JP6829435B2

JP6829435B2 - 哺乳動物核移植胚の発生率向上法

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Publication number: JP6829435B2
Application number: JP2017015891A
Authority: JP
Inventors: 圭宮本; 正樹岩元
Original assignee: PRIMETECH CORPORATION; Kinki University
Current assignee: PRIMETECH CORPORATION; Kinki University
Priority date: 2017-01-31
Filing date: 2017-01-31
Publication date: 2021-02-10
Anticipated expiration: 2037-01-31
Also published as: JP2018121565A

Description

本発明は、哺乳動物の核移植胚を、ヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ；Histone deacetylase）阻害剤と、脱イオン化血清アルブミン（deionized-serum albumin；以下、「ｄ−ＳＡ」ということがある）とを含む培養液中で培養する工程（ａ）と、当該工程（ａ）で培養した哺乳動物の核移植胚を、ビタミンＣとｄ−ＳＡとを含む培養液中に移し、培養する工程（ｂ）とを備えた、哺乳動物核移植胚の作出効率の改善方法や、哺乳動物核移植胚の作出方法（以下、これらを総称して「本件改善／作出方法」ということがある）に関する。

哺乳類における体細胞クローン技術は、２０年近く前に開発された。体細胞クローン技術とは、体細胞核を受精前の卵子に移植し（核移植と呼ばれる）、作製した再構築核移植胚の発生を活性化刺激等により誘導し、最終的に再構築核移植胚を仮母に移植することによりドナー細胞と同じゲノムを有するクローン動物を作出するものである。世界で初めての体細胞クローン動物の作出が、ヒツジで報告されて以来（非特許文献１）、ウシ（非特許文献２）、マウス（非特許文献３）、ブタ（非特許文献４〜６、特許文献１〜３）等の哺乳動物において報告されている。

核移植発明当時の技術は、例えば、マウスにおいて１００個の核移植胚を仮母に移植した場合、１匹のクローン動物が作出される程度の効率（１％）であった。これは、体細胞核が卵子内で初期化される際に、様々な不具合が生じ、不完全な初期化しか誘導されないことに起因すると考えられている。卵子内での体細胞核の初期化不具合を改善し、クローン動物の作出効率を上昇する試みは世界中で行われている。例えば、ＨＤＡＣ阻害剤であるトリコスタチンＡ（ＴＳＡ）を、核移植直後から培養液中に添加すると、クローン個体の作出効率が５％程度まで上昇することが報告されている（非特許文献７、８）。また、ビタミンＣの培養液中への添加によっても、マウスクローン個体の作出効率が、最大４％程度まで上昇することも報告されている（非特許文献９）。しかしながら、かかる文献には、ＨＤＡＣ阻害剤及びビタミンＣを、同時に核移植胚の培養液中に添加しても、顕著な相加又は相乗効果は確認されないことも報告されている。一方、遺伝子改変技術（非特許文献１０）や、テトラプロイドレスキュー法（非特許文献１１）は、クローン個体の作出効率が１０％を超える比較的効率の高い方法ではあるものの、ＥＳ細胞が樹立されていないマウス以外の動物種に適用することは困難であると考えられている。また、特定のｍＲＮＡやｓｉＲＮＡを核移植卵子に注入すると、クローン個体の作出効率を１０％以上に上昇させたことが報告されている(非特許文献１２、１３)。しかし、卵子への核酸の注入が認可されていないヒト核移植卵子を用いた場合を考慮すると、培養液の組成を改良することによって核移植胚の発生効率を改善できる方法の開発が望まれている。

特開２０１１−２２９４５６号公報特開２００２−１２５５１６号公報特開２００２−４５０８５号公報

Wilmut et al., Nature. 1997, 385: 810-813 Kato et al., Science. 1998, 282: 2095-2098 Wakayama et al., Nature. 1998, 394: 369-374 Onishi et al., Science. 2000, 289: 1188-1190 Polejaeva et al., Nature. 2000, 407: 86-90 Betthauser et al., Nature Biotechnol. 2000, 18: 1055-1059 Kishigami et al., BBRC. 2006, 340: 183-189 Rybouchkin et al., Biol. Repod. 2006, 74: 1083-1089 Mallol et al., Plos One. 2015, 10:e0120033 Inoue et al., Science. 2010, 330: 496-499 Lin et al., Cell Stem Cell. 2011, 8:371-375 Matoba et al., Cell. 2014, 159: 884-895 Matoba et al., PNAS. 2011, 108: 20621-20626

本発明の課題は、哺乳動物核移植胚を、比較的簡便に、かつ効率よく作出する方法を提供することにある。

本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を続けている。その過程において、哺乳動物の核移植胚を、ＨＤＡＣ阻害剤及びｄ−ＳＡを含む培養液中で培養し、その後、哺乳動物の核移植胚を、ビタミンＣ及びｄ−ＳＡを含む培養液中に移し、培養すると、哺乳動物核移植胚の作出効率が大幅に改善（上昇）することを見いだし、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は以下のとおりである。
〔１〕以下の工程（ａ）及び（ｂ）を備えたことを特徴とする哺乳動物核移植胚の作出効率の改善方法。
（ａ）哺乳動物の核移植胚を、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤と、脱イオン化血清アルブミンとを含む培養液中で培養する工程；
（ｂ）前記工程（ａ）で培養した哺乳動物の核移植胚を、ビタミンＣと、脱イオン化血清アルブミンとを含む培養液中に移し、培養する工程；
〔２〕前記工程（ｂ）で培養した哺乳動物の核移植胚を、脱イオン化血清アルブミンを含み、かつヒストン脱アセチル化酵素阻害剤と、ビタミンＣとを含まない培養液中に移し、胚ゲノムが活性化するまで培養する工程（ｃ）をさらに備えたことを特徴とする上記〔１〕に記載の改善方法。
〔３〕哺乳動物がマウスの場合、胚ゲノムの活性化時期が２細胞期胚であり、哺乳動物がブタの場合、胚ゲノムの活性化時期が４細胞期胚であることを特徴とする上記〔２〕に記載の改善方法。
〔４〕ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤が、トリコスタチンＡ（ＴＳＡ）であることを特徴とする上記〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の改善方法。
〔５〕脱イオン化血清アルブミンが、脱イオン化ウシ血清アルブミンであることを特徴とする上記〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載の改善方法。
〔６〕以下の工程（ａ）及び（ｂ）を備えたことを特徴とする哺乳動物核移植胚の作出方法。
（ａ）哺乳動物の核移植胚を、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤と、脱イオン化血清アルブミンとを含む培養液中で培養する工程；
（ｂ）前記工程（ａ）で培養した哺乳動物の核移植胚を、ビタミンＣと、脱イオン化血清アルブミンとを含む培養液中に移し、培養する工程；
〔７〕前記工程（ｂ）で培養した哺乳動物の核移植胚を、脱イオン化血清アルブミンを含み、かつヒストン脱アセチル化酵素阻害剤と、ビタミンＣとを含まない培養液中に移し、胚ゲノムが活性化するまで培養する工程（ｃ）をさらに備えたことを特徴とする上記〔６〕に記載の作出方法。
〔８〕哺乳動物がマウスの場合、胚ゲノムの活性化時期が２細胞期胚であり、哺乳動物がブタの場合、胚ゲノムの活性化時期が４細胞期胚であることを特徴とする上記〔７〕に記載の作出方法。
〔９〕ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤が、トリコスタチンＡ（ＴＳＡ）であることを特徴とする上記〔６〕〜〔８〕のいずれかに記載の作出方法。
〔１０〕脱イオン化血清アルブミンが、脱イオン化ウシ血清アルブミンであることを特徴とする上記〔６〕〜〔９〕のいずれかに記載の作出方法。

本発明の実施の他の形態として、ＨＤＡＣ阻害剤と、ビタミンＣと、脱イオン化血清アルブミンとの組合せを含む、哺乳動物核移植胚の作出効率の改善剤であって、ＨＤＡＣ阻害剤と、脱イオン化血清アルブミンとを組み合わせて使用し、その後、ビタミンＣと、脱イオン化血清アルブミンとを組み合わせて使用することを特徴とする前記改善剤（以下、「本件改善剤」ということがある）を挙げることができる。

本件改善／作出方法を用いると、哺乳動物核移植胚を比較的簡便かつ効率よく作出することができる。本件改善／作出方法は、哺乳動物の核移植胚を、ＨＤＡＣ阻害剤及びｄ−ＳＡによる処理と、ビタミンＣ及びｄ−ＳＡによる処理を順次行う点に特徴がある。本実施例では、マウスのみならず、ブタにおいても、核移植胚の作出効率が改善することが具体的に示されている。一方、ＨＤＡＣ阻害剤は、ヒト（文献「Fan et al., 2011 Stem Cells Dev. 20: 1951-1959」)、マウス（文献「Kishigami et al., BBRC. 2006, 340: 183-189」、「Rybouchkin et al., Biol. Repod. 2006, 74: 1083-1089」）、ブタ(文献「Li et al., Theriogenology. 2008, 70: 800-808」)、ウシ（文献「Iager et al., Cloning Stem Cells. 2008, 10: 371-379」）、ウサギ（文献「Shi et al., Dev. Dyn. 2008, 237: 640-648」）、ヒツジ(文献「Wen et al., Theriogenology. 2014, 81: 332-339」)等の哺乳動物においても、核移植胚の作出効率を上昇させる効果を有することが報告されている。したがって、かかる従来技術を考慮すると、本発明の効果は、マウスやブタ以外の他の哺乳動物においても、得られることが十分予想される。このため、本発明は、クローン技術を利用した分野、例えば、品質の高い家畜（例えば、霜降り形質を示すウシ）を生産する畜産業、基礎研究及び医療研究、ペット産業、並びにヒト核移植胚を用いた再生医療の分野に資するものである。

図１Ａは、４種類の群（「無処理群」、「ＨＤＡＣ阻害剤処理群」、「ビタミンＣ処理群」、及び「ＨＤＡＣ阻害剤及びビタミンＣ処理群」）におけるクローンマウスの産仔率を解析した結果を示す図である。図１Ｂは、「ＨＤＡＣ阻害剤及びビタミンＣ処理群」において、１回の妊娠で産まれたマウスクローンの胎仔の写真である。図２Ａは、２種類の群（「ｄ−ＢＳＡ処理群」、及び「ＢＳＡ処理群」）におけるマウス核移植胚の胚盤胞期胚までの発生率を解析した結果を示す図である。図２Ｂは、かかる２種類の群における胚盤胞期胚の位相差顕微鏡画像である。

本件改善／作出方法としては、哺乳動物核移植胚の作出効率改善の有効成分２種（ＨＤＡＣ阻害剤及び脱イオン化血清アルブミン）を含む培養液（以下、「本件培養液ａ」ということがある）中で、哺乳動物の核移植胚を培養する工程（ａ）；及び哺乳動物核移植胚の作出効率改善の有効成分２種（ビタミンＣ及び脱イオン化血清アルブミン）を含む培養液（以下、「本件培養液ｂ」ということがある）中に、前記工程（ａ）で培養した哺乳動物の核移植胚を移し、培養する工程（ｂ）；を備えた方法であれば特に制限されず、ここで哺乳動物としては、例えば、ウシ、ブタ、マウス、ラット、ハムスター、イヌ、ヒト、サル、ヤギ、ウサギ、ネコ、ヒツジ等を挙げることができ、ブタやマウスが好ましい。

本明細書において、「脱イオン化血清アルブミン」とは、脱イオン状態の血清アルブミン、すなわち、亜鉛イオン（Ｚｎ^２＋）、銅イオン（Ｃｕ^２＋）等の重金属イオンをほとんど又は全く含まない状態の血清アルブミンを意味し、脱イオン化血清アルブミンには、重金属イオンを除去するために、脱イオン化処理が施された、哺乳動物（例えば、ウシ、ヒト、ブタ）の血液由来の血清アルブミンの他、重金属イオンをほとんど又は全く含まない哺乳動物（例えば、ヒト、ウシ、ブタ）由来の組換え体血清アルブミン（血清アルブミンの組換えタンパク質）も含まれる。脱イオン化血清アルブミンは、公知の方法、例えば、脱イオン化未処理の血清アルブミン（例えば、ウシ血清アルブミン［Sigma-Aldrich社製］、ヒト血清アルブミン［ASTEC社製］）を、文献「Barker JE, Nienhuis AW. Methods Cell Sci. 1975, 1: 111-112.」や、文献「Isaji et al., J. Reprod. Dev. 2015, 61: 503-510.」に記載の方法に従って、イオン交換樹脂を用いて脱イオン化処理することにより調製することができる。また、イネ（Oryza sativa）の胚乳中で産生された組換え体ヒト血清アルブミン（ＩＢＵＫＩ、BioVerde社製）や、ピキア酵母より産生された組換え体ヒト血清アルブミン（メドウェイ注２５％、田辺三菱製薬社製）等の市販品を用いることもできる。脱イオン化血清アルブミンとしては、脱イオン化ウシ血清アルブミンが好ましい。

上記ＨＤＡＣ阻害剤としては、ヒストン脱アセチル化酵素の機能又は作用を阻害し、核移植胚の細胞核中のヒストンのアセチル化レベルを上昇できるものであれば特に制限されず、例えば、トリコスタチンＡ（ＴＳＡ）、スクリプタイド（Scriptaid）、ＳＡＨＡ（スベロイルアニリドヒドロキサム酸）、オキサムフラチン（Oxamflatin）、Entinostat（ＭＳ−２７５）、ピロキシアミド（pyroxamide）等を挙げることができ、ＴＳＡが好ましい。

上記工程（ｂ）の培養は、哺乳動物の核移植胚の胚ゲノムが活性化するまで行ってもよいが、胚ゲノムが活性化する前に、工程（ｂ）で培養した哺乳動物の核移植胚を、脱イオン化血清アルブミンを含み、かつＨＤＡＣ阻害剤と、ビタミンＣとを含まない培養液（以下、「本件培養液ｃ」ということがある）中に移し、胚ゲノムが活性化するまで培養すること（工程（ｃ）の操作を行うこと）が好ましい。胚ゲノムの活性化後の培養については、特に制限されず、例えば、工程（ｂ）の培養を、胚ゲノムが活性化するまで行った場合、胚ゲノムの活性化後の哺乳動物核移植胚を、本件培養液ｃ中に移し、培養することもできるし、工程（ｃ）の培養を、胚ゲノムが活性化するまで行った場合、胚ゲノムの活性化後の哺乳動物核移植胚を、本件培養液ｃ中に継続して培養することもできる。また、各工程において、本件培養液ａ〜ｃ中の哺乳動物の核移植胚を、新しい本件培養液ａ〜ｃ中に移すことにより、培養液の交換を行ってもよい。

本明細書において、「胚ゲノムが活性化する」とは、卵子中に存在する母性因子依存性の発生から、胚自身のゲノム依存性の発生へ切り替わることを意味する。胚ゲノムが活性化する時期は、哺乳動物の種類によって異なり、例えば、マウスやハムスターの場合、２細胞期胚（通常、胚発生開始後１６〜２４時間の範囲内）であり、ブタやヒトの場合、４細胞期胚（通常、胚発生開始後約４８時間）であり、ウシやヒツジの場合、８細胞期胚（通常、胚発生開始後約７２時間）である。

上記工程（ａ）の培養期間としては、哺乳動物の生物種や培養条件等により異なるため、一概に特定することはできないが、例えば、胚ゲノムが活性化する時期が２細胞期胚である哺乳動物（例えば、マウスやハムスター）の場合、少なくとも、核移植胚の胚発生開始後から８時間を含む期間が好ましく、また、胚ゲノムが活性化する時期が４細胞期胚である哺乳動物（例えば、ブタやヒト）の場合、少なくとも、核移植胚の胚発生開始後から１８〜２０時間を含む期間が好ましい。

上記工程（ｂ）の培養期間としては、哺乳動物の生物種や培養条件等により異なるため、一概に特定することはできないが、例えば、胚ゲノムが活性化する時期が２細胞期胚である哺乳動物（例えば、マウスやハムスター）の場合、少なくとも、核移植胚の胚発生開始後８時間から１５時間を含む期間が好ましく、また、胚ゲノムが活性化する時期が４細胞期胚である哺乳動物（例えば、ブタやヒト）の場合、少なくとも、核移植胚の胚発生開始後１８〜２０時間から４８時間を含む期間が好ましい。

上記工程（ａ）〜（ｃ）の培養液としては、哺乳動物の核移植胚の培養に適した培養液であればよく、血清（例えば、０．１〜３０［ｖ／ｖ］％のＦＢＳ、ＣＳ等）を含む培養液であっても、無血清培養液であってもよいが、血清中に含まれるイオン化血清アルブミンによる影響を最小限にする観点から、無血清培養液が好ましい。かかる「無血清培養液」とは、無調整又は未精製の血清を含まない培養液を意味し、血清代替物を含む培養液は、無血清培養液に含まれる。かかる血清代替物としては、具体的には、市販のＢ２７サプリメント（−インスリン）（Life Technologies社製）、Ｎ２サプリメント（Life Technologies社製）、Ｂ２７サプリメント（Life Technologies社製）、Knockout Serum Replacement（Invitrogen社製）等を挙げることができる。上記工程（ａ）〜（ｃ）における培養液の具体例としては、例えば、ウシ核移植胚を培養する場合、ＴＣＭ−１９９培養液（文献「Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1950; 73: 1-8」参照）やｍＳＯＦ培養液（特開２０１２−２１０１９９号公報参照）を挙げることができ、ブタ核移植胚を培養する場合、ＮＣＳＵ−２３培養液（文献「Theriogenology 1992; 37: 95-109」参照）や、ＰＺＭ培養液（文献「Biol. Reprod. 2002; 66: 112-119」参照）を挙げることができ、ヒツジ核移植胚を培養する場合、Ｅａｇｌｅ’ｓＭＥＭ培養液（文献「J. Anim. Sci. 1976; 42: 912-917」参照）を挙げることができ、ウサギ核移植胚を培養する場合、Ｈａｍ’ｓＦ１０培養液（文献「Exp. Cell Res. 1963; 29: 515-526」参照）、Ｅａｇｌｅ’ｓＭＥＭ培養液（文献「J. Anim. Sci. 1976; 42: 912-917」参照）、及びＲＰＭＩ１６４０培養液（文献「J. Am. Med. Assoc. 1967; 199: 519-524」参照）を挙げることができ、ラット核移植胚を培養する場合、ｍ−ＫＲＢ培養液（文献「J. Reprod. Fert. 1974; 36: 9-22」参照）や、ＨＥＣＭ−１培養液（文献「Hum. Reprod. 1991; 6: 1445-1448」参照）を挙げることができ、ハムスター核移植胚を培養する場合、Ｅａｇｌｅ’ｓＭＥＭ培養液（文献「J. Anim. Sci. 1976; 42: 912-917」参照）を挙げることができ、マウス核移植胚を培養する場合、ＹＨ培養液（文献「Jpn. J. Anim. Reprod. 1971; 16: 147-157）や、ＣＺＢ培養液（文献「J. Reprod. Fertil. 1989; 86: 679-688」参照）や、ＫＳＯＭ培養液（文献「Isaji et al., J. Reprod. Dev. 2015, 61: 503-510.」参照）を挙げることができ、ヒト核移植胚を培養する場合、modified ＨＴＦ培養液（文献「J. Assist. Reprod. Genet. 1995; 12: 97-105」参照）を挙げることができる。

上記工程（ａ）〜（ｃ）の培養液における任意成分としては、還元剤（例えば、２−メルカプトエタノール、ジチオトレイトール［dithiothreitol；ＤＴＴ］等）、鉄源（例えば、トランスフェリン等）、ミネラル（例えば、亜セレン酸ナトリウム）、アミノ酸（例えば、グルタミン、アラニン、アスパラギン、セリン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グリシン、プロリン、チロシン等の非必須アミノ酸）、ビタミン類（例えば、塩化コリン、パントテン酸、葉酸、ニコチンアミド、塩酸ピリドキサル、リボフラビン、塩酸チアミン、アスコルビン酸、ビオチン、イノシトール等）、糖類（例えば、グルコース等）、有機アミン類（例えば、プトレシン等）、ステロイド（例えば、プロゲステロン、β-エストラジオール等）、抗生物質（例えば、ペニシリン、ストレプトマイシン等）、インターロイキン類（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−６等）、接着因子（例えば、ヘパリン、ヘパラン硫酸、コラーゲン、フィブロネクチン等）、有機酸（例えば、ピルビン酸、コハク酸、乳酸等）若しくはその塩、緩衝剤（例えば、ＨＥＰＥＳ等）などを挙げることができる。本明細書において「任意成分」とは、含んでもよいし含まなくてもよい成分のことを意味する。

上記工程（ａ）の培養液としては、ビタミンＣをほとんど（例えば、１．０μｇ／ｍＬ以下、好ましくは０．１μｇ／ｍＬ以下、より好ましくは０．０１μｇ／ｍＬ以下）、又は全く含まないものが好ましい。また、上記工程（ｂ）の培養液としては、ＨＤＡＣ阻害剤をほとんど（例えば、１．０ｐＭ以下、好ましくは０．１ｐＭ以下、より好ましくは０．０１ｐＭ以下）、又は全く含まないものが好ましい。また、上記工程（ａ）及び工程（ｂ）の培養液としては、イオン化ＢＳＡ（脱イオン化未処理の、哺乳動物の血液由来の血清アルブミン）をほとんど（例えば、０．１％以下、好ましくは０．０１％以下、より好ましくは０．００１％以下）、又は全く含まないものが好ましい。

上記工程（ａ）の培養液中のＨＤＡＣ阻害剤の濃度としては、ＨＤＡＣ阻害剤の種類や哺乳動物の種類等により異なるため、一概に特定することはできないが、例えば、ＨＤＡＣ阻害剤がＴＳＡやオキサムフラチンの場合、通常１．０（ｎＭ）以上、好ましくは５．０（ｎＭ）以上、より好ましくは１０（ｎＭ）以上、さらに好ましくは２０（ｎＭ）以上であり、核移植胚への悪影響を回避する観点から、通常１０００（ｎＭ）以下、好ましくは６００（ｎＭ）以下、より好ましくは４００（ｎＭ）以下、さらに好ましくは２００（ｎＭ）以下である。また、ＨＤＡＣ阻害剤がスクリプタイドの場合、通常１０（ｎＭ）以上、好ましくは５０（ｎＭ）以上、より好ましくは１００（ｎＭ）以上、さらに好ましくは２００（ｎＭ）以上であり、核移植胚への悪影響を回避する観点から、通常１０（μＭ）以下、好ましくは６．０（μＭ）以下、より好ましくは３．０（μＭ）以下、さらに好ましくは２．０（μＭ）以下である。また、ＨＤＡＣ阻害剤がＳＡＨＡの場合、通常１０（ｎＭ）以上、好ましくは５０（ｎＭ）以上、より好ましくは１００（ｎＭ）以上、さらに好ましくは５００（ｎＭ）以上であり、核移植胚への悪影響を回避する観点から、通常１００（μＭ）以下、好ましくは５０（μＭ）以下、より好ましくは２０（μＭ）以下、さらに好ましくは１０（μＭ）以下である。

上記工程（ｂ）の培養液中のビタミンＣの濃度としては、哺乳動物の種類等により異なるため、一概に特定することはできないが、通常１．０（μｇ／ｍＬ）以上、好ましくは３．０（μｇ／ｍＬ）以上、より好ましくは６（μｇ／ｍＬ）以上、さらに好ましくは１０（μｇ／ｍＬ）以上である。また、費用対効果や核移植胚への悪影響を回避する観点から、通常１０００（μｇ／ｍＬ）以下、好ましくは６００（μｇ／ｍＬ）以下、より好ましくは３００（μｇ／ｍＬ）以下、さらに好ましくは１００（μｇ／ｍＬ）以下である。したがって、上記工程（ｂ）における培養液中のビタミンＣの濃度としては、通常１．０〜１０００（μｇ／ｍＬ）、好ましくは３．０〜６００（μｇ／ｍＬ）、より好ましくは６〜３００（μｇ／ｍＬ）、さらに好ましくは１０〜１００（μｇ／ｍＬ）である。

哺乳動物の核移植胚の培養温度は、通常約３０〜４０℃の範囲内であり、好ましくは３７℃である。培養時のＣＯ_２濃度は、通常約１〜１０％の範囲内であり、好ましくは約５％である。また、培養時の湿度は、通常約７０〜１００％の範囲内であり、好ましくは約９５〜１００％の範囲内である。また、培養時のＯ_２濃度は、正常酸素濃度（１８〜２２％Ｏ_２）であっても、低酸素濃度（０〜１０％Ｏ_２）であってもよい。

本件改善／作出方法において、哺乳動物の核移植胚の培養は、定法に従って行うことができる。例えば、滴（ドロップ）状の「本件培養液ａ」を、顕微鏡観察用容器上に載置又は接触させ、かかる滴状の「本件培養液ａ」を油で被覆した後、哺乳動物の核移植胚を、ガラスキャピラリー等のキャピラリーを用いて油で被覆した滴状の「本件培養液ａ」中に注入し、培養する。

次いで、滴状の「本件培養液ｂ」を、顕微鏡観察用容器上に載置又は接触させ、かかる滴状の「本件培養液ｂ」を油で被覆した後、「本件培養液ａ」中で培養した哺乳動物の核移植胚を、ガラスキャピラリー等のキャピラリー内に吸引し、必要に応じて「本件培養液ｂ」で１又は２回以上洗浄した後、上記油で被覆した「本件培養液ｂ」中に注入し、培養する。

次に、工程（ｃ）の操作を行う場合、滴状の「本件培養液ｃ」を、顕微鏡観察用容器上に載置又は接触させ、かかる滴状の「本件培養液ｃ」を油で被覆した後、「本件培養液ｂ」中で培養した哺乳動物の核移植胚を、ガラスキャピラリー等のキャピラリー内に吸引し、必要に応じて「本件培養液ｃ」で１又は２回以上洗浄した後、上記油で被覆した「本件培養液ｃ」中に注入し、培養する。

上記顕微鏡観察用容器としては、例えば、培養用シャーレやウェルプレートを挙げることができ、また、上記油としては、例えば、ミネラルオイルやシリコーンオイルを挙げることができる。

上記工程（ａ）において用いる哺乳動物の核移植胚としては、哺乳動物の除核卵子（レシピエント卵子）又は除核受精胚（レシピエント胚）に、哺乳動物のドナー細胞の核を注入（マイクロインジェクション）することにより作製された発生可能な胚であれば特に制限されない。核移植胚は、定法により作製することができる。例えば、ピエゾマイクロマニピュレーター（プライムテック社製）を用いてドナー細胞をレシピエント卵子又はレシピエント胚に注入する方法や、ドナー細胞を、不活性化センダイウイルス（ＨＶＪ Envelope；ＨＶＪ−Ｅ）とともにレシピエント卵子又はレシピエント胚の細胞質に注入し、ドナー細胞と、レシピエント卵子又はレシピエント胚とを細胞融合させる方法を挙げることができる。また、ＨＶＪ−Ｅに代えて、電気パルス刺激によりドナー細胞と、レシピエント卵子又はレシピエント胚との細胞融合を誘導してもよい。かかる電気パルス刺激は、核移植卵子の胚発生の活性化刺激になり得るが、必要に応じてさらに電気パルスを印加し、活性化刺激を与えてもよい。電気パルスとしては、電荷の大きい１回の電気パルス、例えば１．５ｋＶ／ｃｍ、１００μｓｅｃ、１回を印加する方が、それより小さい電荷の電気パルスを２回印加するよりも、胚ゲノムの活性化の点で好ましい。電気パルスの印加は、細胞融合液中で行うことが好ましく、かかる細胞融合液として、マンニトール液を用い、電気パルス刺激後の培養液には、ＮＣＳＵ２３培養液（文献「J.Reprod.Fertil.Suppl.,48,61,1993」参照）又はＰＺＭ培養液（文献「Biol. Reprod. 2002; 66: 112-119」参照）を用いることが、高い胚盤胞形成率の点で好ましい。また、活性化刺激の前に、核移植卵子を、早期染色体凝集（ＰＣＣ；Premature Chromosome Condensation）が起きるまで培養してもよい。核移植卵子の作製時に用いるドナー細胞核の懸濁液や注入操作ドロップ（培養）液や、核移植卵子の活性化刺激前及び活性化刺激中に用いる培養液は、脱イオン化血清アルブミンを含むものが好ましい。

上記ドナー細胞は、レシピエント卵子やレシピエント胚と異なる生物種由来のものであってもよいが、通常同一の生物種由来のものである。

上記レシピエント卵子は、第一極体の放出が確認された卵母細胞から、常法により除核を行うことにより得ることができる。例えば、細胞質分裂抑制剤（例えば、サイトカラシンＢ）を含む培養液中で、卵母細胞の第一極体に接する部分の細胞質を吸引除去することにより、第一極体の直下付近に存在する卵母細胞の染色体を取り除く（除核する）方法を挙げることができる。

本件改善／作出方法により作出された哺乳動物（ヒトを除く）核移植胚を、仮親哺乳動物に胚移植することにより、哺乳動物（ヒトを除く）クローン個体を作製することができる。また、本件改善／作出方法により作出されたヒト核移植胚は、神経や血液等の組織に分化誘導するための材料（ＥＳ細胞）として有用である。本件改善／作出方法において、哺乳動物がヒトである場合、核移植胚を女性の子宮に着床させる工程等のいわゆる医師による医療行為は含まれない。

本件改善剤は、液体タイプと非液体タイプとに大別される。液体タイプ改善剤においては、ふつうＨＤＡＣ阻害剤及び脱イオン化血清アルブミンを有効成分として含む培養液（本件培養液ａ）と、ビタミンＣ及び脱イオン化血清アルブミンを有効成分として含む培養液（本件培養液ｂ）との組合せセットとして構成される。また、非液体タイプ改善剤においては、ふつう培養液に添加される粉体等のＨＤＡＣ阻害剤含有物と、ビタミンＣ含有物と、脱イオン化血清アルブミン含有物との組合せセットか、或いは、培養液に添加される粉体等のＨＤＡＣ阻害剤及び脱イオン化血清アルブミン含有物と、培養液に添加される粉体等のビタミンＣ及び脱イオン化血清アルブミン含有物して構成され、これら非液体タイプ改善剤を培養液に添加すると、本件培養液ａや本件培養液ｂを調製することができる。

以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。以下の実施例において、核移植胚の培養は、インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ_２）内で行った。

１．マウス核移植胚の作出法
１−１ビタミンＣ濃度の検討
ビタミンＣ濃度と、マウス核移植胚の発生率との関連を調べた。具体的には、以下の手順に従って実験を行った。まず、核移植のドナーとして用いる体細胞を、６％の脱イオン化ウシ血清アルブミン（ｄ−ＢＳＡ）を含むＨｅｐｅｓ−ＣＺＢ培養液中に静置し、不活性化センダイウイルス（ＨＶＪ Envelope；ＨＶＪ−Ｅ）を用い、文献「Isaji et al., J. Reprod. Dev. 2015, 61: 503-510.」に記載の方法に従って、マウス除核卵子に移植し、マウス核移植卵子を作製した。ドナー細胞の移植（注入）後のマウス核移植卵子を、０．３％ｄ−ＢＳＡを含むＫＳＯＭ培養液中で１時間培養し、ＰＣＣ（Premature Chromosome Condensation）が起きていることを確認した。その後、マウス核移植卵子を、各種濃度（１μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ、２５μｇ／ｍＬ、又は５０μｇ／ｍＬ）のビタミンＣ（Sigma-Aldrich社製）を含み、かつ０．３％ｄ−ＢＳＡ、５ｍＭ塩化ストロンチウム、２ｍＭＥＧＴＡ、及び５μｇ／ｍＬサイトカラシンＢを含むＫＳＯＭ培養液中に移し、活性化（胚発生誘導）処理を開始した。活性化処理は、文献「Isaji et al., J. Reprod. Dev. 2015, 61: 503-510.」に記載の方法に従って行った。６時間の培養後、上記各種濃度のビタミンＣ及び０．３％ｄ−ＢＳＡを含むＫＳＯＭ培養液中に移し、さらに１８時間培養した（ビタミンＣ処理群）。すなわち、活性化処理後のマウス核移植胚を、計２４時間ビタミンＣ及びｄ−ＢＳＡを含むＫＳＯＭ培養液中で培養した。なお、比較例として、ビタミンＣ不含の培養液にて活性化処理したマウス核移植胚を、ビタミンＣ不含のｄ−ＢＳＡ含有ＫＳＯＭ培養液中で、計２４時間培養した（無処理群）。その後、マウス核移植胚の２細胞期胚までの発生率及び胚盤胞期胚までの発生率を解析した。
その結果、２細胞期胚までの発生率は、培養液中のビタミンＣの濃度（終濃度）いずれを用いた場合でほとんど変わらず高かったものの、胚盤胞期胚までの発生率は、ビタミンＣの終濃度が１（μｇ／ｍＬ）の場合、ビタミンＣの終濃度が１０（μｇ／ｍＬ）、２５（μｇ／ｍＬ）、及び５０（μｇ／ｍＬ）の場合と比べ、２／３以下に低下（Ｐ＜０．０５）していた（表１参照）。
この結果は、マウス核移植胚の発生率を上昇（改善）させるビタミンＣの終濃度は、少なくとも１０（μｇ／ｍＬ）以上であれば十分であることを示している。そこで、以下の実験は、ビタミンＣの終濃度を１０（μｇ／ｍＬ）に固定して行った。

１−２ビタミンＣによる処理期間の検討
ビタミンＣによる処理期間と、マウス核移植胚の発生率との関連を調べた。具体的には、上記「１−１」の項目に記載の「ビタミンＣ処理群」におけるビタミンＣ処理期間、すなわち、マウス核移植卵子の活性化処理後０〜２４時間を、０〜１５時間、０〜８時間、又は８〜１５時間に代えたときの２細胞期胚までの発生率及び胚盤胞期胚までの発生率を解析した。
その結果、２細胞期胚までの発生率は、ビタミンＣの処理期間がいずれの場合でもほとんど変わらず高かったものの、胚盤胞期胚までの発生率は、ビタミンＣの処理期間が、マウス核移植胚の活性化処理後０〜８時間の場合、０〜１５時間や、８〜１５時間の場合と比べ、７４％以下まで低下（Ｐ＜０．０５）していた（表２参照）。
この結果は、マウス核移植胚の発生率を上昇（改善）させるビタミンＣの処理期間は、少なくとも、マウス核移植卵子の活性化処理（マウス核移植胚の発生開始）後８〜１５時間を含む期間であれば十分であることを示している。そこで、以下の実験は、ビタミンＣの処理期間を、マウス核移植卵子の活性化処理（マウス核移植胚の発生開始）後８〜１５時間に固定して行った。

１−３抗酸化作用がマウス核移植胚の発生に及ぼす影響
ビタミンＣは抗酸化作用を有することが知られている。そこで、上記「１−２」の項目に記載の「８〜１５時間のビタミンＣ処理群」において、ビタミンＣに代えて、ビタミンＣ以外の抗酸化剤、すなわち、ビタミンＥやＮ−アセチル−Ｌ−システイン（ＮＡＣ）を用いた場合の２細胞期胚までの発生率及び胚盤胞期胚までの発生率を解析した。その結果、胚盤胞期胚までの発生率は、ビタミンＥ及びＮＡＣのいずれを用いた場合でも、ビタミンＣを用いたときに認められた改善効果は、認められなかった（表３参照）。
この結果は、マウス核移植胚の発生率を上昇（改善）させるためには、ビタミンＣ以外の抗酸化剤は、代用できないことを示している。

１−４ＨＤＡＣ阻害剤、ビタミンＣ、及び脱イオン化血清アルブミンの組合せによるクローンマウスの作出方法
ＨＤＡＣ阻害剤、ビタミンＣ、及び脱イオン化血清アルブミンの組合せと、クローンマウスの作出効率との関連を調べた。具体的には、上記「１−１」の項目に記載の方法に従ってＰＣＣが起きていることを確認したマウス核移植卵子を、５０ｎＭＴＳＡ（Sigma-Aldrich社製）、０．３％ｄ−ＢＳＡ、５ｍＭ塩化ストロンチウム、２ｍＭＥＧＴＡ、及び５μｇ／ｍＬサイトカラシンＢを含むＫＳＯＭ培養液中で活性化処理し、６時間の培養後、５０ｎＭＴＳＡ、及び０．３％ｄ−ＢＳＡを含むＫＳＯＭ培養液中に移し、さらに２時間培養した。すなわち、活性化処理後のマウス核移植胚を、計８時間（活性化処理後から８時間の間）ＴＳＡ及びｄ−ＢＳＡを含むＫＳＯＭ培養液中で培養した。比較例としてＴＳＡを添加せずに８時間培養した区を設けた。次いで、培養したマウス核移植胚を、１０μｇ／ｍＬのビタミンＣ、及び０．３％のｄ−ＢＳＡを含むＫＳＯＭ培養液中に移し、或いは、比較例としてビタミンＣ不含のｄ−ＢＳＡ含有ＫＳＯＭ培養液中に移し、さらに７時間（活性化処理後８時間から１５時間の間）培養した。その後、培養したマウス核移植胚を、ＴＳＡ及びビタミンＣ不含のｄ−ＢＳＡ含有ＫＳＯＭ培養液中に移し、マウス胚ゲノムが活性化する２細胞期胚（活性化処理後１６〜２４時間）まで培養した。得られたマウス２細胞期胚を、文献「Isaji et al., J. Reprod. Dev. 2015, 61: 503-510.」に記載の方法に従って、仮母へ胚移植し、体細胞クローンマウス胚の産仔への発生率（クローンマウスの産仔率）を解析した（図１Ａ参照）。なお、上記ｄ−ＢＳＡは、ウシ血清アルブミン（Sigma-Aldrich社製）を、文献「Isaji et al., J. Reprod. Dev. 2015, 61: 503-510.」に記載の方法に従って、イオン交換樹脂を用いて脱イオン化処理することにより調製した。また、ｄ−ＢＳＡは、マウス除核卵子の培養液中にも加えた。

マウス核移植胚を、ＴＳＡ及びｄ−ＢＳＡを含む培養液中で培養し、その後、ビタミンＣ及びｄ−ＢＳＡを含む培養液中で培養すると、クローンマウスの産仔率は、１５．２％（１６／１０５＝産仔数／移植胚数、以下同様）と高かった（図１Ａの「ＨＤＡＣ阻害剤及びビタミンＣ処理群」、及び図１Ｂ参照）。かかる値は、マウス核移植胚を、ＴＳＡ及びビタミンＣが共に不含のｄ−ＢＳＡを含む培養液中で培養した場合（図１Ａの「無処理群」参照）のクローンマウスの産仔率（０％［０／１７８］）や、ＴＳＡ及びｄ−ＢＳＡを含む培養液中で培養し、その後、ビタミンＣ不含のｄ−ＢＳＡを含む培養液中で培養した場合（図１Ａの「ＨＤＡＣ阻害剤処理群」参照）のクローンマウスの産仔率（４％［５／１２４］）や、ＴＳＡ不含のｄ−ＢＳＡを含む培養液中で培養し、その後、ビタミンＣ及びｄ−ＢＳＡを含む培養液中で培養した場合（図１Ａの「ビタミンＣ処理群」参照）のクローンマウスの産仔率（０％［０／１２５］）と比べ、大幅に上昇していた（Ｐ＜０．０５）。
この結果は、マウス核移植胚を、ＨＤＡＣ阻害剤及び脱イオン化血清アルブミンを含む培養液中で培養し、その後、ビタミンＣ及び脱イオン化血清アルブミンを含む培養液中で培養すると、マウス核移植胚の発生効率（作出効率）が改善（上昇）し、その結果、クローンマウスの作出効率が改善（上昇）することを示している。

また、ビタミンＣ処理群において、活性化（胚発生誘導）処理後のマウス核移植胚を、２細胞期胚までの２４時間、継続的にビタミンＣ及びｄ−ＢＳＡを含む培養液中で培養した場合のクローンマウスの産仔率は、２．４％（２／８４）と有意な上昇は認められなかった。この結果は、ビタミンＣで処理する期間は、少なくともＴＳＡ処理後７時間（活性化処理後８〜１５時間）で十分であることを示唆している。

さらには、上記「ＨＤＡＣ阻害剤及びビタミンＣ処理群」のように、ＴＳＡ及びビタミンＣで順次処理した場合のマウス核移植胚の遺伝子発現パターンと、ＴＳＡ及びビタミンＣの２つを同時に処理した場合のマウス核移植胚の遺伝子発現パターンとを網羅的に解析するために、定法に従ってＲＮＡシークエンシング解析及び階層的クラスタリング解析を行ったところ、両者は異なることが示され、ＴＳＡ及びビタミンＣで順次処理した場合のみ再現性の高い遺伝子発現パターンが観察された。この結果は、ＨＤＡＣ阻害剤処理と、ビタミンＣ処理を順次行うことにより得られるマウス核移植胚の作出効率改善効果と同レベルの効果は、ＨＤＡＣ阻害剤及びビタミンＣの同時処理では得られないことを示唆している。

１−５血清アルブミンの脱イオン化処理がマウス核移植胚の発生に及ぼす影響
脱イオン化状態の血清アルブミンがマウス核移植胚の発生に及ぼす影響を解析した。具体的には、上記「１−４」の項目に記載の「ＨＤＡＣ阻害剤及びビタミンＣ処理群」において、脱イオン化ウシ血清アルブミン（ｄ−ＢＳＡ）に代えて、脱イオン化未処理のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を用いた場合の２細胞期胚までの発生率及び胚盤胞期胚までの発生率を解析した。その結果、２細胞期胚までの発生率は、ＢＳＡを用いた場合（表４の「ＢＳＡ処理群」参照）、及びｄ−ＢＳＡを用いた場合（表４の「ｄ−ＢＳＡ処理群」参照）の両者でほとんど変わらず高かったものの、胚盤胞期胚までの発生率は、脱イオン化未処理のウシ血清アルブミンを用いた場合は、脱イオン化ウシ血清アルブミンを用いた場合と比べ半分以下に低下（Ｐ＝０．０５）していた（表４及び図２参照）。
この結果は、マウス核移植胚の発生率を上昇（改善）させるためには、脱イオン化血清アルブミン（脱イオン化未処理の血清アルブミンではなく）を用いることが必要であることを示している。

１−６まとめ
活性化処理後のマウス核移植胚を、１０時間ＴＳＡで処理すると、胚盤胞期胚までの発生率が上昇することが知られている（文献「Biochem Biophys Res Commun. 2006 Feb 3;340(1):183-9.」参照）。かかる従来技術と、本実施例で得られた上記結果を総合すると、マウス核移植胚の発生開始後から８時間を含む期間、ＨＤＡＣ阻害剤及び脱イオン化血清アルブミンを含む培養液中で培養し、その後、培養したマウス核移植胚を、胚発生開始後少なくとも８時間から１５時間を含む期間、少なくとも１０（μｇ／ｍＬ）以上のビタミンＣ及び脱イオン化血清アルブミンを含む培養液中に移し、培養すると、核移植胚の胚盤胞期胚までの発生率が改善（上昇）し、その結果、クローンマウスの作出効率が改善（上昇）することを示している。

２．ブタ核移植胚の作出法
２−１ＨＤＡＣ阻害剤、ビタミンＣ、及び脱イオン化血清アルブミンとの組合せによるブタ核移植胚の作出方法
オスブタ耳由来の線維芽細胞（体細胞ドナー）の核を用い、特開２００２−１２５５１６号公報に記載の方法に従って、ブタ核移植卵子の作製と、ブタ核移植卵子の活性化（胚発生誘導）処理を、１．５ｋＶ／ｃｍ、１００μsec.×１回の条件下で行った後、以下の条件１〜５に従ってブタ核移植胚の培養を行い、胚盤胞期胚までの発生率を解析した。
その結果、ＴＳＡ処理により胚盤胞期胚までの発生率が改善することが確認された（表５の条件１と条件２との比較）。また、ＴＳＡ及びビタミンＣの組合せによる効果は、ブタ核移植胚を、ＴＳＡ及びビタミンＣを同時に処理した場合（条件３及び５）は認められず（表５の条件２と、条件３及び５との比較）、ＴＳＡ処理後に、ビタミンＣを順次処理した場合（条件４）に認められた（表５の条件２と、条件４との比較）。
この結果は、ブタ核移植胚を、ＨＤＡＣ阻害剤及び脱イオン化血清アルブミンを含む培養液中で培養し、その後、培養したブタ核移植胚を、ビタミンＣ及び脱イオン化血清アルブミンを含む培養液中に移し、培養すると、核移植胚の胚盤胞期胚までの発生率が改善（上昇）することを示しており、マウス核移植胚を用いた実験結果を支持している。

条件１：
〔１〕活性化処理後、ブタ核移植胚を、５μｇ／ｍＬのサイトカラシンＢ（ＣＢ）（Sigma社製、Ｃａｔ.Ｎｏ.Ｃ−６７６２）を含む、０．３％の脱イオン化未処理のＢＳＡ（Sigma社製）含有ＰＺＭ培養液（文献「Biol. Reprod. 2002; 66: 112-119」参照）（以下、「ＣＢ／ＰＺＭ培養液」という）中で２時間培養
〔２〕工程〔１〕で培養したブタ核移植胚を、０．３％のｄ−ＢＳＡ含有ＰＺＭ培養液（以下、「ｍＰＺＭ培養液」という）中に移し、ブタ胚ゲノムが活性化する４細胞期胚（活性化処理後４８時間）まで培養

条件２：
〔１〕活性化処理後、ブタ核移植胚を、５０ｎＭのＴＳＡ（Sigma-Aldrich社製）を含むＣＢ／ＰＺＭ培養液（以下、「ＴＳＡ／ＣＢ／ＰＺＭ培養液」という）中で２時間培養
〔２〕工程〔１〕で培養したブタ核移植胚を、５０ｎＭのＴＳＡを含むｍＰＺＭ培養液（以下、「ＴＳＡ／ｍＰＺＭ培養液」という）中に移し、１６〜１８時間培養
〔３〕工程〔２〕で培養したブタ核移植胚を、ｍＰＺＭ培養液中に移し、ブタ胚ゲノムが活性化する４細胞期胚（活性化処理後４８時間）まで培養

条件３：
〔１〕活性化処理後、ブタ核移植胚を、ＴＳＡ／ＣＢ／ＰＺＭ培養液中で２時間培養
〔２〕工程〔１〕で培養したブタ核移植胚を、１０μｇ／ｍＬのビタミンＣ（Sigma-Aldrich社製）を含むＴＳＡ／ｍＰＺＭ培養液（以下、「ＴＳＡ／ＶＣ／ｍＰＺＭ培養液」という）中に移しで１６〜１８時間培養
〔３〕工程〔２〕で培養したブタ核移植胚を、ｍＰＺＭ培養液中に移し、ブタ胚ゲノムが活性化する４細胞期胚（活性化処理後４８時間）まで培養

条件４：
〔１〕活性化処理後、ブタ核移植胚を、ＴＳＡ／ＣＢ／ＰＺＭ培養液中で２時間培養
〔２〕工程〔１〕で培養したブタ核移植胚を、ＴＳＡ／ｍＰＺＭ培養液中に移し、１６〜１８時間培養
〔３〕工程〔２〕で培養したブタ核移植胚を、１０μｇ／ｍＬのビタミンＣを含むｍＰＺＭ培養液（以下、「ＶＣ／ｍＰＺＭ培養液」という）中に移し、２４時間培養
〔４〕工程〔３〕で培養したブタ核移植胚を、ｍＰＺＭ培養液中に移し、ブタ胚ゲノムが活性化する４細胞期胚（活性化処理後４８時間）まで培養

条件５：
〔１〕活性化処理後、ブタ核移植胚を、ＴＳＡ／ＣＢ／ＰＺＭ培養液中で２時間培養
〔２〕工程〔１〕で培養したブタ核移植胚を、ＴＳＡ／ＶＣ／ｍＰＺＭ培養液中に移し、１６〜１８時間培養
〔３〕工程〔２〕で培養したブタ核移植胚を、ＶＣ／ｍＰＺＭ培養液中に移し、２４時間培養
〔４〕工程〔３〕で培養したブタ核移植胚を、ｍＰＺＭ培養液中に移し、ブタ胚ゲノムが活性化する４細胞期胚（活性化処理後４８時間）まで培養

２−２ブタ核移植卵子の作製時及び活性化直後の培養に用いる液の検討
ブタ核移植卵子の作製時及び活性化直後の培養に用いる液中に、ｄ−ＢＳＡを添加した場合、ブタ核移植胚の発生に及ぼす影響を解析した。具体的には、上記「２−１」の項目に記載の条件４において、ブタ核移植卵子の作製の際、体細胞核注入操作に用いる体細胞懸濁液及び注入操作ドロップ培養液（以下、「核移植卵子作製時の培養液」ともいう）と、ブタ核移植卵子の活性化処理後の２時間培養に用いる培養液（以下、「核移植卵子活性化直後の培養液」ともいう）として、ＰＺＭ培養液（脱イオン化未処理のＢＳＡ含有培養液）又はｍＰＺＭ培養液（脱イオン化ＢＳＡ含有培養液）を用いた場合の、ブタ核移植胚の胚盤胞期胚までの発生率を解析した。
その結果、ブタ核移植胚の胚盤胞期胚までの発生率は、「核移植卵子作製時の培養液」、及び「核移植卵子活性化直後の培養液」の両方の培養液として、ｍＰＺＭ培養液を用いた場合（表６の「条件４−１」）、「核移植卵子作製時の培養液」、又は「核移植卵子活性化直後の培養液」のいずれか一方の培養液としてｍＰＺＭ培養液を用いた場合（表６の「条件４−２」及び「条件４−３」）や、「核移植操作時の培養液」、及び「活性化直後の培養液」の両方の培養液として、ＰＺＭ培養液を用いた場合（表６の「条件４−４」）と比べ、上昇（改善）することが示された。
この結果は、核移植卵子作製時に用いる体細胞懸濁液や注入操作ドロップ培養液、及び核移植卵子活性化直後（少なくとも２時間）の培養液中に、脱イオン化血清アルブミン（脱イオン化未処理の血清アルブミンではなく）を添加すると、ブタ核移植胚の発生率はより上昇（改善）することを示している。

本発明は、クローン技術を利用した分野、例えば、品質の高い家畜（例えば、霜降り形質を示すウシ）を生産する畜産業、基礎研究及び医療研究、ペット産業、並びにヒト核移植胚を用いた再生医療の分野に資するものである。

Claims

以下の工程（ａ）及び（ｂ）を備えたことを特徴とする非ヒト哺乳動物核移植胚の作出効率の改善方法。
（ａ）非ヒト哺乳動物の核移植胚を、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤と、脱イオン化血清アルブミンとを含む培養液中で培養する工程；
（ｂ）前記工程（ａ）で培養した非ヒト哺乳動物の核移植胚を、ビタミンＣと、脱イオン化血清アルブミンとを含む培養液中に移し、培養する工程；
前記工程（ｂ）で培養した非ヒト哺乳動物の核移植胚を、脱イオン化血清アルブミンを含み、かつヒストン脱アセチル化酵素阻害剤と、ビタミンＣとを含まない培養液中に移し、胚ゲノムが活性化するまで培養する工程（ｃ）をさらに備えたことを特徴とする請求項１に記載の改善方法。
非ヒト哺乳動物がマウスの場合、胚ゲノムの活性化時期が２細胞期胚であり、非ヒト哺乳動物がブタの場合、胚ゲノムの活性化時期が４細胞期胚であることを特徴とする請求項２に記載の改善方法。
ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤が、トリコスタチンＡ（ＴＳＡ）であることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の改善方法。
脱イオン化血清アルブミンが、脱イオン化ウシ血清アルブミンであることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の改善方法。
以下の工程（ａ）及び（ｂ）を備えたことを特徴とする非ヒト哺乳動物核移植胚の作出方法。
（ａ）非ヒト哺乳動物の核移植胚を、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤と、脱イオン化血清アルブミンとを含む培養液中で培養する工程；
（ｂ）前記工程（ａ）で培養した非ヒト哺乳動物の核移植胚を、ビタミンＣと、脱イオン化血清アルブミンとを含む培養液中に移し、培養する工程；
前記工程（ｂ）で培養した非ヒト哺乳動物の核移植胚を、脱イオン化血清アルブミンを含み、かつヒストン脱アセチル化酵素阻害剤と、ビタミンＣとを含まない培養液中に移し、胚ゲノムが活性化するまで培養する工程（ｃ）をさらに備えたことを特徴とする請求項６に記載の作出方法。
非ヒト哺乳動物がマウスの場合、胚ゲノムの活性化時期が２細胞期胚であり、非ヒト哺乳動物がブタの場合、胚ゲノムの活性化時期が４細胞期胚であることを特徴とする請求項７に記載の作出方法。
ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤が、トリコスタチンＡ（ＴＳＡ）であることを特徴とする請求項６〜８のいずれかに記載の作出方法。
脱イオン化血清アルブミンが、脱イオン化ウシ血清アルブミンであることを特徴とする請求項６〜９のいずれかに記載の作出方法。