JP6840120B2 - クエンチャー及びその用途 - Google Patents
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Description
本発明は、励起エネルギー準位における発光特性を示す蛍光物質に対して消光効果を示すクエンチャーとその多様な用途に関する。
本研究は、大韓民国通商産業資源部による「高度技術センター(ATC)プログラム(10076988、分子診断のための蛍光体とその応用技術の開発)」からの助成金の支援を受けたものである。
本研究は、大韓民国通商産業資源部による「高度技術センター(ATC)プログラム(10076988、分子診断のための蛍光体とその応用技術の開発)」からの助成金の支援を受けたものである。
クエンチャー（ｑｕｅｎｃｈｅｒ）とは、蛍光分子の蛍光を消光（ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ）させる分子を意味し、通常、光を吸収できる特性を有する染料が用いられる。
消光現象のメカニズムとしては、蛍光共鳴エネルギー転移（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｅｎｅｒｇｙ ｔｒａｎｓｆｅｒ，ＦＲＥＴ）、光誘起電子移動（ｐｈｏｔｏ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｔｒａｎｓｆｅｒ）及びＨ−二量体形成のような染料の凝集によって起こると知られている。
蛍光染料の蛍光を制御または消滅させるためにクエンチャーを用いる場合、消光染料の吸収波長範囲が蛍光染料の示す蛍光波長領域の相当部分或いは全体領域を包括（重畳）するか否かが最も重要である。
また、消光効果を得るには蛍光染料とクエンチャー間の長さも重要であるが、例えば、ＤＮＡの場合は塩基数、ペプチド／タンパク質の場合はアミノ酸数などが考慮されており、より高い消光効果を得るため蛍光染料及びクエンチャーが標識されるリンカーの長さを調節したりする。
主にバイオ分野で商業的に使用されるクエンチャーの場合、通常、光を発せず吸収のみ可能な染料の構造が選択されるが、ＦＲＥＴ現象を利用した蛍光−蛍光染料の組み合わせも多く活用されている。このように組み合わされた蛍光−消光、蛍光−蛍光染料は、相互距離が遠くなるか、生体分子内から離脱する場合、元の蛍光が復元されるか強くなるため、一種の蛍光のｏｎ／ｏｆｆ機能を付与することができるようになり、このような特性を考慮して、特定タンパク質／酵素などのバイオマーカーに感応できるバイオセンサーや活性化プローブなどを設計する際に多く使用されている。
バイオ分野で使用される蛍光又は消光染料の場合、単独使用される場合は、Ｉｎｄｏｃｙａｎｉｎｅ ｇｒｅｅｎやＭｅｔｈｙｌｅｎｅ ｂｌｕｅのようにＦＤＡ承認を受けた限定した染料に限り、通常は、生体分子の有する置換基に結合できる反応性基が導入される。前記反応性基としては、色々知られているが、置換基選択性、反応速度、収率、再現性、安全性などが大勢の研究者たちによって長い間検証されて来ており、最近は、実際の研究や商業的な目的で染料に導入される反応性基は、幾つかに限定されている。
例えば、タンパク質分子のアミン基との結合を目的とする反応性基として最も多く使用されるものは、スクシンイミジルエステルとイソチオシアネート（ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）であり、タンパク質分子のチオール基との結合を目的とする反応性基として最も多く使用されるものは、マレイミドで、タンパク質分子のヒドロキシ基との結合を目的とする反応性基としては、主にジクロロトリアジン（ｄｉｃｈｌｏｒｏｔｒｉａｚｉｎｅ）が選択される。
但し、前記反応性基は、置換反応で結合されるか、水溶性条件下で長時間反応及び保管安全性を維持しがたい場合がほとんどである。
本発明は、光学映像分野で生体分子の同定を観察するため広範囲に使用され得る化合物であり、新規なクエンチャーを提供することを目的とする。
また、本発明は、前記新規なクエンチャーを含む核酸検出用オリゴヌクレオチド、組成物、支持体及び核酸検出方法を提供することを目的とする。
上述した技術的課題を解決するため、本発明の一側面によれば、下記の化１又は化２で表されるクエンチャーが提供される。
ここで、Ｑは、下記の化３又は化４で表され、
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6及びＲは、それぞれ独立して水素、重水素、電子供与性基（ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｄｏｎａｔｉｎｇ ｇｒｏｕｐ）及び電子求引性基（ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｗｉｔｈｄｒａｗｉｎｇ ｇｒｏｕｐ）から選択されており、ｍ及びｎは、それぞれ独立して０〜３の定数であり、Ｘは、Ｏ、Ｓ、Ｃ Ｒ7Ｒ8又はＳｉＲ7Ｒ8で、Ｙは、Ｏ又はＳで、Ｒ7及びＲ8は、それぞれ独立して置換または非置換されたＣ1−Ｃ40アルキル、少なくとも１つのヘテロ原子を含む置換または非置換されたＣ1−Ｃ40ヘテロアルキル、置換または非置換されたアリール及び置換または非置換されたヘテロアリールから選択されるか、互いに結合して環を形成し、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3及びＲのうち少なくとも１つは、カルボキシル、カルボキシル誘導体、ヒドロキシル、ハロアルキル、求核体、アルデヒド、ケトン、ハロゲン化スルホニル、チオール、アミン、スルフヒドリル、アルケン、エポキシド及びホスホロアミダイトから選択される作用基であるか、前記作用基と共有結合可能な反応性基である。
また、本発明の他の側面によれば、下記の化５又は化６で表されるクエンチャーが提供される。
ここで、Ｑは、下記の化３又は化４で表され、
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6及びＲは、それぞれ独立して水素、重水素、電子供与性基（ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｄｏｎａｔｉｎｇ ｇｒｏｕｐ）及び電子求引性基（ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｗｉｔｈｄｒａｗｉｎｇ ｇｒｏｕｐ）から選択されており、ｍ及びｎは、それぞれ独立して０〜３の定数であり、Ｘは、Ｏ、Ｓ、Ｃ Ｒ7Ｒ8又はＳｉＲ7Ｒ8で、Ｙは、Ｏ又はＳで、Ｒ7及びＲ8は、それぞれ独立して置換または非置換されたＣ1−Ｃ40アルキル、少なくとも１つのヘテロ原子を含む置換または非置換されたＣ1−Ｃ40ヘテロアルキル、置換または非置換されたアリール及び置換または非置換されたヘテロアリールから選択されるか、互いに結合して環を形成し、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3及びＲのうち少なくとも１つは、カルボキシル、カルボキシル誘導体、ヒドロキシル、ハロアルキル、求核体、アルデヒド、ケトン、ハロゲン化スルホニル、チオール、アミン、スルフヒドリル、アルケン、エポキシド及びホスホロアミダイトから選択される作用基であるか、前記作用基と共有結合可能な反応性基である。
また、本発明のさらに他の側面によれば、前記クエンチャーとマイナーグルーブバインダー（ＭＧＢ；ｍｉｎｏｒ ｇｒｏｏｖｅ ｂｉｎｄｅｒ）及び蛍光団を含むオリゴヌクレオチドが提供される。
また、本発明のさらに他の側面によれば、前記オリゴヌクレオチドを含む核酸検出用組成物が提供される。
また、本発明のさらに他の側面によれば、前記クエンチャー、支持体及び前記クエンチャーと前記支持体を連結するリンカーを含む核酸検出用支持体が提供される。
また、本発明のさらに他の側面によれば、（ａ）標的核酸、前記標的核酸を増幅させるために必要な試薬及びオリゴヌクレオチドを含む反応混合物を準備するステップ、（ｂ）前記反応混合物のうち、標的核酸を重合酵素連鎖反応によって増幅するステップ、及び（ｃ）前記反応混合物の蛍光強度を測定するステップを含む核酸検出方法が提供される。
本発明は、励起エネルギー準位における発光特性を示す蛍光物質に対して消光効果を示すクエンチャーとその多様な用途に関し、本発明によるクエンチャーは、従来のクエンチャーに比べて消光効率が高いほど優れた消光特性を示す。
本発明をさらに容易に理解するために便宜上、特定の用語を本願に定義する。本願において別に定義しない限り、本発明に使われた科学用語及び技術用語は、該技術分野で通常の知識を有する者にとって通常理解される意味を有する。
また、文脈上特に指定しない限り、単数形態の用語は、それの複数形態も含むものであり、複数形態の用語は、それの単数形態も含んでいてもよい。
新規クエンチャー
本発明の一側面によれば、下記の化１又は化２で表されるクエンチャーが提供される。
本発明の一側面によれば、下記の化１又は化２で表されるクエンチャーが提供される。
また、本発明の他の側面によれば、下記の化５又は化６で表されるクエンチャーが提供される。
ここで、Ｑは、下記の化３又は化４で表され、
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6及びＲは、それぞれ独立して水素、重水素、電子供与性基（ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｄｏｎａｔｉｎｇ ｇｒｏｕｐ）及び電子求引性基（ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｗｉｔｈｄｒａｗｉｎｇ ｇｒｏｕｐ）から選択される。 化2と化6は、pHに応じて相互に変換することができる共鳴構造である。
ここで、電子供与性基（ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｄｏｎａｔｉｎｇ ｇｒｏｕｐ）とは、誘発効果または共鳴効果によって電子を供与する傾向がある作用基を意味し、例えば、置換または非置換されたＣ1−Ｃ40アルキル、少なくとも１つのヘテロ原子を含む置換または非置換されたＣ1−Ｃ40ヘテロアルキル、置換または非置換されたＣ2−Ｃ40アルケニル、置換または非置換されたＣ2−Ｃ40アルキニル、置換または非置換されたＣ1−Ｃ40アルコキシ、置換または非置換されたアリールオキシ、置換または非置換されたチオール基、置換または非置換されたＣ1−Ｃ40アルキルチオ、置換または非置換されたアリールチオ、ヒドロキシ、置換または非置換されたアミノ、置換または非置換されたアリール、置換または非置換されたヘテロアリール及び置換または非置換されたアルアルキルなどがある。
電子求引性基（ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｗｉｔｈｄｒａｗｉｎｇ ｇｒｏｕｐ）とは、誘発効果または共鳴効果によって電子を求引する傾向がある作用基を意味し、例えば、ハロゲン、シアノ、置換または非置換されたアマイド、カルバマート、スルフヒドリル、ニトロ、カルボキシル、カルボキシル酸塩、４次アンモニウム、リン酸、リン酸塩、ケトン、アルデヒド、エステル、アシルクロライド、スルホン酸及びスルホン酸塩などがある。
一実施例において、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3及びＲ4のうち少なくとも１つは、アミノ、ヒドロキシル、ホスホリル、アルデヒド、カルボキシル及びスルフヒドリルから選択される作用基であるか、前記作用基と共有結合可能な反応性基である。
ここで、反応性基としては、（ａ）カルボキシル基とこの誘導体：Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、Ｎ−ヒドロキシベンズトリアゾールエステル、アシルハライド、アシルイミダゾール、チオエステル、ｐ−ニトロフェニルエステル、アルキルエステル、アルケニルエステル、アルキニルエステル及び芳香族性エステル；（ｂ）エステル、エーテル、アルデヒドに転換され得るヒドロキシル；（ｃ）ハロゲンが例えば、アミン、カルボン酸塩アニオン、チオールアニオン、カルボアニオン又はアルコキシドイオンのような求核性作用基に置換されることによって、他の作用基に共有して付着し得るハロアルキル；（ｄ）例えば、マレイミド基とディールス・アルダー反応できる求核体；（ｅ）イミン、ヒドラゾン、セミカルバゾン又はオキシムのようなカルボニル誘導体を形成することができるアルデヒド又はケトン；（ｆ）アミンと反応してスルホアマイドを形成するハロゲン化スルホニル；（ｇ）ジスルフィドに転換されるか、アシルハライドと反応できるチオール；（ｈ）アシル化、アルキル化又は酸化され得るアミン又はスルフヒドリル；（ｉ）環化付加、アシル化、マイケル反応などのような反応を行えるアルケン；（ｊ）アミン又はヒドロキシル化合物と反応できるエポキシド；（ｋ）ホスホロアミダイト及び核酸反応に有用な他の標準作用基などが用いられてもよい。このような反応性基は、反応性クエンチャーを合成するに必要な反応に参加するか干渉しないように適宜選択されてもよい。
他の実施例において、このような反応性基は、保護基で保護されることによって、反応性基が保護基の存在下で任意の反応に参加しないようにすることができる。例えば、反応性基がヒドロキシルである場合、保護基としては、トリアルキルシリル、４，４−ジメトキシトリチル又はその類似体が用いられてもよい。好ましい保護基の例としては、次の参考文献に記載されている内容を参考すればよい（Ｇｒｅｅｎｅ ｅｔ ａｌ．，ＰＲＯＴＥＣＴＩＶＥ ＧＲＯＵＰＳ ＩＮ ＯＲＧＡＮＩＣ ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９１）。
本発明の様々な実施例によるクエンチャーは、上述した反応性基を介して標的生体分子（例えば、核酸）と結合して標識することが可能である。
上述した反応性基は、標的生体分子のアミノ基、イミノ基、チオール基又はヒドロキシル基などのような作用基と反応できる官能基であって、クエンチャーと標的生体分子との間にアミド結合、イミド結合、ウレタン結合、エステル結合、ホスファイト結合、フォスフェート結合又はグアニジン結合のような共有結合を形成してもよい。
ｍ及びｎは、それぞれ独立して０〜３の定数であり、これにより、Ｒ5又はＲ6は、０個〜３個であってもよい。
Ｘは、Ｏ、Ｓ、ＣＲ7Ｒ8又はＳｉＲ7Ｒ8であり、Ｙは、Ｏ又はＳで、Ｒ7及びＲ8は、それぞれ独立して置換または非置換されたＣ1−Ｃ10アルキル、少なくとも１つのヘテロ原子を含む置換または非置換されたＣ2−Ｃ10ヘテロアルキル、置換または非置換されたアリール及び置換または非置換されたヘテロアリールから選択されるか、互いに結合して環を形成してもよい。
また、Ｒ1及びＲ2は、互いに結合して置換または非置換された環を形成するか、Ｒ1及び／又はＲ2は、隣接したＲ5と互いに結合して置換または非置換された環を形成してもよい。
また、Ｒ3及びＲ4は、互いに結合して置換または非置換された環を形成するか、Ｒ3及び／又はＲ4は、隣接したＲ6と互いに結合して置換または非置換された環を形成してもよい。
相互隣接した作用基が互いに結合して置換された環を形成する場合、環内の任意の炭素は、重水素、置換または非置換されたＣ1−Ｃ40アルキル、少なくとも１つのヘテロ原子を含む置換または非置換されたＣ1−Ｃ40ヘテロアルキル、置換または非置換されたＣ2−Ｃ40アルケニル、置換または非置換されたＣ2−Ｃ40アルキニル、置換または非置換されたＣ1−Ｃ40アルコキシ、置換または非置換されたアリールオキシ、置換または非置換されたＣ1−Ｃ40ハロアルキル、ハロゲン、シアノ、ヒドロキシ、置換または非置換されたアミノ、置換または非置換されたアマイド、カルバマート、スルフヒドリル、ニトロ、カルボキシル、カルボキシル酸塩、置換または非置換されたアリール、置換または非置換されたヘテロアリール、置換または非置換されたアルアルキル、４次アンモニウム、リン酸、リン酸塩、ケトン、アルデヒド、エステル、アシルクロライド、スルホン酸及びスルホン酸塩、置換または非置換されたＣ1−Ｃ40アルキルチオ、置換または非置換されたアリールチオ、置換または非置換されたＣ3−Ｃ20シクロアルキル、少なくとも１つのヘテロ原子を含む置換または非置換されたＣ1−Ｃ20ヘテロシクロアルキル、置換または非置換されたＣ3−Ｃ20シクロアルケニル、少なくとも１つのヘテロ原子を含む置換または非置換されたＣ2−Ｃ20ヘテロシクロアルケニル、置換または非置換されたシリル、置換または非置換されたゲルマニウム、エーテル、ニトリル、ポリアルキレンオキシド、カルボキシル、カルボキシル誘導体、ヒドロキシル、ハロアルキル、求核体、アルデヒド、ケトン、ハロゲン化スルホニル、チオール、アミン、スルフヒドリル、アルケン、エポキシド及びホスホロアミダイトから選択される作用基であるか、前記作用基と共有結合可能な反応性基から選択される少なくとも１つに置換されてもよい。
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8又はＲが置換された場合、前記作用基内の任意の炭素は、重水素、置換または非置換されたＣ1−Ｃ40アルキル、少なくとも１つのヘテロ原子を含む置換または非置換されたＣ1−Ｃ40ヘテロアルキル、置換または非置換されたＣ2−Ｃ40アルケニル、置換または非置換されたＣ2−Ｃ40アルキニル、置換または非置換されたＣ1−Ｃ40アルコキシ、置換または非置換されたアリールオキシ、置換または非置換されたＣ1−Ｃ40ハロアルキル、ハロゲン、シアノ、ヒドロキシ、置換または非置換されたアミノ、置換または非置換されたアマイド、カルバマート、スルフヒドリル、ニトロ、カルボキシル、カルボキシル酸塩、置換または非置換されたアリール、置換または非置換されたヘテロアリール、置換または非置換されたアルアルキル、４次アンモニウム、リン酸、リン酸塩、ケトン、アルデヒド、エステル、アシルクロライド、スルホン酸及びスルホン酸塩、置換または非置換されたＣ1−Ｃ40アルキルチオ、置換または非置換されたアリールチオ、置換または非置換されたＣ3−Ｃ20シクロアルキル、少なくとも１つのヘテロ原子を含む置換または非置換されたＣ1−Ｃ20ヘテロシクロアルキル、置換または非置換されたＣ3−Ｃ20シクロアルケニル、少なくとも１つのヘテロ原子を含む置換または非置換されたＣ2−Ｃ20ヘテロシクロアルケニル、置換または非置換されたシリル、置換または非置換されたゲルマニウム、エーテル、ニトリル、ポリアルキレンオキシド、カルボキシル、カルボキシル誘導体、ヒドロキシル、ハロアルキル、求核体、アルデヒド、ケトン、ハロゲン化スルホニル、チオール、アミン、スルフヒドリル、アルケン、エポキシド及びホスホロアミダイトから選択される作用基であるか、前記作用基と共有結合可能な反応性基から選択される少なくとも１つに置換されてもよい。
本願において、Ｒaがアルケニル又はアルキニルであるとき、アルケニルのｓｐ2−混成炭素又はアルキニルのｓｐ−混成炭素が直接に結合されるか、アルケニルのｓｐ2−混成炭素又はアルキニルのｓｐ−混成炭素に結合されたアルキルのｓｐ3−混成炭素によって間接に結合された形態であってもよい。
本願におけるＣa−Ｃb作用基は、ａ〜ｂ個の炭素原子を有する作用基を意味する。例えば、Ｃa−Ｃbアルキルは、ａ〜ｂ個の炭素原子を有する、直鎖アルキル及び分鎖アルキルなどを含む飽和脂肪族基を意味する。直鎖又は分鎖アルキルは、この主鎖に４０個以下（例えば、Ｃ1−Ｃ10の直鎖、Ｃ3−Ｃ10の分鎖）であってもよい。
具体的には、アルキルは、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉ−プロピル、ｎ−ブチル、ｓ−ブチル、ｉ−ブチル、ｔ−ブチル、ペント−１−イル、ペント−２−イル、ペント−３−イル、３−メチルブト−１−イル、３−メチルブト−２−イル、２−メチルブト−２−イル、２，２，２−トリメチル−１−エチル、ｎ−ヘキシル、ｎ−ヘプチル及びｎ−オキチルであってもよい。
また、本願におけるアルコキシは、−Ｏ−（アルキル）基と−Ｏ−（非置換されたシクロアルキル）基両方を意味するものであって、１つ以上のエステル基及び１〜１０個の炭素原子を有する直鎖又は分鎖炭化水素である。
具体的には、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソプロポキシ、ｎ−ブトキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、ｎ−ペントキシ、ｎ−ヘキソキシ、１，２−ジメチルブトキシ、シクロプロピルオキシ、シクロブチルオキシ、シクロペンチルオキシ、シクロヘキシルオキシなどを含むが、これに限定されるものではない。
また、本願におけるハロゲンは、フルオロ（−Ｆ）、クロロ（−Ｃｌ）、ブロモ（−Ｂｒ）又はヨード（−Ｉ）を意味して、ハロアルキルは、上述したハロゲンに置換されたアルキルを意味する。例えば、ハロメチルは、メチルの水素のうち少なくとも１つがハロゲンに切り換えられたメチル（−ＣＨ2Ｘ、−ＣＨＸ2又は−ＣＸ3）を意味する。
本願におけるアルアルキルは、アリールがアルキルの炭素に置換された形態の作用基であって、−（ＣＨ2）nＡｒの総称である。アルアルキルの例として、ベンジル（−ＣＨ2Ｃ6Ｈ5）又はフェネチル（−ＣＨ2ＣＨ2Ｃ6Ｈ5）などがある。
本願におけるアリールは、別に定義されない限り、単一環または相互接合または共有結合で連結された多重環（好ましくは、１〜４個の環）を含む不飽和芳香族性環を意味する。アリールの非制限的な例としては、フェニル、ビフェニル、ｏ−テルフェニル（ｔｅｒｐｈｅｎｙｌ）、ｍ−テルフェニル、ｐ−テルフェニル、１−ナフチル、２−ナフチル、１−アントリル（ａｎｔｈｒｙｌ）、２−アントリル、９−アントリル、１−フェナントレニル（ｐｈｅｎａｎｔｈｒｅｎｙｌ）、２−フェナントレニル、３−フェナントレニル、４−フェナントレニル、９−フェナントレニル、１−ピレニル、２−ピレニル及び４−ピレニルなどがある。
本願におけるヘテロアリールは、上記で定義されたアリール内の１つ以上の炭素原子が窒素、酸素又は硫黄のような非−炭素原子に置換された作用基を意味する。ヘテロアリールの非制限的な例としては、フリル（ｆｕｒｙｌ）、テトラヒドロフリル、ピロリル（ｐｈｒｒｏｌｙｌ）、ピロリジニル（ｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎｙｌ）、チエニル（ｔｈｉｅｎｙｌ）、テトラヒドロチエニル、オキサゾリル（ｏｘａｚｏｌｙｌ）、イソオキサゾリル（ｉｓｏｘａｚｏｌｙｌ）、トリアゾリル（ｔｒｉａｚｏｌｙｌ）、チアゾリル（ｔｈｉａｚｏｌｙｌ）、イソチアゾリル（ｉｓｏｔｈｉａｚｏｌｙｌ）、ピラゾリル（ｐｙｒａｚｏｌｙｌ）、ピラゾリジニル（ｐｙｒａｚｏｌｉｄｉｎｙｌ）、オキサジアゾリル（ｏｘａｄｉａｚｏｌｙｌ）、チアジアゾリル（ｔｈｉａｄｉａｚｏｌｙｌ）、イミダゾリル（ｉｍｉｄａｚｏｌｙｌ）、イミダゾリニル（ｉｍｉｄａｚｏｌｉｎｙｌ）、ピリジル（ｐｙｒｉｄｙｌ）、ピリダジイル（ｐｙｒｉｄａｚｉｙｌ）、トリアジニル（ｔｒｉａｚｉｎｙｌ）、ピペリジニル（ｐｉｐｅｒｉｄｉｎｙｌ）、モルホリニル（ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｙｌ）、チオモルホリニル（ｔｈｉｏｍｏｒｐｈｏｌｉｎｙｌ）、ピラジニル（ｐｙｒａｚｉｎｙｌ）、ピペライニル（ｐｉｐｅｒａｉｎｙｌ）、ピリミジニル（ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｙｌ）、ナフチリジニル（ｎａｐｈｔｈｙｒｉｄｉｎｙｌ）、ベンゾフラニル、ベンゾチエニル、インドリル（ｉｎｄｏｌｙｌ）、インドリニル、インドリジニル、インダゾリル（ｉｎｄａｚｏｌｙｌ）、キノリジニル、キノリニル、イソキノリニル、シンノリニル（ｃｉｎｎｏｌｉｎｙｌ）、フタラジニル（ｐｈｔｈａｌａｚｉｎｙｌ）、キナゾリニル、キノキサリニル、プテリジニル（ｐｔｅｒｉｄｉｎｙｌ）、キヌクリジニル（ｑｕｉｎｕｃｌｉｄｉｎｙｌ）、カルバゾイル、アクリジニル、フェナジニル、フェノチジニル（ｐｈｅｎｏｔｈｉｚｉｎｙｌ）、フェノキサジニル、フリニル、ベンズイミダゾリル（ｂｅｎｚｉｍｉｄａｚｏｌｙｌ）及びベンゾチアゾリルなどと、これらが接合した類似体がある。
本願における炭化水素環（ｃｙｃｌｏａｌｋｙｌ）又はヘテロ原子を含む炭化水素環（ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｏａｌｋｙｌ）は、別に定義されない限り、それぞれアルキル又はヘテロアルキルの環型構造に理解されてもよい。
炭化水素環の非制限的な例としては、シクロペンチル、シクロヘキシル、１−シクロヘキセニル、３−シクロヘキセニル及びシクロヘプチルなどがある。ヘテロ原子を含む炭化水素環の非制限的な例としては、１−（１，２，５，６−テトラヒドロピリジル）、１−ピペリジニル、２−ピペリジニル、３−ピペリジニル、４−モルホリニル、３−モルホリニル、テトラヒドロフラン−２−イル、テトラヒドロフラン−３−イル、テトラヒドロチエン−２−イル、テトラヒドロチエン−３−イル、１−ピペラジニル、２−ピペラジニルなどがある。
また、炭化水素環又はヘテロ原子を含む炭化水素環は、ここに炭化水素環、ヘテロ原子を含む炭化水素環、アリール又はヘテロアリールが接合されるか、共有結合で連結された形態を有していてもよい。
ここで、ポリアルキレンオキシドは、水溶性ポリマー作用基であって、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）、ポリエチレングリコール−ポリプロピレングリコール（ＰＥＧ−ＰＰＧ）コポリマー及びＮ−置換されたメタクリルアマイド−含有ポリマー及びコポリマーを含む。
ポリアルキレンオキシドは、ポリマーの特性を維持する限度内で、必要によって追加して置換されてもよい。例えば、前記置換は、ポリマーの化学的又は生物学的安全性を増加又は減少させるための化学的結合であってもよい。具体的な例として、ポリアルキレンオキシド内の任意の炭素又は末端炭素は、ヒドロキシ、アルキルエーテル（メチルエーテル、エチルエーテル、プロピルエーテルなど）、カルボキシルメチルエーテル、カルボキシエルエーテル、ベンジルエーテル、ジベンジルメチレンエーテル又はジメチルアミンに置換されてもよい。一実施例において、ポリアルキレンオキシドは、メチルエーテルに終結されるポリアルキレンオキシド（ｍＰＥＧ）であってもよく、ここで、ｍＰＥＧは、−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）nＣＨ3の化学式で表され、エチレングリコール繰り返し単位数に相当するｎの大きさによってｍＰＥＧの大きさが異なる。
また、化１、化２、化５及び化６で表されるクエンチャーは、カウンターイオンをさらに含む構造を有してもよい。カウンターイオンは、有機又は無機アニオンであって、クエンチャーの溶解度及び安全性などを考慮して適宜選択されてもよい。
本発明の一実施例によるクエンチャーのカウンターイオンの例として、リン酸６フッ化物イオン、ハロゲンイオン、リン酸イオン、過塩素酸イオン、過ヨード酸イオン、アンチモン６フッ化物イオン、酒石酸６フッ化物イオン、フルオロホウ酸イオン及び４フルオロイオンなどのような無機酸アニオンとチオシアン酸イオン、ベンゼンスルホン酸イオン、ナフタレンスルホン酸イオン、ｐ−トルエンスルホン酸イオン、アルキルスルホン酸イオン、ベンゼンカルボキシル酸イオン、アルキルカルボキシル酸イオン、３ハロアルキルカルボキシル酸イオン、アルキルスルホン酸イオン、トリハロアルキルスルホン酸イオン、及びニコチン酸イオンなどのような有機酸イオンがある。また、チオビスフェノールキレート又はビスジオル−α−ジケントンなどのような金属化合物イオン、ソジウム及びポタシウムなどのような金属イオンと４次アンモニウム塩もカウンターイオンとして選択されてもよい。
化１、化２、化５及び化６で表されるクエンチャーの具体的な例は、次のとおりである。
［化合物１］
［化合物２］
［化合物３］
［化合物４］
［化合物５］
［化合物６］
［化合物７］
［化合物８］
［化合物９］
［化合物１０］
［化合物１１］
［化合物１２］
［化合物１３］
［化合物１４］
［化合物１５］
［化合物１６］
［化合物１７］
［化合物１８］
［化合物１９］
［化合物２０］
［化合物２１］
［化合物２２］
［化合物２３］
［化合物２４］
本願に開示されている化１、化２、化５及び化６で表されるクエンチャーの標的になる生体分子は、抗体、脂質、タンパク質、ペプチド、炭水化物、核酸（ヌクレオチドを含む）から選択される少なくとも１つであってもよい。
脂質の具体的な例としては、脂肪酸（ｆａｔｔｙ ａｃｉｄｓ）、燐脂質（ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄｓ）、リポ多糖（ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ）などがあり、炭水化物の具体的な例としては、単糖類、二糖類、多糖類（例えば、デキストラン）を含む。
このとき、生体分子は、化１、化２、化５及び化６で表されるクエンチャーの任意の作用基又は化１、化２、化５及び化６で表されるクエンチャーに結合された反応性基と反応するための作用基であって、アミノ、スルフヒドリル（ｓｕｌｐｈｙｄｒｙｌ）、カルボニル、ヒドロキシル、カルボキシル、リン酸及びチオリン酸から選択される少なくとも１つを含むか、この誘導体の形態を有していてもよい。
また、生体分子は、アミノ、スルフヒドリル（ｓｕｌｐｈｙｄｒｙｌ）、カルボニル、ヒドロキシル、カルボキシル、リン酸及びチオリン酸から選択される少なくとも１つを含むか、この誘導体の形態を有するオキシ又はジオキシポリ核酸であってもよい。
また、生体分子のほか、化１、化２、化５又は化６で表されるクエンチャーは、アミノ、スルフヒドリル（ｓｕｌｐｈｙｄｒｙｌ）、カルボニル、ヒドロキシル、カルボキシル、リン酸及びチオリン酸から選択される少なくとも１つを含む薬物、ホルモン（水溶体リガンドを含む）、水溶体、酵素又は酵素基質、細胞、細胞膜、毒素、微生物又はナノバイオ素材（ポリスチレンミクロスフェアなど）などを標識するために用いられてもよい。
新規クエンチャーを含むオリゴヌクレオチド、核酸検出用組成物、核酸検出用支持体
本発明の他の側面によれば、化１、化２、化５及び化６で表されるクエンチャーから選択される少なくとも１つを含むオリゴヌクレオチドが提供される。
本発明の他の側面によれば、化１、化２、化５及び化６で表されるクエンチャーから選択される少なくとも１つを含むオリゴヌクレオチドが提供される。
オリゴヌクレオチドは、１〜数百個のヌクレオチドのポリマーを意味するものであって、ＤＮＡ、ＲＮＡ又はＰＮＡを全て含む。また、これらの類似体例えば、前記ヌクレオチドに化学的変更を加えたもの、又は糖を結合したものなど、通常の技術者が容易に変形を加えられるものなどを全て含めており、単一筋又は二重筋からなったあらゆるものを含むことを意味する。
オリゴヌクレオチドは、プローブを含むものが好ましい。このようなプローブは、標的となる核酸と相補的に結合できるプローブであるものがさらに好ましいが、これに限定されるものではない。ここで、プローブは、核酸、ペプチド、糖類、オリゴヌクレオチド、タンパク質、抗体又はこれらの組み合わせから選択されたものであってもよいが、これに限定されるものではない。
一実施例において、オリゴヌクレオチドは、蛍光団を含んでいてもよい。例えば、オリゴヌクレオチドの５’末端には蛍光団が標識されており、３’末端には化１、化２、化５及び化６で表されるクエンチャーから選択される少なくとも１つが標識されていてもよい。５’末端と３’末端の間には、標的となる核酸と相補的に結合できるプローブが位置してもよい。
蛍光団は、次の参考文献に公開されている蛍光団の種類を参考すればよい（Ｃａｒｄｕｌｌｏ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：８７９０−８７９４（１９８８）；Ｄｅｘｔｅｒ，Ｄ．Ｌ．，Ｊ．ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐｈｙｓｉｃｓ ２１：８３６−８５０（１９５３）；Ｈｏｃｈｓｔｒａｓｓｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ４５：１３３−１４１（１９９２）；Ｓｅｌｖｉｎ，Ｐ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ２４６：３００−３３４（１９９５）；Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇ，Ｉ．Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，４０：８３−１１４（１９７１）；Ｓｔｒｙｅｒ，Ｌ．Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，４７：８１９−８４６（１９７８）；Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ３１：６４９３−６４９６（１９９０）；Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６７：１１９７−１２０３（１９９５））。
また、本願に使用できる蛍光団の非制限的な例としては、４−ａｃｅｔａｍｉｄｏ−４’−ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｏｓｔｉｌｂｅｎｅ−２，２’ｄｉｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ、アクリジン及びこの誘導体、５−（２’−ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ−１−ｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ（ＥＤＡＮＳ）、４−ａｍｉｎｏ−Ｎ−［３−ｖｉｎｙｌｓｕｌｆｏｎｙｌ）ｐｈｅｎｙｌ］ｎａｐｈｔｈａｌｉｍｉｄｅ−３，５ｄｉｓｕｌｆｏｎａｔｅ、Ｎ−（４−ａｎｉｌｉｎｏ−１−ｎａｐｈｔｈｙｌ）ｍａｌｅｉｍｉｄｅ、ａｎｔｈｒａｎｉｌａｍｉｄｅ、ＢＯＤＩＰＹ、Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｙｅｌｌｏｗ、クマリン（７−ａｍｉｎｏ−４−ｍｅｔｈｙｌｃｏｕｍａｒｉｎ（ＡＭＣ、Ｃｏｕｍａｒｉｎ１２０）、７−ａｍｉｎｏ−４−ｔｒｉｆｌｕｏｒｏｍｅｔｈｙｌｃｏｕｌｕａｒｉｎ（Ｃｏｕｍａｒａｎ１５１））及びこの誘導体、シアン染料、シアノシン、４’，６−ｄｉａｍｉｎｉｄｉｎｏ−２−ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅ（ＤＡＰＩ）、５’，５”−ｄｉｂｒｏｍｏｐｙｒｏｇａｌｌｏｌ−ｓｕｌｆｏｎａｐｈｔｈａｌｅｉｎ（Ｂｒｏｍｏｐｙｒｏｇａｌｌｏｌ Ｒｅｄ）、７−ｄｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ−３−（４’−ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｏｐｈｅｎｙｌ）−４−ｍｅｔｈｙｌｃｏｕｍａｒｉｎ、ｄｉｅｔｈｙｌｅｎｅｔｒｉａｍｉｎｅｐｅｎｔａａｃｅｔａｔｅ、４，４’−ｄｉｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｏｄｉｈｙｄｒｏ−ｓｔｉｌｂｅｎｅ−２，２’−ｄｉｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ、４，４’−ｄｉｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｏｓｔｉｌｂｅｎｅ−２，２’−ｄｉｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ、５−［ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ］ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ−１−ｓｕｌｆｏｎｙｌ ｃｈｌｏｒｉｄｅ（ＤＮＳ、ｄａｎｓｙｌｃｈｌｏｒｉｄｅ）、４−（４’−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｈｅｎｙｌａｚｏ）ｂｅｎｚｏｉｃ ａｃｉｄ（ＤＡＢＣＹＬ）、４−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｈｅｎｙｌａｚｏｐｈｅｎｙｌ−４’−ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ（ＤＡＢＩＴＣ）、エオシン及びこの誘導体（エオシンイソシアネート）、エリスロシン及びこの誘導体（エリスロシンＢ、エリスロシンイソシアネート）、イチジウム、フルロセイン及びこの誘導体（５−カルボキシフルロセイン（ＦＡＭ））、５−（４，６−ｄｉｃｈｌｏｒｏｔｒｉａｚｉｎ−２−ｙｌ）ａｍｉｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ（ＤＴＡＦ）、２’，７’−ｄｉｍｅｔｈｏｘｙ−４’５’−ｄｉｃｈｌｏｒｏ−６−ｃａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ（ＪＯＥ）、ＱＦＩＴＣ（ＸＲＩＴＣ）、ｆｌｕｏｒｅｓｃａｍｉｎｅ、ＩＲ１４４、ＩＲ１４４６、Ｍａｌａｃｈｉｔｅ Ｇｒｅｅｎ ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ、４−ｍｅｔｈｙｌｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒｏｎｅ、ｏｒｔｈｏ ｃｒｅｓｏｌｐｈｔｈａｌｅｉｎ、ｎｉｔｒｏｔｙｒｏｓｉｎｅ、ｐａｒａｒｏｓａｎｉｌｉｎｅ、フェノルレッド、Ｂ−ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ、ｏ−フタルジアルデヒド、ピレン及びこの誘導体（ピレンブチレート、スクシンイミジル１−ピレンブチレート）、量子ドット、Ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｒｅｄ４（ＣｉｂａｃｒｏｎTMＢｒｉｌｌｉａｎｔ Ｒｅｄ３Ｂ−Ａ）、ロダミン及びこの誘導体（６−カルボキシ−Ｘ−ロダミン、６−カルボキシロダミン、ロダミンＢ、ロダミン１２３、ロダミンＸイソシアネート、スルホロダミンＢ、スルホロダミン１０１、テトラメジルロダミン、テトラメチルロダミンイソシアネート）、リボフラビン、ｒｏｓｏｌｉｃ ａｃｉｄ、ピレン、カルボピロニン、オキサジン、ザンテン、チオザンテン及びｔｅｒｂｉｕｍ ｃｈｅｌａｔｅ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓなどがある。
また、本発明によるオリゴヌクレオチドは、核酸との結合力を向上させるためにマイナーグルーブバインダー（ＭＧＢ；ｍｉｎｏｒ ｇｒｏｏｖｅ ｂｉｎｄｅｒ）をさらに含んでいてもよい。
このようなオリゴヌクレオチドは、化学的、生物学的領域で多様に活用することができる。特に、リアルタイム重合酵素連鎖反応又はマイクロアッセイ（ｍｉｃｒｏａｓｓａｙ）などに有用に用いられるが、これに限定されるものではない。
また、本発明の他の側面によれば、前記オリゴヌクレオチドを含む核酸検出用組成物が提供される。
本発明の一実施例による核酸検出用組成物は、化１、化２、化５又は化６で表されるクエンチャーとマイナーグルーブバインダー及び蛍光団を共に含むオリゴヌクレオチドとともに、標的生体分子との反応のための酵素、溶媒（緩衝液など）及びその他試薬などをさらに含んでいてもよい。
ここで溶媒としては、リン酸塩緩衝液、炭酸塩緩衝液及びトリス緩衝液で構成された群から選択される緩衝液、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、ジクロロメタン、メタノール、エタノール及びアセトニトリルから選択される有機溶媒又は水などを用いてもよく、溶媒の種類によってクエンチャーに様々な作用基を導入することによって溶解度を調節することが可能である。
また、本発明のさらに他の側面によれば、化１、化２、化５又は化６で表されるクエンチャー、支持体及び前記クエンチャーと前記支持体を連結するリンカーを含む核酸検出用支持体が提供される。
これにより、サンプル内の生体分子は、支持体上に固着化したクエンチャーとの相互作用によって支持マトリックス上に固定されてもよい。
前記支持マトリックスは、ガラス、セルロース、ナイロン、アクリルアマイドゲル、デキストラン、ポリスチレン、アルジネート、コラゲン、ペプチド、ピブリン、ヒアルロン酸、アガロース、ポリヒドロキシエチルメタクリレート、ポリビニルアルコール、ポリエチレングライコール、ポリエチレンオキシド、ポリエチレングライコールジアクリレート、ゼラチン、マトリゲル（ｍａｔｒｉｇｅｌ）、ポリ乳酸、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、キトサン、ラクテックス及びセファロースから選択される少なくとも１つで製造されてもよいし、ビーズまたはメンブレンの形態であってもよい。
ここで、リンカーは、クエンチャーと支持体を連結する部分であって、クエンチャーと支持体を連結できる任意の物質は、いずれも本願で意図したリンカーとして用いることができる。
例えば、リンカーは、置換または非置換されたＣ1−Ｃ30アルキル、少なくとも１つのヘテロ原子を含む置換または非置換されたＣ2−Ｃ30ヘテロアルキル、置換または非置換されたＣ6−Ｃ30アリール及び置換または非置換されたＣ3−Ｃ30ヘテロアリールから選択されてもよいし、より具体的には、１〜６個のエチレングリコールが連結された鎖であってもよい。
このようなリンカーは、クエンチャーと支持体を連結するだけであり、クエンチャー又は蛍光団の他の反応または蛍光及び消光作用に影響を及ぼさない。
核酸検出方法
本発明の一実施例によれば、標的核酸にクエンチャーで標識されたプローブを反応させて標識する方法を具現することができる。また、標的生体分子の種類によってクエンチャーに適宜な反応性基を導入することで、標的−特異的相互作用を利用した生体分子の標識方法を具現することもできる。また、クエンチャーで標識した生体分子を電気泳動によって同定する方法を具現することもできる。
本発明の一実施例によれば、標的核酸にクエンチャーで標識されたプローブを反応させて標識する方法を具現することができる。また、標的生体分子の種類によってクエンチャーに適宜な反応性基を導入することで、標的−特異的相互作用を利用した生体分子の標識方法を具現することもできる。また、クエンチャーで標識した生体分子を電気泳動によって同定する方法を具現することもできる。
ＤＮＡマイクロアレイ法
ＤＮＡマイクロアレイ法は、標識すべきである標的核酸に染料を反応させて標識する一方、標的核酸に対して相補的塩基序列を有する単一鎖のプローブ核酸を準備し、単一鎖に変性させた標的核酸とプローブ核酸を基板上で混成化して、標的核酸の蛍光を測定する。
ＤＮＡマイクロアレイ法は、標識すべきである標的核酸に染料を反応させて標識する一方、標的核酸に対して相補的塩基序列を有する単一鎖のプローブ核酸を準備し、単一鎖に変性させた標的核酸とプローブ核酸を基板上で混成化して、標的核酸の蛍光を測定する。
本標識方法において、基板に固定するプローブ核酸としては、遺伝子の発現を調査する場合、ｃＤＮＡなどのｃＤＮＡのライブラリ、ゲノムのライブラリ又はあらゆるゲノムを鋳型にしてＰＣＲ法によって増幅して調剤したものを用いてもよい。
また、遺伝子変異などを調査する場合、標準となる既に知られた序列に基づいて、変異などに対応する様々なオリゴヌクレオチドを合成したものを用いてもよい。
プローブ核酸を基板上に固定することは、核酸の種類や基板の種類によって適宜な方法を選択してもよい。例えば、ＤＮＡの電荷を用いてポリリジンなどのカチオンで表面処理した基板に静電結合させる方法を用いてもよい。
単一鎖に変性させた標的核酸を基板上に固定して、オリゴヌクレオチドと混成化する。ここで、オリゴヌクレオチドの５’末端には蛍光団が標識されて、３’末端には化１、化２、化５及び化６で表されるクエンチャーから選択される少なくとも１つが標識される。５’末端と ３’末端の間には、標的となる核酸と相補的結合できるプローブが位置してもよい。
混成化は、室温〜７０℃、そして、２〜４８時間の範囲で行うことが好ましい。混成化によってプローブ核酸と相補的塩基序列を有する標的核酸が選択的にプローブ核酸と結合する。その後、基板を洗浄して室温で乾燥する。
このとき、オリゴヌクレオチドは、プローブによって標的核酸に混成化されるが、５’末端の蛍光団は、３’末端のクエンチャーによって消光された状態で存在する。
次いで、標的核酸に混成化されたオリゴヌクレオチドは、重合酵素によって伸長されるが、オリゴヌクレオチドは、重合酵素のエクソヌクレアーゼ活性によって標的核酸から分離及び分解され、オリゴヌクレオチドの５’末端の蛍光団と３’末端のクエンチャーは、互いに分離されて、これにより蛍光団は、蛍光を発するようになる。
このとき、発生する蛍光強度を測定して、標的核酸の増幅量を測定することができるようになる。
以下では、本発明の具体的な実施例を提示する。但し、下記に記載されている実施例は、本発明を具体的に例示するか説明するためのものに過ぎないし、これによって本発明が制限されてはならない。
製造例１．化合物４の合成
ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ１の合成
２５０ｍＬの１口反応器にＳｔａｒｔｉｎｇ ｍａｔｅｒｉａｌ（１０ｇ、２０．３１ｍｍｏｌ）、Ａｍｉｎｅ（３２．５ｇ、１０１．５６ｍｍｏｌ）、ジメチルスルホキシド（１００ｍＬ）を入れて６０℃で４８時間撹拌する。冷却後、反応器に水（１００ｍＬ）を入れて強撹拌した後、酢酸エチル（１００ｍＬ×２）で抽出する。有機層に無水硫酸マグネシウムを入れて５分間撹拌した後、固体をろ過する。余液は、濃縮してカラム精製する。（１．８ｇ、３．３０９ｍｍｏｌ、１１％）
２５０ｍＬの１口反応器にＳｔａｒｔｉｎｇ ｍａｔｅｒｉａｌ（１０ｇ、２０．３１ｍｍｏｌ）、Ａｍｉｎｅ（３２．５ｇ、１０１．５６ｍｍｏｌ）、ジメチルスルホキシド（１００ｍＬ）を入れて６０℃で４８時間撹拌する。冷却後、反応器に水（１００ｍＬ）を入れて強撹拌した後、酢酸エチル（１００ｍＬ×２）で抽出する。有機層に無水硫酸マグネシウムを入れて５分間撹拌した後、固体をろ過する。余液は、濃縮してカラム精製する。（１．８ｇ、３．３０９ｍｍｏｌ、１１％）
ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ２の合成
１００ｍＬの１口反応器にｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ１（１．８ｇ、３．３０９ｍｍｏｌ）、イミダゾール（０．６８ｇ、９．９２９ｍｍｏｌ）、ｔｅｒｔ−ブチル−ｄｉ−メチルクロロシラン（０．７５ｇ、４．９６４ｍｍｏｌ）、ジメチルホルムアマイド（２０ｍＬ）を入れて、常温で１時間撹拌する。反応器に酢酸エチル（８０ｍＬ）を入れて塩水（２００ｍＬ×２）で洗う。有機層に無水硫酸マグネシウムを入れて５分間撹拌した後、固体をろ過する。余液は、濃縮してカラム精製する。（１．３７ｇ、２．０８１ｍｍｏｌ、６３％）
１００ｍＬの１口反応器にｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ１（１．８ｇ、３．３０９ｍｍｏｌ）、イミダゾール（０．６８ｇ、９．９２９ｍｍｏｌ）、ｔｅｒｔ−ブチル−ｄｉ−メチルクロロシラン（０．７５ｇ、４．９６４ｍｍｏｌ）、ジメチルホルムアマイド（２０ｍＬ）を入れて、常温で１時間撹拌する。反応器に酢酸エチル（８０ｍＬ）を入れて塩水（２００ｍＬ×２）で洗う。有機層に無水硫酸マグネシウムを入れて５分間撹拌した後、固体をろ過する。余液は、濃縮してカラム精製する。（１．３７ｇ、２．０８１ｍｍｏｌ、６３％）
ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ３の合成
２５０ｍＬの３口反応器にＲｅａｇｅｎｔ（１．２ｇ、４．１６３ｍｍｏｌ）、テトラヒドロフラン（１５ｍＬ）を入れて、窒素気流下において−７８℃で５分間撹拌する。反応器に１．６Ｍのｎ−ブチリチウム（２ｍＬ、３．１２１ｍｍｏｌ）を徐々に滴下した後、−７８℃で１時間撹拌する。ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ２（１．３７ｇ、２．０８１ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン（１５ｍＬ）に溶かして反応器に滴下した後、常温で１２時間撹拌する。反応器に２Ｍの塩酸（１０ｍＬ）を入れて３０分間強撹拌する。濃縮後、カラム精製する。（０．７６ｇ、１．５ｍｍｏｌ、７２％）
２５０ｍＬの３口反応器にＲｅａｇｅｎｔ（１．２ｇ、４．１６３ｍｍｏｌ）、テトラヒドロフラン（１５ｍＬ）を入れて、窒素気流下において−７８℃で５分間撹拌する。反応器に１．６Ｍのｎ−ブチリチウム（２ｍＬ、３．１２１ｍｍｏｌ）を徐々に滴下した後、−７８℃で１時間撹拌する。ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ２（１．３７ｇ、２．０８１ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン（１５ｍＬ）に溶かして反応器に滴下した後、常温で１２時間撹拌する。反応器に２Ｍの塩酸（１０ｍＬ）を入れて３０分間強撹拌する。濃縮後、カラム精製する。（０．７６ｇ、１．５ｍｍｏｌ、７２％）
化合物４の合成
２５０ｍＬの１口反応器にｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ３（１９０ｍｇ、０．３７５ｍｍｏｌ）、４，４’−Ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｔｒｉｔｙｌ Ｃｈｌｏｒｉｄｅ（１３０ｍｇ、０．３７５ｍｍｏｌ）、４−（Ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｐｙｒｉｄｉｎｅ（４５ｍｇ、０．３７５ｍｍｏｌ）、ジメチルホルムアミド（２ｍＬ）を入れて常温で１２時間撹拌する。濃縮後、カラム精製する。（２０ｍｇ、０．０２４７ｍｍｏｌ、７％）1Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ3）δ７．３６−７．３３（ｍ、２Ｈ）、７．２６−７．１１（ｍ、１０Ｈ）、６．７２（ｄ、４Ｈ、Ｊ=８．７Ｈｚ）、４．６５−６．６２（ｍ、３Ｈ）、６．４８−６．４０（ｍ、２Ｈ）、３．９９−３．９７（ｍ、２Ｈ）、３．９０−３．４９（ｍ、１４Ｈ）、３．２２（ｍ、３Ｈ）、３．０９（ｍ、３Ｈ）
２５０ｍＬの１口反応器にｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ３（１９０ｍｇ、０．３７５ｍｍｏｌ）、４，４’−Ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｔｒｉｔｙｌ Ｃｈｌｏｒｉｄｅ（１３０ｍｇ、０．３７５ｍｍｏｌ）、４−（Ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｐｙｒｉｄｉｎｅ（４５ｍｇ、０．３７５ｍｍｏｌ）、ジメチルホルムアミド（２ｍＬ）を入れて常温で１２時間撹拌する。濃縮後、カラム精製する。（２０ｍｇ、０．０２４７ｍｍｏｌ、７％）1Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ3）δ７．３６−７．３３（ｍ、２Ｈ）、７．２６−７．１１（ｍ、１０Ｈ）、６．７２（ｄ、４Ｈ、Ｊ=８．７Ｈｚ）、４．６５−６．６２（ｍ、３Ｈ）、６．４８−６．４０（ｍ、２Ｈ）、３．９９−３．９７（ｍ、２Ｈ）、３．９０−３．４９（ｍ、１４Ｈ）、３．２２（ｍ、３Ｈ）、３．０９（ｍ、３Ｈ）
製造例２．化合物７の合成
ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ１の合成
２５０ｍＬの１口反応器にＳｔａｒｔｉｎｇ ｍａｔｅｒｉａｌ（１０ｇ、２０．３１ｍｍｏｌ）、Ａｍｉｎｅ（３２．５ｇ、１０１．５６ｍｍｏｌ）、ジメチルスルホキシド（１００ｍＬ）を入れて６０℃で４８時間撹拌する。冷却後、反応器に水（１００ｍＬ）を入れて強撹拌した後、酢酸エチル（１００ｍＬ×２）で抽出する。有機層に無水硫酸マグネシウムを入れて５分間撹拌した後、固体をろ過する。余液は、濃縮してカラム精製する。（１０．１１ｇ、１４．９ｍｍｏｌ、７３％）
２５０ｍＬの１口反応器にＳｔａｒｔｉｎｇ ｍａｔｅｒｉａｌ（１０ｇ、２０．３１ｍｍｏｌ）、Ａｍｉｎｅ（３２．５ｇ、１０１．５６ｍｍｏｌ）、ジメチルスルホキシド（１００ｍＬ）を入れて６０℃で４８時間撹拌する。冷却後、反応器に水（１００ｍＬ）を入れて強撹拌した後、酢酸エチル（１００ｍＬ×２）で抽出する。有機層に無水硫酸マグネシウムを入れて５分間撹拌した後、固体をろ過する。余液は、濃縮してカラム精製する。（１０．１１ｇ、１４．９ｍｍｏｌ、７３％）
ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ２の合成
２５０ｍＬの１口反応器にｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ１（８．２ｇ、１４．９ｍｍｏｌ）、Ａｍｉｎｅ（１０ｍＬ、１４９ｍｍｏｌ）、ジメチルスルホキシド（８０ｍＬ）を入れて０℃で１時間撹拌する。冷却後、反応器に水（１００ｍＬ）を入れて強撹拌した後、酢酸エチル（１００ｍＬ×２）で抽出する。有機層に無水硫酸マグネシウムを入れて５分間撹拌した後、固体をろ過する。余液は、濃縮してカラム精製する。（５．１７ｇ、８．４６ｍｍｏｌ、５７％）
２５０ｍＬの１口反応器にｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ１（８．２ｇ、１４．９ｍｍｏｌ）、Ａｍｉｎｅ（１０ｍＬ、１４９ｍｍｏｌ）、ジメチルスルホキシド（８０ｍＬ）を入れて０℃で１時間撹拌する。冷却後、反応器に水（１００ｍＬ）を入れて強撹拌した後、酢酸エチル（１００ｍＬ×２）で抽出する。有機層に無水硫酸マグネシウムを入れて５分間撹拌した後、固体をろ過する。余液は、濃縮してカラム精製する。（５．１７ｇ、８．４６ｍｍｏｌ、５７％）
ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ３の合成
２５０ｍＬの３口反応器にＲｅａｇｅｎｔ（８．７８ｇ、３０．４６ｍｍｏｌ）、テトラヒドロフラン（９０ｍＬ）を入れて窒素気流下において−７８℃で５分間撹拌する。反応器に１．６Ｍのｎ−ブチリチウム（１５．８ｍＬ、２５．３８ｍｍｏｌ）を徐々に滴下した後、−７８℃で１時間撹拌する。ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ２（５．１７ｇ、８．４６ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン（２０ｍＬ）に溶かして反応器に滴下した後、常温で１２時間撹拌する。反応器に２Ｍの塩酸（２０ｍＬ）を入れて３０分間強撹拌する。濃縮後、カラム精製する。（４．５ｇ、７．３７ｍｍｏｌ、８７％）
２５０ｍＬの３口反応器にＲｅａｇｅｎｔ（８．７８ｇ、３０．４６ｍｍｏｌ）、テトラヒドロフラン（９０ｍＬ）を入れて窒素気流下において−７８℃で５分間撹拌する。反応器に１．６Ｍのｎ−ブチリチウム（１５．８ｍＬ、２５．３８ｍｍｏｌ）を徐々に滴下した後、−７８℃で１時間撹拌する。ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ２（５．１７ｇ、８．４６ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン（２０ｍＬ）に溶かして反応器に滴下した後、常温で１２時間撹拌する。反応器に２Ｍの塩酸（２０ｍＬ）を入れて３０分間強撹拌する。濃縮後、カラム精製する。（４．５ｇ、７．３７ｍｍｏｌ、８７％）
化合物７の合成
２５０ｍＬの１口反応器にｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ３（１．８ｇ、２．９４９ｍｍｏｌ）、４，４’−Ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｔｒｉｔｙｌ Ｃｈｌｏｒｉｄｅ（１ｇ、２．９４９ｍｍｏｌ）、４−（Ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｐｙｒｉｄｉｎｅ（０．３６ｇ、２．９４９ｍｍｏｌ）、Ｐｙｒｉｄｉｎｅ（２０ｍＬ）を入れて常温で１２時間撹拌する。濃縮後、カラム精製する。（１．８ｇ、１．９７２ｍｍｏｌ、６７％）1Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ3）δ７．６０（ｍ、２Ｈ）、７．５４−７．５１（ｍ、２Ｈ）、７．４１−７．１４（ｍ、９Ｈ）、６．９７−６．８６（ｍ、４Ｈ）、６．７６（ｄ、４Ｈ、８．４Ｈｚ）、４．９６（ｂｓ、１Ｈ）、３．９１−３．６０（ｍ、２０Ｈ）、３．４６（ｍ、２Ｈ）、３．１６−３．１２（ｍ、４Ｈ）、１．７７（ｍ、６Ｈ）
２５０ｍＬの１口反応器にｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ３（１．８ｇ、２．９４９ｍｍｏｌ）、４，４’−Ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｔｒｉｔｙｌ Ｃｈｌｏｒｉｄｅ（１ｇ、２．９４９ｍｍｏｌ）、４−（Ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｐｙｒｉｄｉｎｅ（０．３６ｇ、２．９４９ｍｍｏｌ）、Ｐｙｒｉｄｉｎｅ（２０ｍＬ）を入れて常温で１２時間撹拌する。濃縮後、カラム精製する。（１．８ｇ、１．９７２ｍｍｏｌ、６７％）1Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ3）δ７．６０（ｍ、２Ｈ）、７．５４−７．５１（ｍ、２Ｈ）、７．４１−７．１４（ｍ、９Ｈ）、６．９７−６．８６（ｍ、４Ｈ）、６．７６（ｄ、４Ｈ、８．４Ｈｚ）、４．９６（ｂｓ、１Ｈ）、３．９１−３．６０（ｍ、２０Ｈ）、３．４６（ｍ、２Ｈ）、３．１６−３．１２（ｍ、４Ｈ）、１．７７（ｍ、６Ｈ）
製造例３．化合物１２の合成
ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ１の合成
２５０ｍＬの１口反応器にＳｔａｒｔｉｎｇ ｍａｔｅｒｉａｌ（１０ｇ、２０．３１ｍｍｏｌ）、Ａｍｉｎｅ（１０ｍＬ、１０１．５６ｍｍｏｌ）、ジメチルスルホキシド（１００ｍＬ）を入れて常温で２時間撹拌する。冷却後、反応器に水（１００ｍＬ）を入れて強撹拌した後、ジクロロメタン（１００ｍＬ×２）で抽出する。有機層に無水硫酸マグネシウムを入れて５分間撹拌した後、固体をろ過する。余液は、濃縮してカラム精製する。（５．８２ｇ、１３．６２ｍｍｏｌ、６７％）
２５０ｍＬの１口反応器にＳｔａｒｔｉｎｇ ｍａｔｅｒｉａｌ（１０ｇ、２０．３１ｍｍｏｌ）、Ａｍｉｎｅ（１０ｍＬ、１０１．５６ｍｍｏｌ）、ジメチルスルホキシド（１００ｍＬ）を入れて常温で２時間撹拌する。冷却後、反応器に水（１００ｍＬ）を入れて強撹拌した後、ジクロロメタン（１００ｍＬ×２）で抽出する。有機層に無水硫酸マグネシウムを入れて５分間撹拌した後、固体をろ過する。余液は、濃縮してカラム精製する。（５．８２ｇ、１３．６２ｍｍｏｌ、６７％）
ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ２の合成
２５０ｍＬの１口反応器にｉｎｔｅｒｍｅｉｄａｔｅ１（２．３ｇ、５．３８１ｍｍｏｌ）、Ａｍｉｎｅ（５ｇ、２６．９ｍｍｏｌ）、ジメチルスルホキシド（２０ｍＬ）を入れて９０℃で６時間撹拌する。冷却後、反応器に水（３００ｍＬ）を入れて強撹拌した後、酢酸エチル（１００ｍＬ×２）で抽出する。有機層に無水硫酸マグネシウムを入れて５分間撹拌した後、固体をろ過する。余液は、濃縮して再結晶する。（２．０８ｇ、４．４８６ｍｍｏｌ、８３％）
２５０ｍＬの１口反応器にｉｎｔｅｒｍｅｉｄａｔｅ１（２．３ｇ、５．３８１ｍｍｏｌ）、Ａｍｉｎｅ（５ｇ、２６．９ｍｍｏｌ）、ジメチルスルホキシド（２０ｍＬ）を入れて９０℃で６時間撹拌する。冷却後、反応器に水（３００ｍＬ）を入れて強撹拌した後、酢酸エチル（１００ｍＬ×２）で抽出する。有機層に無水硫酸マグネシウムを入れて５分間撹拌した後、固体をろ過する。余液は、濃縮して再結晶する。（２．０８ｇ、４．４８６ｍｍｏｌ、８３％）
ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ３の合成
２５０ｍＬの３口反応器にＲｅａｇｅｎｔ１（６．５ｇ、２２．５２ｍｍｏｌ）、テトラヒドロフラン（７０ｍＬ）を入れて窒素気流下において−７８℃で５分間撹拌する。反応器に１．６Ｍのｎ−ブチリチウム（１１．７３ｍＬ、１８．７７ｍｍｏｌ）を徐々に滴下した後、−７８℃で１時間撹拌する。ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ２（２．９ｇ、６．２６ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン（２０ｍＬ）に溶かして反応器に滴下した後、常温で１２時間撹拌する。反応器に２Ｍの塩酸（２０ｍＬ）を入れて３０分間強撹拌する。濃縮後、精製なしに次の反応を行う。
２５０ｍＬの３口反応器にＲｅａｇｅｎｔ１（６．５ｇ、２２．５２ｍｍｏｌ）、テトラヒドロフラン（７０ｍＬ）を入れて窒素気流下において−７８℃で５分間撹拌する。反応器に１．６Ｍのｎ−ブチリチウム（１１．７３ｍＬ、１８．７７ｍｍｏｌ）を徐々に滴下した後、−７８℃で１時間撹拌する。ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ２（２．９ｇ、６．２６ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン（２０ｍＬ）に溶かして反応器に滴下した後、常温で１２時間撹拌する。反応器に２Ｍの塩酸（２０ｍＬ）を入れて３０分間強撹拌する。濃縮後、精製なしに次の反応を行う。
ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ４の合成
２５０ｍＬの１口反応器にｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ３（２．８ｇ）、Ｒｅａｇｅｎｔ２（０．８２ｇ、４．４６ｍｍｏｌ）、Ｏ−（Ｂｅｎｚｏｔｒｉａｚｏｌ−１ｙｌ）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｕｒｏｎｉｕｍ Ｔｅｔｒａｆｌｕｏｒｏｂｏｒａｔｅ（１．７２ｇ、５．３５ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン（１．９ｍＬ、１３．３８ｍｍｏｌ）、ジメチルホルムアマイド（３０ｍＬ）を入れて常温で３時間撹拌する。濃縮してカラム精製する。ジクロロメタン（１０ｍＬ）、４Ｍの塩酸（４ｍＬ）を入れて常温で２時間撹拌する。濃縮してカラム精製する。（１３０ｍｇ、０．１９１ｍｍｏｌ）
２５０ｍＬの１口反応器にｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ３（２．８ｇ）、Ｒｅａｇｅｎｔ２（０．８２ｇ、４．４６ｍｍｏｌ）、Ｏ−（Ｂｅｎｚｏｔｒｉａｚｏｌ−１ｙｌ）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｕｒｏｎｉｕｍ Ｔｅｔｒａｆｌｕｏｒｏｂｏｒａｔｅ（１．７２ｇ、５．３５ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン（１．９ｍＬ、１３．３８ｍｍｏｌ）、ジメチルホルムアマイド（３０ｍＬ）を入れて常温で３時間撹拌する。濃縮してカラム精製する。ジクロロメタン（１０ｍＬ）、４Ｍの塩酸（４ｍＬ）を入れて常温で２時間撹拌する。濃縮してカラム精製する。（１３０ｍｇ、０．１９１ｍｍｏｌ）
化合物１２の合成
５０ｍＬの１口反応器にｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ４（１３０ｍｇ、０．１９１ｍｍｏｌ）、４，４’−Ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｔｒｉｔｙｌ Ｃｈｌｏｒｉｄｅ（１００ｍｇ、０．２８７ｍｍｏｌ）、４−（Ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｐｙｒｉｄｉｎｅ（２３ｍｇ、０．１９１ｍｍｏｌ）、Ｐｙｒｉｄｉｎｅ（１ｍＬ）を入れて常温で７２時間撹拌する。濃縮後、カラム精製する。（６５ｍｇ、０．０６６２ｍｍｏｌ、３５％）1Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ3）δ７．６４−７．５９（ｍ、２Ｈ）、７．４１（ｄ、２Ｈ、８．４Ｈｚ）、７．３１−７．０１（ｍ、１１Ｈ）、６．８８（ｓ、２Ｈ）、６．８２−６．７８（ｍ、４Ｈ）、４．６３−６．６１（ｍ、１Ｈ）、４．２１−４．１８（ｍ、１Ｈ）、４．０５−３．２４（ｍ、２３Ｈ）、３．１６−３．１３（ｍ、４Ｈ）、１．８０−１．７４（ｍ、６Ｈ）
５０ｍＬの１口反応器にｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ４（１３０ｍｇ、０．１９１ｍｍｏｌ）、４，４’−Ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｔｒｉｔｙｌ Ｃｈｌｏｒｉｄｅ（１００ｍｇ、０．２８７ｍｍｏｌ）、４−（Ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｐｙｒｉｄｉｎｅ（２３ｍｇ、０．１９１ｍｍｏｌ）、Ｐｙｒｉｄｉｎｅ（１ｍＬ）を入れて常温で７２時間撹拌する。濃縮後、カラム精製する。（６５ｍｇ、０．０６６２ｍｍｏｌ、３５％）1Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ3）δ７．６４−７．５９（ｍ、２Ｈ）、７．４１（ｄ、２Ｈ、８．４Ｈｚ）、７．３１−７．０１（ｍ、１１Ｈ）、６．８８（ｓ、２Ｈ）、６．８２−６．７８（ｍ、４Ｈ）、４．６３−６．６１（ｍ、１Ｈ）、４．２１−４．１８（ｍ、１Ｈ）、４．０５−３．２４（ｍ、２３Ｈ）、３．１６−３．１３（ｍ、４Ｈ）、１．８０−１．７４（ｍ、６Ｈ）
製造例４．化合物１８の合成
ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ１の合成
２５０ｍＬの１口反応器にＳｔａｒｔｉｎｇ ｍａｔｅｒｉａｌ（２ｇ、４．０６２ｍｍｏｌ）、Ａｍｉｎｅ（９．３２ｇ、４０．６２ｍｍｏｌ）、ジメチルスルホキシド（２０ｍＬ）を入れて６０℃で１２時間撹拌する。冷却後、反応器に水（１００ｍＬ）を入れて強撹拌した後、酢酸エチル（１００ｍＬ×２）で抽出する。有機層に無水硫酸マグネシウムを入れて５分間撹拌した後、固体をろ過する。余液は、濃縮してカラム精製する。（０．８ｇ、１．２２８ｍｍｏｌ、３０％）
２５０ｍＬの１口反応器にＳｔａｒｔｉｎｇ ｍａｔｅｒｉａｌ（２ｇ、４．０６２ｍｍｏｌ）、Ａｍｉｎｅ（９．３２ｇ、４０．６２ｍｍｏｌ）、ジメチルスルホキシド（２０ｍＬ）を入れて６０℃で１２時間撹拌する。冷却後、反応器に水（１００ｍＬ）を入れて強撹拌した後、酢酸エチル（１００ｍＬ×２）で抽出する。有機層に無水硫酸マグネシウムを入れて５分間撹拌した後、固体をろ過する。余液は、濃縮してカラム精製する。（０．８ｇ、１．２２８ｍｍｏｌ、３０％）
ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ２の合成
１００ｍＬの３口反応器にＲｅａｇｅｎｔ（０．９３ｇ、３．２２５ｍｍｏｌ）、テトラヒドロフラン（１０ｍＬ）を入れて窒素気流下において−７８℃で５分間撹拌する。反応器に１．６Ｍのｎ−ブチルリチウム（３ｍＬ、４．８３８ｍｍｏｌ）を徐々に滴下した後、−７８℃で１時間撹拌する。ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ１（０．７ｇ、１．０７５ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン（１０ｍＬ）に溶かして反応器に滴下した後、常温で１２時間撹拌する。反応器に２Ｍの塩酸（１０ｍＬ）を入れて３０分間強撹拌する。濃縮後、カラム精製する。（０．２８ｇ、０．４３０ｍｍｏｌ、４０％）
１００ｍＬの３口反応器にＲｅａｇｅｎｔ（０．９３ｇ、３．２２５ｍｍｏｌ）、テトラヒドロフラン（１０ｍＬ）を入れて窒素気流下において−７８℃で５分間撹拌する。反応器に１．６Ｍのｎ−ブチルリチウム（３ｍＬ、４．８３８ｍｍｏｌ）を徐々に滴下した後、−７８℃で１時間撹拌する。ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ１（０．７ｇ、１．０７５ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン（１０ｍＬ）に溶かして反応器に滴下した後、常温で１２時間撹拌する。反応器に２Ｍの塩酸（１０ｍＬ）を入れて３０分間強撹拌する。濃縮後、カラム精製する。（０．２８ｇ、０．４３０ｍｍｏｌ、４０％）
化合物１８の合成
５０ｍＬの１口反応器にｉｎｔｅｒｍｅｉｄａｔｅ２（２８０ｍｇ、０．４３０ｍｍｏｌ）、４，４’−Ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｔｒｉｔｙｌ Ｃｈｌｏｒｉｄｅ（１４５ｍｇ、０．４３０ｍｍｏｌ）、Ｐｙｒｉｄｉｎｅ（５ｍＬ）を入れて常温で４８時間撹拌する。濃縮後、カラム精製する。（３７ｍｇ、０．０３８８ｍｍｏｌ、９％）1Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ3）δ７．５８−７．５３（ｍ、２Ｈ）、７．４３−７．４０（ｍ、２Ｈ）、７．３１−７．２０（ｍ、７Ｈ）、７．０７−７．０４（ｍ、２Ｈ）、６．８９−６．８１（ｍ、８Ｈ）、４．２３−４．１８（ｍ、４）、３．７８（ｍ、１０Ｈ）、３．５７（ｍ、２Ｈ）、３．３４−３．２２（ｍ、４Ｈ）、３．１６−３．１３（ｍ、４Ｈ）、３．００−２．９８（ｍ、２Ｈ）、２．０５−２．０２（ｍ、６Ｈ）、１．４７−１．３４（ｍ、４Ｈ）
５０ｍＬの１口反応器にｉｎｔｅｒｍｅｉｄａｔｅ２（２８０ｍｇ、０．４３０ｍｍｏｌ）、４，４’−Ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｔｒｉｔｙｌ Ｃｈｌｏｒｉｄｅ（１４５ｍｇ、０．４３０ｍｍｏｌ）、Ｐｙｒｉｄｉｎｅ（５ｍＬ）を入れて常温で４８時間撹拌する。濃縮後、カラム精製する。（３７ｍｇ、０．０３８８ｍｍｏｌ、９％）1Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ3）δ７．５８−７．５３（ｍ、２Ｈ）、７．４３−７．４０（ｍ、２Ｈ）、７．３１−７．２０（ｍ、７Ｈ）、７．０７−７．０４（ｍ、２Ｈ）、６．８９−６．８１（ｍ、８Ｈ）、４．２３−４．１８（ｍ、４）、３．７８（ｍ、１０Ｈ）、３．５７（ｍ、２Ｈ）、３．３４−３．２２（ｍ、４Ｈ）、３．１６−３．１３（ｍ、４Ｈ）、３．００−２．９８（ｍ、２Ｈ）、２．０５−２．０２（ｍ、６Ｈ）、１．４７−１．３４（ｍ、４Ｈ）
製造例５．化合物２０の合成
ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ１の合成
１００ｍＬの１口反応器にＳｔａｒｔｉｎｇ ｍａｔｅｒｉａｌ２（２ｇ、３．８５８ｍｍｏｌ）、Ａｍｉｎｅ（６．４３ｇ、１９．２９ｍｍｏｌ）、ジメチルスルホキシド（２０ｍＬ）を入れて６０℃で４８時間撹拌する。冷却後、反応器に水（１００ｍＬ）を入れて強撹拌した後、酢酸エチル（１００ｍＬ×２）で抽出する。有機層に無水硫酸マグネシウムを入れて５分間撹拌した後、固体をろ過する。余液は、濃縮してカラム精製する。（０．８７ｇ、１．２３９ｍｍｏｌ、３２％）
１００ｍＬの１口反応器にＳｔａｒｔｉｎｇ ｍａｔｅｒｉａｌ２（２ｇ、３．８５８ｍｍｏｌ）、Ａｍｉｎｅ（６．４３ｇ、１９．２９ｍｍｏｌ）、ジメチルスルホキシド（２０ｍＬ）を入れて６０℃で４８時間撹拌する。冷却後、反応器に水（１００ｍＬ）を入れて強撹拌した後、酢酸エチル（１００ｍＬ×２）で抽出する。有機層に無水硫酸マグネシウムを入れて５分間撹拌した後、固体をろ過する。余液は、濃縮してカラム精製する。（０．８７ｇ、１．２３９ｍｍｏｌ、３２％）
ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ２の合成
５０ｍＬの１口反応器にｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ１（０．８７ｇ、１．２３９ｍｍｏｌ）、Ａｍｉｎｅ（１．２ｍＬ、１２．３９ｍｍｏｌ）、ジメチルスルホキシド（１０ｍＬ）を入れて９０℃で２時間撹拌する。冷却後、反応器に水（１００ｍＬ）を入れて強撹拌した後、酢酸エチル（１００ｍＬ×２）で抽出する。有機層に無水硫酸マグネシウムを入れて５分間撹拌した後、固体をろ過する。余液は、濃縮してカラム精製する。（５００ｍｇ、０．７８５ｍｍｏｌ、６３％）
５０ｍＬの１口反応器にｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ１（０．８７ｇ、１．２３９ｍｍｏｌ）、Ａｍｉｎｅ（１．２ｍＬ、１２．３９ｍｍｏｌ）、ジメチルスルホキシド（１０ｍＬ）を入れて９０℃で２時間撹拌する。冷却後、反応器に水（１００ｍＬ）を入れて強撹拌した後、酢酸エチル（１００ｍＬ×２）で抽出する。有機層に無水硫酸マグネシウムを入れて５分間撹拌した後、固体をろ過する。余液は、濃縮してカラム精製する。（５００ｍｇ、０．７８５ｍｍｏｌ、６３％）
ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ３の合成
５０ｍＬの３口反応器にＲｅａｇｅｎｔ（０．６８ｇ、２．３５４ｍｍｏｌ）、テトラヒドロフラン（５ｍＬ）を入れて窒素気流下において−７８℃で５分間撹拌する。反応器に１．４Ｍのｓｅｃ−ブチルリチウム（１．７ｍＬ、２．３５４ｍｍｏｌ）を徐々に滴下した後、−７８℃で１時間撹拌する。ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ２（５００ｍｇ、０．７８５ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン（５ｍＬ）に溶かして反応器に滴下した後、常温で１２時間撹拌する。反応器に２Ｍの塩酸（３ｍＬ）を入れて３０分間強撹拌する。濃縮後、カラム精製する。（３８０ｍｇ、０．５９７ｍｍｏｌ、７６％）
５０ｍＬの３口反応器にＲｅａｇｅｎｔ（０．６８ｇ、２．３５４ｍｍｏｌ）、テトラヒドロフラン（５ｍＬ）を入れて窒素気流下において−７８℃で５分間撹拌する。反応器に１．４Ｍのｓｅｃ−ブチルリチウム（１．７ｍＬ、２．３５４ｍｍｏｌ）を徐々に滴下した後、−７８℃で１時間撹拌する。ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ２（５００ｍｇ、０．７８５ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン（５ｍＬ）に溶かして反応器に滴下した後、常温で１２時間撹拌する。反応器に２Ｍの塩酸（３ｍＬ）を入れて３０分間強撹拌する。濃縮後、カラム精製する。（３８０ｍｇ、０．５９７ｍｍｏｌ、７６％）
化合物２０の合成
１００ｍＬの１口反応器にｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ３（３８０ｍｇ、０．９７ｍｍｏｌ）、４，４’−Ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｔｒｉｔｙｌ Ｃｈｌｏｒｉｄｅ（２００ｍｇ、０．５９７ｍｍｏｌ）、４−（Ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｐｙｒｉｄｉｎｅ（７３ｍｇ、０．５９７ｍｍｏｌ）、Ｐｙｒｉｄｉｎｅ（５ｍＬ）を入れて常温で１２時間撹拌する。濃縮後、カラム精製する。
１００ｍＬの１口反応器にｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ３（３８０ｍｇ、０．９７ｍｍｏｌ）、４，４’−Ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｔｒｉｔｙｌ Ｃｈｌｏｒｉｄｅ（２００ｍｇ、０．５９７ｍｍｏｌ）、４−（Ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｐｙｒｉｄｉｎｅ（７３ｍｇ、０．５９７ｍｍｏｌ）、Ｐｙｒｉｄｉｎｅ（５ｍＬ）を入れて常温で１２時間撹拌する。濃縮後、カラム精製する。
製造例６．クエンチャー−ＣＰＧの合成
１０ｍＬのｖｉａｌに化合物７（１００ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ）、ｓｕｃｃｉｎｉｃ ａｎｈｙｄｒｉｄｅ（９．９ｍｇ、０．０９９ｍｍｏｌ）、４−ジメチルアミノピリジン（１２．１ｍｇ、０．０９９ｍｍｏｌ）、ジクロロメタン（５ｍｌ）を入れて常温で１．５時間ローリングする。濃縮し切れて１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（５２．７ｍｇ、０．２７５ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン（２８ｕｌ）、ピリジン（５ｍｌ）、ＣＰＧ−ＮＨ２（１ｇ）を入れて常温で２時間ローリングする。ｐｏｗｄｅｒをろ過してアセトニトリル、メタノール、ジクロロメタンでそれぞれ３回ずつ洗う。乾燥後、ＣａｐＡ／ＣａｐＢ=１ｍｌ／１ｍｌを入れて常温で２時間ローリングして、アセトニトリル、ジクロロメタンでそれぞれ３回ずつ洗ってから乾燥する。（１ｇ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｌｏａｄｉｎｇ：３７ｕｍｏｌ／ｇ）
下記の表１は、化合物４、化合物１２、化合物１８を用いて前記に記載した製造例６と同じ方法でクエンチャー−ＣＰＧを合成したとき、各化合物に対するｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｌｏａｄｉｎｇを表したものである。
［表１］
製造例７．オリゴヌクレオチドの合成
化合物７を利用して１０−Ｃｏｌｕｍｎ Ｐｏｌｙｇｅｎ ＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒを用いてＯｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅを合成した。合成されたオリゴヌクレオチドのＵＶスペクトラムは、図１に示した。
化合物７を利用して１０−Ｃｏｌｕｍｎ Ｐｏｌｙｇｅｎ ＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒを用いてＯｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅを合成した。合成されたオリゴヌクレオチドのＵＶスペクトラムは、図１に示した。
実験例．クエンチャーの消光特性測定
実験例１
製造例１〜５によって製造された化合物４、化合物７、化合物１２、化合物１８、化合物２０のλMax（ｎｍ）、Ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ（ｅ）を確認した。その結果は、図２及び表２で表した。
実験例１
製造例１〜５によって製造された化合物４、化合物７、化合物１２、化合物１８、化合物２０のλMax（ｎｍ）、Ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ（ｅ）を確認した。その結果は、図２及び表２で表した。
［表２］
図２及び表２の結果を参考すれば、本発明の様々な実施例によるクエンチャーは、４５０ｎｍ以上の波長帯における吸収特性を示すことができ、これにより、様々な蛍光団との組み合わせによって二重標識プローブを設計することが可能である。
実験例２
下記の表３のように、二重標識プローブを設計した後、それぞれの二重標識プローブに対する消光特性を測定した。
下記の表３のように、二重標識プローブを設計した後、それぞれの二重標識プローブに対する消光特性を測定した。
図３〜図５における黒い線は、それぞれの蛍光団とＢＨＱ１がｐｒｏｂｅ状態で表す蛍光値を示し、赤い線は、それぞれの蛍光団と化合物７がｐｒｏｂｅ状態で表す蛍光値を示して、灰色線は、ｐｒｏｂｅを分解したときの蛍光団の蛍光値を示す。
蛍光団とクエンチャーがそれぞれＦＡＭとＢＨＱ１で構成された二重標識プローブ（Ｐｒｏｂｅ１）と蛍光団とクエンチャーがそれぞれＦＡＭと化合物７で構成された二重標識プローブ（Ｐｒｏｂｅ２）の消光効率を示した図３を参照すれば、Ｐｒｏｂｅ１のＢＨＱ１とＰｒｏｂｅ２の化合物７の消光特性が類似することを確認することができる。
一方、蛍光団とクエンチャーがそれぞれＴＥＴとＢＨＱ１で構成された二重標識プローブ（Ｐｒｏｂｅ３）と蛍光団とクエンチャーがそれぞれＴＥＴと化合物７で構成された二重標識プローブ（Ｐｒｏｂｅ４）の消光効率を示した図４と、蛍光団とクエンチャーがそれぞれＨＥＸとＢＨＱ１で構成された二重標識プローブ（Ｐｒｏｂｅ５）と蛍光団とクエンチャーがそれぞれＨＥＸと化合物７で構成された二重標識プローブ（Ｐｒｏｂｅ６）の消光効率を示した図５を参照すれば、ＢＨＱ１より化合物７の消光特性が４４％（ＴＥＴ）、１８％（ＨＥＸ）高いことを確認することができる。
以上のように、本発明の一実施例について説明したが、該技術分野で通常の知識を有する者であれば、特許請求の範囲に記載されている本発明の思想から脱しない範囲内で、構成要素の付加、変更、削除又は追加などによって本発明を多様に修正及び変更させることができ、これも本発明の権利範囲内に含まれる。
Claims (16)
- 下記の化１又は化２で表されるクエンチャー：
Ｑは、下記の化３又は化４で表され、
ｍ及びｎは、それぞれ独立して０〜３の定数で、
Ｘは、Ｏ、Ｓ、ＣＲ7Ｒ8又はＳｉＲ7Ｒ8で、
Ｙは、Ｏ又はＳで、
Ｒ7及びＲ8は、それぞれ独立して置換または非置換されたＣ1−Ｃ40アルキル、少なくとも１つのヘテロ原子を含む置換または非置換されたＣ1−Ｃ40ヘテロアルキル、置換または非置換されたアリール及び置換または非置換されたヘテロアリールから選択されるか、互いに結合して環を形成し、
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3及びＲ4のうち少なくとも１つは、カルボキシル、カルボキシル誘導体、ヒドロキシル、ハロアルキル、求核体、アルデヒド、ケトン、ハロゲン化スルホニル、チオール、アミン、スルフヒドリル、アルケン、エポキシド及びホスホロアミダイトから選択される作用基であるか、前記作用基と共有結合可能な反応性基である。 - 下記の化５又は化６で表されるクエンチャー：
Ｑは、下記の化３又は化４で表され、
ｍ及びｎは、それぞれ独立して０〜３の定数で、
Ｘは、Ｏ、Ｓ、ＣＲ7Ｒ8又はＳｉＲ7Ｒ8で、
Ｙは、Ｏ又はＳで、
Ｒ7及びＲ8は、それぞれ独立して置換または非置換されたＣ1−Ｃ40アルキル、少なくとも１つのヘテロ原子を含む置換または非置換されたＣ1−Ｃ40ヘテロアルキル、置換または非置換されたアリール及び置換または非置換されたヘテロアリールから選択されるか、互いに結合して環を形成し、
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3及びＲ4のうち少なくとも１つは、カルボキシル、カルボキシル誘導体、ヒドロキシル、ハロアルキル、求核体、アルデヒド、ケトン、ハロゲン化スルホニル、チオール、アミン、スルフヒドリル、アルケン、エポキシド及びホスホロアミダイトから選択される作用基であるか、前記作用基と共有結合可能な反応性基である。 - Ｒ1及びＲ2は、互いに結合して置換または非置換された環を形成する、請求項１又は請求項２に記載のクエンチャー。
- Ｒ1及びＲ2から選択される少なくとも１つは、隣接したＲ5と互いに結合して置換または非置換された環を形成する、請求項１又は請求項２に記載のクエンチャー。
- Ｒ3及びＲ4は、互いに結合して置換または非置換された環を形成する、請求項１又は請求項２に記載のクエンチャー。
- Ｒ3及びＲ4から選択される少なくとも１つは、隣接したＲ6と互いに結合して置換または非置換された環を形成する、請求項１又は請求項２に記載のクエンチャー。
- 前記反応性基は、カルボキシル、ヒドロキシル、ハロアルキル、求核体、アルデヒド、ケトン、ハロゲン化スルホニル、チオール、アミン、アルケン、エポキシド及びホスホロアミダイトから選択されており、前記反応性基は、保護基で保護される、請求項１に記載のクエンチャー。
- 請求項１〜請求項４のいずれか一項に記載のクエンチャー；
マイナーグルーブバインダー（ＭＧＢ；ｍｉｎｏｒ ｇｒｏｏｖｅ ｂｉｎｄｅｒ）；及び、
蛍光団；
を含むオリゴヌクレオチド。 - 前記蛍光団は、クマリン、シアニン、ボディピー、フルロセイン、ロダミン、ピレン、カルボピロニン、オキサジン、ザンテン、チオザンテン、アクリジン及び又はこの誘導体から選択される少なくとも１つである、請求項８に記載のオリゴヌクレオチド。
- 請求項８によるオリゴヌクレオチドを含む核酸検出用組成物。
- 請求項１〜請求項４のいずれか一項に記載のクエンチャー；
支持体；及び、
前記クエンチャーと前記支持体を連結するリンカー；
を含む、
核酸検出用支持体。 - 前記支持体は、ガラス、セルロース、ナイロン、アクリルアマイドゲル、デキストラン、ポリスチレン又はレジンである、請求項１１に記載の核酸検出用支持体。
- 前記リンカーは、置換または非置換されたＣ1−Ｃ30アルキル、少なくとも１つのヘテロ原子を含む置換または非置換されたＣ2−Ｃ30ヘテロアルキル、置換または非置換されたＣ6−Ｃ30アリール及び置換または非置換されたＣ3−Ｃ30ヘテロアリールから選択される、請求項１１に記載の核酸検出用支持体。
- （ａ）標的核酸、前記標的核酸を増幅させるために必要な試薬及び請求項８によるオリゴヌクレオチドを含む反応混合物を準備するステップ；
（ｂ）前記反応混合物のうち、標的核酸を重合酵素連鎖反応によって増幅するステップ；及び、
（ｃ）前記反応混合物の蛍光強度を測定するステップ；
を含む，
核酸検出方法。 - 前記ステップ（ｂ）は、
（ｂ−１）前記標的核酸に混成化されたオリゴヌクレオチドが重合酵素によって伸長されるステップ；
（ｂ−２）前記重合酵素のエクソヌクレアーゼ活性によって前記標的核酸から前記オリゴヌクレオチドのクエンチャーと蛍光団が分離されるステップ；及び、
（ｂ−３）前記クエンチャーから落ちた前記蛍光団が蛍光を発するステップ；
を含む、請求項１４に記載の核酸検出方法。 - 前記ステップ（ｃ）において測定された蛍光強度から標的核酸の増幅量を測定するステップ（ｄ）をさらに含む、請求項１４に記載の核酸検出方法。
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