JP2018083775A - Differentiation inhibition composition into mucous membrane type mast cell - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、粘膜型マスト細胞への分化を抑制するための組成物に関する。 The present invention relates to a composition for inhibiting differentiation into mucosal mast cells.
マスト細胞（Ｍａｓｔ Ｃｅｌｌｓ；ＭＣｓ；肥満細胞）は、造血系幹細胞に由来する血球系細胞の一種であり、マクロファージや樹状細胞などのその他の免疫細胞と同様に生体内の様々な組織に分布している。マスト細胞は、各組織において、マスト細胞前駆体（ＭＣＰ）から誘導されるが、各組織においてみられるマスト細胞の表現型は異なる。これは、マスト細胞が多様性（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ）を有しているからである（例えば、非特許文献１を参照）。 Mast cells (MCs; mast cells) are a type of blood cell derived from hematopoietic stem cells, and are distributed in various tissues in the living body like other immune cells such as macrophages and dendritic cells. ing. Mast cells are derived from mast cell precursors (MCP) in each tissue, but the mast cell phenotypes found in each tissue are different. This is because mast cells have diversity (see, for example, Non-Patent Document 1).
マスト細胞は、多様性を有していることにより、同一の組織又は培養容器内においてさえ、同一の刺激に対して相違する反応を示し得る。換言すれば、同一の表現型を有するマスト細胞を得ることは非常に難しい。かかる状況下において、非特許文献１には、Ｔ細胞由来のサイトカインの一種であるインターロイキン（ＩＬ）−３の存在下で、骨髄中のＭＣＰを培養することにより、骨髄由来型マスト細胞（Ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ−ｄｅｒｉｖｅｄ ＭＣ；ＢＭＭＣ）が得られることが記載されている。ＢＭＭＣは、異質性があり、かつ、未成熟であり、さらに表現型が様々な培養添加物により変化し得る細胞である。例えば、ＢＭＭＣを線維芽細胞と共培養することにより、成熟したマスト細胞の一種である結合組織型マスト細胞の表現型を示す。 Due to diversity, mast cells can exhibit different responses to the same stimulus, even within the same tissue or culture vessel. In other words, it is very difficult to obtain mast cells having the same phenotype. Under such circumstances, Non-Patent Document 1 discloses that bone marrow-derived mast cells (Bone) are obtained by culturing MCP in bone marrow in the presence of interleukin (IL) -3, which is a kind of cytokine derived from T cells. marrow-derived MC (BMMC) is obtained. BMMC are cells that are heterogeneous and immature and whose phenotype can be altered by various culture additives. For example, by co-culturing BMMC with fibroblasts, the phenotype of connective tissue type mast cells, which are a type of mature mast cells, is shown.
成熟したマスト細胞の一種として、粘膜型マスト細胞（ｍｕｃｏｓａｌ ＭＣｓ）がある。結合組織型マスト細胞が皮膚や血管内に局在化するのに対して、粘膜型マスト細胞は、生体内の粘膜組織に局在しており、ＩｇＥに対して高い親和性のあるＩｇＥ受容体（ＦｃεＲＩα）を細胞表面に発現している。マウスにおいては、粘膜型マスト細胞は、ＭＭＣＰ−１などのキマーゼを発現する。このＦｃεＲＩαに、アレルゲンとＩｇＥとが免疫複合体を形成して架橋することにより、様々な応答が引き起こされる。そのような応答の結果にもたらされるものとして、例えば、腸内組織における粘膜型マスト細胞が関与する食物アレルギーがある。食物アレルギーは、食物に由来する物質がアレルゲンとなり、ＩｇＥと免疫複合体を形成して、ＦｃεＲＩαと架橋することにより、腸内組織における粘膜型マスト細胞が活性化することにより発症する。 One type of mature mast cell is mucosal mast cells (mucosal MCs). While connective tissue type mast cells are localized in the skin and blood vessels, mucosal type mast cells are localized in mucosal tissues in the body and have high affinity for IgE. (FcεRIα) is expressed on the cell surface. In mice, mucosal mast cells express a chymase such as MMCP-1. Allergens and IgE form immune complexes and cross-link to FcεRIα to cause various responses. As a result of such a response, for example, there is a food allergy involving mucosal mast cells in the intestinal tissue. Food allergy is caused by activation of mucosal mast cells in the intestinal tissue by forming substances derived from food as allergens, forming immune complexes with IgE, and crosslinking with FcεRIα.
粘膜型マスト細胞の活性化は、ヒスタミン、エフェクタープロテアーゼ、ヘパリンなどの炎症性メディエータを遊離する脱顆粒、ＴＮＦ−α、ＩＬ−４、ＩＬ−１３、ＩＬ−６、ＩＬ−３及びケモカインなどの炎症性サイトカインの産生、血小板活性化因子、プロスタグランジン、ロイコトリエンなどの脂質メディエータの産生などをもたらし、生体におけるアレルギー反応を惹起する（非特許文献２を参照）。 Activation of mucosal mast cells is caused by degranulation that releases inflammatory mediators such as histamine, effector protease, heparin, inflammation such as TNF-α, IL-4, IL-13, IL-6, IL-3 and chemokines. This causes production of sex cytokines, production of lipid mediators such as platelet activating factor, prostaglandins and leukotrienes, and induces allergic reactions in the living body (see Non-Patent Document 2).
一方、発酵食品の代表的なものとして、しょうゆがある。大部分のしょうゆは、大豆や小麦などの麦を原料として麹菌などにより発酵及び熟成させて得られる。特許文献１には、しょうゆに含まれる高分子多糖類の中には、マクロファージの活性化作用及びＰＣＡ反応抑制作用を示すものがあることが記載されている。 On the other hand, soy sauce is a typical fermented food. Most soy sauce is obtained by fermenting and ripening with wheat or the like using wheat such as soybeans and wheat as raw materials. Patent Document 1 describes that some high molecular polysaccharides contained in soy sauce exhibit macrophage activation and PCA reaction-suppressing effects.
上記のとおり、粘膜型マスト細胞は、腸管などの粘膜組織に局在化し、アレルゲンが粘膜組織に到達することによるアレルギーの発症に関与し得る。そこで、粘膜組織を介したアレルギーを抑制するためには、異常に増加した粘膜型マスト細胞の割合を減少させることが肝要である。また、アレルギーを発症していなくとも、粘膜型マスト細胞の割合を正常な値に維持することもまた肝要である。 As described above, mucosal mast cells are localized in mucosal tissues such as the intestinal tract, and can be involved in the development of allergies due to the allergen reaching the mucosal tissues. Therefore, in order to suppress allergy via mucosal tissue, it is important to reduce the proportion of abnormally increased mucosal mast cells. It is also important to maintain the ratio of mucosal mast cells at a normal value even if no allergy has occurred.
特に、粘膜組織を介したアレルギーとしては、食物を摂取することにより発症する食物アレルギーがある。そこで、食物アレルギーを誘起する食物性アレルゲンと同時的かつ日常的に摂取することにより、粘膜型マスト細胞の異常増加を抑制し、かつ、粘膜型マスト細胞の割合を正常な値に維持することにより、アレルギー疾患になりにくい体質作りに貢献できれば、食物アレルギーの罹患者の健康や福祉に資することができ、有益である。しかし、非特許文献１及び２並びに特許文献１を含めて、日常の食事の際に摂取することができ、かつ、粘膜型マスト細胞への分化を抑制して、細胞あたりの粘膜型マスト細胞の割合を減少させ得るものはこれまでに知られていない。 In particular, as an allergy through mucosal tissue, there is a food allergy that develops by ingesting food. Therefore, by taking the food allergen that induces food allergy simultaneously and on a daily basis, by suppressing the abnormal increase in mucosal mast cells and maintaining the ratio of mucosal mast cells at a normal value If it can contribute to the creation of a constitution that is unlikely to cause allergic diseases, it can contribute to the health and welfare of those suffering from food allergies. However, including Non-Patent Documents 1 and 2 and Patent Document 1, it can be ingested at the time of daily meals and suppresses differentiation into mucosal mast cells, so that mucosal mast cells per cell Nothing has ever been known that could reduce the rate.
そこで、本発明が解決しようとする課題は、食事の用に供することができ、かつ、細胞あたりの粘膜型マスト細胞の割合を減少させることができる組成物を提供することにある。 Therefore, the problem to be solved by the present invention is to provide a composition that can be used for meals and can reduce the ratio of mucosal mast cells per cell.
大豆の発酵物及び麦の発酵物において、大豆アレルゲン及び麦アレルゲンは発酵を通じて大幅に減少していることがＥＬＩＳＡ法などにより確認されている。したがって、大豆アレルゲンや麦アレルゲンに敏感に応答する個体において、発酵を通じて大豆アレルゲンや麦アレルゲンが分解した大豆の発酵物及び麦の発酵物を摂取したとしても、アレルギーの症状が見られる可能性が低いと考えられる。 In the fermented soybean and the fermented wheat, it has been confirmed by the ELISA method that the soybean allergen and the wheat allergen are significantly reduced through fermentation. Therefore, in individuals who respond sensitively to soy allergens and barley allergens, even if they consume fermented soybeans and fermented wheats that have been decomposed through fermentation, the allergic symptoms are unlikely to be seen it is conceivable that.
本発明者らは鋭意研究を積み重ねた結果、大豆の発酵物や麦の発酵物を含むしょうゆなどの発酵食品は、該発酵食品の後に摂取した小麦アレルゲンに対する免疫寛容がみられ、さらにアレルギーの発症を低めること、すなわち、アレルギーの発症に抑制的に作用し得ることを見出した。そして、さらに鋭意研究を進めていくうちに、粘膜型マスト細胞に着目するに至り、粘膜型マスト細胞への分化誘導方法及び粘膜型マスト細胞の製造方法を創作することを試みた。 As a result of intensive studies, the present inventors have found that fermented foods such as soy sauce containing fermented soybeans and fermented wheat have immune tolerance to wheat allergens ingested after the fermented foods, and further development of allergies. It has been found that it can act to suppress the onset of allergies. And while further researching, it came to focus on mucosal mast cells, and tried to create a method for inducing differentiation into mucosal mast cells and a method for producing mucosal mast cells.
その結果、ＢＭＭＣと同様の性質を有する未成熟マスト細胞株とＩＬ−１０とを接触させることにより安定的に粘膜型マスト細胞の割合を高め得ることを見出した。この知見を基に製造された粘膜型マスト細胞を用いて検討を重ねた結果、発酵食品に含まれる大豆の発酵物及び麦の発酵物は、未成熟細胞から粘膜型マスト細胞への異常な分化を抑制することや粘膜型マスト細胞の割合を正常な値に維持することを通じて、細胞あたりの粘膜型マスト細胞の割合を減少させることにより、大豆アレルゲンや小麦アレルゲンなどの食物性アレルゲンが作用する細胞の数を減じることができ、アレルギーに対して抑制的に作用する可能性があることを見出した。 As a result, it was found that the ratio of mucosal mast cells can be stably increased by contacting IL-10 with an immature mast cell line having the same properties as BMMC. As a result of repeated studies using mucosal mast cells produced based on this knowledge, fermented soybeans and fermented wheat contained in fermented foods are abnormally differentiated from immature cells to mucosal mast cells. By reducing the percentage of mucosal mast cells per cell by suppressing the level of mucosal mast cells and suppressing the rate of mucosal mast cells, cells that act as food allergens such as soybean allergen and wheat allergen It has been found that there is a possibility of reducing the number of allergies, which may act to suppress allergies.
そして、これらの知見を基に、本発明者らは、大豆の発酵物及び麦の発酵物を利用した、粘膜型マスト細胞への分化抑制用組成物及び抗アレルギー用組成物を創作することに成功した。本発明はこれらの知見及び成功例に基づいて完成するに至った発明である。 Based on these findings, the present inventors have created a composition for inhibiting differentiation into mucosal mast cells and a composition for antiallergy using fermented soybeans and fermented wheat. Successful. The present invention has been completed based on these findings and successful examples.
したがって、本発明の各一態様によれば、以下のものが提供される：
［１］大豆の発酵物及び麦の発酵物を有効成分として含有する、粘膜型マスト細胞への分化抑制用組成物。
［２］前記組成物は、しゅうゆ又はみそである、［１］に記載の粘膜型マスト細胞への分化抑制用組成物。
［３］前記しょうゆは、こいくちしょうゆ、うすくちしょうゆ、たまりしょうゆ、さいしこみしょうゆ及びしろしょうゆからなる群から選ばれるしょうゆである、［２］に記載の粘膜型マスト細胞への分化抑制用組成物。
［４］前記組成物は、インターロイキン−３及びインターロイキン−１０の存在下で、未成熟マスト細胞株から粘膜型マスト細胞への分化を抑制する作用を有する組成物である、［１］〜［３］のいずれか１項に記載の粘膜型マスト細胞への分化抑制用組成物。
［５］［１］〜［４］のいずれか１項に記載の組成物を有効成分として含有する、抗アレルギー用組成物。
［６］前記抗アレルギー用組成物は、食物アレルギーを発症している者又は該食物アレルギーを発症する可能性がある者に摂取される抗アレルギー用組成物である、［５］に記載の抗アレルギー用組成物。
［７］前記抗アレルギー用組成物は、食物性アレルゲンを含有する食品と併用される抗アレルギー用組成物である、［５］又は［６］に記載の抗アレルギー用組成物。
［８］前記抗アレルギー用組成物は、粘膜組織を介するアレルギーを対象とする抗アレルギー用組成物である、［５］〜［７］のいずれか１項に記載の抗アレルギー用組成物。
Therefore, according to each aspect of the present invention, the following is provided:
[1] A composition for inhibiting differentiation into mucosal mast cells, comprising fermented soybeans and fermented wheat as active ingredients.
[2] The composition for inhibiting differentiation into mucosal mast cells according to [1], wherein the composition is mushroom or miso.
[3] The composition for suppressing differentiation into mucosal mast cells according to [2], wherein the soy sauce is soy sauce selected from the group consisting of koikuchi soy sauce, thin soy sauce, tamari soy sauce, saiko soy sauce and white soy sauce. object.
[4] The composition is a composition having an action of suppressing differentiation from an immature mast cell line to a mucosal mast cell in the presence of interleukin-3 and interleukin-10. The composition for inhibiting differentiation into mucosal mast cells according to any one of [3].
[5] An antiallergic composition comprising the composition according to any one of [1] to [4] as an active ingredient.
[6] The antiallergic composition according to [5], wherein the antiallergic composition is an antiallergic composition that is taken by a person who has developed a food allergy or a person who may develop the food allergy. Allergy composition.
[7] The antiallergic composition according to [5] or [6], wherein the antiallergic composition is an antiallergic composition used in combination with a food containing a food allergen.
[8] The antiallergic composition according to any one of [5] to [7], wherein the antiallergic composition is an antiallergic composition intended for allergy via mucosal tissue.
本発明の一態様である組成物は、有効成分による粘膜型マスト細胞への分化を抑制する作用及び抗アレルギー作用を通じて、粘膜性のアレルギーや該アレルギーと関連する炎症、例えば、食物アレルギー、花粉症、胃炎、腸炎、下痢、潰瘍性大腸炎、鼻炎、気管支炎、気管支喘息、レフレル症候群、口内炎などによる症状や自己免疫症状を改善、緩和、抑制、治療若しくは予防すること、又は免疫療法の用に供することが期待できる。 The composition which is one embodiment of the present invention has a mucosal allergy and inflammation associated with the allergy, such as food allergies and hay fever, by inhibiting the differentiation into mucosal mast cells by an active ingredient and an antiallergic effect. For improving, alleviating, suppressing, treating or preventing symptoms or autoimmune symptoms such as gastritis, enteritis, diarrhea, ulcerative colitis, rhinitis, bronchitis, bronchial asthma, refrell syndrome, stomatitis, etc., or for immunotherapy It can be expected to serve.
特に、食物アレルギーの発症者にとって、アレルゲン除去食品の摂取は該発症者やその周囲の者にとって負担が甚大である。そこで、アレルギーを抑制する作用を示し得る本発明の一態様である組成物によれば、他の飲食品と併用することにより、食物アレルギーに関連する症状を減弱することが期待できる。 In particular, for those suffering from food allergies, the consumption of allergen-removed foods is a significant burden on those who are affected and those around them. Therefore, according to the composition which is one embodiment of the present invention that can exhibit an action of suppressing allergy, it can be expected that symptoms associated with food allergy are attenuated by using it together with other food and drink.
以下、本発明の一態様である粘膜型マスト細胞への分化抑制用組成物及び抗アレルギー用組成物（以下、これらをまとめて本発明の一態様の組成物と総称する場合がある。）の詳細並びに本発明の一態様である粘膜型マスト細胞への分化誘導方法及び粘膜型マスト細胞の製造方法の詳細について説明するが、本発明の技術的範囲は本項目の事項によってのみに限定されるものではなく、本発明はその目的を達成する限りにおいて種々の態様をとり得る。 Hereinafter, the composition for inhibiting differentiation into mucosal mast cells and the composition for antiallergy which are one embodiment of the present invention (hereinafter, these may be collectively referred to as the composition of one embodiment of the present invention). The details and the details of the method for inducing differentiation into mucosal mast cells and the method for producing mucosal mast cells which are one embodiment of the present invention will be described, but the technical scope of the present invention is limited only by the matters of this item. However, the present invention can take various forms as long as the object is achieved.
本発明の一態様は、大豆の発酵物及び麦の発酵物を有効成分として含有する、粘膜型マスト細胞への分化抑制用組成物である。 One aspect of the present invention is a composition for inhibiting differentiation into mucosal mast cells, containing fermented soybeans and fermented wheat as active ingredients.
本明細書における各用語は、別段の定めがない限り、当業者により通常用いられている意味で使用され、不当に限定的な意味を有するものとして解釈されるべきではない。 Each term in this specification is used in the meaning normally used by those skilled in the art unless otherwise specified, and should not be construed as having an unduly limiting meaning.
例えば、分化とは、一般的に、特性をもたない細胞が様々な特性を持つ細胞に変化することをいうところ、本明細書における「分化」は、ある特性を有する細胞が別の特性を有する細胞に転じることを広く意味することに加え、一般に分化細胞として知られている２種の細胞の間での、可逆的又は不可逆的な相互の転換をも含む、より広範な概念として用いられ得る。本明細書における「分化を抑制する」とは、分化することを妨げることに加えて、分化前の状態に維持すること、分化後の状態を分化前の状態に戻すことなどを含み得る。また、本明細書における「分化を誘導する」とは、分化を引き起こすことに加えて、分化することを妨げないことなどを含み得る。 For example, differentiation generally means that a cell having no characteristic changes to a cell having various characteristics. In this specification, “differentiation” means that a cell having a certain characteristic has another characteristic. In addition to its broad meaning to turn into cells, it is used as a broader concept, including reversible or irreversible reciprocal transformations between two types of cells commonly known as differentiated cells. obtain. As used herein, “suppressing differentiation” may include, in addition to preventing differentiation, maintaining a state before differentiation, returning a state after differentiation to a state before differentiation, and the like. In addition, “inducing differentiation” in the present specification may include, in addition to causing differentiation, not preventing differentiation.
例えば、「組成物」は、通常用いられている意味のものとして特に限定されないが、例えば、２種以上の物質が組み合わさってなる物であり、具体的には、有効成分と別の物質とが組み合わさってなるもの、有効成分の２種以上が組み合わさってなるものなどが挙げられ、より具体的には、有効成分の１種以上と固形物又は溶媒の１種以上とが組み合わさってなる固形組成物及び液性組成物などが挙げられる。 For example, the “composition” is not particularly limited as a meaning that is usually used. For example, the “composition” is a combination of two or more substances, specifically, an active ingredient and another substance. In combination, two or more active ingredients are combined, and more specifically, one or more active ingredients are combined with one or more solids or solvents. And solid compositions and liquid compositions.
粘膜型マスト細胞への分化抑制用組成物は、含有する有効成分が機能することにより、粘膜型マスト細胞への分化抑制作用を示す。 The composition for inhibiting differentiation into mucosal mast cells exhibits an action of inhibiting differentiation into mucosal mast cells when the active ingredient contained therein functions.
大豆の発酵物は、通常知られているとおりに、大豆に微生物を作用させて大豆中の物質を分解及び／又は変換することなどにより得られる発酵物であれば特に限定されない。同様に、麦の発酵物は、通常知られているとおりに、小麦、大麦、裸麦、はと麦などの麦に微生物を作用させて麦中の物質を分解及び／又は変換することなどにより得られる発酵物であれば特に限定されない。 As is generally known, fermented soybeans are not particularly limited as long as they are fermented products obtained by causing microorganisms to act on soybeans to decompose and / or convert substances in soybeans. Similarly, fermented wheat can be obtained by causing microorganisms to act on wheat such as wheat, barley, bare wheat, and hato-barley to decompose and / or convert substances in the wheat, as is generally known. It is not particularly limited as long as it is a fermented product.
本発明の一態様の組成物は、大豆の発酵物及び麦の発酵物を含有するものであれば特に限定されないが、例えば、しょうゆ、みそ及びこれらを含有する飲食品やこれらを用いて調理や加工された飲食品などが挙げられ、調理の際や他の食材や食品とともに用いられるしょうゆ及びみそであることが好ましい。 The composition of one embodiment of the present invention is not particularly limited as long as it contains a fermented soybean product and a fermented wheat product. For example, soy sauce, miso, foods and drinks containing these, and cooking or Examples include processed foods and drinks, and soy sauce and miso used in cooking and with other foods and foods.
しょうゆやみそは、通常知られているとおりのものであれば特に限定されず、例えば、農林水産省により示されている「しょうゆ品質表示基準」や「みそ品質表示基準」において定義付けされているものを挙げることができる。 Soy sauce and miso are not particularly limited as long as they are normally known. For example, soy sauce and miso are defined in the “soy sauce quality labeling standard” and “miso quality labeling standard” provided by the Ministry of Agriculture, Forestry and Fisheries. Things can be mentioned.
しょうゆの具体例としては、例えば、こいくちしょうゆ、うすくちしょうゆ、たまりしょうゆ、さいしこみしょうゆ、しろしょうゆ、だししょうゆ、照りしょうゆ、生揚げしょうゆなどが挙げられ、粘膜型マスト細胞への分化抑制作用の強度の観点からこいくちしょうゆ、うすくちしょうゆ、たまりしょうゆ、さいしこみしょうゆ及びしろしょうゆが好ましいが、これらに限定されない。しょうゆは、上記の例示したしょうゆなどをさらなる加工処理に供したものであってもよい。このような加工処理は特に限定されないが、例えば、脱塩処理や希釈処理などが挙げられる。また、しょうゆは、しょうゆ中の特定の成分を減少若しくは排除又はしょうゆに特定の成分を追加する意図をもって製造したしょうゆであってもよく、例えば、無塩下又は減塩下で製造したしょうゆ、トマトなどの野菜成分を追加するように製造したしょうゆなどが挙げられる。しょうゆは、これらのうちの１種を単独で、又は２種以上を組み合わせて使用できる。 Specific examples of soy sauce include, for example, koikuchi soy sauce, thin soy sauce, tamari soy sauce, saiko soy sauce, white soy sauce, dashi soy sauce, shimmered soy sauce, and fried soy sauce. From the viewpoint of strength, preferred are soy sauce, thin soy sauce, tamari soy sauce, sweet soy sauce and white soy sauce, but are not limited thereto. Soy sauce may be obtained by subjecting the soy sauce exemplified above to further processing. Such processing is not particularly limited, and examples thereof include desalting and dilution. In addition, soy sauce may be soy sauce produced with the intention of reducing or eliminating specific ingredients in soy sauce or adding specific ingredients to soy sauce, for example, soy sauce produced under no salt or low salt, tomato And soy sauce made with added vegetable ingredients. Soy sauce can be used alone or in combination of two or more.
大豆の発酵物、麦の発酵物及びこれらを含有する組成物は、その入手方法について特に限定されず、例えば、市販されているものや当業者により通常知られている手法により製造したものなどを利用することができる。例えば、しょうゆは、本願出願人であるキッコーマン社から市販されているものを挙げることができ、具体的には「キッコーマン しょうゆ」、「キッコーマン 特選丸大豆しょうゆ」、「キッコーマン 特選丸大豆減塩しょうゆ」、「キッコーマン 減塩しょうゆ」、「キッコーマン 特選有機しょうゆ」、「キッコーマン うすくちしょうゆ」などが挙げられるが、これらに限定されない。 The fermented soybeans, fermented wheat, and compositions containing these are not particularly limited in terms of the method of obtaining them, such as those that are commercially available or those that are produced by techniques commonly known by those skilled in the art. Can be used. Examples of soy sauce include those commercially available from Kikkoman Corporation, the applicant of this application. Specifically, “Kikkoman soy sauce”, “Kikkoman specialty soy sauce”, “Kikkoman soy sauce soy sauce” , “Kikkoman low salt soy sauce”, “Kikkoman specialty organic soy sauce”, “Kikkoman light soy sauce”, etc., but are not limited thereto.
粘膜型マスト細胞への分化抑制作用は、非粘膜型マスト細胞から粘膜型マスト細胞への分化を抑制する作用であって、結果として粘膜型マスト細胞の割合を低め得る作用であれば、その作用機序、合わせて伴う他の作用、程度などについては特に限定されない。粘膜型マスト細胞への分化抑制作用としては特に限定されないが、例えば、非粘膜型マスト細胞の増殖に適した条件下や非粘膜型マスト細胞から粘膜型マスト細胞への分化に適した条件下における、非粘膜型マスト細胞から粘膜型マスト細胞への分化を抑制する作用が挙げられる。 A mucosal mast cell differentiation inhibitory action is an action that suppresses the differentiation of non-mucosal mast cells into mucosal mast cells, and as a result can reduce the proportion of mucosal mast cells. There is no particular limitation on the mechanism, other actions, the degree, etc. that accompany it. Although it is not particularly limited as an action to suppress differentiation into mucosal mast cells, for example, under conditions suitable for proliferation of non-mucosal mast cells or conditions suitable for differentiation from non-mucosal mast cells to mucosal mast cells And the action of suppressing differentiation from non-mucosal mast cells to mucosal mast cells.
粘膜型マスト細胞への分化抑制作用は、例えば、後述する本発明の粘膜型マスト細胞への分化誘導方法において、未成熟マスト細胞株から粘膜型マスト細胞への分化を抑制する作用であることが好ましい。未成熟マスト細胞株の具体的な例としては、ＦｃεＲＩα及びｃ−Ｋｉｔを発現し、かつ、ＭＭＣＰ（Ｍｏｕｓｅ Ｍａｓｔ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｔｅａｓｅ）−１、ＭＭＣＰ−２、ＭＭＣＰ−３、ＭＭＣＰ−４、ＭＭＣＰ−５、ＭＭＣＰ−６及びカルボキシペプチダーゼＡを実質的に発現しない未成熟マスト細胞株などが挙げられ、より具体的な例としてはマウスの肝臓に由来するマスト細胞を株化したＭＣ／９細胞などが挙げられる。 The action of inhibiting differentiation into mucosal mast cells may be, for example, an action of inhibiting differentiation from an immature mast cell line into mucosal mast cells in the method for inducing differentiation into mucosal mast cells of the present invention described later. preferable. Specific examples of immature mast cell lines include FcεRIα and c-Kit and MMCP (Mouse Must Cell Protease) -1, MMCP-2, MMCP-3, MMCP-4, MMCP-5, Examples include immature mast cell lines that do not substantially express MMCP-6 and carboxypeptidase A, and more specific examples include MC / 9 cells established from mast cells derived from mouse liver. .
粘膜型マスト細胞への分化抑制作用は、その評価方法について特に限定されず、例えば、粘膜型マスト細胞が特異的に発現する遺伝子の発現量を測定すること、粘膜型マスト細胞が細胞内外に発現するマーカー分子（タンパク質）を測定すること、粘膜型マスト細胞の数や割合を測定することなどにより評価することができる。例えば、粘膜型マスト細胞が細胞内に特異的に発現するタンパク質について、標識化抗体を用いて細胞内標識をし、次いで標識した細胞の数及び割合を測定することにより評価することができる。 The differentiation inhibiting action on mucosal mast cells is not particularly limited with respect to the evaluation method. For example, measuring the expression level of a gene specifically expressed by mucosal mast cells, expressing mucosal mast cells inside or outside the cell It can be evaluated by measuring a marker molecule (protein) to be measured, measuring the number and ratio of mucosal mast cells, and the like. For example, a protein that is specifically expressed in a mucosal mast cell can be evaluated by intracellular labeling with a labeled antibody and then measuring the number and ratio of the labeled cells.
粘膜型マスト細胞が細胞内に特異的に発現するタンパク質は、例えば、マウスの系ではＭＭＣＰ−１及びＭＭＣＰ−２などが挙げられる。 Examples of proteins that are specifically expressed in the mucosal mast cells include MMCP-1 and MMCP-2 in the mouse system.
粘膜型マスト細胞への分化抑制作用を評価する具体的な第１の評価系は、ＩＬ−３及びＩＬ−１０の存在下で、ＭＣ／９細胞と本発明の一態様の組成物とを共培養し、次いで培養した細胞の量及び割合（ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）並びにＭＭＣＰ−１について標識化した粘膜型マスト細胞（ＭＭＣＰ−１陽性細胞）のｐｏｐｕｌａｔｉｏｎを測定することを含む方法である。粘膜型マスト細胞のｐｏｐｕｌａｔｉｏｎは、例えば、フローサイトメトリーなどの方法、ＥＬＩＳＡやラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）などの抗原抗体反応を利用する方法などにより測定することができるが、特に限定されない。 A specific first evaluation system for evaluating differentiation-inhibiting action on mucosal mast cells is the co-use of MC / 9 cells and the composition of one embodiment of the present invention in the presence of IL-3 and IL-10. Culturing and then measuring the quantity and population of cultured cells and the population of mucosal mast cells labeled for MMCP-1 (MMCP-1 positive cells). The population of mucosal mast cells can be measured by, for example, a method such as flow cytometry or a method using an antigen-antibody reaction such as ELISA or radioimmunoassay (RIA), but is not particularly limited.
粘膜型マスト細胞への分化抑制作用を評価する具体的な第２の評価系は、ＩＬ−３及びＩＬ−１０の存在下で、ＭＣ／９細胞と本発明の一態様の組成物とを共培養し、次いで培養後に回収した細胞からＲＮＡを抽出し、次いで抽出したＲＮＡを逆転写してｃＤＮＡライブラリーを得て、次いで得られたｃＤＮＡライブラリーを基にＭＭＣＰ−１遺伝子の発現量を測定することを含む方法である。 A specific second evaluation system for evaluating differentiation-inhibiting action on mucosal mast cells is the co-use of MC / 9 cells and the composition of one embodiment of the present invention in the presence of IL-3 and IL-10. Culturing and then extracting RNA from the cells collected after culturing, then reverse-trancribing the extracted RNA to obtain a cDNA library, and then measuring the expression level of the MMCP-1 gene based on the obtained cDNA library It is a method including.
第１及び第２の評価系におけるＭＣ／９細胞と本発明の一態様の組成物とを共培養させる条件は特に限定されず、例えば、ＩＬ−３及びＩＬ−１０が失活せず、かつ、ＭＣ／９細胞が死滅しないような条件を挙げることができ、マスト細胞の維持又は増殖に適した培地、温度、ＣＯ２濃度、ｐＨなどを採用した培養条件であることが好ましい。この際、ＩＬ−３及びＩＬ−１０に加えて、他の成分が系内に存在していてもよい。他の成分は、サイトカインが失活せず、かつ、マスト細胞が死滅しないような成分であれば特に限定されないが、例えば、細胞培養に通常用いる成分が挙げられ、より具体的には２−メルカプトエタノールなどの還元剤、血清やＬ−グルタミンなどの細胞増殖に適した栄養成分、ペニシリンやストレプトマイシンなどの抗生物質、ＩＬ−２といったサイトカインなどの生理活性物質などが挙げられる。他の成分の使用量は、本発明の目的を達成し得る範囲内において、適宜設定することができる。 Conditions for co-culturing MC / 9 cells and the composition of one embodiment of the present invention in the first and second evaluation systems are not particularly limited. For example, IL-3 and IL-10 are not inactivated, and The culture conditions are such that MC / 9 cells do not die, and culture conditions that employ a medium, temperature, CO 2 concentration, pH, etc. suitable for the maintenance or growth of mast cells are preferred. At this time, in addition to IL-3 and IL-10, other components may be present in the system. The other components are not particularly limited as long as cytokines are not inactivated and mast cells are not killed, and examples thereof include components usually used for cell culture, and more specifically 2-mercapto. Examples include reducing agents such as ethanol, nutritional components suitable for cell growth such as serum and L-glutamine, antibiotics such as penicillin and streptomycin, and physiologically active substances such as cytokines such as IL-2. The usage-amount of another component can be suitably set within the range which can achieve the objective of this invention.
粘膜型マスト細胞への分化抑制作用は、その程度について特に限定されないが、例えば、上記の第１の評価系により、本発明の一態様の組成物を用いない場合と比べて、ＭＭＣＰ−１が陽性である粘膜型マスト細胞（ＭＭＣＰ−１陽性細胞）の割合を低める作用であり、好ましくはＭＭＣＰ−１陽性細胞の割合を０．９倍以下に低める作用であり、より好ましくはＭＭＣＰ−１陽性細胞の割合を０．８倍以下に低める作用であり、さらに好ましくはＭＭＣＰ−１陽性細胞の割合を０．７倍以下に低める作用である。 The degree of differentiation-inhibiting action on mucosal mast cells is not particularly limited. For example, MMCP-1 is more effective in the first evaluation system than in the case where the composition of one embodiment of the present invention is not used. It is an action of lowering the ratio of positive mucosal mast cells (MMCP-1 positive cells), preferably an action of reducing the ratio of MMCP-1 positive cells to 0.9 times or less, more preferably MMCP-1 positive This is an action of reducing the ratio of cells to 0.8 times or less, and more preferably an action of reducing the ratio of MMCP-1 positive cells to 0.7 times or less.
本発明の別の一態様は、大豆の発酵物及び麦の発酵物を有効成分として含有する、又は粘膜型マスト細胞への分化抑制用組成物を有効成分として含有する、抗アレルギー用組成物である。 Another aspect of the present invention is an antiallergic composition comprising a fermented soybean product and a fermented wheat product as active ingredients, or a composition for inhibiting differentiation into mucosal mast cells as an active ingredient. is there.
抗アレルギー用組成物は、通常知られているとおりのものであれば特に限定されず、例えば、アレルギーの症状、アレルギーと関連した疾患の症状及び自己免疫症状などを改善、緩和、抑制、治療若しくは予防するための、又は免疫療法の用に供するための組成物であり得る。 The antiallergic composition is not particularly limited as long as it is generally known. For example, it improves, alleviates, suppresses, treats or treats allergic symptoms, allergic-related disease symptoms, and autoimmune symptoms. It can be a composition for prevention or for use in immunotherapy.
抗アレルギー用組成物は、消化器官系、例えば、腸、胃、鼻腔、咽頭、口腔などの器官における粘膜組織を介するアレルギーを対象とするものであることが好ましく、食物アレルギー、花粉症、胃炎、腸炎、下痢、潰瘍性大腸炎、鼻炎、気管支炎、気管支喘息、レフレル症候群及び口内炎を対象とするものであることがより好ましい。しょうゆやみそなどの発酵食品は食物性アレルゲンを含む食材や食品とともに摂取する頻度が高いことから、食物アレルギーを対象とするものであることが好ましく、食物性アレルゲンが接触する可能性がある腸、胃、咽頭、口腔などの器官における粘膜組織を介するアレルギーを対象とするものであることがより好ましい。 The antiallergic composition is preferably intended for allergies via mucosal tissues in organs such as the digestive organ system, such as the intestine, stomach, nasal cavity, pharynx, oral cavity, food allergy, hay fever, gastritis, More preferably, it is intended for enteritis, diarrhea, ulcerative colitis, rhinitis, bronchitis, bronchial asthma, refrell syndrome and stomatitis. Fermented foods such as soy sauce and miso are often taken with food and allergen-containing foods and foods, so it is preferably intended for food allergies, intestines that may be contacted by food allergens, It is more preferable to target allergies via mucosal tissues in organs such as the stomach, pharynx and oral cavity.
免疫応答のメカニズムは未解明な部分が多く、本発明の技術的範囲はいかなる理論や推測にも拘泥されるものではないが、抗アレルギー用組成物は、例えば、適用した被験体において、粘膜型マスト細胞の割合を低下させることにより、粘膜型マスト細胞が活性化することによる脱顆粒、炎症性サイトカインの産生、脂質メディエータの産生などのいずれかの生理的現象の程度を減弱することができ、これにより抗アレルギー作用を発揮し得る。 The mechanism of the immune response is largely unknown, and the technical scope of the present invention is not limited to any theory or speculation, but the antiallergic composition is, for example, a mucosal type in an applied subject. By reducing the ratio of mast cells, the degree of any physiological phenomenon such as degranulation due to activation of mucosal mast cells, production of inflammatory cytokines, production of lipid mediators, etc. can be attenuated, Thereby, an antiallergic action can be exhibited.
抗アレルギー作用は、その評価方法について特に限定されず、例えば、当業者にとって公知の方法を特に限定せずに挙げることができ、具体的には適用した被験体におけるアレルギーの症状の程度を測定すること、粘膜型マスト細胞から遊離した、又は産生された生理活性物質を測定すること、粘膜型マスト細胞の割合や数を測定することなどにより評価する方法が挙げられる。 The antiallergic action is not particularly limited with respect to its evaluation method, for example, a method known to those skilled in the art can be mentioned without particular limitation, and specifically measures the degree of allergic symptoms in the applied subject. And a method of evaluating by measuring a physiologically active substance released or produced from mucosal mast cells, measuring the ratio and number of mucosal mast cells, and the like.
本発明の一態様の組成物の適用対象は特に限定されず、例えば、動物、中でも哺乳類が挙げられ、哺乳類としてはヒト、イヌ、ネコ、ウシ、ウマなどが挙げられ、これらの中でもヒトであることが好ましい。適用対象は、健常な対象であってもよいが、アレルギーの治療又は予防が望まれる対象であることが好ましい。 The application target of the composition of one embodiment of the present invention is not particularly limited, and examples thereof include animals, especially mammals. Examples of mammals include humans, dogs, cats, cows, horses, etc. Among these, humans are included. It is preferable. The application target may be a healthy subject, but is preferably a subject for which treatment or prevention of allergy is desired.
アレルギーの治療又は予防が望まれる対象としては、例えば、粘膜組織を介したアレルギーに罹患している者又はその可能性がある者が挙げられ、小麦アレルギーや大豆アレルギーなどの食物アレルギーを発症している者及び該食物アレルギーを発症する可能性がある者であることが好ましい。 Examples of subjects for which treatment or prevention of allergy is desired include, for example, those who have or may have allergies through mucosal tissue, and develop food allergies such as wheat allergies and soy allergies. And those who are likely to develop food allergies.
本発明の一態様の組成物は、粘膜型マスト細胞への分化抑制作用及び抗アレルギー作用を有することから、例えば、食物アレルギーを引き起こす可能性がある食物性アレルゲンを含有する食材や食品と併用することができる。本発明の一態様の組成物と併用される食材や食品としては特に限定されないが、例えば、大豆、小麦などの麦などの食物性アレルゲンを含有する食品が好ましい。本発明の一態様の組成物と併用される食材や食品は、本発明の一態様の組成物と同時的に、又はこれと前後して摂取され得る。 Since the composition of one embodiment of the present invention has an action of suppressing differentiation into mucosal mast cells and an antiallergic action, for example, it is used in combination with foods and foods containing food allergens that may cause food allergies. be able to. The food or food used in combination with the composition of one embodiment of the present invention is not particularly limited, and for example, a food containing a food allergen such as wheat or wheat such as soybean is preferable. The foodstuff or food used in combination with the composition of one embodiment of the present invention can be ingested simultaneously with or before or after the composition of one embodiment of the present invention.
本発明の一態様の組成物は、その適用方法について特に限定されず、例えば、経口的又は非経口的に適用され得る。非経口的な適用としては、皮内、皮下、静脈内、筋肉内投与などによる注射及び注入；経皮；鼻、咽頭などの粘膜からの吸入などが挙げられるが、これらに限定されない。 The composition of one embodiment of the present invention is not particularly limited with respect to the application method, and can be applied, for example, orally or parenterally. Parenteral applications include, but are not limited to, injection and infusion by intradermal, subcutaneous, intravenous, intramuscular administration, etc .; transdermal; inhalation from mucous membranes such as the nose and pharynx.
本発明の一態様の組成物は、粘膜型マスト細胞への分化抑制作用及び抗アレルギー作用が用量依存傾向にあることから、それらの適用量は年齢、体格、症状などの適用対象の特性；適用方法；適用部位などに合わせて適宜設定することができる。具体的には、本発明の一態様の組成物がしょうゆ又はしょうゆ含有食品である場合、本発明の一態様の組成物の摂取量は、例えば、０．１〜１，０００ｍｇ／体重６０ｋｇ／日であるが、これに限定されない。摂取回数は特に限定されないが、例えば、１日１〜３回であり、摂取量に応じて適宜回数を増減することができる。 Since the composition of one embodiment of the present invention has a dose-dependent tendency to suppress differentiation and antiallergic action on mucosal mast cells, the application amount thereof is a characteristic of an application target such as age, physique, and symptom; Method: It can be set appropriately according to the application site. Specifically, when the composition of one embodiment of the present invention is soy sauce or a soy sauce-containing food, the amount of intake of the composition of one embodiment of the present invention is, for example, 0.1 to 1,000 mg / weight 60 kg / day. However, it is not limited to this. The number of times of ingestion is not particularly limited, but is, for example, 1 to 3 times per day, and the number of times of intake can be appropriately increased or decreased according to the amount of intake.
本発明の一態様の組成物は、これを経口的に摂取することにより、経口免疫寛容が誘導又は増強される場合がある。その結果として、経口免疫寛容により、例えば、食物アレルギーなどのアレルギー症状や自己免疫症状を改善、緩和、抑制、治療又は予防することが可能となる。 In the composition of one embodiment of the present invention, oral tolerance may be induced or enhanced by taking it orally. As a result, oral tolerance can improve, alleviate, suppress, treat or prevent allergic symptoms such as food allergies and autoimmune symptoms.
また、本発明の一態様の組成物は、粘膜型マスト細胞により産生される炎症性サイトカインや炎症性メディエータなどの生理活性物質が関与する、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、乾癬、潰瘍性大腸炎、クローン病などの症状を改善、緩和、抑制、治療又は予防することが期待できる。 The composition of one embodiment of the present invention includes rheumatoid arthritis, systemic lupus erythematosus, multiple sclerosis, psoriasis, which involves physiologically active substances such as inflammatory cytokines and inflammatory mediators produced by mucosal mast cells. It can be expected to improve, alleviate, suppress, treat or prevent symptoms such as ulcerative colitis and Crohn's disease.
本発明の一態様の組成物は、それらを単独で、又はそれらを配合する飲食品組成物や医薬品組成物などの形態をとり得る。したがって、本発明の具体的な一態様は、大豆の発酵物及び麦の発酵物を有効成分として含有する、又は本発明の一態様の組成物を含有する、飲食品組成物、医薬品組成物、医薬部外品組成物、化粧品組成物、動物飼料組成物などである。 The composition of one embodiment of the present invention can be in the form of a food or beverage composition or a pharmaceutical composition in which they are used alone or in combination. Therefore, a specific embodiment of the present invention contains a fermented soybean product and a fermented wheat product as active ingredients, or a food and beverage composition, a pharmaceutical composition, which contains the composition of one embodiment of the present invention, These are quasi-drug compositions, cosmetic compositions, animal feed compositions and the like.
本発明の一態様の組成物が飲食品組成物である場合は、本発明の目的を達成し得る限り、食経験のある、天然物及び非天然物並びにこれらの含有物を配合してもよい。例えば、飲食品組成物には、抗アレルギー効果や経口免疫寛容増強効果が知られている、フラボノイド、ゲニステイン、ゲニスチンなどを含む豆乳；醤油などに含まれる大豆発酵多糖類；ビタミンＣなどのビタミン類などを配合することが好ましい。 In the case where the composition of one embodiment of the present invention is a food or drink composition, natural and non-natural products and their contents may be blended as long as the object of the present invention can be achieved. . For example, the food and drink composition has known anti-allergic effects and oral immune tolerance enhancing effects, soy milk containing flavonoids, genistein, genistin, etc .; soybean fermented polysaccharides contained in soy sauce; vitamins such as vitamin C Etc. are preferably blended.
飲食品組成物に含有してもよい他の成分としては、例えば、糖質甘味料、安定化剤、乳化剤、澱粉、澱粉加工物、澱粉分解物、食塩、着香料、着色料、酸味料、風味原料、栄養素、果汁、卵などの動植物性食材、賦形剤、増量剤、結合剤、増粘剤、香油などの通常の食品加工に使用される添加物を挙げることができる。添加物の使用量は、本発明の課題の解決を妨げない限り特に限定されず、適宜設定され得る。 Examples of other components that may be contained in the food and drink composition include, for example, saccharide sweeteners, stabilizers, emulsifiers, starch, processed starch products, starch degradation products, salt, flavoring agents, coloring agents, acidulants, Additives used in normal food processing such as flavor raw materials, nutrients, fruit juices, and animal and vegetable foods such as eggs, excipients, extenders, binders, thickeners, and perfume oils. The amount of additive used is not particularly limited as long as it does not hinder the solution of the problems of the present invention, and can be set as appropriate.
飲食品組成物は、通常用いられる形態であれば特に限定されず、例えば、固形状、液状、ゲル状、懸濁液状、クリーム状、シート状、スティック状、粉状、粒状、顆粒状、錠状、棒状、板状、ブロック状、ペースト状、カプセル状、カプレット状などの各形態を採り得る。 The food and drink composition is not particularly limited as long as it is a commonly used form, and for example, solid, liquid, gel, suspension, cream, sheet, stick, powder, granule, granule, tablet Shapes, rod shapes, plate shapes, block shapes, paste shapes, capsule shapes, caplet shapes, and the like.
飲食品組成物の具体的な一態様は、例えば、生体に対して一定の機能性を有する飲食品である機能性飲食品である。機能性飲食品は、例えば、特定保健用飲食品、機能性表示飲食品、栄養機能飲食品、保健機能飲食品、特別用途飲食品、栄養補助飲食品、健康補助飲食品、サプリメント、美容飲食品などのいわゆる健康飲食品に加えて、乳児用飲食品、妊産婦用飲食品、高齢者用飲食品などの特定者用飲食品を包含する。さらに機能性飲食品は、コーデックス（ＦＡＯ／ＷＨＯ合同食品規格委員会）の食品規格に基づく健康強調表示（Ｈｅａｌｔｈ ｃｌａｉｍ）が適用される健康飲食品を包含する。 The specific one aspect | mode of the food-drinks composition is a functional food-drinks which are food-drinks which have fixed functionality with respect to a biological body, for example. Functional foods and beverages include, for example, specific health foods and drinks, functional indication foods and drinks, nutritional functional foods and drinks, health functional foods and drinks, special purpose foods and drinks, nutritional supplements and foods, health supplements and foods, supplements, beauty foods and beverages In addition to so-called healthy foods and beverages such as foods and beverages for infants, foods and beverages for pregnant women, foods and beverages for specific people such as foods and beverages for elderly people are included. Furthermore, functional food / beverage products include the health food / beverage products to which the health claim based on the food standards of Codex (FAO / WHO Joint Food Standards Committee) is applied.
飲食品組成物の包装形態は特に限定されず、適用される形態などに応じて適宜選択できるが、例えば、ＰＴＰなどのブリスターパック；ストリップ包装；ヒートシール；アルミパウチ；プラスチックや合成樹脂などを用いるフィルム包装；バイアルなどのガラス容器；アンプルなどのプラスチック容器などが挙げられる。 The packaging form of the food / beverage composition is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the form to be applied. For example, blister packs such as PTP; strip packaging; heat sealing; aluminum pouch; Film packaging; Glass containers such as vials; Plastic containers such as ampoules.
本発明の一態様の組成物が医薬品組成物である場合は、適用後に少なくとも粘膜型マスト細胞への分化抑制作用が発揮し、それに伴いアレルギーの症状やアレルギーに関連のある疾患の症状を治療又は予防し得る限り、あらゆる医薬品の形態をとり得る。医薬品組成物には、本発明の目的を達成し得る限り、特許文献１に記載されている有効成分などの他の粘膜型マスト細胞への分化抑制作用又は抗アレルギー作用を有する生理活性物質を配合することができる。このような生理活性物質の他の具体例としては、抗ＩＬ−１０受容体抗体、ＩＬ−１０アナログ、ＩＬ−１０受容体拮抗阻害剤、ＩＬ−１０との複合体形成物質、抗ＩＬ−３受容体抗体、ＩＬ−３アナログ、ＩＬ−３受容体拮抗阻害剤、ＩＬ−３との複合体形成物質などが挙げられるが、これらに限定されない。 In the case where the composition of one embodiment of the present invention is a pharmaceutical composition, it exerts at least an action of inhibiting differentiation into mucosal mast cells after application, and accordingly treats allergic symptoms or allergic related diseases. It can take any pharmaceutical form as long as it can be prevented. As long as the object of the present invention can be achieved, the pharmaceutical composition contains a physiologically active substance having an action of inhibiting differentiation to other mucosal mast cells or an antiallergic action such as the active ingredient described in Patent Document 1. can do. Other specific examples of such a physiologically active substance include an anti-IL-10 receptor antibody, an IL-10 analog, an IL-10 receptor antagonist, an agent that forms a complex with IL-10, and an anti-IL-3. Examples include, but are not limited to, receptor antibodies, IL-3 analogs, IL-3 receptor antagonists, and substances that form a complex with IL-3.
医薬品組成物には、有効成分以外に様々な目的に対するその他の成分を含めてもよく、このようなその他の成分としては、例えば保存剤、緩衝剤などが挙げられる。保存剤としては、ナトリウム重亜硫酸、ナトリウム重硫酸、ナトリウムチオ硫酸塩化ベンザルコニウム、クロロブタノール、チメロサール、酢酸フェニル水銀、硝酸フェニル水銀、メチルパラベン、ポリビニルアルコール、フェニルエチルアルコール、アンモニア、ジチオスレイトール、ベータメルカプトエタノールなどが挙げられる。また、緩衝剤としては、炭酸ナトリウム、ホウ酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、重炭酸ナトリウムなどが挙げられる。これら薬剤は、系のｐＨを２〜９、好ましくは４〜８の間で維持することができる量で存在することができる。 In addition to the active ingredient, the pharmaceutical composition may contain other ingredients for various purposes. Examples of such other ingredients include preservatives and buffers. Preservatives include sodium bisulfite, sodium bisulfate, sodium thiosulfate benzalkonium chloride, chlorobutanol, thimerosal, phenylmercuric acetate, phenylmercuric nitrate, methylparaben, polyvinyl alcohol, phenylethyl alcohol, ammonia, dithiothreitol, beta Examples include mercaptoethanol. Examples of the buffer include sodium carbonate, sodium borate, sodium phosphate, sodium acetate, sodium bicarbonate and the like. These agents can be present in amounts that can maintain the pH of the system between 2-9, preferably between 4-8.
医薬品組成物の剤型は特に限定されないが、例えば、注射剤（筋肉、皮下、皮内）、経口製剤、点鼻製剤などが例示される。例えば、医薬品組成物は、食物アレルギーなどのアレルギー疾患を治療するためのワクチンとして調製することができる。医薬品組成物がワクチンの形態である場合、複数種類の有効成分を含む混合カクテルワクチンであってもよい。 The dosage form of the pharmaceutical composition is not particularly limited, and examples thereof include injections (muscular, subcutaneous, intradermal), oral preparations, nasal preparations and the like. For example, the pharmaceutical composition can be prepared as a vaccine for treating allergic diseases such as food allergies. When the pharmaceutical composition is in the form of a vaccine, it may be a mixed cocktail vaccine containing multiple types of active ingredients.
粘膜型マスト細胞を安定的かつ効率的に誘導して、細胞あたりの粘膜型マスト細胞の割合を増加させる方法についてはこれまでに知られていなかったが、本発明者らは方法を構築することに成功した。本明細書にて、本発明者らが見出した粘膜型マスト細胞への分化誘導方法及び粘膜型マスト細胞の製造方法を述べる。 Although a method for stably and efficiently inducing mucosal mast cells to increase the ratio of mucosal mast cells per cell has not been known so far, the present inventors have constructed a method. succeeded in. In the present specification, a method for inducing differentiation into mucosal mast cells and a method for producing mucosal mast cells found by the present inventors will be described.
粘膜型マスト細胞への分化誘導方法は、未成熟マスト細胞株とインターロイキン−１０とを、又は未成熟マスト細胞株とインターロイキン−１０及びインターロイキン−３とを接触させることにより、未成熟マスト細胞株から粘膜型マスト細胞への分化を誘導する工程を少なくとも含む方法である。粘膜型マスト細胞の製造方法は、未成熟マスト細胞株とインターロイキン−１０とを、又は未成熟マスト細胞株とインターロイキン−１０及びインターロイキン−３とを接触させることにより、粘膜型マスト細胞を得る工程を含む製造方法である。 The method for inducing differentiation into mucosal mast cells is performed by bringing an immature mast cell line and interleukin-10 into contact with each other, or by bringing an immature mast cell line into contact with interleukin-10 and interleukin-3. It is a method including at least a step of inducing differentiation from a cell line to a mucosal mast cell. A method for producing a mucosal mast cell comprises contacting an immature mast cell line with interleukin-10, or bringing an immature mast cell line into contact with interleukin-10 and interleukin-3. It is a manufacturing method including the process of obtaining.
いずれの方法においても、ＩＬ−３及びＩＬ−１０は、それぞれ通常知られているとおりのサイトカインであれば特に限定されない。ＩＬ−３及びＩＬ−１０は、その入手方法について特に限定されないが、例えば、市販されているものを利用することやＴ細胞やＢ細胞などのＩＬ−３やＩＬ−１０を分泌する細胞から得た培養上清などを常法に従って分離精製することなどによって入手することできる。ＩＬ−３及びＩＬ−１０は、その由来生物種については特に限定されず、例えば、ヒト、マウス、ラット、ウシ、イヌ、ウマ、ネコ、ヒツジ、ブタなどの哺乳類が挙げられるが、高度な分化誘導活性が認められるために、マスト細胞と同一の由来生物種であることが好ましい。 In any method, IL-3 and IL-10 are not particularly limited as long as they are cytokines as they are generally known. IL-3 and IL-10 are not particularly limited in terms of the method for obtaining them. For example, IL-3 and IL-10 are obtained from commercially available products or from cells that secrete IL-3 or IL-10 such as T cells and B cells. The culture supernatant can be obtained by separation and purification according to a conventional method. IL-3 and IL-10 are not particularly limited as to the species from which they are derived, and examples thereof include mammals such as humans, mice, rats, cows, dogs, horses, cats, sheep, pigs, and the like. Since inductive activity is recognized, it is preferable that the same species of origin as the mast cell.
いずれの方法においても、未成熟マスト細胞株は、通常知られているとおりの骨髄その他の組織に由来するマスト細胞であれば特に限定されないが、例えば、異質性があり、かつ、表現型が粘膜型マスト細胞だけではなく、結合組織型マスト細胞にもなり得るマスト細胞株であることが好ましい。未成熟マスト細胞株は、マスト細胞が特異的に発現するタンパク質を発現するものがより好ましく、ＦｃεＲＩα及びｃ−Ｋｉｔからなる群から選ばれるタンパク質を発現するものがさらに好ましく、ＦｃεＲＩα及びｃ−Ｋｉｔの両方を発現するものがなおさらに好ましい。また、前記未成熟マスト細胞株は、ＦｃεＲＩα及びｃ−Ｋｉｔを発現し、かつ、ＭＭＣＰ−１、ＭＭＣＰ−２、ＭＭＣＰ−３、ＭＭＣＰ−４、ＭＭＣＰ−５、ＭＭＣＰ−６及びカルボキシペプチダーゼＡを実質的に発現しない未成熟マスト細胞株であることが好ましい。 In any method, the immature mast cell line is not particularly limited as long as it is a mast cell derived from bone marrow or other tissues as is generally known. For example, it is heterogeneous and has a phenotype of mucosa. It is preferably a mast cell line that can be a connective tissue type mast cell as well as a type mast cell. The immature mast cell line is preferably one that expresses a protein that is specifically expressed by mast cells, more preferably one that expresses a protein selected from the group consisting of FcεRIα and c-Kit, and FcεRIα and c-Kit. Even more preferred are those that express both. In addition, the immature mast cell line expresses FcεRIα and c-Kit, and substantially contains MMCP-1, MMCP-2, MMCP-3, MMCP-4, MMCP-5, MMCP-6 and carboxypeptidase A. Preferably, it is an immature mast cell line that does not express it.
未成熟マスト細胞株は、粘膜型マスト細胞が発現する少なくともいずれか１種のタンパク質の発現が陰性であると評価することによって、粘膜型マスト細胞と区別し得る。例えば、マウスにおいては、未成熟マスト細胞株は、粘膜型マスト細胞が発現するキマーゼの１種であるＭＭＣＰ（Ｍｏｕｓｅ Ｍａｓｔ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｔｅａｓｅ）−１の発現については陰性と評価される。したがって、粘膜型マスト細胞への分化誘導方法は、例えば、マウスの系においては、ＭＭＣＰ−１陰性であると評価される未成熟マスト細胞株からＭＭＣＰ−１陽性であると評価される粘膜型マスト細胞への分化を誘導する工程を少なくとも含む方法と表すことができる。 An immature mast cell line can be distinguished from a mucosal mast cell by evaluating that the expression of at least one protein expressed by the mucosal mast cell is negative. For example, in mice, an immature mast cell line is evaluated as negative for the expression of MMCP (Mouse Must Cell Protease) -1, which is a kind of chymase expressed by mucosal mast cells. Therefore, the method for inducing differentiation into mucosal mast cells is, for example, a mucosal mast evaluated to be MMCP-1 positive from an immature mast cell line evaluated to be MMCP-1 negative in a mouse system. It can be expressed as a method including at least a step of inducing differentiation into cells.
未成熟マスト細胞株は、その入手方法については特に限定されず、例えば、TC Moon, et al（MucosalImmunology, Vol. 3, No. 2, (2010), pp.111-128）に記載されているとおりに、ＩＬ−３の存在下又は非存在下で、骨髄中のマスト細胞前駆体やその他の組織に存在するマスト細胞を株化することにより、取得することができる。未成熟マスト細胞株の具体例としては、マウスの肝臓に由来するマスト細胞株であるＭＣ／９細胞などが挙げられるが、これに限定されない。 The method of obtaining immature mast cell lines is not particularly limited, and is described in, for example, TC Moon, et al (MucosalImmunology, Vol. 3, No. 2, (2010), pp. 111-128). Similarly, it can be obtained by establishing mast cell precursors in the bone marrow and mast cells present in other tissues in the presence or absence of IL-3. Specific examples of immature mast cell lines include, but are not limited to, MC / 9 cells, which are mast cell lines derived from mouse liver.
粘膜型マスト細胞への分化誘導方法及び粘膜型マスト細胞の製造方法では、ＩＬ−１０と、又はＩＬ−１０及びＩＬ−３と未成熟マスト細胞株とを接触させることを含む。いずれの方法においても、これらサイトカインと未成熟マスト細胞株とを接触させる条件は特に限定されず、例えば、ＩＬ−１０及びＩＬ−３が失活せず、かつ、未成熟マスト細胞株が死滅しないような条件を挙げることができ、未成熟マスト細胞株の維持又は増殖に適した培地、温度、ＣＯ２濃度、ｐＨなどの培養条件であることが好ましい。 The method for inducing differentiation into mucosal mast cells and the method for producing mucosal mast cells include contacting IL-10, or IL-10 and IL-3, and an immature mast cell line. In any method, the conditions for contacting these cytokines with the immature mast cell line are not particularly limited. For example, IL-10 and IL-3 are not inactivated, and the immature mast cell line is not killed. Such conditions can be mentioned, and culture conditions such as a medium, temperature, CO 2 concentration, and pH suitable for maintenance or growth of immature mast cell lines are preferable.
未成熟マスト細胞株の細胞数並びにＩＬ−１０及びＩＬ−３の添加量は特に限定されない。未成熟マスト細胞株の細胞数は、例えば、通常ｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞培養する際に用いられる細胞数が挙げられ、培養容器の材質や形状によって適宜設定することができるが、より具体的には１０３〜１０８ｃｅｌｌｓ／ｍｌ程度であり、１０４〜１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌであることが好ましい。ＩＬ−１０及びＩＬ−３の添加量は、例えば、通常細胞に対して活性を示し得るとされている範囲の量が挙げられ、未成熟マスト細胞株の細胞数によって適宜設定することができるが、より具体的には０．１ｎｇ／ｍｌ〜５，０００ｎｇ／ｍｌであり、１〜１，０００ｎｇ／ｍｌであることが好ましく、１０〜３００ｎｇ／ｍｌであることがより好ましく、２０〜２００ｎｇ／ｍｌであることがさらに好ましい。 The number of immature mast cell lines and the amount of IL-10 and IL-3 added are not particularly limited. The number of cells of the immature mast cell line is, for example, the number of cells usually used when culturing cells in vitro, and can be appropriately set depending on the material and shape of the culture vessel. It is about 3 to 10 8 cells / ml, and preferably 10 4 to 10 6 cells / ml. The amount of IL-10 and IL-3 added is, for example, an amount in a range that can be demonstrated to be active against normal cells, and can be appropriately set depending on the number of cells of the immature mast cell line. More specifically, it is 0.1 ng / ml to 5,000 ng / ml, preferably 1 to 1,000 ng / ml, more preferably 10 to 300 ng / ml, and 20 to 200 ng / ml. More preferably.
ＩＬ−３を用いる場合、ＩＬ−３の使用方法については特に限定されず、例えば、未成熟マスト細胞株とＩＬ−１０とを接触させるときと同時に、又はそのときに前後して、未成熟マスト細胞株と接触させる方法が挙げられるが、ＩＬ−３はＩＬ−１０と同時に未成熟マスト細胞株に接触させることが好ましい。 When IL-3 is used, the method for using IL-3 is not particularly limited. For example, immature mast may be used at the same time as or before and after contacting an immature mast cell line with IL-10. Although the method of making it contact with a cell line is mentioned, It is preferable to make IL-3 contact an immature mast cell line simultaneously with IL-10.
未成熟マスト細胞株とＩＬ−１０及びＩＬ−３といったサイトカインとの接触時間は特に限定されず、例えば、粘膜型マスト細胞の存在が確認できる時間などが挙げられるが、未成熟マスト細胞株の培養時間に相当する２〜４日間程度が好ましい。その他の接触条件は、通常の細胞培養に適した条件であれば特に限定されないが、静置培養であることが好ましい。 The contact time between the immature mast cell line and cytokines such as IL-10 and IL-3 is not particularly limited, and examples thereof include a time during which the presence of mucosal mast cells can be confirmed. About 2 to 4 days corresponding to the time is preferable. Other contact conditions are not particularly limited as long as they are suitable for normal cell culture, but stationary culture is preferable.
未成熟マスト細胞株とＩＬ−１０及びＩＬ−３といったサイトカインとを接触させる際に、他の成分が系内に存在していてもよい。他の成分は、サイトカインが失活せず、かつ、未成熟マスト細胞株が死滅しないような成分であれば特に限定されないが、例えば、通常細胞培養に用いる成分が挙げられ、より具体的には２−メルカプトエタノールなどの還元剤、血清やＬ−グルタミンなどの細胞増殖に適した栄養成分、ペニシリンやストレプトマイシンなどの抗生物質、ＩＬ−２といったサイトカインなどの生理活性物質などが挙げられる。他の成分の使用量は、本発明の目的を達成し得る範囲内において、適宜設定することができる。 When the immature mast cell line is contacted with cytokines such as IL-10 and IL-3, other components may be present in the system. The other components are not particularly limited as long as cytokines are not inactivated and immature mast cell lines are not killed, but examples include components usually used for cell culture, and more specifically Examples include reducing agents such as 2-mercaptoethanol, nutritional components suitable for cell growth such as serum and L-glutamine, antibiotics such as penicillin and streptomycin, and physiologically active substances such as cytokines such as IL-2. The usage-amount of another component can be suitably set within the range which can achieve the objective of this invention.
未成熟マスト細胞株とＩＬ−１０及びＩＬ−３といったサイトカインとを接触させることにより、未成熟マスト細胞株から粘膜型マスト細胞を分化誘導できる。粘膜型マスト細胞への分化誘導作用は、未成熟マスト細胞株から粘膜型マスト細胞への分化を誘導する作用であって、結果として粘膜型マスト細胞の割合を高め得る作用であれば、その作用機序や合わせて伴う他の作用などについては特に限定されない。 By bringing an immature mast cell line into contact with cytokines such as IL-10 and IL-3, differentiation of mucosal mast cells can be induced from the immature mast cell line. The action of inducing differentiation into mucosal mast cells is an action of inducing differentiation from an immature mast cell line into mucosal mast cells, and as a result, the action can increase the proportion of mucosal mast cells. There are no particular restrictions on the mechanism or other actions involved.
粘膜型マスト細胞への分化誘導は、その評価方法について特に限定されず、例えば、粘膜型マスト細胞が特異的に発現する遺伝子の発現量を測定すること、粘膜型マスト細胞が細胞内外に発現するマーカー分子（タンパク質）を測定すること、粘膜型マスト細胞の数や割合を測定することなどにより評価することができる。例えば、粘膜型マスト細胞が細胞内に特異的に発現するタンパク質について、標識化抗体を用いて細胞内標識をし、次いで標識した細胞の数及び割合を測定することにより評価することができる。 The method for inducing differentiation into mucosal mast cells is not particularly limited with respect to the evaluation method. For example, the expression level of a gene that is specifically expressed by mucosal mast cells is measured, and mucosal mast cells are expressed inside and outside the cells. It can be evaluated by measuring a marker molecule (protein) or measuring the number or ratio of mucosal mast cells. For example, a protein that is specifically expressed in a mucosal mast cell can be evaluated by intracellular labeling with a labeled antibody and then measuring the number and ratio of the labeled cells.
粘膜型マスト細胞が細胞内に特異的に発現するタンパク質は、例えば、マウスの系ではＭＭＣＰ−１及びＭＭＣＰ−２などが挙げられる。 Examples of proteins that are specifically expressed in the mucosal mast cells include MMCP-1 and MMCP-2 in the mouse system.
粘膜型マスト細胞への分化誘導方法の具体的な一態様として、例えば、未成熟マスト細胞株とＩＬ−１０とを、又はＩＬ−１０及びＩＬ−３とを共培養し、次いで培養した細胞の量及び割合（ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）並びに細胞内標識又は細胞外標識した粘膜型マスト細胞のｐｏｐｕｌａｔｉｏｎを測定することを含む方法である。粘膜型マスト細胞のｐｏｐｕｌａｔｉｏｎは、例えば、フローサイトメトリーなどの方法、ＥＬＩＳＡやラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）などの抗原抗体反応を利用する方法などにより測定することができるが、特に限定されない。 As a specific embodiment of the method for inducing differentiation into mucosal mast cells, for example, immature mast cell line and IL-10, or IL-10 and IL-3 are co-cultured, and then cultured cells A method comprising measuring the amount and population and population of intracellular or extracellular labeled mucosal mast cells. The population of mucosal mast cells can be measured by, for example, a method such as flow cytometry or a method using an antigen-antibody reaction such as ELISA or radioimmunoassay (RIA), but is not particularly limited.
粘膜型マスト細胞への分化誘導方法の別の具体的な一態様として、例えば、未成熟マスト細胞株とＩＬ−１０とを、又はＩＬ−１０及びＩＬ−３とを共培養し、次いで培養後に回収した細胞からＲＮＡを抽出し、次いで抽出したＲＮＡを逆転写してｃＤＮＡライブラリーを得て、次いで得られたｃＤＮＡライブラリーを基に粘膜型マスト細胞が特異的に発現する遺伝子の発現量を測定することを含む方法が挙げられる。 As another specific embodiment of the method for inducing differentiation into mucosal mast cells, for example, immature mast cell line and IL-10, or IL-10 and IL-3 are co-cultured, and then cultured. RNA is extracted from the collected cells, then the extracted RNA is reverse transcribed to obtain a cDNA library, and then the expression level of a gene that is specifically expressed in mucosal mast cells is measured based on the obtained cDNA library The method including doing is mentioned.
粘膜型マスト細胞への分化誘導方法を応用した方法の一つとしては、本発明の別の一態様である、未成熟マスト細胞株とＩＬ−１０とを、又はＩＬ−１０及びＩＬ−３とを接触させることにより、粘膜型マスト細胞を得る工程を少なくとも含む、粘膜型マスト細胞の製造方法が挙げられる。 As one of the methods applying the method for inducing differentiation into mucosal mast cells, another embodiment of the present invention is immature mast cell line and IL-10, or IL-10 and IL-3. A method for producing a mucosal mast cell, which includes at least a step of obtaining a mucosal mast cell by bringing into contact therewith.
粘膜型マスト細胞の製造方法により製造される粘膜型マスト細胞は、ｉｎ ｖｉｖｏ又はｅｘ ｖｉｖｏでの使用が考えられる。例えば、製造された粘膜型マスト細胞を被験体の粘膜組織に適用することにより、被験体の寄生虫感染防御やその他の粘膜感染症の症状を改善、緩和、抑制、治療又は予防することが期待できる。 The mucosal mast cells produced by the method for producing mucosal mast cells can be used in vivo or ex vivo. For example, by applying the produced mucosal mast cells to the mucosal tissue of a subject, it is expected to improve, alleviate, suppress, treat or prevent the symptoms of parasite infection and other mucosal infections in the subject. it can.
本発明の一態様である方法では、本発明の目的を達成し得る限り、上記した工程の前段若しくは後段又は工程中に、種々の工程や操作を加入することができる。また、工程内及び工程間は、連続的又は断続的に実施することができる。 In the method which is one embodiment of the present invention, various processes and operations can be added before or after the above-described process or in the process as long as the object of the present invention can be achieved. Moreover, it can implement continuously or intermittently in the process and between processes.
以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではなく、本発明の課題を解決し得る限り、本発明は種々の態様をとることができる。 Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to examples. However, the present invention is not limited to these examples, and the present invention can take various modes as long as the problems of the present invention can be solved. .
［実施例１］
マウスマスト細胞株であるＭＣ／９細胞を用いて、粘膜型マスト細胞（ＭＭＣＰ−１陽性細胞）を以下のとおりに誘導した。
[Example 1]
Using the mouse mast cell line MC / 9 cells, mucosal mast cells (MMCP-1-positive cells) were induced as follows.
マウスの粘膜型マスト細胞は、マスト細胞の表面マーカー分子であるＦｃεＲＩα及びｃ−Ｋｉｔを発現すると同時に、細胞内にＭＭＣＰ−１というプロテアーゼを発現する。マウスマスト細胞株であるＭＣ／９細胞は、ＦｃεＲＩα及びｃ−Ｋｉｔを発現しているが、粘膜型のマーカーであるＭＭＣＰ−１を発現していない。そこで、ＭＣ／９細胞を粘膜型へ分化させることを目的に、下記の実験を実施した。 The mucosal mast cells of the mouse express FcεRIα and c-Kit, which are surface marker molecules of mast cells, and at the same time, express a protease called MMCP-1. MC / 9 cells, which are a mouse mast cell line, express FcεRIα and c-Kit, but do not express MMCP-1, which is a mucosal marker. Therefore, the following experiment was conducted for the purpose of differentiating MC / 9 cells into a mucosal type.
１．細胞培養のための培地の調製
ＳＩＧＭＡ社製Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ培地に、下記の終濃度になるように試薬を添加して、培地を調製した。
１０％（ｗ／ｖ） ＦＢＳ
１％（ｗ／ｖ） Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎｅ／Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ
２ｍＭ Ｌ−ｇｌｕｔａｍｉｎｅ
０．０５ｍＭ ２−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ
１０％（ｗ／ｖ） Ｒａｔ Ｔ−ＳＴＩＭ（日本ベクトン・ディッキンソン社製）
1. Preparation of Medium for Cell Culture A medium was prepared by adding reagents to Dulbecco's Modified Eagle's medium manufactured by SIGMA so as to have the following final concentrations.
10% (w / v) FBS
1% (w / v) Penicilline / Streptomycin
2 mM L-glutamine
0.05 mM 2-mercaptoethanol
10% (w / v) Rat T-STIM (Nippon Becton Dickinson)
２．ＭＣ／９細胞懸濁液の調製
ＭＣ／９（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−８３０６）凍結ストックを培地に添加し、週に２回程度培地を交換しながら培養した。５継代（Ｐ５）の時点で３×１０６ ｃｅｌｌｓ／ｍＬのワーキングストックを作成した。ワーキングストックを培地に添加し、培養後週に２回程度で継代しながら培養することにより、Ｐ９以降の細胞を回収した。回収した細胞について、培地で１回洗浄した後、トリパンブルー（Ｇｉｂｃｏ社製）で懸濁し血球計算板を用いて細胞数を計測した。その後、２×１０６ ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるように培地に懸濁することにより、ＭＣ／９細胞懸濁液を調製した。
2. Preparation of MC / 9 Cell Suspension MC / 9 (ATCC CRL-8306) frozen stock was added to the medium and cultured while changing the medium about twice a week. A working stock of 3 × 10 6 cells / mL was made at the time of passage 5 (P5). The working stock was added to the medium, and the cells after P9 were collected by culturing while subcultured about twice a week after culturing. The collected cells were washed once with a medium, suspended in trypan blue (manufactured by Gibco), and the number of cells was counted using a hemocytometer. Then, MC / 9 cell suspension was prepared by suspending in a culture medium so that it might become 2 * 10 < 6 > cells / mL.
３．サイトカイン溶液の調製
ｍｏｕｓｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ＩＬ−３（１００μＭ；ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）及びｍｏｕｓｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ＩＬ−１０（１００μＭ；ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）を、それぞれ１２０ｎｇ／ｍｌとなるように培地で希釈して、ＩＬ−３溶液及びＩＬ−１０溶液を調製した。
3. Preparation of cytokine solution mouse recombinant protein IL-3 (100 μM; manufactured by eBioscience) and mouse recombinant protein IL-10 (100 μM; manufactured by eBioscience) were each diluted to 120 ng / ml with a medium, and IL-3 was prepared. Solutions and IL-10 solutions were prepared.
４．抗ＩＬ−１０受容体抗体（αＩＬ−１０Ｒ抗体）溶液の調製
Ｐｕｒｉｆｉｅｄ ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ ＣＤ２１０（ＩＬ−１０Ｒ） Ａｎｔｉｂｏｄｙ（５００μＭ；Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）を、それぞれ１２、１２０及び１２００ｎｇ／ｍｌとなるように培地で希釈することにより、αＩＬ−１０Ｒ抗体を調製した。
4). Preparation of Anti-IL-10 Receptor Antibody (αIL-10R Antibody) Solution Purified anti-mouse CD210 (IL-10R) Antibody (500 μM; manufactured by Biolegend) was added to the culture medium at 12, 120 and 1200 ng / ml, respectively. ΑIL-10R antibody was prepared by dilution.
５．培養方法
表１の例１〜１０が示すとおりに、９６ウェル平底プレート（ＢＤ ＦＡＬＣＯＮ社製）の各ウェルに、内容物が所定の最終濃度になるように上記溶液及び培地を添加して、３日間培養した。ただし、上記培地として、Ｒａｔ Ｔ−ＳＴＩＭを含有しない培地を用いた。
5. Culturing method As shown in Examples 1 to 10 of Table 1, the above solution and medium were added to each well of a 96-well flat bottom plate (BD FALCON) so that the contents had a predetermined final concentration. Cultured for days. However, a medium not containing Rat T-STIM was used as the medium.
６．細胞数計測のためのＦＡＣＳＡｒｉａ解析
培養後に回収した細胞を、１×ＰＢＳ／２％ＦＢＳで２回洗浄した後、Ｆｃブロック（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）と反応させた。次いで、反応後の細胞を、ＰＥ標識ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ ＦｃεＲＩα（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）及びＰＥ／ｃｙ７標識ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ ＣＤ１１７（ｃ−Ｋｉｔ）（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）と反応させた。次いで、反応後の細胞を、１×ＰＢＳで１回洗浄した後、Ｆｉｘａｂｌｅ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ｄｙｅ ｅＦｌｕｏｒ ４５０（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）と反応させた。
6). Cells collected after FACSAria analysis culture for cell count were washed twice with 1 × PBS / 2% FBS, and then reacted with Fc block (manufactured by BD Bioscience). Subsequently, the cells after the reaction were reacted with PE-labeled anti-mouse FcεRIα (manufactured by Biolegend) and PE / cy7-labeled anti-mouse CD117 (c-Kit) (manufactured by Biolegend). Next, the cells after the reaction were washed once with 1 × PBS and then reacted with Fixable Viability Dye eFluor 450 (manufactured by eBioscience).
次いで、反応後の細胞を、１×ＰＢＳ／２％ＦＢＳで１回洗浄した後、ＩＣバッファー（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）を用いて固定化した。次いで、固定化した細胞を、Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎバッファー（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）を用いて洗浄した後、Ａｌｅｘａ６４７標識抗ＭＭＣＰ−１抗体（ｐｕｒｉｆｉｅｄ ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ ＭＣＰＴ−１（ｍＭＣＰ−１）（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）をＡｌｅｘａＦｌｏｕｒ６４７ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ（ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）にて標識したもの）と反応させ細胞内標識を行った。次いで、標識した細胞を、１×ＰＢＳ／２％ＦＢＳで洗浄し、さらに同バッファー２００μＬに懸濁した後、ＦＡＣＳＡｒｉａを用いて解析した。解析の際、特定量のＢＤ ＦＡＣＳＴＭ Ａｃｃｕｄｒｏｐ Ｂｅａｄｓ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）を既知体積のサンプルに加え、細胞とともにビーズを計測した。ビーズ量とビーズの取り込み数、生細胞の取り込み数から全細胞数を算出した。さらに全細胞数とＭＭＣＰ−１陽性細胞の割合とから、ＭＭＣＰ−１陽性細胞数を算出した。 Subsequently, the cells after the reaction were washed once with 1 × PBS / 2% FBS, and then immobilized using IC buffer (manufactured by eBioscience). Next, the fixed cells were washed with Permeabilization buffer (manufactured by eBioscience), and then Alexa647-labeled anti-MMCP-1 antibody (purified anti-mouse MCPT-1 (mMCP-1) (manufactured by eBioscience) was alexafloor647bodies. Intracellular labeling was carried out by reacting with a labeling kit (manufactured by life technology). Subsequently, the labeled cells were washed with 1 × PBS / 2% FBS, further suspended in 200 μL of the same buffer, and analyzed using FACSAria. During the analysis, a specific amount of BD FACS ™ Accudrop Beads (manufactured by BD Bioscience) was added to a sample of a known volume, and the beads were counted together with the cells. The total number of cells was calculated from the amount of beads, the number of beads incorporated, and the number of living cells incorporated. Further, the number of MMCP-1 positive cells was calculated from the total number of cells and the ratio of MMCP-1 positive cells.
７．細胞数解析結果
ＦＡＣＳＡｒｉａ解析の結果について、例１〜７の結果をまとめたものを図１に示し、例２、例６及び例８〜１０の結果をまとめたものを図２に示す。
7). Results of cell number analysis Regarding the results of FACSAria analysis, the results of Examples 1-7 are summarized in FIG. 1, and the results of Examples 2, 6, and 8-10 are summarized in FIG.
（１）例１〜７の結果（図１Ａ〜Ｃ）
図１Ａが示すとおり、ＩＬ−３添加条件と比較して、ＩＬ−１０添加条件では、ＭＭＣＰ−１陽性細胞の割合の顕著な増加が見られた。また、図１Ｂが示すとおり、ＭＭＣＰ−１陽性細胞数についても、これらの比較から、ＩＬ−１０を添加することにより増加傾向を示すことがわかった。
(1) Results of Examples 1-7 (FIGS. 1A-C)
As shown in FIG. 1A, a significant increase in the proportion of MMCP-1 positive cells was observed under the IL-10 addition condition as compared with the IL-3 addition condition. In addition, as shown in FIG. 1B, it was found from these comparisons that the number of MMCP-1 positive cells also showed an increasing tendency by adding IL-10.
総細胞数については、図１Ｃが示すとおり、サイトカイン非添加条件においては、十分な細胞の増殖が見られなかった。また、ＩＬ−３及びＩＬ−１０を独立して添加した際には、それぞれ細胞数が増加することが確認されたが、これらの間の増加の程度については、大きな差異はなかった。 Regarding the total number of cells, as shown in FIG. 1C, sufficient cell proliferation was not observed under the non-cytokine conditions. Moreover, when IL-3 and IL-10 were added independently, it was confirmed that the number of cells increased, but there was no significant difference in the degree of increase between them.
ＩＬ−３添加条件とＩＬ−１０添加条件との比較から、ＭＭＣＰ−１陽性細胞はＩＬ−１０依存的に分化誘導することが確認された。 From a comparison between the IL-3 addition condition and the IL-10 addition condition, it was confirmed that MMCP-1 positive cells induce differentiation in an IL-10-dependent manner.
一方、ＩＬ−３とＩＬ−１０とを同時に添加した条件下においては、ＭＭＣＰ−１陽性細胞の割合が増加することが確認された（図１Ａを参照）。しかし、その増加の程度は、ＩＬ−１０を単独で添加した条件と比較して、顕著に大きいというものではなかった。一方、ＭＭＣＰ−１陽性細胞数及び総細胞数については、ＩＬ−３添加条件及びＩＬ−１０添加条件と比べて、相乗的に顕著に増加することが確認された（図１Ｂ及び図１Ｃを参照）。 On the other hand, under the condition where IL-3 and IL-10 were added simultaneously, it was confirmed that the ratio of MMCP-1 positive cells increased (see FIG. 1A). However, the degree of the increase was not significantly greater than the condition where IL-10 was added alone. On the other hand, it was confirmed that the number of MMCP-1 positive cells and the total number of cells increased synergistically significantly as compared with the IL-3 addition condition and the IL-10 addition condition (see FIGS. 1B and 1C). ).
図１の結果より、ＩＬ−１０は濃度依存的にＭＣ／９細胞からＭＭＣＰ−１陽性細胞を分化誘導する作用があることが確認された。 From the results of FIG. 1, it was confirmed that IL-10 has an action of inducing differentiation of MMCP-1 positive cells from MC / 9 cells in a concentration-dependent manner.
（２）例２、例６及び例８〜１０の結果（図２Ａ〜Ｃ）
抗ＩＬ−１０受容体抗体を添加することでマスト細胞が発現するＩＬ−１０受容体をブロックし、ＩＬ−１０シグナルを阻害することにより、ＭＭＣＰ−１陽性細胞の誘導がどのような影響を受けるかについて評価した。
(2) Results of Examples 2, 6 and 8-10 (FIGS. 2A-C)
By adding an anti-IL-10 receptor antibody, the IL-10 receptor expressed by mast cells is blocked, and by inhibiting IL-10 signal, the induction of MMCP-1 positive cells is affected. I evaluated it.
図２Ａ及び図２Ｂに示すとおり、ＩＬ−３添加条件及びＩＬ−１０添加条件と比較して、抗ＩＬ−１０受容体（ａＩＬ−１０Ｒ）抗体を添加する条件では、濃度依存的なＭＭＣＰ−１陽性細胞の割合及び数の顕著な減少が確認された。しかし、図２Ｃが示すとおり、全細胞数は、抗ＩＬ−１０受容体抗体を添加することにより若干減少したものの、その程度はＭＭＣＰ−１陽性細胞の割合の減少の程度と比較すると非常に小さかった。すなわち、抗ＩＬ−１０受容体抗体を添加することにより、総細胞数に与える影響は小さいながらも、ＭＭＣＰ−１陽性細胞の数及び割合を格別顕著に減少した。 As shown in FIG. 2A and FIG. 2B, the concentration-dependent MMCP-1 in the condition where the anti-IL-10 receptor (aIL-10R) antibody is added as compared with the IL-3 addition condition and the IL-10 addition condition A significant decrease in the percentage and number of positive cells was confirmed. However, as FIG. 2C shows, although the total cell number was slightly reduced by adding anti-IL-10 receptor antibody, the extent was very small compared with the degree of decrease in the proportion of MMCP-1 positive cells. It was. That is, by adding an anti-IL-10 receptor antibody, the number and ratio of MMCP-1-positive cells were markedly reduced although the influence on the total cell number was small.
図２の結果より、ＩＬ−１０はＭＣ／９細胞からＭＭＣＰ−１陽性細胞を分化誘導する作用があることが確認されたとともに、ＩＬ−１０とＩＬ−１０受容体との結合を阻害することにより、ＭＭＣＰ−１陽性細胞の割合及び数を減じることができることがわかった。 From the results of FIG. 2, it was confirmed that IL-10 has an action of inducing differentiation of MMCP-1 positive cells from MC / 9 cells and inhibits the binding between IL-10 and IL-10 receptor. It was found that the ratio and number of MMCP-1 positive cells can be reduced.
［実施例２］
しょうゆが粘膜型マスト細胞の分化を抑制する効果を有することについて、複数の市販しょうゆ及びモデルしょうゆを用いて、以下のとおりに評価した。
[Example 2]
About soy sauce having the effect which suppresses differentiation of a mucosal type mast cell, it evaluated as follows using several commercial soy sauce and model soy sauce.
マウスの粘膜型マスト細胞は、マスト細胞の表面マーカー分子であるＦｃεＲＩα及びｃ−Ｋｉｔを発現すると同時に、細胞内にＭＭＣＰ−１というプロテアーゼを発現する。マウスマスト細胞株であるＭＣ／９は、ＦｃεＲＩα及びｃ−Ｋｉｔを発現しているが、粘膜型のマーカーであるＭＭＣＰ−１を発現していない。そこで、ＭＣ／９から粘膜型マスト細胞（ＭＭＣＰ−１陽性細胞）への分化を利用して、しょうゆによる分化抑制効果について、下記の実験を実施した。 The mucosal mast cells of the mouse express FcεRIα and c-Kit, which are surface marker molecules of mast cells, and at the same time, express a protease called MMCP-1. MC / 9, a mouse mast cell line, expresses FcεRIα and c-Kit, but does not express MMCP-1, which is a mucosal marker. Then, the following experiment was implemented about the differentiation inhibitory effect by soy sauce using differentiation from MC / 9 to a mucosal type mast cell (MMCP-1 positive cell).
１．細胞培養のための培地の調製
ＳＩＧＭＡ社製Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ培地に、下記の終濃度になるように試薬を添加して、培地を調製した。
１０％（ｗ／ｖ） ＦＢＳ
１％（ｗ／ｖ） Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎｅ／Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ
２ｍＭ Ｌ−ｇｌｕｔａｍｉｎｅ
０．０５ｍＭ ２−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ
１０％（ｗ／ｖ） Ｒａｔ Ｔ−ＳＴＩＭ（日本ベクトン・ディッキンソン社製）
1. Preparation of Medium for Cell Culture A medium was prepared by adding reagents to Dulbecco's Modified Eagle's medium manufactured by SIGMA so as to have the following final concentrations.
10% (w / v) FBS
1% (w / v) Penicilline / Streptomycin
2 mM L-glutamine
0.05 mM 2-mercaptoethanol
10% (w / v) Rat T-STIM (Nippon Becton Dickinson)
２．ＭＣ／９細胞懸濁液の調製
ＭＣ／９（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−８３０６）凍結ストックを培地に添加し、週に２回程度培地を交換しながら培養した。５継代（Ｐ５）の時点で３×１０６ ｃｅｌｌｓ／ｍＬのワーキングストックを作成した。ワーキングストックを培地に添加し、培養後週に２回程度で継代しながら培養することにより、Ｐ９以降の細胞を回収した。回収した細胞について、培地で１回洗浄した後、トリパンブルー（Ｇｉｂｃｏ社製）で懸濁し血球計算板を用いて細胞数を計測した。その後、２×１０６ ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるように培地に懸濁することにより、ＭＣ／９細胞懸濁液を調製した。
2. Preparation of MC / 9 Cell Suspension MC / 9 (ATCC CRL-8306) frozen stock was added to the medium and cultured while changing the medium about twice a week. A working stock of 3 × 10 6 cells / mL was made at the time of passage 5 (P5). The working stock was added to the medium, and the cells after P9 were collected by culturing while subcultured about twice a week after culturing. The collected cells were washed once with a medium, suspended in trypan blue (manufactured by Gibco), and the number of cells was counted using a hemocytometer. Then, MC / 9 cell suspension was prepared by suspending in a culture medium so that it might become 2 * 10 < 6 > cells / mL.
３．サイトカイン溶液の調製
ｍｏｕｓｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ＩＬ−３（１００μＭ；ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）及びｍｏｕｓｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ＩＬ−１０（１００μＭ；ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）を、それぞれ１２０ｎｇ／ｍｌとなるように培地で希釈して、ＩＬ−３溶液及びＩＬ−１０溶液を調製した。
3. Preparation of cytokine solution mouse recombinant protein IL-3 (100 μM; manufactured by eBioscience) and mouse recombinant protein IL-10 (100 μM; manufactured by eBioscience) were each diluted to 120 ng / ml with a medium, and IL-3 was prepared. Solutions and IL-10 solutions were prepared.
４．被験しょうゆ試料の調製
被験しょうゆ試料として、下記の市販しょうゆ及びモデルしょうゆについて、しょうゆ原液の濃度を１として、培地を用いて６０倍、１２０倍、２４０倍、４８０倍又は９６０倍に希釈して試験に供した。
市販しょうゆ：こいくちしょうゆ、特選丸大豆しょうゆ、うすくちしょうゆ、たまりしょうゆ、脱塩しょうゆ（特選丸大豆しょうゆを脱塩処理したもの）（以上、すべてキッコーマン社製）
モデルしょうゆ：たまりしょうゆ（キッコーマン社製）に含まれる成分のうち、酸、食塩、アルコール及びアミノ酸を、たまりしょうゆに含まれる濃度で配合して調製したもの
4). Preparation of test soy sauce samples As test soy sauce samples, the following commercial soy sauce and model soy sauce were tested with the concentration of the soy sauce stock solution being 1, diluted 60-fold, 120-fold, 240-fold, 480-fold or 960-fold with the medium. It was used for.
Commercial soy sauce: Koikuchi soy sauce, selected soy soy sauce, thin soy sauce, tamari soy sauce, desalted soy sauce (desalted soy sauce made from selected soy soy sauce) (all manufactured by Kikkoman)
Model soy sauce: Of ingredients contained in Tamari soy sauce (Kikkoman), acid, salt, alcohol and amino acids are blended at concentrations contained in soy sauce
５．培養方法
表１及び表２の例１〜２８が示すとおりに、９６ウェル平底プレート（ＢＤ ＦＡＬＣＯＮ社製）の各ウェルに、内容物が所定の最終濃度になるように上記溶液及び培地を添加して、初発細胞数を１．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとして３日間培養した。ただし、上記培地として、Ｒａｔ Ｔ−ＳＴＩＭを含有しない培地を用いた。
5. Culturing method As shown in Examples 1 to 28 of Table 1 and Table 2, the above solution and medium were added to each well of a 96-well flat bottom plate (BD FALCON) so that the contents had a predetermined final concentration. Then, the initial cell number was cultured at 1.0 × 10 5 cells / well for 3 days. However, a medium not containing Rat T-STIM was used as the medium.
６．細胞数計測のためのＦＡＣＳＡｒｉａ解析
培養後に回収した細胞を、１×ＰＢＳ／２％ＦＢＳで２回洗浄した後、Ｆｃブロック（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）と反応させた。次いで、反応後の細胞を、ＰＥ標識ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ ＦｃεＲＩα（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）及びＰＥ／ｃｙ７標識ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ ＣＤ１１７（ｃ−Ｋｉｔ）（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）と反応させた。次いで、反応後の細胞を、１×ＰＢＳで１回洗浄した後、Ｆｉｘａｂｌｅ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ｄｙｅ ｅＦｌｕｏｒ ４５０（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）と反応させた。
6). Cells collected after FACSAria analysis culture for cell count were washed twice with 1 × PBS / 2% FBS, and then reacted with Fc block (manufactured by BD Bioscience). Subsequently, the cells after the reaction were reacted with PE-labeled anti-mouse FcεRIα (manufactured by Biolegend) and PE / cy7-labeled anti-mouse CD117 (c-Kit) (manufactured by Biolegend). Next, the cells after the reaction were washed once with 1 × PBS and then reacted with Fixable Viability Dye eFluor 450 (manufactured by eBioscience).
次いで、反応後の細胞を、１×ＰＢＳ／２％ＦＢＳで１回洗浄した後、ＩＣバッファー（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）を用いて固定化した。次いで、固定化した細胞を、Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎバッファー（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）を用いて洗浄した後、Ａｌｅｘａ６４７標識抗ＭＭＣＰ−１抗体（ｐｕｒｉｆｉｅｄ ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ ＭＣＰＴ−１（ｍＭＣＰ−１）（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）をＡｌｅｘａＦｌｏｕｒ６４７ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ（ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）にて標識したもの）と反応させ細胞内標識を行った。次いで、標識した細胞を、１×ＰＢＳ／２％ＦＢＳで洗浄し、さらに同バッファー２００μＬに懸濁した後、ＦＡＣＳＡｒｉａを用いて解析した。解析の際、特定量のＢＤ ＦＡＣＳＴＭ Ａｃｃｕｄｒｏｐ Ｂｅａｄｓ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）を既知体積のサンプルに加え、細胞とともにビーズを計測した。ビーズ量とビーズの取り込み数、生細胞の取り込み数から全細胞数を算出した。さらに全細胞数とＭＭＣＰ−１陽性細胞の割合とから、ＭＭＣＰ−１陽性細胞数を算出した。 Subsequently, the cells after the reaction were washed once with 1 × PBS / 2% FBS, and then immobilized using IC buffer (manufactured by eBioscience). Next, the fixed cells were washed with Permeabilization buffer (manufactured by eBioscience), and then Alexa647-labeled anti-MMCP-1 antibody (purified anti-mouse MCPT-1 (mMCP-1) (manufactured by eBioscience) was alexafloor647bodies. Intracellular labeling was carried out by reacting with a labeling kit (manufactured by life technology). Subsequently, the labeled cells were washed with 1 × PBS / 2% FBS, further suspended in 200 μL of the same buffer, and analyzed using FACSAria. During the analysis, a specific amount of BD FACS ™ Accudrop Beads (manufactured by BD Bioscience) was added to a sample of a known volume, and the beads were counted together with the cells. The total number of cells was calculated from the amount of beads, the number of beads incorporated, and the number of living cells incorporated. Further, the number of MMCP-1 positive cells was calculated from the total number of cells and the ratio of MMCP-1 positive cells.
７．細胞数解析結果
ＦＡＣＳＡｒｉａ解析の結果について、表１に示す例１〜８の結果をまとめたものを図１に示し、表２に示す例９〜２８の結果をまとめたものを図２に示す。
7). Results of cell number analysis As for the results of FACSAria analysis, the results of Examples 1 to 8 shown in Table 1 are summarized in FIG. 1, and the results of Examples 9 to 28 shown in Table 2 are summarized in FIG.
（１）例１〜８の結果（図１Ａ〜Ｃ）
図３Ａが示すとおり、ＩＬ−１０のみを添加した場合やＩＬ−３及びＩＬ−１０を添加した場合と比較して、脱塩しょうゆを添加した場合では、濃度依存的にＭＭＣＰ−１陽性細胞の割合が減少した。同様に、図３Ｂが示すとおり、ＭＭＣＰ−１陽性細胞数についても、濃度依存的にＭＭＣＰ−１陽性細胞数が減少する傾向にあることを確認した。一方で、図３Ｃが示すとおり、総細胞数については、このような傾向は見られなかった。
(1) Results of Examples 1-8 (FIGS. 1A-C)
As shown in FIG. 3A, when desalted soy sauce was added compared to the case where only IL-10 was added or when IL-3 and IL-10 were added, the concentration of MMCP-1 positive cells was dependent on the concentration. The rate has decreased. Similarly, as FIG. 3B shows, it was confirmed that the number of MMCP-1 positive cells also tends to decrease in a concentration-dependent manner. On the other hand, as FIG. 3C shows, such a tendency was not seen about the total cell number.
図３の結果より、しょうゆには、細胞の生存率については影響を与えずにして、濃度依存的にＭＣ／９細胞からのＭＭＣＰ−１陽性細胞への分化を抑制する作用があることが確認された。 From the results of FIG. 3, it is confirmed that soy sauce has an effect of suppressing differentiation from MC / 9 cells to MMCP-1-positive cells in a concentration-dependent manner without affecting the cell viability. It was done.
（２）例９〜２８の結果（図２）
図４に示すとおり、サイトカインのみを添加した場合と比較して、サイトカインに加えて、脱塩しょうゆ、こいくちしょうゆ、たまりしょうゆ、特選丸大豆しょうゆ又はうすくちしょうゆを加えた場合は、ＭＭＣＰ−１陽性細胞の割合が減少した。しかし、しょうゆを製造する際の発酵工程によって主として得られるペプチドやタンパク質を含まないモデルしょうゆでは、ＭＭＣＰ−１陽性細胞の割合の減少はみられなかった。
(2) Results of Examples 9 to 28 (FIG. 2)
As shown in FIG. 4, when desalted soy sauce, koikuchi soy sauce, tamari soy sauce, specialty round soybean soy sauce or lightly soy sauce is added in addition to cytokine, MMCP-1 The percentage of positive cells decreased. However, in the model soy sauce that does not contain peptides or proteins mainly obtained by the fermentation process when producing soy sauce, a decrease in the proportion of MMCP-1-positive cells was not observed.
図４の結果より、しょうゆのような発酵食品は、ＭＣ／９細胞からのＭＭＣＰ−１陽性細胞への分化を抑制する作用があることが確認された。 From the results of FIG. 4, it was confirmed that fermented foods such as soy sauce have an action of suppressing differentiation from MC / 9 cells to MMCP-1 positive cells.
本発明の一態様の組成物は、未成熟マスト細胞から粘膜型マスト細胞への分化を抑制する作用及び抗アレルギー作用を通じて、健常者に加えて、粘膜型マスト細胞の割合の増加に関連した疾患や症状を改善、緩和、抑制、治療又は予防することを期待する摂取者にとって有用なものであり、このような摂取者の健康及び福祉に資するものとして利用可能なものである。また、本明細書で開示される方法は、未成熟マスト細胞株を安定的に粘膜型マスト細胞へ誘導することができることから、粘膜型マスト細胞の割合を高める目的や、粘膜型マスト細胞の機序を評価する目的において利用可能である。 The composition of one embodiment of the present invention is a disease associated with an increase in the proportion of mucosal mast cells in addition to healthy individuals, through the action of inhibiting differentiation from immature mast cells to mucosal mast cells and the antiallergic action. It is useful for those who expect to improve, alleviate, suppress, treat, or prevent symptoms, and can be used to contribute to the health and well-being of such consumers. In addition, since the method disclosed in the present specification can stably induce an immature mast cell line to a mucosal mast cell, the purpose of increasing the proportion of the mucosal mast cell, It can be used for the purpose of evaluating the introduction.
Claims (8)
The antiallergic composition according to any one of claims 5 to 7, wherein the antiallergic composition is an antiallergic composition intended for allergy via mucosal tissue.
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