JP6999061B1 - Immunostimulatory composition, cold-like symptom preventive agent, and virus infection preventive agent - Google Patents
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Abstract
【課題】本発明の課題は、良好な免疫賦活作用を有するエンテロコッカス・フェカリス菌含有組成物を提供することである。【解決手段】本発明は、エンテロコッカス・フェカリス菌であって、２０μｇ／ｍＬの前記エンテロコッカス・フェカリス菌と５×１０５個／ｍＬの骨髄細胞由来のプラズマサイトイド樹状細胞とを共培養することで５０ｐｇ／ｍＬ以上のＩＦＮ－αを産生する指標で表されるプラズマサイトイド樹状細胞の活性化能を有するエンテロコッカス・フェカリス菌を含む、免疫賦活用組成物を提供する。【選択図】なしPROBLEM TO BE SOLVED: To provide a composition containing Enterococcus faecalis having a good immunostimulatory action. The present invention is an Enterococcus faecalis bacterium, which is obtained by co-culturing 20 μg / mL of the Enterococcus faecalis bacterium and 5 × 105 cells / mL of plasmacytoid dendritic cells derived from bone marrow cells. Provided is an immunostimulatory composition comprising Enterococcus faecalis having the ability to activate plasmacytoid dendritic cells represented by an index that produces IFN-α of 50 pg / mL or more. [Selection diagram] None
Description
本発明は、免疫賦活用組成物、風邪様症状予防剤、及びウイルス感染予防剤に関する。 The present invention relates to an immunostimulatory composition, a cold-like symptom preventive agent, and a virus infection preventive agent.
動物の体内に備わる免疫力は、環境変化や各種ストレスにより低下し得る。免疫力の維持や向上のための方法として、免疫機構に作用する乳酸菌を摂取することが知られる。 The immunity of an animal can be reduced by environmental changes and various stresses. As a method for maintaining or improving immunity, it is known to ingest lactic acid bacteria that act on the immune system.
免疫機構に作用する乳酸菌として、エンテロコッカス属の乳酸菌、特にエンテロコッカス・フェカリス菌が挙げられる。
特許文献１及び２には、エンテロコッカス・フェカリスＥＣ－１２株がマウス由来のマクロファージ及びヒト由来の末梢血単核球を刺激し、インターロイキン－１２を産生することが記載されている。
特許文献３及び４には、エンテロコッカス・フェカリスＮＦ－１０１１株がマウスの脾臓細胞に作用し、インターフェロン－β及びインターフェロン－γの産生を増強することが記載されている。
特許文献５には、エンテロコッカス・フェカリス菌を、マウスのパイエル板細胞と共培養することで、培地上清のＩｇＡが増加したことが報告されている。
Examples of lactic acid bacteria that act on the immune system include lactic acid bacteria of the genus Enterococcus, particularly Enterococcus faecalis.
Patent Documents 1 and 2 describe that Enterococcus faecalis EC-12 stimulates mouse-derived macrophages and human-derived peripheral blood mononuclear cells to produce interleukin-12.
Patent Documents 3 and 4 describe that Enterococcus faecalis NF-1011 strain acts on mouse spleen cells to enhance the production of interferon-β and interferon-γ.
Patent Document 5 reports that IgA in the culture medium supernatant was increased by co-culturing Enterococcus faecalis with mouse Peyer's patch cells.
しかし、免疫機構への作用がより強い乳酸菌に対するニーズがある。 However, there is a need for lactic acid bacteria that have a stronger effect on the immune system.
本発明は以上の実情に鑑みてなされたものであり、良好な免疫賦活作用を有するエンテロコッカス・フェカリス菌含有組成物の提供を目的とする。 The present invention has been made in view of the above circumstances, and an object of the present invention is to provide a composition containing Enterococcus faecalis having a good immunostimulatory effect.
本発明者らが検討した結果、エンテロコッカス・フェカリス菌のうち一部の菌が、プラズマサイトイド樹状細胞を高度に活性化できること、及び、ＩＦＮ－αの産生量の高さがその活性化指標となることを新規に見出し、本発明を完成するに至った。より具体的には、本発明は以下を提供する。 As a result of the examination by the present inventors, the fact that some of Enterococcus faecalis can highly activate plasmacytoid dendritic cells and the high production amount of IFN-α are the activation indicators. We have newly found that this is the case, and have completed the present invention. More specifically, the present invention provides the following.
（１） エンテロコッカス・フェカリス菌であって、２０μｇ／ｍＬの前記エンテロコッカス・フェカリス菌と５×１０５個／ｍＬの骨髄細胞由来のプラズマサイトイド樹状細胞とを共培養することで５０ｐｇ／ｍＬ以上のＩＦＮ－αを産生する指標で表されるプラズマサイトイド樹状細胞の活性化能を有するエンテロコッカス・フェカリス菌を含む、免疫賦活用組成物。 (1) Enterococcus faecalis bacterium, 50 pg / mL or more by co-culturing 20 μg / mL of the Enterococcus faecalis bacterium and 5 × 10 5 cells / mL plasmacytoid dendritic cells derived from bone marrow cells. An immunostimulatory composition comprising Enterococcus faecalis having the ability to activate plasmacytoid dendritic cells represented by an index for producing IFN-α.
（２） 分泌型ＩｇＡの産生促進用である、（１）に記載の免疫賦活用組成物。 (2) The immunostimulatory composition according to (1), which is used for promoting the production of secretory IgA.
（３） エンテロコッカス・フェカリス菌であって、２０μｇ／ｍＬの前記エンテロコッカス・フェカリス菌と５×１０５個／ｍＬの骨髄細胞由来のプラズマサイトイド樹状細胞とを共培養することで５０ｐｇ／ｍＬ以上のＩＦＮ－αを産生する指標で表されるプラズマサイトイド樹状細胞の活性化能を有するエンテロコッカス・フェカリス菌を含む、風邪様症状予防剤。 (3) Enterococcus faecalis bacterium, 50 pg / mL or more by co-culturing 20 μg / mL of the Enterococcus faecalis bacterium and 5 × 10 5 cells / mL plasmacytoid dendritic cells derived from bone marrow cells. A cold-like symptom preventive agent containing Enterococcus faecalis having the ability to activate plasmacytoid dendritic cells represented by an index for producing IFN-α.
（４） エンテロコッカス・フェカリス菌であって、２０μｇ／ｍＬの前記エンテロコッカス・フェカリス菌と５×１０５個／ｍＬの骨髄細胞由来のプラズマサイトイド樹状細胞とを共培養することで５０ｐｇ／ｍＬ以上のＩＦＮ－αを産生する指標で表されるプラズマサイトイド樹状細胞の活性化能を有するエンテロコッカス・フェカリス菌を含む、ウイルス感染予防剤。 (4) Enterococcus faecalis bacterium, 50 pg / mL or more by co-culturing 20 μg / mL of the Enterococcus faecalis bacterium and 5 × 10 5 cells / mL plasmacytoid dendritic cells derived from bone marrow cells. A virus infection preventive agent containing Enterococcus faecalis having the ability to activate plasmacytoid dendritic cells represented by an index for producing IFN-α.
本発明によれば、良好な免疫賦活作用を有するエンテロコッカス・フェカリス菌含有組成物が提供される。 According to the present invention, there is provided an Enterococcus faecalis-containing composition having a good immunostimulatory effect.
以下、本発明の実施形態について説明するが、本発明はこれに限定されない。 Hereinafter, embodiments of the present invention will be described, but the present invention is not limited thereto.
＜免疫賦活用組成物＞
本発明の免疫賦活用組成物は、エンテロコッカス・フェカリス菌であって、２０μｇ／ｍＬの該エンテロコッカス・フェカリス菌と５×１０５個／ｍＬの骨髄細胞由来のプラズマサイトイド樹状細胞とを共培養することで５０ｐｇ／ｍＬ以上のＩＦＮ－αを産生する指標で表されるプラズマサイトイド樹状細胞の活性化能を有するエンテロコッカス・フェカリス菌を含む。
<Immune-stimulating composition>
The immunostimulatory composition of the present invention is Enterococcus faecalis, in which 20 μg / mL of the Enterococcus faecalis and 5 × 10 5 cells / mL of plasmacytoid dendritic cells derived from bone marrow cells are co-cultured. It contains Enterococcus faecalis having the ability to activate plasmacytoid dendritic cells represented by an index that produces IFN-α of 50 pg / mL or more.
本発明において「エンテロコッカス・フェカリス菌」とは、学名が「Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ」である乳酸菌を意味し、免疫賦活用組成物の有効成分に相当する。 In the present invention, "Enterococcus faecalis" means a lactic acid bacterium whose scientific name is "Enterococcus faecalis", and corresponds to an active ingredient of an immunostimulatory composition.
本発明において「免疫賦活用組成物」とは、動物（ヒト及び非ヒト動物）又は動物由来の細胞に対して、免疫賦活作用をもたらすための組成物を意味する。
免疫賦活用組成物は、エンテロコッカス・フェカリス菌からなるものであってもよく、エンテロコッカス・フェカリス菌とともにその他の成分が配合されたものであってもよい。
In the present invention, the "immunostimulatory composition" means a composition for exerting an immunostimulatory effect on an animal (human and non-human animal) or a cell derived from an animal.
The immunostimulatory composition may be composed of Enterococcus faecalis, or may be a mixture of Enterococcus faecalis and other components.
本発明において「免疫賦活作用」とは、免疫力の賦活化、及びそれによってもたらされる体調維持効果や治療効果等を包含する。
本発明の免疫賦活用組成物は、プラズマサイトイド樹状細胞の活性化及びＩＦＮ－αの産生によって免疫賦活作用をもたらす。
In the present invention, the "immunity activating effect" includes activation of immunity, and a physical condition maintenance effect and a therapeutic effect brought about by the activation.
The immunostimulatory composition of the present invention brings about an immunostimulatory effect by activating plasmacytoid dendritic cells and producing IFN-α.
本発明において「プラズマサイトイド樹状細胞」は、「ｐＤＣ」（ｐｌａｓｍａｃｙｔｏｉｄ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌ）とも称される。
本発明において「ＩＦＮ－α」は、「インターフェロン－α」の略称である。本発明における「ＩＦＮ－α」は、サブタイプの全て、又は１以上の組み合わせを包含する。
In the present invention, the "plasmacytoid dendritic cell" is also referred to as "pDC" (plasmacytoid dendritic cell).
In the present invention, "IFN-α" is an abbreviation for "interferon-α". "IFN-α" in the present invention includes all subtypes or a combination of one or more.
本発明において「プラズマサイトイド樹状細胞の活性化能」とは、ＩＦＮ－αの産生量の増加を指標として特定される。
つまり、本発明において「プラズマサイトイド樹状細胞の活性化能が高い」とは、エンテロコッカス・フェカリス菌が、プラズマサイトイド樹状細胞の活性化を介してＩＦＮ－αの産生量を増加させることを意味する。
そして、本発明によれば、産生されるＩＦＮ－αの産生量が高く、２０μｇ／ｍＬのエンテロコッカス・フェカリス菌と５×１０５個／ｍＬの骨髄細胞由来のプラズマサイトイド樹状細胞とを共培養することで５０ｐｇ／ｍＬ以上のＩＦＮ－αを産生する。
In the present invention, "the ability to activate plasmacytoid dendritic cells" is specified by using an increase in the amount of IFN-α produced as an index.
That is, in the present invention, "high activation ability of plasmacytoid dendritic cells" means that Enterococcus faecalis increases the production amount of IFN-α through activation of plasmacytoid dendritic cells. Means.
According to the present invention, the amount of IFN-α produced is high, and 20 μg / mL Enterococcus faecalis and 5 × 10 5 cells / mL plasmacytoid dendritic cells derived from bone marrow cells are coexistent. By culturing, IFN-α of 50 pg / mL or more is produced.
本発明において「骨髄細胞由来のプラズマサイトイド樹状細胞」とは、Ｆｌｔ３－Ｌ（ＦＭＳ－ｒｅｌａｔｅｄ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ ３ ｌｉｇａｎｄ）の存在下で骨髄細胞を培養することで産生誘導されるプラズマサイトイド樹状細胞を含む樹状細胞群を意味する。本発明において、骨髄細胞にＦｌｔ３－Ｌを添加し、培養することで得られる樹状細胞群の中には、プラズマサイトイド樹状細胞のほか、ミエロイド系樹状細胞等が含まれ得る。
Ｆｌｔ３－Ｌの由来は問わず、例えば哺乳類（ヒト、マウス等）に由来していてもよいし、微生物（例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ等）等を用いた合成物であってもよい。Ｆｌｔ３－Ｌの添加量は特に限定されないが、例えば、骨髄細胞濃度１×１０６個／ｍＬの細胞培養培地に対し、０．１ｎｇ／ｍＬ以上１ｍｇ／ｍＬ以下であってもよい。
In the present invention, the "plasmacytoid dendritic cell derived from bone marrow cell" is a plasmacytoid dendritic cell whose production is induced by culturing bone marrow cells in the presence of Flt3-L (FMS-related tyrosine dendritic cell). It means a group of dendritic cells including cells. In the present invention, the dendritic cell group obtained by adding Flt3-L to bone marrow cells and culturing may include plasmacytoid dendritic cells, myeloid dendritic cells, and the like.
The origin of Flt3-L is not limited, and may be derived from, for example, mammals (humans, mice, etc.), or may be a compound using a microorganism (eg, Escherichia coli, etc.). The amount of Flt3-L added is not particularly limited, but may be, for example, 0.1 ng / mL or more and 1 mg / mL or less with respect to a cell culture medium having a bone marrow cell concentration of 1 × 10 6 cells / mL.
骨髄細胞からプラズマサイトイド樹状細胞が誘導されたかどうかは、細胞の形状、目的のマーカー（プラズマサイトイド樹状細胞が特異的に発現しているタンパク質やプラズマサイトイド樹状細胞が発現していないタンパク質等）の発現等を観察又は測定等することで特定できる。
例えば、骨髄細胞からプラズマサイトイド樹状細胞が誘導されたかどうかは、実施例に示す顕微鏡観察や、フローサイトメトリー分析によって特定できるが、その条件は特に限定されない。顕微鏡観察やフローサイトメトリーに使用する抗体や標識の種類や数は適宜設定できる。
Whether plasmacytoid dendritic cells were induced from bone marrow cells depends on the cell shape and the target marker (proteins specifically expressed by plasmacytoid dendritic cells or plasmacytoid dendritic cells). It can be identified by observing or measuring the expression of non-proteins, etc.).
For example, whether or not plasmacytoid dendritic cells are derived from bone marrow cells can be specified by microscopic observation shown in Examples or flow cytometric analysis, but the conditions are not particularly limited. The type and number of antibodies and labels used for microscopic observation and flow cytometry can be set as appropriate.
本発明におけるＩＦＮ－αの産生量の具体的な測定方法は、実施例の＜乳酸菌株のスクリーニング＞の項に示すとおりである。
具体的には、以下の方法で測定する。
（プラズマサイトイド樹状細胞と乳酸菌との共培養）
マウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ（Ｃ５７ＢＬ／６ＪＪｍｓＳｌｃ等））の大腿骨から、常法に従って骨髄細胞を回収し、赤血球除去処理を行う。
得られた骨髄細胞を、細胞培養培地中に、１×１０６個／ｍＬとなるように懸濁し、ＣＯ２インキュベーターで、５％ＣＯ２、３７℃の培養条件で培養する。
培養開始から４日目に、３／７量の培地を交換する。
培養開始から８日目に、細胞培養培地に懸濁したエンテロコッカス・フェカリス菌を添加し、骨髄細胞の終濃度を５×１０５個／ｍＬに調整し、かつエンテロコッカス・フェカリス菌の終濃度を２０μｇ／ｍＬに調整する。
さらに、５％ＣＯ２、３７℃で４８時間培養後、培養上清を回収する。
なお、細胞培養培地としては、ＲＰＭＩ－１６４０培地に、１０％ ウシ胎児血清、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、５，０００ＩＵ／μｇ ペニシリン・ストレプトマイシン、５０μＭ β－メルカプトエタノール、及び、１００ｎｇ／ｍＬ Ｆｌｔ３－Ｌを添加したものを使用する。
上記培地成分のうち、「Ｆｌｔ３－Ｌ」は、プラズマサイトイド樹状細胞を誘導するためのサイトカインである。
（ＩＦＮ－α産生量の測定）
ＥＬＩＳＡ法により、各培養上清中のＩＦＮ－α産生量を測定する。
The specific method for measuring the amount of IFN-α produced in the present invention is as shown in the section <Screening for Lactic Acid Bacteria Strains> in Examples.
Specifically, it is measured by the following method.
(Co-culture of plasmacytoid dendritic cells and lactic acid bacteria)
Bone marrow cells are collected from the femur of a mouse (C57BL / 6J (C57BL / 6JJmsSlc, etc.)) according to a conventional method, and red blood cell removal treatment is performed.
The obtained bone marrow cells are suspended in a cell culture medium at 1 × 10 6 cells / mL and cultured in a CO 2 incubator under 5% CO 2 and 37 ° C. culture conditions.
On the 4th day from the start of culture, 3/7 amount of medium is replaced.
On the 8th day from the start of culture, Enterococcus faecalis suspended in the cell culture medium was added to adjust the final concentration of bone marrow cells to 5 × 10 5 cells / mL, and the final concentration of Enterococcus faecalis was 20 μg. Adjust to / mL.
Further, after culturing at 5% CO 2 , 37 ° C. for 48 hours, the culture supernatant is collected.
As the cell culture medium, 10% fetal bovine serum, 10 mM HEPES, 5,000 IU / μg penicillin / streptomycin, 50 μM β-mercaptoethanol, and 100 ng / mL Flt3-L were added to RPMI-1640 medium. To use.
Among the above-mentioned medium components, "Flt3-L" is a cytokine for inducing plasmacytoid dendritic cells.
(Measurement of IFN-α production)
The amount of IFN-α produced in each culture supernatant is measured by the ELISA method.
２０μｇ／ｍＬのエンテロコッカス・フェカリス菌と５×１０５個／ｍＬの骨髄細胞由来のプラズマサイトイド樹状細胞とを共培養することによるＩＦＮ－αの産生量は高いほど好ましく、例えば、１００ｐｇ／ｍＬ以上、１５０ｐｇ／ｍＬ以上、２００ｐｇ／ｍＬ以上、２５０ｐｇ／ｍＬ以上、３００ｐｇ／ｍＬ以上であってもよい。
２０μｇ／ｍＬのエンテロコッカス・フェカリス菌と５×１０５個／ｍＬの骨髄細胞由来のプラズマサイトイド樹状細胞とを共培養することによるＩＦＮ－αの産生量の上限は特に限定されないが、通常１，０００ｐｇ／ｍＬ以下である。
The higher the amount of IFN-α produced by co-culturing 20 μg / mL Enterococcus faecalis and 5 × 10 5 cells / mL plasmacytoid dendritic cells is preferable, for example, 100 pg / mL. As mentioned above, it may be 150 pg / mL or more, 200 pg / mL or more, 250 pg / mL or more, and 300 pg / mL or more.
The upper limit of the amount of IFN-α produced by co-culturing 20 μg / mL Enterococcus faecalis and 5 × 10 5 cells / mL plasmacytoid dendritic cells derived from bone marrow cells is not particularly limited, but is usually 1. It is 000 pg / mL or less.
本発明の免疫賦活用組成物は、分泌型ＩｇＡ（ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ ＩｇＡ、ｓ－ＩｇＡ）の産生も促進し得る。
したがって、本発明において「免疫賦活」とは、「分泌型ＩｇＡの産生促進」を包含する。
The immunostimulatory composition of the present invention can also promote the production of secretory IgA (secretory IgA, s-IgA).
Therefore, in the present invention, "immunity activation" includes "promotion of secretory IgA production".
分泌型ＩｇＡの産生量の特定方法は特に限定されないが、例えば、本発明の免疫賦活用組成物を摂取した哺乳類（ヒト等）において、摂取前後の生体試料（唾液、気道分泌液、腸管分泌液、乳汁、涙、尿、汗等）に含まれる分泌型ＩｇＡの量や分泌型ＩｇＡの分泌速度を測定する方法が挙げられる。
また、分泌型ＩｇＡの量の代わりに、以下を測定してもよい。
・ 樹状細胞からＩｇＡ産生形質細胞（ＩｇＡ＋Ｂ細胞）までに関与する、Ｔ細胞やＢ細胞の活性化指標
・ 免疫関与物質（各種サイトカイン等）の遺伝子発現
・ 乳酸菌の抗原特異的ｓ－ＩｇＡ、又は非抗原特異的ｓ－ＩｇＡの量
・ 分泌型ＩｇＡによるウイルスや細菌の不活化や接着量、複合体形成量
The method for specifying the amount of secreted IgA produced is not particularly limited, but for example, in mammals (humans and the like) who have ingested the immunostimulatory composition of the present invention, biological samples (saliva, airway secretion, intestinal secretion) before and after ingestion. , Milk, tears, urine, sweat, etc.) and methods for measuring the amount of secretory IgA and the rate of secretion of secretory IgA can be mentioned.
Further, instead of the amount of secretory IgA, the following may be measured.
・ Activation index of T cells and B cells involved from dendritic cells to IgA-producing plasma cells (IgA + B cells) ・ Gene expression of immune-related substances (various cytokines, etc.) ・ Antigen-specific s-IgA of lactic acid bacteria , Or the amount of non-antigen-specific s-IgA, the amount of inactivation and adhesion of viruses and bacteria by secretory IgA, and the amount of complex formation
分泌型ＩｇＡ産生量は、例えば、以下のように測定してもよい。
（１）１日当たり１，０００億個のエンテロコッカス・フェカリス菌に相当する量の免疫賦活用組成物を、２週間継続的にヒトに経口摂取させる。
（２）免疫賦活用組成物の摂取前後の唾液を流涎で採取し、唾液に含まれる分泌型ＩｇＡ量をＥＬＩＳＡ法により測定する。
（３）分泌型ＩｇＡ量の増加量が高いほど、分泌型ＩｇＡの産生促進効果が高いと判断できる。
例えば、免疫賦活用組成物摂取前と比較した時の分泌型ＩｇＡの増加量は、１５ｍｇ／ｄＬ以上、１０ｍｇ／ｄＬ以上、５ｍｇ／ｄＬ以上、４ｍｇ／ｄＬ以上、３ｍｇ／ｄＬ以上、２ｍｇ／ｄＬ以上、１ｍｇ／ｄＬ以上、０．５ｍｇ／ｄＬ以上であり得る。
例えば、分泌型ＩｇＡの産生比（摂取後／摂取前）は、４．０倍以上、３．５倍以上、３．０倍以上、２．５倍以上、２．０倍以上、１．５倍以上、１．２倍以上であり得る。
The secretory IgA production amount may be measured, for example, as follows.
(1) An amount of an immunostimulatory composition corresponding to 100 billion Enterococcus faecalis bacteria per day is orally ingested by humans continuously for 2 weeks.
(2) Saliva before and after ingestion of the immunostimulatory composition is collected by saliva, and the amount of secretory IgA contained in the saliva is measured by the ELISA method.
(3) It can be determined that the higher the increase in the amount of secretory IgA, the higher the effect of promoting the production of secretory IgA.
For example, the amount of increase in secretory IgA when compared with that before ingestion of the immunostimulatory composition is 15 mg / dL or more, 10 mg / dL or more, 5 mg / dL or more, 4 mg / dL or more, 3 mg / dL or more, 2 mg / dL. As mentioned above, it may be 1 mg / dL or more and 0.5 mg / dL or more.
For example, the production ratio of secretory IgA (after ingestion / before ingestion) is 4.0 times or more, 3.5 times or more, 3.0 times or more, 2.5 times or more, 2.0 times or more, 1.5 times. It can be more than double and more than 1.2 times.
（エンテロコッカス・フェカリス菌）
本発明におけるエンテロコッカス・フェカリス菌は、２０μｇ／ｍＬの該エンテロコッカス・フェカリス菌と５×１０５個／ｍＬの骨髄細胞由来のプラズマサイトイド樹状細胞とを共培養することで５０ｐｇ／ｍＬ以上のＩＦＮ－αを産生する指標で表されるプラズマサイトイド樹状細胞の活性化能を有するものであれば特に限定されない。
(Enterococcus faecalis)
The Enterococcus faecalis bacterium in the present invention is an IFN of 50 pg / mL or more by co-culturing 20 μg / mL of the Enterococcus faecalis bacterium and 5 × 10 5 cells / mL plasmacytoid dendritic cells derived from bone marrow cells. -There is no particular limitation as long as it has the ability to activate plasmacytoid dendritic cells represented by an index that produces α.
本発明におけるエンテロコッカス・フェカリス菌の例としては、以下が挙げられる。
Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ ＮＢＲＣ３９７１
Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ ＮＢＲＣ３９８９
Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ ＮＢＲＣ１２５８０
Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ ＮＢＲＣ１２９６４
Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ ＮＢＲＣ１２９６５
Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ ＮＢＲＣ１２９６６
Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ ＮＢＲＣ１２９６７
Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ ＮＢＲＣ１２９６８
Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ ＮＢＲＣ１２９６９
Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ ＮＢＲＣ１２９７０
Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ ＮＢＲＣ１００４８０
Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ ＮＢＲＣ１００４８２
Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ ＮＢＲＣ１００４８３
Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ ＮＢＲＣ１００４８４
Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ ＪＣＭ８９０２
Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ ＪＣＭ８９０４
Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ ＪＣＭ２０３０７
Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ ＪＣＭ２０３１３
Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ ＪＣＭ３１４６７
Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ ＪＣＭ２０３０９
Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ ＮＲＩＣ０１０３
Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ ＮＲＩＣ０１１０
Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ ＮＲＩＣ０１１２
Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ ＮＲＩＣ１１４１
Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ ＮＲＩＣ１１４２
Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ ＮＲＩＣ１１４３
Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ ＮＲＩＣ１７４６
Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ ＮＲＩＣ１７５１
Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ ＮＲＩＣ１７８３
Examples of Enterococcus faecalis in the present invention include the following.
Enterococcus faecalis NBRC3971
Enterococcus faecalis NBRC3989
Enterococcus faecalis NBRC12580
Enterococcus faecalis NBRC12964
Enterococcus faecalis NBRC12965
Enterococcus faecalis NBRC12966
Enterococcus faecalis NBRC12967
Enterococcus faecalis NBRC12968
Enterococcus faecalis NBRC12969
Enterococcus faecalis NBRC12970
Enterococcus faecalis NBRC100480
Enterococcus faecalis NBRC100482
Enterococcus faecalis NBRC100883
Enterococcus faecalis NBRC100484
Enterococcus faecalis JCM8902
Enterococcus faecalis JCM8904
Enterococcus faecalis JCM20307
Enterococcus faecalis JCM20313
Enterococcus faecalis JCM31467
Enterococcus faecalis JCM20309
Enterococcus faecalis NRIC0103
Enterococcus faecalis NRIC0110
Enterococcus faecalis NRIC0112
Enterococcus faecalis NRIC1141
Enterococcus faecalis NRIC1142
Enterococcus faecalis NRIC1143
Enterococcus faecalis NRIC1746
Enterococcus faecalis NRIC1751
Enterococcus faecalis NRIC1783
本発明におけるエンテロコッカス・フェカリス菌としては、プラズマサイトイド樹状細胞の活性化能力が特に高いという観点から、以下が好ましい。
Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ ＮＢＲＣ３９７１
Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ ＮＢＲＣ３９８９
Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ ＮＢＲＣ１２５８０
Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ ＮＢＲＣ１２９６４
Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ ＮＢＲＣ１２９６５
Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ ＮＢＲＣ１２９６６
Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ ＮＢＲＣ１２９６７
Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ ＮＢＲＣ１２９６８
Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ ＮＢＲＣ１２９６９
Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ ＮＢＲＣ１００４８０
Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ ＮＢＲＣ１００４８２
Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ ＮＢＲＣ１００４８３
Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ ＮＢＲＣ１００４８４
The Enterococcus faecalis bacterium in the present invention is preferably as follows from the viewpoint of particularly high ability to activate plasmacytoid dendritic cells.
Enterococcus faecalis NBRC3971
Enterococcus faecalis NBRC3989
Enterococcus faecalis NBRC12580
Enterococcus faecalis NBRC12964
Enterococcus faecalis NBRC12965
Enterococcus faecalis NBRC12966
Enterococcus faecalis NBRC12967
Enterococcus faecalis NBRC12968
Enterococcus faecalis NBRC12969
Enterococcus faecalis NBRC100480
Enterococcus faecalis NBRC100482
Enterococcus faecalis NBRC100883
Enterococcus faecalis NBRC100484
上記で例示された乳酸菌は、独立行政法人製品評価技術基盤機構（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｉｔｅ．ｇｏ．ｊｐ／）、理化学研究所バイオリソース研究センター（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｅｂ．ｂｒｃ．ｒｉｋｅｎ．ｊｐ／ｊａ／）、又は東京農業大学菌株保存室（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｏｄａｉ．ａｃ．ｊｐ／）から入手することができる。 The lactic acid bacteria exemplified above are the National Institute of Technology and Evaluation (https://www.nite.go.jp/), RIKEN BioResource Research Center (https://web.brc.riken.jp/). It can be obtained from ja /) or the strain storage room of Tokyo Agriculture University (https://www.nodai.ac.jp/).
なお、本発明においては、上記で例示された乳酸菌だけではなく、該乳酸菌株と同等の菌株も包含する。ただし、本発明における乳酸菌はこれらに限定されない。
本発明において「同等の菌株」とは、菌株名が異なっていても、上記で例示された乳酸菌株から由来している菌株、上記で例示された乳酸菌株が由来する菌株、又は上記で例示された乳酸菌株の子孫である菌株を包含する。
It should be noted that the present invention includes not only the lactic acid bacteria exemplified above but also strains equivalent to the lactic acid bacteria strain. However, the lactic acid bacterium in the present invention is not limited to these.
In the present invention, the "equivalent strain" is a strain derived from the lactic acid strain exemplified above, a strain derived from the lactic acid strain exemplified above, or an example described above, even if the strain name is different. Includes strains that are descendants of lactic acid bacteria strains.
上記で例示された乳酸菌株と同等の菌株は、他の菌株保存機関に保存されている場合もある。
例えば、「Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ ＮＢＲＣ１００４８０」と同等の菌株として、「Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ ＮＢＲＣ１００４８１」、「Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ ＪＣＭ ５８０３」、「Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ ＪＣＭ ８７２６」等が挙げられる。
そのため、本発明における「Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ ＮＢＲＣ１００４８０」は、これらの同等の菌株も包含する。
Strains equivalent to the lactic acid strains exemplified above may be stored in other strain storage institutions.
For example, examples of the strain equivalent to "Enterococcus faecalis NBRC100480" include "Enterococcus faecalis NBRC100481", "Enterococcus faecalis JCM 5803", "Enterococcus faecalis JCM 5803", "Enterococcus faec.
Therefore, "Enterococcus faecalis NBRC100480" in the present invention also includes these equivalent strains.
本発明におけるエンテロコッカス・フェカリス菌は、生菌であってもよく、死菌（殺菌処理を施されたもの等）であってもよい。 The Enterococcus faecalis bacterium in the present invention may be a live bacterium or a dead bacterium (such as one that has been sterilized).
本発明におけるエンテロコッカス・フェカリス菌の形態は特に限定されず、培養物、培養濃縮物、乾燥物等であり得る。
培養物の濃縮方法としては、膜濾過、遠心分離等が挙げられる。
乾燥方法としては、凍結乾燥、スプレードライ、ドラムドライ等が挙げられる。
The form of Enterococcus faecalis in the present invention is not particularly limited, and may be a culture, a culture concentrate, a dried product, or the like.
Examples of the method for concentrating the culture include membrane filtration and centrifugation.
Examples of the drying method include freeze-drying, spray-drying, drum-drying and the like.
本発明におけるエンテロコッカス・フェカリス菌は、必要に応じて、超音波破砕処理、酵素添加処理、夾雑物（色素、タンパク質等）除去処理、凍結処理等が施されていてもよい。
夾雑物除去処理としては、活性炭、イオン交換樹脂、合成吸着剤等を用いた方法等が挙げられる。
The Enterococcus faecalis bacterium in the present invention may be subjected to ultrasonic crushing treatment, enzyme addition treatment, contaminant (dye, protein, etc.) removal treatment, freezing treatment and the like, if necessary.
Examples of the contaminant removal treatment include a method using activated carbon, an ion exchange resin, a synthetic adsorbent and the like.
本発明の免疫賦活用組成物における、本発明におけるエンテロコッカス・フェカリス菌（つまり、２０μｇ／ｍＬの該エンテロコッカス・フェカリス菌と５×１０５個／ｍＬの骨髄細胞由来のプラズマサイトイド樹状細胞とを共培養することで５０ｐｇ／ｍＬ以上のＩＦＮ－αを産生する指標で表されるプラズマサイトイド樹状細胞の活性化能を有するエンテロコッカス・フェカリス菌）の含有量は特に限定されない。
本発明におけるエンテロコッカス・フェカリス菌の含有量（菌数）の下限は、本発明の免疫賦活用組成物に対して、１回用量あたり、好ましくは１００万個以上、より好ましくは１，０００万個以上である。
本発明におけるエンテロコッカス・フェカリス菌の含有量（菌数）の上限は、本発明の免疫賦活用組成物に対して、１回用量あたり、好ましくは１０兆個以下、より好ましくは２兆個以下である。
In the immunostimulatory composition of the present invention, the Enterococcus faecalis bacterium according to the present invention (that is, 20 μg / mL of the Enterococcus faecalis bacterium and 5 × 10 5 cells / mL of plasmacytoid dendritic cells derived from bone marrow cells The content of Enterococcus faecalis (Enterococcus faecalis) having the ability to activate plasmacytoid dendritic cells represented by an index that produces IFN-α of 50 pg / mL or more by co-culture is not particularly limited.
The lower limit of the content (number of bacteria) of Enterococcus faecalis in the present invention is preferably 1 million or more, more preferably 10 million per dose, with respect to the immunostimulatory composition of the present invention. That is all.
The upper limit of the content (number of bacteria) of Enterococcus faecalis in the present invention is preferably 10 trillion or less, more preferably 2 trillion or less, per single dose with respect to the immunostimulatory composition of the present invention. be.
（その他の成分）
本発明の免疫賦活用組成物には、本発明におけるエンテロコッカス・フェカリス菌の作用を阻害しない範囲で、飲食品や、医薬品等に含まれ得る任意の成分が含まれていてもよい。
このような成分としては、本発明における要件のいずれか又は全てを満たさないエンテロコッカス・フェカリス菌、乳酸菌培養培地成分、発酵物、免疫賦活剤、賦形剤（デキストリン等）、基剤、乳化剤、溶剤、安定剤等が挙げられる。
これらの成分の種類や配合量は、得ようとする効果等に応じて適宜設定できる。
(Other ingredients)
The immunostimulatory composition of the present invention may contain any component that can be contained in foods and drinks, pharmaceuticals and the like, as long as the action of Enterococcus faecalis in the present invention is not inhibited.
Such components include Enterococcus faecalis, a lactic acid bacterium culture medium component, a fermented product, an immunostimulant, an excipient (dextrin, etc.), a base, an emulsifier, and a solvent that do not meet any or all of the requirements in the present invention. , Stabilizers and the like.
The type and blending amount of these components can be appropriately set according to the effect to be obtained and the like.
＜免疫賦活用組成物の製造方法＞
本発明の免疫賦活用組成物の製造方法は特に限定されず、得ようとする免疫賦活用組成物の形態等に応じて適宜選択できる。
<Manufacturing method of immunostimulatory composition>
The method for producing the immunostimulatory composition of the present invention is not particularly limited, and can be appropriately selected depending on the form of the immunostimulatory composition to be obtained and the like.
本発明の免疫賦活用組成物の形態としては、飲食品（栄養補助食品、健康補助食品、栄養調整食品、保健機能食品、特定保健用食品、栄養機能食品、機能性表示食品等）、化粧品、医薬（医薬品、医薬部外品等）等が挙げられる。 The form of the immunostimulatory composition of the present invention includes foods and drinks (dietary supplements, health supplements, nutritionally adjusted foods, health functional foods, foods for specified health use, nutritional functional foods, foods with functional claims, etc.), cosmetics, and the like. Examples include pharmaceuticals (pharmaceuticals, non-pharmaceutical products, etc.).
飲食品としては、ヒト用飲食品、非ヒト動物用又は養魚用飼料、ペットフード等を包含する。
具体的には、以下が挙げられる；
飲料類（日本茶、ウーロン茶、紅茶、コーヒー、ジュース、加工乳、スポーツドリンク等）、
ベーカリー類（パン、ピザ、パイ等）、
洋菓子類（クッキー、クラッカー、ビスケット、ケーキ、カステラ等）、
麺類（うどん、そば、ラーメン等）、
パスタ類（スパゲティー、マカロニ等）、
スナック菓子類（おかき、ポテトチップス、スナック等）、
菓子類（ハードキャンディー、ソフトキャンディー、キャラメル、ガム、チョコレート等）、
冷菓（アイスクリーム、シャーベット等）、
乳製品（クリーム、チーズ、ムース、粉乳、練乳、乳飲料等）、
洋生菓子類（ゼリー、プリン、ムース、ヨーグルト、バタークリーム、カスタードクリーム等）、
和菓子類（求肥、ういろう、もち、おはぎ、どら焼き等）、
果実・野菜の加工食品類（ジャム、マーマレード、シロップ漬け、糖果等）、
ペースト類（フラワーペースト、フルーツペースト、ピーナッツペースト等）、
漬物類（らっきょ漬け、福神漬け、キムチ等）、
複合調味料（醤油、ソース、たれ、麺つゆ、だしの素、スープの素等）、
調味料類（シチューの素、スープの素、カレーの素、マヨネーズ、ケチャップ等）、
レトルトや缶詰食品（カレー、シチュー、スープ等）、
冷凍食品や冷蔵食品（ハム、ソーセージ、ベーコン、ハンバーグ、ミートボール、コロッケ、餃子、ピラフ、おにぎり等）、
水産加工食品（ちくわ、かまぼこ等）、
米飯類（リゾット、寿司等）、
乳児用ミルク、離乳食、ベビーフード、ペットフード、ペット用ガム、動物用飼料等。
Foods and drinks include foods and drinks for humans, feeds for non-human animals or fish, pet foods and the like.
Specifically, the following can be mentioned;
Beverages (Japanese tea, oolong tea, black tea, coffee, juice, processed milk, sports drinks, etc.),
Bakeries (bread, pizza, pies, etc.),
Western confectionery (cookies, crackers, biscuits, cakes, castella, etc.),
Noodles (udon, soba, ramen, etc.),
Pasta (spaghetti, macaroni, etc.),
Snacks (okaki, potato chips, snacks, etc.),
Confectionery (hard candy, soft candy, caramel, gum, chocolate, etc.),
Frozen desserts (ice cream, sorbet, etc.),
Dairy products (cream, cheese, mousse, milk powder, condensed milk, milk drinks, etc.),
Western sweets (jelly, pudding, mousse, yogurt, butter cream, custard cream, etc.),
Japanese sweets (Gyuhi, Uiro, Mochi, Ohagi, Dorayaki, etc.),
Processed fruit and vegetable foods (jam, marmalade, syrup pickles, candied fruit, etc.),
Pastes (flower paste, fruit paste, peanut paste, etc.),
Pickles (pickled scallions, pickled Fukujin, kimchi, etc.),
Complex seasonings (soy sauce, sauce, sauce, noodle soup, dashi stock, soup stock, etc.),
Seasonings (stew base, soup base, curry base, mayonnaise, ketchup, etc.),
Retorts and canned foods (curry, stew, soup, etc.),
Frozen foods and refrigerated foods (ham, sausage, bacon, hamburger, meatballs, croquettes, dumplings, pilaf, rice balls, etc.),
Processed fishery foods (chikuwa, kamaboko, etc.),
Cooked rice (risotto, sushi, etc.),
Baby milk, baby food, baby food, pet food, pet gum, animal feed, etc.
化粧品としては、例えば、以下が挙げられる；
洗浄剤（石けん、ボディーシャンプー、クレンジングクリーム、洗顔料等）、
ローション、
クリーム（洗顔フォーム、バニシングクリーム、コールドクリーム、エモリエントクリーム、マッサージクリーム等）、
乳液、美容液、パック、浴用剤等。
Cosmetics include, for example;
Detergent (soap, body shampoo, cleansing cream, washing pigment, etc.),
lotion,
Cream (face wash foam, vanishing cream, cold cream, emollient cream, massage cream, etc.),
Milky lotion, beauty essence, facial mask, bathing agent, etc.
医薬としては、経口投与剤、血管内投与剤、経腸投与剤、経皮投与剤、腹腔内投与剤等が挙げられる。
剤形としては、特に限定されないが、例えば、散剤、粉剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、丸剤、坐剤、液剤、注射剤等が挙げられる。
Examples of the pharmaceutical include oral administration agents, intravascular administration agents, enteral administration agents, transdermal administration agents, intraperitoneal administration agents and the like.
The dosage form is not particularly limited, and examples thereof include powders, powders, granules, tablets, capsules, pills, suppositories, liquids, and injections.
＜免疫賦活用組成物の用途＞
本発明の免疫賦活用組成物の用途は特に限定されず、免疫の賦活化を要する任意の対象に投与できる。
<Use of immunostimulatory composition>
The use of the immunostimulatory composition of the present invention is not particularly limited, and it can be administered to any subject requiring immunostimulation.
本発明の免疫賦活用組成物の投与量は、投与対象の種類や状態等に応じて適宜設定できる。 The dose of the immunostimulatory composition of the present invention can be appropriately set according to the type and condition of the administration target.
本発明の免疫賦活用組成物の投与頻度や投与期間は、投与対象の種類や状態等に応じて適宜設定できる。
例えば、本発明の免疫賦活用組成物は毎日又は数日（例えば、２～４日）おきに投与してもよい。
例えば、本発明の免疫賦活用組成物は数日～数年にわたって投与してもよい。
The administration frequency and administration period of the immunostimulatory composition of the present invention can be appropriately set according to the type and condition of the administration target.
For example, the immunostimulatory composition of the present invention may be administered daily or every few days (eg, 2-4 days).
For example, the immunostimulatory composition of the present invention may be administered over several days to several years.
本発明は、良好な免疫賦活効果を有するため、投与対象に免疫機能の改善をもたらし得る。例えば、本発明の免疫賦活用組成物は、風邪様症状予防剤や、ウイルス感染予防剤として機能し得るため、健康な体調の維持に役立てることができる。 Since the present invention has a good immunostimulatory effect, it can bring about an improvement in immune function to the administration subject. For example, the immunostimulatory composition of the present invention can function as a cold-like symptom preventive agent and a virus infection preventive agent, and thus can be useful for maintaining a healthy physical condition.
本発明において「風邪様症状」とは、鼻水、倦怠感、疲労感、寒気、のどの痛み、咳等を包含する。 In the present invention, the "cold-like symptom" includes a runny nose, fatigue, fatigue, chills, sore throat, cough and the like.
本発明において「ウイルス感染」とは、例えば、ヘルペスウイルス、インフルエンザウイルス、コロナウイルス、麻疹ウイルス、ノロウイルス等のウイルスへの感染を包含する。 In the present invention, "virus infection" includes, for example, infection with viruses such as herpes virus, influenza virus, coronavirus, measles virus, and norovirus.
＜免疫賦活に用いるエンテロコッカス・フェカリス菌のスクリーニング方法＞
本発明は、上述のとおり、エンテロコッカス・フェカリス菌のうち一部の菌が、プラズマサイトイド樹状細胞の活性化作用が強く、その結果、ＩＦＮ－αの産生能も特に高いという新規な知見に基づく。
したがって、本発明は、プラズマサイトイド樹状細胞の活性化、及び／又は、ＩＦＮ－α産生量の増加を指標とする、免疫賦活に用いるエンテロコッカス・フェカリス菌のスクリーニング方法も包含する。
<Screening method for Enterococcus faecalis used for immunostimulation>
As described above, the present invention is based on the novel finding that some of Enterococcus faecalis have a strong activation effect on plasmacytoid dendritic cells, and as a result, the production ability of IFN-α is particularly high. Based on.
Therefore, the present invention also includes a method for screening Enterococcus faecalis used for immunostimulation, using activation of plasmacytoid dendritic cells and / or an increase in IFN-α production as an index.
本発明のスクリーニング方法は、エンテロコッカス・フェカリス菌に分類される候補菌株群から目的菌株を選抜する選抜工程を含む。
該選抜工程における候補菌株群の選抜基準は、プラズマサイトイド樹状細胞の活性化（ＩＦＮ－α産生量の増加）である。
The screening method of the present invention includes a selection step of selecting a target strain from a group of candidate strains classified into Enterococcus faecalis.
The selection criterion for the candidate strain group in the selection step is activation of plasmacytoid dendritic cells (increase in IFN-α production).
選抜工程は、例えば、候補菌群の培養、培養上清の分析等を含み得る。 The selection step may include, for example, culturing the candidate bacterial group, analyzing the culture supernatant, and the like.
候補菌群の培養方法としては、乳酸菌の任意の培養方法を採用し得る。例えば、実施例の＜乳酸菌株のスクリーニング＞の項に示した方法であってもよい。 As a method for culturing the candidate bacterial group, any method for culturing lactic acid bacteria can be adopted. For example, the method shown in the section <Screening for Lactic Acid Bacteria Strains> in Examples may be used.
培養上清の分析の方法としては、測定対象（ＩＦＮ－α濃度等）に応じた方法を採用し得る。例えば、市販のキットを用いたＥＬＩＳＡ法であってもよい。 As a method for analyzing the culture supernatant, a method according to the measurement target (IFN-α concentration, etc.) can be adopted. For example, an ELISA method using a commercially available kit may be used.
選抜基準は特に限定されないが、例えば、２０μｇ／ｍＬのエンテロコッカス・フェカリス菌と５×１０５個／ｍＬの骨髄細胞由来のプラズマサイトイド樹状細胞とを共培養することで５０ｐｇ／ｍＬ以上のＩＦＮ－αを産生する指標で表されるプラズマサイトイド樹状細胞の活性化能を有するという要件を満たすように選抜してもよい。 The selection criteria are not particularly limited, but for example, by co-culturing 20 μg / mL Enterococcus faecalis and 5 × 10 5 cells / mL plasmacytoid dendritic cells derived from bone marrow cells, an IFN of 50 pg / mL or more is obtained. -They may be selected to meet the requirement of having the ability to activate plasmacytoid dendritic cells represented by an index that produces α.
以下に、実施例により本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be described in more detail by way of examples, but the present invention is not limited to these examples.
＜乳酸菌の準備＞
以下の乳酸菌を準備した。
エンテロコッカス・フェカリス菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）：５９株
エンテロコッカス属に属する乳酸菌（エンテロコッカス・フェカリス菌以外）：３株
<Preparation of lactic acid bacteria>
The following lactic acid bacteria were prepared.
Enterococcus faecalis: 59 strains Lactic acid bacteria belonging to the genus Enterococcus (other than Enterococcus faecalis): 3 strains
エンテロコッカス・フェカリス菌は、独立行政法人製品評価技術基盤機構から分譲されたもの、又は自然界より単離したものである。 Enterococcus faecalis is either sold from the National Institute of Technology and Evaluation, or isolated from the natural world.
エンテロコッカス属に属する乳酸菌（エンテロコッカス・フェカリス菌以外）は、独立行政法人製品評価技術基盤機構から分譲されたものである。具体的には、エンテロコッカス・フェシウム菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）、エンテロコッカス・デュランス菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｄｕｒａｎｓ）、又はエンテロコッカス・カセリフラバス菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｃａｓｓｅｌｉｆｌａｖｕｓ）を用いた。 Lactic acid bacteria belonging to the genus Enterococcus (other than Enterococcus faecalis) were sold by the National Institute of Technology and Evaluation. Specifically, Enterococcus faecium, Enterococcus durance, or Enterococcus casseliflavus was used.
＜乳酸菌の菌末化＞
各乳酸菌を、乳酸菌培養培地（ぶどう糖２質量％、及び市販の酵母エキス２質量％を含む。）で３０℃又は３７℃で、９～２４時間培養した。
培養中、水酸化ナトリウムを用いて培地のｐＨを６．５に制御しつつ、１００ｒｐｍで攪拌した。
培養後の菌体を遠心分離で集菌した後、培地上清を水に置換し、遠心分離を繰り返すことで、遠心分離後の上清のＢｒｉｘ値が０．２％以下になるまで洗浄した。
洗浄後の菌体を集菌した後、１０５℃で３０分殺菌した。
殺菌した菌体を凍結乾燥することで菌末を得た。
<Lactic acid bacteria powderation>
Each lactic acid bacterium was cultured in a lactic acid bacterium culture medium (containing 2% by mass of glucose and 2% by mass of a commercially available yeast extract) at 30 ° C. or 37 ° C. for 9 to 24 hours.
During the culture, the medium was stirred at 100 rpm while controlling the pH of the medium to 6.5 using sodium hydroxide.
After collecting the cultured cells by centrifugation, the culture medium supernatant was replaced with water, and the centrifugation was repeated until the Brix value of the supernatant after centrifugation became 0.2% or less. ..
After collecting the washed cells, they were sterilized at 105 ° C. for 30 minutes.
Bacterial powder was obtained by freeze-drying the sterilized cells.
＜乳酸菌株のスクリーニング＞
以下の方法で、各乳酸菌株のＩＦＮ－α産生能を評価した。
<Screening for lactic acid bacteria strains>
The IFN-α production ability of each lactic acid bacterium strain was evaluated by the following method.
（プラズマサイトイド樹状細胞と乳酸菌との共培養）
マウス（Ｃ５７ＢＬ／６ＪＪｍｓＳｌｃ）の大腿骨から、常法に従って骨髄細胞を回収し、ＡＣＫ ｌｙｓｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ）で赤血球除去処理を行った。
得られた骨髄細胞を、細胞培養培地中に、１×１０６個／ｍＬとなるように懸濁し、ＣＯ２インキュベーターで、５％ＣＯ２、３７℃の培養条件で培養した。
培養開始から４日目に、３／７量の培地を交換した。
培養開始から８日目に、細胞培養培地に懸濁した各菌末を添加し、骨髄細胞の終濃度を５×１０５個／ｍＬに調整し、かつ乳酸菌の終濃度を２０μｇ／ｍＬに調整した。
さらに、５％ＣＯ２、３７℃で４８時間培養後、培養上清を回収した。
(Co-culture of plasmacytoid dendritic cells and lactic acid bacteria)
Bone marrow cells were collected from the femur of a mouse (C57BL / 6JJmsSlc) according to a conventional method, and erythrocyte removal treatment was performed with ACK lysing buffer (Thermo Fisher SCIENTIFIC).
The obtained bone marrow cells were suspended in a cell culture medium at 1 × 10 6 cells / mL and cultured in a CO 2 incubator under 5% CO 2 and 37 ° C. culture conditions.
On the 4th day from the start of the culture, 3/7 amount of the medium was replaced.
On the 8th day from the start of culture, each bacterial powder suspended in the cell culture medium was added to adjust the final concentration of bone marrow cells to 5 × 10 5 cells / mL and the final concentration of lactic acid bacteria to 20 μg / mL. did.
Further, after culturing at 5% CO 2 and 37 ° C. for 48 hours, the culture supernatant was recovered.
なお、細胞培養培地としては、ＲＰＭＩ－１６４０培地（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）に、１０％ ＦＣＳ（ウシ胎児血清、ｂｉｏｗｅｓｔ）、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ）、５，０００ＩＵ／μｇ ペニシリン・ストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、５０μＭ β－メルカプトエタノール（富士フイルム和光純薬株式会社）、及び、１００ｎｇ／ｍＬ Ｆｌｔ３－Ｌ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉを用いた合成物、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を添加したものを使用した。
上記培地成分のうち、「Ｆｌｔ３－Ｌ」は、プラズマサイトイド樹状細胞を誘導するためのサイトカインである。
As the cell culture medium, RPMI-1640 medium (Sigma-Aldrich), 10% FCS (fetal bovine serum, biotec), 10 mM HEPES (Thermo Fisher SCIENTIFIC), 5,000 IU / μg penicillin streptomycin (Sigma-Aldrich). ), 50 μM β-mercaptoethanol (Fujifilm Wako Junyaku Co., Ltd.), and 100 ng / mL Flt3-L (composite using Escherichia coli, Miltenyi Biotec) were added.
Among the above-mentioned medium components, "Flt3-L" is a cytokine for inducing plasmacytoid dendritic cells.
（ＩＦＮ－α産生量の測定）
ＩＦＮ－α測定キット（ＰＢＬ）を用いて、ＥＬＩＳＡ法により、各培養上清中のＩＦＮ－α産生量を測定した。
(Measurement of IFN-α production)
Using the IFN-α measurement kit (PBL), the amount of IFN-α produced in each culture supernatant was measured by the ELISA method.
また、以下の試料中のＩＦＮ－α産生量も測定した。以下の試料は、上記「（プラズマサイトイド樹状細胞と乳酸菌との共培養）」と同様の操作によって得られたものである。
陰性対照：細胞培養培地のみ
ＯＫ－４３２：各菌末の代わりに「ピシバニール（登録商標）」を添加して得られた試料である。「ピシバニール（登録商標）」は、乳酸球菌（ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ））を有効成分として含む、市販の抗悪性腫瘍剤及びリンパ管腫治療剤である。
The amount of IFN-α produced in the following samples was also measured. The following samples were obtained by the same operation as the above "(Co-culture of plasmacytoid dendritic cells and lactic acid bacteria)".
Negative control: Cell culture medium only OK-432: A sample obtained by adding "Picibanil (registered trademark)" instead of each bacterial powder. "Picibanil®" is a commercially available antineoplastic agent and a therapeutic agent for lymphangioma containing streptococcus (Streptococcus pyogenes) as an active ingredient.
（ＩＦＮ－α産生量の測定結果）
ＩＦＮ－α産生量の測定結果の一部を表１に示す。ＩＦＮ－α産生量が高いほど、プラズマサイトイド樹状細胞の活性が高いことを意味する。
エンテロコッカス・フェカリス菌のうち、表１の「実施例」に示した菌のみが、高いＩＦＮ－α産生能を有し、プラズマサイトイド樹状細胞を高度に活性化することがわかった。例えば、スクリーニングした５９株のうち、５０ｐｇ／ｍＬ以上のＩＦＮ－αを産生した株は１３株のみで、そのうち、わずか３株が２００ｐｇ／ｍＬ以上ものＩＦＮ－αを産生し、高度にプラズマサイトイド樹状細胞を活性化した。
他方で、多くのエンテロコッカス・フェカリス菌は、例えば、「比較例」の「ＮＢＲＣ １２９７０」のようにＩＦＮ－α産生能が低く、プラズマサイトイド樹状細胞の活性化能力が低かった。
(Measurement result of IFN-α production amount)
Table 1 shows a part of the measurement results of the IFN-α production amount. The higher the amount of IFN-α produced, the higher the activity of plasmacytoid dendritic cells.
It was found that among the Enterococcus faecalis bacteria, only the bacteria shown in "Examples" in Table 1 had a high IFN-α producing ability and highly activated plasmacytoid dendritic cells. For example, of the 59 strains screened, only 13 strains produced IFN-α of 50 pg / mL or more, and only 3 of them produced IFN-α of 200 pg / mL or more, and were highly plasmacytoid. Activated dendritic cells.
On the other hand, many Enterococcus faecalis had a low IFN-α producing ability and a low ability to activate plasmacytoid dendritic cells, for example, "NBRC 12970" in "Comparative Example".
また、エンテロコッカス属に属する乳酸菌であっても、エンテロコッカス・フェカリス菌以外はいずれもＩＦＮ－α産生能が低く、プラズマサイトイド樹状細胞の活性化能力が低かった。 In addition, even among the lactic acid bacteria belonging to the genus Enterococcus, all of them except Enterococcus faecalis had a low IFN-α producing ability and a low ability to activate plasmacytoid dendritic cells.
「ＯＫ－４３２」は、マクロファージの増加効果、ナチュラルキラー細胞等の活性化効果、各種サイトカイン（ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－８、ＩＬ－１２、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α等）の産生誘導効果を有することが知られており、樹状細胞に感作し得ると予測できる。
しかし、予測に反し、「ＯＫ－４３２」には、ＩＦＮ－α産生能がほぼ認められず、プラズマサイトイド樹状細胞を活性化しないことが明らかとなった。
"OK-432" has an effect of increasing macrophages, an effect of activating natural killer cells, and various cytokines (IL-1, IL-2, IL-8, IL-12, IFN-γ, TNF-α, etc.). It is known to have a production-inducing effect and can be predicted to be sensitized to dendritic cells.
However, contrary to expectations, it was revealed that "OK-432" had almost no IFN-α producing ability and did not activate plasmacytoid dendritic cells.
以上より、プラズマサイトイド樹状細胞の高度な活性化能は、多くのエンテロコッカス・フェカリス菌に認められなかったことから、任意の菌株が備えているわけではないことがわかった。
他方で、一部のエンテロコッカス・フェカリス菌は、プラズマサイトイド樹状細胞の高度な活性化能を有し、かかる点は極めて意外な知見である。
From the above, it was found that the high activation ability of plasmacytoid dendritic cells was not observed in many Enterococcus faecalis bacteria, and therefore, it was found that any strain did not have it.
On the other hand, some Enterococcus faecalis have a high ability to activate plasmacytoid dendritic cells, which is a very surprising finding.
＜プラズマサイトイド樹状細胞の確認＞
以下の方法で、上記＜乳酸菌株のスクリーニング＞における骨髄細胞の培養系により、プラズマサイトイド樹状細胞が実際に誘導されていることを確認した。
<Confirmation of plasmacytoid dendritic cells>
By the following method, it was confirmed that plasmacytoid dendritic cells were actually induced by the culture system of bone marrow cells in the above <screening of lactic acid bacteria strain>.
（ＮＢＲＣ１００４８０株の染色）
０．１ｍｇ／ｍＬの蛍光標識試薬「Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ ｉｓｏｍｅｒ Ｉ」（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を、０．１Ｍ 炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．２）に懸濁し、ＦＩＴＣ染色液を作製した。
１ｍｇ／ｍＬのエンテロコッカス・フェカリス菌（ＮＢＲＣ１００４８０株）を、ＦＩＴＣ染色液に懸濁し、常温、暗環境下で６０分間インキュベートした。
ＦＩＴＣ染色したＮＢＲＣ１００４８０株を、ＰＢＳ（－）（日水製薬株式会社）で３回洗浄後、細胞培養培地に再懸濁し、染色したＮＢＲＣ１００４８０株を得た。
(Staining of NBRC100480 strain)
A 0.1 mg / mL fluorescent labeling reagent "Fluorescein isothiocynate isomer I" (Sigma-Aldrich) was suspended in 0.1 M sodium carbonate buffer (pH 9.2) to prepare a FITC stain.
1 mg / mL Enterococcus faecalis (NBRC100480 strain) was suspended in a FITC stain and incubated for 60 minutes at room temperature in a dark environment.
The FITC-stained NBRC100480 strain was washed 3 times with PBS (-) (Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) and then resuspended in a cell culture medium to obtain a stained NBRC100480 strain.
（プラズマサイトイド樹状細胞及び乳酸菌貪食の顕微鏡観察）
染色したＮＢＲＣ１００４８０株を用いて上記「（プラズマサイトイド樹状細胞と乳酸菌との共培養）」と同様に骨髄細胞の調製を行い、ＦＩＴＣ染色したＮＢＲＣ１００４８０株を添加し、３時間培養を行った。
培養した細胞の培地上清をアスピレーターで吸い取り、ＰＢＳ（－）で置換した後、「ＰＥ－Ｃｙ５」（登録商標）標識抗マウスＣＤ４５Ｒ／Ｂ２２０ラット抗体（ＲＡ３－６Ｂ２）（ＢＤ）を用いて、常温、暗環境下で３０分間、培養した細胞に抗体で標識を行った。その後、ＰＢＳ（－）で３回洗浄した後、光学顕微鏡（モデル：ＭＴ４３００Ｌ、メイジテクノ株式会社）で、明視野観察法及び蛍光観察法（４８０ｎｍで励起）に基づき観察した。
(Microscopic observation of plasmacytoid dendritic cells and lactic acid bacteria phagocytosis)
Bone marrow cells were prepared using the stained NBRC100480 strain in the same manner as in the above "(Co-culture of plasmacytoid dendritic cells and lactic acid bacteria)", FITC-stained NBRC100480 strain was added, and the cells were cultured for 3 hours.
The medium supernatant of the cultured cells was sucked up with an aspirator, replaced with PBS (-), and then using a "PE-Cy5" (registered trademark) -labeled anti-mouse CD45R / B220 rat antibody (RA3-6B2) (BD). The cultured cells were labeled with an antibody for 30 minutes at room temperature and in a dark environment. Then, after washing with PBS (−) three times, the observation was carried out with an optical microscope (model: MT4300L, Mage Techno Co., Ltd.) based on a bright-field observation method and a fluorescence observation method (excited at 480 nm).
（フローサイトメトリー分析）
ＮＢＲＣ１００４８０株を用いて上記「（プラズマサイトイド樹状細胞と乳酸菌との共培養）」と同様に培養を行い、ＮＢＲＣ１００４８０株で刺激をかけた細胞培養物を得た。
あわせて、「（ＩＦＮ－α産生量の測定）」と同様に培養を行い、陰性対照の細胞培養物も準備した。
それぞれの細胞培養物を、ＰＢＳ（－）で懸濁し、下記の抗体で標識した。あわせて、下記のアイソタイプコントロールも準備した。各抗体との反応を、常温、暗環境下で３０分行った後、ＰＢＳ（－）で洗浄し、「ＧＵＡＶＡ ＰＣＡ」（ＭＥＲＣＫ）を用いてフローサイトメトリー分析を行った。
［標識抗体］
「ＰＥ－Ｃｙ５」（登録商標）標識抗マウスＣＤ４５Ｒ／Ｂ２２０ラット抗体（ＲＡ３－６Ｂ２）（ＢＤ）
抗ＣＤ１１ｃ抗体（ＫＢ９０）（ａｂｃａｍ）
「Ｃｙ３」（登録商標）標識抗マウスＩｇＧ Ｈ＆Ｌ抗体（ａｂｃａｍ）
［アイソタイプコントロール］
「ＰＥ－Ｃｙ５」（登録商標）標識ラットＩｇＧ２ａ，κアイソタイプコントロール抗体（Ｒ３５－９５）（ＢＤ）
マウスＩｇＧ１，κモノクローナルアイソタイプコントロール抗体（１５－６Ｅ１０Ａ７）（ａｂｃａｍ）
(Flow cytometry analysis)
The NBRC100480 strain was used for culturing in the same manner as in the above "(Co-culture of plasmacytoid dendritic cells and lactic acid bacteria)" to obtain a cell culture stimulated with the NBRC100480 strain.
At the same time, the culture was carried out in the same manner as in "(Measurement of IFN-α production amount)", and a negative control cell culture was also prepared.
Each cell culture was suspended in PBS (-) and labeled with the following antibody. At the same time, the following isotype controls were also prepared. The reaction with each antibody was carried out at room temperature in a dark environment for 30 minutes, washed with PBS (−), and flow cytometric analysis was performed using “GUAVA PCA” (MERCK).
[Labeled antibody]
"PE-Cy5"® labeled anti-mouse CD45R / B220 rat antibody (RA3-6B2) (BD)
Anti-CD11c antibody (KB90) (abcam)
"Cy3"® labeled anti-mouse IgG H & L antibody (abcam)
[Isotype control]
"PE-Cy5"® labeled rat IgG2a, κ isotype control antibody (R35-95) (BD)
Mouse IgG1, κ monoclonal isotype control antibody (15-6E10A7) (abcam)
（顕微鏡観察の結果）
明視野観察法での観察の結果、プラズマサイトイド樹状細胞の特徴である球状の細胞を確認した。さらに、活性化されたプラズマサイトイド樹状細胞に生じる突起も確認した。
蛍光観察法での観察の結果、明視野観察法での観察でプラズマサイトイド樹状細胞の特徴が認められた細胞に、「ＰＥ－Ｃｙ５」による蛍光を確認し、Ｂ２２０が発現していることを確認した。Ｂ２２０はマウス由来の樹状細胞のうち、プラズマサイトイド樹状細胞に特徴的に発現するマーカーである。この結果から、観察した細胞がプラズマサイトイド樹状細胞であることを確認した。さらに、ＦＩＴＣ染色したＮＢＲＣ１００４８０株がプラズマサイトイド樹状細胞に貪食されている様子も確認した。
(Results of microscopic observation)
As a result of observation by the bright field observation method, spherical cells, which are characteristic of plasmacytoid dendritic cells, were confirmed. In addition, we also identified protrusions on activated plasmacytoid dendritic cells.
As a result of observation by the fluorescence observation method, fluorescence by "PE-Cy5" was confirmed in the cells in which the characteristics of plasmacytoid dendritic cells were observed by the observation by the bright field observation method, and B220 was expressed. It was confirmed. B220 is a marker characteristically expressed in plasmacytoid dendritic cells among mouse-derived dendritic cells. From this result, it was confirmed that the observed cells were plasmacytoid dendritic cells. Furthermore, it was confirmed that the FITC-stained NBRC100480 strain was phagocytosed by plasmacytoid dendritic cells.
また、本試験系では、プラズマサイトイド樹状細胞だけではなく、ミエロイド系樹状細胞も生育し得る。
実際、明視野観察法での観察の結果、ミエロイド系樹状細胞と思われる枝状の突起を有する細胞を観察した。
蛍光観察法での観察の結果、ミエロイド系樹状細胞と思われる細胞には「ＰＥ－Ｃｙ５」による蛍光は確認できなかったため、Ｂ２２０は発現していないことが確認できた。さらに、ＦＩＴＣ染色したＮＢＲＣ１００４８０株がミエロイド系樹状細胞に貪食されている様子を確認した。
Further, in this test system, not only plasmacytoid dendritic cells but also myeloid dendritic cells can grow.
In fact, as a result of observation by the bright field observation method, cells having branch-like protrusions, which are considered to be myeloid dendritic cells, were observed.
As a result of observation by the fluorescence observation method, fluorescence by "PE-Cy5" could not be confirmed in the cells considered to be myeloid dendritic cells, so that it was confirmed that B220 was not expressed. Furthermore, it was confirmed that the FITC-stained NBRC100480 strain was phagocytosed by myeloid dendritic cells.
以上より、ＮＢＲＣ１００４８０株がプラズマサイトイド樹状細胞に認識され、貪食されることで、活性化していることを確認した。 From the above, it was confirmed that the NBRC100480 strain was recognized and phagocytosed by plasmacytoid dendritic cells and activated.
（フローサイトメトリー分析の結果）
表２にフローサイトメトリーの結果を示す。アイソタイプコントロールの測定結果に基づき設定した蛍光強度より、ＣＤ１１ｃ＋Ｂ２２０＋細胞をプラズマサイトイド樹状細胞として解析した。
陰性対照では、プラズマサイトイド樹状細胞が全体細胞に対して１．３％存在していた。このことから、骨髄細胞からプラズマサイトイド樹状細胞が誘導されていることを確認した。
また、ＮＢＲＣ１００４８０株の細胞培養物では、プラズマサイトイド樹状細胞が全体細胞に対して３．３％存在していた。この値は、陰性対照における値よりも高い。したがって、ＮＢＲＣ１００４８０株がプラズマサイトイド樹状細胞を刺激し、活性化することにより、その存在割合が増加することを確認した。
(Results of flow cytometry analysis)
Table 2 shows the results of flow cytometry. From the fluorescence intensity set based on the measurement results of the isotype control, CD11c + B220 + cells were analyzed as plasmacytoid dendritic cells.
In the negative control, plasmacytoid dendritic cells were present at 1.3% of the total cells. From this, it was confirmed that plasmacytoid dendritic cells were induced from bone marrow cells.
Further, in the cell culture of the NBRC100480 strain, plasmacytoid dendritic cells were present in 3.3% of the total cells. This value is higher than the value in the negative control. Therefore, it was confirmed that the NBRC100480 strain stimulates and activates plasmacytoid dendritic cells, thereby increasing the abundance ratio.
＜ヒトの唾液中分泌型ＩｇＡ測定試験＞
上記＜乳酸菌株のスクリーニング＞において、高いＩＦＮ－α産生能が確認されたエンテロコッカス・フェカリス菌から免疫賦活用組成物を調製した。該免疫賦活用組成物をヒトに投与し、唾液中分泌型ＩｇＡ（ｓ－ＩｇＡ）量を評価した。
<Human saliva secretion type IgA measurement test>
An immunostimulatory composition was prepared from Enterococcus faecalis, which was confirmed to have a high IFN-α producing ability in the above <screening of lactic acid bacteria strain>. The immunostimulatory composition was administered to humans and the amount of salivary secretory IgA (s-IgA) was evaluated.
（免疫賦活用組成物の作製）
エンテロコッカス・フェカリス菌（ＮＢＲＣ１００４８０株）の菌末の菌数を、「バクテリアカウンター」（サンリード硝子有限会社）を用いて測定した。
次いで、菌数が１，０００億個となるように、菌末を、賦形剤であるデキストリン（「デキストリンＮＳＤ３００」、サンエイ糖化株式会社）中に分散させ、乳酸菌含有試験食品を作製した。
該乳酸菌含有試験食品は、本発明の免疫賦活用組成物に相当する。
(Preparation of immunostimulatory composition)
The number of bacterial powders of Enterococcus faecalis (NBRC100480 strain) was measured using a "bacterial counter" (Sunlead Glass Co., Ltd.).
Next, the bacterial powder was dispersed in dextrin (“dextrin NSD300”, Sanei Saccharification Co., Ltd.) as an excipient so that the number of bacteria was 100 billion, and a lactic acid bacterium-containing test food was prepared.
The lactic acid bacterium-containing test food corresponds to the immunostimulatory composition of the present invention.
（免疫賦活用組成物の投与）
健康な２０～５０歳の男女（８名）に、免疫賦活用組成物を２週間毎日摂取させた。
摂取前、及び摂取２週間後の各時点で被験者から唾液を採取した。
唾液採取は、朝食後２時間を経過しており、かつ、唾液採取前１時間は飲食をしていない状態で、午前１０時に行った。唾液採取には唾液採取キット（ＳＡＬＩＭＥＴＲＩＣＳ）を用いて流延で行った。
(Administration of immunostimulatory composition)
Healthy men and women aged 20 to 50 (8) were given the immunostimulatory composition daily for 2 weeks.
Saliva was collected from the subjects before ingestion and at each time point 2 weeks after ingestion.
Saliva collection was performed at 10 am, 2 hours after breakfast and 1 hour before saliva collection without eating or drinking. Saliva collection was performed by infusion using a saliva collection kit (SALIMETRICS).
（唾液中分泌型ＩｇＡ量の測定）
各唾液中の分泌型ＩｇＡ量を、ｓ－ＩｇＡ測定キット（Ｉｍｍｕｎｄｉａｇｎｏｓｔｉｋ ＧｍｂＨ）を用いて、ＥＬＩＳＡ法で測定した。
測定結果について、「ＢｅｌｌＣｕｒｖｅ ｆｏｒ Ｅｘｃｅｌ（ｖｅｒｓｉｏｎ ３．２１）」（Ｓｏｃｉａｌ Ｓｕｒｖｅｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．）を用いて、ｔ検定を行い、統計解析した（＊有意差あり、ｐ＜０．０５）。
(Measurement of saliva secretory IgA amount)
The amount of secreted IgA in each saliva was measured by the ELISA method using an s-IgA measurement kit (Immundiagnostic GmbH).
The measurement results were subjected to t-test using "BellCurve for Excel (version 3.21)" (Social Survey Research Information Co., Ltd.) and statistically analyzed (* significantly different, p <0.05). ..
（唾液中分泌型ＩｇＡ量の測定結果）
唾液中分泌型ＩｇＡ量の測定結果を表３に示す。
摂取前に平均６．０ｍｇ／ｄＬであった唾液中分泌型ＩｇＡ量が、摂取２週間後には平均１１．４ｍｇ／ｄＬまで有意（Ｐ＜０．０５）に増加した。
この結果から、本発明の免疫賦活用組成物は、唾液中の分泌型ＩｇＡ量を増加させることが示された。
(Measurement result of saliva secretion type IgA amount)
Table 3 shows the measurement results of the amount of salivary secretory IgA.
The salivary secretory IgA amount, which was 6.0 mg / dL on average before ingestion, increased significantly (P <0.05) to 11.4 mg / dL on average 2 weeks after ingestion.
From this result, it was shown that the immunostimulatory composition of the present invention increases the amount of secreted IgA in saliva.
また、被験者に対し、摂取前と比べて摂取２週間後の体調の変化に関するアンケートもあわせて行った。
その結果、摂取前と比べ、摂取２週間後では、８名中５名が鼻水、倦怠感、疲労感、寒気、のどの痛み、咳等が軽減されたと回答した。
また、残りの３名も良好な体調を維持していた。
In addition, a questionnaire was also given to the subjects regarding changes in their physical condition two weeks after ingestion compared to before ingestion.
As a result, 5 out of 8 respondents answered that their runny nose, fatigue, tiredness, chills, sore throat, cough, etc. were alleviated 2 weeks after ingestion compared to before ingestion.
In addition, the remaining three people also maintained good physical condition.
以上から、本発明の免疫賦活用組成物を摂取することで、風邪様症状の緩和効果やウイルス感染予防効果や、健康な体調の維持効果が期待できる。 From the above, ingestion of the immunostimulatory composition of the present invention can be expected to have an effect of alleviating cold-like symptoms, an effect of preventing virus infection, and an effect of maintaining a healthy physical condition.
Claims (4)
Enterococcus faecalis, 20 μg / mL of Enterococcus faecalis, and 5 × 10 5 cells / mL of plasmacytoid dendritic cells derived from bone marrow cells are co-cultured to obtain an IFN of 50 pg / mL or more. Virus infection preventive agents including Enterococcus faecalis having the ability to activate plasmacytoid dendritic cells represented by an index producing α (excluding NBRC 3989 fermented immunostimulators for fish and shellfish). ) .
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