸エチル=95/5〜70/30)で精製することにより、2-((ジメチルアミノ)メチル)-2-(((テトラデシルカルバモイル)オキシ)メチル)プロパン-1,3-ジイル ジテトラデカノアート (0.052 g, 0.063 mmol, 収率62%)を得た。
ESI-MS m/z: 824 (M + H)+
工程3
工程2で得られた2-((ジメチルアミノ)メチル)-2-(((テトラデシルカルバモイル)オキシ)メチル)プロパン-1,3-ジイル ジテトラデカノアート (0.052 g, 0.063 mmol)を用い、実施例1工程2と同様にして、標記化合物 (0.012 g, 0.014 mmol, 収率21%)を得た。
ESI-MS m/z: 838 (M)+; 1H-NMR (CDCl3) δ: 0.88 (t, J = 7.0 Hz, 9H), 1.22-1.33 (m, 62H), 1.51-1.61 (m, 6H), 2.38 (t, J = 7.6 Hz, 4H), 3.13 (dd, J = 14.2, 5.8 Hz, 2H), 3.59 (s, 9H), 4.12 (s, 2H), 4.19 (s, 2H), 4.21 (d, J = 12.0 Hz, 2H), 4.25 (d, J = 12.0 Hz, 2H), 6.72 (t, J = 5.8 Hz, 1H).
N,N,N-トリメチル-3-((オクタデシルカルバモイル)オキシ)-2,2-ビス((テトラデカノイルオキシ)メチル)プロパン-1-アミニウム クロリド(化合物II-37)
工程1
実施例45と同様の方法で、テトラデシルアミンの代わりにステアリルアミン (東京化成工業社製) を用い、標記の化合物 (0.015 g, 0.016 mmol, 通し収率0.5%) を得た。
ESI-MS m/z: 894 (M)+;1H-NMR (CDCl3) δ: 0.88 (t, J = 6.8 Hz, 9H), 1.21-1.34 (m, 70H), 1.51-1.62 (m, 6H), 2.38 (t, J = 7.6 Hz, 4H), 3.13 (dd, J = 14.3, 5.8 Hz, 2H), 3.60 (s, 9H), 4.12 (s, 2H), 4.19 (s, 2H), 4.21 (d, J = 12.2 Hz, 2H), 4.25 (d, J = 12.2 Hz, 2H), 6.69 (t, J = 5.8 Hz, 1H).
N,N,N-トリメチル-3-(ステアロイルオキシ)-2,2-ビス((テトラデカノイルオキシ)メチル)プロパン-1-アミニウム クロリド (化合物II-37)
工程1
“アンゲバンテ・ケミー・インターナショナルエディション (Angewandte Chemie International Edition) ”, 2009年, 第48巻, p.2126 - 2130記載の方法で合成した(5-(ブロモメチル)-2,2-ジメチル-1,3-ジオキサン-5-イル)メタノール (1.00 g, 4.18mmol)のピリジン (10 mL)溶液に、ステアロイルクロリド (2.53 g, 8.36 mmol)を加え、室温で30分撹拌した。反応液に水を加え、酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、ろ過した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (ヘキサン/酢酸エチル=90/10)で精製することにより、(5-(ブロモメチル)-2,2-ジメチル-1,3-ジオキサン-5-イル)メチル ステアラート(0.95 g, 1.879 mmol, 収率45 %)を得た。
1H-NMR (CDCl3) δ: 0.89 (t, J = 7.0 Hz, 9H), 1.23-1.40 (m, 44H), 1.54-1.64 (m, 26H), 2.01-2.08 (m, 12H), 2.35 (t, J = 7.6 Hz, 6H), 2.77 (t, J = 6.8 Hz, 6H), 3.40 (s, 9H), 4.46 (s, 6H), 4.70 (s, 2H), 28-5.42 (m, 12H), 9.54 (br s, 1H).
工程2
工程1で得られた(5-(ブロモメチル)-2,2-ジメチル-1,3-ジオキサン-5-イル)メチル ステアラート (0.95 g, 1.879 mmol)のN,N-ジメチルアホルムアミド (10 mL)溶液に、ジメチルアミン (2.0 mol/L テトラヒドロフラン溶液, 5.64 mL, 11.3 mmol)を加え、マイクロウェーブ照射下、120℃で13時間攪拌した。反応液に水を加え、酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、ろ過した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (クロロホルム/メタノール=99/1〜90/10)で精製することにより、(5-((ジメチルアミノ)メチル)-2,2-ジメチル-1,3-ジオキサン-5-イル)メチル ステアラート(0.14 g, 0.298 mmol, 収率16 %) を得た。
ESI-MS m/z: 470 (M + H)+
工程3
実施例41の工程2と同様の方法で、工程1で得られた(5-((ジメチルアミノ)メチル)-2,2-ジメチル-1,3-ジオキサン-5-イル)メチル ステアラート (0.140 g, 0.298 mmol)を用い、3-(ジメチアミノ)-2,2-ビス(ヒドロキシメチル)プロピル ステアラート (0.12g, 0.279 mmol, 収率94 %)を得た。
ESI-MS m/z: 430 (M + H)+
工程4
工程3で得られた3-(ジメチアミノ)-2,2-ビス(ヒドロキシメチル)プロピル ステアラート (0.12 g, 0.279 mmol)のジクロロメタン (2 mL)溶液に、ピリジン (0.122 mL, 1.51 mmol)を加えた後、氷冷下にてテトラデカノイルクロリド (0.224 g, 0.98 mmol)を加え、室温で1時間攪拌した。反応液に水を加え、酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、ろ過した。減圧下濃縮し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (ヘキサン/酢酸エチル=95/5)で精製することにより、2-((ジメチルアミノ)メチル)-2-((ステアロイルオキシ)メチル)プロパン-1,3-ジイル ジテトラデカノアート (0.150 g, 0.176 mmol, 収率63%)を得た。
ESI-MS m/z: 851 (M + H)+
工程5
工程4で得られた-((ジメチルアミノ)メチル)-2-((ステアロイルオキシ)メチル)プロパン-1,3-ジイル ジテトラデカノアート (0.150 g, 0.176 mmol)を用い、実施例1工程2と同様にして、標記化合物(0.032 g, 0.056 mmol, 収率32%)を得た。
ESI-MS m/z: 865 (M)+; 1H-NMR (CDCl3) δ: 0.88 (t, J = 6.8 Hz, 9H), 1.19-1.33 (m, 68H), 1.54-1.65 (m, 6H), 2.38 (t, J = 7.6 Hz, 6H), 3.63 (s, 9H), 3.95 (s, 2H), 4.29 (s, 6H).
N,N,N-トリメチル-3-(((Z)-テトラデカ-9-エンオイル)オキシ)-2,2-ビス((((Z)-テトラデカ-9-エンオイル)オキシ)メチル)プロパン-1-アミニウム クロリド(化合物II-39)
工程1
ミリストレイン酸 (Nu-Chek Prep,Inc社製, 2.50 g, 11.0 mmol)のジクロロメタン(20 mL)溶液に塩化チオニル (1.61 mL, 22.1 mmol)とN,N-ジメチルホルムアミド (8.55 mL, 0.110 mmol)を加えて、室温で1時間撹拌した。反応液を減圧下濃縮することで、ミリストレイル クロリドの粗生成物(2.70 g, 11.04 mmol, 収率100%)を得た。
工程2
実施例33と同様の方法で、パルミトイルクロリドの代わりに工程1で得られたミリストレイル クロリド (1.88 g, 7.66 mmol) を用い、標記の化合物 (0.350 g, 0.417 mmol, 通し収率27%) を得た。
ESI-MS m/z:803 (M)+; 1H-NMR (CDCl3) δ: 0.86-0.94 (m, 9H), 1.26-1.39 (m, 36H), 1.53-1.64 (m, 6H), 1.97-2.07 (m, 12H), 2.38 (t, J = 7.6 Hz, 6H), 3.67 (s, 9H), 3.99 (s, 2H), 4.30 (s, 6H), 5.29-5.39 (m, 6H).
2-((4-((1,3-ビス(テトラデカノイルオキシ)-2-((テトラデカノイルオキシ)メチル)プロパン-2-イル)アミノ)-4-オキソブタノイル)オキシ)-N,N,N-トリメチルエタン-1-アミニウム クロリド(化合物II-40)
工程1
“オーストラリアン・ジャーナル・オブ・ケミストリー(Australian Journal of Chemistry) ”, 2013年, 第66巻, p.23 - 29記載の方法に準じた方法で合成した4-((1,3-ビス(テトラデカノイルオキシ)-2-((テトラデカノイルオキシ)メチル)プロパン-2-イル)アミノ)-4-オキソブタン酸 (0.250 g, 0.293 mmol)のジクロロメタン (3 mL)溶液に1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド (0.084 g, 0.440 mmol)、2-(ジメチルアミノ)エタン-1-オール (東京化成工業社製, 0.039 g, 0.440 mmol), 4-ジメチルアミノピリジン (0.036 g, 0.293 mmol)を順番に加えて、室温で終夜撹拌した。反応液に水を加え、酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、ろ過した。減圧下濃縮し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (クロロホルム/メタノール=99/1〜90/10)で精製することにより、2-(4-(2-(ジメチルアミノ)エトキシ)-4-オキソブタンアミド)-2-((テトラデカノイルオキシ)メチル)プロパン-1,3-ジイル ジテトラデカノアート (0.200 g, 0.217 mmol, 収率74%)を得た。
ESI-MS m/z: 924 (M + H)+
工程2
工程1で得られた2-(4-(2-(ジメチルアミノ)エトキシ)-4-オキソブタンアミド)-2-((テトラデカノイルオキシ)メチル)プロパン-1,3-ジイル ジテトラデカノアート (0.200 g, 0.217 mmol)を用い、実施例1工程2と同様にして、標記化合物 (0.150 g, 0.154 mmol, 収率71%)を得た。
ESI-MS m/z: 938 (M)+; 1H-NMR (CDCl3) δ: 0.88 (t, J = 6.8 Hz, 9H), 1.20-1.34 (m, 60H), 1.56-1.65 (m, 6H), 2.34 (t, J = 7.6 Hz, 6H), 2.54 (br s, 4H), 3.48 (s, 9H), 4.13-4.21 (m, 2H), 4.40 (s, 6H), 4.57-4.65 (m, 2H), 6.22 (s, 1H).
3-((4-((1,3-ビス(テトラデカノイルオキシ)-2-((テトラデカノイルオキシ)メチル)プロパン-2-イル)アミノ)-4-オキソブタノイル)オキシ)-1-メチルキヌクリジン-1-ニウム クロリド(化合物II-41)
実施例49と同様の方法で、2-(ジメチルアミノ)エタン-1-オールの代わりにクヌクリジン-3-オール (東京化成工業社製)を用い、標記の化合物 (0.350 g, 0.417 mmol, 通し収率46%) を得た。
ESI-MS m/z: 976 (M)+; 1H-NMR (CDCl3) δ: 0.88 (t, J = 7.0 Hz, 9H), 1.18-1.35 (m, 66H), 1.55-1.66 (m, 6H), 1.97-2.10 (m, 1H), 2.14-2.26 (m, 2H), 2.45-2.70 (m, 6H), 3.34 (s, 3H), 3.61-4.07 (m, 6H), 4.41 (s, 6H), 5.03-5.10 (m, 1H), 6.50 (s, 1H).
N,N,N-トリメチル-16,22-ジオキソ-19-(((テトラデシルカルバモイル)オキシ)メチル)-17,21-ジオキサ-15,23-ジアザヘプタトリアコンタン-19-アミニウム クロリド (化合物II-42)
工程1
2-(ジメチルアミノ)-2-(ヒドロキシメチル)プロパン-1,3-ジオール (0.15 g,1.01 mmol)にトルエン (4 mL)、トリエチルアミン (0.280 mL, 2.01 mmol)、1-テトラデカンイソシアナート (1.66 mL, 6.03 mmol)を順に加え、マイクロ波反応装置で100℃、 4時間反応させた。反応液に水を加え、クロロホルムで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、ろ過した。減圧下濃縮し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (クロロホルム/メタノール=99/1〜90/10)で精製することにより、2-(ジメチルアミノ)-2-(((テトラデシルカルバモイル)オキシ)メチル)プロパン-1,3-ジイル ビス(テトラデシルカルバマート) (0.872 g, 1.01 mmol, 収率100%)を得た。
ESI-MS m/z: 868 (M + H)+
工程2
工程1で得られた2-(ジメチルアミノ)-2-(((テトラデシルカルバモイル)オキシ)メチル)プロパン-1,3-ジイル ビス(テトラデシルカルバマート) (0.872 g, 1.01 mmol)を用い、実施例1工程2と同様にして、標記化合物 (0.761 g, 0.829 mmol, 収率82%)を得た。
ESI-MS m/z: 882 (M)+; 1H-NMR (CDCl3) δ: 0.88 (t, J = 7.0 Hz, 9H), 1.22-1.32 (m, 66H), 1.47-1.56 (m, 6H), 3.13 (td, J = 14.3, 6.0 Hz, 6H), 3.58 (s, 9H), 4.52 (s, 6H), 6.69 (t, J = 6.0 Hz, 3H).
N,N,N-トリメチル-1,3-ビス(3,7,11,15-テトラメチルヘキサデカノイルオキシ)-2-((3,7,11,15-テトラメチルヘキサデカノイル)メチル)プロパン-2-アミニウム クロリド (化合物II-43)
2-ジメチルアミノ-2-ヒドロキシメチルプロパン-1,3-ジオール (0.0170 g, 0.112 mmol) の 1,2-ジクロロエタン (1 mL) 溶液に3,7,11,15-テトラメチルヘキサデカン酸 (0.1826 g, 0.561 mmol)、((((1-シアノ-2-エトキシ-2-オキソエチリデン)アミノ)オキシ) -4-モルホリノメチレン)ジメチルアンモニウムヘキサフルオロりん酸塩 (Sigma-Aldirch社製, 0.240 g, 0.561 mmol)、N,N-ジイソプロピルエチルアミン (0.098 mL, 0.561 mmol)を加えて、60℃で終夜攪拌した。室温まで冷却後、減圧下濃縮した。得られた残渣をアミノシリカゲルカラムクロマトグラフィー (ヘキサン/酢酸エチル = 95/5) で精製して 2-(ジメチルアミノ)-2-((3,7,11,15-テトラメチルヘキサデカノイルオキシ)メチル)プロパン-1,3-ジイルジイル ビス(3,7,11,15-テトラメチルヘキサデカノアート)の粗生成物を得た。得られた粗生成物にヨウ化メチル (1.00 mL, 16.0 mmol) を加え、室温で終夜撹拌した。反応液を減圧下濃縮した。残渣を少量のメタノール-クロロホルム (1:1)に溶解してイオン交換樹脂 (Dow Chemical製, Dowex(TM) 1x-2 100 mesh, Cl型, 約20倍量, 水およびメタノールでプレ洗浄) にロードし、メタノール-クロロホルム(1:1)で溶出した。溶出液を減圧下濃縮し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (クロロホルム/メタノール = 90/10) で精製して標記の化合物 (0.0766 g, 0.071 mmol, 収率63%)を得た。
ESI-MS m/z: 1043 (M)+; 1H-NMR (CDCl3) δ: 0.81-0.87 (m, 36H), 0.92 (d, J = 6.7 Hz, 9H), 0.97-1.42 (m, 60H), 1.51 (tt, J= 19.8, 6.7 Hz, 3H), 1.84-1.97 (m, 3H), 2.16 (ddd, J = 15.5, 8.4, 2.3 Hz, 3H), 2.38 (ddd, J = 15.5, 5.6, 1.6 Hz, 3H), 3.72 (s, 9H), 4.55 (s, 6H).
N,N,N-トリメチル-2-((テトラデカノイルオキシ)メチル)-2-テトラデシルヘキサデカン-1-アミニウム クロリド(化合物II-44)
実施例19と同様の方法で、実施例19工程1で用いる(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニル メタンスルホナートと工程4で用いる(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエン酸の代わりにそれぞれ1-ブロモテトラデカン(東京化成工業社製)、ミリスチン酸(東京化成工業社製)を用い、標記の化合物 (0.292 g, 0.39 mmol, 通し収率22%)を得た。
ESI-MS m/z: 721 (M)+; 1H-NMR (CD3OD) δ: 0.90 (t, J = 6.8 Hz, 9H), 1.28-1.32 (m, 70H), 1.49 (br s, 2H), 1.63-1.66 (m, 2H), 2.42 (t, J= 7.2 Hz, 2H), 3.26 (s, 9H), 3.43 (s, 2H), 4.18 (s, 2H).
2-ヘキサデシル-N,N,N-トリメチル-2-((パルミトイルオキシ)メチル)オクタデカン-1-アミニウム クロリド (化合物II-45)
実施例19と同様の方法で、実施例19工程1で用いる(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニル メタンスルホナートと工程4で用いる(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエン酸の代わりに、それぞれ1-ブロモヘキサデカン (東京化成工業社製)、パルミチン酸 (東京化成工業社製)を用い、標記の化合物 (0.195 g, 0.23 mmol, 通し収率5%)を得た。
ESI-MS m/z: 805 (M)+; 1H-NMR (CD3OD) δ: 0.90 (t, J = 6.8 Hz, 9H), 1.28-1.33 (m, 82H), 1.49 (br s, 2H), 1.63-1.67 (m, 2H), 2.43 (t, J= 7.2 Hz, 2H), 3.26 (s, 9H), 3.43 (s, 2H), 4.18 (s, 2H).
N,N,N-トリメチル-2-((ステアロイルオキシ)メチル)-2-テトラデシルヘキサデカ-1-アミニウム クロリド (化合物II-46)
実施例19と同様の方法で、実施例19工程1で用いる(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニル メタンスルホナートと工程4で用いる(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエン酸の代わりに、それぞれ1-ブロモテトラデカン (東京化成工業社製)、ステアリン酸 (東京化成工業社製)を用い、標記の化合物 (0.421 g, 0.52 mmol, 通し収率20%)を得た。
ESI-MS m/z: 777 (M)+; 1H-NMR (CD3OD) δ: 0.90 (t, J = 6.8 Hz, 9H), 1.29-1.33 (m, 78H), 1.49 (br s, 2H),1.63-1.67 (m, 2H), 2.43 (t, J= 7.2 Hz, 2H), 3.27(s, 9H), 3.44 (s, 2H), 4.18 (s, 2H).
3-(ドデカノイルオキシ)-N,N,N-トリメチル-2,2-ビス((ステアロイルオキシ)メチル)プロパン-1-アミニウム クロリド (化合物II-47)
実施例46と同様の方法で、実施例46工程1で用いるステアロイルクロリドと工程4で用いるテトラデカノイルクロリドの代わりに、それぞれラウロイルクロリド (東京化成工業社製)、ステアロイルクロリド (東京化成工業社製)を用い、標記の化合物 (0.200 g, 0.417 mmol, 通し収率0.3%)を得た。
ESI-MS m/z: 893 (M)+; 1H-NMR (CDCl3) δ: 0.88 (t, J = 6.9 Hz, 9H), 1.21-1.32(m, 72H), 1.57-1.64 (m, 6H), 2.38 (t, J = 7.6 Hz, 6H), 3.63 (s, 9H), 3.99 (s, 2H), 4.29 (s, 6H).
3-(ドデカノイルオキシ)-N,N,N-トリメチル-2,2-ビス((パルミトイルオキシ)メチル)プロパン-1-アミニウム クロリド(化合物II-48)
実施例47と同様の方法で、実施例47工程1で用いるステアロイルクロリドと工程4で用いるテトラデカノイルクロリドの代わりに、それぞれラウロイルクロリド (東京化成工業社製)、パルミトイルクロリド (和光純薬工業社製)を用い、標記の化合物 (0.350 g, 0.40 mmol, 通し収率0.6%)を得た。
ESI-MS m/z: 837 (M)+; 1H-NMR (CDCl3) δ: 0.88 (t, J = 6.9 Hz, 9H), 1.21-1.33(m, 64H), 1.56-1.64 (m, 6H), 2.38 (t, J = 7.6 Hz, 6H), 3.66 (s, 9H), 3.98 (s, 2H), 4.29 (s, 6H).
3-(ドデカノイルオキシ)-2-((ドデカノイルオキシ)メチル)-N,N,N-トリメチル-2-((ステアロイルオキシ)メチル)プロパン-1-アミニウム クロリド(化合物II-49)
実施例47と同様の方法で、実施例47工程4で用いるテトラデカノイルクロリドの代わりにラウロイルクロリド (東京化成工業社製)を用い、標記の化合物 (0.210 g, 0.249 mmol, 通し収率0.3%)を得た。
ESI-MS m/z: 809 (M)+; 1H-NMR (CDCl3) δ: 0.88 (t, J = 6.9 Hz, 9H), 1.23-1.34(m, 60H), 1.53-1.65 (m, 6H), 2.38 (t, J = 7.6 Hz, 6H), 3.63 (s, 9H), 3.97 (s, 2H), 4.29 (s, 6H).
N,N,N-トリメチル-3-(パルミトイルオキシ)-2-((パルミトイルオキシ)メチル)-2-((ステアロイルオキシ)メチル)プロパン-1-アミニウム クロリド(化合物II-50)
実施例47と同様の方法で、実施例47工程4で用いるテトラデカノイルクロリドの代わりに、パルミトイルクロリド (東京化成工業社製)を用い、標記の化合物 (0.420 g, 0.44 mmol, 通し収率0.5%)を得た。
ESI-MS m/z: 921 (M)+; 1H-NMR (CDCl3) δ: 0.88 (t, J= 6.9 Hz, 9H), 1.21-1.32(m, 76H), 1.55-1.65 (m, 6H), 2.38 (t, J = 7.6 Hz, 6H), 3.67 (s, 9H), 399 (s, 2H), 4.29 (s, 6H).
3-(イコサノイルオキシ)-N,N,N-トリメチル-2,2-ビス((テトラデカノイルオキシ)メチル)プロパン-1-アミニウム クロリド(化合物II-51)
実施例47と同様の方法で、実施例47工程1で用いるステアロイルクロリドの代わりに、エイコサノイル クロリド (Nu-Chek Prep,Inc.社製)を用い、標記の化合物を得る。
3-(ドデカノイルオキシ)-2-((ドデカノイルオキシ)メチル)-2-((イコサノイルオキシ)メチル)-N,N,N-トリメチルプロパン-1-アミニウム クロリド(化合物II-52)
実施例47と同様の方法で、実施例47工程1で用いるステアロイル クロリドと工程4で用いるテトラデカノイル クロリドの代わりに、それぞれエイコサノイル クロリド (Nu-Chek Prep,Inc.社製)、ラウロイル クロリド (和光純薬工業社製)を用い、標記の化合物を得る。
N,N,N-トリメチル-3-(メチル(3-(テトラデカノイルオキシ)-2,2-ビス((テトラデカノイルオキシ)メチル)プロピル)アミノ)プロパン-1-アミニウム クロリド(化合物II-53)
工程1
2-(ブロモメチル)-2-(ヒドロキシメチル)プロパン-1,3-ジオール (0.15 g, 0.754 mmol)のN,N-ジメチルアセトアミド(1 mL)溶液に、N,N,N’-トリメチルプロパン-1,3-ジアミン (0.263 g, 2.26 mmol)を加え、マイクロ波反応装置で100℃、 2時間反応させた。その後、氷冷下でN,N-ジイソプロピルエチルアミン (0.395 mL, 2.26 mmol)、次いでテトラデカノイル クロリド(1.12 g, 4.52 mmol)を加え、室温で2時間撹拌した。反応液に水を加え、酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、ろ過した。減圧下濃縮し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (クロロホルム/メタノール=99/1〜90/10)で精製することにより、2-(((3-(ジメチルアミノ)プロピル)(メチル)アミノ)メチル)-2-((テトラデカノイルオキシ)メチル)プロパン-1,3-ジイル ジテトラデカノアート (0.040 g, 0.046 mmol, 収率6%)を得た。
ESI-MS m/z: 866 (M + H)+
工程2
工程1で得られた2-(((3-(ジメチルアミノ)プロピル)(メチル)アミノ)メチル)-2-((テトラデカノイルオキシ)メチル)プロパン-1,3-ジイル ジテトラデカノアート (0.040 g, 0.046 mmol)を用い、実施例1工程2と同様にして、標記化合物 (0.015 g, 0.016 mmol, 収率35%)を得た。
ESI-MS m/z: 880 (M)+; 1H-NMR (CDCl3) δ: 0.88 (t, J = 6.8 Hz, 9H), 1.20-1.35 (m, 62H), 1.54-1.65 (m, 6H), 1.87-2.03 (m, 2H), 2.21-2.31 (m, 2H), 2.31 (t, J = 7.6 Hz, 6H), 2.49 (br s, 3H), 3.40 (s, 9H), 3.52-3.63 (m, 2H), 4.05 (s, 6H).
(S)-6-(ジ(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニルアミノ)-N,N,N-トリメチル-5-オレアミド-6-オキソヘキサン-1-アミニウム クロリド (化合物III-2)
工程1
アンモニア (約2 mol/Lメタノール溶液、18.0 mL、36.0 mmol)に、(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニル メタンスルホナート (1.55 g, 4.50 mmol) を加え、マイクロ波反応装置を用いて130℃で3時間攪拌した。反応液に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加えてクロロホルムで5回抽出した。有機層を合わせて飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥後ろ過し、減圧濃縮することで(Z)-オクタデカ-9-エニルアミンの粗生成物を得た。
得られた粗生成物に(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニル メタンスルホナート (1.24 g, 3.60 mmol) および50%水酸化ナトリウム水溶液 (1.44 g、18.0 mmol)を加え、油浴上110℃で60分間攪拌した。室温まで冷却後、反応液を酢酸エチルで希釈し、水、ついで飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥後ろ過し、減圧濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (クロロホルム/メタノール=100/0〜95/5)で精製することにより、(9Z,12Z)-ジ(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニルアミン (0.838 g, 1.631 mmol, 収率36%)を得た。
ESI-MS m/z: 515 (M + H)+; 1H-NMR(CDCl3) δ: 0.89 (t, J = 6.8 Hz, 6H), 1.26-1.38 (m, 32H), 1.45-1.54 (m, 4H), 2.05 (q, J = 6.6 Hz, 8H), 2.60 (t, J = 7.1 Hz, 4H), 2.77 (t, J = 5.9 Hz, 4H), 5.29-5.43 (m, 8H).
工程2
(S)-2-アミノ-6-(tert-ブトキシカルボニルアミノ)ヘキサン酸 (1.94 g, 7.88 mmol) のアセトン(5 mL) 溶液に、水酸化ナトリウム (2 mol/L 水溶液, 5 mL)、オレオイル クロリド (2.09 g, 6.89 mmol) を加え、室温にて終夜攪拌した。反応液に塩酸水溶液 (6 mol/L) を加えてクロロホルムで2回抽出した。有機層を、無水硫酸マグネシウムで乾燥後、減圧下濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (クロロホルム/メタノール= 90/10〜80/20) で精製することにより (S)-6-(tert-ブトキシカルボニルアミノ)-2-オレアミドヘキサン酸 (2.50 g, 4.89 mmol, 収率71%) を得た。
ESI-MS m/z: 510 (M - H)-; 1H-NMR (CDCl3) δ: 0.87 (t, J = 7.0 Hz, 3H), 1.20-1.54 (m, 33H), 1.57-1.68 (m, 2H), 1.71-1.93 (m, 2H), 1.96-2.05 (m, 4H), 2.18-2.29 (m, 2H), 3.07-3.16 (m, 2H), 4.50-4.60 (m, 1H), 4.63-4.76 (m, 1H), 5.28-5.39 (m, 2H), 6.49-6.57 (m, 1H).
工程3
工程2で得られた (S)-6-(tert-ブトキシカルボニルアミノ)-2-オレアミドヘキサン酸 (0.291 g, 0.570 mmol) の 1,2-ジクロロエタン (4 mL) 溶液に、O-(7-アザ-1H-ベンゾトリアゾール-1-イル)-N,N,N',N'-テトラメチルウロニウム ヘキサフルオロフォスフェート ( 0.433 g, 1.14 mmol)、N,N-ジイソプロピルエチルアミン(0.498 mL, 2.85 mmol)、工程1で得られた (9Z,12Z)-ジ(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニルアミン (0.293 g, 0.570 mmol) を加え、室温にて4時間攪拌した。反応液に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加えてクロロホルムで2回抽出した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥後ろ過し、減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (ヘキサン/酢酸エチル = 80/20) で精製することにより tert-ブチル(S)-6-(ジ(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニルアミノ)-5-オレアミド-6-オキソヘキシルカルバマート (0.489 g, 0.486 mmol, 収率85%) を得た。
ESI-MS m/z: 1008 (M + H)+; 1H-NMR (CDCl3) δ: 0.85-0.92 (m, 9H), 1.20-1.72 (m, 73H), 1.97-2.08 (m, 12H), 2.18 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 2.74-2.80 (m, 4H), 3.02-3.34 (m, 5H), 3.44-3.53 (m, 1H), 4.55-4.63 (m, 1H), 4.88 (td, J = 8.2, 4.6 Hz, 1H), 5.28-5.43 (m, 10H), 6.30 (d, J = 8.4 Hz, 1H).
工程4
工程3で得られた tert-ブチル (S)-6-(ジ(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニルアミノ)-5-オレアミド-6-オキソヘキシルカルバマート (0.459 g, 0.456 mmol) の 1,2-ジクロロエタン (2 mL) 溶液にトリフルオロ酢酸 (0.500 mL, 6.49 mmol) を加え、室温にて1時間攪拌した。反応液を減圧濃縮した後、残渣にクロロホルムと飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加えてクロロホルムで2回抽出した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥後ろ過し、減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (ヘキサン/酢酸エチル = 90/10〜80/20) で精製することにより N-((S)-6-アミノ-1-(ジ ((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエン-1-イル)アミノ)-1-オキソヘキサン-2-イル)オレアミド (0.259 g, 0.286 mmol, 収率63%) を得た。
ESI-MS m/z: 907 (M + H)+; 1H-NMR (CDCl3) δ: 0.86-0.91 (m, 9H), 1.20-1.71 (m, 64H), 1.96-2.09 (m, 12H), 2.21 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 2.73-2.88 (m, 6H), 3.08-3.47 (m, 4H), 4.81-4.88 (m, 1H), 5.28-5.43 (m, 10H), 6.67 (br s, 1H).
工程5
工程4で得られた N-((S)-6-アミノ-1-(ジ ((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエン-1-イル)アミノ)-1-オキソヘキサン-2-イル)オレアミド (0.137 g, 0.151 mmol) の 1,2-ジクロロエタン (1 mL) 溶液に、38%ホルムアルデヒド水溶液 (0.300 mL)、ナトリウムトリアセトキシボロヒドリド (0.096 g, 0.453 mmol)を加え、室温で終夜攪拌した。反応液に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加えて、クロロホルムで2回抽出した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥後、減圧下濃縮した。残渣をアミノシリカゲルカラムクロマトグラフィー (ヘキサン/酢酸エチル = 50/50) で精製することで、N-((S)-1-(ジ(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニルアミノ)-6-(ジメチルアミノ)-1-オキソヘキサン-2-イル)オレアミド (0.122 g, 0.130 mmol, 収率86%) を得た。
ESI-MS m/z: 936 (M + H)+; 1H-NMR (CDCl3) δ: 0.83-0.93 (m, 9H), 1.12-1.77 (m, 64H), 1.95-2.25 (m, 22H), 2.73-2.80 (m, 4H), 3.04-3.15 (m, 1H), 3.20-3.34 (m, 2H), 3.44-3.54 (m, 1H), 4.85-4.91 (m, 1H), 5.28-5.43 (m, 10H), 6.28 (d, J= 8.6 Hz, 1H).
工程6
実施例8工程2と同様な方法で、(9Z,9'Z,12Z,12'Z)-2-(ジメチルアミノ)-2-(((9Z,12Z)-オクタデク-9,12-ジエノイルオキシ)メチル)プロパン-1,3-ジイル ジオクタデク-9,12-ジエノアートの代わりに工程5で得られた N-((S)-1-(ジ(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニルアミノ)-6-(ジメチルアミノ)-1-オキソヘキサン-2-イル)オレアミド (0.104 g, 0.111 mol)を用いて標記の化合物 (0.0707 g, 0.0718 mol, 65%)を得た。
ESI-MS m/z: 950 (M)+; 1H-NMR (CDCl3) δ: 0.85-0.91 (m, 9H), 1.21-1.83 (m, 64H), 1.97-2.08 (m, 12H), 2.19 (t, J= 7.7 Hz, 2H), 2.74-2.80 (m, 4H), 3.05-3.84 (m, 15H), 4.82-4.90 (m, 1H), 5.28-5.43 (m, 10H), 6.41-6.46 (m, 1H).
(S)-N,N,N-トリメチル-5-(ノナコサン-15-イルオキシ)-1,5-ジオキソ-1-(テトラデシロキシ)ペンタン-2-アミニウム クロリド (化合物III-3)
工程1
ぎ酸エチル (ナカライテスク社製, 2.4 mL, 29.7 mmol) のテトラヒドロフラン (9 mL) 溶液にテトラデシルマグネシウム クロリド (Sigma-Aldrich社製, 1.0 mol/L テトラヒドロフラン溶液, 59.4 mL, 59.4 mmol) を加え、60℃で2時間攪拌した。反応液を氷冷し、水と硫酸 (ナカライテスク社製, 2.0 mol/L水溶液) を加えた。沈殿物を濾取し、ノナコサン-15-オール (6.90 g, 16.2 mmol, 収率55%) を得た。
1H-NMR (CDCl3) δ: 0.88 (t, J = 6.8 Hz, 6H), 1.22-1.34 (m, 48H), 1.37-1.49 (m, 2H), 3.54-3.64 (m, 1H).
工程2
1-tert-ブチル 2-アミノペンタンジオアート 塩酸塩 (渡辺化学工業社製, 10.0 g, 30.3 mmol) のエタノール (150 mL) 溶液にパラホルムアルデヒド (Sigma-Aldrich社製, 5.50 g, 183 mmol)、シアノ水素化ホウ素ナトリウム (5.70 g, 90.7 mmol) を加え、室温で終夜攪拌した。反応液に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、クロロホルムで2回抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、ろ過し、減圧下濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (ヘキサン/酢酸エチル = 35/65) で精製することで、(S)-5-ベンジル 1-tert-ブチル2-(ジメチルアミノ)ペンタンジオアート(8.20 g, 25.5 mmol, 収率84%) を得た。
1H-NMR (CDCl3) δ: 1.48 (s, 9H), 1.95-2.00 (m, 2H), 2.32 (s, 6H), 2.43 (t, J = 7.8 Hz, 2H), 3.04 (t, J = 7.5 Hz, 1H), 5.12 (s, 6H), 7.29-7.40 (m, 5H).
工程3
(S)-5-ベンジル 1-tert-ブチル2-(ジメチルアミノ)ペンタンジオアート(8.20 g, 25.5 mmol) のエタノール (200 mL) 溶液に、パラジウム-炭素 (東京化成工業社製, パラジウム10%, 約55%水湿潤品, 820 mg)を加え、水素雰囲気下、室温で7時間攪拌した。不溶物をセライトろ過にて除去し、ろ液を濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (ジクロロメタン/メタノール= 85/15) で精製することで、(S)-5-tert-ブトキシ-4-(ジメチルアミノ)-5-オキソペンタン酸の粗生成物を得た。 (4.83 g, 20.9 mmol, 粗収率82%) を得た。
得られた(S)-5-tert-ブトキシ-4-(ジメチルアミノ)-5-オキソペンタン酸 (4.83 g, 20.9 mmol) の粗生成物に、1.2-ジクロロエタン (200 mL)、工程1で得られたノナコサン-15-オール (9.75 g, 23.0 mmol)、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩 (8.01 g, 41.8 mmol)、N,N-ジメチルアミノピリジン (255 mg, 2.09 mmol) を加え、50 ℃で3時間攪拌した。反応液に水を加え、ジクロロメタンで2回抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥後、ろ過し、減圧下濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (ヘキサン/酢酸エチル = 85/15) で精製することで、(S)-1-tert-ブチル5-ノナコサン-15-イル 2-(ジメチルアミノ)ペンタンジオアート (8.13 g, 12.7 mmol, 収率61%) を得た。
1H-NMR (CDCl3) δ: 0.88 (t, J = 6.8 Hz, 6H), 1.20-1.38 (m, 48H), 1.46-1.57 (m, 4H), 1.91-2.00 (m, 2H), 2.33-2.41 (m, 8H), 3.05 (t, J= 7.6 Hz, 1H), 4.82-4.93 (m, 1H).
工程4
工程3で得られた(S)-1-tert-ブチル5-ノナコサン-15-イル 2-(ジメチルアミノ)ペンタンジオアート (8.13 g, 12.7 mmol) のジクロロメタン (40 mL) 溶液に、トリフルオロ酢酸 (20 mL) を加え、40℃で終夜攪拌した。反応液を減圧下濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (ジクロロメタン/メタノール = 85/15) で精製することで、(S)-2-(ジメチルアミノ)-5-(ノナコサン-15-イルオキシ)-5-オキソペンタン酸 (6.70 g, 11.5 mmol, 収率90%) を得た。
1H-NMR (CDCl3) δ: 0.89 (t, J = 7.0 Hz, 6H), 1.18-1.37 (m, 48H), 1.44-1.60 (m, 4H), 2.00-2.13 (m, 2H), 2.52-2.74 (m, 2H), 2.87 (s, 6H), 3.62-3.73 (m, 1H), 4.80-4.89 (m, 1H).
工程5
工程4で得られた(S)-2-(ジメチルアミノ)-5-(ノナコサン-15-イルオキシ)-5-オキソペンタン酸 (100 mg, 0.172 mmol) の1,2-ジクロロエタン溶液 (2.0 mL) に、(1-シアノ-2-エトキシ-2-オキソエチリデンアミノオキシ)ジメチルアミノ-モルホリノ-カルベニウムヘキサフルオロリン酸塩 (96.0 mg, 0.224 mmol)、N,N-ジイソプロピルエチルアミン(0.060 mL, 0.344 mmol)をテトラデカン-1-オール () を加え、室温で終夜攪拌した。反応液に水を加えてジクロロメタンで抽出した。有機層を水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、ろ過し、減圧下濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(ヘキサン/酢酸エチル= 95/5〜85/15)で精製することで、(S)-5-ノナコサン-15-イル 1-テトラデシル 2-(ジメチルアミノ)ペンタンジオアート (64.0 mg, 0.0822 mmol, 収率48%) を得た。1H-NMR (CDCl3) δ: 0.88 (t, J = 6.8 Hz, 9H), 1.12-1.39 (m, 70H), 1.45-1.69 (m, 6H), 1.93-2.03 (m, 2H), 2.29-2.38 (m, 8H), 3.16 (t, J = 7.4 Hz, 1H), 4.03-4.17 (m, 2H), 4.80-4.91 (m, 1H).
工程6
実施例8工程2と同様な方法で、(9Z,9'Z,12Z,12'Z)-2-(ジメチルアミノ)-2-(((9Z,12Z)-オクタデク-9,12-ジエノイルオキシ)メチル)プロパン-1,3-ジイル ジオクタデク-9,12-ジエノアートの代わりに工程5で得られる (S)-5-ノナコサン-15-イル 1-テトラデシル 2-(ジメチルアミノ)ペンタンジオアートを用いて標記化合物を得る。
(S)-1-(ドデシルオキシ)-N,N,N-トリメチル-5-(ノナコサン-15-イルオキシ)-1,5-ジオキソペンタン-2-アミニウム クロリド (化合物III-4)
実施例64と同様な方法で、実施例64工程5のテトラデカン-1-オールの代わりにドデカン-1-オールを用いて標記の化合物を得る。
(S)-1-(ヘキサデシルオキシ)-N,N,N-トリメチル-5-(ノナコサン-15-イルオキシ)-1,5-ジオキソペンタン-2-アミニウム クロリド (化合物III-5)
実施例64と同様な方法で、実施例64工程5のテトラデカン-1-オールの代わりにヘキサデカン-1-オールを用いて標記の化合物を得る。
(S)-N,N,N-トリメチル-5-(ノナコサン-15-イルオキシ)-1-(オクタデシルオキシ)-1,5-ジオキソペンタン-2-アミニウム クロリド (化合物III-6)
実施例64と同様な方法で、実施例64工程5のテトラデカン-1-オールの代わりにオクタデカン-1-オールを用いて標記の化合物を得る。
(S,Z)-N,N,N-トリエチル-5-(ノナコサン-15-イルオキシ)-1-(オクタデカ-9-エニルオキシ)-1,5-ジオキソペンタン-2-アミニウム クロリド (化合物III-7)
実施例64と同様な方法で、実施例64工程5のテトラデカン-1-オールの代わりに(Z)-オクタデカ-9-エン-1-オールを用いて標記の化合物を得る。
(6Z,9Z,28Z,31Z)-N,N-ジメチル-N-(2-(N-メチルステアルアミド)エチル)ヘプタトリアコンタ-6,9,28,31-テトラエン-19-アミニウム クロリド (化合物IV-2)
工程1
国際公開第2010/042877号に記載の方法に準じた方法で得られた(6Z,9Z,28Z,31Z)-ヘプタトリアコンタ-6,9,28,31-テトラエン-19-オン (0.50 g, 0.256 mmol)の1,2-ジクロロエタン (2 mL)溶液に、メタノール (2 mL)、N1,N2-ジメチルエタン-1,2-ジアミン (東京化成工業社製, 0.085 mL, 0.767 mmol)、ナトリウムトリアセトキシボロヒドリド (0.325 g, 1.53 mmol) を加え、50℃で5時間攪拌した。反応液に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加えてクロロホルムで2回抽出した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、ろ過し、減圧下濃縮した。得られた残渣をアミノシリカカラムクロマトグラフィー (ヘキサン/酢酸エチル = 90/10〜80/20) で精製して N1-((6Z,9Z,28Z,31Z)-ヘプタトリアコンタ-6,9,28,31-テトラエン-19-イル)-N1,N2-ジメチルエタン-1,2-ジアミン (0.0303 g, 0.0506 mmol, 収率20%) を得た。
ESI-MS m/z: 600 (M + H)+; 1H-NMR (CDCl3) δ: 0.89 (t, J = 6.8 Hz, 6H), 1.13-1.45 (m, 40H), 2.01-2.09 (m, 8H), 2.14 (s, 3H), 2.28-2.40 (m, 1H), 2.43 (s, 3H), 2.52-2.60 (m, 4H), 2.75-2.80 (m, 4H), 5.29-5.42 (m, 8H).
工程2
工程1で得られた N1-((6Z,9Z,28Z,31Z)-ヘプタトリアコンタ-6,9,28,31-テトラエン-19-イル)-N1,N2-ジメチルエタン-1,2-ジアミン (0.0258 g, 0.0431 mmol) の1,2-ジクロロエタン (1 mL) 溶液に、ステアロイル クロリド (0.039 0g, 0.129 mmol)、N,N-ジイソプロピルエチルアミン (0.038 mL, 0.215 mmol)を加えて、室温で1時間攪拌した。反応液に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加えてクロロホルムで2回抽出した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、ろ過し、減圧下濃縮した。得られた残渣をアミノシリカカラムクロマトグラフィー (ヘキサン/酢酸エチル = 90/10) で精製して N-(2-((6Z,9Z,28Z,31Z)-ヘプタトリアコンタ-6,9,28,31-テトラエン-19-イル(メチル)アミノ)エチル)-N-メチルステアルアミドの粗生成物を得た。
得られた粗生成物にヨウ化メチル (1.00 mL, 16.0 mmol) を加え、50℃で1時間撹拌した。反応液を減圧下濃縮した。残渣を少量のメタノール-クロロホルム (1:1) に溶解してイオン交換樹脂 (Dow Chemical製, Dowex(TM) 1x-2 100 mesh, Cl型, 約20倍量, 水およびメタノールでプレ洗浄) にロードし、メタノール-クロロホルム (1:1) で溶出した。溶出液を減圧下濃縮し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (クロロホルム/メタノール = 80/20) で精製して標記の化合物 (0.0149 g, 0.0163 mmol, 収率38%)を得た。
ESI-MS m/z: 881 (M)+; 1H-NMR (CDCl3) δ: 0.84-0.92 (m, 9H), 1.20-2.09 (m, 78H), 2.27-2.38 (m, 2H), 2.74-2.80 (m, 4H), 3.14-3.45 (m, 9H), 3.77-4.09 (m, 5H), 5.28-5.43 (m, 8H).
(9Z,12Z)-N,N-ジメチル-N-(3-((9Z,12Z)-N-((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニル)オクタデカ-9,12-ジエンアミド)プロピル)オクタデカ-9,12-ジエン-1-アミニウム クロリド (化合物IV-3)
工程1
(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニル メタンスルホナート (0.838 g, 2.43 mmol) に3-アミノプロパン-1-オール (1.66 g, 21.9 mmol) を加えて、90℃にて3時間攪拌した。反応液を減圧下濃縮し、得られた残渣をアミノシリカゲルクロマトグラフィー (ヘキサン/酢酸エチル) で精製して 3-((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニルアミノ)プロパン-1-オール (0.722 g, 2.23 mmol, 収率92%) を得た。
ESI-MS m/z: 325 (M + H)+; 1H-NMR (CDCl3) δ: 0.89 (t, J = 6.9 Hz, 3H), 1.26-1.39 (m, 17H), 1.46 (tt, J = 7.1, 6.9 Hz, 3H), 1.69 (tt, J = 5.7, 5.4 Hz, 2H), 2.02-2.08 (m, 4H), 2.60 (t, J = 7.1 Hz, 2H), 2.75-2.80 (m, 2H), 2.88 (t, J = 5.7 Hz, 2H), 3.81 (t, J = 5.4 Hz, 2H), 5.30-5.42 (m, 4H).
工程2
実施例63工程5と同様な方法により、N-((S)-6-アミノ-1-(ジ ((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエン-1-イル)アミノ)-1-オキソヘキサン-2-イル)オレアミドの代わりに工程1で得られた 3-((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニルアミノ)プロパン-1-オール (0.233 g, 0.722 mol) を用い、3-(メチル((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニル)アミノ)プロパン-1-オール (0.220 g, 0.652 mol, 収率90%)を得た。
ESI-MS m/z: 338 (M + H)+; 1H-NMR (CDCl3) δ: 1H-NMR (CDCl3) δ: 0.89 (t, J = 7.0 Hz, 3H), 1.24-1.40 (m, 16H), 1.47 (tt, J = 7.6, 7.0 Hz, 2H), 1.69 (tt, J = 5.7, 5.2 Hz, 2H), 2.01-2.08 (m, 4H), 2.23 (s, 3H), 2.34 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 2.59 (t, J = 5.7 Hz, 2H), 2.75-2.80 (m, 2H), 3.80 (t, J = 5.2 Hz, 2H), 5.29-5.42 (m, 4H).
工程3
(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニル メタンスルホナート (2.85 g, 8.27 mmol) のアセトニトリル(30 mL) 溶液に、炭酸セシウム (6.74 g, 20.7 mmol)、よう化テトラ‐ｎ‐ブチルアンモニウム (3.05 g, 8.27 mmol)および N-(tert-ブトキシカルボニル)-2-ニトロベンゼンスルホンアミド (2.50 g, 8.27 mmol) を加えて、加熱還流下3時間攪拌した。反応液を室温まで冷却し、水を加えて酢酸エチルで抽出した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、ろ過し、減圧下濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (ヘキサン/酢酸エチル = 70/30) で精製して tert-ブチル 2-ニトロフェニルスルホニル((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニル)カルバマート (3.21 g, 5.83 mmol) を得た。
得られた tert-ブチル 2-ニトロフェニルスルホニル((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニル)カルバマート (3.21 g, 5.83 mmol) のジクロロメタン (23 mL) 溶液にトリフルオロ酢酸 (9.63 mL, 126 mmol) を加えて、室温で0.5時間攪拌した。反応液をジクロロメタンで希釈し、水酸化ナトリウム水溶液 (1 mol/L) と飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加えた。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、ろ過し、減圧下濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (ヘキサン/酢酸エチル = 95/5) で精製して2-ニトロ-N-((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニル)ベンゼンスルホンアミド (2.48 g, 5.50 mmol, 収率67 %) を得た。
ESI-MS m/z: 338 (M + H)+; 1H-NMR (CDCl3) δ: 0.89 (t, J = 7.0 Hz, 3H), 1.22-1.39 (m, 16H), 1.52 (m, 2H), 2.01-2.05 (m, 4H), 2.77 (t, J = 6.6 Hz, 2H), 3.09 (q, J = 6.7 Hz, 2H), 5.23 (m, 1H), 5.31-5.42 (m, 4H), 7.71-7.76 (m, 2H), 7.78-7.87 (1H), 813-8.15 (m, 1H).
工程4
工程2で得られた 3-(メチル((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニル)アミノ)プロパン-1-オール (0.220 g, 0.652 mol) のテトラヒドロフラン (4 mL) 溶液に、工程3で得られた 2-ニトロ-N-((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニル)ベンゼンスルホンアミド (0.441 g, 0.978 mmol)、トリフェニルホスフィン (0.257 g, 0.978 mmol)、アゾジカルボン酸ジエチル (ナカライテスク社製、40%トルエン溶液, 0.387 mL, 0.851 mmol) を加えて、50℃にて2時間攪拌した。反応液を室温まで冷却し、飽和食塩水を加えてヘキサンで2回抽出した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、ろ過し、減圧下濃縮した。得られた残渣をアミノシリカゲルカラムクロマトグラフィー (ヘキサン/酢酸エチル = 80/20) で精製してN-(3-(メチル((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニル)アミノ)プロピル)-2-ニトロ-N-((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニル)ベンゼンスルホンアミドの粗生成物を得た。
得られたN-(3-(メチル((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニル)アミノ)プロピル)-2-ニトロ-N-((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニル)ベンゼンスルホンアミドの粗生成物のアセトニトリル (5 mL) 溶液に、ドデカン-1-チオール (0.409 mL, 1.63 mmol) と 1,8-ジアザビシクロ [5.4.0]-7-ウンデセン (0.246 mL, 1.630 mmol) を加えて、60℃で2時間攪拌した。反応液に水を加えてヘキサンで2回抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、ろ過し、減圧下濃縮した。得られた残渣をアミノシリカゲルカラムクロマトグラフィー (ヘキサン/酢酸エチル = 75/25) で精製して N1-メチル-N1,N3-ジ ((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニル)プロパン-1,3-ジアミン(0.212 g, 0.363 mmol, 収率56%) を得た。
ESI-MS m/z: 586 (M + H)+; 1H-NMR (CDCl3) δ: 0.89 (t, J = 7.0 Hz, 6H), 1.22-1.51 (m, 36H), 1.66 (tt, J = 7.2, 7.1 Hz, 2H), 2.01-2.08 (m, 8H), 2.20 (s, 3H), 2.29 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 2.36 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 2.58 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 2.62 (t, J = 7.1 Hz, 2H), 2.75-2.80 (m, 4H), 5.29-5.43 (m, 8H).
工程5
工程4で得られた N1-メチル-N1,N3-ジ((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニル)プロパン-1,3-ジアミン (0.108 g, 0.185 mmol) の 1,2-ジクロロエタン (1 mL) 溶液に、(9Z, 12Z)-オクタデカ-9,12-ジエン酸 (0.104 g, 0.370 mmol)、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩 (0.106 g, 0.555 mmol)、N,N-ジメチルアミノピリジン (0.0023 g, 0.0188 mmol)を加えて室温で1時間攪拌した。反応液を減圧下濃縮した。得られた残渣をアミノシリカゲルカラムクロマトグラフィー (ヘキサン/酢酸エチル = 85/15) で精製して (9Z,12Z)-N-(3-(メチル((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニル)アミノ)プロピル)-N-((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニル)オクタデカ-9,12-ジエナミド(0.146 g, 0.172 mmol, 収率93%) を得た
ESI-MS m/z: 848 (M + H)+; 1H-NMR (CDCl3) δ: 0.89 (t, J = 7.0 Hz, 9H), 1.21-1.74 (m, 54H), 2.01-2.08 (m, 12H), 2.18 (s, 3H), 2.24-2.33 (m, 6H), 2.74-2.80 (m, 6H), 3.18-3.35 (m, 4H), 5.29-5.42 (m, 12H).
工程6
実施例8工程2と同様な方法で、(9Z,9'Z,12Z,12'Z)-2-(ジメチルアミノ)-2-(((9Z,12Z)-オクタデク-9,12-ジエノイルオキシ)メチル)プロパン-1,3-ジイル ジオクタデク-9,12-ジエノアートの代わりに工程5で得られた (9Z,12Z)-N-(3-(メチル((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニル)アミノ)プロピル)-N-((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニル)オクタデカ-9,12-ジエナミド (0.100 g, 0.118 mmol)を用いて標記の化合物 (0.0804 g, 0.0895 mol, 収率76%)を得た。
ESI-MS m/z: 862 (M)+; 1H-NMR (CDCl3) δ: 1H-NMR (CDCl3) δ: 0.88 (t, J = 7.0 Hz, 9H), 1.22-1.41 (m, 46H), 1.49-1.78 (m, 6H), 1.93-2.10 (m, 14H), 2.30 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 2.74-2.79 (m, 6H), 3.24-3.35 (m, 8H), 3.36-3.47 (m, 4H), 3.59-3.67 (m, 2H), 5.28-5.42 (m, 12H).
(R)-2-((2R,3R,4S)-3,4-ビス((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニルオキシ)テトラヒドロフラン-2-イル)-N,N,N-トリメチル-2-((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニルオキシ)エタンアミニウム クロリド (化合物V’-1)
工程1
(2R,3R,4S)-2-((R)-1,2-ジヒドロキシエチル)テトラヒドロフラン-3,4-ジオール(Sigma-Aldrich社製, 0.315 g, 1.92 mmol) のピリジン (和光純薬工業社製, 10 mL) 溶液に、4,4'-ジメトキシトリチル クロリド (0.704 g, 2.02 mmol)、N,N-ジメチルアミノピリジン(0.047 g, 0.384 mmol) を加えて50℃で終夜攪拌した。室温まで冷却後、減圧下濃縮した。得られた残渣をアミノシリカゲルカラムクロマトグラフィー (クロロホルム/メタノール = 90/10) で精製して (2R,3R,4S)-2-((R)-2-(ビス(4-メトキシフェニル)フェニル)メトキシ)-1-ヒドロキシエチル)テトラヒドロフラン-3,4-ジオール(0.465 g, 0.997 mmol, 収率52%) を得た。
1H-NMR (CDCl3) δ: 1.67-1.74 (m, 1H), 2.73-2.77 (m, 1H), 3.31 (dd, J = 9.8, 6.2 Hz, 1H), 3.41-3.50 (m, 2H), 3.70 (dd, J = 9.6, 1.3 Hz, 1H), 3.79 (s, 6H), 3.94 (dd, J = 6.2, 3.5 Hz, 1H), 4.10-4.24 (m, 3H), 4.26-4.30 (m, 1H), 6.81-6.86 (m, 4H), 7.20-7.36 (m, 7H), 7.41-7.45 (m, 2H).
工程2
工程1で得られた (2R,3R,4S)-2-((R)-2-(ビス(4-メトキシフェニル)フェニル)メトキシ)-1-ヒドロキシエチル)テトラヒドロフラン-3,4-ジオール(0.0669 g, 0.143 mmol) のテトラヒドロフラン (1 mL) 溶液に、(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニル メタンスルホナート (0.247 g, 0.717 mmol)、水素化ナトリウム (油性, 60%, 0.0459 g, 1.15 mmol) を加え、加熱還流下で終夜撹拌した。室温まで冷却後、反応液に飽和食塩水を加えてヘキサンで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、ろ過し、減圧下濃縮した。得られた残渣をアミノシリカゲルカラムクロマトグラフィー (ヘキサン/酢酸エチル = 90/10) で精製して(2R,3R,4S)-2-((R)-2-(ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)-1-((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニルオキシ)エチル)-3,4-ビス((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニルオキシ)テトラヒドロフランの粗生成物を得た。
得られた(2R,3R,4S)-2-((R)-2-(ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)-1-((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニルオキシ)エチル)-3,4-ビス((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニルオキシ)テトラヒドロフランの粗生成物に、ジクロロメタン (1 mL)、トリフルオロ酢酸 (0.0500 mL, 0.649 mmol) を加え、室温で5分攪拌した。反応液を減圧下濃縮し、得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィー (ヘキサン/酢酸エチル = 70/30) で精製して(R)-2-((2R,3R,4S)-3,4-ビス((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニルオキシ)テトラヒドロフラン-2-イル)-2-((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニルオキシ)エタノール(0.0531 g, 0.0584 mmol, 収率41%) を得た。
1H-NMR (CDCl3) δ: 0.89 (t, J = 7.0 Hz, 9H), 1.23-1.43 (m, 48H), 1.50-1.62 (m, 6H), 2.01-2.09 (m, 12H), 2.32 (dd, J = 8.2, 4.2 Hz, 1H), 2.74-2.80 (m, 6H), 3.37-3.50 (m, 4H), 3.54-3.69 (m, 3H), 3.69-3.77 (m, 2H), 3.80-3.87 (m, 2H), 3.88-3.95 (m, 2H), 4.06 (dd, J = 9.8, 4.7 Hz, 1H), 5.28-5.42 (m, 12H).
工程3
工程2で得られた (R)-2-((2R,3R,4S)-3,4-ビス((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニルオキシ)テトラヒドロフラン-2-イル)-2-((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニルオキシ)エタノール(0.0491 g, 0.0540 mmol) のジクロロメタン (1 mL) 溶液に、メタンスルホニルクロリド (純正化学社製, 0.0500 mL, 0.642 mmol)、トリエチルアミン (0.150 mL, 1.08 mmol) を加えて、室温で1時間攪拌した。反応液にメタンスルホニルクロリド (0.0500 mL, 0.642 mmol)、トリエチルアミン (0.150 mL, 1.08 mmol) を加えて、室温で1時間攪拌した。反応液にクロロホルム (1 mL) を加えて、室温にて1時間攪拌した。反応液にメタンスルホニルクロリド (0.0500 mL, 0.642 mmol)、トリエチルアミン (0.150 mL, 1.08 mmol) を加えて、40℃で2時間攪拌した後、加熱還流下2時間攪拌した。反応液に飽和食塩水を加えてクロロホルムで抽出した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、ろ過し、減圧下濃縮した。得られた残渣に、テトラヒドロフラン (1 mL)、ジメチルアミン (2.0 mol/L テトラヒドロフラン溶液, 2 mL, 2.00 mmol) を加え、マイクロ波反応装置を用いて130℃で5時間攪拌した。反応液を減圧下濃縮した。得られた残渣をアミノシリカゲルカラムクロマトグラフィー (ヘキサン/酢酸エチル = 95/5) で精製して (R)-2-((2R,3R,4S)-3,4-ビス((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニルオキシ)テトラヒドロフラン-2-イル)-N,N-ジメチル-2-((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニルオキシ)エタンアミンの粗生成物を得た。得られた(R)-2-((2R,3R,4S)-3,4-ビス((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニルオキシ)テトラヒドロフラン-2-イル)-N,N-ジメチル-2-((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニルオキシ)エタンアミンの粗生成物にクロロホルム (0.5 mL)、ヨウ化メチル (1.00 mL, 16.0 mmol) を加え、室温で2時間撹拌した。反応液を減圧下濃縮した。残渣を少量のメタノール-クロロホルム (1:1) に溶解してイオン交換樹脂 (Dow Chemical製, Dowex(TM) 1x-2 100 mesh, Cl型, 約20倍量, 水およびメタノールでプレ洗浄) にロードし、メタノール-クロロホルム (1:1) で溶出した。溶出液を減圧下濃縮し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (クロロホルム/メタノール = 90/10) で精製して標記の化合物 (0.0130 g, 0.0132 mmol, 収率24%)を得た。
ESI-MS m/z: 951 (M)+; 1H-NMR (CDCl3) δ: 0.89 (t, J= 7.0 Hz, 9H), 1.23-1.40 (m, 48H), 1.51-1.61 (m, 6H), 2.01-2.09 (m, 12H), 2.74-2.80 (m, 6H), 3.34-3.68 (m, 17H), 3.70-3.74 (m, 1H), 3.81-3.84 (m, 1H), 3.93-4.02 (m, 3H), 4.07-4.12 (m, 1H), 5.28-5.43 (m, 12H).
参考例1
メチルジ((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニル)アミン(化合物CL-1)
メチルアミン(Sigma-Aldrich社製, 約2 mol/Lテトラヒドロフラン溶液、10.5 mL、21.0 mmol)に(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニル メタンスルホナート(1.03 g, 3.00 mmol)を加え、マイクロ波反応装置を用いて150℃で90分間加熱撹拌した。反応液を酢酸エチルで希釈し、2 mol/L水酸化ナトリウム水溶液、ついで飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥後ろ過し、減圧下濃縮することでメチル((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニル)アミンの粗生成物を得た。
得られた粗生成物に(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニル メタンスルホナート(0.93 g, 2.70 mmol)および50%水酸化ナトリウム水溶液(0.960 g, 12.0 mmol)を加え、油浴上135℃で60分間加熱撹拌した。室温まで冷却後、反応液を酢酸エチルで希釈し、水、ついで飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥後ろ過し、減圧下濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(クロロホルム/メタノール = 100/0〜97/3)で精製することにより標記の化合物(1.07 g, 2.03 mmol, 通し収率67 %)を得た。
ESI-MS m/z: 529 (M + H)+; 1H-NMR (CDCl3) δ: 0.89 (t, J = 6.7 Hz, 6H), 1.29 (br s, 32H), 1.40-1.51 (m, 4H), 1.97-2.06 (m, 8H), 2.20 (s, 3H), 2.30 (t, J = 7.6 Hz, 4H), 2.77 (t, J = 5.8 Hz, 4H), 5.28-5.43 (m, 8H).
参考例2
2,2-ジリノレイル-4-(2-ジメチルアミノエチル)-[1,3]-ジオキソラン (化合物CL-2)
CL-2は、国際公開第2010/042877号に記載の方法に準じた方法で合成した。
参考例3
(3R,4R)-3,4-ビス((Z)-ヘキサデカ-9-エニルオキシ)-1-メチルピロリジン (化合物CL-3)
工程1
(3R,4R)-1-ベンジルピロリジン-3,4-ジオール(ダイバーキン(Diverchim S.A.)社製, 146 mg, 0.753 mmol)をテトラヒドロフラン (5 mL)に溶解させ、氷冷下水素化ナトリウム(油性, 60%, 241 mg, 6.03 mmol)を加えた後、加熱還流下30分間撹拌した。反応混合物に(Z)-ヘキサデカ-9-エニル メタンスルホナート(Nu-Chek Prep,Inc.製, 600 mg, 1.88 mmol)のテトラヒドロフラン(5 mL)溶液を滴下し、加熱還流下4時間撹拌した。室温まで冷却後、反応を水で停止させた。得られた混合物に飽和食塩水を加え、酢酸エチルで2回抽出した。有機層を合わせ、無水硫酸マグネシウムで乾燥後、減圧下濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(クロロホルム/メタノール＝100/0〜98/2)で精製することにより(3R,4R)-1-ベンジル-3,4-ビス((Z)-ヘキサデカ-9-エニルオキシ)ピロリジン (231 mg, 0.362 mmol, 収率48%)を得た。
ESI-MS m/z: 639 (M + H)+; 1H-NMR (CDCl3) δ: 0.88 (t, J = 6.8 Hz, 6H), 1.28-1.37 (m, 36H), 1.50-1.60 (m, 4H), 2.01 (q, J = 5.9 Hz, 8H), 2.50 (dd, J = 9.8, 4.6 Hz, 2H), 2.85 (dd, J = 9.8, 5.9 Hz, 2H), 3.34-3.47 (m, 4H), 3.59 (q, J = 12.6 Hz, 2H), 3.83 (t, J = 4.6 Hz, 2H), 5.29-5.40 (m, 4H), 7.20-7.34 (m, 5H).
工程2
工程1で得られた(3R,4R)-1-ベンジル-3,4-ビス((Z)-ヘキサデカ-9-エニルオキシ)ピロリジン (208 mg, 0.326 mmol)を1,2-ジクロロエタン(4 mL)に溶解させ、クロロぎ酸1-クロロエチル(東京化成工業社製, 0.107 ml, 0.978 mmol)を加え130℃で1時間撹拌した。反応溶液にメタノール(4 mL)を加え、130℃でさらに1時間撹拌した。室温まで冷却後、減圧下濃縮し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(クロロホルム/メタノール=100/0〜92/8)で精製した。得られた有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、次いで飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥後ろ過し、減圧下濃縮することで(3R,4R)-3,4-ビス((Z)-ヘキサデカ-9-エニルオキシ)ピロリジン (160 mg, 0.292 mmol, 収率89%)を得た。
ESI-MS m/z: 549 (M + H)+; 1H-NMR (CDCl3) δ: 0.88 (t, J = 6.6 Hz, 6H), 1.27-1.36 (m, 34H), 1.50-1.59 (m, 4H), 1.82 (br s, 3H), 2.01 (q, J = 6.2 Hz, 8H), 2.84 (dd, J = 12.5, 3.0 Hz, 2H), 3.10 (dd, J = 12.5, 5.0 Hz, 2H), 3.43 (t, J = 6.8 Hz, 4H), 3.77 (dd, J = 5.0, 3.0 Hz, 2H), 5.29-5.40 (m, 4H).
工程3
工程2で得られた(3R,4R)-3,4-ビス((Z)-ヘキサデカ-9-エニルオキシ)ピロリジン (107 mg, 0.195 mmol)を1,2-ジクロロエタン (1.5 mL)、およびメタノール (1.5 mL)に溶解させ、ホルムアルデヒド (0.145 ml, 1.95 mmol)、およびナトリウムトリアセトキシボロヒドリド(207 mg, 0.976 mmol)を加え室温で1時間撹拌した。反応溶液に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、水層を酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥後ろ過し、減圧下濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (クロロホルム/メタノール＝100/0〜96/4)で精製することで標記の化合物 (107 mg, 0.190 mmol, 収率97%)を得た。
ESI-MS m/z: 563 (M + H)+; 1H-NMR (CDCl3) δ: 0.88 (t, J = 6.8 Hz, 6H), 1.27-1.38 (m, 34H), 1.52-1.62 (m, 4H), 1.67 (br s, 2H), 2.01 (q, J = 6.1 Hz, 8H), 2.32 (s, 3H), 2.47 (dd, J= 9.8, 4.4 Hz, 2H), 2.83 (dd, J= 9.8, 5.8 Hz, 2H), 3.36-3.49 (m, 4H), 3.81 (t, J = 4.4 Hz, 2H), 5.29-5.41 (m, 4H).
参考例4
3-(ジメチルアミノ)プロピル ジ((Z)-オクタデカ-9-エニル)カルバマート(化合物CL-4)
工程1
アンモニア(東京化成工業社製, 約2 mol/Lメタノール溶液、12.0 mL、24.0 mmol)に、(Z)-オクタデカ-9-エニル メタンスルホナート(1.04 g, 3.00 mmol)を加え、マイクロ波反応装置を用いて130℃で3時間攪拌した。反応液に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加えてクロロホルムで5回抽出した。有機層を合わせて飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥後ろ過し、減圧濃縮することで(Z)-オクタデカ-9-エニルアミンの粗生成物を得た。
得られた粗生成物に(Z)-オクタデカ-9-エニル メタンスルホナート(0.832 g, 2.40 mmol)および50%水酸化ナトリウム水溶液(0.960 g、12.0 mmol)を加え、油浴上110℃で60分間攪拌した。室温まで冷却後、反応液を酢酸エチルで希釈し、水、ついで飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥後ろ過し、減圧濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(クロロホルム/メタノール=100/0〜95/5)で精製することにより、ジ((Z)-オクタデカ-9-エニル)アミン (0.562 g, 1.085 mmol, 収率36%)を得た。
ESI-MS m/z: 519(M + H)+; 1H-NMR(CDCl3) δ: 0.88(t, J = 6.7 Hz, 6H), 1.29(br s, 45H), 1.41-1.52(m, 4H), 1.97-2.05(m, 8H), 2.58(t, J = 7.2 Hz, 4H), 5.28-5.40(m, 4H).
工程2
工程1で得られるジ((Z)-オクタデカ-9-エニル)アミン (0.156 g、0.301 mmol)をクロロホルム(3 mL)に溶解させ、“ジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサイエティー(J.Am.Chem.Soc.)”,1981年,第103巻,p.4194-4199記載の方法に準じた方法で合成した3-(ジメチルアミノ)プロピル 4-ニトロフェニル カルボナート塩酸塩 (0.138 g、0.452 mmol)およびトリエチルアミン(0.168 mL, 1.21 mmol)を加え、マイクロ波反応装置を用いて110℃で60分間攪拌した。反応液に3-(ジメチルアミノ)プロピル 4-ニトロフェニル カルボナート塩酸塩 (22.9 mg、0.0753 mmol)を加え、マイクロ波反応装置を用いて110℃で20分間攪拌した。反応液に3-(ジメチルアミノ)プロピル 4-ニトロフェニル カルボナート塩酸塩 (22.9 mg、0.0753 mmol)を加え、マイクロ波反応装置を用いて110℃で20分間攪拌した。反応液に3-(ジメチルアミノ)プロピル 4-ニトロフェニル カルボナート塩酸塩 (22.9 mg、0.0753 mmol)を加え、マイクロ波反応装置を用いて110℃で20分間攪拌した。反応液をクロロホルムで希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄し、ついで飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥後ろ過し、減圧濃縮した。得られた残渣を少量のn-ヘキサン/酢酸エチル(1/4)に溶解してアミノ修飾シリカゲルのパッドに吸着させ、n-ヘキサン/酢酸エチル(1/4)で溶出し、減圧濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(クロロホルム/メタノール=100/0〜95/5)で精製することで標記の化合物 (0.173 g, 0.267 mmol, 収率89%)を得た。
ESI-MS m/z: 648(M + H)+; 1H-NMR(CDCl3) δ: 0.88(t, J= 6.6 Hz, 6H), 1.28(br s, 44H), 1.45-1.55(m, 4H), 1.75-1.85(m, 2H), 1.97-2.04(m, 8H), 2.23(s, 6H), 2.34(t, J= 7.6 Hz, 2H), 3.13-3.24(m, 4H), 4.10(t, J=6.4 Hz, 2H), 5.28-5.40(m, 4H).
参考例5
N-メチル-N,N-ビス(2-((Z)-ヘキサデカ-9-エニルオキシ)エチル)アミン(化合物CL-5)
水素化ナトリウム(油性, 60%, 222 mg, 5.55 mmol)のトルエン(2 mL)懸濁液に、N-メチルジエタノールアミン(東京化成工業社製、82.6 mg, 0.693 mmol)のトルエン (2 mL)溶液を撹拌しながら添加した後、(Z)-ヘキサデカ-9-エニル メタンスルホナート(530 mg, 1.66 mmol)のトルエン(2 mL)溶液を滴下した。得られた混合物を加熱還流下2時間撹拌した。室温まで冷却後、反応を水で停止させた。得られた混合物に飽和食塩水を加え、酢酸エチルで抽出した。有機層を、無水硫酸マグネシウムで乾燥後、減圧下濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(クロロホルム/メタノール＝100/0〜98/2)で精製することにより標記の化合物 (199 mg, 0.353 mmol, 収率51%)を得た。
ESI-MS m/z: 565 (M + H)+; 1H-NMR (CDCl3) δ: 0.88 (t, J = 6.8 Hz, 6H), 1.29 (br s, 36H), 1.51-1.56 (m, 4H), 1.97-2.04 (m, 8H), 2.33 (s, 3H), 2.64 (t, J = 6.1 Hz, 4H), 3.41 (t, J = 6.8 Hz, 4H), 3.52 (t, J = 6.1 Hz, 4H), 5.28-5.40 (m, 4H).
参考例6
(3R,4R)-3-(ジメチルアミノ)プロピル 3,4-ビス((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニルオキシ)ピロリジン-1-カルボキシラート (化合物CL-6)
工程1
水素化ナトリウム(油性, 60%, 5.80 g, 145 mmol)のトルエン(100 mL)懸濁液に、(3R,4R)-1-ベンジルピロリジン-3,4-ジオール(Diverchim S.A.社製、3.50 g, 18.1 mmol)のトルエン (70 mL)溶液を撹拌しながら添加した後、(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニル メタンスルホナート(15.6 g, 45.3 mmol)のトルエン(30 mL)溶液を滴下した。得られた混合物を加熱還流下終夜撹拌した。室温まで冷却後、反応を飽和塩化アンモニウム基水溶液で停止した。得られた混合物に飽和食塩水を加え、酢酸エチルで2回抽出した。有機層を合わせ、無水硫酸マグネシウムで乾燥後、減圧下濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(メタノール/クロロホルム=0/100〜2/98)で精製することにより(3R,4R)-1-ベンジル-3,4-ビス((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニルオキシ)ピロリジン(6.96 g, 10.1 mmol, 収率56%)を得た。
ESI-MS m/z: 691 (M + H)+; 1H-NMR (CDCl3) δ: 0.89 (t, J = 6.9 Hz, 6H), 1.26-1.38 (m, 30H), 1.52-1.62 (m, 6H), 2.05 (q, J = 6.3 Hz, 8H), 2.50 (dd, J = 9.9, 4.3 Hz, 2H), 2.77 (t, J = 5.8 Hz, 4H), 2.85 (dd, J = 9.6, 5.9 Hz, 2H), 3.37-3.45 (m, 4H), 3.52-3.66 (m, 2H), 3.83 (t, J = 4.6 Hz, 2H), 5.28-5.43 (m, 8H), 7.23-7.33 (m, 5H).
工程2
工程1で得られた(3R,4R)-1-ベンジル-3,4-ビス((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニルオキシ)ピロリジン (6.96 g, 10.1 mmol))を1,2-ジクロロエタン (100mL)に溶解させ、クロロぎ酸1-クロロエチル(3.30 ml, 30.3 mmol)を加え130℃で1時間撹拌した。反応溶液にメタノール(100 mL)を加え、130℃でさらに1時間撹拌した。室温まで冷却後、減圧下濃縮し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(クロロホルム/メタノール=100/0〜92/8)で精製した。得られた有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、次いで飽和塩化ナトリウム水溶液で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥後ろ過し、減圧下濃縮することで(3R,4R)-3,4-ビス((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニルオキシ)ピロリジン(5.56 g, 9.27 mmol, 収率92%)を得た。
ESI-MS m/z: 601 (M + H)+; 1H-NMR (CDCl3) δ: 0.89 (t, J = 6.9 Hz, 6H), 1.29-1.41 (m, 30H), 1.49-1.60 (m, 4H), 1.67 (br s, 3H), 2.05 (q, J = 6.5 Hz, 8H), 2.75-2.85 (m, 6H), 3.09 (dd, J = 12.4, 5.1 Hz, 2H), 3.37-3.49 (m, 4H), 3.76 (dd, J= 5.0, 3.3 Hz, 2H), 5.28-5.43 (m, 8H).
工程3
参考例4の工程2と同様の方法で、ジ((Z)-オクタデカ-9-エニル)アミンの代わりに工程2で得られた(3R,4R)-3,4-ビス((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニルオキシ)ピロリジン(0.111 g, 0.185 mmol)を用いて、標記の化合物 (0.101 g, 0.139 mmol, 75%) を得た。
ESI-MS m/z: 730 (M + H)+; 1H-NMR (CDCl3) δ: 0.89 (t, J = 6.9 Hz, 6H), 1.24-1.40 (m, 32H), 1.50-1.57 (m, 4H), 1.77-1.83 (m, 2H), 2.02-2.08 (m, 8H), 2.23 (s, 6H), 2.34 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 2.77 (t, J = 6.8 Hz, 4H), 3.38-3.56 (m, 8H), 3.83-3.86 (m, 2H), 4.11 (t, J = 6.5 Hz, 2H), 5.30-5.42 (m, 8H).
実施例１で得られたI-1、参考例1で得られたCL-1および1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-[メトキシ(ポリエチレングリコール)-2000](PEG-DSPE) を用いて以下のように核酸含有脂質ナノ粒子を製造した。用いた核酸はセンス鎖（５‘―ＣＣＧＵＣＧＵＡＵＵＣＧＵＧＡＧＣＡＡＧＡ―３’）と、アンチセンス鎖（５‘―ＵＵＧＣＵＣＡＣＧＡＡＵＡＣＧＡＣＧＧＵＧ―３’）の塩基配列からなる、ルシフェラーゼ（以下Lucと表す) 遺伝子の発現を抑制するsiRNAであり、ジーンデザイン社（GeneDesign社）から入手した(以下、「Luc siRNA」)。
実施例1で得られたI-1は10 mg/mLとなるように100%イソプロピルアルコールに溶解し、脂質ストック溶液とした。参考例1で得られたCL-1は50 mg/mLとなるように100%イソプロピルアルコールに溶解し、脂質ストック溶液とした。1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-[メトキシ(ポリエチレングリコール)-2000](PEG-DSPE)（日油社製）は20 mg/mLとなるように100%イソプロピルアルコールに溶解し、脂質ストック溶液とした。各脂質ストック溶液は、-20℃で保管し、製剤調製の直前に60℃に加温して脂質を溶解してから室温に戻して用いた。
Luc siRNAは1 mg/mLとなるように注射用水に溶解し、Luc siRNA溶液を調製した。
20 mLの80%イソプロピルアルコールに前記脂質ストック溶液としたI-1を0.469 μmolとなるように添加した。続いて、前記Luc siRNA溶液を200 μL添加し1分間攪拌後、本溶液に前記脂質ストック溶液としたCL-1/PEG-DSPEを1.41 μmol/0.209 μmolとなるように添加した。その後、20%以下イソプロピルアルコール溶液となるよう注射用水を62 mL/秒以上の流速で添加し粗製剤を形成した。得られた粗製剤はアミコンウルトラ（Millipore社製）を用いて濃縮し、さらに溶媒を生理食塩水に置換し、0.2 μmのフィルター（東洋濾紙社製）を用いてクリーンベンチ内でろ過した。さらに得られた製剤のsiRNA濃度を測定し、siRNA濃度で0.1 mg/mLとなるように生理食塩水を用いて希釈することで、製剤1を得た。
脂質Aおよび脂質Bを様々な量比に用いた核酸含有脂質ナノ粒子の製造例を以下に示す。
実施例1で得られたI-1および参考例1で得られたCL-1を用いて以下のように核酸含有脂質ナノ粒子を製造した。
20 mLの80%イソプロピルアルコールに前記脂質ストック溶液としたI-1を0.939 μmolとなるように添加した。続いて、前記Luc siRNA溶液を200 μL添加し1分間攪拌後、本溶液に前記脂質ストック溶液としたCL-1/PEG-DSPEを0.939 μmol/0.209 μmolとなるように添加した。その後、20%以下イソプロピルアルコール溶液となるよう注射用水を62 mL/秒以上の流速で添加し粗製剤を形成した。得られた粗製剤はアミコンウルトラ（Millipore社製）を用いて濃縮し、さらに溶媒を生理食塩水に置換し、0.2 μmのフィルター（東洋濾紙社製）を用いてクリーンベンチ内でろ過した。さらに得られた製剤のsiRNA濃度を測定し、siRNA濃度で0.1 mg/mLとなるように生理食塩水を用いて希釈することで、製剤2を得た。
実施例1で得られたI-1および参考例1で得られたCL-1を用いて以下のように核酸含有脂質ナノ粒子を製造した。
20 mLの80%イソプロピルアルコールに前記脂質ストック溶液としたI-1を1.41 μmolとなるように添加した。続いて、前記Luc siRNA溶液を200 μL添加し1分間攪拌後、本溶液に前記脂質ストック溶液としたCL-1/PEG-DSPEを0.469 μmol/0.209 μmolとなるように添加した。その後、20%以下イソプロピルアルコール溶液となるよう注射用水を62 mL/秒以上の流速で添加し粗製剤を形成した。得られた粗製剤はアミコンウルトラ（Millipore社製）を用いて濃縮し、さらに溶媒を生理食塩水に置換し、0.2 μmのフィルター（東洋濾紙社製）を用いてクリーンベンチ内でろ過した。さらに得られた製剤のsiRNA濃度を測定し、siRNA濃度で0.1 mg/mLとなるように生理食塩水を用いて希釈することで、製剤3を得た。
実施例1で得られたI-1を用いて以下のように核酸含有脂質ナノ粒子を製造した。
20 mLの80%イソプロピルアルコールに前記脂質ストック溶液としたI-1を1.88 μmolとなるように添加した。続いて、前記Luc siRNA溶液を200 μL添加し1分間攪拌後、本溶液に前記脂質ストック溶液としたPEG-DSPEを0.209 μmolとなるように添加した。その後、20%以下イソプロピルアルコール溶液となるよう注射用水を62 mL/秒以上の流速で添加し粗製剤を形成した。得られた粗製剤はアミコンウルトラ（Millipore社製）を用いて濃縮し、さらに溶媒を生理食塩水に置換し、0.2 μmのフィルター（東洋濾紙社製）を用いてクリーンベンチ内でろ過した。さらに得られた製剤のsiRNA濃度を測定し、siRNA濃度で0.1 mg/mLとなるように生理食塩水を用いて希釈することで、製剤4を得た。
実施例1で得られたI-1および参考例1で得られたCL-1を用いて以下のように核酸含有脂質ナノ粒子を製造した。
1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-[メトキシ(ポリエチレングリコール)-2000](PEG-DMPE)（日油社製）は20 mg/mLとなるように100%イソプロピルアルコールに溶解し、脂質ストック溶液とした。
製剤1のPEG-DSPEをPEG-DMPEにした以外、実施例72と同様にして製剤5を得た。
製剤2のPEG-DSPEをPEG-DMPEにした以外、実施例73と同様にして製剤6を得た。
製剤3のPEG-DSPEをPEG-DMPEにした以外、実施例74と同様にして製剤7を得た。
製剤4のPEG-DSPEをPEG-DMPEにした以外、実施例75と同様にして製剤8を得た。
実施例1で得られたI-1および参考例2で得られたCL-2を用いて以下のように核酸含有脂質ナノ粒子を製造した。
参考例2で得られたCL-2は10 mg/mLとなるように100%イソプロピルアルコールに溶解し、脂質ストック溶液とした。脂質ストック溶液は、-20℃で保管し、製剤調製の直前に60℃に加温して脂質を溶解してから室温に戻して用いた。
製剤6のCL-1をCL-2にした以外、実施例77と同様にして製剤9を得た。
比較例1
20 mLの80%イソプロピルアルコールに前記Luc siRNA溶液を0.2 mL添加した。続いて、前記脂質ストック溶液としたCL-1/PEG-DSPEを1.88 μmol/0.209 μmolとなるように添加した。その後、20%以下のイソプロピルアルコール溶液となるよう注射用水を約62 mL/秒以上の流速で添加し粗製剤を形成した。得られた粗製剤はアミコンウルトラ（Millipore社製）を用いて濃縮し、さらに溶媒を生理食塩水に置換し、0.2 μmのフィルター（東洋濾紙社製）を用いてクリーンベンチ内でろ過した。さらに得られた製剤のsiRNA濃度を測定し、siRNA濃度で0.1 mg/mLとなるように生理食塩水を用いて希釈することで、製剤10を得た。
比較例2
製剤10のPEG-DSPEをPEG-DMPEにした以外、比較例1と同様にして製剤11を得た。
比較例3
製剤11のCL-1を参考例2で得られたCL-2にした以外、比較例1と同様にして製剤12を得た。
試験例1
製剤中の核酸含有脂質ナノ粒子の平均粒子径測定
粒子径測定装置（Zetasizer Nano ZS, マルバーン（Malvern）社製）で製剤中の核酸含有脂質ナノ粒子の平均粒子径を測定し、結果を表45に示した。なお表中のPDIは多分散指数(Polydispersity Index)を表す。
Figure 0006910947
その結果、脂質B(CL-1またはCL-2)、PEG脂質（PEG-DSPEまたはPEG-DMPE）と核酸とをイソプロピルアルコールに分散させ、その分散液に62 mL/秒以上の流速で水を加えてイソプロピルアルコール濃度を得られた溶液に対して20% (v/v%)に低下することで形成させた実施例72〜80および比較例1〜3に記載する製剤１〜12は、脂質A(I-1)の含有または非含有に関わらず、平均粒子径が小さく、52 nm以下であった。
試験例2
核酸含有脂質ナノ粒子内siRNAの血清安定性評価
実施例72〜75、80および比較例1、3で得られた各製剤（製剤1-4, 9, 10, 12）に含有されるsiRNAの安定性を以下の方法で確認した。核酸の最終濃度が0.05 mg/mLとなるように生理食塩水で希釈した製剤に、ウシ胎仔血清（FBS,、Gibco社、5891746D）を10%（v/v%）となるように添加し、37℃で120分間インキュベーションした。該溶液を氷上に設置し、150 μLのトリゾール試薬（Trizol LS Reagent、Invitrogen社）および40 μLのクロロホルムを添加した後、ボルテクッスにより攪拌し15分間静置し、遠心後に核酸が含まれる上清を回収しサンプルとした。
本サンプルに1当量のローディングバッファー（Novex TBU-Urea Sample Buffer、Invitrogen社）を添加し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（Novex 15%TBE-Urea gel、Invitrogen社）に供して、ランニングバッファー（Novex TBE Running Buffer）で泳動し、核酸染色試薬（SYBR GreenII RNA Gel Stain、タカラバイオ社）を用いて染色した。
その結果、I-1非含有の製剤10および12中のsiRNAは分解された一方で、I-1含有製剤（製剤1〜4および9）中のsiRNAは未分解であった（図1）。さらにI-1の含有率が多いほど血清による分解を抑制することが認められた。このことから、I-1が血清に対するsiRNAの安定性を向上させる脂質ナノ粒子形成に寄与していることが示唆された。
試験例3
核酸含有脂質ナノ粒子のインビトロ活性評価試験
比較例2〜3および実施例76〜80で得られた各製剤（製剤5〜9, 11〜12）を、それぞれ以下の方法により、ルシフェラーゼを強制発現させたヒト子宮頸癌由来細胞株HeLa細胞（以降、Luc2CP-HeLaと記載する）に導入した。
核酸の最終濃度が0.3〜100 nMとなるように、オプティメム（Opti-MEM、Gibco社)で希釈した各製剤を、96ウェルの培養プレートに、20 μLずつ分注した後、1.25%ウシ胎仔血清（FBS、SAFCバイオサイエンス（SAFC Biosciences社）を含む最小必須培地（MEM）に懸濁させたLuc2CP-HeLa細胞を、細胞数7500/80 μL/ウェルとなるように播種し、37℃、5%CO2条件下で培養することで、各製剤をLuc2CP-HeLa細胞内に導入した。また陰性対照の群として何も処理しない細胞を播種した。
各製剤を導入した細胞を37℃の5%CO2インキュベーター内で24時間培養し、細胞増殖試験アッセイ(CellTiter-Fluor Cell Viability Assay、プロメガ社、G6080)及びルシフェラーゼ定量システム（Steady-Glo Luciferase Assay System 、プロメガ社、E2520）を用いて、製品に添付された説明書に記載された方法に従い処理した後、各発光強度をプレートリーダーで測定した。得られたルシフェリン発光量を細胞増殖試験アッセイで得られた蛍光量で補正した。各製剤処理群の発光量は、陰性対照群の補正後発光量を1としたときの相対的な割合として算出した。
図2から明らかなように、I-1が含有された製剤5〜9をヒト子宮頸癌由来細胞株Luc2CP-HeLa細胞内に導入後のLucの発現率は、I-1が非含有の製剤11および12と比較して抑制率が高い。
よって、本発明の脂質Aを含有する脂質ナノ粒子は核酸を細胞内等に導入することができ、インビトロで細胞内に薬物送達することを容易にする製剤であることが明らかとなった。
実施例1で得られたI-1、PEG-DMPE、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン（DSPC）、コレステロールおよび参考例１で得られたCL-1を含んだ核酸含有脂質ナノ粒子を以下のように調製した。
DSPCおよびコレステロールは日油より入手した。
核酸は実施例72記載の1 mg/mL Luc siRNA溶液を用いた。
実施例1で得られたI-1は、10 mg/mLとなるように100%イソプロピルアルコールに溶解し、脂質ストック溶液とした。
参考例1で得られたCL-1は50 mg/mLとなるように100%イソプロピルアルコールに溶解し、脂質ストック溶液とした。PEG-DMPE、DSPC およびコレステロールはそれぞれ20 mg/mLとなるように100%イソプロピルアルコールに溶解し、脂質ストック溶液とした。各脂質ストック溶液は、-20℃で保管し、製剤調製の直前に60℃に加温して脂質を溶解してから室温に戻して用いた。
20 mLの80%イソプロピルアルコールにI-1を0.156 μmolとなるように添加した。続いて、siRNA溶液を200 μL添加し1分間攪拌後、本溶液にCL-1/PEG-DMPE/DSPC/コレステロールを1.88 μmol/0.145 μmol/0.566 μmol/1.17 μmolとなるように添加した。その後、20%以下イソプロピルアルコール溶液となるよう注射用水を62 mL/秒以上の流速で添加し粗製剤を形成した。得られた粗製剤はアミコンウルトラ（Millipore社製）を用いて濃縮し、さらに溶媒を生理食塩水に置換し、0.2 μmのフィルター（東洋濾紙社製）を用いてクリーンベンチ内でろ過した。さらに得られた製剤のsiRNA濃度を測定し、siRNA濃度で0.1 mg/mLとなるように生理食塩水を用いて希釈することで、製剤13を得た。
実施例1で得られたI-1、PEG-DMPE、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン（DSPC）、コレステロールおよび参考例１で得られたCL-1を含んだ核酸含有脂質ナノ粒子を以下のように調製した。
20 mLの80%イソプロピルアルコールにI-1を0.313 μmolとなるように添加した。続いて、siRNA溶液を200 μL添加し1分間攪拌後、本溶液にCL-1/PEG-DMPE/DSPC/コレステロールを1.88 μmol/0.145 μmol/0.515 μmol/1.07 μmolとなるように添加した。その後、20%以下イソプロピルアルコール溶液となるよう注射用水を62 mL/秒以上の流速で添加し粗製剤を形成した。得られた粗製剤はアミコンウルトラ（Millipore社製）を用いて濃縮し、さらに溶媒を生理食塩水に置換し、0.2 μmのフィルター（東洋濾紙社製）を用いてクリーンベンチ内でろ過した。さらに得られた製剤のsiRNA濃度を測定し、siRNA濃度で0.1 mg/mLとなるように生理食塩水を用いて希釈することで、製剤14を得た。
実施例1で得られたI-1、PEG-DMPE、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン（DSPC）、コレステロールおよび参考例１で得られたCL-1を含んだ核酸含有脂質ナノ粒子を以下のように調製した。
20 mLの80%イソプロピルアルコールにI-1を0.469 μmolとなるように添加した。続いて、siRNA溶液を200 μL添加し1分間攪拌後、本溶液にCL-1/PEG-DMPE/DSPC/コレステロールを1.88 μmol/0.145 μmol/0.464 μmol/0.963 μmolとなるように添加した。その後、20%以下イソプロピルアルコール溶液となるよう注射用水を62 mL/秒以上の流速で添加し粗製剤を形成した。得られた粗製剤はアミコンウルトラ（Millipore社製）を用いて濃縮し、さらに溶媒を生理食塩水に置換し、0.2 μmのフィルター（東洋濾紙社製）を用いてクリーンベンチ内でろ過した。さらに得られた製剤のsiRNA濃度を測定し、siRNA濃度で0.1 mg/mLとなるように生理食塩水を用いて希釈することで、製剤15を得た。
実施例1で得られたI-1、PEG-DMPE、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン（DSPC）、コレステロールおよび参考例１で得られたCL-1を含んだ核酸含有脂質ナノ粒子を以下のように調製した。
20 mLの80%イソプロピルアルコールにI-1を0.626 μmolとなるように添加した。続いて、siRNA溶液を200 μL添加し1分間攪拌後、本溶液にCL-1/PEG-DMPE/DSPC/コレステロールを1.88 μmol/0.145 μmol/0.413 μmol/0.858 μmolとなるように添加した。その後、20%以下イソプロピルアルコール溶液となるよう注射用水を62 mL/秒以上の流速で添加し粗製剤を形成した。得られた粗製剤はアミコンウルトラ（Millipore社製）を用いて濃縮し、さらに溶媒を生理食塩水に置換し、0.2 μmのフィルター（東洋濾紙社製）を用いてクリーンベンチ内でろ過した。さらに得られた製剤のsiRNA濃度を測定し、siRNA濃度で0.1 mg/mLとなるように生理食塩水を用いて希釈することで、製剤16を得た。
製剤13のCL-1をCL-2にした以外、実施例81と同様にして製剤17を得た。
製剤14のCL-1をCL-2にした以外、実施例82と同様にして製剤18を得た。
製剤15のCL-1をCL-2にした以外、実施例83と同様にして製剤19を得た。
製剤16のCL-1をCL-2にした以外、実施例84と同様にして製剤20を得た。
比較例4
PEG-DMPE、DSPC、コレステロールおよびCL-1を含んだ核酸含有脂質ナノ粒子を以下のように調製した。
20 mLの80%イソプロピルアルコールにLuc siRNA溶液を0.2 mL添加した。続いて、CL-1/PEG-DMPE/DSPC/コレステロールを1.88 μmol/0.145 μmol/0.617 μmol/1.28 μmolとなるように各脂質を添加した。その後、20%以下イソプロピルアルコール溶液となるよう注射用水を62 mL/秒以上の流速で添加し粗製剤を形成した。得られた粗製剤はアミコンウルトラ（Millipore社製）を用いて濃縮し、さらに溶媒を生理食塩水に置換し、0.2 μmのフィルター（東洋濾紙社製）を用いてクリーンベンチ内でろ過した。さらに得られた製剤のsiRNA濃度を測定し、siRNA濃度で0.1 mg/mLとなるように生理食塩水を用いて希釈することで、製剤21を得た。
比較例5
製剤21のCL-1をCL-2にした以外、比較例4と同様にして製剤22を得た。
試験例4
核酸含有脂質ナノ粒子の平均粒子径測定
粒子径測定装置（Zetasizer Nano ZS, マルバーン（Malvern）社製）で製剤中の核酸含有脂質ナノ粒子の平均粒子径を測定した（表46）。なお表中のPDIは多分散指数(Polydispersity Index)を表す。
Figure 0006910947
その結果、脂質B(CL-1またはCL-2)、DSPC、コレステロールおよびPEG-DMPEと核酸との複合体をイソプロピルアルコールに分散させ、その分散液に急速に水を加えて形成させた実施例81〜88および比較例4〜5に記載する製剤13〜22（13-22）は、脂質A(I-1)の含有または非含有に関わらず、平均粒子径が小さく、56 nm以下であった。
試験例5
核酸含有脂質ナノ粒子のインビトロ活性評価試験
実施例81〜88および比較例4〜5で得られた製剤13〜22を、それぞれ以下の方法により、ルシフェラーゼを強制発現させたヒト子宮頸癌由来細胞株HeLa細胞（Luc2CP-HeLa）に導入した。
核酸の最終濃度が0.3〜100 nMとなるように、オプティメム（Opti-MEM、Gibco社)で希釈した各製剤を、96ウェルの培養プレートに、20 μLずつ分注した後、1.25%ウシ胎仔血清（FBS、SAFCバイオサイエンス（SAFC Biosciences社）を含む最小必須培地（MEM）に懸濁させたLuc2CP-HeLa細胞を、細胞数7500/80 μL/ウェルとなるように播種し、37℃、5%CO2条件下で培養することで、各製剤をLuc2CP-HeLa細胞内に導入した。また陰性対照の群として何も処理しない細胞を播種した。
各製剤を導入した細胞を37℃の5%CO2インキュベーター内で24時間培養し、ルシフェラーゼ定量システム（Steady-Glo Luciferase Assay System 、プロメガ社、E2520）を用いて、製品に添付された説明書に記載された方法に従い処理した後、発光強度をプレートリーダーで測定した。各製剤処理群の発光量は、陰性対照群の発光量を1としたときの相対的な割合として算出した。
図3から明らかなように、脂質BとしてCL-1を含有する製剤のうち、I-1を含む製剤（製剤13〜16）をヒト子宮頸癌由来細胞株Luc2CP-HeLa細胞内に導入後のLucの発現率は、I-1非含有の製剤（製剤21）と比較して抑制率が高い。また、脂質BとしてCL-2を含有する製剤のうち、I-1を含む製剤(製剤17〜20)とI-1非含有の製剤(製剤22)との比較においても同様の結果であった。
よって、本発明の脂質Aを含有する脂質ナノ粒子は核酸を細胞内等に導入することができ、インビトロで細胞内に薬物送達することを容易にする製剤であることが明らかとなった。
I-1、PEG-DMPE、DSPC、コレステロールおよび各種の脂質Bを含んだ核酸含有脂質ナノ粒子を以下のように調製した。
核酸は実施例72記載の1 mg/mL Luc siRNA溶液を用いた。
脂質B、PEG-DMPE、DSPCおよびコレステロールはそれぞれ20 mg/mLとなるように100%イソプロピルアルコールに溶解し、脂質ストック溶液とした。脂質Aは5〜10 mg/mLとなるように100%イソプロピルアルコールに溶解し、脂質ストック溶液とした。各ストック溶液は、-20℃で保管し、製剤調製の直前に60℃に加温して脂質を溶解してから室温に戻して用いた。
実施例1で得られたI-1は10 mg/mLとなるように100%イソプロピルアルコールに溶解し、脂質ストック溶液とした。ストック溶液は、-20℃で保管し、製剤調製の直前に60℃に加温して脂質を溶解してから室温に戻して用いた。
20 mLの80%イソプロピルアルコールにI-1を0.626 μmolとなるように添加した。続いて、siRNA溶液を200 μL添加し1分間攪拌後、本溶液にCL-5/PEG-DMPE/DSPC/コレステロールを1.88 μmol/0.145 μmol/0.413 μmol/0.858 μmolとなるように添加した。その後、20%以下イソプロピルアルコール溶液となるよう注射用水を62 mL/秒以上の流速で添加し粗製剤を形成した。得られた粗製剤はアミコンウルトラ（Millipore社製）を用いて濃縮し、さらに溶媒を生理食塩水に置換し、0.2 μmのフィルター（東洋濾紙社製）を用いてクリーンベンチ内でろ過した。さらに得られた製剤のsiRNA濃度を測定し、siRNA濃度で0.1 mg/mLとなるように生理食塩水を用いて希釈することで、製剤23を得た。
製剤23のCL-5を参考例3で得られたCL-3にした以外、実施例89と同様にして製剤24を得た。
製剤23のCL-5を参考例4で得られたCL-4にした以外、実施例89と同様にして製剤25を得た。
比較例6
20 mLの80%イソプロピルアルコールにLuc siRNA溶液を0.2 mL添加した。続いて、CL-5/PEG-DMPE/DSPC/コレステロールを1.88 μmol/0.145 μmol/0.617 μmol/1.28 μmolとなるように各脂質を添加した。その後、20%以下イソプロピルアルコール溶液となるよう注射用水を62 mL/秒以上の流速で添加し粗製剤を形成した。得られた粗製剤はアミコンウルトラ（Millipore社製）を用いて濃縮し、さらに溶媒を生理食塩水に置換し、0.2 μmのフィルター（東洋濾紙社製）を用いてクリーンベンチ内でろ過した。さらに得られた製剤のsiRNA濃度を測定し、siRNA濃度で0.1 mg/mLとなるように生理食塩水を用いて希釈することで、製剤26を得た。
比較例7
製剤26のCL-5を参考例3で得られたCL-3にした以外、比較例6と同様にして製剤27を得た。
比較例8
製剤26のCL-5を参考例6で得られたCL-6にした以外、比較例6と同様にして製剤28を得た。
比較例9
製剤26のCL-5を参考例4で得られたCL-4にした以外、比較例6と同様にして製剤29を得た。
試験例6
核酸含有脂質ナノ粒子の平均粒子径測定
粒子径測定装置（Zetasizer Nano ZS, マルバーン（Malvern）社製）で製剤中の核酸含有脂質ナノ粒子の平均粒子径を測定した（表47）。なお表中のPDIは多分散指数(Polydispersity Index)を表す。
Figure 0006910947
その結果、脂質B(CL-3〜6)、DSPC、コレステロールおよびPEG-DMPEと核酸との複合体をイソプロピルアルコールに分散させ、その分散液に急速に水を加えて形成させた実施例89〜91および比較例6〜9に記載する製剤23〜29は、脂質A(I-1)の含有または非含有に関わらず、平均粒子径が小さく、50 nm以下であった。
試験例7
核酸含有脂質ナノ粒子のインビトロ活性評価試験
実施例89〜91および比較例6〜9で得られた各製剤（製剤23〜29）を、それぞれ以下の方法により、ルシフェラーゼを強制発現させたヒト子宮頸癌由来細胞株HeLa細胞（Luc2CP-HeLa）に導入した。
核酸の最終濃度が10 nMとなるように、オプティメム（Opti-MEM、Gibco社)で希釈した各製剤を、96ウェルの培養プレートに、20 μLずつ分注した後、1.25%ウシ胎仔血清（FBS、SAFCバイオサイエンス（SAFC Biosciences社）を含む最小必須培地（MEM）に懸濁させたLuc2CP-HeLa細胞を、細胞数7500/80 μL/ウェルとなるように播種し、37℃、5%CO2条件下で培養することで、各製剤をLuc2CP-HeLa細胞内に導入した。また陰性対照の群として何も処理しない細胞を播種した。
各製剤を導入した細胞を37℃の5%CO2インキュベーター内で24時間培養し、ルシフェラーゼ定量システム（Steady-Glo Luciferase Assay System 、プロメガ社、E2520）を用いて、製品に添付された説明書に記載された方法に従い処理した後、発光強度をプレートリーダーで測定した。各製剤処理群の発光量は、陰性対照群の発光量を1としたときの相対的な割合として算出した。
図4から明らかなように、I-1を含む製剤（製剤23〜25）をLuc2CP-HeLa内に導入後のLucの発現率は、I-1を含有しない製剤（製剤26〜29）と比較して抑制率が高かった。
よって、本発明の脂質Aを含有する脂質ナノ粒子は核酸を細胞内等に導入することができ、インビトロ試験の結果からインビボでも細胞内に薬物送達することを容易にする製剤であることが推定される。
各種の脂質A、各種の脂質B、PEG-DMPE、DSPC、コレステロールを含んだ核酸含有脂質ナノ粒子を以下のように調製した。
実施例92〜216の核酸は実施例72記載の1 mg/mL Luc siRNA溶液を用い、脂質Aは5〜10 mg/mLとなるように100%イソプロピルアルコールに溶解し、脂質ストック溶液とし、PEG-DMPE、DSPCおよびコレステロールはそれぞれ20 mg/mLとなるように100%イソプロピルアルコールに溶解し、脂質ストック溶液とし、脂質Bは10〜20 mg/mLとなるように100%イソプロピルアルコールに溶解し、脂質ストック溶液とした。各ストック溶液は、-20℃で保管し、製剤調製の直前に60℃に加温して脂質を溶解してから室温に戻して用いた。
製剤16のI-1を実施例4で得られたI-4にした以外、実施例84と同様にして製剤30を得た。
製剤24のI-1を実施例4で得られたI-4にした以外、実施例90と同様にして製剤31を得た。
製剤25のI-1を実施例4で得られたI-4にした以外、実施例91と同様にして製剤32を得た。
製剤16のI-1を実施例5で得られたI-5にした以外、実施例84と同様にして製剤33を得た。
製剤24のI-1を実施例5で得られたI-5にした以外、実施例90と同様にして製剤34を得た。
製剤23のCL-5を参考例6で得られたCL-6にし、I-１を実施例5で得られたI-5にした以外、実施例89と同様にして製剤35を得た。
製剤25のI-1を実施例5で得られたI-5にした以外、実施例91と同様にして製剤36を得た。
製剤16のI-1を実施例13で得られたII-6にした以外、実施例84と同様にして製剤37を得た。
製剤23のI-1を実施例13で得られたII-6にした以外、実施例89と同様にして製剤38を得た。
製剤24のI-1を実施例13で得られたII-6にした以外、実施例90と同様にして製剤39を得た。
製剤35のI-5を実施例13で得られたII-6にした以外、実施例97と同様にして製剤40を得た。
製剤25のI-1を実施例13で得られたII-6にした以外、実施例91と同様にして製剤41を得た。
製剤16のI-1を実施例9で得られたII-2にした以外、実施例84と同様にして製剤42を得た。
製剤23のI-1を実施例9で得られたII-2にした以外、実施例89と同様にして製剤43を得た。
製剤24のI-1を実施例9で得られたII-2にした以外、実施例90と同様にして製剤44を得た。
製剤25のI-1を実施例9で得られたII-2にした以外、実施例91と同様にして製剤45を得た。
製剤24のI-1を実施例3で得られたI-3にした以外、実施例90と同様にして製剤46を得た。
製剤24のI-1を実施例14で得られたII-7にした以外、実施例90と同様にして製剤47を得た。
製剤14のI-1を実施例8で得られたII-1にした以外、実施例82と同様にして製剤48を得た。
製剤48のCL-1を参考例5で得られたCL-5 にした以外、実施例110と同様にして製剤49を得た。
製剤48のCL-1を参考例3で得られたCL-3にした以外、実施例110と同様にして製剤50を得た。
製剤48のCL-1を参考例4で得られたCL-4にした以外、実施例110と同様にして製剤51を得た。
製剤14のI-1を実施例10で得られたII-3にした以外、実施例82と同様にして製剤52を得た。
製剤49のII-1を実施例10で得られたII-3にした以外、実施例111と同様にして製剤53を得た。
製剤51のII-1を実施例10で得られたII-3にした以外、実施例113と同様にして製剤54を得た。
製剤14のI-1を実施例19で得られたII-12にした以外、実施例82と同様にして製剤55を得た。
製剤49のII-1を実施例19で得られたII-12にした以外、実施例111と同様にして製剤56を得た。
製剤51のII-1を実施例19で得られたII-12にした以外、実施例113と同様にして製剤57を得た。
製剤14のCL-1を参考例6で得られたCL-6にし、I-1を実施例19で得られたII-12にした以外、実施例82と同様にして製剤58を得た。
製剤14のI-1を実施例28で得られたII-21にした以外、実施例82と同様にして製剤59を得た。
製剤49のII-1を実施例28で得られたII-21にした以外、実施例111と同様にして製剤60を得た。
製剤51のII-1を実施例28で得られたII-21にした以外、実施例113と同様にして製剤61を得た。
製剤13のI-1を実施例24で得られたII-17にした以外、実施例81と同様にして製剤62を得た。
製剤62のCL-1を参考例4で得られたCL-4にした以外、実施例124と同様にして製剤63を得た。
製剤14のI-1を実施例70で得られたIV-3にした以外、実施例82と同様にして製剤64を得た。
製剤14のI-1を実施例63で得られたIII-2にした以外、実施例82と同様にして製剤65を得た。
製剤14のI-1を実施例30で得られたII-23にした以外、実施例82と同様にして製剤66を得た。
製剤49のII-1を実施例30で得られたII-23にした以外、実施例111と同様にして製剤67を得た。
製剤14のI-1を実施例37で得られたII-28にした以外、実施例82と同様にして製剤68を得た。
製剤49のII-1を実施例37で得られたII-28にした以外、実施例111と同様にして製剤69を得た。
製剤14のI-1を実施例29で得られたII-22にした以外、実施例82と同様にして製剤70を得た。
製剤49のII-1を実施例29で得られたII-22にした以外、実施例111と同様にして製剤71を得た。
製剤14のI-1を実施例17で得られたII-10にした以外、実施例82と同様にして製剤72を得た。
製剤49のII-1を実施例17で得られたII-10にした以外、実施例111と同様にして製剤73を得た。
製剤14のI-1を実施例39で得られたII-30にした以外、実施例82と同様にして製剤74を得た。
製剤49のII-1を実施例39で得られたII-30にした以外、実施例111と同様にして製剤75を得た。
製剤14のI-1を実施例40で得られたII-31にした以外、実施例82と同様にして製剤76を得た。
製剤49のII-1を実施例40で得られたII-31にした以外、実施例111と同様にして製剤77を得た。
製剤14のI-1を実施例43で得られたII-34にした以外、実施例82と同様にして製剤78を得た。
製剤49のII-1を実施例43で得られたII-34にした以外、実施例111と同様にして製剤79を得た。
製剤14のI-1を実施例23で得られたII-16にした以外、実施例82と同様にして製剤80を得た。
製剤49のII-1を実施例23で得られたII-16にした以外、実施例111と同様にして製剤81を得た。
製剤49のII-1を実施例2で得られたI-2にした以外、実施例111と同様にして製剤82を得た。
製剤49のII-1を実施例12で得られたII-5にした以外、実施例111と同様にして製剤83を得た。
製剤49のII-1を実施例25で得られたII-18にした以外、実施例111と同様にして製剤84を得た。
製剤49のII-1を実施例36で得られたII-27にした以外、実施例111と同様にして製剤85を得た。
製剤49のII-1を実施例27で得られたII-20にした以外、実施例111と同様にして製剤86を得た。
製剤49のII-1を実施例22で得られたII-15にした以外、実施例111と同様にして製剤87を得た。
製剤49のII-1を実施例31で得られたIII-1にした以外、実施例111と同様にして製剤88を得た。
製剤14のI-1を実施例44で得られたII-35にした以外、実施例82と同様にして製剤89を得た。
製剤49のII-1を実施例44で得られたII-35にした以外、実施例111と同様にして製剤90を得た。
製剤14のI-1を実施例50で得られたII-41にした以外、実施例82と同様にして製剤91を得た。
製剤49のII-1を実施例50で得られたII-41にした以外、実施例111と同様にして製剤92を得た。
製剤14のI-1を実施例33で得られたII-24にした以外、実施例82と同様にして製剤93を得た。
製剤49のII-1を実施例33で得られたII-24にした以外、実施例111と同様にして製剤94を得た。
製剤14のI-1を実施例34で得られたII-25にした以外、実施例82と同様にして製剤95を得た。
製剤49のII-1を実施例34で得られたII-25にした以外、実施例111と同様にして製剤96を得た。
製剤14のI-1を実施例35で得られたII-26にした以外、実施例82と同様にして製剤97を得た。
製剤49のII-1を実施例35で得られたII-26にした以外、実施例111と同様にして製剤98を得た。
製剤14のI-1を実施例51で得られたII-42にした以外、実施例82と同様にして製剤99を得た。
製剤49のII-1を実施例51で得られたII-42にした以外、実施例111と同様にして製剤100を得た。
製剤14のI-1を実施例52で得られたII-43にした以外、実施例82と同様にして製剤101を得た。
製剤49のII-1を実施例52で得られたII-43にした以外、実施例111と同様にして製剤102を得た。
製剤14のI-1を実施例45で得られたII-36にした以外、実施例82と同様にして製剤103を得た。
製剤49のII-1を実施例45で得られたII-36にした以外、実施例111と同様にして製剤104を得た。
製剤49のII-1を実施例24で得られたII-17にした以外、実施例111と同様にして製剤105を得た。
製剤13のI-1を実施例11で得られたII-4にした以外、実施例81と同様にして製剤106を得た。
製剤106のCL-1を参考例5で得られたCL-5にした以外、実施例168と同様にして製剤107を得た。
製剤14のI-1を実施例42で得られたII-33にした以外、実施例82と同様にして製剤108を得た。
製剤49のII-1を実施例42で得られたII-33にした以外、実施例111と同様にして製剤109を得た。
製剤14のI-1を実施例46で得られたII-37にした以外、実施例82と同様にして製剤110を得た。
製剤49のII-1を実施例46で得られたII-37にした以外、実施例111と同様にして製剤111を得た。
製剤13のI-1を実施例38で得られたII-29にした以外、実施例81と同様にして製剤112を得た。
製剤107のII-4を実施例38で得られたII-29にした以外、実施例169と同様にして製剤113を得た。
製剤49のII-1を実施例47で得られたII-38にした以外、実施例111と同様にして製剤114を得た。
製剤49のII-1を実施例15で得られたII-8にした以外、実施例111と同様にして製剤115を得た。
製剤49のII-1を実施例18で得られたII-11にした以外、実施例111と同様にして製剤116を得た。
製剤49のII-1を実施例48で得られたII-39にした以外、実施例111と同様にして製剤117を得た。
製剤13のI-1を実施例70で得られたIV-3にした以外、実施例81と同様にして製剤118を得た。
製剤107のII-4を実施例70で得られたIV-3にした以外、実施例169と同様にして製剤119を得た。
製剤13のI-1を実施例63で得られたIII-2にした以外、実施例81と同様にして製剤120を得た。
製剤107のII-4を実施例63で得られたIII-2にした以外、実施例169と同様にして製剤121を得た。
製剤13のI-1を実施例69で得られたIV-2にした以外、実施例81と同様にして製剤122を得た。
製剤107のII-4を実施例69で得られたIV-2にした以外、実施例169と同様にして製剤123を得た。
製剤13のI-1を実施例20で得られたII-13にした以外、実施例81と同様にして製剤124を得た。
製剤107のII-4を実施例20で得られたII-13にした以外、実施例169と同様にして製剤125を得た。
20 mLの80%イソプロピルアルコールに実施例24で得られたII-17を0.0782 μmolとなるように添加した。続いて、siRNA溶液を200 μL添加し1分間攪拌後、本溶液にCL-1/PEG-DMPE/DSPC/コレステロールを1.88 μmol/0.145 μmol/0.591 μmol/1.23 μmolとなるように添加した。その後、20%以下イソプロピルアルコール溶液となるよう注射用水を62 mL/秒以上の流速で添加し粗製剤を形成した。得られた粗製剤はアミコンウルトラ（Millipore社製）を用いて濃縮し、さらに溶媒を生理食塩水に置換し、0.2 μmのフィルター（東洋濾紙社製）を用いてクリーンベンチ内でろ過した。さらに得られた製剤のsiRNA濃度を測定し、siRNA濃度で0.1 mg/mLとなるように生理食塩水を用いて希釈することで、製剤126を得た。
製剤13のI-1を実施例6で得られたI-6にした以外、実施例81と同様にして製剤127を得た。
製剤13のI-1を実施例32で得られたIV-1にした以外、実施例81と同様にして製剤128を得た。
製剤107のII-4を実施例32で得られたIV-1にした以外、実施例169と同様にして製剤129を得た。
20 mLの80%イソプロピルアルコールに実施例32で得られたIV-1を0.156 μmolとなるように添加した。続いて、siRNA溶液を200 μL添加し1分間攪拌後、本溶液にCL-5/PEG-DMPE/DSPC/コレステロールを1.88 μmol/0.784 μmol/0.358 μmol/0.743 μmolとなるように添加した。その後、20%以下イソプロピルアルコール溶液となるよう注射用水を62 mL/秒以上の流速で添加し粗製剤を形成した。得られた粗製剤はアミコンウルトラ（Millipore社製）を用いて濃縮し、さらに溶媒を生理食塩水に置換し、0.2 μmのフィルター（東洋濾紙社製）を用いてクリーンベンチ内でろ過した。さらに得られた製剤のsiRNA濃度を測定し、siRNA濃度で0.1 mg/mLとなるように生理食塩水を用いて希釈することで、製剤130を得た。
試験例8
核酸含有脂質ナノ粒子の平均粒子径測定
粒子径測定装置（Zetasizer Nano ZS, マルバーン（Malvern）社製）で製剤中の核酸含有脂質ナノ粒子の平均粒子径を測定した（表48）。なお表中のPDIは多分散指数(Polydispersity Index)を表す。
Figure 0006910947
Figure 0006910947
Figure 0006910947
その結果、実施例92〜192に記載する製剤30〜130は平均粒子径が小さく、60 nm以下であった。
試験例9
核酸含有脂質ナノ粒子のインビトロ活性評価試験
実施例92〜192で得られた各製剤（製剤30〜130）を、それぞれ以下の方法により、
ルシフェラーゼを強制発現させたヒト子宮頸癌由来細胞株HeLa細胞（Luc2CP-HeLa）に導入した。
核酸の最終濃度が10 nMとなるように、オプティメム（Opti-MEM、Gibco社)で希釈した各製剤を、96ウェルの培養プレートに、20 μLずつ分注した後、1.25%ウシ胎仔血清（FBS、SAFCバイオサイエンス（SAFC Biosciences社）を含む最小必須培地（MEM）に懸濁させたLuc2CP-HeLa細胞を、細胞数7500/80 μL/ウェルとなるように播種し、37℃、5%CO2条件下で培養することで、各製剤をLuc2CP-HeLa細胞内に導入した。また陰性対照の群として何も処理しない細胞を播種した。
各製剤を導入した細胞を37℃の5%CO2インキュベーター内で24時間培養し、ルシフェラーゼ定量システム（Steady-Glo Luciferase Assay System 、プロメガ社、E2520）を用いて、製品に添付された説明書に記載された方法に従い処理した後、発光強度をプレートリーダーで測定した。各製剤処理群の発光量は、陰性対照群の発光量を1としたときの相対的な割合として算出した。表49には各試験回で設置した脂質Aを含有しない比較例4記載の製剤21または比較例6〜9記載の製剤26〜29のLucの発現抑制率を記載した。
表49から明らかなように、脂質Aを含む製剤（製剤30〜130）はLuc2CP-HeLa内に導入するとLucの発現を抑制した。
よって、本発明の脂質Aを含有する脂質ナノ粒子は核酸を細胞内等に導入することができ、インビトロで細胞内に薬物送達することを容易にする製剤であることが明らかとなった。
Figure 0006910947
Figure 0006910947
Figure 0006910947
Figure 0006910947
II-3、CL-1、PEG-DMPE、DSPC、コレステロールの各成分比を変えた核酸含有脂質ナノ粒子を以下のように調製した。
実施例10で得られたII-3、PEG-DMPE、DSPC、コレステロールおよび参考例1で得られたCL-1を含んだ核酸含有脂質ナノ粒子を以下のように調製した。
20 mLの80%イソプロピルアルコールにII-3を0.313 μmolとなるように添加した。続いて、siRNA溶液を200 μL添加し1分間攪拌後、本溶液にCL-1/PEG-DMPE/DSPC/コレステロールを1.04 μmol/0.145 μmol/0.761 μmol/1.66 μmolとなるように添加した。その後、20%以下イソプロピルアルコール溶液となるよう注射用水を62 mL/秒以上の流速で添加し粗製剤を形成した。得られた粗製剤はアミコンウルトラ（Millipore社製）を用いて濃縮し、さらに溶媒を生理食塩水に置換し、0.2 μmのフィルター（東洋濾紙社製）を用いてクリーンベンチ内でろ過した。さらに得られた製剤のsiRNA濃度を測定し、siRNA濃度で0.1 mg/mLとなるように生理食塩水を用いて希釈することで、製剤131を得た。
実施例10で得られたII-3、PEG-DMPE、DSPC、コレステロールおよび参考例1で得られたCL-1を含んだ核酸含有脂質ナノ粒子を以下のように調製した。
20 mLの80%イソプロピルアルコールにII-3を0.313 μmolとなるように添加した。続いて、siRNA溶液を200 μL添加し1分間攪拌後、本溶液にCL-1/PEG-DMPE/DSPC/コレステロールを1.04 μmol/0.145 μmol/0.104 μmol/2.32 μmolとなるように添加した。その後、20%以下イソプロピルアルコール溶液となるよう注射用水を62 mL/秒以上の流速で添加し粗製剤を形成した。得られた粗製剤はアミコンウルトラ（Millipore社製）を用いて濃縮し、さらに溶媒を生理食塩水に置換し、0.2 μmのフィルター（東洋濾紙社製）を用いてクリーンベンチ内でろ過した。さらに得られた製剤のsiRNA濃度を測定し、siRNA濃度で0.1 mg/mLとなるように生理食塩水を用いて希釈することで、製剤132を得た。
実施例10で得られたII-3、PEG-DMPE、DSPC、コレステロールおよび参考例1で得られたCL-1を含んだ核酸含有脂質ナノ粒子を以下のように調製した。
20 mLの80%イソプロピルアルコールにII-3を0.313 μmolとなるように添加した。続いて、siRNA溶液を200 μL添加し1分間攪拌後、本溶液にCL-1/PEG-DMPE/DSPC/コレステロールを3.21 μmol/0.217 μmol/1.61 μmol/0.53 μmolとなるように添加した。その後、20%以下イソプロピルアルコール溶液となるよう注射用水を62 mL/秒以上の流速で添加し粗製剤を形成した。得られた粗製剤はアミコンウルトラ（Millipore社製）を用いて濃縮し、さらに溶媒を生理食塩水に置換し、0.2 μmのフィルター（東洋濾紙社製）を用いてクリーンベンチ内でろ過した。さらに得られた製剤のsiRNA濃度を測定し、siRNA濃度で0.1 mg/mLとなるように生理食塩水を用いて希釈することで、製剤133を得た。
実施例10で得られたII-3、PEG-DMPE、DSPC、コレステロールおよび参考例1で得られたCL-1を含んだ核酸含有脂質ナノ粒子を以下のように調製した。
20 mLの80%イソプロピルアルコールにII-3を0.313 μmolとなるように添加した。続いて、siRNA溶液を200 μL添加し1分間攪拌後、本溶液にCL-1/PEG-DMPE/DSPC/コレステロールを3.48 μmol/0.217 μmol/0.374 μmol/1.50 μmolとなるように添加した。その後、20%以下イソプロピルアルコール溶液となるよう注射用水を62 mL/秒以上の流速で添加し粗製剤を形成した。得られた粗製剤はアミコンウルトラ（Millipore社製）を用いて濃縮し、さらに溶媒を生理食塩水に置換し、0.2 μmのフィルター（東洋濾紙社製）を用いてクリーンベンチ内でろ過した。さらに得られた製剤のsiRNA濃度を測定し、siRNA濃度で0.1 mg/mLとなるように生理食塩水を用いて希釈することで、製剤134を得た。
実施例10で得られたII-3、PEG-DMPE、DSPC、コレステロールおよび参考例1で得られたCL-1を含んだ核酸含有脂質ナノ粒子を以下のように調製した。
20 mLの80%イソプロピルアルコールにII-3を0.313 μmolとなるように添加した。続いて、siRNA溶液を200 μL添加し1分間攪拌後、本溶液にCL-1/PEG-DMPE/DSPC/コレステロールを2.63 μmol/1.18 μmol/1.32 μmol/0.44 μmolとなるように添加した。その後、20%以下イソプロピルアルコール溶液となるよう注射用水を62 mL/秒以上の流速で添加し粗製剤を形成した。得られた粗製剤はアミコンウルトラ（Millipore社製）を用いて濃縮し、さらに溶媒を生理食塩水に置換し、0.2 μmのフィルター（東洋濾紙社製）を用いてクリーンベンチ内でろ過した。さらに得られた製剤のsiRNA濃度を測定し、siRNA濃度で0.1 mg/mLとなるように生理食塩水を用いて希釈することで、製剤135を得た。
比較例10
CL-1、PEG-DMPE、DSPC、コレステロールの各成分比を変えた脂質Aが非含有の核酸含有脂質ナノ粒子を以下のように調製した。
核酸は実施例72記載の1 mg/mL Luc siRNA溶液を用いた。
参考例1で得られたCL-1、PEG-DMPE、DSPCおよびコレステロールはそれぞれ20 mg/mLとなるように100%イソプロピルアルコールに溶解し、脂質ストック溶液とした。ストック溶液は、-20℃で保管し、製剤調製の直前に60℃に加温して脂質を溶解してから室温に戻して用いた。
20 mLの80%イソプロピルアルコールにLuc siRNA溶液を0.2 mL添加した。続いて、CL-1/PEG-DMPE/DSPC/コレステロールを1.04 μmol/0.145 μmol/0.860 μmol/1.88 μmolとなるように各脂質を添加した。その後、20%以下イソプロピルアルコール溶液となるよう注射用水を62 mL/秒以上の流速で添加し粗製剤を形成した。得られた粗製剤はアミコンウルトラ（Millipore社製）を用いて濃縮し、さらに溶媒を生理食塩水に置換し、0.2 μmのフィルター（東洋濾紙社製）を用いてクリーンベンチ内でろ過した。さらに得られた製剤のsiRNA濃度を測定し、siRNA濃度で0.1 mg/mLとなるように生理食塩水を用いて希釈することで、製剤136を得た。
比較例11
CL-1、PEG-DMPE、DSPC、コレステロールの各成分比を変えた脂質Aが非含有の核酸含有脂質ナノ粒子を以下のように調製した。
20 mLの80%イソプロピルアルコールにLuc siRNA溶液を0.2 mL添加した。続いて、CL-1/PEG-DMPE/DSPC/コレステロールを1.04 μmol/0.145 μmol/0.117 μmol/2.62 μmolとなるように各脂質を添加した。その後、20%以下イソプロピルアルコール溶液となるよう注射用水を62 mL/秒以上の流速で添加し粗製剤を形成した。得られた粗製剤はアミコンウルトラ（Millipore社製）を用いて濃縮し、さらに溶媒を生理食塩水に置換し、0.2 μmのフィルター（東洋濾紙社製）を用いてクリーンベンチ内でろ過した。さらに得られた製剤のsiRNA濃度を測定し、siRNA濃度で0.1 mg/mLとなるように生理食塩水を用いて希釈することで、製剤137を得た。
比較例12
CL-1、PEG-DMPE、DSPC、コレステロールの各成分比を変えた脂質Aが非含有の核酸含有脂質ナノ粒子を以下のように調製した。
20 mLの80%イソプロピルアルコールにLuc siRNA溶液を0.2 mL添加した。続いて、CL-1/PEG-DMPE/DSPC/コレステロールを3.21 μmol/0.217 μmol/1.84 μmol/0.61 μmolとなるように各脂質を添加した。その後、20%以下イソプロピルアルコール溶液となるよう注射用水を62 mL/秒以上の流速で添加し粗製剤を形成した。得られた粗製剤はアミコンウルトラ（Millipore社製）を用いて濃縮し、さらに溶媒を生理食塩水に置換し、0.2 μmのフィルター（東洋濾紙社製）を用いてクリーンベンチ内でろ過した。さらに得られた製剤のsiRNA濃度を測定し、siRNA濃度で0.1 mg/mLとなるように生理食塩水を用いて希釈することで、製剤138を得た。
比較例13
CL-1、PEG-DMPE、DSPC、コレステロールの各成分比を変えた脂質Aが非含有の核酸含有脂質ナノ粒子を以下のように調製した。
20 mLの80%イソプロピルアルコールにLuc siRNA溶液を0.2 mL添加した。続いて、CL-1/PEG-DMPE/DSPC/コレステロールを3.48 μmol/0.217 μmol/0.437 μmol/1.75 μmolとなるように各脂質を添加した。その後、20%以下イソプロピルアルコール溶液となるよう注射用水を62 mL/秒以上の流速で添加し粗製剤を形成した。得られた粗製剤はアミコンウルトラ（Millipore社製）を用いて濃縮し、さらに溶媒を生理食塩水に置換し、0.2 μmのフィルター（東洋濾紙社製）を用いてクリーンベンチ内でろ過した。さらに得られた製剤のsiRNA濃度を測定し、siRNA濃度で0.1 mg/mLとなるように生理食塩水を用いて希釈することで、製剤139を得た。
試験例10
核酸含有脂質ナノ粒子の平均粒子径測定
粒子径測定装置（Zetasizer Nano ZS, マルバーン（Malvern）社製）で製剤中の核酸含有脂質ナノ粒子の平均粒子径を測定した（表50）。なお表中のPDIは多分散指数(Polydispersity Index)を表す。
Figure 0006910947
その結果、脂質A(II-3)の含有または非含有に関わらず、実施例193〜197に記載する製剤131〜135および比較例10〜13に記載する製剤136〜139は平均粒子径が小さく、50 nm以下であった。
試験例11
核酸含有脂質ナノ粒子のインビトロ活性評価試験
実施例193〜197で得られた各製剤（製剤131〜135）および比較例10〜13で得られた各製剤（製剤136〜139）を、それぞれ以下の方法により、ルシフェラーゼを強制発現させたヒト子宮頸癌由来細胞株HeLa細胞（Luc2CP-HeLa）に導入した。
核酸の最終濃度が10 nMとなるように、オプティメム（Opti-MEM、Gibco社)で希釈した各製剤を、96ウェルの培養プレートに、20 μLずつ分注した後、1.25%ウシ胎仔血清（FBS、SAFCバイオサイエンス（SAFC Biosciences社）を含む最小必須培地（MEM）に懸濁させたLuc2CP-HeLa細胞を、細胞数7500/80 μL/ウェルとなるように播種し、37℃、5%CO2条件下で培養することで、各製剤をLuc2CP-HeLa細胞内に導入した。また陰性対照の群として何も処理しない細胞を播種した。
各製剤を導入した細胞を37℃の5%CO2インキュベーター内で24時間培養し、ルシフェラーゼ定量システム（Steady-Glo Luciferase Assay System 、プロメガ社、E2520）を用いて、製品に添付された説明書に記載された方法に従い処理した後、発光強度をプレートリーダーで測定した。各製剤処理群の発光量は、陰性対照群の発光量を1としたときの相対的な割合として算出した。
表51から明らかなように、脂質Aを含む製剤（製剤131〜135）は各成分の含有量によらず、Lucの発現を抑制した。
よって、本発明の脂質Aを含有する脂質ナノ粒子は核酸を細胞内等に導入することができ、インビトロで細胞内に薬物送達することを容易にする製剤であることが明らかとなった。
Figure 0006910947
脂質A、脂質B、PEG-DMPE、DSPC、コレステロールを含んだ核酸含有脂質ナノ粒子を以下のように調製した。
製剤23のI-1を実施例4で得られたI-4にした以外、実施例89と同様にして製剤141を得た。
製剤23のI-1を実施例5で得られたI-5にした以外、実施例89と同様にして製剤142を得た。
製剤16のI-1を実施例3で得られたI-3にした以外、実施例84と同様にして製剤143を得た。
製剤107のII-4を実施例6で得られたI-6にした以外、実施例169と同様にして製剤144を得た。
製剤58のII-17を実施例8で得られたII-1にした以外、実施例120と同様にして製剤145を得た。
製剤35のI-5を実施例9で得られたII-2にした以外、実施例97と同様にして製剤146を得た。
製剤16のI-1を実施例14で得られたII-7にした以外、実施例84と同様にして製剤147を得た。
製剤23のI-1を実施例14で得られたII-7にした以外、実施例89と同様にして製剤148を得た。
製剤58のII-17を実施例10で得られたII-3にした以外、実施例120と同様にして製剤149を得た。
製剤58のII-17を実施例19で得られたII-12にした以外、実施例120と同様にして製剤150を得た。
製剤107のII-4を実施例16で得られたII-9にした以外、実施例169と同様にして製剤151を得た。
製剤49のII-1を実施例41で得られたII-32にした以外、実施例111と同様にして製剤152を得た。
製剤49のII-1を実施例49で得られたII-40にした以外、実施例111と同様にして製剤153を得た。
20 mLの80%イソプロピルアルコールに実施例10で得られたII-3を0.313 μmolとなるように添加した。続いて、siRNA溶液を200 μL添加し1分間攪拌後、本溶液にCL-1/PEG-DMPE/DSPC/コレステロールを2.85 μmol/1.176 μmol/0.307 μmol/1.23 μmolとなるように添加した。その後、20%以下イソプロピルアルコール溶液となるよう注射用水を62 mL/秒以上の流速で添加し粗製剤を形成した。得られた粗製剤はアミコンウルトラ（Millipore社製）を用いて濃縮し、さらに溶媒を生理食塩水に置換し、0.2 μmのフィルター（東洋濾紙社製）を用いてクリーンベンチ内でろ過した。さらに得られた製剤のsiRNA濃度を測定し、siRNA濃度で0.1 mg/mLとなるように生理食塩水を用いて希釈することで、製剤154を得た。
製剤35のI-5を実施例31で得られたIII-1にした以外、実施例97と同様にして製剤155を得た。
製剤130のCL-5を参考例1で得られたCL-1にした以外、実施例192と同様にして製剤156を得た。
製剤14のI-1を実施例53で得られたII-44にした以外、実施例82と同様にして製剤157を得た。
製剤14のI-1を実施例54で得られたII-45にした以外、実施例82と同様にして製剤158を得た。
製剤14のI-1を実施例55で得られたII-46にした以外、実施例82と同様にして製剤159を得た。
試験例12
核酸含有脂質ナノ粒子の平均粒子径測定
粒子径測定装置（Zetasizer Nano ZS, マルバーン（Malvern）社製）で製剤中の核酸含有脂質ナノ粒子の平均粒子径を測定した（表52）。なお表中のPDIは多分散指数(Polydispersity Index)を表す。
Figure 0006910947
その結果、実施例198〜216に記載する製剤141〜159は平均粒子径が小さく、50 nm以下であった。
実施例10で得られたII-3または実施例19で得られたII-12と参考例1で得られたCL-1、PEG-DSPE、DSPC、コレステロールの各成分の含有量を変えた核酸含有脂質ナノ粒子を以下のように調製した。
なお、実施例217〜253の核酸は実施例72記載の1 mg/mL Luc siRNA溶液を用い、脂質Aは10 mg/mLとなるように100%エタノールに溶解し、脂質ストック溶液とし、CL-1、PEG-DSPE、DSPCおよびコレステロールはそれぞれ20 mg/mLとなるように100%エタノールに溶解し、脂質ストック溶液とした。各ストック溶液は、-20℃で保管し、製剤調製の直前に60℃に加温して脂質を溶解してから室温に戻して用いた。
実施例10で得られたII-3、PEG-DSPE、コレステロールおよび参考例1で得られたCL-1を含んだ核酸含有脂質ナノ粒子を以下のように調製した。
20 mLの80%エタノールにII-3を0.313 μmolとなるように添加した。続いて、siRNA溶液を200 μL添加し1分間攪拌後、本溶液にCL-1/PEG-DSPE/コレステロールを1.88 μmol/0.235 μmol/1.49 μmolとなるように添加した。その後、20%以下エタノール溶液となるよう注射用水を62 mL/秒以上の流速で添加し粗製剤を形成した。得られた粗製剤はアミコンウルトラ（Millipore社製）を用いて濃縮し、さらに溶媒を生理食塩水に置換し、0.2 μmのフィルター（東洋濾紙社製）を用いてクリーンベンチ内でろ過した。さらに得られた製剤のsiRNA濃度を測定し、siRNA濃度で0.1 mg/mLとなるように生理食塩水を用いて希釈することで、製剤160を得た。
実施例10で得られたII-3、PEG-DSPE、DSPC、コレステロールおよび参考例1で得られたCL-1を含んだ核酸含有脂質ナノ粒子を以下のように調製した。
20 mLの80%エタノールにII-3を0.313 μmolとなるように添加した。続いて、siRNA溶液を200 μL添加し1分間攪拌後、本溶液にCL-1/PEG-DSPE/DSPC/コレステロールを1.88 μmol/0.235 μmol/0.486 μmol/1.01 μmolとなるように添加した。その後、20%以下エタノール溶液となるよう注射用水を62 mL/秒以上の流速で添加し粗製剤を形成した。得られた粗製剤はアミコンウルトラ（Millipore社製）を用いて濃縮し、さらに溶媒を生理食塩水に置換し、0.2 μmのフィルター（東洋濾紙社製）を用いてクリーンベンチ内でろ過した。さらに得られた製剤のsiRNA濃度を測定し、siRNA濃度で0.1 mg/mLとなるように生理食塩水を用いて希釈することで、製剤167を得た。
実施例10で得られたII-3、PEG-DSPE、DSPC、コレステロールおよび参考例1で得られたCL-1を含んだ核酸含有脂質ナノ粒子を以下のように調製した。
20 mLの80%エタノールにII-3を0.313 μmolとなるように添加した。続いて、siRNA溶液を200 μL添加し1分間攪拌後、本溶液にCL-1/PEG-DSPE/DSPC/コレステロールを2.02 μmol/0.235 μmol/1.01 μmol/0.337 μmolとなるように添加した。その後、20%以下エタノール溶液となるよう注射用水を62 mL/秒以上の流速で添加し粗製剤を形成した。得られた粗製剤はアミコンウルトラ（Millipore社製）を用いて濃縮し、さらに溶媒を生理食塩水に置換し、0.2 μmのフィルター（東洋濾紙社製）を用いてクリーンベンチ内でろ過した。さらに得られた製剤のsiRNA濃度を測定し、siRNA濃度で0.1 mg/mLとなるように生理食塩水を用いて希釈することで、製剤162を得た。
実施例10で得られたII-3、PEG-DSPE、DSPC、コレステロールおよび参考例1で得られたCL-1を含んだ核酸含有脂質ナノ粒子を以下のように調製した。
20 mLの80%エタノールにII-3を0.313 μmolとなるように添加した。続いて、siRNA溶液を200 μL添加し1分間攪拌後、本溶液にCL-1/PEG-DSPE/DSPC/コレステロールを2.19 μmol/0.235 μmol/0.236 μmol/0.944 μmolとなるように添加した。その後、20%以下エタノール溶液となるよう注射用水を62 mL/秒以上の流速で添加し粗製剤を形成した。得られた粗製剤はアミコンウルトラ（Millipore社製）を用いて濃縮し、さらに溶媒を生理食塩水に置換し、0.2 μmのフィルター（東洋濾紙社製）を用いてクリーンベンチ内でろ過した。さらに得られた製剤のsiRNA濃度を測定し、siRNA濃度で0.1 mg/mLとなるように生理食塩水を用いて希釈することで、製剤163を得た。
実施例10で得られたII-3、PEG-DSPE、DSPC、コレステロールおよび参考例1で得られたCL-1を含んだ核酸含有脂質ナノ粒子を以下のように調製した。
20 mLの80%エタノールにII-3を0.313 μmolとなるように添加した。続いて、siRNA溶液を200 μL添加し1分間攪拌後、本溶液にCL-1/PEG-DSPE/DSPC/コレステロールを1.52 μmol/0.235 μmol/1.62 μmol/0.236 μmolとなるように添加した。その後、20%以下エタノール溶液となるよう注射用水を62 mL/秒以上の流速で添加し粗製剤を形成した。得られた粗製剤はアミコンウルトラ（Millipore社製）を用いて濃縮し、さらに溶媒を生理食塩水に置換し、0.2 μmのフィルター（東洋濾紙社製）を用いてクリーンベンチ内でろ過した。さらに得られた製剤のsiRNA濃度を測定し、siRNA濃度で0.1 mg/mLとなるように生理食塩水を用いて希釈することで、製剤164を得た。
実施例10で得られたII-3、PEG-DSPE、DSPC、コレステロールおよび参考例1で得られたCL-1を含んだ核酸含有脂質ナノ粒子を以下のように調製した。
20 mLの80%エタノールにII-3を0.313 μmolとなるように添加した。続いて、siRNA溶液を200 μL添加し1分間攪拌後、本溶液にCL-1/PEG-DSPE/DSPC/コレステロールを1.52 μmol/0.235 μmol/0.944 μmol/0.910 μmolとなるように添加した。その後、20%以下エタノール溶液となるよう注射用水を62 mL/秒以上の流速で添加し粗製剤を形成した。得られた粗製剤はアミコンウルトラ（Millipore社製）を用いて濃縮し、さらに溶媒を生理食塩水に置換し、0.2 μmのフィルター（東洋濾紙社製）を用いてクリーンベンチ内でろ過した。さらに得られた製剤のsiRNA濃度を測定し、siRNA濃度で0.1 mg/mLとなるように生理食塩水を用いて希釈することで、製剤165を得た。
実施例10で得られたII-3、PEG-DSPE、DSPC、コレステロールおよび参考例1で得られたCL-1を含んだ核酸含有脂質ナノ粒子を以下のように調製した。
20 mLの80%エタノールにII-3を0.313 μmolとなるように添加した。続いて、siRNA溶液を200 μL添加し1分間攪拌後、本溶液にCL-1/PEG-DSPE/DSPC/コレステロールを1.52 μmol/0.235 μmol/0.236 μmol/1.62 μmolとなるように添加した。その後、20%以下エタノール溶液となるよう注射用水を62 mL/秒以上の流速で添加し粗製剤を形成した。得られた粗製剤はアミコンウルトラ（Millipore社製）を用いて濃縮し、さらに溶媒を生理食塩水に置換し、0.2 μmのフィルター（東洋濾紙社製）を用いてクリーンベンチ内でろ過した。さらに得られた製剤のsiRNA濃度を測定し、siRNA濃度で0.1 mg/mLとなるように生理食塩水を用いて希釈することで、製剤166を得た。
実施例10で得られたII-3、PEG-DSPE、DSPC、コレステロールおよび参考例1で得られたCL-1を含んだ核酸含有脂質ナノ粒子を以下のように調製した。
20 mLの80%エタノールにII-3を0.313 μmolとなるように添加した。続いて、siRNA溶液を200 μL添加し1分間攪拌後、本溶液にCL-1/PEG-DSPE/DSPC/コレステロールを1.01 μmol/0.235 μmol/2.09 μmol/0.270 μmolとなるように添加した。その後、20%以下エタノール溶液となるよう注射用水を62 mL/秒以上の流速で添加し粗製剤を形成した。得られた粗製剤はアミコンウルトラ（Millipore社製）を用いて濃縮し、さらに溶媒を生理食塩水に置換し、0.2 μmのフィルター（東洋濾紙社製）を用いてクリーンベンチ内でろ過した。さらに得られた製剤のsiRNA濃度を測定し、siRNA濃度で0.1 mg/mLとなるように生理食塩水を用いて希釈することで、製剤167を得た。
実施例10で得られたII-3、PEG-DSPE、DSPC、コレステロールおよび参考例1で得られたCL-1を含んだ核酸含有脂質ナノ粒子を以下のように調製した。
20 mLの80%エタノールにII-3を0.313 μmolとなるように添加した。続いて、siRNA溶液を200 μL添加し1分間攪拌後、本溶液にCL-1/PEG-DSPE/DSPC/コレステロールを1.01 μmol/0.235 μmol/1.42 μmol/0.944 μmolとなるように添加した。その後、20%以下エタノール溶液となるよう注射用水を62 mL/秒以上の流速で添加し粗製剤を形成した。得られた粗製剤はアミコンウルトラ（Millipore社製）を用いて濃縮し、さらに溶媒を生理食塩水に置換し、0.2 μmのフィルター（東洋濾紙社製）を用いてクリーンベンチ内でろ過した。さらに得られた製剤のsiRNA濃度を測定し、siRNA濃度で0.1 mg/mLとなるように生理食塩水を用いて希釈することで、製剤168を得た。
実施例10で得られたII-3、PEG-DSPE、DSPC、コレステロールおよび参考例1で得られたCL-1を含んだ核酸含有脂質ナノ粒子を以下のように調製した。
20 mLの80%エタノールにII-3を0.313 μmolとなるように添加した。続いて、siRNA溶液を200 μL添加し1分間攪拌後、本溶液にCL-1/PEG-DSPE/DSPC/コレステロールを1.01 μmol/0.235 μmol/0.742 μmol/1.62 μmolとなるように添加した。その後、20%以下エタノール溶液となるよう注射用水を62 mL/秒以上の流速で添加し粗製剤を形成した。得られた粗製剤はアミコンウルトラ（Millipore社製）を用いて濃縮し、さらに溶媒を生理食塩水に置換し、0.2 μmのフィルター（東洋濾紙社製）を用いてクリーンベンチ内でろ過した。さらに得られた製剤のsiRNA濃度を測定し、siRNA濃度で0.1 mg/mLとなるように生理食塩水を用いて希釈することで、製剤169を得た。
実施例10で得られたII-3、PEG-DSPE、DSPC、コレステロールおよび参考例1で得られたCL-1を含んだ核酸含有脂質ナノ粒子を以下のように調製した。
20 mLの80%エタノールにII-3を0.313 μmolとなるように添加した。続いて、siRNA溶液を200 μL添加し1分間攪拌後、本溶液にCL-1/PEG-DSPE/DSPC/コレステロールを1.01 μmol/0.235 μmol/0.101 μmol/2.26 μmolとなるように添加した。その後、20%以下エタノール溶液となるよう注射用水を62 mL/秒以上の流速で添加し粗製剤を形成した。得られた粗製剤はアミコンウルトラ（Millipore社製）を用いて濃縮し、さらに溶媒を生理食塩水に置換し、0.2 μmのフィルター（東洋濾紙社製）を用いてクリーンベンチ内でろ過した。さらに得られた製剤のsiRNA濃度を測定し、siRNA濃度で0.1 mg/mLとなるように生理食塩水を用いて希釈することで、製剤170を得た。
実施例10で得られたII-3、PEG-DSPE、DSPC、コレステロールおよび参考例1で得られたCL-1を含んだ核酸含有脂質ナノ粒子を以下のように調製した。
20 mLの80%エタノールにII-3を0.313 μmolとなるように添加した。続いて、siRNA溶液を200 μL添加し1分間攪拌後、本溶液にCL-1/PEG-DSPE/DSPC/コレステロールを2.82 μmol/0.353 μmol/0.779 μmol/1.62 μmolとなるように添加した。その後、20%以下エタノール溶液となるよう注射用水を62 mL/秒以上の流速で添加し粗製剤を形成した。得られた粗製剤はアミコンウルトラ（Millipore社製）を用いて濃縮し、さらに溶媒を生理食塩水に置換し、0.2 μmのフィルター（東洋濾紙社製）を用いてクリーンベンチ内でろ過した。さらに得られた製剤のsiRNA濃度を測定し、siRNA濃度で0.1 mg/mLとなるように生理食塩水を用いて希釈することで、製剤171を得た。
実施例10で得られたII-3、PEG-DSPE、DSPC、コレステロールおよび参考例1で得られたCL-1を含んだ核酸含有脂質ナノ粒子を以下のように調製した。
20 mLの80%エタノールにII-3を0.313 μmolとなるように添加した。続いて、siRNA溶液を200 μL添加し1分間攪拌後、本溶液にCL-1/PEG-DSPE/DSPC/コレステロールを3.03 μmol/0.353 μmol/1.56 μmol/0.521 μmolとなるように添加した。その後、20%以下エタノール溶液となるよう注射用水を62 mL/秒以上の流速で添加し粗製剤を形成した。得られた粗製剤はアミコンウルトラ（Millipore社製）を用いて濃縮し、さらに溶媒を生理食塩水に置換し、0.2 μmのフィルター（東洋濾紙社製）を用いてクリーンベンチ内でろ過した。さらに得られた製剤のsiRNA濃度を測定し、siRNA濃度で0.1 mg/mLとなるように生理食塩水を用いて希釈することで、製剤172を得た。
実施例10で得られたII-3、PEG-DSPE、DSPC、コレステロールおよび参考例1で得られたCL-1を含んだ核酸含有脂質ナノ粒子を以下のように調製した。
20 mLの80%エタノールにII-3を0.313 μmolとなるように添加した。続いて、siRNA溶液を200 μL添加し1分間攪拌後、本溶液にCL-1/PEG-DSPE/DSPC/コレステロールを3.39 μmol/0.353 μmol/0.365 μmol/1.46 μmolとなるように添加した。その後、20%以下エタノール溶液となるよう注射用水を62 mL/秒以上の流速で添加し粗製剤を形成した。得られた粗製剤はアミコンウルトラ（Millipore社製）を用いて濃縮し、さらに溶媒を生理食塩水に置換し、0.2 μmのフィルター（東洋濾紙社製）を用いてクリーンベンチ内でろ過した。さらに得られた製剤のsiRNA濃度を測定し、siRNA濃度で0.1 mg/mLとなるように生理食塩水を用いて希釈することで、製剤173を得た。
実施例10で得られたII-3、PEG-DSPE、DSPC、コレステロールおよび参考例1で得られたCL-1を含んだ核酸含有脂質ナノ粒子を以下のように調製した。
20 mLの80%エタノールにII-3を0.313 μmolとなるように添加した。続いて、siRNA溶液を200 μL添加し1分間攪拌後、本溶液にCL-1/PEG-DSPE/DSPC/コレステロールを2.35 μmol/0.353 μmol/2.50 μmol/0.365 μmolとなるように添加した。その後、20%以下エタノール溶液となるよう注射用水を62 mL/秒以上の流速で添加し粗製剤を形成した。得られた粗製剤はアミコンウルトラ（Millipore社製）を用いて濃縮し、さらに溶媒を生理食塩水に置換し、0.2 μmのフィルター（東洋濾紙社製）を用いてクリーンベンチ内でろ過した。さらに得られた製剤のsiRNA濃度を測定し、siRNA濃度で0.1 mg/mLとなるように生理食塩水を用いて希釈することで、製剤174を得た。
実施例10で得られたII-3、PEG-DSPE、DSPC、コレステロールおよび参考例1で得られたCL-1を含んだ核酸含有脂質ナノ粒子を以下のように調製した。
20 mLの80%エタノールにII-3を0.313 μmolとなるように添加した。続いて、siRNA溶液を200 μL添加し1分間攪拌後、本溶液にCL-1/PEG-DSPE/DSPC/コレステロールを2.35 μmol/0.353 μmol/1.46 μmol/1.41 μmolとなるように添加した。その後、20%以下エタノール溶液となるよう注射用水を62 mL/秒以上の流速で添加し粗製剤を形成した。得られた粗製剤はアミコンウルトラ（Millipore社製）を用いて濃縮し、さらに溶媒を生理食塩水に置換し、0.2 μmのフィルター（東洋濾紙社製）を用いてクリーンベンチ内でろ過した。さらに得られた製剤のsiRNA濃度を測定し、siRNA濃度で0.1 mg/mLとなるように生理食塩水を用いて希釈することで、製剤175を得た。
実施例10で得られたII-3、PEG-DSPE、DSPC、コレステロールおよび参考例1で得られたCL-1を含んだ核酸含有脂質ナノ粒子を以下のように調製した。
20 mLの80%エタノールにII-3を0.313 μmolとなるように添加した。続いて、siRNA溶液を200 μL添加し1分間攪拌後、本溶液にCL-1/PEG-DSPE/DSPC/コレステロールを2.35 μmol/0.353 μmol/0.365 μmol/2.50 μmolとなるように添加した。その後、20%以下エタノール溶液となるよう注射用水を62 mL/秒以上の流速で添加し粗製剤を形成した。得られた粗製剤はアミコンウルトラ（Millipore社製）を用いて濃縮し、さらに溶媒を生理食塩水に置換し、0.2 μmのフィルター（東洋濾紙社製）を用いてクリーンベンチ内でろ過した。さらに得られた製剤のsiRNA濃度を測定し、siRNA濃度で0.1 mg/mLとなるように生理食塩水を用いて希釈することで、製剤176を得た。
実施例10で得られたII-3、PEG-DSPE、DSPC、コレステロールおよび参考例1で得られたCL-1を含んだ核酸含有脂質ナノ粒子を以下のように調製した。
20 mLの80%エタノールにII-3を0.313 μmolとなるように添加した。続いて、siRNA溶液を200 μL添加し1分間攪拌後、本溶液にCL-1/PEG-DSPE/DSPC/コレステロールを1.56 μmol/0.353 μmol/3.23 μmol/0.417 μmolとなるように添加した。その後、20%以下エタノール溶液となるよう注射用水を62 mL/秒以上の流速で添加し粗製剤を形成した。得られた粗製剤はアミコンウルトラ（Millipore社製）を用いて濃縮し、さらに溶媒を生理食塩水に置換し、0.2 μmのフィルター（東洋濾紙社製）を用いてクリーンベンチ内でろ過した。さらに得られた製剤のsiRNA濃度を測定し、siRNA濃度で0.1 mg/mLとなるように生理食塩水を用いて希釈することで、製剤177を得た。
実施例10で得られたII-3、PEG-DSPE、DSPC、コレステロールおよび参考例1で得られたCL-1を含んだ核酸含有脂質ナノ粒子を以下のように調製した。
20 mLの80%エタノールにII-3を0.313 μmolとなるように添加した。続いて、siRNA溶液を200 μL添加し1分間攪拌後、本溶液にCL-1/PEG-DSPE/DSPC/コレステロールを1.56 μmol/0.353 μmol/1.15 μmol/2.50 μmolとなるように添加した。その後、20%以下エタノール溶液となるよう注射用水を62 mL/秒以上の流速で添加し粗製剤を形成した。得られた粗製剤はアミコンウルトラ（Millipore社製）を用いて濃縮し、さらに溶媒を生理食塩水に置換し、0.2 μmのフィルター（東洋濾紙社製）を用いてクリーンベンチ内でろ過した。さらに得られた製剤のsiRNA濃度を測定し、siRNA濃度で0.1 mg/mLとなるように生理食塩水を用いて希釈することで、製剤178を得た。
実施例10で得られたII-3、PEG-DSPE、DSPC、コレステロールおよび参考例1で得られたCL-1を含んだ核酸含有脂質ナノ粒子を以下のように調製した。
20 mLの80%エタノールにII-3を0.313 μmolとなるように添加した。続いて、siRNA溶液を200 μL添加し1分間攪拌後、本溶液にCL-1/PEG-DSPE/DSPC/コレステロールを1.56 μmol/0.353 μmol/0.156 μmol/3.49 μmolとなるように添加した。その後、20%以下エタノール溶液となるよう注射用水を62 mL/秒以上の流速で添加し粗製剤を形成した。得られた粗製剤はアミコンウルトラ（Millipore社製）を用いて濃縮し、さらに溶媒を生理食塩水に置換し、0.2 μmのフィルター（東洋濾紙社製）を用いてクリーンベンチ内でろ過した。さらに得られた製剤のsiRNA濃度を測定し、siRNA濃度で0.1 mg/mLとなるように生理食塩水を用いて希釈することで、製剤179を得た。
実施例19で得られたII-12、PEG-DSPE、DSPC、コレステロールおよび参考例1で得られたCL-1を含んだ核酸含有脂質ナノ粒子を以下のように調製した。
20 mLの80%エタノールにII-12を0.313 μmolとなるように添加した。続いて、siRNA溶液を200 μL添加し1分間攪拌後、本溶液にCL-1/PEG-DSPE/DSPC/コレステロールを1.88 μmol/0.235 μmol/0.486 μmol/1.01 μmolとなるように添加した。その後、20%以下エタノール溶液となるよう注射用水を62 mL/秒以上の流速で添加し粗製剤を形成した。得られた粗製剤はアミコンウルトラ（Millipore社製）を用いて濃縮し、さらに溶媒を生理食塩水に置換し、0.2 μmのフィルター（東洋濾紙社製）を用いてクリーンベンチ内でろ過した。さらに得られた製剤のsiRNA濃度を測定し、siRNA濃度で0.1 mg/mLとなるように生理食塩水を用いて希釈することで、製剤180を得た。
製剤162のII-3を実施例19で得られたII-12にした以外、実施例219と同様にして製剤181を得た。
製剤164のII-3を実施例19で得られたII-12にした以外、実施例221と同様にして製剤182を得た。
製剤165のII-3を実施例19で得られたII-12にした以外、実施例222と同様にして製剤183を得た。
製剤166のII-3を実施例19で得られたII-12にした以外、実施例223と同様にして製剤184を得た。
製剤167のII-3を実施例19で得られたII-12にした以外、実施例224と同様にして製剤185を得た。
製剤169のII-3を実施例19で得られたII-12にした以外、実施例226と同様にして製剤186を得た。
製剤170のII-3を実施例19で得られたII-12にした以外、実施例227と同様にして製剤187を得た。
製剤171のII-3を実施例19で得られたII-12にした以外、実施例228と同様にして製剤188を得た。
製剤172のII-3を実施例19で得られたII-12にした以外、実施例229と同様にして製剤189を得た。
製剤173のII-3を実施例19で得られたII-12にした以外、実施例230と同様にして製剤190を得た。
製剤174のII-3を実施例19で得られたII-12にした以外、実施例231と同様にして製剤191を得た。
製剤175のII-3を実施例19で得られたII-12にした以外、実施例232と同様にして製剤192を得た。
製剤176のII-3を実施例19で得られたII-12にした以外、実施例233と同様にして製剤193を得た。
20 mLの80%イソプロピルアルコールにII-12を0.313 μmolとなるように添加した。続いて、siRNA溶液を200 μL添加し1分間攪拌後、本溶液にCL-1/PEG-DSPE/DSPC/コレステロールを1.56 μmol/0.353 μmol/2.19 μmol/1.46 μmolとなるように添加した。その後、20%以下イソプロピルアルコール溶液となるよう注射用水を62 mL/秒以上の流速で添加し粗製剤を形成した。得られた粗製剤はアミコンウルトラ（Millipore社製）を用いて濃縮し、さらに溶媒を生理食塩水に置換し、0.2 μmのフィルター（東洋濾紙社製）を用いてクリーンベンチ内でろ過した。さらに得られた製剤のsiRNA濃度を測定し、siRNA濃度で0.1 mg/mLとなるように生理食塩水を用いて希釈することで、製剤194を得た。
製剤178のII-3を実施例19で得られたII-12にした以外、実施例235と同様にして製剤195を得た。
製剤179のII-3を実施例19で得られたII-12にした以外、実施例236と同様にして製剤196を得た。
試験例13
核酸含有脂質ナノ粒子の平均粒子径測定
粒子径測定装置（Zetasizer Nano ZS, マルバーン（Malvern）社製）で製剤中の核酸含有脂質ナノ粒子の平均粒子径を測定した（表53）。なお表中のPDIは多分散指数(Polydispersity Index)を表す。
Figure 0006910947
Figure 0006910947
その結果、実施例217〜253に記載する製剤160〜196は平均粒子径が小さく、50 nm以下であった。
コラーゲンゲル中における浸透性の評価に用いた核酸含有脂質ナノ粒子の調製
I-1を含有した粒子径の小さい核酸含有脂質ナノ粒子は以下のように調製した。
用いた核酸はセンス鎖［（５‘―Ｙ＿Ｎ（Ｈ）＿ＧＣＣＡＧＡＣＵＵＵＧＵＵＧＧＡＵＵＵＧＡＡＡｔｔ―３’）］と、アンチセンス鎖［（５‘―ＡＡＵＵＵＣＡＡＡ（Ｍ）ＵＣ（Ｍ）ＣＡ（Ｍ）ＡＣ（Ｍ）ＡＡ（Ｍ）ＡＧ（Ｍ）ＵＣ（Ｍ）ＵＧ（Ｍ）ＧＣ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）―３’）］の塩基配列からなる(Ｎ（Ｍ）＝２‘−ＯＭｅ ＲＮＡ、Ｕｐｐｅｒ ｃａｓｅ＝ＲＮＡ、Ｌｏｗｅｒ ｃａｓｅ＝ＤＮＡ、Ｙ＝Ａｌｅｘａ４８８、Ｎ（Ｈ）＝ｓｓＨ ａｍｉｎｏ ｌｉｎｋｅｒを示す）。該siRNAはHPRT1遺伝子の発現を抑制するsiRNAであり、ジーンデザイン社（GeneDesign社）から入手した(以下、「AF488-HPRT1 siRNA」)。AF488-HPRT1 siRNAは1 mg/mLとなるように注射用水に溶解し、AF488-HPRT1 siRNA溶液を調製した。PEG-DSPEおよびDSPCおよびコレステロールは日油より入手した。
実施例1で得られたI-1は10 mg/mLとなるように100%イソプロピルアルコールに溶解し、脂質ストック溶液とした。参考例1で得られたCL-1およびPEG-DSPEおよびDSPCおよびコレステロールは20 mg/mLとなるように100%イソプロピルアルコールに溶解し、脂質ストック溶液とした。ストック溶液は、-20℃で保管し、製剤調製の直前に60℃に加温して脂質を溶解してから室温に戻して用いた。
20 mLの80%イソプロピルアルコールにI-1を0.581 μmolとなるように添加した。続いて、siRNA溶液を200 μL添加し1分間攪拌後、本溶液にCL-1/PEG-DSPE/DSPC/コレステロールを1.88 μmol/0.235 μmol/0.398 μmol/0.827 μmolとなるように添加した。その後、20%以下イソプロピルアルコール溶液となるよう注射用水を62 mL/秒以上の流速で添加し粗製剤を形成した。得られた粗製剤はアミコンウルトラ（Millipore社製）を用いて濃縮し、さらに溶媒を生理食塩水に置換し、0.2 μmのフィルター（東洋濾紙社製）を用いてクリーンベンチ内でろ過した。さらに得られた製剤のsiRNA濃度を測定し、siRNA濃度で0.1 mg/mLとなるように生理食塩水を用いて希釈することで、製剤197を得た。
比較例14
I-1非含有で、粒子径の大きい核酸含有脂質ナノ粒子は以下のように調製した。
PEG-DSPEおよびDSPCおよびコレステロールは日油より入手した。
参考例1で得られたCL-1およびPEG-DSPEおよびDSPCおよびコレステロールは20 mg/mLとなるように100%イソプロピルアルコールに溶解し、脂質ストック溶液とした。ストック溶液は、-20℃で保管し、製剤調製の直前に60℃に加温して脂質を溶解してから室温に戻して用いた。
用いた核酸は実施例80記載のAF488-HPRT1 siRNAを用いた。
20 mLの80%イソプロピルアルコールにAF488-HPRT1 siRNA溶液を0.2 mL添加した。続いて、CL-1/PEG-DSPE/DSPC/コレステロールを1.88 μmol/0.235 μmol/0.587 μmol/1.22 μmolとなるように各脂質を添加した。その後、20%以下イソプロピルアルコール溶液となるよう注射用水を約0.2 mL/秒以下の流速で添加し粗製剤を形成した。得られた粗製剤はアミコンウルトラ（Millipore社製）を用いて濃縮し、さらに溶媒を生理食塩水に置換し、0.2 μmのフィルター（東洋濾紙社製）を用いてクリーンベンチ内でろ過した。さらに得られた製剤のsiRNA濃度を測定し、siRNA濃度で0.1 mg/mLとなるように生理食塩水を用いて希釈することで、製剤198を得た。
比較例15
I-1を含有した粒子径の大きい核酸含有脂質ナノ粒子は以下のように調製した。
PEG-DSPEおよびDSPCおよびコレステロールは日油より入手した。用いた核酸は実施例254記載のAF488-HPRT1 siRNAを用いた。
実施例1で得られたI-1は10 mg/mLとなるように100%イソプロピルアルコールに溶解し、脂質ストック溶液とした。参考例1で得られたCL-1およびPEG-DSPEおよびDSPCおよびコレステロールは20 mg/mLとなるように100%イソプロピルアルコールに溶解し、脂質ストック溶液とした。ストック溶液は、-20℃で保管し、製剤調製の直前に60℃に加温して脂質を溶解してから室温に戻して用いた。
20 mLの80%イソプロピルアルコールにI-1を0.581 μmolとなるように添加した。続いて、siRNA溶液を200 μL添加し1分間攪拌後、本溶液にCL-1/PEG-DSPE/DSPC/コレステロールを1.88 μmol/0.235 μmol/0.398 μmol/0.827 μmolとなるように添加した。その後、20%以下イソプロピルアルコール溶液となるよう注射用水を0.22 mL/秒以下の流速で添加し粗製剤を形成した。得られた粗製剤はアミコンウルトラ（Millipore社製）を用いて濃縮し、さらに溶媒を生理食塩水に置換し、0.2 μmのフィルター（東洋濾紙社製）を用いてクリーンベンチ内でろ過した。さらに得られた製剤のsiRNA濃度を測定し、siRNA濃度で0.1 mg/mLとなるように生理食塩水を用いて希釈することで、製剤199を得た。
試験例14
酸含有脂質ナノ粒子の平均粒子径測定
粒子径測定装置（Zetasizer Nano ZS, マルバーン（Malvern）社製）で製剤中の核酸含有脂質ナノ粒子の平均粒子径を測定した（表54）。なお表中のPDIは多分散指数(Polydispersity Index)を表す。
Figure 0006910947
試験例15
核酸含有脂質ナノ粒子のコラーゲンゲル中における浸透性評価
実施例254および比較例14、15で得られた各製剤について、それぞれ以下の方法により浸透性を評価した。ラット尾由来コラーゲンタイプI（BD Biosciences社）500 μLに1 M Sodium hydroxideを13.4 μL（和光社）および0.17 M EDTA溶液（ナカライテスク社）を68.78 μＬを添加しボルテックス後、500 μLチューブ（アシストチューブ）に添加し室温で１日静置した。そこに、製剤197〜199を添加し、７時間静置した後にルミノーイメージアナライザー（LAS3000、富士フィルム社）にて蛍光観察をした。
図5から明らかなように、粒子径の小さい核酸含有脂質ナノ粒子（製剤197）はコラーゲンゲルの間隙を容易にすり抜けて浸透するのに対して、粒子径の大きい核酸含有脂質ナノ粒子（製剤197および製剤199）はその間隙をすり抜けることができないためにコラーゲンゲルの上部に留まっていることが確認された。
試験例16
核酸含有脂質ナノ粒子のコラーゲンゲル中における浸透性評価
実施例254記載のAF488-HPRT1 siRNA、実施例254で得られた製剤197および比較例15で得られた製剤199について、それぞれ以下の方法により浸透性を評価した。ラット尾由来コラーゲンタイプI（BD Biosciences社）500 μLに1 M Sodium hydroxideを13.4 μL（和光社）および0.17 M EDTA溶液（ナカライテスク社）を68.78 μＬを添加しボルテックス後、1 mL テルモシリンジに充填し、室温で１日静置した。そこに、AF488-HPRT1 siRNA単体、製剤197および製剤199を添加し、24時間静置した後にゲルを回収し、ルミノーイメージアナライザー（LAS3000、富士フィルム社）にて蛍光観察をした。
図6から明らかなように、粒子径の小さい核酸含有脂質ナノ粒子（製剤197）はコラーゲンゲルの間隙を容易にすり抜けて浸透するのに対して、粒子径の大きい核酸含有脂質ナノ粒子（製剤199）はその間隙をすり抜けることができないためにコラーゲンゲルの上部に留まっていることが確認された。また、浸透した距離を測定した結果、図７が示すように、粒子径の小さい核酸含有脂質ナノ粒子（製剤197）は粒子径の大きい核酸含有脂質ナノ粒子（製剤199）に対して約2倍の浸透距離を示した。
本発明により、従来の粒子に比して、安定かつ小型化された核酸含有脂質ナノ粒子を製造することができ、このような安定かつ小型化された核酸含有脂質ナノ粒子を、ほ乳類等に投与することにより、該核酸を、例えば、腫瘍組織深部の細胞内等に容易に導入することができる。
配列番号1は、Luc siRNA センス鎖の塩基配列を示す。
配列番号2は、Luc siRNA アンチセンス鎖の塩基配列を示す。
配列番号3は、AF488-HPRT1 siRNA センス鎖の塩基配列を示す。
配列番号4は、AF488-HPRT1 siRNA アンチセンス鎖の塩基配列を示す。

Claims (12)

1つの4級アンモニウム基を有する親水部および置換基を有していても良い独立した3つの炭化水素基を有する脂質(脂質A)、水溶性高分子の脂質誘導体または脂肪酸誘導体、ならびに核酸を含む、核酸含有脂質ナノ粒子であって、
前記脂質A中の3つの炭化水素基が、直鎖もしくは分枝状の置換されていても良いC8-C24アルキル、C8-C24アルケニルまたはC8-C24アルキニルであり、
前記脂質A中の4級アンモニウム基のモル数が前記核酸中のリン原子のモル数に対して0.1〜10倍モル量であり、
前記核酸含有脂質ナノ粒子の平均粒子径が20〜65 nmであり、
前記脂質Aが、
式(I)
Figure 0006910947
 （式中、
R1〜R3は同一または異なって直鎖もしくは分枝状の置換されていても良いC8-C24アルキル、C8-C24アルケニルまたはC8-C24アルキニルであり、
L1〜L3は同一または異なって存在しないか、-Z1-(CY1Y2)p1-または-Z2-(CY3Y4)p2-Z3-(CY5Y6)p3-（式中、Y1〜Y6は同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルであり、Z1〜Z3は同一または異なって、-O-、-NY7A-、-CO-O-、-O-CO-、-CO-NY7B-、-NY7C-CO-または-NY7D-CO-0-であり（式中、Y7A〜Y7Dは同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルである）、p1〜p3は同一または異なって1〜5の整数である）であり、
X1は置換されていても良いC1-C4アルキルであり、
A1は薬学的に許容される陰イオンである）、
式(II)
Figure 0006910947
 （式中、
R4〜R6は同一または異なって直鎖もしくは分枝状の置換されていても良いC8-C24アルキル、C8-C24アルケニルまたはC8-C24アルキニルであり、
L4〜L6は同一または異なって存在しないか、-Z4-(CY8Y9)p4-または-Z5-(CY10Y11)p5-Z6-(CY12Y13)p6-（式中、Y8〜Y13は同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルであり、Z4〜Z6は同一または異なって、-O-、-NY14A-、-CO-O-、-O-CO-、-CO-NY14B-、-NY14C-CO-または-NY14D-CO-0-であり（式中、Y14A〜Y14Dは同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルである）、p4は0〜5の整数であり、p5は1〜5の整数であり、p6は0〜5の整数である）であり、
L7は存在しないか、-(CY15Y16)p7-、-(CY17Y18)p8-Z7-(CY19Y20)p9-または-(CY21Y22)p10-Z8-(CY23Y24)p11-Z9-(CY25Y26)p12-（式中、Y15〜Y26は同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルであり、Z7〜Z9は同一または異なって、-O-、-NY27A-、-CO-O-、-O-CO-、-CO-NY27B-、-NY27C-CO-または-NY27D-CO-0-であり（式中、Y27A〜Y27Dは同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルである）、p7は1〜5の整数であり、p8は0〜5の整数であり、p9は1〜5の整数であり、p10は0〜5の整数であり、p11は1〜5の整数であり、p12は1〜5の整数である）であり、
B1は、
Figure 0006910947
 （式中、X2およびX3は同一または異なって置換されていても良いC1-C4アルキルであるか、または一緒になって隣接する窒素原子とともに置換されていても良いC4-C6ヘテロ環を形成し、X4は置換されていても良いC1-C4アルキルであり、X5およびX6は同一または異なって置換されていても良いC1-C4アルキルであるか、または一緒になって隣接する窒素原子とともに置換されていても良いC4-C6ヘテロ環を形成し、X7は置換されていても良いC1-C4アルキルであり、Y28〜Y37は同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルであり、Z10およびZ11は同一または異なって-O-、-NY38A-、-CO-O-、-O-CO-、-CO-NY38B-、-NY38C-CO-または-NY38D-CO-0-であり（式中、Y38A〜Y38Dは同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルである）、p13は0〜5の整数であり、p14〜p17は同一または異なって1〜5の整数である）であり、
A2は薬学的に許容される陰イオンである）、
式(III)
Figure 0006910947
 （式中、
R7〜R9は同一または異なって直鎖もしくは分枝状の置換されていても良いC8-C24アルキル、C8-C24アルケニルまたはC8-C24アルキニルであり、
L8〜L10は同一または異なって存在しないか、-Z12-(CY39Y40)p18-または-Z13-(CY41Y42)p19-Z14-(CY43Y44)p20-（式中、Y39〜Y44は同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルであり、Z12〜Z14は同一または異なって、-O-、-NY45A-、-CO-O-、-O-CO-、-CO-NY45B-、-NY45C-CO-、-NY45D-CO-0-または-CO-であり（式中、Y45A〜Y45Dは同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルである）、p18は0〜5の整数であり、p19は1〜5の整数であり、p20は0〜5の整数である）であり、
L11は存在しないか、-(CY46Y47)p21-、-(CY48Y49)p22-Z15-(CY50Y51)p23-または-(CY52Y53)p24-Z16-(CY54Y55)p25-Z17-(CY56Y57)p26-（式中、Y46〜Y57は同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルであり、Z15〜Z17は同一または異なって、-O-、-NY58A-、-CO-O-、-O-CO-、-CO-NY58B-、-NY58C-CO-、-NY58D-CO-0-または-CO-であり（式中、Y58A〜Y58Dは同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルである）、p21は1〜5の整数であり、p22は0〜5の整数であり、p23は1〜5の整数であり、p24は0〜5の整数であり、p25は1〜5の整数であり、p26は1〜5の整数である）であり、
L12は存在しないか、-(CY59Y60)p27-、-(CY61Y62)p28-Z18-(CY63Y64)p29-または-(CY65Y66)p30-Z19-(CY67Y68)p31-Z20-(CY69Y70)p32-（式中、Y59〜Y70は同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルであり、Z18〜Z20は同一または異なって、-O-、-NY71A-、-CO-O-、-O-CO-、-CO-NY71B-、-NY71C-CO-、-NY71D-CO-0-または-CO-であり（式中、Y71A〜Y71Dは同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルである）、p27は1〜5の整数であり、p28は0〜5の整数であり、p29は0〜5の整数であり、p30は0〜5の整数であり、p31は1〜5の整数であり、p32は0〜5の整数である）であり、
J1およびJ2は同一または異なってCY72またはN(式中、Y72は水素原子、ヒドロキシ、置換されていても良いC1-C4アルキル、置換されていても良いC1-C4アルコキシ、または置換されていても良いC1-C4アシルオキシである)であり、
B2は、
Figure 0006910947
 （式中、X8およびX9は同一または異なって置換されていても良いC1-C4アルキルであるか、または一緒になって隣接する窒素原子とともに置換されていても良いC4-C6ヘテロ環を形成し、X10は置換されていても良いC1-C4アルキルであり、X11およびX12は同一または異なって置換されていても良いC1-C4アルキルであるか、または一緒になって隣接する窒素原子とともに置換されていても良いC4-C6ヘテロ環を形成し、X13は置換されていても良いC1-C4アルキルであり、Y73〜Y82は同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルであり、Z21およびZ22は同一または異なって-O-、-NY83A-、-CO-O-、-O-CO-、-CO-NY83B-、-NY83C-CO-または-NY83D-CO-0-であり（式中、Y83A〜Y83Dは同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルである）、p33は0〜5の整数であり、p34〜p37は同一または異なって1〜5の整数である）であり、
A3は薬学的に許容される陰イオンである）、または
式(IV)
Figure 0006910947
 （式中、
R10〜R12は同一または異なって直鎖もしくは分枝状の置換されていても良いC8-C24アルキル、C8-C24アルケニルまたはC8-C24アルキニルであり、
L13は存在しないか、-Z23-(CY83Y84)p38-または-Z24-(CY85Y86)p39-Z25-(CY87Y88)p40-（式中、Y83〜Y88は同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルであり、Z23〜Z25は同一または異なって、-O-、-NY89A-、-CO-O-、-O-CO-、-CO-NY89B-、-NY89C-CO-または-NY89D-CO-0-であり（式中、Y89A〜Y89Dは同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルである）、p38〜p40は同一または異なって1〜5の整数である）であり、
L14およびL15は同一または異なって存在しないか、-Z26-(CY90Y91)p41-または-Z27-(CY92Y93)p42-Z28-(CY94Y95)p43-（式中、Y90〜Y95は同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルであり、Z26〜Z28は同一または異なって、-O-、-NY96A-、-CO-O-、-O-CO-、-CO-NY96B-、-NY96C-CO-、-NY96D-CO-0-または-CO-であり（式中、Y96A〜Y96Dは同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルである）、p41は0〜5の整数であり、p42は1〜5の整数であり、p43は0〜5の整数である）であり、
L16は存在しないか、-(CY97Y98)p44-、-(CY99Y100)p45-Z29-(CY101Y102)p46-または-(CY103Y104)p47-Z30-(CY105Y106)p48-Z31-(CY107Y108)p49-（式中、Y97〜Y108は同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルであり、Z29〜Z31は同一または異なって、-O-、-NY109A-、-CO-O-、-O-CO-、-CO-NY109B-、-NY109C-CO-、-NY109D-CO-0-または-CO-であり（式中、Y109A〜Y109Dは同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルである）、p44は1〜5の整数であり、p45は0〜5の整数であり、p46は1〜5の整数であり、p47は0〜5の整数であり、p48は1〜5の整数であり、p49は1〜5の整数である）であり、
J3はCY110またはN(式中、Y110は水素原子、ヒドロキシ、置換されていても良いC1-C4アルキル、置換されていても良いC1-C4アルコキシ、または置換されていても良いC1-C4アシルオキシである)であり、
X14およびX15は同一または異なって置換されていても良いC1-C4アルキルであるか、または一緒になって隣接する窒素原子とともに置換されていても良いC4-C6ヘテロ環を形成し、
A4は薬学的に許容される陰イオンである）
で表される脂質またはそれらの組み合わせである、核酸含有脂質ナノ粒子。
脂質Aが式（I）で表される脂質であり、式(I)において、L1〜L3のうち1つが-CO-O-(CY1Y2)p1-または-O-CO-(CY1Y2)p1-であるか、L1〜L3のうち2つ以上が同一または異なって-CO-O-(CY1Y2)p1-または-O-CO-(CY1Y2)p1-であり、R1〜R3が直鎖または分枝状のC15-C20アルケニルまたはC9-C18アルキルであり、かつ同一である、請求項１記載の脂質ナノ粒子。
脂質Aが式（II）で表される脂質であり、式(II)において、L4〜L6のうち1つが-CO-O-(CY8Y9)p4-、-O-CO-(CY8Y9)p4-、または-O-CO-(CY10Y11)p5-O-(CY12Y13)p6-であるか、L4〜L6のうち2つ以上が同一または異なって-CO-O-(CY8Y9)p4-、-O-CO-(CY8Y9)p4-、または-O-CO-(CY10Y11)p5-O-(CY12Y13)p6-であり、R4〜R6が直鎖または分枝状のC15-C20アルケニルまたはC9-C18アルキルであり、かつ同一である、請求項１記載の脂質ナノ粒子。
脂質Aが式（III）で表される脂質であり、式(III)において、L8〜L10のうち1つが-CO-O-(CY39Y40)p18-または-O-CO-(CY39Y40)p18-であるか、L8〜L10のうち2つ以上が同一または異なって-CO-O-(CY39Y40)p18または-O-CO-(CY39Y40)p18-であり、R7〜R9が直鎖または分枝状のC15-C20アルケニルまたはC9-C18アルキルである、請求項１記載の脂質ナノ粒子。
脂質Aが式（IV）で表される脂質であり、式(IV)において、L13が-CO-O-(CY83Y84)p38-あるいは-O-CO-(CY83Y84)p38-であるか、L14およびL15のうち1つが-CO-O-(CY90Y91)p41-あるいは-O-CO-(CY90Y91)p41-であるか、L13が-CO-O-(CY83Y84)p38-あるいは-O-CO-(CY83Y84)p38-であり、かつL14およびL15のうち1つが-CO-O-(CY90Y91)p41-あるいは-O-CO-(CY90Y91)p41-であるか、L14およびL15が同一あるいは異なって-CO-O-(CY90Y91)p41-あるいは-O-CO-(CY90Y91)p41-であるか、またはL13が-CO-O-(CY83Y84)p38-あるいは-O-CO-(CY83Y84)p38-であり、かつL14およびL15が同一あるいはは異なって-CO-O-(CY90Y91)p41-または-O-CO-(CY90Y91)p41-であり、R10〜R12が直鎖または分枝状のC15-C20アルケニルまたはC9-C18アルキルである、請求項１記載の脂質ナノ粒子。
核酸含有脂質ナノ粒子の製造方法であって、
(a)水に混和可能な有機溶媒と水との混合溶媒中で、1つの4級アンモニウム基を有する親水部および置換基を有していても良い独立した3つの炭化水素基を有する脂質(脂質A)と、核酸とを混合して、脂質Aと核酸を含む第1の脂質溶液を調製する工程、
(b)第1の脂質溶液に、水溶性高分子の脂質誘導体または脂肪酸誘導体を含む第2の脂質溶液を加えて、第3の脂質溶液を調製する工程、および
(c)第3の脂質溶液に、水または緩衝剤水溶液を添加する工程
を含み、
前記脂質A中の3つの炭化水素基が、直鎖もしくは分枝状の置換されていても良いC8-C24アルキル、C8-C24アルケニルまたはC8-C24アルキニルであり、
前記脂質A中の4級アンモニウム基のモル数が前記核酸中のリン原子のモル数に対して0.1〜10倍モル量であり、
前記核酸含有脂質ナノ粒子の平均粒子径が20〜65 nmであり、
前記脂質Aが、
式(I)
Figure 0006910947
 （式中、
R1〜R3は同一または異なって直鎖もしくは分枝状の置換されていても良いC8-C24アルキル、C8-C24アルケニルまたはC8-C24アルキニルであり、
L1〜L3は同一または異なって存在しないか、-Z1-(CY1Y2)p1-または-Z2-(CY3Y4)p2-Z3-(CY5Y6)p3-（式中、Y1〜Y6は同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルであり、Z1〜Z3は同一または異なって、-O-、-NY7A-、-CO-O-、-O-CO-、-CO-NY7B-、-NY7C-CO-または-NY7D-CO-0-であり（式中、Y7A〜Y7Dは同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルである）、p1〜p3は同一または異なって1〜5の整数である）であり、
X1は置換されていても良いC1-C4アルキルであり、
A1は薬学的に許容される陰イオンである）、
式(II)
Figure 0006910947
 （式中、
R4〜R6は同一または異なって直鎖もしくは分枝状の置換されていても良いC8-C24アルキル、C8-C24アルケニルまたはC8-C24アルキニルであり、
L4〜L6は同一または異なって存在しないか、-Z4-(CY8Y9)p4-または-Z5-(CY10Y11)p5-Z6-(CY12Y13)p6-（式中、Y8〜Y13は同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルであり、Z4〜Z6は同一または異なって、-O-、-NY14A-、-CO-O-、-O-CO-、-CO-NY14B-、-NY14C-CO-または-NY14D-CO-0-であり（式中、Y14A〜Y14Dは同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルである）、p4は0〜5の整数であり、p5は1〜5の整数であり、p6は0〜5の整数である）であり、
L7は存在しないか、-(CY15Y16)p7-、-(CY17Y18)p8-Z7-(CY19Y20)p9-または-(CY21Y22)p10-Z8-(CY23Y24)p11-Z9-(CY25Y26)p12-（式中、Y15〜Y26は同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルであり、Z7〜Z9は同一または異なって、-O-、-NY27A-、-CO-O-、-O-CO-、-CO-NY27B-、-NY27C-CO-または-NY27D-CO-0-であり（式中、Y27A〜Y27Dは同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルである）、p7は1〜5の整数であり、p8は0〜5の整数であり、p9は1〜5の整数であり、p10は0〜5の整数であり、p11は1〜5の整数であり、p12は1〜5の整数である）であり、
B1は、
Figure 0006910947
 （式中、X2およびX3は同一または異なって置換されていても良いC1-C4アルキルであるか、または一緒になって隣接する窒素原子とともに置換されていても良いC4-C6ヘテロ環を形成し、X4は置換されていても良いC1-C4アルキルであり、X5およびX6は同一または異なって置換されていても良いC1-C4アルキルであるか、または一緒になって隣接する窒素原子とともに置換されていても良いC4-C6ヘテロ環を形成し、X7は置換されていても良いC1-C4アルキルであり、Y28〜Y37は同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルであり、Z10およびZ11は同一または異なって-O-、-NY38A-、-CO-O-、-O-CO-、-CO-NY38B-、-NY38C-CO-または-NY38D-CO-0-であり（式中、Y38A〜Y38Dは同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルである）、p13は0〜5の整数であり、p14〜p17は同一または異なって1〜5の整数である）であり、
A2は薬学的に許容される陰イオンである）、
式(III)
Figure 0006910947
 （式中、
R7〜R9は同一または異なって直鎖もしくは分枝状の置換されていても良いC8-C24アルキル、C8-C24アルケニルまたはC8-C24アルキニルであり、
L8〜L10は同一または異なって存在しないか、-Z12-(CY39Y40)p18-または-Z13-(CY41Y42)p19-Z14-(CY43Y44)p20-（式中、Y39〜Y44は同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルであり、Z12〜Z14は同一または異なって、-O-、-NY45A-、-CO-O-、-O-CO-、-CO-NY45B-、-NY45C-CO-、-NY45D-CO-0-または-CO-であり（式中、Y45A〜Y45Dは同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルである）、p18は0〜5の整数であり、p19は1〜5の整数であり、p20は0〜5の整数である）であり、
L11は存在しないか、-(CY46Y47)p21-、-(CY48Y49)p22-Z15-(CY50Y51)p23-または-(CY52Y53)p24-Z16-(CY54Y55)p25-Z17-(CY56Y57)p26-（式中、Y46〜Y57は同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルであり、Z15〜Z17は同一または異なって、-O-、-NY58A-、-CO-O-、-O-CO-、-CO-NY58B-、-NY58C-CO-、-NY58D-CO-0-または-CO-であり（式中、Y58A〜Y58Dは同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルである）、p21は1〜5の整数であり、p22は0〜5の整数であり、p23は1〜5の整数であり、p24は0〜5の整数であり、p25は1〜5の整数であり、p26は1〜5の整数である）であり、
L12は存在しないか、-(CY59Y60)p27-、-(CY61Y62)p28-Z18-(CY63Y64)p29-または-(CY65Y66)p30-Z19-(CY67Y68)p31-Z20-(CY69Y70)p32-（式中、Y59〜Y70は同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルであり、Z18〜Z20は同一または異なって、-O-、-NY71A-、-CO-O-、-O-CO-、-CO-NY71B-、-NY71C-CO-、-NY71D-CO-0-または-CO-であり（式中、Y71A〜Y71Dは同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルである）、p27は1〜5の整数であり、p28は0〜5の整数であり、p29は0〜5の整数であり、p30は0〜5の整数であり、p31は1〜5の整数であり、p32は0〜5の整数である）であり、
J1およびJ2は同一または異なってCY72またはN(式中、Y72は水素原子、ヒドロキシ、置換されていても良いC1-C4アルキル、置換されていても良いC1-C4アルコキシ、または置換されていても良いC1-C4アシルオキシである)であり、
B2は、
Figure 0006910947
 （式中、X8およびX9は同一または異なって置換されていても良いC1-C4アルキルであるか、または一緒になって隣接する窒素原子とともに置換されていても良いC4-C6ヘテロ環を形成し、X10は置換されていても良いC1-C4アルキルであり、X11およびX12は同一または異なって置換されていても良いC1-C4アルキルであるか、または一緒になって隣接する窒素原子とともに置換されていても良いC4-C6ヘテロ環を形成し、X13は置換されていても良いC1-C4アルキルであり、Y73〜Y82は同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルであり、Z21およびZ22は同一または異なって-O-、-NY83A-、-CO-O-、-O-CO-、-CO-NY83B-、-NY83C-CO-または-NY83D-CO-0-であり（式中、Y83A〜Y83Dは同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルである）、p33は0〜5の整数であり、p34〜p37は同一または異なって1〜5の整数である）であり、
A3は薬学的に許容される陰イオンである）、または
式(IV)
Figure 0006910947
 （式中、
R10〜R12は同一または異なって直鎖もしくは分枝状の置換されていても良いC8-C24アルキル、C8-C24アルケニルまたはC8-C24アルキニルであり、
L13は存在しないか、-Z23-(CY83Y84)p38-または-Z24-(CY85Y86)p39-Z25-(CY87Y88)p40-（式中、Y83〜Y88は同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルであり、Z23〜Z25は同一または異なって、-O-、-NY89A-、-CO-O-、-O-CO-、-CO-NY89B-、-NY89C-CO-または-NY89D-CO-0-であり（式中、Y89A〜Y89Dは同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルである）、p38〜p40は同一または異なって1〜5の整数である）であり、
L14およびL15は同一または異なって存在しないか、-Z26-(CY90Y91)p41-または-Z27-(CY92Y93)p42-Z28-(CY94Y95)p43-（式中、Y90〜Y95は同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルであり、Z26〜Z28は同一または異なって、-O-、-NY96A-、-CO-O-、-O-CO-、-CO-NY96B-、-NY96C-CO-、-NY96D-CO-0-または-CO-であり（式中、Y96A〜Y96Dは同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルである）、p41は0〜5の整数であり、p42は1〜5の整数であり、p43は0〜5の整数である）であり、
L16は存在しないか、-(CY97Y98)p44-、-(CY99Y100)p45-Z29-(CY101Y102)p46-または-(CY103Y104)p47-Z30-(CY105Y106)p48-Z31-(CY107Y108)p49-（式中、Y97〜Y108は同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルであり、Z29〜Z31は同一または異なって、-O-、-NY109A-、-CO-O-、-O-CO-、-CO-NY109B-、-NY109C-CO-、-NY109D-CO-0-または-CO-であり（式中、Y109A〜Y109Dは同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルである）、p44は1〜5の整数であり、p45は0〜5の整数であり、p46は1〜5の整数であり、p47は0〜5の整数であり、p48は1〜5の整数であり、p49は1〜5の整数である）であり、
J3はCY110またはN(式中、Y110は水素原子、ヒドロキシ、置換されていても良いC1-C4アルキル、置換されていても良いC1-C4アルコキシ、または置換されていても良いC1-C4アシルオキシである)であり、
X14およびX15は同一または異なって置換されていても良いC1-C4アルキルであるか、または一緒になって隣接する窒素原子とともに置換されていても良いC4-C6ヘテロ環を形成し、
A4は薬学的に許容される陰イオンである）
で表される脂質またはそれらの組み合わせである、前記製造方法。
核酸含有脂質ナノ粒子の製造方法であって、
(a)水に混和可能な有機溶媒と水との混合溶媒中で、1つの4級アンモニウム基を有する親水部および置換基を有していても良い独立した3つの炭化水素基を有する脂質(脂質A)と、核酸と、水溶性高分子の脂質誘導体または脂肪酸誘導体とを混合して、脂質と核酸を含む第1の脂質溶液を調製する工程、および
(b)第1の脂質溶液に、水または緩衝剤水溶液を添加する工程
を含み、
前記脂質A中の3つの炭化水素基が、直鎖もしくは分枝状の置換されていても良いC8-C24アルキル、C8-C24アルケニルまたはC8-C24アルキニルであり、
前記脂質A中の4級アンモニウム基のモル数が前記核酸中のリン原子のモル数に対して0.1〜10倍モル量であり、
前記核酸含有脂質ナノ粒子の平均粒子径が20〜65 nmであり、
前記脂質Aが、
式(I)
Figure 0006910947
 （式中、
R1〜R3は同一または異なって直鎖もしくは分枝状の置換されていても良いC8-C24アルキル、C8-C24アルケニルまたはC8-C24アルキニルであり、
L1〜L3は同一または異なって存在しないか、-Z1-(CY1Y2)p1-または-Z2-(CY3Y4)p2-Z3-(CY5Y6)p3-（式中、Y1〜Y6は同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルであり、Z1〜Z3は同一または異なって、-O-、-NY7A-、-CO-O-、-O-CO-、-CO-NY7B-、-NY7C-CO-または-NY7D-CO-0-であり（式中、Y7A〜Y7Dは同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルである）、p1〜p3は同一または異なって1〜5の整数である）であり、
X1は置換されていても良いC1-C4アルキルであり、
A1は薬学的に許容される陰イオンである）、
式(II)
Figure 0006910947
 （式中、
R4〜R6は同一または異なって直鎖もしくは分枝状の置換されていても良いC8-C24アルキル、C8-C24アルケニルまたはC8-C24アルキニルであり、
L4〜L6は同一または異なって存在しないか、-Z4-(CY8Y9)p4-または-Z5-(CY10Y11)p5-Z6-(CY12Y13)p6-（式中、Y8〜Y13は同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルであり、Z4〜Z6は同一または異なって、-O-、-NY14A-、-CO-O-、-O-CO-、-CO-NY14B-、-NY14C-CO-または-NY14D-CO-0-であり（式中、Y14A〜Y14Dは同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルである）、p4は0〜5の整数であり、p5は1〜5の整数であり、p6は0〜5の整数である）であり、
L7は存在しないか、-(CY15Y16)p7-、-(CY17Y18)p8-Z7-(CY19Y20)p9-または-(CY21Y22)p10-Z8-(CY23Y24)p11-Z9-(CY25Y26)p12-（式中、Y15〜Y26は同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルであり、Z7〜Z9は同一または異なって、-O-、-NY27A-、-CO-O-、-O-CO-、-CO-NY27B-、-NY27C-CO-または-NY27D-CO-0-であり（式中、Y27A〜Y27Dは同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルである）、p7は1〜5の整数であり、p8は0〜5の整数であり、p9は1〜5の整数であり、p10は0〜5の整数であり、p11は1〜5の整数であり、p12は1〜5の整数である）であり、
B1は、
Figure 0006910947
 （式中、X2およびX3は同一または異なって置換されていても良いC1-C4アルキルであるか、または一緒になって隣接する窒素原子とともに置換されていても良いC4-C6ヘテロ環を形成し、X4は置換されていても良いC1-C4アルキルであり、X5およびX6は同一または異なって置換されていても良いC1-C4アルキルであるか、または一緒になって隣接する窒素原子とともに置換されていても良いC4-C6ヘテロ環を形成し、X7は置換されていても良いC1-C4アルキルであり、Y28〜Y37は同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルであり、Z10およびZ11は同一または異なって-O-、-NY38A-、-CO-O-、-O-CO-、-CO-NY38B-、-NY38C-CO-または-NY38D-CO-0-であり（式中、Y38A〜Y38Dは同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルである）、p13は0〜5の整数であり、p14〜p17は同一または異なって1〜5の整数である）であり、
A2は薬学的に許容される陰イオンである）、
式(III)
Figure 0006910947
 （式中、
R7〜R9は同一または異なって直鎖もしくは分枝状の置換されていても良いC8-C24アルキル、C8-C24アルケニルまたはC8-C24アルキニルであり、
L8〜L10は同一または異なって存在しないか、-Z12-(CY39Y40)p18-または-Z13-(CY41Y42)p19-Z14-(CY43Y44)p20-（式中、Y39〜Y44は同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルであり、Z12〜Z14は同一または異なって、-O-、-NY45A-、-CO-O-、-O-CO-、-CO-NY45B-、-NY45C-CO-、-NY45D-CO-0-または-CO-であり（式中、Y45A〜Y45Dは同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルである）、p18は0〜5の整数であり、p19は1〜5の整数であり、p20は0〜5の整数である）であり、 L11は存在しないか、-(CY46Y47)p21-、-(CY48Y49)p22-Z15-(CY50Y51)p23-または-(CY52Y53)p24-Z16-(CY54Y55)p25-Z17-(CY56Y57)p26-（式中、Y46〜Y57は同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルであり、Z15〜Z17は同一または異なって、-O-、-NY58A-、-CO-O-、-O-CO-、-CO-NY58B-、-NY58C-CO-、-NY58D-CO-0-または-CO-であり（式中、Y58A〜Y58Dは同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルである）、p21は1〜5の整数であり、p22は0〜5の整数であり、p23は1〜5の整数であり、p24は0〜5の整数であり、p25は1〜5の整数であり、p26は1〜5の整数である）であり、
L12は存在しないか、-(CY59Y60)p27-、-(CY61Y62)p28-Z18-(CY63Y64)p29-または-(CY65Y66)p30-Z19-(CY67Y68)p31-Z20-(CY69Y70)p32-（式中、Y59〜Y70は同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルであり、Z18〜Z20は同一または異なって、-O-、-NY71A-、-CO-O-、-O-CO-、-CO-NY71B-、-NY71C-CO-、-NY71D-CO-0-または-CO-であり（式中、Y71A〜Y71Dは同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルである）、p27は1〜5の整数であり、p28は0〜5の整数であり、p29は0〜5の整数であり、p30は0〜5の整数であり、p31は1〜5の整数であり、p32は0〜5の整数である）であり、
J1およびJ2は同一または異なってCY72またはN(式中、Y72は水素原子、ヒドロキシ、置換されていても良いC1-C4アルキル、置換されていても良いC1-C4アルコキシ、または置換されていても良いC1-C4アシルオキシである)であり、
B2は、
Figure 0006910947
 （式中、X8およびX9は同一または異なって置換されていても良いC1-C4アルキルであるか、または一緒になって隣接する窒素原子とともに置換されていても良いC4-C6ヘテロ環を形成し、X10は置換されていても良いC1-C4アルキルであり、X11およびX12は同一または異なって置換されていても良いC1-C4アルキルであるか、または一緒になって隣接する窒素原子とともに置換されていても良いC4-C6ヘテロ環を形成し、X13は置換されていても良いC1-C4アルキルであり、Y73〜Y82は同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルであり、Z21およびZ22は同一または異なって-O-、-NY83A-、-CO-O-、-O-CO-、-CO-NY83B-、-NY83C-CO-または-NY83D-CO-0-であり（式中、Y83A〜Y83Dは同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルである）、p33は0〜5の整数であり、p34〜p37は同一または異なって1〜5の整数である）であり、
A3は薬学的に許容される陰イオンである）、または
式(IV)
Figure 0006910947
 （式中、
R10〜R12は同一または異なって直鎖もしくは分枝状の置換されていても良いC8-C24アルキル、C8-C24アルケニルまたはC8-C24アルキニルであり、
L13は存在しないか、-Z23-(CY83Y84)p38-または-Z24-(CY85Y86)p39-Z25-(CY87Y88)p40-（式中、Y83〜Y88は同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルであり、Z23〜Z25は同一または異なって、-O-、-NY89A-、-CO-O-、-O-CO-、-CO-NY89B-、-NY89C-CO-または-NY89D-CO-0-であり（式中、Y89A〜Y89Dは同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルである）、p38〜p40は同一または異なって1〜5の整数である）であり、
L14およびL15は同一または異なって存在しないか、-Z26-(CY90Y91)p41-または-Z27-(CY92Y93)p42-Z28-(CY94Y95)p43-（式中、Y90〜Y95は同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルであり、Z26〜Z28は同一または異なって、-O-、-NY96A-、-CO-O-、-O-CO-、-CO-NY96B-、-NY96C-CO-、-NY96D-CO-0-または-CO-であり（式中、Y96A〜Y96Dは同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルである）、p41は0〜5の整数であり、p42は1〜5の整数であり、p43は0〜5の整数である）であり、
L16は存在しないか、-(CY97Y98)p44-、-(CY99Y100)p45-Z29-(CY101Y102)p46-または-(CY103Y104)p47-Z30-(CY105Y106)p48-Z31-(CY107Y108)p49-（式中、Y97〜Y108は同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルであり、Z29〜Z31は同一または異なって、-O-、-NY109A-、-CO-O-、-O-CO-、-CO-NY109B-、-NY109C-CO-、-NY109D-CO-0-または-CO-であり（式中、Y109A〜Y109Dは同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルである）、p44は1〜5の整数であり、p45は0〜5の整数であり、p46は1〜5の整数であり、p47は0〜5の整数であり、p48は1〜5の整数であり、p49は1〜5の整数である）であり、
J3はCY110またはN(式中、Y110は水素原子、ヒドロキシ、置換されていても良いC1-C4アルキル、置換されていても良いC1-C4アルコキシ、または置換されていても良いC1-C4アシルオキシである)であり、
X14およびX15は同一または異なって置換されていても良いC1-C4アルキルであるか、または一緒になって隣接する窒素原子とともに置換されていても良いC4-C6ヘテロ環を形成し、
A4は薬学的に許容される陰イオンである）
で表される脂質またはそれらの組み合わせである、前記製造方法。
核酸含有脂質ナノ粒子を構成する脂質膜に、1つの4級アンモニウム基を有する親水部、および置換基を有していても良い独立した3つの炭化水素基を有する脂質(脂質A)を使用する、核酸含有脂質ナノ粒子を安定化する方法であって、
前記脂質A中の3つの炭化水素基が、直鎖もしくは分枝状の置換されていても良いC8-C24アルキル、C8-C24アルケニルまたはC8-C24アルキニルであり、
前記脂質A中の4級アンモニウム基のモル数が前記核酸中のリン原子のモル数に対して0.1〜10倍モル量であり、
前記核酸含有脂質ナノ粒子の平均粒子径が20〜65 nmであり、
前記、脂質Aが、
式(I)
Figure 0006910947
 （式中、
R1〜R3は同一または異なって直鎖もしくは分枝状の置換されていても良いC8-C24アルキル、C8-C24アルケニルまたはC8-C24アルキニルであり、
L1〜L3は同一または異なって存在しないか、-Z1-(CY1Y2)p1-または-Z2-(CY3Y4)p2-Z3-(CY5Y6)p3-（式中、Y1〜Y6は同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルであり、Z1〜Z3は同一または異なって、-O-、-NY7A-、-CO-O-、-O-CO-、-CO-NY7B-、-NY7C-CO-または-NY7D-CO-0-であり（式中、Y7A〜Y7Dは同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルである）、p1〜p3は同一または異なって1〜5の整数である）であり、
X1は置換されていても良いC1-C4アルキルであり、
A1は薬学的に許容される陰イオンである）、
式(II)
Figure 0006910947
 （式中、
R4〜R6は同一または異なって直鎖もしくは分枝状の置換されていても良いC8-C24アルキル、C8-C24アルケニルまたはC8-C24アルキニルであり、
L4〜L6は同一または異なって存在しないか、-Z4-(CY8Y9)p4-または-Z5-(CY10Y11)p5-Z6-(CY12Y13)p6-（式中、Y8〜Y13は同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルであり、Z4〜Z6は同一または異なって、-O-、-NY14A-、-CO-O-、-O-CO-、-CO-NY14B-、-NY14C-CO-または-NY14D-CO-0-であり（式中、Y14A〜Y14Dは同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルである）、p4は0〜5の整数であり、p5は1〜5の整数であり、p6は0〜5の整数である）であり、
L7は存在しないか、-(CY15Y16)p7-、-(CY17Y18)p8-Z7-(CY19Y20)p9-または-(CY21Y22)p10-Z8-(CY23Y24)p11-Z9-(CY25Y26)p12-（式中、Y15〜Y26は同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルであり、Z7〜Z9は同一または異なって、-O-、-NY27A-、-CO-O-、-O-CO-、-CO-NY27B-、-NY27C-CO-または-NY27D-CO-0-であり（式中、Y27A〜Y27Dは同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルである）、p7は1〜5の整数であり、p8は0〜5の整数であり、p9は1〜5の整数であり、p10は0〜5の整数であり、p11は1〜5の整数であり、p12は1〜5の整数である）であり、
B1は、
Figure 0006910947
 （式中、X2およびX3は同一または異なって置換されていても良いC1-C4アルキルであるか、または一緒になって隣接する窒素原子とともに置換されていても良いC4-C6ヘテロ環を形成し、X4は置換されていても良いC1-C4アルキルであり、X5およびX6は同一または異なって置換されていても良いC1-C4アルキルであるか、または一緒になって隣接する窒素原子とともに置換されていても良いC4-C6ヘテロ環を形成し、X7は置換されていても良いC1-C4アルキルであり、Y28〜Y37は同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルであり、Z10およびZ11は同一または異なって-O-、-NY38A-、-CO-O-、-O-CO-、-CO-NY38B-、-NY38C-CO-または-NY38D-CO-0-であり（式中、Y38A〜Y38Dは同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルである）、p13は0〜5の整数であり、p14〜p17は同一または異なって1〜5の整数である）であり、
A2は薬学的に許容される陰イオンである）、
式(III)
Figure 0006910947
 （式中、
R7〜R9は同一または異なって直鎖もしくは分枝状の置換されていても良いC8-C24アルキル、C8-C24アルケニルまたはC8-C24アルキニルであり、
L8〜L10は同一または異なって存在しないか、-Z12-(CY39Y40)p18-または-Z13-(CY41Y42)p19-Z14-(CY43Y44)p20-（式中、Y39〜Y44は同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルであり、Z12〜Z14は同一または異なって、-O-、-NY45A-、-CO-O-、-O-CO-、-CO-NY45B-、-NY45C-CO-、-NY45D-CO-0-または-CO-であり（式中、Y45A〜Y45Dは同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルである）、p18は0〜5の整数であり、p19は1〜5の整数であり、p20は0〜5の整数である）であり、
L11は存在しないか、-(CY46Y47)p21-、-(CY48Y49)p22-Z15-(CY50Y51)p23-または-(CY52Y53)p24-Z16-(CY54Y55)p25-Z17-(CY56Y57)p26-（式中、Y46〜Y57は同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルであり、Z15〜Z17は同一または異なって、-O-、-NY58A-、-CO-O-、-O-CO-、-CO-NY58B-、-NY58C-CO-、-NY58D-CO-0-または-CO-であり（式中、Y58A〜Y58Dは同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルである）、p21は1〜5の整数であり、p22は0〜5の整数であり、p23は1〜5の整数であり、p24は0〜5の整数であり、p25は1〜5の整数であり、p26は1〜5の整数である）であり、
L12は存在しないか、-(CY59Y60)p27-、-(CY61Y62)p28-Z18-(CY63Y64)p29-または-(CY65Y66)p30-Z19-(CY67Y68)p31-Z20-(CY69Y70)p32-（式中、Y59〜Y70は同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルであり、Z18〜Z20は同一または異なって、-O-、-NY71A-、-CO-O-、-O-CO-、-CO-NY71B-、-NY71C-CO-、-NY71D-CO-0-または-CO-であり（式中、Y71A〜Y71Dは同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルである）、p27は1〜5の整数であり、p28は0〜5の整数であり、p29は0〜5の整数であり、p30は0〜5の整数であり、p31は1〜5の整数であり、p32は0〜5の整数である）であり、
J1およびJ2は同一または異なってCY72またはN(式中、Y72は水素原子、ヒドロキシ、置換されていても良いC1-C4アルキル、置換されていても良いC1-C4アルコキシ、または置換されていても良いC1-C4アシルオキシである)であり、
B2は、
Figure 0006910947
 （式中、X8およびX9は同一または異なって置換されていても良いC1-C4アルキルであるか、または一緒になって隣接する窒素原子とともに置換されていても良いC4-C6ヘテロ環を形成し、X10は置換されていても良いC1-C4アルキルであり、X11およびX12は同一または異なって置換されていても良いC1-C4アルキルであるか、または一緒になって隣接する窒素原子とともに置換されていても良いC4-C6ヘテロ環を形成し、X13は置換されていても良いC1-C4アルキルであり、Y73〜Y82は同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルであり、Z21およびZ22は同一または異なって-O-、-NY83A-、-CO-O-、-O-CO-、-CO-NY83B-、-NY83C-CO-または-NY83D-CO-0-であり（式中、Y83A〜Y83Dは同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルである）、p33は0〜5の整数であり、p34〜p37は同一または異なって1〜5の整数である）であり、
A3は薬学的に許容される陰イオンである）、または
式(IV)
Figure 0006910947
 （式中、
R10〜R12は同一または異なって直鎖もしくは分枝状の置換されていても良いC8-C24アルキル、C8-C24アルケニルまたはC8-C24アルキニルであり、
L13は存在しないか、-Z23-(CY83Y84)p38-または-Z24-(CY85Y86)p39-Z25-(CY87Y88)p40-（式中、Y83〜Y88は同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルであり、Z23〜Z25は同一または異なって、-O-、-NY89A-、-CO-O-、-O-CO-、-CO-NY89B-、-NY89C-CO-または-NY89D-CO-0-であり（式中、Y89A〜Y89Dは同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルである）、p38〜p40は同一または異なって1〜5の整数である）であり、
L14およびL15は同一または異なって存在しないか、-Z26-(CY90Y91)p41-または-Z27-(CY92Y93)p42-Z28-(CY94Y95)p43-（式中、Y90〜Y95は同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルであり、Z26〜Z28は同一または異なって、-O-、-NY96A-、-CO-O-、-O-CO-、-CO-NY96B-、-NY96C-CO-、-NY96D-CO-0-または-CO-であり（式中、Y96A〜Y96Dは同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルである）、p41は0〜5の整数であり、p42は1〜5の整数であり、p43は0〜5の整数である）であり、
L16は存在しないか、-(CY97Y98)p44-、-(CY99Y100)p45-Z29-(CY101Y102)p46-または-(CY103Y104)p47-Z30-(CY105Y106)p48-Z31-(CY107Y108)p49-（式中、Y97〜Y108は同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルであり、Z29〜Z31は同一または異なって、-O-、-NY109A-、-CO-O-、-O-CO-、-CO-NY109B-、-NY109C-CO-、-NY109D-CO-0-または-CO-であり（式中、Y109A〜Y109Dは同一または異なって水素原子または置換されていても良いC1-C4アルキルである）、p44は1〜5の整数であり、p45は0〜5の整数であり、p46は1〜5の整数であり、p47は0〜5の整数であり、p48は1〜5の整数であり、p49は1〜5の整数である）であり、
J3はCY110またはN(式中、Y110は水素原子、ヒドロキシ、置換されていても良いC1-C4アルキル、置換されていても良いC1-C4アルコキシ、または置換されていても良いC1-C4アシルオキシである)であり、
X14およびX15は同一または異なって置換されていても良いC1-C4アルキルであるか、または一緒になって隣接する窒素原子とともに置換されていても良いC4-C6ヘテロ環を形成し、
A4は薬学的に許容される陰イオンである）
で表される脂質またはそれらの組み合わせである、方法。
請求項1〜5のいずれか1項に記載の核酸含有脂質ナノ粒子を含む、医薬。
静脈内投与用また皮下投与用である、請求項9記載の医薬。
請求項1〜5のいずれか1項に記載の核酸含有脂質ナノ粒子を含む、癌または炎症疾患の治療剤。
静脈内投与用また皮下投与用である、請求項11記載の治療剤。
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