JP6842655B2 - Composition for suppressing differentiation into mucosal mast cells - Google Patents
Composition for suppressing differentiation into mucosal mast cells Download PDFInfo
- Publication number
- JP6842655B2 JP6842655B2 JP2016227131A JP2016227131A JP6842655B2 JP 6842655 B2 JP6842655 B2 JP 6842655B2 JP 2016227131 A JP2016227131 A JP 2016227131A JP 2016227131 A JP2016227131 A JP 2016227131A JP 6842655 B2 JP6842655 B2 JP 6842655B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- cells
- mast cells
- mucosal
- soy sauce
- composition
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 210000000350 mc(t) Anatomy 0.000 title claims description 123
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims description 76
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 title claims description 75
- 235000013555 soy sauce Nutrition 0.000 claims description 91
- 210000003630 histaminocyte Anatomy 0.000 claims description 78
- 102000003814 Interleukin-10 Human genes 0.000 claims description 56
- 108090000174 Interleukin-10 Proteins 0.000 claims description 56
- 108010002386 Interleukin-3 Proteins 0.000 claims description 41
- 230000009471 action Effects 0.000 claims description 25
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 claims description 15
- 229940076144 interleukin-10 Drugs 0.000 claims description 6
- 229940076264 interleukin-3 Drugs 0.000 claims description 4
- 210000004877 mucosa Anatomy 0.000 claims description 4
- 102100039064 Interleukin-3 Human genes 0.000 claims 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 143
- 101710150582 Monomethylamine corrinoid protein 1 Proteins 0.000 description 60
- 238000000034 method Methods 0.000 description 42
- 102000000646 Interleukin-3 Human genes 0.000 description 40
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 38
- 241000209140 Triticum Species 0.000 description 25
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 25
- 230000003266 anti-allergic effect Effects 0.000 description 24
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 23
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 23
- 239000000047 product Substances 0.000 description 21
- 208000004262 Food Hypersensitivity Diseases 0.000 description 19
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 19
- 235000020932 food allergy Nutrition 0.000 description 19
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 19
- 230000007815 allergy Effects 0.000 description 18
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 16
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 16
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 15
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 15
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 14
- 102100038006 High affinity immunoglobulin epsilon receptor subunit alpha Human genes 0.000 description 13
- 101710128966 High affinity immunoglobulin epsilon receptor subunit alpha Proteins 0.000 description 13
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 13
- 239000013566 allergen Substances 0.000 description 13
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 13
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 12
- 102000016971 Proto-Oncogene Proteins c-kit Human genes 0.000 description 10
- 108010014608 Proto-Oncogene Proteins c-kit Proteins 0.000 description 10
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 10
- 210000004400 mucous membrane Anatomy 0.000 description 10
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 10
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 10
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 10
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 10
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 10
- 206010016946 Food allergy Diseases 0.000 description 8
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 8
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 8
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 8
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 8
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 8
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 8
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 8
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 8
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 8
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 8
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 8
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 8
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 7
- 239000013568 food allergen Substances 0.000 description 7
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 7
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 235000015429 Mirabilis expansa Nutrition 0.000 description 6
- 244000294411 Mirabilis expansa Species 0.000 description 6
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 6
- 230000000172 allergic effect Effects 0.000 description 6
- 208000010668 atopic eczema Diseases 0.000 description 6
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 6
- 235000021107 fermented food Nutrition 0.000 description 6
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 6
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 6
- 235000013536 miso Nutrition 0.000 description 6
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 5
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 5
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 5
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 5
- 230000036541 health Effects 0.000 description 5
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 4
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 4
- 101710150583 Monomethylamine corrinoid protein 2 Proteins 0.000 description 4
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 4
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 4
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 4
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 4
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 4
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 4
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 4
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 4
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 4
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 4
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 4
- 206010009900 Colitis ulcerative Diseases 0.000 description 3
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000004551 Interleukin-10 Receptors Human genes 0.000 description 3
- 108010017550 Interleukin-10 Receptors Proteins 0.000 description 3
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 3
- 201000006704 Ulcerative Colitis Diseases 0.000 description 3
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 3
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 description 3
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 3
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 3
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 3
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 3
- 230000006870 function Effects 0.000 description 3
- 235000013376 functional food Nutrition 0.000 description 3
- 235000001497 healthy food Nutrition 0.000 description 3
- 230000006058 immune tolerance Effects 0.000 description 3
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 3
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 3
- 210000003800 pharynx Anatomy 0.000 description 3
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 3
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 3
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 3
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 3
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 3
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 3
- WRMNZCZEMHIOCP-UHFFFAOYSA-N 2-phenylethanol Chemical compound OCCC1=CC=CC=C1 WRMNZCZEMHIOCP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000035285 Allergic Seasonal Rhinitis Diseases 0.000 description 2
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 2
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 2
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 2
- 102000000496 Carboxypeptidases A Human genes 0.000 description 2
- 108010080937 Carboxypeptidases A Proteins 0.000 description 2
- 108090000227 Chymases Proteins 0.000 description 2
- 102000003858 Chymases Human genes 0.000 description 2
- 206010012735 Diarrhoea Diseases 0.000 description 2
- 208000004232 Enteritis Diseases 0.000 description 2
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 2
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 2
- NTYJJOPFIAHURM-UHFFFAOYSA-N Histamine Chemical compound NCCC1=CN=CN1 NTYJJOPFIAHURM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 2
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 2
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 2
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 2
- -1 MMCP-3 Proteins 0.000 description 2
- 101000980580 Mus musculus Mast cell protease 1 Proteins 0.000 description 2
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 2
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 2
- 206010048908 Seasonal allergy Diseases 0.000 description 2
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- DWAQJAXMDSEUJJ-UHFFFAOYSA-M Sodium bisulfite Chemical compound [Na+].OS([O-])=O DWAQJAXMDSEUJJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J Trypan blue Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].C1=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C=C(S([O-])(=O)=O)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3C)C=3C=C(C(=CC=3)\N=N\C=3C(=CC4=CC(=CC(N)=C4C=3O)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)C)=C(O)C2=C1N GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 2
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 2
- 208000006673 asthma Diseases 0.000 description 2
- 230000001363 autoimmune Effects 0.000 description 2
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 2
- 206010006451 bronchitis Diseases 0.000 description 2
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 2
- OSASVXMJTNOKOY-UHFFFAOYSA-N chlorobutanol Chemical compound CC(C)(O)C(Cl)(Cl)Cl OSASVXMJTNOKOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000002808 connective tissue Anatomy 0.000 description 2
- 238000010411 cooking Methods 0.000 description 2
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000011033 desalting Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 2
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 2
- 235000012041 food component Nutrition 0.000 description 2
- ZCOLJUOHXJRHDI-CMWLGVBASA-N genistein 7-O-beta-D-glucoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CC(O)=C2C(=O)C(C=3C=CC(O)=CC=3)=COC2=C1 ZCOLJUOHXJRHDI-CMWLGVBASA-N 0.000 description 2
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 2
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000001822 immobilized cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 2
- 208000030603 inherited susceptibility to asthma Diseases 0.000 description 2
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 2
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 2
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 2
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 2
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 2
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 2
- 108010080042 mast cell protease 4 Proteins 0.000 description 2
- 235000012054 meals Nutrition 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- LXCFILQKKLGQFO-UHFFFAOYSA-N methylparaben Chemical compound COC(=O)C1=CC=C(O)C=C1 LXCFILQKKLGQFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 210000000214 mouth Anatomy 0.000 description 2
- 229930014626 natural product Natural products 0.000 description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 2
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 2
- 230000008823 permeabilization Effects 0.000 description 2
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 2
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 2
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 2
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 2
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 206010039083 rhinitis Diseases 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 235000010267 sodium hydrogen sulphite Nutrition 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 2
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 2
- 208000003265 stomatitis Diseases 0.000 description 2
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 2
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 description 2
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 2
- MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N (3s)-4-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(1s)-1-carboxy-2-hydroxyethyl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-[[2-[[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]amino]acetyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCCN MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N 0.000 description 1
- WPRAXAOJIODQJR-UHFFFAOYSA-N 1-(3,4-dimethylphenyl)ethanone Chemical compound CC(=O)C1=CC=C(C)C(C)=C1 WPRAXAOJIODQJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HVAUUPRFYPCOCA-AREMUKBSSA-N 2-O-acetyl-1-O-hexadecyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCOC[C@@H](OC(C)=O)COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C HVAUUPRFYPCOCA-AREMUKBSSA-N 0.000 description 1
- 241000228212 Aspergillus Species 0.000 description 1
- 108010012236 Chemokines Proteins 0.000 description 1
- 102000019034 Chemokines Human genes 0.000 description 1
- 244000077995 Coix lacryma jobi Species 0.000 description 1
- 235000007354 Coix lacryma jobi Nutrition 0.000 description 1
- 208000011231 Crohn disease Diseases 0.000 description 1
- ZZZCUOFIHGPKAK-UHFFFAOYSA-N D-erythro-ascorbic acid Natural products OCC1OC(=O)C(O)=C1O ZZZCUOFIHGPKAK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000007882 Gastritis Diseases 0.000 description 1
- 206010064147 Gastrointestinal inflammation Diseases 0.000 description 1
- ZCOLJUOHXJRHDI-FZHKGVQDSA-N Genistein 7-O-glucoside Natural products O([C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)c1cc(O)c2C(=O)C(c3ccc(O)cc3)=COc2c1 ZCOLJUOHXJRHDI-FZHKGVQDSA-N 0.000 description 1
- CJPNHKPXZYYCME-UHFFFAOYSA-N Genistin Natural products OCC1OC(Oc2ccc(O)c3OC(=CC(=O)c23)c4ccc(O)cc4)C(O)C(O)C1O CJPNHKPXZYYCME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 240000005979 Hordeum vulgare Species 0.000 description 1
- 235000007340 Hordeum vulgare Nutrition 0.000 description 1
- 102000003816 Interleukin-13 Human genes 0.000 description 1
- 108090000176 Interleukin-13 Proteins 0.000 description 1
- 102000010790 Interleukin-3 Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010038452 Interleukin-3 Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000004388 Interleukin-4 Human genes 0.000 description 1
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 description 1
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 description 1
- 102000004889 Interleukin-6 Human genes 0.000 description 1
- 235000007688 Lycopersicon esculentum Nutrition 0.000 description 1
- 206010065764 Mucosal infection Diseases 0.000 description 1
- YCUNGEJJOMKCGZ-UHFFFAOYSA-N Pallidiflorin Natural products C1=CC(OC)=CC=C1C1=COC2=CC=CC(O)=C2C1=O YCUNGEJJOMKCGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000030852 Parasitic disease Diseases 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108010003541 Platelet Activating Factor Proteins 0.000 description 1
- 239000004372 Polyvinyl alcohol Substances 0.000 description 1
- 201000004681 Psoriasis Diseases 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 240000003768 Solanum lycopersicum Species 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 1
- 229930003268 Vitamin C Natural products 0.000 description 1
- 208000006903 Wheat Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 1
- 208000030961 allergic reaction Diseases 0.000 description 1
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 1
- 229960000510 ammonia Drugs 0.000 description 1
- 230000003042 antagnostic effect Effects 0.000 description 1
- 230000008485 antagonism Effects 0.000 description 1
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000003796 beauty Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 229960000686 benzalkonium chloride Drugs 0.000 description 1
- CADWTSSKOVRVJC-UHFFFAOYSA-N benzyl(dimethyl)azanium;chloride Chemical compound [Cl-].C[NH+](C)CC1=CC=CC=C1 CADWTSSKOVRVJC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 229910021538 borax Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004067 bulking agent Substances 0.000 description 1
- 239000007894 caplet Substances 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 229960004926 chlorobutanol Drugs 0.000 description 1
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 description 1
- 239000006071 cream Substances 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 235000015872 dietary supplement Nutrition 0.000 description 1
- 210000002249 digestive system Anatomy 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- LNGNZSMIUVQZOX-UHFFFAOYSA-L disodium;dioxido(sulfanylidene)-$l^{4}-sulfane Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])=S LNGNZSMIUVQZOX-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 1
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 1
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N ethyl mercaptane Natural products CCS DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000763 evoking effect Effects 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 229930003935 flavonoid Natural products 0.000 description 1
- 235000017173 flavonoids Nutrition 0.000 description 1
- 150000002215 flavonoids Chemical class 0.000 description 1
- 239000000796 flavoring agent Substances 0.000 description 1
- 235000013355 food flavoring agent Nutrition 0.000 description 1
- 230000037406 food intake Effects 0.000 description 1
- 235000003599 food sweetener Nutrition 0.000 description 1
- 235000015203 fruit juice Nutrition 0.000 description 1
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- TZBJGXHYKVUXJN-UHFFFAOYSA-N genistein Natural products C1=CC(O)=CC=C1C1=COC2=CC(O)=CC(O)=C2C1=O TZBJGXHYKVUXJN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000006539 genistein Nutrition 0.000 description 1
- 229940045109 genistein Drugs 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 1
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 1
- 229960001340 histamine Drugs 0.000 description 1
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 230000006057 immunotolerant effect Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 108040006870 interleukin-10 receptor activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 1
- 150000002617 leukotrienes Chemical class 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 210000004742 mc(tc) Anatomy 0.000 description 1
- 235000010270 methyl p-hydroxybenzoate Nutrition 0.000 description 1
- 239000004292 methyl p-hydroxybenzoate Substances 0.000 description 1
- 229960002216 methylparaben Drugs 0.000 description 1
- 201000006417 multiple sclerosis Diseases 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 210000003928 nasal cavity Anatomy 0.000 description 1
- 239000007923 nasal drop Substances 0.000 description 1
- 229940100662 nasal drops Drugs 0.000 description 1
- 210000001331 nose Anatomy 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 1
- 229940094443 oxytocics prostaglandins Drugs 0.000 description 1
- 230000036281 parasite infection Effects 0.000 description 1
- 239000002304 perfume Substances 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 229940067107 phenylethyl alcohol Drugs 0.000 description 1
- XEBWQGVWTUSTLN-UHFFFAOYSA-M phenylmercury acetate Chemical compound CC(=O)O[Hg]C1=CC=CC=C1 XEBWQGVWTUSTLN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 239000000088 plastic resin Substances 0.000 description 1
- 229920002451 polyvinyl alcohol Polymers 0.000 description 1
- 229940068984 polyvinyl alcohol Drugs 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 150000003180 prostaglandins Chemical class 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 235000021067 refined food Nutrition 0.000 description 1
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910000029 sodium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000017550 sodium carbonate Nutrition 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011008 sodium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 235000010339 sodium tetraborate Nutrition 0.000 description 1
- 239000008247 solid mixture Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 235000013322 soy milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 230000003068 static effect Effects 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 239000003765 sweetening agent Substances 0.000 description 1
- 239000000057 synthetic resin Substances 0.000 description 1
- 229920003002 synthetic resin Polymers 0.000 description 1
- 201000000596 systemic lupus erythematosus Diseases 0.000 description 1
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 1
- 239000002562 thickening agent Substances 0.000 description 1
- RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L thimerosal Chemical compound [Na+].CC[Hg]SC1=CC=CC=C1C([O-])=O RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229940033663 thimerosal Drugs 0.000 description 1
- BSVBQGMMJUBVOD-UHFFFAOYSA-N trisodium borate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]B([O-])[O-] BSVBQGMMJUBVOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 235000019154 vitamin C Nutrition 0.000 description 1
- 239000011718 vitamin C Substances 0.000 description 1
Description
本発明は、粘膜型マスト細胞への分化を抑制するための組成物に関する。 The present invention relates to a composition for suppressing differentiation into mucosal mast cells.
マスト細胞（Ｍａｓｔ Ｃｅｌｌｓ；ＭＣｓ；肥満細胞）は、造血系幹細胞に由来する血球系細胞の一種であり、マクロファージや樹状細胞などのその他の免疫細胞と同様に生体内の様々な組織に分布している。マスト細胞は、各組織において、マスト細胞前駆体（ＭＣＰ）から誘導されるが、各組織においてみられるマスト細胞の表現型は異なる。これは、マスト細胞が多様性（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ）を有しているからである（例えば、非特許文献１を参照）。 Mast cells (MCs; mast cells) are a type of hematopoietic cells derived from hematopoietic stem cells and are distributed in various tissues in the body like other immune cells such as macrophages and dendritic cells. ing. Mast cells are derived from mast cell precursors (MCPs) in each tissue, but the mast cell phenotype found in each tissue is different. This is because mast cells have diversity (see, for example, Non-Patent Document 1).
マスト細胞は、多様性を有していることにより、同一の組織又は培養容器内においてさえ、同一の刺激に対して相違する反応を示し得る。換言すれば、同一の表現型を有するマスト細胞を得ることは非常に難しい。かかる状況下において、非特許文献１には、Ｔ細胞由来のサイトカインの一種であるインターロイキン（ＩＬ）−３の存在下で、骨髄中のＭＣＰを培養することにより、骨髄由来型マスト細胞（Ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ−ｄｅｒｉｖｅｄ ＭＣ；ＢＭＭＣ）が得られることが記載されている。ＢＭＭＣは、異質性があり、かつ、未成熟であり、さらに表現型が様々な培養添加物により変化し得る細胞である。例えば、ＢＭＭＣを線維芽細胞と共培養することにより、成熟したマスト細胞の一種である結合組織型マスト細胞の表現型を示す。 Due to their diversity, mast cells can respond differently to the same stimulus, even within the same tissue or culture vessel. In other words, it is very difficult to obtain mast cells with the same phenotype. Under such circumstances, Non-Patent Document 1 describes bone marrow-derived mast cells (Bone) by culturing MCP in bone marrow in the presence of interleukin (IL) -3, which is a type of T cell-derived cytokine. It is described that a bone marrow-developed MC (BMMC) can be obtained. BMMCs are cells that are heterogeneous, immature, and whose phenotype can be altered by various culture additives. For example, by co-culturing BMMC with fibroblasts, the phenotype of connective tissue mast cells, which is a type of mature mast cells, is shown.
成熟したマスト細胞の一種として、粘膜型マスト細胞（ｍｕｃｏｓａｌ ＭＣｓ）がある。結合組織型マスト細胞が皮膚や血管内に局在化するのに対して、粘膜型マスト細胞は、生体内の粘膜組織に局在しており、ＩｇＥに対して高い親和性のあるＩｇＥ受容体（ＦｃεＲＩα）を細胞表面に発現している。マウスにおいては、粘膜型マスト細胞は、ＭＭＣＰ−１などのキマーゼを発現する。このＦｃεＲＩαに、アレルゲンとＩｇＥとが免疫複合体を形成して架橋することにより、様々な応答が引き起こされる。そのような応答の結果にもたらされるものとして、例えば、腸内組織における粘膜型マスト細胞が関与する食物アレルギーがある。食物アレルギーは、食物に由来する物質がアレルゲンとなり、ＩｇＥと免疫複合体を形成して、ＦｃεＲＩαと架橋することにより、腸内組織における粘膜型マスト細胞が活性化することにより発症する。 As a kind of mature mast cells, there are mucosal mast cells (mucosal MCs). Connective tissue mast cells are localized in the skin and blood vessels, whereas mucosal mast cells are localized in the mucosal tissue in vivo and have a high affinity for IgE. (FcεRIα) is expressed on the cell surface. In mice, mucosal mast cells express chymase such as MMCP-1. Various responses are evoked by the allergen and IgE forming an immune complex and cross-linking to this FcεRIα. The consequences of such a response include, for example, food allergies involving mucosal mast cells in intestinal tissue. Food allergy develops when food-derived substances become allergens, form immune complexes with IgE, and cross-link with FcεRIα to activate mucosal mast cells in the intestinal tissue.
粘膜型マスト細胞の活性化は、ヒスタミン、エフェクタープロテアーゼ、ヘパリンなどの炎症性メディエータを遊離する脱顆粒、ＴＮＦ−α、ＩＬ−４、ＩＬ−１３、ＩＬ−６、ＩＬ−３及びケモカインなどの炎症性サイトカインの産生、血小板活性化因子、プロスタグランジン、ロイコトリエンなどの脂質メディエータの産生などをもたらし、生体におけるアレルギー反応を惹起する（非特許文献２を参照）。 Activation of mucosal mast cells causes degranulation to release inflammatory mediators such as histamine, effector proteases and heparins, and inflammation such as TNF-α, IL-4, IL-13, IL-6, IL-3 and chemokine. It causes the production of sex cytokines, platelet activating factor, prostaglandins, leukotrienes and other lipid mediators, and induces an allergic reaction in the living body (see Non-Patent Document 2).
一方、発酵食品の代表的なものとして、しょうゆがある。大部分のしょうゆは、大豆や小麦などの麦を原料として麹菌などにより発酵及び熟成させて得られる。特許文献１には、しょうゆに含まれる高分子多糖類の中には、マクロファージの活性化作用及びＰＣＡ反応抑制作用を示すものがあることが記載されている。 On the other hand, soy sauce is a typical fermented food. Most soy sauce is obtained by fermenting and aging wheat such as soybeans and wheat with aspergillus. Patent Document 1 describes that some of the high molecular weight polysaccharides contained in soy sauce exhibit a macrophage activating effect and a PCA reaction suppressing effect.
上記のとおり、粘膜型マスト細胞は、腸管などの粘膜組織に局在化し、アレルゲンが粘膜組織に到達することによるアレルギーの発症に関与し得る。そこで、粘膜組織を介したアレルギーを抑制するためには、異常に増加した粘膜型マスト細胞の割合を減少させることが肝要である。また、アレルギーを発症していなくとも、粘膜型マスト細胞の割合を正常な値に維持することもまた肝要である。 As described above, mucosal mast cells can be localized in mucosal tissues such as the intestinal tract and can be involved in the development of allergies when allergens reach the mucosal tissues. Therefore, in order to suppress allergies mediated by mucosal tissues, it is important to reduce the proportion of abnormally increased mucosal mast cells. It is also important to maintain the proportion of mucosal mast cells at normal values even if allergies have not developed.
特に、粘膜組織を介したアレルギーとしては、食物を摂取することにより発症する食物アレルギーがある。そこで、食物アレルギーを誘起する食物性アレルゲンと同時的かつ日常的に摂取することにより、粘膜型マスト細胞の異常増加を抑制し、かつ、粘膜型マスト細胞の割合を正常な値に維持することにより、アレルギー疾患になりにくい体質作りに貢献できれば、食物アレルギーの罹患者の健康や福祉に資することができ、有益である。しかし、非特許文献１及び２並びに特許文献１を含めて、日常の食事の際に摂取することができ、かつ、粘膜型マスト細胞への分化を抑制して、細胞あたりの粘膜型マスト細胞の割合を減少させ得るものはこれまでに知られていない。 In particular, as an allergy through mucosal tissue, there is a food allergy that develops by ingesting food. Therefore, by ingesting it simultaneously and daily with a food allergen that induces food allergies, it is possible to suppress an abnormal increase in mucosal mast cells and maintain the proportion of mucosal mast cells at a normal value. If we can contribute to building a constitution that is less likely to cause allergic diseases, it will contribute to the health and welfare of people suffering from food allergies, which is beneficial. However, including Non-Patent Documents 1 and 2 and Patent Document 1, the mucosal mast cells per cell can be ingested during daily meals and suppress the differentiation into mucosal mast cells. Nothing has been known that could reduce the proportion.
そこで、本発明が解決しようとする課題は、食事の用に供することができ、かつ、細胞あたりの粘膜型マスト細胞の割合を減少させることができる組成物を提供することにある。 Therefore, an object to be solved by the present invention is to provide a composition that can be used for meals and can reduce the ratio of mucosal mast cells per cell.
大豆の発酵物及び麦の発酵物において、大豆アレルゲン及び麦アレルゲンは発酵を通じて大幅に減少していることがＥＬＩＳＡ法などにより確認されている。したがって、大豆アレルゲンや麦アレルゲンに敏感に応答する個体において、発酵を通じて大豆アレルゲンや麦アレルゲンが分解した大豆の発酵物及び麦の発酵物を摂取したとしても、アレルギーの症状が見られる可能性が低いと考えられる。 It has been confirmed by the ELISA method and the like that soybean allergens and wheat allergens are significantly reduced through fermentation in fermented soybeans and fermented wheat. Therefore, individuals who are sensitive to soybean allergens and wheat allergens are unlikely to have allergic symptoms even if they ingest soybean fermented products and wheat fermented products obtained by decomposing soybean allergens and wheat allergens through fermentation. it is conceivable that.
本発明者らは鋭意研究を積み重ねた結果、大豆の発酵物や麦の発酵物を含むしょうゆなどの発酵食品は、該発酵食品の後に摂取した小麦アレルゲンに対する免疫寛容がみられ、さらにアレルギーの発症を低めること、すなわち、アレルギーの発症に抑制的に作用し得ることを見出した。そして、さらに鋭意研究を進めていくうちに、粘膜型マスト細胞に着目するに至り、粘膜型マスト細胞への分化誘導方法及び粘膜型マスト細胞の製造方法を創作することを試みた。 As a result of diligent research, the present inventors have found that fermented foods such as soy sauce containing fermented soybean products and fermented wheat products are immunotolerant to wheat allergens ingested after the fermented foods, and further develop allergies. It was found that it can suppress the onset of allergies. Then, as we proceeded with further diligent research, we came to pay attention to mucosal mast cells and tried to create a method for inducing differentiation into mucosal mast cells and a method for producing mucosal mast cells.
その結果、ＢＭＭＣと同様の性質を有する未成熟マスト細胞株とＩＬ−１０とを接触させることにより安定的に粘膜型マスト細胞の割合を高め得ることを見出した。この知見を基に製造された粘膜型マスト細胞を用いて検討を重ねた結果、発酵食品に含まれる大豆の発酵物及び麦の発酵物は、未成熟細胞から粘膜型マスト細胞への異常な分化を抑制することや粘膜型マスト細胞の割合を正常な値に維持することを通じて、細胞あたりの粘膜型マスト細胞の割合を減少させることにより、大豆アレルゲンや小麦アレルゲンなどの食物性アレルゲンが作用する細胞の数を減じることができ、アレルギーに対して抑制的に作用する可能性があることを見出した。 As a result, it was found that the proportion of mucosal mast cells can be stably increased by contacting IL-10 with an immature mast cell line having the same properties as BMMC. As a result of repeated studies using mucosal mast cells produced based on this finding, the fermented soybean and fermented wheat contained in fermented foods abnormally differentiated from immature cells into mucosal mast cells. Cells on which food allergens such as soybean allergens and wheat allergens act by reducing the proportion of mucosal mast cells per cell by suppressing the proportion of mucosal mast cells and maintaining the proportion of mucosal mast cells at normal values. It was found that the number of mast cells can be reduced and that it may act suppressively against allergens.
そして、これらの知見を基に、本発明者らは、大豆の発酵物及び麦の発酵物を利用した、粘膜型マスト細胞への分化抑制用組成物及び抗アレルギー用組成物を創作することに成功した。本発明はこれらの知見及び成功例に基づいて完成するに至った発明である。 Then, based on these findings, the present inventors decided to create a composition for suppressing differentiation into mucosal mast cells and a composition for anti-allergy using fermented soybean and fermented wheat. Successful. The present invention has been completed based on these findings and successful examples.
したがって、本発明の各一態様によれば、以下のものが提供される：
［１］大豆の発酵物及び麦の発酵物を有効成分として含有する、粘膜型マスト細胞への分化抑制用組成物。
［２］前記組成物は、しゅうゆ又はみそである、［１］に記載の粘膜型マスト細胞への分化抑制用組成物。
［３］前記しょうゆは、こいくちしょうゆ、うすくちしょうゆ、たまりしょうゆ、さいしこみしょうゆ及びしろしょうゆからなる群から選ばれるしょうゆである、［２］に記載の粘膜型マスト細胞への分化抑制用組成物。
［４］前記組成物は、インターロイキン−３及びインターロイキン−１０の存在下で、未成熟マスト細胞株から粘膜型マスト細胞への分化を抑制する作用を有する組成物である、［１］〜［３］のいずれか１項に記載の粘膜型マスト細胞への分化抑制用組成物。
［５］［１］〜［４］のいずれか１項に記載の組成物を有効成分として含有する、抗アレルギー用組成物。
［６］前記抗アレルギー用組成物は、食物アレルギーを発症している者又は該食物アレルギーを発症する可能性がある者に摂取される抗アレルギー用組成物である、［５］に記載の抗アレルギー用組成物。
［７］前記抗アレルギー用組成物は、食物性アレルゲンを含有する食品と併用される抗アレルギー用組成物である、［５］又は［６］に記載の抗アレルギー用組成物。
［８］前記抗アレルギー用組成物は、粘膜組織を介するアレルギーを対象とする抗アレルギー用組成物である、［５］〜［７］のいずれか１項に記載の抗アレルギー用組成物。
Therefore, according to each aspect of the invention, the following are provided:
[1] A composition for suppressing differentiation into mucosal mast cells, which contains a fermented soybean product and a fermented wheat product as active ingredients.
[2] The composition for suppressing differentiation into mucosal mast cells according to [1], wherein the composition is soybean paste or miso.
[3] The composition for suppressing differentiation into mucosal mast cells according to [2], wherein the soy sauce is a soy sauce selected from the group consisting of koikuchi soy sauce, thin soy sauce, tamari soy sauce, saikomi soy sauce and white soy sauce. Stuff.
[4] The composition is a composition having an action of suppressing the differentiation of an immature mast cell line into a mucosal mast cell in the presence of interleukin-3 and interleukin-10, [1] to The composition for suppressing differentiation into mucosal mast cells according to any one of [3].
[5] An antiallergic composition containing the composition according to any one of [1] to [4] as an active ingredient.
[6] The anti-allergic composition according to [5], wherein the anti-allergic composition is an anti-allergic composition ingested by a person who has developed a food allergy or a person who may develop the food allergy. Composition for allergies.
[7] The anti-allergic composition according to [5] or [6], wherein the anti-allergic composition is an anti-allergic composition used in combination with a food containing a food allergen.
[8] The antiallergic composition according to any one of [5] to [7], wherein the antiallergic composition is an antiallergic composition for allergies via mucosal tissues.
本発明の一態様である組成物は、有効成分による粘膜型マスト細胞への分化を抑制する作用及び抗アレルギー作用を通じて、粘膜性のアレルギーや該アレルギーと関連する炎症、例えば、食物アレルギー、花粉症、胃炎、腸炎、下痢、潰瘍性大腸炎、鼻炎、気管支炎、気管支喘息、レフレル症候群、口内炎などによる症状や自己免疫症状を改善、緩和、抑制、治療若しくは予防すること、又は免疫療法の用に供することが期待できる。 The composition according to one aspect of the present invention has mucosal allergies and inflammations associated with the allergies, such as food allergies and pollinosis, through the action of suppressing the differentiation of the active ingredient into mucosal mast cells and the antiallergic action. , Gastric inflammation, enteritis, diarrhea, ulcerative colitis, rhinitis, bronchitis, bronchial asthma, Refrel syndrome, stomatitis, etc. to improve, alleviate, suppress, treat or prevent, or for immunotherapy It can be expected to be provided.
特に、食物アレルギーの発症者にとって、アレルゲン除去食品の摂取は該発症者やその周囲の者にとって負担が甚大である。そこで、アレルギーを抑制する作用を示し得る本発明の一態様である組成物によれば、他の飲食品と併用することにより、食物アレルギーに関連する症状を減弱することが期待できる。 In particular, for a person who develops a food allergy, ingestion of an allergen-free food is extremely burdensome for the person who develops the food allergy and those around it. Therefore, according to the composition which is one aspect of the present invention capable of exhibiting an action of suppressing allergies, it can be expected that the symptoms related to food allergies are alleviated when used in combination with other foods and drinks.
以下、本発明の一態様である粘膜型マスト細胞への分化抑制用組成物及び抗アレルギー用組成物（以下、これらをまとめて本発明の一態様の組成物と総称する場合がある。）の詳細並びに本発明の一態様である粘膜型マスト細胞への分化誘導方法及び粘膜型マスト細胞の製造方法の詳細について説明するが、本発明の技術的範囲は本項目の事項によってのみに限定されるものではなく、本発明はその目的を達成する限りにおいて種々の態様をとり得る。 Hereinafter, a composition for suppressing differentiation into mucosal mast cells and a composition for anti-allergy, which are one aspect of the present invention (hereinafter, these may be collectively referred to as the composition of one aspect of the present invention). Details and details of a method for inducing differentiation into mucosal mast cells and a method for producing mucosal mast cells, which is one aspect of the present invention, will be described, but the technical scope of the present invention is limited only by the matters of this item. However, the present invention may take various aspects as long as the object is achieved.
本発明の一態様は、大豆の発酵物及び麦の発酵物を有効成分として含有する、粘膜型マスト細胞への分化抑制用組成物である。 One aspect of the present invention is a composition for suppressing differentiation into mucosal mast cells, which contains a fermented soybean product and a fermented wheat product as active ingredients.
本明細書における各用語は、別段の定めがない限り、当業者により通常用いられている意味で使用され、不当に限定的な意味を有するものとして解釈されるべきではない。 Unless otherwise specified, each term in the present specification is used in the meaning commonly used by those skilled in the art and should not be construed as having an unreasonably limited meaning.
例えば、分化とは、一般的に、特性をもたない細胞が様々な特性を持つ細胞に変化することをいうところ、本明細書における「分化」は、ある特性を有する細胞が別の特性を有する細胞に転じることを広く意味することに加え、一般に分化細胞として知られている２種の細胞の間での、可逆的又は不可逆的な相互の転換をも含む、より広範な概念として用いられ得る。本明細書における「分化を抑制する」とは、分化することを妨げることに加えて、分化前の状態に維持すること、分化後の状態を分化前の状態に戻すことなどを含み得る。また、本明細書における「分化を誘導する」とは、分化を引き起こすことに加えて、分化することを妨げないことなどを含み得る。 For example, differentiation generally means that a cell having no characteristic changes into a cell having various characteristics, and "differentiation" in the present specification means that a cell having one characteristic has another characteristic. Used as a broader concept, including reversible or irreversible reciprocal conversion between two types of cells commonly known as differentiated cells, in addition to broadly meaning turning into a cell to possess. obtain. As used herein, "suppressing differentiation" may include, in addition to preventing differentiation, maintaining the state before differentiation, returning the state after differentiation to the state before differentiation, and the like. Further, "inducing differentiation" in the present specification may include not only causing differentiation but also not hindering differentiation.
例えば、「組成物」は、通常用いられている意味のものとして特に限定されないが、例えば、２種以上の物質が組み合わさってなる物であり、具体的には、有効成分と別の物質とが組み合わさってなるもの、有効成分の２種以上が組み合わさってなるものなどが挙げられ、より具体的には、有効成分の１種以上と固形物又は溶媒の１種以上とが組み合わさってなる固形組成物及び液性組成物などが挙げられる。 For example, the "composition" is not particularly limited as having a commonly used meaning, but is, for example, a combination of two or more substances, specifically, an active ingredient and another substance. Examples include those obtained by combining two or more kinds of active ingredients, and more specifically, one or more kinds of active ingredients combined with one or more kinds of solid substances or solvents. Examples thereof include solid compositions and liquid compositions.
粘膜型マスト細胞への分化抑制用組成物は、含有する有効成分が機能することにより、粘膜型マスト細胞への分化抑制作用を示す。 The composition for suppressing differentiation into mucosal mast cells exhibits an action of suppressing differentiation into mucosal mast cells by the function of the active ingredient contained therein.
大豆の発酵物は、通常知られているとおりに、大豆に微生物を作用させて大豆中の物質を分解及び／又は変換することなどにより得られる発酵物であれば特に限定されない。同様に、麦の発酵物は、通常知られているとおりに、小麦、大麦、裸麦、はと麦などの麦に微生物を作用させて麦中の物質を分解及び／又は変換することなどにより得られる発酵物であれば特に限定されない。 As is generally known, the fermented soybean is not particularly limited as long as it is a fermented product obtained by allowing microorganisms to act on soybean to decompose and / or convert substances in soybean. Similarly, fermented wheat products are obtained by, as is generally known, decomposing and / or converting substances in wheat by allowing microorganisms to act on wheat such as wheat, barley, bare wheat, and adlay. It is not particularly limited as long as it is a fermented product.
本発明の一態様の組成物は、大豆の発酵物及び麦の発酵物を含有するものであれば特に限定されないが、例えば、しょうゆ、みそ及びこれらを含有する飲食品やこれらを用いて調理や加工された飲食品などが挙げられ、調理の際や他の食材や食品とともに用いられるしょうゆ及びみそであることが好ましい。 The composition of one aspect of the present invention is not particularly limited as long as it contains a fermented soybean product and a fermented wheat product, but for example, soy sauce, miso, foods and drinks containing these, and cooking using these are used. Examples include processed foods and drinks, and soy sauce and miso used during cooking and with other ingredients and foods are preferable.
しょうゆやみそは、通常知られているとおりのものであれば特に限定されず、例えば、農林水産省により示されている「しょうゆ品質表示基準」や「みそ品質表示基準」において定義付けされているものを挙げることができる。 Soy sauce and miso are not particularly limited as long as they are generally known, and are defined in, for example, "soy sauce quality labeling standard" and "miso quality labeling standard" indicated by the Ministry of Agriculture, Forestry and Fisheries. I can mention things.
しょうゆの具体例としては、例えば、こいくちしょうゆ、うすくちしょうゆ、たまりしょうゆ、さいしこみしょうゆ、しろしょうゆ、だししょうゆ、照りしょうゆ、生揚げしょうゆなどが挙げられ、粘膜型マスト細胞への分化抑制作用の強度の観点からこいくちしょうゆ、うすくちしょうゆ、たまりしょうゆ、さいしこみしょうゆ及びしろしょうゆが好ましいが、これらに限定されない。しょうゆは、上記の例示したしょうゆなどをさらなる加工処理に供したものであってもよい。このような加工処理は特に限定されないが、例えば、脱塩処理や希釈処理などが挙げられる。また、しょうゆは、しょうゆ中の特定の成分を減少若しくは排除又はしょうゆに特定の成分を追加する意図をもって製造したしょうゆであってもよく、例えば、無塩下又は減塩下で製造したしょうゆ、トマトなどの野菜成分を追加するように製造したしょうゆなどが挙げられる。しょうゆは、これらのうちの１種を単独で、又は２種以上を組み合わせて使用できる。 Specific examples of soy sauce include koikuchi soy sauce, thin soy sauce, tamari soy sauce, saishikomi soy sauce, white soy sauce, dashi soy sauce, shining soy sauce, and fried soy sauce. From the viewpoint of strength, Koikuchi soy sauce, thin soy sauce, tamari soy sauce, saikomi soy sauce and white soy sauce are preferable, but not limited to these. The soy sauce may be a soy sauce obtained by subjecting the above-exemplified soy sauce or the like to further processing. Such a processing treatment is not particularly limited, and examples thereof include desalting treatment and dilution treatment. In addition, soy sauce may be soy sauce produced with the intention of reducing or eliminating specific components in soy sauce or adding specific components to soy sauce, for example, soy sauce produced under unsalted or reduced salt, tomatoes. Examples include soy sauce manufactured to add vegetable ingredients such as. Soy sauce can be used alone or in combination of two or more.
大豆の発酵物、麦の発酵物及びこれらを含有する組成物は、その入手方法について特に限定されず、例えば、市販されているものや当業者により通常知られている手法により製造したものなどを利用することができる。例えば、しょうゆは、本願出願人であるキッコーマン社から市販されているものを挙げることができ、具体的には「キッコーマン しょうゆ」、「キッコーマン 特選丸大豆しょうゆ」、「キッコーマン 特選丸大豆減塩しょうゆ」、「キッコーマン 減塩しょうゆ」、「キッコーマン 特選有機しょうゆ」、「キッコーマン うすくちしょうゆ」などが挙げられるが、これらに限定されない。 The fermented soybean product, the fermented wheat product, and the composition containing these are not particularly limited in terms of the method of obtaining them, and for example, those commercially available or those produced by a method usually known to those skilled in the art can be used. It can be used. For example, soy sauce may be commercially available from Kikkoman, the applicant of the present application, and specifically, "Kikkoman soy sauce", "Kikkoman specially selected whole soy sauce", and "Kikkoman specially selected whole soy sauce with reduced salt". , "Kikkoman low-salt soy sauce", "Kikkoman special organic soy sauce", "Kikkoman thin soy sauce", etc., but not limited to these.
粘膜型マスト細胞への分化抑制作用は、非粘膜型マスト細胞から粘膜型マスト細胞への分化を抑制する作用であって、結果として粘膜型マスト細胞の割合を低め得る作用であれば、その作用機序、合わせて伴う他の作用、程度などについては特に限定されない。粘膜型マスト細胞への分化抑制作用としては特に限定されないが、例えば、非粘膜型マスト細胞の増殖に適した条件下や非粘膜型マスト細胞から粘膜型マスト細胞への分化に適した条件下における、非粘膜型マスト細胞から粘膜型マスト細胞への分化を抑制する作用が挙げられる。 The action of suppressing differentiation into mucosal mast cells is an action of suppressing the differentiation of non-mucosal mast cells into mucosal mast cells, and if the action can reduce the proportion of mucosal mast cells as a result, the action. The mechanism, other actions associated with it, the degree, etc. are not particularly limited. The effect of suppressing differentiation into mucosal mast cells is not particularly limited, but is, for example, under conditions suitable for proliferation of non-mucosal mast cells or under conditions suitable for differentiation of non-mucosal mast cells into mucosal mast cells. , The action of suppressing the differentiation of non-mucosal mast cells into mucosal mast cells can be mentioned.
粘膜型マスト細胞への分化抑制作用は、例えば、後述する本発明の粘膜型マスト細胞への分化誘導方法において、未成熟マスト細胞株から粘膜型マスト細胞への分化を抑制する作用であることが好ましい。未成熟マスト細胞株の具体的な例としては、ＦｃεＲＩα及びｃ−Ｋｉｔを発現し、かつ、ＭＭＣＰ（Ｍｏｕｓｅ Ｍａｓｔ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｔｅａｓｅ）−１、ＭＭＣＰ−２、ＭＭＣＰ−３、ＭＭＣＰ−４、ＭＭＣＰ−５、ＭＭＣＰ−６及びカルボキシペプチダーゼＡを実質的に発現しない未成熟マスト細胞株などが挙げられ、より具体的な例としてはマウスの肝臓に由来するマスト細胞を株化したＭＣ／９細胞などが挙げられる。 The action of suppressing differentiation into mucosal mast cells is, for example, an action of suppressing differentiation of immature mast cell lines into mucosal mast cells in the method for inducing differentiation into mucosal mast cells of the present invention, which will be described later. preferable. Specific examples of immature mast cell lines include FcεRIα and c-Kit, and MMCP (Mast Cell Protease) -1, MMCP-2, MMCP-3, MMCP-4, MMCP-5, Examples thereof include immature mast cell lines that do not substantially express MMCP-6 and carboxypeptidase A, and more specific examples include MC / 9 cells in which mast cells derived from mouse liver are established. ..
粘膜型マスト細胞への分化抑制作用は、その評価方法について特に限定されず、例えば、粘膜型マスト細胞が特異的に発現する遺伝子の発現量を測定すること、粘膜型マスト細胞が細胞内外に発現するマーカー分子（タンパク質）を測定すること、粘膜型マスト細胞の数や割合を測定することなどにより評価することができる。例えば、粘膜型マスト細胞が細胞内に特異的に発現するタンパク質について、標識化抗体を用いて細胞内標識をし、次いで標識した細胞の数及び割合を測定することにより評価することができる。 The effect of suppressing differentiation into mucosal mast cells is not particularly limited in terms of the evaluation method. For example, the expression level of a gene specifically expressed by mucosal mast cells can be measured, and mucosal mast cells are expressed inside and outside the cells. It can be evaluated by measuring the marker molecule (protein) to be used, measuring the number and ratio of mucosal mast cells, and the like. For example, a protein that is specifically expressed intracellularly in mucosal mast cells can be evaluated by intracellularly labeling with a labeled antibody and then measuring the number and proportion of labeled cells.
粘膜型マスト細胞が細胞内に特異的に発現するタンパク質は、例えば、マウスの系ではＭＭＣＰ−１及びＭＭＣＰ−２などが挙げられる。 Examples of proteins that mucosal mast cells specifically express in cells include MMCP-1 and MMCP-2 in mouse systems.
粘膜型マスト細胞への分化抑制作用を評価する具体的な第１の評価系は、ＩＬ−３及びＩＬ−１０の存在下で、ＭＣ／９細胞と本発明の一態様の組成物とを共培養し、次いで培養した細胞の量及び割合（ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）並びにＭＭＣＰ−１について標識化した粘膜型マスト細胞（ＭＭＣＰ−１陽性細胞）のｐｏｐｕｌａｔｉｏｎを測定することを含む方法である。粘膜型マスト細胞のｐｏｐｕｌａｔｉｏｎは、例えば、フローサイトメトリーなどの方法、ＥＬＩＳＡやラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）などの抗原抗体反応を利用する方法などにより測定することができるが、特に限定されない。 A specific first evaluation system for evaluating the differentiation inhibitory effect on mucosal mast cells is a combination of MC / 9 cells and the composition of one aspect of the present invention in the presence of IL-3 and IL-10. A method comprising culturing and then measuring the population and proportion of cultured cells and the populationation of mucosal mast cells labeled for MMCP-1 (MMCP-1 positive cells). Population of mucosal mast cells can be measured by, for example, a method such as flow cytometry, a method utilizing an antigen-antibody reaction such as ELISA or radioimmunoassay (RIA), but is not particularly limited.
粘膜型マスト細胞への分化抑制作用を評価する具体的な第２の評価系は、ＩＬ−３及びＩＬ−１０の存在下で、ＭＣ／９細胞と本発明の一態様の組成物とを共培養し、次いで培養後に回収した細胞からＲＮＡを抽出し、次いで抽出したＲＮＡを逆転写してｃＤＮＡライブラリーを得て、次いで得られたｃＤＮＡライブラリーを基にＭＭＣＰ−１遺伝子の発現量を測定することを含む方法である。 A specific second evaluation system for evaluating the differentiation inhibitory effect on mucosal mast cells is a combination of MC / 9 cells and the composition of one aspect of the present invention in the presence of IL-3 and IL-10. After culturing, RNA is extracted from the cells collected after culturing, and then the extracted RNA is reverse transcribed to obtain a cDNA library, and then the expression level of the MMCP-1 gene is measured based on the obtained cDNA library. It is a method that includes that.
第１及び第２の評価系におけるＭＣ／９細胞と本発明の一態様の組成物とを共培養させる条件は特に限定されず、例えば、ＩＬ−３及びＩＬ−１０が失活せず、かつ、ＭＣ／９細胞が死滅しないような条件を挙げることができ、マスト細胞の維持又は増殖に適した培地、温度、ＣＯ２濃度、ｐＨなどを採用した培養条件であることが好ましい。この際、ＩＬ−３及びＩＬ−１０に加えて、他の成分が系内に存在していてもよい。他の成分は、サイトカインが失活せず、かつ、マスト細胞が死滅しないような成分であれば特に限定されないが、例えば、細胞培養に通常用いる成分が挙げられ、より具体的には２−メルカプトエタノールなどの還元剤、血清やＬ−グルタミンなどの細胞増殖に適した栄養成分、ペニシリンやストレプトマイシンなどの抗生物質、ＩＬ−２といったサイトカインなどの生理活性物質などが挙げられる。他の成分の使用量は、本発明の目的を達成し得る範囲内において、適宜設定することができる。 The conditions for co-culturing the MC / 9 cells and the composition of one aspect of the present invention in the first and second evaluation systems are not particularly limited, and for example, IL-3 and IL-10 are not inactivated and IL-10 is not inactivated. , MC / 9 cells can be mentioned, and it is preferable that the culture conditions employ a medium, temperature, CO 2 concentration, pH, etc. suitable for maintenance or proliferation of mast cells. At this time, in addition to IL-3 and IL-10, other components may be present in the system. The other components are not particularly limited as long as they do not inactivate cytokines and kill mast cells, but examples thereof include components normally used for cell culture, and more specifically 2-mercapto. Examples thereof include reducing agents such as ethanol, nutritional components suitable for cell growth such as serum and L-glutamine, antibiotics such as penicillin and streptomycin, and physiologically active substances such as cytokines such as IL-2. The amount of other components used can be appropriately set within a range in which the object of the present invention can be achieved.
粘膜型マスト細胞への分化抑制作用は、その程度について特に限定されないが、例えば、上記の第１の評価系により、本発明の一態様の組成物を用いない場合と比べて、ＭＭＣＰ−１が陽性である粘膜型マスト細胞（ＭＭＣＰ−１陽性細胞）の割合を低める作用であり、好ましくはＭＭＣＰ−１陽性細胞の割合を０．９倍以下に低める作用であり、より好ましくはＭＭＣＰ−１陽性細胞の割合を０．８倍以下に低める作用であり、さらに好ましくはＭＭＣＰ−１陽性細胞の割合を０．７倍以下に低める作用である。 The degree of the effect of suppressing differentiation into mucosal mast cells is not particularly limited, but for example, according to the first evaluation system described above, MMCP-1 can be used as compared with the case where the composition of one aspect of the present invention is not used. It is an action of lowering the proportion of positive mucosal mast cells (MMCP-1 positive cells), preferably an action of reducing the proportion of MMCP-1 positive cells to 0.9 times or less, and more preferably MMCP-1 positive. It is an action of reducing the proportion of cells to 0.8 times or less, and more preferably an action of reducing the proportion of MMCP-1-positive cells to 0.7 times or less.
本発明の別の一態様は、大豆の発酵物及び麦の発酵物を有効成分として含有する、又は粘膜型マスト細胞への分化抑制用組成物を有効成分として含有する、抗アレルギー用組成物である。 Another aspect of the present invention is an anti-allergic composition containing a fermented soybean product and a fermented wheat product as active ingredients, or a composition for suppressing differentiation into mucosal mast cells as an active ingredient. is there.
抗アレルギー用組成物は、通常知られているとおりのものであれば特に限定されず、例えば、アレルギーの症状、アレルギーと関連した疾患の症状及び自己免疫症状などを改善、緩和、抑制、治療若しくは予防するための、又は免疫療法の用に供するための組成物であり得る。 The antiallergic composition is not particularly limited as long as it is generally known, and for example, allergic symptoms, allergic-related disease symptoms, autoimmune symptoms, etc. are improved, alleviated, suppressed, treated or treated. It can be a composition for prevention or for use in immunotherapy.
抗アレルギー用組成物は、消化器官系、例えば、腸、胃、鼻腔、咽頭、口腔などの器官における粘膜組織を介するアレルギーを対象とするものであることが好ましく、食物アレルギー、花粉症、胃炎、腸炎、下痢、潰瘍性大腸炎、鼻炎、気管支炎、気管支喘息、レフレル症候群及び口内炎を対象とするものであることがより好ましい。しょうゆやみそなどの発酵食品は食物性アレルゲンを含む食材や食品とともに摂取する頻度が高いことから、食物アレルギーを対象とするものであることが好ましく、食物性アレルゲンが接触する可能性がある腸、胃、咽頭、口腔などの器官における粘膜組織を介するアレルギーを対象とするものであることがより好ましい。 The antiallergic composition preferably targets allergies through mucosal tissues in organs such as the digestive system, such as the intestine, stomach, nasal cavity, pharynx, and oral cavity, and includes food allergies, pollinosis, and gastrointestinal inflammation. More preferably, it targets enteritis, diarrhea, ulcerative colitis, rhinitis, bronchitis, bronchial asthma, Refrel syndrome and stomatitis. Fermented foods such as soy sauce and miso are frequently ingested with foods and foods containing food allergens, so it is preferable that they are intended for food allergies, and the intestines that food allergens may come into contact with. More preferably, it targets allergies mediated by mucosal tissues in organs such as the stomach, pharynx, and oral cavity.
免疫応答のメカニズムは未解明な部分が多く、本発明の技術的範囲はいかなる理論や推測にも拘泥されるものではないが、抗アレルギー用組成物は、例えば、適用した被験体において、粘膜型マスト細胞の割合を低下させることにより、粘膜型マスト細胞が活性化することによる脱顆粒、炎症性サイトカインの産生、脂質メディエータの産生などのいずれかの生理的現象の程度を減弱することができ、これにより抗アレルギー作用を発揮し得る。 Although the mechanism of immune response remains largely unclear and the technical scope of the invention is not bound by any theory or speculation, antiallergic compositions can be described, for example, in mucosal types in applied subjects. By reducing the proportion of mast cells, the degree of any physiological phenomenon such as degranulation by activation of mucosal mast cells, production of inflammatory cytokines, production of lipid mediators, etc. can be attenuated. This can exert an anti-allergic effect.
抗アレルギー作用は、その評価方法について特に限定されず、例えば、当業者にとって公知の方法を特に限定せずに挙げることができ、具体的には適用した被験体におけるアレルギーの症状の程度を測定すること、粘膜型マスト細胞から遊離した、又は産生された生理活性物質を測定すること、粘膜型マスト細胞の割合や数を測定することなどにより評価する方法が挙げられる。 The antiallergic action is not particularly limited in its evaluation method, and for example, a method known to those skilled in the art can be mentioned without particular limitation, and specifically, the degree of allergic symptoms in the applied subject is measured. That is, a method of evaluation by measuring a physiologically active substance released or produced from mucosal mast cells, measuring the proportion or number of mucosal mast cells, and the like can be mentioned.
本発明の一態様の組成物の適用対象は特に限定されず、例えば、動物、中でも哺乳類が挙げられ、哺乳類としてはヒト、イヌ、ネコ、ウシ、ウマなどが挙げられ、これらの中でもヒトであることが好ましい。適用対象は、健常な対象であってもよいが、アレルギーの治療又は予防が望まれる対象であることが好ましい。 The application target of the composition of one aspect of the present invention is not particularly limited, and examples thereof include animals, particularly mammals, and mammals include humans, dogs, cats, cows, horses, and the like, and among these, humans. Is preferable. The target of application may be a healthy target, but is preferably a target for which treatment or prevention of allergies is desired.
アレルギーの治療又は予防が望まれる対象としては、例えば、粘膜組織を介したアレルギーに罹患している者又はその可能性がある者が挙げられ、小麦アレルギーや大豆アレルギーなどの食物アレルギーを発症している者及び該食物アレルギーを発症する可能性がある者であることが好ましい。 Targets for which treatment or prevention of allergies are desired include, for example, those who have or may have allergies through mucosal tissues, and develop food allergies such as wheat allergies and soybean allergies. It is preferable to be a person who has a food allergy and a person who may develop the food allergy.
本発明の一態様の組成物は、粘膜型マスト細胞への分化抑制作用及び抗アレルギー作用を有することから、例えば、食物アレルギーを引き起こす可能性がある食物性アレルゲンを含有する食材や食品と併用することができる。本発明の一態様の組成物と併用される食材や食品としては特に限定されないが、例えば、大豆、小麦などの麦などの食物性アレルゲンを含有する食品が好ましい。本発明の一態様の組成物と併用される食材や食品は、本発明の一態様の組成物と同時的に、又はこれと前後して摂取され得る。 Since the composition of one aspect of the present invention has an action of suppressing differentiation into mucosal mast cells and an antiallergic action, it is used in combination with, for example, a food or food containing a food allergen that may cause food allergies. be able to. The foodstuff or food used in combination with the composition of one aspect of the present invention is not particularly limited, but for example, a food containing a food allergen such as wheat such as soybean and wheat is preferable. Ingredients and foods used in combination with the composition of one aspect of the present invention can be ingested simultaneously with or before and after the composition of one aspect of the present invention.
本発明の一態様の組成物は、その適用方法について特に限定されず、例えば、経口的又は非経口的に適用され得る。非経口的な適用としては、皮内、皮下、静脈内、筋肉内投与などによる注射及び注入；経皮；鼻、咽頭などの粘膜からの吸入などが挙げられるが、これらに限定されない。 The composition of one aspect of the present invention is not particularly limited in terms of its application method, and can be applied, for example, orally or parenterally. Parenteral applications include, but are not limited to, injections and injections by intradermal, subcutaneous, intravenous, intramuscular, etc .; transdermal; inhalation through mucosa such as the nose and pharynx.
本発明の一態様の組成物は、粘膜型マスト細胞への分化抑制作用及び抗アレルギー作用が用量依存傾向にあることから、それらの適用量は年齢、体格、症状などの適用対象の特性；適用方法；適用部位などに合わせて適宜設定することができる。具体的には、本発明の一態様の組成物がしょうゆ又はしょうゆ含有食品である場合、本発明の一態様の組成物の摂取量は、例えば、０．１〜１，０００ｍｇ／体重６０ｋｇ／日であるが、これに限定されない。摂取回数は特に限定されないが、例えば、１日１〜３回であり、摂取量に応じて適宜回数を増減することができる。 Since the composition of one aspect of the present invention tends to have a dose-dependent effect on differentiation inhibitory effect on mucosal mast cells and an antiallergic effect, the application amount thereof is the characteristics of the application target such as age, physique, and symptoms; application. Method: It can be appropriately set according to the application site and the like. Specifically, when the composition of one aspect of the present invention is soy sauce or a food containing soy sauce, the intake of the composition of one aspect of the present invention is, for example, 0.1 to 1,000 mg / body weight 60 kg / day. However, it is not limited to this. The number of intakes is not particularly limited, but is, for example, 1 to 3 times a day, and the number of intakes can be appropriately increased or decreased according to the amount of intake.
本発明の一態様の組成物は、これを経口的に摂取することにより、経口免疫寛容が誘導又は増強される場合がある。その結果として、経口免疫寛容により、例えば、食物アレルギーなどのアレルギー症状や自己免疫症状を改善、緩和、抑制、治療又は予防することが可能となる。 The composition of one aspect of the present invention may induce or enhance oral immune tolerance by ingesting it orally. As a result, oral immune tolerance can improve, alleviate, suppress, treat or prevent, for example, allergic symptoms such as food allergies and autoimmune symptoms.
また、本発明の一態様の組成物は、粘膜型マスト細胞により産生される炎症性サイトカインや炎症性メディエータなどの生理活性物質が関与する、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、乾癬、潰瘍性大腸炎、クローン病などの症状を改善、緩和、抑制、治療又は予防することが期待できる。 In addition, the composition of one aspect of the present invention comprises rheumatoid arthritis, systemic lupus erythematosus, multiple sclerosis, psoriasis, which involves physiologically active substances such as inflammatory cytokines and inflammatory mediators produced by mucosal mast cells. It can be expected to improve, alleviate, suppress, treat or prevent symptoms such as ulcerative colitis and Crohn's disease.
本発明の一態様の組成物は、それらを単独で、又はそれらを配合する飲食品組成物や医薬品組成物などの形態をとり得る。したがって、本発明の具体的な一態様は、大豆の発酵物及び麦の発酵物を有効成分として含有する、又は本発明の一態様の組成物を含有する、飲食品組成物、医薬品組成物、医薬部外品組成物、化粧品組成物、動物飼料組成物などである。 The composition of one aspect of the present invention may take the form of a food or drink composition or a pharmaceutical composition containing them alone or in combination with them. Therefore, a specific aspect of the present invention is a food or drink composition, a quasi-drug, which contains a fermented soybean product and a fermented wheat product as active ingredients, or contains the composition of one aspect of the present invention. These include quasi-drug compositions, cosmetic compositions, and animal feed compositions.
本発明の一態様の組成物が飲食品組成物である場合は、本発明の目的を達成し得る限り、食経験のある、天然物及び非天然物並びにこれらの含有物を配合してもよい。例えば、飲食品組成物には、抗アレルギー効果や経口免疫寛容増強効果が知られている、フラボノイド、ゲニステイン、ゲニスチンなどを含む豆乳；醤油などに含まれる大豆発酵多糖類；ビタミンＣなどのビタミン類などを配合することが好ましい。 When the composition of one aspect of the present invention is a food and drink composition, natural products and non-natural products having eating experience and their inclusions may be blended as long as the object of the present invention can be achieved. .. For example, soymilk containing flavonoids, genistein, genistin, etc., which are known to have anti-allergic effects and oral immune tolerance enhancing effects, in food and drink compositions; soybean fermented polysaccharides contained in soy sauce, etc .; vitamins such as vitamin C. It is preferable to mix such as.
飲食品組成物に含有してもよい他の成分としては、例えば、糖質甘味料、安定化剤、乳化剤、澱粉、澱粉加工物、澱粉分解物、食塩、着香料、着色料、酸味料、風味原料、栄養素、果汁、卵などの動植物性食材、賦形剤、増量剤、結合剤、増粘剤、香油などの通常の食品加工に使用される添加物を挙げることができる。添加物の使用量は、本発明の課題の解決を妨げない限り特に限定されず、適宜設定され得る。 Other ingredients that may be contained in the food and drink composition include, for example, sugar sweeteners, stabilizers, emulsifiers, starches, processed starch products, starch decomposition products, salt, flavoring agents, coloring agents, acidulants, and the like. Examples include animal and vegetable foodstuffs such as flavoring ingredients, nutrients, fruit juices and eggs, excipients, bulking agents, binders, thickeners, additives used in ordinary food processing such as perfume oils. The amount of the additive used is not particularly limited as long as it does not interfere with the solution of the problem of the present invention, and can be set as appropriate.
飲食品組成物は、通常用いられる形態であれば特に限定されず、例えば、固形状、液状、ゲル状、懸濁液状、クリーム状、シート状、スティック状、粉状、粒状、顆粒状、錠状、棒状、板状、ブロック状、ペースト状、カプセル状、カプレット状などの各形態を採り得る。 The food and drink composition is not particularly limited as long as it is in a commonly used form, and is, for example, solid, liquid, gel, suspension, cream, sheet, stick, powder, granular, granular, or tablet. It can take various forms such as a rod shape, a plate shape, a block shape, a paste shape, a capsule shape, and a caplet shape.
飲食品組成物の具体的な一態様は、例えば、生体に対して一定の機能性を有する飲食品である機能性飲食品である。機能性飲食品は、例えば、特定保健用飲食品、機能性表示飲食品、栄養機能飲食品、保健機能飲食品、特別用途飲食品、栄養補助飲食品、健康補助飲食品、サプリメント、美容飲食品などのいわゆる健康飲食品に加えて、乳児用飲食品、妊産婦用飲食品、高齢者用飲食品などの特定者用飲食品を包含する。さらに機能性飲食品は、コーデックス（ＦＡＯ／ＷＨＯ合同食品規格委員会）の食品規格に基づく健康強調表示（Ｈｅａｌｔｈ ｃｌａｉｍ）が適用される健康飲食品を包含する。 A specific aspect of the food and drink composition is, for example, a functional food and drink which is a food and drink having a certain functionality with respect to a living body. Functional foods and drinks include, for example, foods and drinks for specified health use, foods and drinks with functional claims, foods and drinks with nutritional functions, foods and drinks with health functions, foods and drinks for special purposes, foods and drinks for nutritional supplements, healthy foods and drinks, supplements, beauty foods and drinks. In addition to so-called healthy foods and drinks such as, it includes foods and drinks for specific persons such as foods and drinks for infants, foods and drinks for pregnant women, and foods and drinks for the elderly. Further, functional foods and drinks include healthy foods and drinks to which a health claim based on the food standards of Codex (FAO / WHO Joint Food Standards Committee) is applied.
飲食品組成物の包装形態は特に限定されず、適用される形態などに応じて適宜選択できるが、例えば、ＰＴＰなどのブリスターパック；ストリップ包装；ヒートシール；アルミパウチ；プラスチックや合成樹脂などを用いるフィルム包装；バイアルなどのガラス容器；アンプルなどのプラスチック容器などが挙げられる。 The packaging form of the food and drink composition is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the applicable form and the like. For example, a blister pack such as PTP; strip packaging; heat seal; aluminum pouch; plastic or synthetic resin is used. Film packaging; glass containers such as vials; plastic containers such as ampoules.
本発明の一態様の組成物が医薬品組成物である場合は、適用後に少なくとも粘膜型マスト細胞への分化抑制作用が発揮し、それに伴いアレルギーの症状やアレルギーに関連のある疾患の症状を治療又は予防し得る限り、あらゆる医薬品の形態をとり得る。医薬品組成物には、本発明の目的を達成し得る限り、特許文献１に記載されている有効成分などの他の粘膜型マスト細胞への分化抑制作用又は抗アレルギー作用を有する生理活性物質を配合することができる。このような生理活性物質の他の具体例としては、抗ＩＬ−１０受容体抗体、ＩＬ−１０アナログ、ＩＬ−１０受容体拮抗阻害剤、ＩＬ−１０との複合体形成物質、抗ＩＬ−３受容体抗体、ＩＬ−３アナログ、ＩＬ−３受容体拮抗阻害剤、ＩＬ−３との複合体形成物質などが挙げられるが、これらに限定されない。 When the composition of one aspect of the present invention is a pharmaceutical composition, it exerts at least an inhibitory effect on differentiation into mucosal mast cells after application, and accordingly treats or treats allergic symptoms or symptoms of diseases related to allergies. It can take any form of medicine as long as it can be prevented. The pharmaceutical composition contains a physiologically active substance having an inhibitory effect on differentiation into other mucosal mast cells or an antiallergic effect, such as the active ingredient described in Patent Document 1, as long as the object of the present invention can be achieved. can do. Other specific examples of such physiologically active substances include anti-IL-10 receptor antibody, IL-10 analog, IL-10 receptor antagonism inhibitor, complex-forming substance with IL-10, and anti-IL-3. Examples include, but are not limited to, receptor antibodies, IL-3 analogs, IL-3 receptor antagonistic inhibitors, complex-forming substances with IL-3, and the like.
医薬品組成物には、有効成分以外に様々な目的に対するその他の成分を含めてもよく、このようなその他の成分としては、例えば保存剤、緩衝剤などが挙げられる。保存剤としては、ナトリウム重亜硫酸、ナトリウム重硫酸、ナトリウムチオ硫酸塩化ベンザルコニウム、クロロブタノール、チメロサール、酢酸フェニル水銀、硝酸フェニル水銀、メチルパラベン、ポリビニルアルコール、フェニルエチルアルコール、アンモニア、ジチオスレイトール、ベータメルカプトエタノールなどが挙げられる。また、緩衝剤としては、炭酸ナトリウム、ホウ酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、重炭酸ナトリウムなどが挙げられる。これら薬剤は、系のｐＨを２〜９、好ましくは４〜８の間で維持することができる量で存在することができる。 In addition to the active ingredient, the pharmaceutical composition may contain other ingredients for various purposes, and such other ingredients include, for example, preservatives, buffers, and the like. Preservatives include sodium bisulfite, sodium bisulfite, sodium thiosulfite benzalkonium chloride, chlorobutanol, thimerosal, phenylmercury acetate, phenylmercury nitrate, methylparaben, polyvinyl alcohol, phenylethyl alcohol, ammonia, dithiothreitol, beta. Examples include mercaptoethanol. Examples of the buffer include sodium carbonate, sodium borate, sodium phosphate, sodium acetate, sodium bicarbonate and the like. These agents can be present in an amount capable of maintaining the pH of the system between 2-9, preferably 4-8.
医薬品組成物の剤型は特に限定されないが、例えば、注射剤（筋肉、皮下、皮内）、経口製剤、点鼻製剤などが例示される。例えば、医薬品組成物は、食物アレルギーなどのアレルギー疾患を治療するためのワクチンとして調製することができる。医薬品組成物がワクチンの形態である場合、複数種類の有効成分を含む混合カクテルワクチンであってもよい。 The dosage form of the pharmaceutical composition is not particularly limited, and examples thereof include injections (muscle, subcutaneous, intradermal), oral preparations, and nasal drops preparations. For example, the pharmaceutical composition can be prepared as a vaccine for treating allergic diseases such as food allergies. When the pharmaceutical composition is in the form of a vaccine, it may be a mixed cocktail vaccine containing a plurality of active ingredients.
粘膜型マスト細胞を安定的かつ効率的に誘導して、細胞あたりの粘膜型マスト細胞の割合を増加させる方法についてはこれまでに知られていなかったが、本発明者らは方法を構築することに成功した。本明細書にて、本発明者らが見出した粘膜型マスト細胞への分化誘導方法及び粘膜型マスト細胞の製造方法を述べる。 Although a method for stably and efficiently inducing mucosal mast cells to increase the ratio of mucosal mast cells per cell has not been known so far, the present inventors should construct a method. succeeded in. In the present specification, the method for inducing differentiation into mucosal mast cells and the method for producing mucosal mast cells found by the present inventors will be described.
粘膜型マスト細胞への分化誘導方法は、未成熟マスト細胞株とインターロイキン−１０とを、又は未成熟マスト細胞株とインターロイキン−１０及びインターロイキン−３とを接触させることにより、未成熟マスト細胞株から粘膜型マスト細胞への分化を誘導する工程を少なくとも含む方法である。粘膜型マスト細胞の製造方法は、未成熟マスト細胞株とインターロイキン−１０とを、又は未成熟マスト細胞株とインターロイキン−１０及びインターロイキン−３とを接触させることにより、粘膜型マスト細胞を得る工程を含む製造方法である。 The method for inducing differentiation into mucosal mast cells is to contact the immature mast cell line with interleukin-10 or the immature mast cell line with interleukin-10 and interleukin-3 to induce immature mast cells. It is a method that includes at least a step of inducing differentiation from a cell line into mucosal mast cells. The method for producing mucosal mast cells is to bring mucosal mast cells into contact with an immature mast cell line and interleukin-10, or by contacting an immature mast cell line with interleukin-10 and interleukin-3. It is a manufacturing method including a step of obtaining.
いずれの方法においても、ＩＬ−３及びＩＬ−１０は、それぞれ通常知られているとおりのサイトカインであれば特に限定されない。ＩＬ−３及びＩＬ−１０は、その入手方法について特に限定されないが、例えば、市販されているものを利用することやＴ細胞やＢ細胞などのＩＬ−３やＩＬ−１０を分泌する細胞から得た培養上清などを常法に従って分離精製することなどによって入手することできる。ＩＬ−３及びＩＬ−１０は、その由来生物種については特に限定されず、例えば、ヒト、マウス、ラット、ウシ、イヌ、ウマ、ネコ、ヒツジ、ブタなどの哺乳類が挙げられるが、高度な分化誘導活性が認められるために、マスト細胞と同一の由来生物種であることが好ましい。 In either method, IL-3 and IL-10 are not particularly limited as long as they are cytokines as are usually known. The method of obtaining IL-3 and IL-10 is not particularly limited, but for example, commercially available ones can be used or obtained from cells secreting IL-3 or IL-10 such as T cells and B cells. It can be obtained by separating and purifying the culture supernatant or the like according to a conventional method. The species of origin of IL-3 and IL-10 are not particularly limited, and examples thereof include mammals such as humans, mice, rats, cows, dogs, horses, cats, sheep, and pigs, but they are highly differentiated. Since the inducing activity is observed, it is preferable that the species is the same as the mast cell.
いずれの方法においても、未成熟マスト細胞株は、通常知られているとおりの骨髄その他の組織に由来するマスト細胞であれば特に限定されないが、例えば、異質性があり、かつ、表現型が粘膜型マスト細胞だけではなく、結合組織型マスト細胞にもなり得るマスト細胞株であることが好ましい。未成熟マスト細胞株は、マスト細胞が特異的に発現するタンパク質を発現するものがより好ましく、ＦｃεＲＩα及びｃ−Ｋｉｔからなる群から選ばれるタンパク質を発現するものがさらに好ましく、ＦｃεＲＩα及びｃ−Ｋｉｔの両方を発現するものがなおさらに好ましい。また、前記未成熟マスト細胞株は、ＦｃεＲＩα及びｃ−Ｋｉｔを発現し、かつ、ＭＭＣＰ−１、ＭＭＣＰ−２、ＭＭＣＰ−３、ＭＭＣＰ−４、ＭＭＣＰ−５、ＭＭＣＰ−６及びカルボキシペプチダーゼＡを実質的に発現しない未成熟マスト細胞株であることが好ましい。 In either method, the immature mast cell line is not particularly limited as long as it is a mast cell derived from bone marrow or other tissues as is usually known, but for example, it is heterologous and the phenotype is mucosal. It is preferable that the mast cell line can be not only a type mast cell but also a connective tissue type mast cell. The immature mast cell line is more preferably one that expresses a protein specifically expressed by mast cells, further preferably one that expresses a protein selected from the group consisting of FcεRIα and c-Kit, and of FcεRIα and c-Kit. Those expressing both are even more preferable. In addition, the immature mast cell line expresses FcεRIα and c-Kit, and substantially MMCP-1, MMCP-2, MMCP-3, MMCP-4, MMCP-5, MMCP-6 and carboxypeptidase A. It is preferably an immature mast cell line that is not specifically expressed.
未成熟マスト細胞株は、粘膜型マスト細胞が発現する少なくともいずれか１種のタンパク質の発現が陰性であると評価することによって、粘膜型マスト細胞と区別し得る。例えば、マウスにおいては、未成熟マスト細胞株は、粘膜型マスト細胞が発現するキマーゼの１種であるＭＭＣＰ（Ｍｏｕｓｅ Ｍａｓｔ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｔｅａｓｅ）−１の発現については陰性と評価される。したがって、粘膜型マスト細胞への分化誘導方法は、例えば、マウスの系においては、ＭＭＣＰ−１陰性であると評価される未成熟マスト細胞株からＭＭＣＰ−１陽性であると評価される粘膜型マスト細胞への分化を誘導する工程を少なくとも含む方法と表すことができる。 Immature mast cell lines can be distinguished from mucosal mast cells by assessing negative expression of at least one protein expressed by mucosal mast cells. For example, in mice, immature mast cell lines are evaluated as negative for the expression of MMCP (Mouse Mast Cell Protease) -1, which is one of the chymase expressed by mucosal mast cells. Therefore, the method for inducing differentiation into mucosal mast cells is, for example, in a mouse system, a mucosal mast that is evaluated as MMCP-1 positive from an immature mast cell line that is evaluated as MMCP-1 negative. It can be described as a method that includes at least a step of inducing differentiation into cells.
未成熟マスト細胞株は、その入手方法については特に限定されず、例えば、TC Moon, et al（MucosalImmunology, Vol. 3, No. 2, (2010), pp.111-128）に記載されているとおりに、ＩＬ−３の存在下又は非存在下で、骨髄中のマスト細胞前駆体やその他の組織に存在するマスト細胞を株化することにより、取得することができる。未成熟マスト細胞株の具体例としては、マウスの肝臓に由来するマスト細胞株であるＭＣ／９細胞などが挙げられるが、これに限定されない。 The method of obtaining the immature mast cell line is not particularly limited, and is described in, for example, TC Moon, et al (Mucosal Immunology, Vol. 3, No. 2, (2010), pp.111-128). As described above, it can be obtained by straining mast cells present in mast cell precursors and other tissues in bone marrow in the presence or absence of IL-3. Specific examples of the immature mast cell line include, but are not limited to, MC / 9 cells, which are mast cell lines derived from mouse liver.
粘膜型マスト細胞への分化誘導方法及び粘膜型マスト細胞の製造方法では、ＩＬ−１０と、又はＩＬ−１０及びＩＬ−３と未成熟マスト細胞株とを接触させることを含む。いずれの方法においても、これらサイトカインと未成熟マスト細胞株とを接触させる条件は特に限定されず、例えば、ＩＬ−１０及びＩＬ−３が失活せず、かつ、未成熟マスト細胞株が死滅しないような条件を挙げることができ、未成熟マスト細胞株の維持又は増殖に適した培地、温度、ＣＯ２濃度、ｐＨなどの培養条件であることが好ましい。 The method for inducing differentiation into mucosal mast cells and the method for producing mucosal mast cells include contacting IL-10 or IL-10 and IL-3 with an immature mast cell line. In either method, the conditions for contacting these cytokines with the immature mast cell line are not particularly limited, and for example, IL-10 and IL-3 are not inactivated and the immature mast cell line is not killed. Such conditions can be mentioned, and it is preferable that the culture conditions are suitable for the maintenance or proliferation of the immature mast cell line , such as medium, temperature, CO 2 concentration, and pH.
未成熟マスト細胞株の細胞数並びにＩＬ−１０及びＩＬ−３の添加量は特に限定されない。未成熟マスト細胞株の細胞数は、例えば、通常ｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞培養する際に用いられる細胞数が挙げられ、培養容器の材質や形状によって適宜設定することができるが、より具体的には１０３〜１０８ｃｅｌｌｓ／ｍｌ程度であり、１０４〜１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌであることが好ましい。ＩＬ−１０及びＩＬ−３の添加量は、例えば、通常細胞に対して活性を示し得るとされている範囲の量が挙げられ、未成熟マスト細胞株の細胞数によって適宜設定することができるが、より具体的には０．１ｎｇ／ｍｌ〜５，０００ｎｇ／ｍｌであり、１〜１，０００ｎｇ／ｍｌであることが好ましく、１０〜３００ｎｇ／ｍｌであることがより好ましく、２０〜２００ｎｇ／ｍｌであることがさらに好ましい。 The number of cells in the immature mast cell line and the amount of IL-10 and IL-3 added are not particularly limited. The number of cells in the immature mast cell line includes, for example, the number of cells normally used for cell culture in vitro, and can be appropriately set depending on the material and shape of the culture vessel, but more specifically, 10 It is about 3 to 10 8 cells / ml, and preferably 10 4 to 6 cells / ml. The amount of IL-10 and IL-3 added is, for example, an amount in the range in which activity can be exhibited with respect to normal cells, and can be appropriately set depending on the number of cells in the immature mast cell line. More specifically, it is 0.1 ng / ml to 5,000 ng / ml, preferably 1 to 1,000 ng / ml, more preferably 10 to 300 ng / ml, and 20 to 200 ng / ml. Is more preferable.
ＩＬ−３を用いる場合、ＩＬ−３の使用方法については特に限定されず、例えば、未成熟マスト細胞株とＩＬ−１０とを接触させるときと同時に、又はそのときに前後して、未成熟マスト細胞株と接触させる方法が挙げられるが、ＩＬ−３はＩＬ−１０と同時に未成熟マスト細胞株に接触させることが好ましい。 When IL-3 is used, the method of using IL-3 is not particularly limited, and for example, the immature mast cell line is brought into contact with the IL-10 at the same time, or before or after that time. Although a method of contacting with a cell line can be mentioned, it is preferable that IL-3 is brought into contact with an immature mast cell line at the same time as IL-10.
未成熟マスト細胞株とＩＬ−１０及びＩＬ−３といったサイトカインとの接触時間は特に限定されず、例えば、粘膜型マスト細胞の存在が確認できる時間などが挙げられるが、未成熟マスト細胞株の培養時間に相当する２〜４日間程度が好ましい。その他の接触条件は、通常の細胞培養に適した条件であれば特に限定されないが、静置培養であることが好ましい。 The contact time between the immature mast cell line and cytokines such as IL-10 and IL-3 is not particularly limited, and examples thereof include a time during which the presence of mucosal mast cells can be confirmed. It is preferably about 2 to 4 days, which corresponds to the time. Other contact conditions are not particularly limited as long as they are suitable for normal cell culture, but static culture is preferable.
未成熟マスト細胞株とＩＬ−１０及びＩＬ−３といったサイトカインとを接触させる際に、他の成分が系内に存在していてもよい。他の成分は、サイトカインが失活せず、かつ、未成熟マスト細胞株が死滅しないような成分であれば特に限定されないが、例えば、通常細胞培養に用いる成分が挙げられ、より具体的には２−メルカプトエタノールなどの還元剤、血清やＬ−グルタミンなどの細胞増殖に適した栄養成分、ペニシリンやストレプトマイシンなどの抗生物質、ＩＬ−２といったサイトカインなどの生理活性物質などが挙げられる。他の成分の使用量は、本発明の目的を達成し得る範囲内において、適宜設定することができる。 Other components may be present in the system upon contact of the immature mast cell line with cytokines such as IL-10 and IL-3. The other components are not particularly limited as long as they do not inactivate cytokines and do not kill immature mast cell lines, but examples thereof include components normally used for cell culture, and more specifically. Examples thereof include reducing agents such as 2-mercaptoethanol, nutritional components suitable for cell growth such as serum and L-glutamine, antibiotics such as penicillin and streptomycin, and physiologically active substances such as cytokines such as IL-2. The amount of other components used can be appropriately set within a range in which the object of the present invention can be achieved.
未成熟マスト細胞株とＩＬ−１０及びＩＬ−３といったサイトカインとを接触させることにより、未成熟マスト細胞株から粘膜型マスト細胞を分化誘導できる。粘膜型マスト細胞への分化誘導作用は、未成熟マスト細胞株から粘膜型マスト細胞への分化を誘導する作用であって、結果として粘膜型マスト細胞の割合を高め得る作用であれば、その作用機序や合わせて伴う他の作用などについては特に限定されない。 By contacting the immature mast cell line with cytokines such as IL-10 and IL-3, mucosal mast cells can be induced to differentiate from the immature mast cell line. The action of inducing differentiation into mucosal mast cells is an action of inducing differentiation of immature mast cell lines into mucosal mast cells, and if the action can increase the proportion of mucosal mast cells as a result, the action. The mechanism and other actions associated with it are not particularly limited.
粘膜型マスト細胞への分化誘導は、その評価方法について特に限定されず、例えば、粘膜型マスト細胞が特異的に発現する遺伝子の発現量を測定すること、粘膜型マスト細胞が細胞内外に発現するマーカー分子（タンパク質）を測定すること、粘膜型マスト細胞の数や割合を測定することなどにより評価することができる。例えば、粘膜型マスト細胞が細胞内に特異的に発現するタンパク質について、標識化抗体を用いて細胞内標識をし、次いで標識した細胞の数及び割合を測定することにより評価することができる。 The induction of differentiation into mucosal mast cells is not particularly limited in the evaluation method. For example, the expression level of a gene specifically expressed by mucosal mast cells is measured, and mucosal mast cells are expressed inside and outside the cells. It can be evaluated by measuring a marker molecule (protein), measuring the number and ratio of mucosal mast cells, and the like. For example, a protein that is specifically expressed intracellularly in mucosal mast cells can be evaluated by intracellularly labeling with a labeled antibody and then measuring the number and proportion of labeled cells.
粘膜型マスト細胞が細胞内に特異的に発現するタンパク質は、例えば、マウスの系ではＭＭＣＰ−１及びＭＭＣＰ−２などが挙げられる。 Examples of proteins that mucosal mast cells specifically express in cells include MMCP-1 and MMCP-2 in mouse systems.
粘膜型マスト細胞への分化誘導方法の具体的な一態様として、例えば、未成熟マスト細胞株とＩＬ−１０とを、又はＩＬ−１０及びＩＬ−３とを共培養し、次いで培養した細胞の量及び割合（ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）並びに細胞内標識又は細胞外標識した粘膜型マスト細胞のｐｏｐｕｌａｔｉｏｎを測定することを含む方法である。粘膜型マスト細胞のｐｏｐｕｌａｔｉｏｎは、例えば、フローサイトメトリーなどの方法、ＥＬＩＳＡやラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）などの抗原抗体反応を利用する方法などにより測定することができるが、特に限定されない。 As a specific embodiment of the method for inducing differentiation into mucosal mast cells, for example, immature mast cell lines and IL-10, or IL-10 and IL-3 are co-cultured, and then the cultured cells are used. A method comprising measuring the amount and proportion (population) and the populationation of intracellular or extracellularly labeled mucosal mast cells. Population of mucosal mast cells can be measured by, for example, a method such as flow cytometry, a method utilizing an antigen-antibody reaction such as ELISA or radioimmunoassay (RIA), but is not particularly limited.
粘膜型マスト細胞への分化誘導方法の別の具体的な一態様として、例えば、未成熟マスト細胞株とＩＬ−１０とを、又はＩＬ−１０及びＩＬ−３とを共培養し、次いで培養後に回収した細胞からＲＮＡを抽出し、次いで抽出したＲＮＡを逆転写してｃＤＮＡライブラリーを得て、次いで得られたｃＤＮＡライブラリーを基に粘膜型マスト細胞が特異的に発現する遺伝子の発現量を測定することを含む方法が挙げられる。 As another specific embodiment of the method for inducing differentiation into mucosal mast cells, for example, immature mast cell lines and IL-10, or IL-10 and IL-3 are co-cultured, and then after culturing. RNA is extracted from the collected cells, then the extracted RNA is reverse transcribed to obtain a cDNA library, and then the expression level of genes specifically expressed by mucosal mast cells is measured based on the obtained cDNA library. There are methods that include doing.
粘膜型マスト細胞への分化誘導方法を応用した方法の一つとしては、本発明の別の一態様である、未成熟マスト細胞株とＩＬ−１０とを、又はＩＬ−１０及びＩＬ−３とを接触させることにより、粘膜型マスト細胞を得る工程を少なくとも含む、粘膜型マスト細胞の製造方法が挙げられる。 As one of the methods to which the method for inducing differentiation into mucosal mast cells is applied, an immature mast cell line and IL-10, or IL-10 and IL-3, which are another aspect of the present invention, are used. A method for producing mucosal mast cells, which comprises at least a step of obtaining mucosal mast cells by contacting the cells.
粘膜型マスト細胞の製造方法により製造される粘膜型マスト細胞は、ｉｎ ｖｉｖｏ又はｅｘ ｖｉｖｏでの使用が考えられる。例えば、製造された粘膜型マスト細胞を被験体の粘膜組織に適用することにより、被験体の寄生虫感染防御やその他の粘膜感染症の症状を改善、緩和、抑制、治療又は予防することが期待できる。 The mucosal mast cells produced by the method for producing mucosal mast cells are considered to be used in vivo or ex vivo. For example, by applying the produced mucosal mast cells to the mucosal tissue of the subject, it is expected to improve, alleviate, suppress, treat or prevent the subject's parasite infection protection and other symptoms of mucosal infection. it can.
本発明の一態様である方法では、本発明の目的を達成し得る限り、上記した工程の前段若しくは後段又は工程中に、種々の工程や操作を加入することができる。また、工程内及び工程間は、連続的又は断続的に実施することができる。 In the method according to one aspect of the present invention, various steps and operations can be added to the pre-stage or the post-stage or the process of the above-mentioned steps as long as the object of the present invention can be achieved. In addition, it can be carried out continuously or intermittently within and between steps.
以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではなく、本発明の課題を解決し得る限り、本発明は種々の態様をとることができる。 Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples, but the present invention is not limited to these Examples, and the present invention can take various aspects as long as the problems of the present invention can be solved. ..
［実施例１］
マウスマスト細胞株であるＭＣ／９細胞を用いて、粘膜型マスト細胞（ＭＭＣＰ−１陽性細胞）を以下のとおりに誘導した。
[Example 1]
Mucosal mast cells (MMCP-1-positive cells) were induced as follows using MC / 9 cells, which are mouse mast cell lines.
マウスの粘膜型マスト細胞は、マスト細胞の表面マーカー分子であるＦｃεＲＩα及びｃ−Ｋｉｔを発現すると同時に、細胞内にＭＭＣＰ−１というプロテアーゼを発現する。マウスマスト細胞株であるＭＣ／９細胞は、ＦｃεＲＩα及びｃ−Ｋｉｔを発現しているが、粘膜型のマーカーであるＭＭＣＰ−１を発現していない。そこで、ＭＣ／９細胞を粘膜型へ分化させることを目的に、下記の実験を実施した。 Mast cell mucosa of mice expresses FcεRIα and c-Kit, which are surface marker molecules of mast cells, and at the same time, expresses a protease called MMCP-1 in the cells. MC / 9 cells, which are mouse mast cell lines, express FcεRIα and c-Kit, but do not express the mucosal marker MMCP-1. Therefore, the following experiment was carried out for the purpose of differentiating MC / 9 cells into the mucosal type.
１．細胞培養のための培地の調製
ＳＩＧＭＡ社製Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ培地に、下記の終濃度になるように試薬を添加して、培地を調製した。
１０％（ｗ／ｖ） ＦＢＳ
１％（ｗ／ｖ） Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎｅ／Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ
２ｍＭ Ｌ−ｇｌｕｔａｍｉｎｅ
０．０５ｍＭ ２−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ
１０％（ｗ／ｖ） Ｒａｔ Ｔ−ＳＴＩＭ（日本ベクトン・ディッキンソン社製）
1. 1. Preparation of medium for cell culture A reagent was added to Dulvecco's Modified Eagle's medium manufactured by SIGMA so as to have the following final concentration to prepare a medium.
10% (w / v) FBS
1% (w / v) Penicillline / Streptomycin
2 mM L-glutamine
0.05 mM 2-mercaptoethanol
10% (w / v) Rat T-STIM (manufactured by Becton Dickinson, Japan)
２．ＭＣ／９細胞懸濁液の調製
ＭＣ／９（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−８３０６）凍結ストックを培地に添加し、週に２回程度培地を交換しながら培養した。５継代（Ｐ５）の時点で３×１０６ ｃｅｌｌｓ／ｍＬのワーキングストックを作成した。ワーキングストックを培地に添加し、培養後週に２回程度で継代しながら培養することにより、Ｐ９以降の細胞を回収した。回収した細胞について、培地で１回洗浄した後、トリパンブルー（Ｇｉｂｃｏ社製）で懸濁し血球計算板を用いて細胞数を計測した。その後、２×１０６ ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるように培地に懸濁することにより、ＭＣ／９細胞懸濁液を調製した。
2. Preparation of MC / 9 cell suspension MC / 9 (ATCC CRL-8306) frozen stock was added to the medium, and the cells were cultured while changing the medium about twice a week. At the time of 5 passages (P5), a working stock of 3 × 10 6 cells / mL was prepared. The working stock was added to the medium, and the cells after P9 were collected by culturing while subculturing about twice a week after culturing. The collected cells were washed once with a medium, suspended in trypan blue (manufactured by Gibco), and the number of cells was counted using a hemocytometer. The MC / 9 cell suspension was then prepared by suspending in medium to 2 × 10 6 cells / mL.
３．サイトカイン溶液の調製
ｍｏｕｓｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ＩＬ−３（１００μＭ；ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）及びｍｏｕｓｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ＩＬ−１０（１００μＭ；ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）を、それぞれ１２０ｎｇ／ｍｌとなるように培地で希釈して、ＩＬ−３溶液及びＩＬ−１０溶液を調製した。
3. 3. Preparation of Cytokine Solution Mouse recombinant protein IL-3 (100 μM; manufactured by eBioscience) and mouse recombinant protein IL-10 (100 μM; manufactured by eBioscience) are diluted with a medium to 120 ng / ml, respectively, to a concentration of 120 ng / ml. A solution and an IL-10 solution were prepared.
４．抗ＩＬ−１０受容体抗体（αＩＬ−１０Ｒ抗体）溶液の調製
Ｐｕｒｉｆｉｅｄ ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ ＣＤ２１０（ＩＬ−１０Ｒ） Ａｎｔｉｂｏｄｙ（５００μＭ；Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）を、それぞれ１２、１２０及び１２００ｎｇ／ｍｌとなるように培地で希釈することにより、αＩＬ−１０Ｒ抗体を調製した。
4. Preparation of anti-IL-10 receptor antibody (αIL-10R antibody) solution Purified anti-mouse CD210 (IL-10R) Antibody (500 μM; manufactured by BioLegend) in a medium at 12, 120 and 1200 ng / ml, respectively. The αIL-10R antibody was prepared by dilution.
５．培養方法
表１の例１〜１０が示すとおりに、９６ウェル平底プレート（ＢＤ ＦＡＬＣＯＮ社製）の各ウェルに、内容物が所定の最終濃度になるように上記溶液及び培地を添加して、３日間培養した。ただし、上記培地として、Ｒａｔ Ｔ−ＳＴＩＭを含有しない培地を用いた。
5. Culturing method As shown in Examples 1 to 10 of Table 1, the above solution and medium were added to each well of a 96-well flat bottom plate (manufactured by BD FALCON) so that the contents had a predetermined final concentration, and 3 Incubated for days. However, as the above medium, a medium containing no Rat T-STIM was used.
６．細胞数計測のためのＦＡＣＳＡｒｉａ解析
培養後に回収した細胞を、１×ＰＢＳ／２％ＦＢＳで２回洗浄した後、Ｆｃブロック（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）と反応させた。次いで、反応後の細胞を、ＰＥ標識ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ ＦｃεＲＩα（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）及びＰＥ／ｃｙ７標識ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ ＣＤ１１７（ｃ−Ｋｉｔ）（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）と反応させた。次いで、反応後の細胞を、１×ＰＢＳで１回洗浄した後、Ｆｉｘａｂｌｅ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ｄｙｅ ｅＦｌｕｏｒ ４５０（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）と反応させた。
6. FACSAria analysis for cell numbering The cells collected after culturing were washed twice with 1 × PBS / 2% FBS and then reacted with Fc block (manufactured by BD Bioscience). The cells after the reaction were then reacted with PE-labeled anti-mouse FcεRIα (manufactured by BioLegend) and PE / cy7-labeled anti-mouse CD117 (c-Kit) (manufactured by BioLegend). Then, the cells after the reaction were washed once with 1 × PBS and then reacted with Fixable Viability Dye eFluor 450 (manufactured by eBioscience).
次いで、反応後の細胞を、１×ＰＢＳ／２％ＦＢＳで１回洗浄した後、ＩＣバッファー（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）を用いて固定化した。次いで、固定化した細胞を、Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎバッファー（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）を用いて洗浄した後、Ａｌｅｘａ６４７標識抗ＭＭＣＰ−１抗体（ｐｕｒｉｆｉｅｄ ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ ＭＣＰＴ−１（ｍＭＣＰ−１）（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）をＡｌｅｘａＦｌｏｕｒ６４７ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ（ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）にて標識したもの）と反応させ細胞内標識を行った。次いで、標識した細胞を、１×ＰＢＳ／２％ＦＢＳで洗浄し、さらに同バッファー２００μＬに懸濁した後、ＦＡＣＳＡｒｉａを用いて解析した。解析の際、特定量のＢＤ ＦＡＣＳＴＭ Ａｃｃｕｄｒｏｐ Ｂｅａｄｓ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）を既知体積のサンプルに加え、細胞とともにビーズを計測した。ビーズ量とビーズの取り込み数、生細胞の取り込み数から全細胞数を算出した。さらに全細胞数とＭＭＣＰ−１陽性細胞の割合とから、ＭＭＣＰ−１陽性細胞数を算出した。 Then, the cells after the reaction were washed once with 1 × PBS / 2% FBS and then immobilized with an IC buffer (manufactured by eBioscience). Then, the immobilized cells were washed with a Permeabilization buffer (manufactured by eBioscience), and then Alexa647-labeled anti-MMCP-1 antibody (purified anti-mouse MCPT-1 (mMCP-1) (manufactured by eBioscience) was added to AlexaFlour647Ant. Intracellular labeling was performed by reacting with a Labeling Kit (labeled by life technology). The labeled cells were then washed with 1 × PBS / 2% FBS, suspended in 200 μL of the same buffer, and then analyzed using FACSAria. During the analysis, a specific amount of BD FACS TM Accudrop Beads (manufactured by BD Bioscience) was added to a sample of known volume and beads were measured along with the cells. The total number of cells was calculated from the amount of beads, the number of beads taken up, and the number of live cells taken up. Furthermore, the number of MMCP-1 positive cells was calculated from the total number of cells and the ratio of MMCP-1 positive cells.
７．細胞数解析結果
ＦＡＣＳＡｒｉａ解析の結果について、例１〜７の結果をまとめたものを図１に示し、例２、例６及び例８〜１０の結果をまとめたものを図２に示す。
7. Cell Number Analysis Results Regarding the results of FACSAria analysis, the results of Examples 1 to 7 are summarized in FIG. 1, and the results of Examples 2, 6 and 8 to 10 are summarized in FIG.
（１）例１〜７の結果（図１Ａ〜Ｃ）
図１Ａが示すとおり、ＩＬ−３添加条件と比較して、ＩＬ−１０添加条件では、ＭＭＣＰ−１陽性細胞の割合の顕著な増加が見られた。また、図１Ｂが示すとおり、ＭＭＣＰ−１陽性細胞数についても、これらの比較から、ＩＬ−１０を添加することにより増加傾向を示すことがわかった。
(1) Results of Examples 1 to 7 (FIGS. 1A to 1C)
As shown in FIG. 1A, a significant increase in the proportion of MMCP-1-positive cells was observed under the IL-10 addition condition as compared with the IL-3 addition condition. Further, as shown in FIG. 1B, it was found from these comparisons that the number of MMCP-1 positive cells also showed an increasing tendency by adding IL-10.
総細胞数については、図１Ｃが示すとおり、サイトカイン非添加条件においては、十分な細胞の増殖が見られなかった。また、ＩＬ−３及びＩＬ−１０を独立して添加した際には、それぞれ細胞数が増加することが確認されたが、これらの間の増加の程度については、大きな差異はなかった。 As for the total number of cells, as shown in FIG. 1C, sufficient cell proliferation was not observed under the cytokine-free condition. In addition, it was confirmed that the number of cells increased when IL-3 and IL-10 were added independently, but there was no significant difference in the degree of increase between them.
ＩＬ−３添加条件とＩＬ−１０添加条件との比較から、ＭＭＣＰ−１陽性細胞はＩＬ−１０依存的に分化誘導することが確認された。 From the comparison between the IL-3 addition condition and the IL-10 addition condition, it was confirmed that the MMCP-1-positive cells induce differentiation in an IL-10-dependent manner.
一方、ＩＬ−３とＩＬ−１０とを同時に添加した条件下においては、ＭＭＣＰ−１陽性細胞の割合が増加することが確認された（図１Ａを参照）。しかし、その増加の程度は、ＩＬ−１０を単独で添加した条件と比較して、顕著に大きいというものではなかった。一方、ＭＭＣＰ−１陽性細胞数及び総細胞数については、ＩＬ−３添加条件及びＩＬ−１０添加条件と比べて、相乗的に顕著に増加することが確認された（図１Ｂ及び図１Ｃを参照）。 On the other hand, it was confirmed that the proportion of MMCP-1-positive cells increased under the condition that IL-3 and IL-10 were added at the same time (see FIG. 1A). However, the degree of the increase was not remarkably large as compared with the condition in which IL-10 was added alone. On the other hand, it was confirmed that the number of MMCP-1 positive cells and the total number of cells were synergistically and significantly increased as compared with the IL-3 addition condition and the IL-10 addition condition (see FIGS. 1B and 1C). ).
図１の結果より、ＩＬ−１０は濃度依存的にＭＣ／９細胞からＭＭＣＰ−１陽性細胞を分化誘導する作用があることが確認された。 From the results shown in FIG. 1, it was confirmed that IL-10 has an action of inducing differentiation of MMCP-1-positive cells from MC / 9 cells in a concentration-dependent manner.
（２）例２、例６及び例８〜１０の結果（図２Ａ〜Ｃ）
抗ＩＬ−１０受容体抗体を添加することでマスト細胞が発現するＩＬ−１０受容体をブロックし、ＩＬ−１０シグナルを阻害することにより、ＭＭＣＰ−１陽性細胞の誘導がどのような影響を受けるかについて評価した。
(2) Results of Examples 2, 6 and 8 to 10 (FIGS. 2A to 2C)
How is the induction of MMCP-1-positive cells affected by blocking the IL-10 receptor expressed by mast cells by adding an anti-IL-10 receptor antibody and inhibiting the IL-10 signal? Was evaluated.
図２Ａ及び図２Ｂに示すとおり、ＩＬ−３添加条件及びＩＬ−１０添加条件と比較して、抗ＩＬ−１０受容体（ａＩＬ−１０Ｒ）抗体を添加する条件では、濃度依存的なＭＭＣＰ−１陽性細胞の割合及び数の顕著な減少が確認された。しかし、図２Ｃが示すとおり、全細胞数は、抗ＩＬ−１０受容体抗体を添加することにより若干減少したものの、その程度はＭＭＣＰ−１陽性細胞の割合の減少の程度と比較すると非常に小さかった。すなわち、抗ＩＬ−１０受容体抗体を添加することにより、総細胞数に与える影響は小さいながらも、ＭＭＣＰ−１陽性細胞の数及び割合を格別顕著に減少した。 As shown in FIGS. 2A and 2B, the concentration-dependent MMCP-1 under the condition of adding the anti-IL-10 receptor (aIL-10R) antibody as compared with the condition of adding IL-3 and the condition of adding IL-10. A significant decrease in the proportion and number of positive cells was confirmed. However, as shown in FIG. 2C, although the total cell number was slightly reduced by the addition of the anti-IL-10 receptor antibody, the degree was very small compared to the degree of reduction in the proportion of MMCP-1-positive cells. It was. That is, the addition of the anti-IL-10 receptor antibody significantly reduced the number and proportion of MMCP-1-positive cells, although the effect on the total number of cells was small.
図２の結果より、ＩＬ−１０はＭＣ／９細胞からＭＭＣＰ−１陽性細胞を分化誘導する作用があることが確認されたとともに、ＩＬ−１０とＩＬ−１０受容体との結合を阻害することにより、ＭＭＣＰ−１陽性細胞の割合及び数を減じることができることがわかった。 From the results of FIG. 2, it was confirmed that IL-10 has an effect of inducing differentiation of MMCP-1-positive cells from MC / 9 cells, and also inhibits the binding between IL-10 and the IL-10 receptor. It was found that the proportion and number of MMCP-1-positive cells can be reduced.
［実施例２］
しょうゆが粘膜型マスト細胞の分化を抑制する効果を有することについて、複数の市販しょうゆ及びモデルしょうゆを用いて、以下のとおりに評価した。
[Example 2]
The effect of soy sauce on suppressing the differentiation of mucosal mast cells was evaluated as follows using a plurality of commercially available soy sauces and model soy sauces.
マウスの粘膜型マスト細胞は、マスト細胞の表面マーカー分子であるＦｃεＲＩα及びｃ−Ｋｉｔを発現すると同時に、細胞内にＭＭＣＰ−１というプロテアーゼを発現する。マウスマスト細胞株であるＭＣ／９は、ＦｃεＲＩα及びｃ−Ｋｉｔを発現しているが、粘膜型のマーカーであるＭＭＣＰ−１を発現していない。そこで、ＭＣ／９から粘膜型マスト細胞（ＭＭＣＰ−１陽性細胞）への分化を利用して、しょうゆによる分化抑制効果について、下記の実験を実施した。 Mast cell mucosa of mice expresses FcεRIα and c-Kit, which are surface marker molecules of mast cells, and at the same time, expresses a protease called MMCP-1 in the cells. The mouse mast cell line MC / 9 expresses FcεRIα and c-Kit, but does not express the mucosal marker MMCP-1. Therefore, the following experiment was carried out on the differentiation-suppressing effect of soy sauce using the differentiation of MC / 9 into mucosal mast cells (MMCP-1 positive cells).
１．細胞培養のための培地の調製
ＳＩＧＭＡ社製Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ培地に、下記の終濃度になるように試薬を添加して、培地を調製した。
１０％（ｗ／ｖ） ＦＢＳ
１％（ｗ／ｖ） Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎｅ／Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ
２ｍＭ Ｌ−ｇｌｕｔａｍｉｎｅ
０．０５ｍＭ ２−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ
１０％（ｗ／ｖ） Ｒａｔ Ｔ−ＳＴＩＭ（日本ベクトン・ディッキンソン社製）
1. 1. Preparation of medium for cell culture A reagent was added to Dulvecco's Modified Eagle's medium manufactured by SIGMA so as to have the following final concentration to prepare a medium.
10% (w / v) FBS
1% (w / v) Penicillline / Streptomycin
2 mM L-glutamine
0.05 mM 2-mercaptoethanol
10% (w / v) Rat T-STIM (manufactured by Becton Dickinson, Japan)
２．ＭＣ／９細胞懸濁液の調製
ＭＣ／９（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−８３０６）凍結ストックを培地に添加し、週に２回程度培地を交換しながら培養した。５継代（Ｐ５）の時点で３×１０６ ｃｅｌｌｓ／ｍＬのワーキングストックを作成した。ワーキングストックを培地に添加し、培養後週に２回程度で継代しながら培養することにより、Ｐ９以降の細胞を回収した。回収した細胞について、培地で１回洗浄した後、トリパンブルー（Ｇｉｂｃｏ社製）で懸濁し血球計算板を用いて細胞数を計測した。その後、２×１０６ ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるように培地に懸濁することにより、ＭＣ／９細胞懸濁液を調製した。
2. Preparation of MC / 9 cell suspension MC / 9 (ATCC CRL-8306) frozen stock was added to the medium, and the cells were cultured while changing the medium about twice a week. At the time of 5 passages (P5), a working stock of 3 × 10 6 cells / mL was prepared. The working stock was added to the medium, and the cells after P9 were collected by culturing while subculturing about twice a week after culturing. The collected cells were washed once with a medium, suspended in trypan blue (manufactured by Gibco), and the number of cells was counted using a hemocytometer. The MC / 9 cell suspension was then prepared by suspending in medium to 2 × 10 6 cells / mL.
３．サイトカイン溶液の調製
ｍｏｕｓｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ＩＬ−３（１００μＭ；ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）及びｍｏｕｓｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ＩＬ−１０（１００μＭ；ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）を、それぞれ１２０ｎｇ／ｍｌとなるように培地で希釈して、ＩＬ−３溶液及びＩＬ−１０溶液を調製した。
3. 3. Preparation of Cytokine Solution Mouse recombinant protein IL-3 (100 μM; manufactured by eBioscience) and mouse recombinant protein IL-10 (100 μM; manufactured by eBioscience) are diluted with a medium to 120 ng / ml, respectively, to a concentration of 120 ng / ml. A solution and an IL-10 solution were prepared.
４．被験しょうゆ試料の調製
被験しょうゆ試料として、下記の市販しょうゆ及びモデルしょうゆについて、しょうゆ原液の濃度を１として、培地を用いて６０倍、１２０倍、２４０倍、４８０倍又は９６０倍に希釈して試験に供した。
市販しょうゆ：こいくちしょうゆ、特選丸大豆しょうゆ、うすくちしょうゆ、たまりしょうゆ、脱塩しょうゆ（特選丸大豆しょうゆを脱塩処理したもの）（以上、すべてキッコーマン社製）
モデルしょうゆ：たまりしょうゆ（キッコーマン社製）に含まれる成分のうち、酸、食塩、アルコール及びアミノ酸を、たまりしょうゆに含まれる濃度で配合して調製したもの
4. Preparation of test soy sauce sample As a test soy sauce sample, the following commercially available soy sauce and model soy sauce are tested by diluting them 60 times, 120 times, 240 times, 480 times, or 960 times with a medium, with the concentration of the soy sauce stock solution set to 1. Served to.
Commercially available soy sauce: Koikuchi soy sauce, specially selected whole soy sauce, thin soy sauce, tamari soy sauce, desalted soy sauce (desalted specially selected whole soy sauce) (all manufactured by Kikkoman)
Model soy sauce: Of the ingredients contained in Tamari soy sauce (manufactured by Kikkoman), acid, salt, alcohol and amino acids are mixed and prepared at the concentration contained in Tamari soy sauce.
５．培養方法
表１及び表２の例１〜２８が示すとおりに、９６ウェル平底プレート（ＢＤ ＦＡＬＣＯＮ社製）の各ウェルに、内容物が所定の最終濃度になるように上記溶液及び培地を添加して、初発細胞数を１．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとして３日間培養した。ただし、上記培地として、Ｒａｔ Ｔ−ＳＴＩＭを含有しない培地を用いた。
5. Culturing Method As shown in Examples 1 to 28 of Table 1 and Table 2, the above solution and medium were added to each well of a 96-well flat bottom plate (manufactured by BD FALCON) so that the contents had a predetermined final concentration. Te, and cultured for 3 days the number of initial cells as 1.0 × 10 5 cells / well. However, as the above medium, a medium containing no Rat T-STIM was used.
６．細胞数計測のためのＦＡＣＳＡｒｉａ解析
培養後に回収した細胞を、１×ＰＢＳ／２％ＦＢＳで２回洗浄した後、Ｆｃブロック（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）と反応させた。次いで、反応後の細胞を、ＰＥ標識ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ ＦｃεＲＩα（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）及びＰＥ／ｃｙ７標識ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ ＣＤ１１７（ｃ−Ｋｉｔ）（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）と反応させた。次いで、反応後の細胞を、１×ＰＢＳで１回洗浄した後、Ｆｉｘａｂｌｅ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ｄｙｅ ｅＦｌｕｏｒ ４５０（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）と反応させた。
6. FACSAria analysis for cell numbering The cells collected after culturing were washed twice with 1 × PBS / 2% FBS and then reacted with Fc block (manufactured by BD Bioscience). The cells after the reaction were then reacted with PE-labeled anti-mouse FcεRIα (manufactured by BioLegend) and PE / cy7-labeled anti-mouse CD117 (c-Kit) (manufactured by BioLegend). Then, the cells after the reaction were washed once with 1 × PBS and then reacted with Fixable Viability Dye eFluor 450 (manufactured by eBioscience).
次いで、反応後の細胞を、１×ＰＢＳ／２％ＦＢＳで１回洗浄した後、ＩＣバッファー（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）を用いて固定化した。次いで、固定化した細胞を、Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎバッファー（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）を用いて洗浄した後、Ａｌｅｘａ６４７標識抗ＭＭＣＰ−１抗体（ｐｕｒｉｆｉｅｄ ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ ＭＣＰＴ−１（ｍＭＣＰ−１）（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）をＡｌｅｘａＦｌｏｕｒ６４７ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ（ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）にて標識したもの）と反応させ細胞内標識を行った。次いで、標識した細胞を、１×ＰＢＳ／２％ＦＢＳで洗浄し、さらに同バッファー２００μＬに懸濁した後、ＦＡＣＳＡｒｉａを用いて解析した。解析の際、特定量のＢＤ ＦＡＣＳＴＭ Ａｃｃｕｄｒｏｐ Ｂｅａｄｓ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）を既知体積のサンプルに加え、細胞とともにビーズを計測した。ビーズ量とビーズの取り込み数、生細胞の取り込み数から全細胞数を算出した。さらに全細胞数とＭＭＣＰ−１陽性細胞の割合とから、ＭＭＣＰ−１陽性細胞数を算出した。 Then, the cells after the reaction were washed once with 1 × PBS / 2% FBS and then immobilized with an IC buffer (manufactured by eBioscience). Then, the immobilized cells were washed with a Permeabilization buffer (manufactured by eBioscience), and then Alexa647-labeled anti-MMCP-1 antibody (purified anti-mouse MCPT-1 (mMCP-1) (manufactured by eBioscience) was added to AlexaFlour647Ant. Intracellular labeling was performed by reacting with a Labeling Kit (labeled by life technology). The labeled cells were then washed with 1 × PBS / 2% FBS, suspended in 200 μL of the same buffer, and then analyzed using FACSAria. During the analysis, a specific amount of BD FACS TM Accudrop Beads (manufactured by BD Bioscience) was added to a sample of known volume and beads were measured along with the cells. The total number of cells was calculated from the amount of beads, the number of beads taken up, and the number of live cells taken up. Furthermore, the number of MMCP-1 positive cells was calculated from the total number of cells and the ratio of MMCP-1 positive cells.
７．細胞数解析結果
ＦＡＣＳＡｒｉａ解析の結果について、表１に示す例１〜８の結果をまとめたものを図１に示し、表２に示す例９〜２８の結果をまとめたものを図２に示す。
7. Cell Number Analysis Results Regarding the results of FACSAria analysis, FIG. 1 shows a summary of the results of Examples 1 to 8 shown in Table 1, and FIG. 2 shows a summary of the results of Examples 9 to 28 shown in Table 2.
（１）例１〜８の結果（図１Ａ〜Ｃ）
図３Ａが示すとおり、ＩＬ−１０のみを添加した場合やＩＬ−３及びＩＬ−１０を添加した場合と比較して、脱塩しょうゆを添加した場合では、濃度依存的にＭＭＣＰ−１陽性細胞の割合が減少した。同様に、図３Ｂが示すとおり、ＭＭＣＰ−１陽性細胞数についても、濃度依存的にＭＭＣＰ−１陽性細胞数が減少する傾向にあることを確認した。一方で、図３Ｃが示すとおり、総細胞数については、このような傾向は見られなかった。
(1) Results of Examples 1 to 8 (FIGS. 1A to 1C)
As shown in FIG. 3A, when desalted soy sauce was added as compared with the case where only IL-10 was added or when IL-3 and IL-10 were added, the MMCP-1-positive cells were concentrated in a concentration-dependent manner. The proportion has decreased. Similarly, as shown in FIG. 3B, it was confirmed that the number of MMCP-1 positive cells also tended to decrease in a concentration-dependent manner. On the other hand, as shown in FIG. 3C, such a tendency was not observed in the total number of cells.
図３の結果より、しょうゆには、細胞の生存率については影響を与えずにして、濃度依存的にＭＣ／９細胞からのＭＭＣＰ−１陽性細胞への分化を抑制する作用があることが確認された。 From the results shown in FIG. 3, it was confirmed that soy sauce has an effect of suppressing the differentiation of MC / 9 cells into MMCP-1-positive cells in a concentration-dependent manner without affecting the cell viability. Was done.
（２）例９〜２８の結果（図２）
図４に示すとおり、サイトカインのみを添加した場合と比較して、サイトカインに加えて、脱塩しょうゆ、こいくちしょうゆ、たまりしょうゆ、特選丸大豆しょうゆ又はうすくちしょうゆを加えた場合は、ＭＭＣＰ−１陽性細胞の割合が減少した。しかし、しょうゆを製造する際の発酵工程によって主として得られるペプチドやタンパク質を含まないモデルしょうゆでは、ＭＭＣＰ−１陽性細胞の割合の減少はみられなかった。
(2) Results of Examples 9 to 28 (Fig. 2)
As shown in FIG. 4, compared with the case where only cytokines are added, when desalted soy sauce, koikuchi soy sauce, tamari soy sauce, specially selected whole soy sauce or light soy sauce is added, MMCP-1 The proportion of positive cells decreased. However, the proportion of MMCP-1-positive cells was not reduced in the model soy sauce containing no peptide or protein, which was mainly obtained by the fermentation process in the production of soy sauce.
図４の結果より、しょうゆのような発酵食品は、ＭＣ／９細胞からのＭＭＣＰ−１陽性細胞への分化を抑制する作用があることが確認された。 From the results shown in FIG. 4, it was confirmed that fermented foods such as soy sauce have an effect of suppressing the differentiation of MC / 9 cells into MMCP-1-positive cells.
本発明の一態様の組成物は、未成熟マスト細胞から粘膜型マスト細胞への分化を抑制する作用及び抗アレルギー作用を通じて、健常者に加えて、粘膜型マスト細胞の割合の増加に関連した疾患や症状を改善、緩和、抑制、治療又は予防することを期待する摂取者にとって有用なものであり、このような摂取者の健康及び福祉に資するものとして利用可能なものである。また、本明細書で開示される方法は、未成熟マスト細胞株を安定的に粘膜型マスト細胞へ誘導することができることから、粘膜型マスト細胞の割合を高める目的や、粘膜型マスト細胞の機序を評価する目的において利用可能である。 The composition of one aspect of the present invention is a disease associated with an increase in the proportion of mucosal mast cells in addition to healthy subjects through an action of suppressing the differentiation of immature mast cells into mucosal mast cells and an antiallergic action. It is useful for ingestors who expect to improve, alleviate, suppress, treat or prevent mast cells and symptoms, and can be used as a contribution to the health and welfare of such ingestors. In addition, the method disclosed herein can stably induce an immature mast cell line to mucosal mast cells, and therefore has the purpose of increasing the proportion of mucosal mast cells and the mechanism of mucosal mast cells. It can be used for the purpose of evaluating the introduction.
Claims (2)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2016227131A JP6842655B2 (en) | 2016-11-22 | 2016-11-22 | Composition for suppressing differentiation into mucosal mast cells |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2016227131A JP6842655B2 (en) | 2016-11-22 | 2016-11-22 | Composition for suppressing differentiation into mucosal mast cells |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2018083775A JP2018083775A (en) | 2018-05-31 |
| JP6842655B2 true JP6842655B2 (en) | 2021-03-17 |
Family
ID=62238024
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2016227131A Active JP6842655B2 (en) | 2016-11-22 | 2016-11-22 | Composition for suppressing differentiation into mucosal mast cells |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP6842655B2 (en) |
-
2016
- 2016-11-22 JP JP2016227131A patent/JP6842655B2/en active Active
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2018083775A (en) | 2018-05-31 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP3585487B1 (en) | Antiallergic composition | |
| Chalamaiah et al. | Immunomodulatory effects of protein hydrolysates from rohu (Labeo rohita) egg (roe) in BALB/c mice | |
| JP5227182B2 (en) | Use of beta-hydroxy-beta-methylbutyrate to regulate imbalances in type 1 and type 2 cytokine production | |
| JP2007254333A (en) | Microbial cell-containing composition having inflammation suppressive action | |
| JPWO2006093267A1 (en) | Fermentation composition having immunomodulatory action | |
| TWI784045B (en) | Composition for promoting generation of hyaluronic acid | |
| JP2009142266A (en) | New strain of lactobacillus | |
| JP2008245569A (en) | Lactobacillus composition having high antiallergic activity and method for producing this lactobacillus | |
| Wang et al. | An overview on marine anti-allergic active substances for alleviating food-induced allergy | |
| Kaushal et al. | Age-related decline in macrophage and lymphocyte functions in mice and its alleviation by treatment with probiotic Dahi containing Lactobacillus acidophilus and Bifidobacterium bifidum | |
| Otunola et al. | Choosing suitable food vehicles for functional food products | |
| KR101635268B1 (en) | Composition for immune boosting having viability and function of spleen cells comprising Fucoidane | |
| JP5550802B2 (en) | Composition containing melon extract having immunomodulating action | |
| JP6842655B2 (en) | Composition for suppressing differentiation into mucosal mast cells | |
| JP4656859B2 (en) | Oxidative stress inhibitor | |
| Hunter et al. | Feeding ZESPRI™ GOLD Kiwifruit puree to mice enhances serum immunoglobulins specific for ovalbumin and stimulates ovalbumin-specific mesenteric lymph node cell proliferation in response to orally administered ovalbumin | |
| Amaral et al. | Antigenic dietary protein guides maturation of the host immune system promoting resistance to Leishmania major infection in C57BL/6 mice | |
| JP6842656B2 (en) | Composition for suppressing differentiation into mucosal mast cells | |
| JPWO2020166708A1 (en) | New lactic acid bacteria and compositions containing them | |
| JP6999061B1 (en) | Immunostimulatory composition, cold-like symptom preventive agent, and virus infection preventive agent | |
| JP2022505483A (en) | Structural and functional properties of yeast-derived polysaccharides that induce TREG cells | |
| JP2019076039A (en) | Selenoneine-containing composition | |
| JP6815943B2 (en) | Composition for Inducing Foxp3-Positive T Cells and Method for Producing Foxp3-Positive T Cells | |
| US20230248782A1 (en) | Mitochondrial Function-Improving Composition | |
| JP6892079B2 (en) | Regulatory T cell inducers, adjuvants and food compositions |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20190802 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20200804 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20200824 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20201117 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20210106 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20210126 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20210204 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6842655 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |