JP6908936B2 - セレノプロテインｐ活性阻害作用を有する成分を含有する、肺高血圧症の予防又は治療剤 - Google Patents

セレノプロテインｐ活性阻害作用を有する成分を含有する、肺高血圧症の予防又は治療剤 Download PDF

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Description

［関連出願の相互参照］
本出願は、２０１６年０６月１７日に出願された、日本国特許出願第２０１６−１２１０３４号明細書（その開示全体が参照により本明細書中に援用される）に基づく優先権を主張する。本発明は、肺高血圧症の予防又は治療剤に関する。
肺高血圧症は、心臓から肺に血液を送る肺動脈の血圧が高くなり心臓及び肺の機能に障害をもたらす疾患であり、一般に「高血圧」と言われる症状とは全く異なる疾患である。また、肺高血圧症は致死性の高い重篤な疾患であるため、その治療法の開発が急がれている。
従来、肺高血圧症の治療としては、カテーテルで血管を広げる治療、血栓を取り除く外科出術等の処置がされているが、より侵襲性の低い治療法が望まれている。また、投薬治療としては、血管拡張剤等が知られているが（非特許文献１等）、かかる治療法で救えない患者は依然として多く、さらなる肺高血圧症治療剤の開発が強く望まれている。
国際公開ＷＯ２０１５／１６３０９８
J Clin Invest. 2012;122(12): 4306-4313 Kalogris et al. Biochemical Pharamacology 2014;90:226-234 Wei et al. Oncotarget 2014;5(14):5819-5831 Satoh et al., Circ. Res. 2014, 115, 738-750. Satoh et al., Cardiovasc. Res. 2009, 81, 226-234. Satoh et al., Circulation, 2006, 113, 1442-1450. Shimizu et al., Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 2013, 33, 2780-2791.
本発明は、これまで肺高血圧症の治療効果について知られていなかった化合物を有効成分とする新規の肺高血圧症予防又は治療剤を提供することにある。
かかる状況の下、本発明者らは数千種類の化合物について検討した結果、いくつかの化合物がセレノプロテインＰの活性を阻害する作用を有すること、かつ当該化合物が、肺高血圧症の原因の一つと言われる、肺動脈平滑筋細胞の異常増殖を抑制すること、そして肺高血圧症の予防治療効果を有することを見出した。本発明は、かかる新規の知見に基づくものである。
従って、本発明は、以下の項を提供する：
項１．セレノプロテインＰ活性阻害作用を有する成分を含有する、肺高血圧症の予防又は治療剤。
項２．セレノプロテインＰ活性阻害作用を有する成分が、サンギナリン、ブファジエノリド及びメチル １０−ヒドロキシ−２，４ａ，６ａ，９，１２ｂ，１４ａ−ヘキサメチル−１１−オキソ−１，２，３，４，４ａ，５，６，６ａ，１１，１２ｂ，１３，１４，１４ａ，１４ｂ−テトラデカヒドロピセン−２−カルボキシレート及びブファジエノリドからなる群より選択される少なくとも一種又はその塩である、項１に記載の肺高血圧症の予防又は治療剤。
項３．経口投与剤である、項１又は２に記載の肺高血圧症の予防又は治療剤。
項４．サンギナリン、ブファジエノリド及びメチル １０−ヒドロキシ−２，４ａ，６ａ，９，１２ｂ，１４ａ−ヘキサメチル−１１−オキソ−１，２，３，４，４ａ，５，６，６ａ，１１，１２ｂ，１３，１４，１４ａ，１４ｂ−テトラデカヒドロピセン−２−カルボキシレート及びブファジエノリドからなる群より選択される少なくとも一種を含有するセレノプロテインＰ活性阻害剤。
項５−１．動物にセレノプロテインＰ活性阻害作用を有する成分の有効量を投与することを含む、肺高血圧症を予防又は治療する方法。
項５−２．セレノプロテインＰ活性阻害作用を有する成分が、サンギナリン、ブファジエノリド及びメチル １０−ヒドロキシ−２，４ａ，６ａ，９，１２ｂ，１４ａ−ヘキサメチル−１１−オキソ−１，２，３，４，４ａ，５，６，６ａ，１１，１２ｂ，１３，１４，１４ａ，１４ｂ−テトラデカヒドロピセン−２−カルボキシレート及びブファジエノリドからなる群より選択される少なくとも一種又はその塩である、項５−１に記載の方法。
項５−３．セレノプロテインＰ活性阻害作用を有する成分が経口投与される、項５−１又は５−２に記載の方法。
項６−１．肺高血圧症の予防又は治療に使用するためのセレノプロテインＰ活性阻害作用を有する成分。
項６−２．サンギナリン、ブファジエノリド及びメチル １０−ヒドロキシ−２，４ａ，６ａ，９，１２ｂ，１４ａ−ヘキサメチル−１１−オキソ−１，２，３，４，４ａ，５，６，６ａ，１１，１２ｂ，１３，１４，１４ａ，１４ｂ−テトラデカヒドロピセン−２−カルボキシレート及びブファジエノリドからなる群より選択される少なくとも一種又はその塩である、項６−１に記載のセレノプロテインＰ活性阻害作用を有する成分。
項６−３．肺高血圧症の予防又は治療がセレノプロテインＰ活性阻害作用を有する成分の経口投与により行われる、項６−１又は６−２に記載のセレノプロテインＰ活性阻害作用を有する成分。
項７−１．肺高血圧症の予防又は治療剤を製造するための、セレノプロテインＰ活性阻害作用を有する成分の使用。
項７−２．セレノプロテインＰ活性阻害作用を有する成分が、サンギナリン、ブファジエノリド及びメチル １０−ヒドロキシ−２，４ａ，６ａ，９，１２ｂ，１４ａ−ヘキサメチル−１１−オキソ−１，２，３，４，４ａ，５，６，６ａ，１１，１２ｂ，１３，１４，１４ａ，１４ｂ−テトラデカヒドロピセン−２−カルボキシレート及びブファジエノリドからなる群より選択される少なくとも一種又はその塩である、項７−１に記載の使用。
項７−３．前記肺高血圧症の予防又は治療剤が経口投与剤である、項７−１又は７−２に記載の使用。
項８−１．動物にサンギナリン、ブファジエノリド及びメチル １０−ヒドロキシ−２，４ａ，６ａ，９，１２ｂ，１４ａ−ヘキサメチル−１１−オキソ−１，２，３，４，４ａ，５，６，６ａ，１１，１２ｂ，１３，１４，１４ａ，１４ｂ−テトラデカヒドロピセン−２−カルボキシレートからなる群より選択される少なくとも一種の有効量を投与することを含む、セレノプロテインＰ活性を阻害する方法。
項８−２．サンギナリン、ブファジエノリド及びメチル １０−ヒドロキシ−２，４ａ，６ａ，９，１２ｂ，１４ａ−ヘキサメチル−１１−オキソ−１，２，３，４，４ａ，５，６，６ａ，１１，１２ｂ，１３，１４，１４ａ，１４ｂ−テトラデカヒドロピセン−２−カルボキシレートからなる群より選択される少なくとも一種が経口投与される、項８−１に記載の方法。
項８−３．前記動物がヒト以外である、項８−１又は８−２に記載の方法。
項８−４．インビトロで行われる、項８−１に記載の方法。
項９−１．セレノプロテインＰ活性阻害に使用するための、サンギナリン、ブファジエノリド及びメチル １０−ヒドロキシ−２，４ａ，６ａ，９，１２ｂ，１４ａ−ヘキサメチル−１１−オキソ−１，２，３，４，４ａ，５，６，６ａ，１１，１２ｂ，１３，１４，１４ａ，１４ｂ−テトラデカヒドロピセン−２−カルボキシレートからなる群より選択される少なくとも一種。
項９−２．セレノプロテインＰ活性阻害が経口投与により行われる、項９−１に記載のサンギナリン、ブファジエノリド及びメチル １０−ヒドロキシ−２，４ａ，６ａ，９，１２ｂ，１４ａ−ヘキサメチル−１１−オキソ−１，２，３，４，４ａ，５，６，６ａ，１１，１２ｂ，１３，１４，１４ａ，１４ｂ−テトラデカヒドロピセン−２−カルボキシレートからなる群より選択される少なくとも一種。
項９−３．ヒト以外の動物におけるセレノプロテインＰ活性阻害に使用するための、項９−１又は９−２に記載のサンギナリン、ブファジエノリド及びメチル １０−ヒドロキシ−２，４ａ，６ａ，９，１２ｂ，１４ａ−ヘキサメチル−１１−オキソ−１，２，３，４，４ａ，５，６，６ａ，１１，１２ｂ，１３，１４，１４ａ，１４ｂ−テトラデカヒドロピセン−２−カルボキシレートからなる群より選択される少なくとも一種。
項９−４．インビトロでのセレノプロテインＰ活性阻害に使用するための、行われる、項９−１に記載のサンギナリン、ブファジエノリド及びメチル １０−ヒドロキシ−２，４ａ，６ａ，９，１２ｂ，１４ａ−ヘキサメチル−１１−オキソ−１，２，３，４，４ａ，５，６，６ａ，１１，１２ｂ，１３，１４，１４ａ，１４ｂ−テトラデカヒドロピセン−２−カルボキシレートからなる群より選択される少なくとも一種。
項１０−１．セレノプロテインＰ活性阻害剤を製造するための、サンギナリン、ブファジエノリド及びメチル １０−ヒドロキシ−２，４ａ，６ａ，９，１２ｂ，１４ａ−ヘキサメチル−１１−オキソ−１，２，３，４，４ａ，５，６，６ａ，１１，１２ｂ，１３，１４，１４ａ，１４ｂ−テトラデカヒドロピセン−２−カルボキシレートからなる群より選択される少なくとも一種の使用。
項１０−２．セレノプロテインＰ活性阻害剤が経口投与剤である、項１０−１に記載の使用。
項１０−３．セレノプロテインＰ活性阻害剤がヒト以外の動物に対するセレノプロテインＰ活性阻害剤である、項１０−１又は１０−２に記載の使用。
項１０−４．セレノプロテインＰ活性阻害剤がインビトロで使用するためのセレノプロテインＰ活性阻害剤である、項１０−１に記載の使用。
本発明によれば、セレノプロテインＰ活性阻害作用を有する成分を用いることによって、新規の肺高血圧症予防又は治療剤を提供することができる。
実施例１−１におけるセレノプロテインＰ遺伝子発現を示す。 実施例１−２におけるウェスタンブロッティングの結果を示す。 実施例２における右室収縮期圧の測定結果を示す。 実施例２における左心室及び心室中隔重量に対する右心室自由壁重量の比を示す。 実施例２におけるアルファ−平滑筋アクチン染色の結果を示す。図中、Nが非筋性化、Pが部分的筋性化、Mが完全筋性化の割合を示す。 実施例３における右室収縮期圧の測定結果を示す。 実施例３における左心室及び心室中隔重量に対する右心室自由壁重量の比を示す。 実施例４における右室収縮期圧の測定結果を示す。 実施例４における左心室及び心室中隔重量に対する右心室自由壁重量の比を示す。 実施例５における各試験のプロトコル概略図又は結果を示す。
肺高血圧症の予防又は治療剤
本発明は、セレノプロテインＰ活性阻害作用を有する成分を含有する、肺高血圧症の予防又は治療剤を提供する。
ここで、セレノプロテインＰとは、分子中にセレノシステインを含むセレノプロテインのうち、血漿中で最も一般的に見られるタンパク質であり、１０個のセレノシステインを含んでいる点等でその他のセレノプロテインと構造が異なっている。また、セレノプロテインＰは、肝臓で合成されると考えられている。本発明において、ある化合物がセレノプロテインＰ活性阻害作用を有するか否かは本願実施例１−１記載の方法に準じて確認することができる。
セレノプロテインＰの活性を阻害する化合物としては、サンギナリン、ブファジエノリド、メチル １０−ヒドロキシ−２，４ａ，６ａ，９，１２ｂ，１４ａ−ヘキサメチル−１１−オキソ−１，２，３，４，４ａ，５，６，６ａ，１１，１２ｂ，１３，１４，１４ａ，１４ｂ−テトラデカヒドロピセン−２−カルボキシレート等の化合物又はその塩が挙げられる。本明細書において、サンギナリン、ブファジエノリド、メチル １０−ヒドロキシ−２，４ａ，６ａ，９，１２ｂ，１４ａ−ヘキサメチル−１１−オキソ−１，２，３，４，４ａ，５，６，６ａ，１１，１２ｂ，１３，１４，１４ａ，１４ｂ−テトラデカヒドロピセン−２−カルボキシレート等のセレノプロテインＰの活性を阻害する化合物を単に化合物Ａと略することもある。従って、本発明は、化合物Ａ又はその塩を含有する、肺高血圧症の予防又は治療剤を提供する。
本発明の有効成分である、サンギナリン（sanguinarine）又はその塩（塩化物等）は、下記構造を有する化合物またはその塩であり、公知の物質である：
Figure 0006908936
サンギナリンはこれまで悪性腫瘍の治療薬としての研究が行われてきた（非特許文献２）。しかし、サンギナリンがセレノプロテインＰの活性を阻害することも、肺高血圧症の予防又は治療効果を有することもこれまで一切報告されていない。従って、本発明の効果は、従来技術から予想し得ないものである。
本明細書において、本発明の有効成分である、ブファジエノリドは、下記式（Ｉ−Ａ）又は（ＩＩ−Ａ）で表される基本骨格を有するステロイドの総称を指す：
Figure 0006908936
例えば、ブファジエノリド又はその塩としては、例えば、下記式（Ｉ）又は（ＩＩ）で表される化合物等が挙げられ、式（Ｉ）で表される化合物又はその塩が好ましい：
Figure 0006908936
［式中、Ｒ１は水素、水酸基又はアセチルオキシ基を示す。Ｒ２は水素又は水酸基を示す。］。
より具体的には、ブファジエノリド又はその塩としては、例えば、下記構造を有する化合物又はその塩が好ましい：
Figure 0006908936
Figure 0006908936
。これらの化合物のうち
Figure 0006908936
で示される５ａ，７−ジヒドロキシ−９ａ，１１ａ−ジメチル−１−（２−オキソ−２Ｈ−ピラン−５−イル）ヘキサデカヒドロナフト［１’，２’：６，７］インデノ［１，７ａ−ｂ］オキシレン−２−イル アセテート（5a,7-dihydroxy-9a,11a-dimethyl-1-(2-oxo-2H-pyran-5-yl)hexadecahydronaphtho[1',2':6,7]indeno[1,7a-b]oxiren-2-yl acetate）が好ましい。
より具体的には、例えば、下記構造を有するシノブフォタリン（cinobufotalin、CAS 1108-68-5［（１Ｒ，２Ｒ，２ａＲ，３ａＳ，５ａＳ，７Ｓ，９ａＲ，１１ａＲ）−５ａ，７−ジヒドロキシ−９ａ，１１ａ−ジメチル−１−（２−オキソ−２Ｈ−ピラン−５−イル）ヘキサデカヒドロナフト［１’，２’：６，７］インデノ［１，７ａ−ｂ］オキシレン−２−イル アセテート（(1R,2R,2aR,3aS,5aS,7S,9aR,11aR)-5a,7-dihydroxy-9a,11a-dimethyl-1-(2-oxo-2H-pyran-5-yl)hexadecahydronaphtho[1',2':6,7]indeno[1,7a-b]oxiren-2-yl acetate）］）、ブファタリン（bufatalin）、シノブファギン（cinobufagin）、ブファリン（bufalin）等が挙げられる：
Figure 0006908936
Figure 0006908936
。これらの化合物又はその塩のうち、シノブフォタリン又はその塩が好ましい。ブファジエノリド又はその塩は、公知の物質であるかまたは公知の物質から適宜作製することができる。
ブファジエノリドはヒキガエルの耳下線及び皮脂腺からの分泌物から単離されたステロイドである。かかるヒキガエルの耳下線及び皮脂腺からの分泌物は強心利尿剤として用いられている。しかし、ブファジエノリドがセレノプロテインＰの活性を阻害することも、肺高血圧症の予防又は治療効果を有することもこれまで一切報告されていない。従って、本発明の効果は、従来技術から予想し得ないものである。
本発明の有効成分である、メチル １０−ヒドロキシ−２，４ａ，６ａ，９，１２ｂ，１４ａ−ヘキサメチル−１１−オキソ−１，２，３，４，４ａ，５，６，６ａ，１１，１２ｂ，１３，１４，１４ａ，１４ｂ−テトラデカヒドロピセン−２−カルボキシレート（methyl 10-hydroxy-2,4a,6a,9,12b,14a-hexamethyl-11-oxo-1,2,3,4,4a,5,6,6a,11,12b,13,14,14a,14b-tetradecahydropicene-2-carboxylate）又はその塩は、下記構造を有する公知の化合物、又はその塩である：
Figure 0006908936
尚、本発明において、メチル １０−ヒドロキシ−２，４ａ，６ａ，９，１２ｂ，１４ａ−ヘキサメチル−１１−オキソ−１，２，３，４，４ａ，５，６，６ａ，１１，１２ｂ，１３，１４，１４ａ，１４ｂ−テトラデカヒドロピセン−２−カルボキシレートを、単に化合物Ｐと示すこともある。
化合物Ｐのうち、下記構造を有するプリスティメリン（pristimerin、CAS 1258-84-0［メチル （２Ｒ，４ａＳ，６ａＳ，１２ｂＲ，１４ａＳ，１４ｂＲ）−１０−ヒドロキシ−２，４ａ，６ａ，９，１２ｂ，１４ａ−ヘキサメチル−１１−オキソ−１，２，３，４，４ａ，５，６，６ａ，１１，１２ｂ，１３，１４，１４ａ，１４ｂ−テトラデカヒドロピセン−２−カルボキシレート（methyl (2R,4aS,6aS,12bR,14aS,14bR)-10-hydroxy-2,4a,6a,9,12b,14a-hexamethyl-11-oxo-1,2,3,4,4a,5,6,6a,11,12b,13,14,14a,14b-tetradecahydropicene-2-carboxylate）］）が好ましい：
Figure 0006908936
化合物Ｐはこれまで悪性腫瘍の治療薬としての研究が行われてきた（非特許文献３）。しかし、化合物ＰがセレノプロテインＰの活性を阻害することも、肺高血圧症の予防又は治療効果を有することもこれまで一切報告されていない。従って、本発明の効果は、従来技術から予想し得ないものである。
本発明者らは、セレノプロテインＰの活性を阻害する作用を示すサンギナリン、シノブフォタリン及びプリスティメリンが全て肺高血圧症の予防又は治療に有効であることを見出した。従って、サンギナリン、シノブフォタリン及びプリスティメリン又はこれらの塩が好ましい化合物ではあるものの、それ以外にセレノプロテインＰの活性を阻害する化合物があった場合も同様に、肺高血圧症の予防又は治療に有効であるものと考えられる。セレノプロテインＰ活性の阻害作用が肺高血圧症の予防又は治療にどのように関連するかは明らかではないが、例えば、セレノプロテインＰが肺高血圧症由来肺動脈平滑筋細胞の増殖を抑制し(実際に本3化合物はすべてヒト肺高血圧症由来肺動脈平滑筋細胞の増殖抑制効果を示している)肺高血圧症における肺血管リモデリングを抑制することによって治療効果を示すこと等が推測される。尚、本発明者らは、被験対象由来の試料中のセレノプロテインＰタンパク質の濃度を指標として、肺高血圧症の検査ができること、すなわちセレノプロテインＰタンパク質を肺高血圧症を検出するためのバイオマーカーとして使用し得ることを見出している（特許文献１）。しかし、一般的に、ある疾患の発生、進行には、多種多様な因子が関与していることが多いため、１つの因子を遮断しても所望の治療効果が得られるとは限らない。従って、ある疾患を検出するためのバイオマーカーを当該疾患を治療するための標的とした治療を試みても、必ずしも好ましい結果が得られていない。
また、本発明の対象疾患である肺高血圧症については、その原因が十分には明らかにされておらず、またセレノプロテインＰ活性が具体的にどのように関与しているかも明らかになっていない。従って、セレノプロテインＰ活性阻害作用を有する成分が肺高血圧症の予防又は治療に有効であったという本発明者らの見出した新たな知見は、従来技術から予想し得ないものである。
尚、本発明において、化合物Ａとしては、サンギナリン、ブファジエノリド、前記化合物Ｐ、これらの塩等の低分子化合物（例えば、分子量５０００以下、好ましくは２０００以下、より好ましくは１０００以下、より好ましくは５００以下の化合物等）；核酸、抗体等の高分子化合物（上記低分子化合物より分子量の大きい化合物。例えば、分子量が５００を超え、好ましくは１０００を超え、より好ましくは２０００を超え、より好ましくは５０００を超える化合物等）等が挙げられる。化合物Ａとして低分子化合物を用いる場合、サンギナリン、ブファジエノリド、前記化合物Ｐ、これらの塩等が好ましく、サンギナリン、ブファジエノリド、これらの塩等がより好ましく、サンギナリン又はその塩等がより好ましい。
また、本発明の有効成分である化合物Ａ又はその塩が、光学異性体、立体異性体、位置異性体等の異性体を有する場合には、いずれの異性体であるか明記がない限り、いずれの異性体を用いた発明も、種々の異性体の混合物を用いた発明も本発明に包含され得る。
本発明の有効成分である化合物Ａの塩は、酸付加塩と塩基との塩を包含する。酸付加塩の具体例として、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、硫酸塩、過塩素酸塩、リン酸塩等の無機酸塩、シュウ酸塩、マロン酸塩、コハク酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、乳酸塩、リンゴ酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、安息香酸塩、トリフルオロ酢酸塩、酢酸塩、メタンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、トリフルオロメタンスルホン酸塩等の有機酸塩、及びグルタミン酸塩、アスパラギン酸塩等の酸性アミノ酸塩が挙げられる。塩基との塩の具体例としては、ナトリウム塩、カリウム塩又はカルシウム塩のようなアルカリ金属又はアルカリ土類金属塩、ピリジン塩、トリエチルアミン塩のような有機塩基との塩、リジン、アルギニン等の塩基性アミノ酸との塩が挙げられる。また、本発明の有効成分である化合物Ａがカチオンである場合、化合物Ａの塩には、ハロゲン化物（塩化物等）等も包含される。
本発明の有効成分である化合物Ａは、水和物又は溶媒和物の形で存在することもあるので、これらの水和物及び溶媒和物もまた本発明の有効成分である化合物に包含される。
溶媒和物を形成する溶媒としては、エタノール、プロパノール等のアルコール、酢酸等の有機酸、酢酸エチル等のエステル類、テトラヒドロフラン、ジエチルエーテル等のエーテル類、アセトン等のケトン類、ＤＭＳＯ等が例示される。
本発明においては、本発明の有効成分である化合物Ａ又はその塩そのものを肺高血圧症の予防又は治療剤として用いても、薬学的に許容される各種担体（例えば、例えば等張化剤、キレート剤、安定化剤、ｐＨ調節剤、防腐剤、抗酸化剤、溶解補助剤、粘稠化剤等）と組み合わせた医薬組成物として用いてもよい。
等張化剤としては、例えば、グルコース、トレハロース、ラクトース、フルクトース、マンニトール、キシリトール、ソルビトール等の糖類、グリセリン、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール等の多価アルコール類、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム等の無機塩類等が挙げられる。これらの等張化剤は、１種単独で、又は２種以上を組み合わせて用いることができる。
キレート剤としては、例えば、エデト酸二ナトリウム、エデト酸カルシウム二ナトリウム、エデト酸三ナトリウム、エデト酸四ナトリウム、エデト酸カルシウム等のエデト酸塩類、エチレンジアミン四酢酸塩、ニトリロ三酢酸又はその塩、ヘキサメタリン酸ソーダ、クエン酸等が挙げられる。これらのキレート剤は、１種単独で、又は２種以上を組み合わせて用いることができる。
安定化剤としては、例えば、亜硫酸水素ナトリウム等が挙げられる。
ｐＨ調節剤としては、例えば、塩酸、炭酸、酢酸、クエン酸等の酸が挙げられ、さらに水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等のアルカリ金属水酸化物、炭酸ナトリウム等のアルカリ金属炭酸塩又は炭酸水素塩、酢酸ナトリウム等のアルカリ金属酢酸塩、クエン酸ナトリウム等のアルカリ金属クエン酸塩、トロメタモール等の塩基等が挙げられる。これらのｐＨ調節剤は、１種単独で、又は２種以上を組み合わせて用いることができる。
防腐剤としては、例えば、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸エチル、パラオキシ安息香酸プロピル、パラオキシ安息香酸ブチル等のパラオキシ安息香酸エステル、グルコン酸クロルヘキシジン、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、塩化セチルピリジニウム等の第４級アンモニウム塩、アルキルポリアミノエチルグリシン、クロロブタノール、ポリクォード、ポリヘキサメチレンビグアニド、クロルヘキシジン等が挙げられる。これらの防腐剤は、１種単独で、又は２種以上を組み合わせて用いることができる。
抗酸化剤としては、例えば、亜硫酸水素ナトリウム、乾燥亜硫酸ナトリウム、ピロ亜硫酸ナトリウム、濃縮混合トコフェロール等が挙げられる。これらの抗酸化剤は、１種単独で、又は２種以上を組み合わせて用いることができる。
溶解補助剤としては、例えば、安息香酸ナトリウム、グリセリン、Ｄ−ソルビトール、ブドウ糖、プロピレングリコール、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、マクロゴール、Ｄ−マンニトール等が挙げられる。これらの溶解補助剤は、１種単独で、又は２種以上を組み合わせて用いることができる。
粘稠化剤としては、例えば、ポリエチレングリコール、メチルセルロース、エチルセルロース、カルメロースナトリウム、キサンタンガム、コンドロイチン硫酸ナトリウム、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール等が挙げられる。これらの粘稠化剤は、１種単独で、又は２種以上を組み合わせて用いることができる。
また、上記医薬組成物は、化合物Ａ又はその塩以外に、肺高血圧症の予防又は治療作用を有するとされている化合物をさらに含んでいてもよい。肺高血圧症の予防又は治療作用を有することが知られている化合物としては、例えば、エポプロステノール、シルデナフィル、ボセンタン等が挙げられる。これらの化合物は、１種単独で、又は２種以上を組み合わせて用いることができる。
医薬組成物の実施形態において、組成物中の化合物Ａ又はその塩の含有量は特に限定されず、化合物Ａの含有量換算で、例えば、９０質量％以上、７０質量％以上、５０質量％以上、３０質量％以上、１０質量％以上、５質量％以上、１質量％以上等の条件から適宜設定できる。
製剤形態は、特に限定されず、例えば錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、シロップ剤等の経口投与剤； 注射剤（静脈注射、筋肉注射、局所注射等）、含嗽剤、点滴剤、外用剤（軟膏、クリーム、貼付薬、吸入薬）、座剤等の非経口投与剤等の各種製剤形態を挙げることができる。上記製剤形態のうち、好ましいものとしては、例えば、経口投与剤（錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、シロップ剤等）、外用剤（軟膏、クリーム、貼付薬、吸入薬）等が挙げられる。
本発明において、化合物Ａ又はその塩の投与量は、投与経路、患者の年齢、体重、症状等によって異なり一概に規定できないが、化合物Ａの投与量として、成人に対する１日投与量が通常、約５０００ｍｇ以下、好ましくは約１０００ｍｇ以下、より好ましくは５００ｍｇ以下になる量とすればよい。化合物Ａ又はその塩の投与量の下限も特に限定されず、例えば、化合物Ａの投与量として、成人に対する１日投与量が通常、１ｍｇ以上、好ましくは１０ｍｇ以上、より好ましくは１００ｍｇ以上の範囲で適宜設定できる。１日１回投与する場合は、１製剤中にこの量が含まれていればよく、１日３回投与する場合は、１製剤中にこの３分の１量が含まれていればよい。
本発明の肺高血圧症の予防又は治療剤は、哺乳動物等の患者に投与される。哺乳動物としては、ヒト、サル、マウス、ラット、ウサギ、ネコ、イヌ、ブタ、ウシ、ウマ、ヒツジ等が挙げられる。
本発明の肺高血圧症の予防又は治療剤は、少なくとも肺動脈平滑筋細胞の異常増殖を抑制することにより肺高血圧症を予防、治療緩和する。従って、本発明は、化合物Ａ又はその塩を含む肺動脈平滑筋細胞の異常増殖抑制剤も提供する。肺動脈平滑筋細胞の異常増殖抑制剤の有効成分、製剤形態、投与量等は、肺高血圧症の予防又は治療剤と同様である。
セレノプロテインＰ活性阻害剤
本発明は、また、サンギナリン、ブファジエノリド及び化合物Ｐからなる群より選択される少なくとも一種又はその塩を含有するセレノプロテインＰ活性阻害剤も提供する。セレノプロテインＰ活性阻害剤の有効成分、製剤形態、投与量等は、肺高血圧症の予防又は治療剤と同様である。
前述したように、サンギナリン、ブファジエノリド及び化合物Ｐ又はこれらの塩がセレノプロテインＰ阻害活性を示すことは知られておらす、本発明者らが、新たに見出した知見である。前述のようにサンギナリン、ブファジエノリド及び化合物Ｐからなる群より選択される少なくとも一種を用いることによって、セレノプロテインＰ活性を抑制することができる。従って、本発明にかかるセレノプロテインＰ活性阻害剤は、セレノプロテインＰ活性抑制により処置し得る疾患の予防又は治療剤として用いることができる。セレノプロテインＰ活性抑制により処置し得る疾患としては、特に限定されないがＩＩ型糖尿病等の糖尿病等が挙げられる。
以下に、以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されない。
実施例１−１
１０％のウシ胎児血清（Fetal bovine serum; ＦＢＳ）を含む標準培地にて培養された肺動脈性肺高血圧症由来肺動脈平滑筋細胞に対して、サンギナリン（ＳＳＸ社製（Ｃａｔ．Ｎｏ．１８４５，Sanguinarine Chloride １０ｍｇ）を１００％ジメチルスルホキシド（Dimethyl sulfoxide, ＤＭＳＯ）に溶解し、２ｍＭとしたもの）、シノブフォタリン（Ｓｉｇｍａ社製（Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｃ１１４７−１０ＭＧ，シノブフォタリン１０ｍｇ）を１００％ＤＭＳＯに溶解し、２ｍＭとしたもの）、プリスティメリン（ＲＳＤ社製（Ｃａｔ．Ｎｏ．３７３１／５０，プリスティメリン５０ｍｇ）を１００％ＤＭＳＯに溶解し、２ｍＭとしたもの）をそれぞれ最終濃度が５μＭとなるよう添加し、２４時間培養を行った（各群 ｎ＝４）。
24時間後にこれらの細胞からtotal RNAを抽出・精製し、ＲＴ−ＰＣＲによりセレノプロテインＰ遺伝子発現の変化をコントロール群(同濃度のＤＭＳＯを含む１０％FBS標準培地)と比較した。尚、セレノプロテインＰ遺伝子発現は、Glyceraldehyde-3-Phosphate Dehydrogenase (ＧＡＰＤＨ)を内部標準として補正した値を用いた。
その結果は図１に示す通り、いずれの化合物を投与した場合においても肺動脈平滑筋細胞からのセレノプロテインＰ遺伝子発現が有意に抑制された（いずれの化合物を投与した場合においても、セレノプロテインＰ遺伝子発現はコントロールに対して統計的に有意な差を示した）。
実施例１−２
また、サンギナリンに関しては、Ｃ５７ＢＬ／６マウス（各群 ｎ＝８）に対してサンギナリン投与（５ｍｇ／ｋｇ／日、２８日間連日、経口投与）を行った。同時に１０％低酸素環境下で飼育して低酸素誘発肺高血圧モデルマウスを作成し検討した結果、肺におけるセレノプロテインＰ蛋白発現がコントロールに比してサンギナリン投与群にて有意に抑制されるウェスタンブロッティング結果を得た(図２)。
実施例２ サンギナリン
８週齢、雄、Ｃ５７ＢＬ６／Ｊマウス（各群 ｎ＝８）に対してサンギナリン投与（５ｍｇ／ｋｇ／日、２８日間連日、経口投与）を行った。サンギナリンはＳＳＸ社製（Ｃａｔ．Ｎｏ．１８４５，Sanguinarine Chloride １０ｍｇ）を使用した。調整方法は、サンギナリンをまず１００％ＤＭＳＯに溶解し、１００μｇ／μｌとし、さらにこれをphosphate buffered saline (ＰＢＳ)に溶解し、最終濃度１μｇ／μｌとした。コントロール群はＤＭＳＯが同濃度となるようにＰＢＳに溶解し調整した（１％ＤＭＳＯ）。
試験開始日より、マウスを１０％Ｏ２低酸素環境下で飼育し、低酸素誘発性肺高血圧症モデルマウスを作成した。同日より、コントロール群と治療群の試験溶液を、マウス用ゾンデを用いて直接マウスの胃内に１日１回投与した。投与量は、試験期間中連日マウスの体重測定を行い、５ｍｇ／ｋｇ／日となるよう個別に投与量を算出した。
投与期間（＝低酸素飼育期間）は２８日間。
２８日の連日投与後、肺血行力学、右心肥大を終点（低酸素刺激開始後２８日目）において評価した。肺血行力学評価は、右内頸静脈より挿入した圧測定用カテーテル(トランソニック・サイセンス社)により直接右室収縮期圧（ＲＶＳＰ）を測定することにより行った。また、右心肥大の測定は、摘出した心臓組織において右心室自由壁（ＲＶ）重量を測定し、左心室と心室中隔（ＬＶ＋Ｓｅｐｔｕｍ）重量に対する比（ＲＶ／（ＬＶ＋Ｓｅｐｔｕｍ））を算出することにより評価した。尚、ＲＶ／（ＬＶ＋Ｓｅｐｔｕｍ）は右室肥大の指標となり、数値が大きいほど右室肥大をきたしていることを示す。結果を図３及び４に示す。また、肺血管の再構築を評価するために、肺組織切片におけるアルファ−平滑筋アクチン（α−ＳＭＡ）染色を２８日目に実施した。肺組織切片におけるアルファ−平滑筋アクチン（α−ＳＭＡ）免疫染色を行い、α−ＳＭＡ陽性を示す末梢肺動脈の筋性化の程度(非筋性化、部分的筋性化、完全筋性化の3段階に分類)を定量評価することにより、肺血管の再構築の評価を行った。具体的には、直径２０〜７０μｍの肺動脈弾性板の二重化を各切片につき約１００本程度ずつ評価した。ここで、内弾性板と外弾性板との二重化が、肺動脈の全周の５０％未満のものを非筋性化とし、当該二重化が肺動脈の全周の５０％以上、１００％未満のものを部分的筋性化とし、当該二重化が肺動脈の全周に及んでいるものを完全筋性化とした。結果を図５に示す。図に示すように、慢性低酸素刺激による右室収縮期圧、右心肥大について、コントロール群に比べてサンギナリン投与群で有意な減弱を認めた。
実施例３ ブファジエノリド
８週齢、雄、Ｃ５７ＢＬ６／Ｊマウス（各群ｎ＝８）に対してシノブフォタリン投与（５ｍｇ／ｋｇ／日、２８日間連日、腹腔内投与）を行った。シノブフォタリンはＳｉｇｍａ社製（Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｃ１１４７−１０ＭＧ，シノブフォタリン１０ｍｇ）を使用。調整方法は、シノブフォタリンをまず１００％ＤＭＳＯに溶解し、３０μｇ／μｌとし、さらにこれをＰＢＳに溶解し、最終濃度０．３μｇ／μｌとした。コントロール群はＤＭＳＯが同濃度となるようにＰＢＳに溶解し調整した（１％ＤＭＳＯ）。試験開始日より、マウスを１０％Ｏ２低酸素環境下で飼育し、低酸素誘発性肺高血圧症モデルマウスを作成した。同日より、コントロール群と治療群の試験溶液を腹腔内に連日投与開始した。投与量は、試験期間中連日マウスの体重測定を行い、５ｍｇ／ｋｇ／日となるよう個別に投与量を算出した。
投与期間（＝低酸素飼育期間）は２８日間。
２８日の連日投与後、肺血行力学、右心肥大を終点（低酸素刺激開始後２８日目）において評価した。また、肺血管の再構築を評価するために、肺組織切片におけるアルファ−平滑筋アクチン（α−ＳＭＡ）染色を２８日目に実施した。肺血行力学、右心肥大の具体的な測定、評価は、実施例２と同様の手法を用いた。
結果を図６、７に示す。図に示すように、慢性低酸素刺激による右室収縮期圧、右心肥大について、コントロール群に比べてシノブフォタリン投与群で有意な減弱を認めた。
実施例４ プリスティメリン
８週齢、雄、Ｃ５７ＢＬ６／Ｊマウス（各群ｎ＝８）に対してプリスティメリン投与（１ｍｇ／ｋｇ／日、２８日間隔日、腹腔内投与）を行った。プリスティメリンはＲＳＤ社製（Ｃａｔ．Ｎｏ．３７３１／５０，プリスティメリン５０ｍｇ）を使用した。調整方法は、プリスティメリンをまず１００％ＤＭＳＯに溶解し、６μｇ／μｌとし、さらにこれをＰＢＳに溶解し、最終濃度０．０６μｇ／μｌとした。コントロール群はＤＭＳＯが同濃度となるようにＰＢＳに溶解し調整した（１％ＤＭＳＯ）。
試験開始日より、マウスを１０％Ｏ２低酸素環境下で飼育し、低酸素誘発性肺高血圧症モデルマウスを作成した。同日より、コントロール群と治療群の試験溶液を腹腔内に隔日で投与開始した。投与量は、試験期間中連日マウスの体重測定を行い、１ｍｇ／ｋｇ／日となるよう個別に投与量を算出した。
投与期間（＝低酸素飼育期間）は２８日間。
２８日の隔日投与後、肺血行力学、右心肥大を終点（低酸素刺激開始後２８日目）において評価した。また、肺血管の再構築を評価するために、肺組織切片におけるアルファ−平滑筋アクチン（α−ＳＭＡ）染色を２８日目に実施した。肺血行力学、右心肥大の具体的な測定、評価は、実施例２と同様の手法を用いた。
結果を図８、９に示す。図に示すように、慢性低酸素刺激による右室収縮期圧、右心肥大について、コントロール群に比べてプリスティメリン投与群で有意な減弱を認めた。
実施例５ サンギナリン
サンギナリンの肺動脈性肺高血圧（ＰＡＨ）に対する治療効果をさらに評価するために、別の肺高血圧動物モデルを用いた。具体的には以下の通り：
方法
動物試験
本試験においては、コントロールには、同腹子又はビヒクル処理した群を用いた。Ｓｕｇｅｎ／低酸素誘発高血圧モデルラットを肺高血圧（ＰＨ）の評価に用いた（非特許文献４）。肺高血圧の発症を評価するために、右室収縮期圧（ＲＶＳＰ）、右心室肥大（ＲＶＨ）を測定した（非特許文献４〜６）。
右心カテーテルについては、１．４−Ｆ（ラット）圧測定用カテーテル（トランソニック・サイセンス社）を右内頸静脈より挿入し、右心室でＲＶＳＰを測定した（非特許文献７）。
Ｓｕｇｅｎ／低酸素モデルにおいては、ラット（Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ，雄，７−１０週齢）にＶＥＧＦ受容体阻害剤ＳＵ５４１６（Sigma-Aldrich, St Louis, MO）を、イソフラン麻酔下で皮下注射し（２０ｍｇ ｐｅｒ ｋｇ ｂｏｄｙ ｗｅｉｇｈｔ）、次いで、低酸素（１０％Ｏ２）に３週間曝露した。所定の期間、以下の処置をした後、ラットをイソフルラン（１．５％）で麻酔し、右心カテーテルを行った。全てのデータは、PowerLab data acquisition system (AD Instruments, Bella Vista, Australia）を用いて分析し、連続する５０回拍分以上を平均した（非特許文献４〜６)。血清サンプルを麻酔下でラット下大静脈から採取し、２，５００ｇで１０分間を２回、遠心分離し、プロテアーゼインヒビターカクテル (Sigma-Aldrich）を添加し、そしてアリコートをすぐに−８０℃で保存した。
右心室肥大の評価
ホルムアルデヒドで固定した乾燥心臓を摘出し、右心室自由壁（ＲＶ）、左心室（ＬＶ）及び心室中隔から切り離した。左心室と心室中隔（ＬＶ＋Ｓｅｐｔｕｍ）の重量に対する右心室自由壁（ＲＶ）重量の比［ＲＶ／（ＬＶ＋Ｓ）］を測定して、ＲＶＨの程度を評価した（非特許文献４）。
Ｓｕｇｅｎ／低酸素誘発ＰＨラットに対するサンギナリン処置
ラット（Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ、雄、７−１０週齢）に、ＶＥＧＦ受容体阻害剤ＳＵ５４１６（Sigma-Aldrich）を、イソフラン麻酔下で皮下注射し（２０ｍｇ ｐｅｒ ｋｇ ｂｏｄｙ ｗｅｉｇｈｔ）、次いで、低酸素（１０％Ｏ２）に３週間曝露した（ｈｙｐｏｘｉａ＋ＳＵ５４１６）。ｄａｙ２１に、ラットにランダムに、通常酸素下（２１％Ｏ２）で、４週間、サンギナリン（５ｍｇ ｐｅｒ ｋｇ ｂｏｄｙ ｗｅｉｇｈｔ）又はビヒクルを経口投与した。ビヒクルを投与した群をビヒクルコントロールと示す。また、ｄａｙ１に生理食塩水を注射し、７週間通常酸素に曝露したラットを(通常酸素)コントロールとして用いた。体重及び摂餌量は、サンギナリン群とビヒクルコントロール群とで有意な差はなかった。ｄａｙ４９に、ラットをイソフラン（１．０％）で麻酔し、ＲＶＳＰ、ＲＶＨ及び肺血管リモデリングを測定することによりＰＨの発症を評価した。
結果
ラットを、２１日間慢性低酸素とＶＥＧＦ受容体阻害剤ＳＵ５４１６に曝露した（図１０Ａ）。このＳｕｇｅｎ／低酸素モデルラットに対し、ＰＨの発症後、サンギナリン処置を開始した（図１０Ａ）。２８日間のサンギナリンの経口投与は、体重及び摂餌量に影響しなかった（図１０Ｂ）。しかし、サンギナリン処置により、ビヒクルコントロールと比較してＲＶＳＰ及びＲＶＨは低下した（図１０Ｃ）。また、肺におけるＳｅＰのタンパク質レベルは、Ｓｕｇｅｎ／低酸素処置により増加した（図１０Ｄ）。これに対し、サンギナリン処置により、肺におけるＳｅＰ発現も有意に減少した。上記のように、サンギナリンは、動物モデルのＰＨをｉｎ ｖｉｖｏで緩和した。
尚、図１０における各図についての説明は以下の通り：
図１０（Ａ） Ｓｕｇｅｎ／低酸素ラットモデルに対するサンギナリン投与についてのプロトコル概略図。ラットを慢性的低酸素状態（１０％Ｏ２）及びＶＥＧＦ受容体阻害剤ＳＵ５４１６の組み合わせに２１日間曝露し、その後、５ｍｇ／ｋｇ ｂｏｄｙ ｗｅｉｇｈｔのサンギナリン又はビヒクルを２８日間経口投与した。
図１０（Ｂ） サンギナリン又はビヒクル投与開始時点から４週間のＳｕｇｅｎ／低酸素ラットにおける体重の推移（ｎ＝１２）。データは、ｍｅａｎ±ＳＥＭを示す。
図１０（Ｃ） 慢性低酸素及びＶＥＧＦ受容体阻害剤ＳＵ５４１６に２１日間曝露し、ＰＡＨが誘導された後、ビヒクル及びサンギナリンの経口投与処置を２８日間行ったラットにおける右室収縮期圧（ＲＶＳＰ，図１０（Ｃ）左）及び右心室肥大（ＲＶＨ、図（Ｃ）右）。(通常酸素)コントロールラット（ＳＵ５４１６注射も慢性低酸素への曝露もされなかったラット）はｎ＝６、ビヒクル又はサンギナリン処置されたラットは各群ｎ＝１２。
図１０（Ｄ） サンギナリン処置 有又は無の、通常酸素コントロールラット又は低酸素＋ＳＵ５４１６ラットにおけるＳｅＰタンパク質の定量。データは、ｍｅａｎ±ＳＥＭで示す。＊ｐ＜０．０５。パラメータの比較は、ｏｎｅ−ｗａｙ又はｔｗｏ−ｗａｙ ＡＮＯＶＡ及び多重比較のためのＴｕｋｅｙ’ｓ ＨＳＤ検定にて行った。

Claims (5)

  1. サンギナリン、ブファジエノリド及びメチル １０−ヒドロキシ−２，４ａ，６ａ，９，１２ｂ，１４ａ−ヘキサメチル−１１−オキソ−１，２，３，４，４ａ，５，６，６ａ，１１，１２ｂ，１３，１４，１４ａ，１４ｂ−テトラデカヒドロピセン−２−カルボキシレートからなる群より選択される少なくとも一種又はその塩を含有する、肺高血圧症の予防又は治療剤。
  2. 前記肺高血圧症が肺動脈性肺高血圧症である、請求項１に記載の肺高血圧症の予防又は治療剤。
  3. サンギナリン、ブファジエノリド及びメチル １０−ヒドロキシ−２，４ａ，６ａ，９，１２ｂ，１４ａ−ヘキサメチル−１１−オキソ−１，２，３，４，４ａ，５，６，６ａ，１１，１２ｂ，１３，１４，１４ａ，１４ｂ−テトラデカヒドロピセン−２−カルボキシレートからなる群より選択される少なくとも一種を含有するセレノプロテインＰ活性阻害剤。
  4. 肺高血圧症の予防又は治療剤を製造するための、サンギナリン、ブファジエノリド及びメチル １０−ヒドロキシ−２，４ａ，６ａ，９，１２ｂ，１４ａ−ヘキサメチル−１１−オキソ−１，２，３，４，４ａ，５，６，６ａ，１１，１２ｂ，１３，１４，１４ａ，１４ｂ−テトラデカヒドロピセン−２−カルボキシレートからなる群より選択される少なくとも一種又はその塩の使用。
  5. セレノプロテインＰ活性阻害剤を製造するための、サンギナリン、ブファジエノリド及びメチル １０−ヒドロキシ−２，４ａ，６ａ，９，１２ｂ，１４ａ−ヘキサメチル−１１−オキソ−１，２，３，４，４ａ，５，６，６ａ，１１，１２ｂ，１３，１４，１４ａ，１４ｂ−テトラデカヒドロピセン−２−カルボキシレートからなる群より選択される少なくとも一種の使用。
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