JP6877533B2 - 試料の加圧凍結およびｘ線結晶構造解析用のモジュール式試料ホルダ - Google Patents

Description

本発明は加圧凍結およびＸ線結晶構造解析用のモジュール式試料ホルダと、このような形式のモジュール式試料ホルダを用いて試料を加圧凍結し、かつＸ線結晶構造解析する方法とに関する。

先行技術
Ｘ線結晶構造解析は、結晶の原子および／または分子構造を識別する方法である。試料は、Ｘ線放射のビームにより標的にされる。このビームは、試料の結晶構造により回折される。回折されたビームの角度および強度を測定することにより、結晶中の電子密度の三次元モデルを作成することができる。この電子密度から、結晶中の原子の平均位置、その化学結合、乱れおよび様々な別の情報を特定することができる。Ｘ線結晶学解析用のＸ線放射は、たとえばシンクロトロンにより形成することができる。

Ｘ線結晶構造解析は、蛋白質のような大きな生体分子の構造を特定するために使用することができる。Ｘ線結晶構造解析中の蛋白質結晶に対する、Ｘ線により引き起こされる放射線損傷を減じるために、試料は、Ｘ線結晶構造解析の前に加圧凍結により低温の温度へと冷却することができる。

加圧凍結（ＨＰＦ）は、水を含む試料または組織標本を高圧を加えながら急速に凍結するための方法である。加圧凍結により、試料のガラス化（つまり氷晶の形成なしに凍結すること）が達成され、その過程で水は、氷晶の核形成を引き起こすことなしに液状からアモルファスの状態へと変えられる。したがって、試料の低温固定または低温固定化を達成することができる。試料の細胞組成物を、著しい構造劣化を引き起こすことなしに位置固定させることができる。

蛋白質結晶の加圧凍結の詳細な説明のためには、Burkhardt, Anja等，”Fast High-Pressure Freezing of Protein Crystals in Their Mother Liquor”. Acta Crystallographica Section F: Structural Biology and Crystallization Communications 68.Pt 4 (2012): 495-500. PMC. Web. 24 Aug. 2016が参照される。

試料の加圧凍結のために、通常は第１の試料ホルダが使用される。凍結工程後に、試料は、第１の試料ホルダから分離しなければならず、かつＸ線結晶構造解析用の第２の試料ホルダに配置しなければならない。異なる試料ホルダ間でのこの移動は、複雑かつ時間を消耗する手順であり、試料の損傷および汚染の恐れをもたらす。

この移動の手間を最小限にし、加圧凍結のステップとＸ線結晶構造解析のステップとの間での試料の損傷または汚染の恐れを減じることが望まれている。

発明の開示
この目的は、独立請求項に記載の特徴による、モジュール式試料ホルダと、試料の加圧凍結および／またはＸ線結晶構造解析の方法とにより達成される。本発明の別の利点および実施形態は、従属請求項および以下の説明ならびに添付の図面による実施例から明らかとなる。本発明に係るモジュール式試料ホルダおよび本発明に係る方法の利点および実施形態は、同様に以下で明らかとなる。

本発明に係るモジュール式試料ホルダは、Ｘ線結晶構造解析の過程でその結晶構造が分析される生体分子、特に蛋白質の結晶を有するか、または含んでいる試料にとって特に好適である。Ｘ線結晶構造解析のためのＸ線放射は、特にシンクロトロンにより形成することができる。

本発明の第１の態様によれば、モジュール式試料ホルダは、試料保持エレメントと拡張エレメントとを有している。これらの試料保持エレメントと拡張エレメントは互いに接続可能であり、かつその反対に、互いに分離可能である。

試料保持エレメントは、細管と、基部エレメントとを有している。細管は、特に細管の上面において試料を保持するために適合されている。この目的のためには、細管は、対応する保持エレメント、たとえばループを有していてよい。基部エレメントは、特に細管の底面において、つまり試料を保持しない細管端部において細管を保持するために適合されている。細管は、特に基部エレメントに堅固に取り付けられていてよく、または基部エレメントから取外し可能であってよい。基部エレメントは、特に細管のための対応する保持エレメントを有している。この保持エレメントは、たとえば基部エレメントの上面に配置することができる。細管は、特に基部エレメントの上面に対して垂直にまたはほぼ垂直に配置されている。

基部エレメントの底面から細管の上面までの第１の距離は、ｄ _１ である。この第１の距離ｄ _１ は特に、試料保持エレメントを加圧凍結するための加圧凍結ユニットに合うように寸法設計されている。したがって、試料保持エレメントは、特に、特別な型の加圧凍結ユニットのために設計されかつ寸法設計されている。試料の加圧凍結を実施するために、好適には試料保持エレメントのみが拡張エレメントに接続されることなしに使用され得る。

しかし、試料保持エレメント自体は、通常はＸ線結晶構造解析ユニットのためには使用することができない。なぜならば、試料保持エレメントは、対応する結晶構造解析ユニット内に合わないからである。通常、試料保持エレメントは、この結晶構造解析ユニットのためには小さすぎる。したがって、試料のＸ線結晶構造解析を実施するために、試料保持エレメントと拡張エレメントとが互いに接続される。その結果、拡張エレメントは、基部エレメントに、特に基部エレメントの底面に接続されるように適合されている。拡張エレメントと基部エレメントとが互いに接続されている場合、拡張エレメントの底面から細管の上面までの第２の距離はｄ_２である。この第２の距離ｄ_２は、第１の距離ｄ_１よりも大きい。第２の距離ｄ_２は、特に試料のＸ線結晶構造解析を実施するためのＸ線結晶構造解析ユニット内に合うように寸法設計されている。

このように組み立てられたモジュール式試料ホルダは、特に、特定の型のＸ線結晶構造解析ユニットのために設計されかつ寸法設計されている。特に、拡張エレメントは、Ｘ線結晶構造解析のために使用可能ではないような試料保持エレメントを、対応するＸ線結晶構造解析ユニット内で使用可能な試料ホルダ内に適合させるように設計されかつ寸法設計されている。

本発明の第２の態様によれば、モジュール式試料ホルダは、試料保持エレメントとカートリッジとを有している。これらの試料保持エレメントとカートリッジとは互いに接続可能であり、かつその反対に、互いに分離可能である。

上記と同様に、試料保持エレメントは、試料を保持するために適合された細管と、細管を保持するために適合された基部エレメントとを有している。

カートリッジは、その内部に封入エレメントを有している。細管および封入エレメントは、細管が封入エレメントの内部に配置され得るように形成されている。この封入エレメントは特に、カートリッジの内部のキャビティとして、特に細管キャビティとして構成されていてよい。したがって試料保持エレメントは、このカートリッジ内に合うように設計されている。

この封入エレメントの直径は、特に細管の直径よりも僅かにだけ大きい。凍結工程後に、接続された試料保持エレメントとカートリッジとは、保管領域に保管することができる。Ｘ線結晶構造解析のために、試料保持エレメントは、このカートリッジから分離される。

したがって、試料保持エレメントは、特にカートリッジ内に完全に合うように設計されかつ寸法設計されている。試料保持エレメントとカートリッジとの組合わせは、特に特別な型の加圧凍結ユニットのために設計されている。試料の加圧凍結を実施するために、試料保持エレメントとカートリッジとは互いに接続される。

本発明は、試料の加圧凍結と続くＸ線結晶構造解析の両方を同一の試料ホルダで実施することを簡単な形式で可能にする。本発明とは異なり、先行技術によれば、試料は、まず第１の試料ホルダを用いて凍結される。この第１の試料ホルダは、対応する加圧凍結ユニットにおいてしか使用することができない。次いで試料は、第１の試料ホルダから分離しなければならず、第２の試料ホルダに配置しなければならない。この第２の試料ホルダは、対応するＸ線結晶構造解析ユニットにおいてしか使用することができない。この第２の試料ホルダは、結晶構造解析ユニット内に挿入することができ、Ｘ線結晶構造解析を実施することができる。これとは異なり、本発明によれば、試料は、異なる試料ホルダ間で移動させる必要はない。この移動は、手間のかかる時間を消耗する手順であり、試料の損傷または汚染の恐れをもたらす。

本発明は、本発明の第１の態様によるモジュール式試料ホルダと、試料のＸ線結晶構造解析を実施するためのＸ線結晶構造解析ユニットとを有する（第１の）システムにも関する。本発明は、本発明の第２の態様によるモジュール式試料ホルダと、試料を加圧凍結するための加圧凍結ユニットとを有する（第２の）システムにも関する。最終的に本発明は、第１および第２のシステムを有する組み合わせられたシステムにも関する。

本発明に係る方法の過程において、試料を保持している試料保持エレメントがカートリッジに接続される。接続されたカートリッジと試料保持エレメントとは、対応する加圧凍結ユニット内に配置される。試料の加圧凍結は、加圧凍結ユニットにより実施される。その後に、凍結された試料はただちに結晶構造解析の過程において分析され得る。択一的には、凍結された試料は適切な低温保管領域に保管され得る。この低温保管領域は、たとえば液体窒素により低温の温度にまで冷却され得る。この目的のためには、接続された試料保持エレメントとカートリッジとが、対応する保管領域へと搬送され、かつ保管され得る。この保管領域から試料保持エレメントは収集され、結晶構造解析ユニットへと搬送される。

Ｘ線結晶構造解析を実施するために、凍結された試料保持エレメントは、カートリッジから分離され、拡張エレメントに接続される。モジュール式試料ホルダを形成する接続された試料保持エレメントと拡張エレメントとは、対応するＸ線結晶構造解析ユニット内に配置され、凍結された試料のＸ線結晶構造解析がＸ線結晶構造解析ユニットにより実施される。

拡張エレメントは、凍結直後に試料保持エレメントに接続することができ、組み合わせられた試料保持エレメント、カートリッジおよび拡張エレメントは、低温の保管領域に保管することができる。択一的には、接続された試料保持エレメントとカートリッジとを保管することができる。択一的には、試料保持エレメントのみを保管領域に保管することができ、この保管領域から収集された後に拡張エレメントに接続することができる。

対応する加圧凍結ユニットは、出願人により、Leica EM ICEの商品名で製造されている。Leica EM ICEは、その前モデルであるLeica EM HPMの後継である。本発明の特に有利な実施形態によれば、ベースエレメントの底面から細管の上面までの距離は、Leica EM ICEのように設計された加圧凍結ユニットに合うように寸法設計されている。このLeica EM ICE装置またはこのように設計された装置では、適切に液体窒素が圧力伝達媒体としても冷却剤としても使用される。このシステムにおける凍結サイクルは、適切には以下のように実施することができる。

凍結プロセスは、チャンバ内で実施される。このチャンバ内には試料が配置される。圧力上昇は、閉鎖された孔の下流側で実施される。この孔は、チャンバの正面に配置されている。この孔を開くことにより、窒素がチャンバ内に噴射される。この窒素流は、チャンバの出口に設けられたノズルにより制限される。したがって、このチャンバ内で圧力が上昇させられる。この窒素流は、通常、低温の温度を有していない。試料の凍結は、この圧力上昇後に、つまり試料が圧力下にセットされてから実施される。この目的のためには、低温の温度を有する圧縮された低温媒体、たとえば液体窒素がチャンバ内にガイドされる。

この装置により、１０ｍｓ未満で特に２０００バールまでの圧力上昇を達成することができる。試料は、典型的には５０００Ｋ／秒以上の冷却率で２０００バールの圧力に達した後に即座に冷却され得る。加圧凍結のより詳細な説明のためには、独国特許出願公開第１８０６７４１号明細書（DE1806741A1）、独国特許出願公開第１００１５７７３号明細書（DE10015773A1）または独国特許出願公開第１００６５１４３号明細書（DE10065143A1）が参照される。

加圧凍結ユニットであるLeica EM ICEまたはこのように設計された対応するユニットは、装填ステーションを有している。凍結工程を実施するために、まず特別に構成されたカートリッジがこの装填ステーションに配置される。その後に、試料保持エレメントが装填ステーションに配置され、カートリッジ内へと挿入される。装填ステーションのカバーまたは蓋を閉じることによって、カートリッジと試料保持エレメントとは互いに接続されて、加圧凍結工程が自動的に開始させられる。凍結工程後に、カートリッジと試料保持エレメントとの組合わせは、Leica EM ICEまたは対応するユニットにより低温媒体、特に液体窒素の冷却浴、特にデュワー瓶内へと自動的に排出される。

このカートリッジと試料保持エレメントとは特に、試料の最適な凍結を可能にするLeica EM ICEまたはこのように設計された加圧凍結ユニットのために設計され、かつ寸法設計されている。試料保持エレメントは、特に、カートリッジ内に完全に合うように設計されかつ寸法設計されている。凍結工程後に、接続された試料保持エレメントとカートリッジとは、保管領域において保管することができる。Ｘ線結晶構造解析のために、試料保持エレメントはカートリッジから分離される。

有利には、基部エレメントの底面から細管の上面までの距離は、１５ｍｍ〜１９ｍｍの範囲にある。この場合、試料保持エレメントは、カートリッジ内、Leica EM ICE内またはそのような装置内に正確に合うように設計されている。Leica EM ICEは、対応する試料保持エレメントの１９ｍｍの最大高さを許容する。

しかし、上記でも指摘したように、試料保持エレメント自体は、通常はＸ線結晶構造解析ユニットのためには適していない。Ｘ線結晶構造解析ユニットのための試料ホルダは、通常、いわゆるＳＰＩＮＥ協会の基準にしたがって種々異なる製造者により構成される。ＳＰＩＮＥ（Structural Proteomics IN Europe）は、生物医学的に重要なターゲットを対象としたテクノロジーを推進し、構造プロテオミクスに生物医学的に焦点をおいた汎ヨーロッパの統合を形成するために設立された。ＳＰＩＮＥの詳細な説明に関してはStuart, D. I., Jones, E. Y., Wilson, K. S. & Daenke, S. (2006), Acta Cryst. D62, -2-1を参照されたい。

対応する試料ホルダの特殊な特徴は、２０１４年４月１５日に改定された文書”SPINE SAMPLE HOLDER & VIAL SPECIFICATIONS-L-R05”に記載されており、下記のホームページで閲覧可能である。
＜URL：https://www.embl.fr/spinesampleholder/＞

このＳＰＩＮＥ基準によれば、対応する試料ホルダは、キャップと、ピンとから構成されている。結晶支持体、特にループが、上記ピンに取り付けられている。上記キャップは、ピンの支持体である。キャップの基部から結晶（またはビーム位置）、たとえばピンの上面への距離として規定される試料ホルダの長さは、２２ｍｍである。この固定された試料ホルダ長さにより、ＳＰＩＮＥ協会は、Ｘ線結晶構造解析ユニットのための種々異なる種類の試料交換器の互換性を達成しようとした。したがって、試料交換器が試料ホルダを掴むか、または試料ホルダに取り付けられているキャップの底面から、結晶構造解析を実施するためにＸ線ビームが向けられるべき試料の位置への距離は、常に２２ｍｍである。

有利には、拡張エレメントと基部エレメントとが互いに接続されている場合、拡張エレメントの底面から細管の上面までの第２の距離ｄ_２は、２２ｍｍ±１．５ｍｍの範囲にある。試料は、細管の上面に正確に配置されている必要はないので、好適には±１．５ｍｍの範囲の許容公差がある。したがって、拡張エレメントの底面から細管の上面へのこの距離は、好適にはＳＰＩＮＥ基準にしたがって寸法設計されている。したがって、モジュール式試料ホルダは、ＳＰＩＮＥ基準により設計されたあらゆる種類のＸ線結晶構造解析ユニットにおいて使用することができる。好適には、拡張エレメントの底面の直径は、ほぼまたは正確に１２ｍｍである。この直径も、ＳＰＩＮＥ基準により設定されている。

したがって、本発明は特に、モジュール式試料ホルダであって、Leica EM ICEにより、またはそのように設計されたユニットにより加圧凍結するために使用することができ、かつＳＰＩＮＥ基準と互換性があり、したがってＳＰＩＮＥ基準にしたがって設計されたＸ線結晶構造解析ユニットによりＸ線結晶構造解析のために使用することができるモジュール式試料ホルダを提供する。

好適には、カートリッジは単独部材として構成されている。したがってカートリッジは、特に分離することができない硬いエレメントとして構成される。しかしカートリッジは、互いに分離可能な２つまたは複数のシェルとしても実施され得る。

有利には、カートリッジは試料保持エレメントの基部エレメントにカートリッジを接続するための接続手段を有している。好適には、この接続手段は磁気的な接続手段として構成されている。この磁気的な接続手段は、特に金属製の材料から形成された基部エレメントと相互作用し、したがってカートリッジと試料保持エレメントとを力結合式に接続する。

好適には、細管の少なくとも一部は、ポリイミド、特にカプトンから形成されている。特に有利な実施形態によれば、細管は、金属材料から形成されたピンと、ポリイミド、特にカプトンから形成された、試料を保持するために適合された保持エレメントとを有している。蛋白質結晶は、特に特定の溶液中に溶解される。結晶は、カプトン製のエレメント、特に保持エレメント内に配置することができ、試料は溶液中に配置されている。基部エレメントは、特に腐食コーティングされた鋼、または強磁性のステンレス鋼（特にステンレス鋼４３０Ｆ等）から形成されている。

有利には、基部エレメントは、側域とこの側域に対して垂直方向の上面とを有する円筒形またはほぼ円筒形の形状である。好適には、基部エレメントの上面は、平坦またはほぼ平坦なシートとして構成されている。このシートは、特に、たとえば孔を有していてよく、この孔内に細管を挿入することができる。この孔は、特に平坦なシートの中心に配置される。上面は、好適には、段付けされた外縁を有する平坦またはほぼ平坦なシートとして構成することができ、これにより、特に試料保持エレメントをカートリッジ内に正確に配置することができる。

基部エレメントは、好適には、その内部が中空である。基部エレメントの底面は、好適には開口を有している。特に、実質的には基部エレメントの底面全体が、この開口を形成していてよい。基部エレメントの中空の内部において、カートリッジの対応する管内に細管を正確に挿入するための適切なガイド手段が配置されていてよい。特に、機械的なガイドエレメントは、これらのガイド手段に取り付けることができる。この目的のためには、機械的なガイドエレメントを特に基部エレメントの底面に設けられた開口を通じて試料保持エレメント内に挿入することができる。この機械的なガイドエレメントによって、試料ホルダを特にカートリッジ内に挿入することができる。

好適には、拡張エレメントは、基部エレメントの内部、特にその内面と相互作用するように適合された接続手段を有している。したがって、試料保持エレメントと拡張エレメントとが接続される。基部エレメントの内部には、対応する第２の接続手段が配置されていてよい。この第２の接続手段は、拡張エレメントの接続手段と相互作用することができる。拡張エレメントの接続手段は、好適には、基部エレメントの底面に設けられるか、基部エレメントの底面により形成された開口を通じて基部エレメントの内部に挿入されるように適合されている。

対応する接続手段は、有利には、試料保持エレメントと拡張エレメントとを磁気的かつ／または機械的に接続するために適合されている。拡張エレメントの接続手段は、試料保持エレメントと拡張エレメントとの力結合式の接続を形成するたとえば１つまたは複数のクランプエレメントとして形成されていてよい。この場合、基部エレメントの内部の第２の接続手段は必ずしも設けられていない。力結合式の接続は、基部エレメントの内壁に向かって押し当てられるか、または力を加えるか、または付勢されるクランプ手段により形成することができる。力結合式の接続は、磁気的な接続手段によっても形成することができる。この磁気的な接続手段は、基部エレメントの金属製の内壁エレメントと相互作用することができる。接続手段は、特に形状結合式の接続部を形成することができる。この目的のためには、接続手段および／または第２の接続手段は、ねじ山として実施されていてよい。

なお、上記で言及した特徴および以下でさらに説明される特徴は、本発明の主旨を逸脱することなしに、それぞれ示唆された組合わせにおけるだけでなく、別の組合わせでも、また単独でも使用可能である。

本発明を以下に添付の図面を参照して例示的な形式でさらに説明する。

試料保持エレメントおよび拡張エレメントを備えた本発明に係るモジュール式試料ホルダの好適な実施形態を概略的に示す種々異なる斜視図である。 試料保持エレメントおよび拡張エレメントを備えた本発明に係るモジュール式試料ホルダの好適な実施形態を概略的に示す種々異なる斜視図である。 試料保持エレメント、拡張エレメントおよびカートリッジを備えた本発明に係るモジュール式試料ホルダの好適な実施形態を概略的に示す種々異なる斜視図である。 本発明に係るモジュール式試料ホルダの試料保持エレメントおよびカートリッジと共に加圧凍結ユニットの一部を概略的に示す斜視図である。

詳細な説明
図１ａには、試料保持エレメントと拡張エレメントとを備える本発明に係るモジュール式試料ホルダの好適な実施形態が概略的に示されており、参照符号１０を付与されている。このモジュール式試料ホルダ１０は、図１ａでは分解斜視図で示されており、図１ｂでは、その組立て状態において斜視図で示されている。図面における同一の参照符号は、同一のエレメントまたは構造同一のエレメントを示している。

図１ａでは、試料ホルダ１０の２つのモジュール、つまり試料保持エレメント１００と、拡張エレメント２００とが互いに分離されて示されている。

試料保持エレメント１００は、基部エレメント１１０と、細管１２０とを有している。細管１２０は、金属材料で形成されたピン１２１を有していて、このピン１２１上には、ポリイミド、好適にはカプトンで形成された保持エレメント１２２が取り付けられている。試料は、この保持エレメント１２２内に配置することができる。保持エレメント１２２は、特に小さなカプトン管として構成されており、このカプトン管内に、特定の溶液内にある試料として蛋白質結晶を配置することができる。この溶液中に試料は溶解されている。

保持エレメント１２２は、たとえば、ループとして構成されていてもよい。細管１２０は、特に、いわゆるハンプトンピン（Hampton pin）として構成されていてもよい。

基部エレメント１１０は、細管１２０を保持するために適合されており、側域１１１と、この側域１１１に対して垂直方向の上面１１２とを有する円筒形またはほぼ円筒形の形状を有している。基部エレメント１１０の内部は、特に中空である。ガイド手段を側域１１１の内壁に設けることができ、これにより、図３および図４に関して説明するように、試料保持エレメント１００をカートリッジ内に挿入することができる。

上面１１２は、特に段付けされた外縁１１５を備える、平坦またはほぼ平坦なシートとして構成されていてよい。この段付けされた外縁１１５は、図３に関して説明するように、特にカートリッジ内において試料保持エレメント１００をセンタリングして位置決めすることを可能にするために設けられている。

基部エレメント１１０の底面にはシートは設けられていない。したがって、基部エレメント１１０の底面は、開口を形成する。基部エレメント１１０、つまり側域１１１および上面１１２は、金属、たとえば強磁性のステンレス鋼から形成されている。

基部エレメント１１０は、特に、シート１１３の中央に設けられた孔１１３の形の、細管１２０のための保持エレメントを有している。この孔１１３内に細管１２０を挿入することができる。したがって、細管１２０は、基部エレメントの上面１１２に対して垂直方向にまたはほぼ垂直方向に配置されている。

加圧凍結の過程で液体窒素をガイドするためにシート１１２の中心に対して周方向で幾つかの複数の孔１１４が設けられている。

拡張エレメント２００は、基部２０１を有している。この基部２０１上には、接続手段２０２が配置されている。これらの接続手段２０２は、試料保持エレメント１００を拡張エレメント２００に接続するために適合されている。

接続手段２０２は、基部エレメント１１０の底面に設けられた開口を通じて、基部エレメント１１０の中空の内部へと挿入することができる。この特別な実施例では、接続手段２０２は、クランプエレメントとして実施されており、基部エレメント１１０の内壁に対して押圧するかまたは力を加えることにより、試料保持エレメント１００と拡張エレメント２００とを力結合式に接続する。

モジュール式試料ホルダ１０が、組み立てられた状態で、つまり試料保持エレメント１００と拡張エレメント２００とが互いに接続された状態で図１ｂに示されている。図１ｂでは、拡張エレメント２００の底面から細管１２０の上面までの距離はｄ_２である。この距離ｄ_２は、２２ｍｍ±１．５ｍｍであり、したがってＳＰＩＮＥ基準にしたがって寸法設計されている。特に、ＳＰＩＮＥ基準の２２ｍｍの設定距離は、拡張エレメント２００の底面から試料までの距離に関する。したがって、試料が保持エレメント１２２のエッジに正確に配置されていない場合、距離ｄ_２は２２ｍｍよりも僅かに大きくなることがある。

したがって距離ｄ_２は、ＳＰＩＮＥ基準により構成された試料のＸ線結晶構造解析を実施するためのＸ線結晶構造解析ユニット内に合うように寸法設計されている。さらに、拡張エレメント２００の底面の直径ｄ_３は、実質的にまたは正確に１２ｍｍであり、したがってＳＰＩＮＥ基準にしたがって寸法設計されている。

したがってモジュール式試料ホルダ１０は、その組み立てられた状態において、ＳＰＩＮＥ基準の要求を満たしている。しかし、組み立てられたモジュール式試料ホルダ１０は、特定のタイプの加圧凍結ユニット、特にLeica EM ICEまたは同様の設計のためには使用することができない。

しかし、互いに分離されている場合、試料ホルダを、Leica EM ICEまたはそのように設計された装置において使用することができる。この装置は、対応する試料保持エレメントの１９ｍｍの最大高さを許容する。したがって、基部エレメント１１０の底面から細管１２０の上面までの距離ｄ_１は、最大で１９ｍｍであり、特に１５ｍｍ〜１９ｍｍの間の範囲であり、したがってLeica EM ICEの形の加圧凍結ユニットに合うように寸法設計されている。

図２には、試料保持エレメント１００’と拡張エレメント２００’とを備えた本発明に係るモジュール式試料ホルダの別の好適な実施形態が概略的に示されており、参照符号１０’を付与されている。

図２ａは、互いに分離された試料保持エレメント１００’と拡張エレメント２００’とを備えたモジュール式試料ホルダ１０’を斜視断面図で示している。図２ｂは、互いに接続された試料保持エレメント１００’と拡張エレメント２００’とを斜視断面図で示している。図２ｃは、図２ｂと同様の斜視図を示している。

図１に示したモジュール式試料ホルダ１０と同様に、図２に示したモジュール式試料ホルダ１０’も、金属ピン１２１’およびカプトン保持エレメント１２２’を有する細管１２０’を保持するために適合された基部エレメント１１０’を有している。細管１２０’のための保持エレメント１１３’は、円筒体として構成されている。

基部エレメント１１０’は、円筒形またはほぼ円筒形の形状である。図１に示した基部エレメント１１０とは異なり、この基部エレメント１１０’の内部は中空ではなく、側域１１１’と上面１１２’とを備えたほぼ中実な円筒体である。基部エレメント１１０’内の孔１１４’は、加圧凍結の過程で液体窒素をガイドするために設けられている。この場合、円筒形の基部エレメント１１０’は、たとえば１ｍｍ〜３ｍｍの範囲の、底面から上面１１２’までの高さを有していてよい。

拡張エレメント２００’は、基部２０１’と、接続手段２０２’とを有している。この実施例では、接続手段２０２は、試料保持エレメント１００’と拡張エレメント２００’とを力結合式に接続するために、磁気的な接続手段として構成されている。この目的のためには、１つまたは複数の磁石２０２’が設けられており、これらの磁石は、金属から形成された基部エレメント１１０’と相互作用することができる。

図１ｂと同様に、基部エレメント１１０’の底面から細管１２０’の上面への第１の距離ｄ_１は、１５ｍｍ〜１９ｍｍの範囲にあり、したがってLeica EM ICEの形の加圧凍結ユニットに合うように寸法設計されている。

拡張エレメント２００’の底面から細管１２０’の上面への第２の距離はｄ_２であり、２２ｍｍ±１．５ｍｍの範囲にあり、したがってＳＰＩＮＥ基準にしたがって寸法設計されている。

さらに、拡張エレメント２００’の底面の直径ｄ_３は、実質的にまたは正確に１２ｍｍであり、したがってＳＰＩＮＥ基準にしたがって寸法設計されている。

本発明によれば、試料保持エレメントは、図３に関連して説明される加圧凍結のためのカートリッジにも接続可能である。

図３は、図２に示した試料保持エレメント１００’と拡張エレメント２００’と、対応するカートリッジ３００とを示している。

図３ａは、互いに分離された３つのモジュール１００’，２００’および３００を斜視断面図で示している。これらのモジュール１００’，２００’，３００は、図３ｂでは互いに接続されて斜視断面図で示されており、図３ｃでは斜視図で示されている。

カートリッジ３００は、封入エレメント３２０を有していて、この封入エレメント３２０の内部は、細管キャビティの形をしている。この細管キャビティ３２０は、カートリッジ３００のケーシング３１０の内部に配置されている。細管１２０’は、この細管キャビティ３２０内に配置するために適合されている。この細管キャビティ３２０の直径は、特に細管１２０’の直径よりも僅かにだけ大きく形成されている。

さらに、接続手段３３０がケーシング３１０の内部に設けられており、これによりカートリッジ３００を試料保持エレメント１００’に接続することができる。この接続手段３３０は、好適には磁気的な接続手段３３０として、たとえば１つまたは複数の磁石として構成されている。

これらの磁石３３０は、基部エレメント１１０’と相互作用することができ、これによりカートリッジ３００と金属製の基部エレメント１１０’とを力結合式に接続することができる。

図４には、Leica EM ICEの形の加圧凍結ユニットの一部が斜視図で概略的に示されている。特にLeica EM ICEの装填ステーション４００が図示されている。この装填ステーション内に試料が加圧凍結のために装填される。

装填ステーション４００は、チャンバ４０１を有している。このチャンバ４０１内に、まずカートリッジ３００が機械的なガイドエレメント４０２、たとえばロッドにより装填される。その後に、試料保持エレメント１００’が機械的なガイドエレメント４０２によりチャンバ内に位置決めされ、したがってカートリッジ３００内に挿入される。

試料保持エレメント１００’をチャンバ４０１内に装填するために、機械的なガイドエレメント４０２は、試料保持エレメント１００’の基部エレメント１１０’の内部に設けられたガイド手段に接続される。機械的なガイドエレメント４０２は、試料の損傷なしに、カートリッジ３００内に試料保持エレメント１００’を正確に挿入することを可能にする。

２つの異なる機械的なガイドエレメント、すなわち、チャンバ４０１内にカートリッジを装填するための第１のガイドエレメントと、試料ホルダのための第２のガイドエレメントとを設けることも可能である。

カートリッジ３００と試料保持エレメント１００’が両方ともチャンバ４０１内に装填されている場合、ハンドル４０４を備える蓋４０４が閉じられる。この蓋４０３を閉鎖することにより試料の加圧凍結が引き起こされる。この目的のためには、カートリッジ３００と試料保持エレメント１００’とは、互いに接続され、導管４０５を通じて、加圧凍結プロセスが実施されるLeica EM ICEの内部へと搬送される。

加圧凍結工程の後にカートリッジ３００と試料保持エレメント１００’との組合わせは、自動的にLeica EM ICEにより、低温媒体、特に液体窒素の冷却浴、たとえばデュワー瓶内へと排出される。

１０ モジュール式試料ホルダ
１００ 試料保持エレメント
１１０ 基部エレメント
１１１ 基部エレメントの側域
１１２ 基部エレメントの上面、シート
１１３ 細管１２０のための保持エレメント、孔
１１４ 孔
１２０ 細管
１２１ ピン
１２２ 保持エレメント
２００ 拡張エレメント
２０１ 基部
２０２ 接続手段、クランプエレメント
１０’ モジュール式試料ホルダ
１００’ 試料保持エレメント
１１０’ 基部エレメント
１１１’ 基部エレメントの側域
１１２’ 基部エレメントの上面、シート
１１３’ 細管１２０’のための保持エレメント
１１４’ 孔
１２０’ 細管
１２１’ ピン
１２２’ 保持エレメント
２００’ 拡張エレメント
２０１’ 基部
２０２’ 接続手段、磁石
３００ カートリッジ
３１０ カートリッジのケーシング
３２０ 封入エレメント、細管キャビティ
３３０ 接続手段、磁石
４００ 加圧凍結ユニットの装填ステーション
４０１ チャンバ
４０２ 機械的なガイドエレメント、ロッド
４０３ 蓋
４０４ ハンドル
４０５ 導管

Claims (20)

1. 試料を加圧凍結しかつ／またはＸ線結晶構造解析するためのモジュール式試料ホルダ（１０，１０’）であって、互いに接続可能かつ互いに分離可能な試料保持エレメント（１００，１００’）と拡張エレメント（２００，２００’）とを備え、前記試料保持エレメント（１００，１００’）は、細管（１２０，１２０’）と、基部エレメント（１１０，１１０’）とを有しており、
   前記細管（１２０，１２０’）は、前記試料を保持するように適合されており、
   前記基部エレメント（１１０，１１０’）は、前記細管（１２０，１２０’）を保持するように適合されており、
   前記基部エレメント（１１０，１１０’）の底面から前記細管（１２０，１２０’）の上面への距離は、第１の距離（ｄ _１ ）であり、
   前記拡張エレメント（２００，２００’）は、前記基部エレメント（１１０，１１０’）に接続されるように適合されており、
   前記拡張エレメント（２００，２００’）と前記基部エレメント（１１０，１１０’）とが互いに接続されている場合、前記拡張エレメント（２００，２００’）の底面から前記細管（１２０，１２０’）の上面までの距離は、第２の距離（ｄ _２ ）であり、
   前記第２の距離（ｄ _２ ）は、前記第１の距離（ｄ _１ ）よりも大きく形成されており、
   前記第１の距離（ｄ _１ ）は、前記試料保持エレメント（１００，１００’）を加圧凍結するための加圧凍結ユニットに合うように寸法設計されており、
   前記第２の距離（ｄ _２ ）は、前記試料のＸ線結晶構造解析を実施するためのＸ線結晶構造解析ユニットに合うように寸法設計されている、モジュール式試料ホルダ（１０，１０’）。
2. カートリッジ（３００）をさらに備え、
   前記カートリッジ（３００）は、その内部に封入エレメント（３２０）を有しており、
   前記細管（１２０，１２０’）と前記封入エレメント（３２０）とは、前記細管（１２０，１２０’）が前記封入エレメント（３２０）の内部に配置され得るように形成されている、請求項１記載のモジュール式試料ホルダ（１０，１０’）。
3. 前記封入エレメント（３２０）は、前記カートリッジの内部のキャビティとして構成されている、請求項２記載のモジュール式試料ホルダ（１０，１０’）。
4. 前記カートリッジ（３００）は、単独部材として構成されている、請求項２または３記載のモジュール式試料ホルダ（１０，１０’）。
5. 前記カートリッジ（３００）は、前記試料保持エレメントの前記基部エレメント（１１０，１１０’）に前記カートリッジ（３００）を接続するために接続手段（３３０）を有している、請求項２から４までのいずれか１項記載のモジュール式試料ホルダ（１０，１０’）。
6. 前記試料保持エレメント（１００，１００’）は、前記カートリッジ（３００）内に合うように設計されている、請求項２から５までのいずれか１項記載のモジュール式試料ホルダ（１０，１０’）。
7. 前記細管（１２０，１２０’）の少なくとも一部は、ポリイミドから形成されている、請求項１から６までのいずれか１項記載のモジュール式試料ホルダ（１０，１０’）。
8. 前記細管（１２０，１２０’）は、ピン（１２１，１２１’）と、保持エレメント（１２２，１２２’）とを有しており、前記ピン（１２１，１２１’）は、金属材料から形成されており、前記保持エレメント（１２２，１２２’）は、前記試料を保持するために適合されており、かつポリイミドから形成されている、請求項１から７までのいずれか１項記載のモジュール式試料ホルダ（１０，１０’）。
9. 前記基部エレメント（１１０，１１０’）は、側域（１１１，１１１’）と、該側域（１１１，１１１’）に対して垂直方向の上面（１１２，１１２’）とを有する円筒形、またはほぼ円筒形の形状である、請求項１から８までのいずれか１項記載のモジュール式試料ホルダ（１０，１０’）。
10. 前記基部エレメント（１１０，１１０’）の上面（１１２，１１２’）は、平坦またはほぼ平坦なシートとして、または段付けされた外縁（１１５，１１５’）を有する平坦またはほぼ平坦なシートとして形成されている、請求項９記載のモジュール式試料ホルダ（１０，１０’）。
11. 前記基部エレメント（１１０，１１０’）は、その内部が中空であり、前記基部エレメントの底面は、開口を有しているか、または開口を形成している、請求項１から１０までのいずれか１項記載のモジュール式試料ホルダ（１０，１０’）。
12. 前記拡張エレメント（２００，２００’）は、前記基部エレメント（１１０，１１０’）と相互作用するように適合された接続手段（２０２）を有しており、したがって前記試料保持エレメント（１００，１００’）と前記拡張エレメント（２００，２００’）とが接続される、請求項１１記載のモジュール式試料ホルダ（１０，１０’）。
13. 前記拡張エレメントの前記接続手段（２０２，２０２’）は、前記基部エレメント（１１０，１１０’）の前記底面に設けられた前記開口を通じて、前記基部エレメント（１１０，１１０’）の内部に挿入されるように適合されている、請求項１２記載のモジュール式試料ホルダ（１０，１０’）。
14. 前記接続手段（２０２，２０２’）は、前記試料保持エレメント（１００，１００’）と前記拡張エレメント（２００，２００’）とを磁気的かつ／または機械的に接続するために適合されている、請求項１２または１３記載のモジュール式試料ホルダ（１０，１０’）。
15. 前記拡張エレメント（２００，２００’）の底面の直径（ｄ_３）は、実質的にまたは正確に１２ｍｍである、請求項１から１４までのいずれか１項記載のモジュール式試料ホルダ（１０，１０’）。
16. 前記第１の距離（ｄ _１ ）は、１５ｍｍ〜１９ｍｍの範囲にある、請求項１から１５までのいずれか１項記載のモジュール式試料ホルダ（１０，１０’）。
17. 前記拡張エレメント（２００，２００’）の前記底面から前記細管（１２０，１２０’）の前記上面への前記第２の距離（ｄ _２ ）は、２２ｍｍ±１．５ｍｍの範囲にある、請求項１から１６までのいずれか１項記載のモジュール式試料ホルダ（１０，１０’）。
18. 前記第１の距離（ｄ _１ ）は、加圧凍結ユニットに合うように寸法設計されている、請求項１から１７までのいずれか１項記載のモジュール式試料ホルダ（１０，１０’）。
19. 前記拡張エレメント（２００，２００’）の前記底面から前記細管（１２０，１２０’）の前記上面までの前記第２の距離（ｄ _２ ）は、ＳＰＩＮＥ基準にしたがって寸法設計されている、請求項１から１８までのいずれか１項記載のモジュール式試料ホルダ（１０，１０’）。
20. 請求項１から１９までのいずれか１項記載のモジュール式試料ホルダ（１０，１０’）を用いて試料を加圧凍結し、かつＸ線結晶構造解析する方法であって、該方法は、
    前記試料を保持している試料保持エレメント（１００，１００’）と、カートリッジ（３００）とを互いに接続するステップと、
    接続された前記試料保持エレメント（１００，１００’）と前記カートリッジ（３００）とを加圧凍結ユニット内に配置するステップと、
    前記加圧凍結ユニットにより前記試料の加圧凍結を実施するステップと、
    凍結された前記試料保持エレメント（１００，１００’）と前記カートリッジ（３００）とを互いに分離するステップと、
    凍結された前記試料保持エレメント（１００，１００’）と拡張エレメント（２００，２００’）とを接続するステップと、
    接続された前記試料保持エレメント（１００，１００’）と前記拡張エレメント（２００，２００’）とをＸ線結晶構造解析ユニット内に配置するステップと、
    前記Ｘ線結晶構造解析ユニットにより凍結された前記試料のＸ線結晶構造解析を実施するステップと
    を有する、モジュール式試料ホルダ（１０，１０’）を用いて試料を加圧凍結し、かつＸ線結晶構造解析する方法。

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