JP6829225B2 - モノアミン産生増加剤としての間葉系幹細胞を含む医薬組成物 - Google Patents
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Description
本発明は，セロトニン，ノルアドレナリン，それらの主要代謝産物のいずれかもしくは複数の濃度を，生体内で上昇させるための医薬組成物に関する。
特開2008-61569号公報には，セロトニン及びｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害剤を含む幹細胞増殖培地により間葉系幹細胞分化維持をはかる方法が記載されている。この公報では，セロトニンは，培地に添加される組成のひとつとして記載されている。
特許第5541845号公報には，間葉系幹細胞を含むアトピー性皮膚炎の治療剤が記載されている。
特許第6191694号公報には，間葉系幹細胞を含む軟骨損傷の治療剤が記載されている。
本発明は，血液および脳脊髄液を含む生体において，モノアミン系神経伝達物質の産生を促進する医薬組成物を提供することを目的とする。この組成物は，例えば，セロトニン，ノルアドレナリン，またはそれらの主要代謝産物のうちいずれかまたは複数の量を増加させる作用を有する。
上記の課題は，間葉系幹細胞を有効成分として含む医薬組成物が，血液および脳脊髄液などの生体内における，モノアミン系神経伝達物質やその主要代謝産物の産生を促進する作用を有するという実施例による知見に基づく。
本発明は，医薬組成物に関する。これを本発明の医薬組成物とよぶ。この医薬組成物は，医薬又は薬剤として機能する。この医薬組成物は，間葉系幹細胞を有効成分として含む。間葉系幹細胞の由来組織の例は，脂肪組織又は臍帯組織である。この医薬組成物は，治療や予防を含めた各種の目的（例えば筋肉増強，精神安定，鎮痛）を達成するために必要とされる有効量の間葉系幹細胞を含んでもよい。
本発明の医薬組成物は，神経伝達物質であるモノアミン，又はそのモノアミンの代謝産物の産生を促進するための医薬組成物である。この医薬組成物は，モノアミンが低下することによる諸症状や疾患の治療剤として利用できるほか，モノアミンが増加することによる生体機能の亢進剤としても利用できる。
神経伝達物質であるモノアミンの例は，セロトニン及びノルアドレナリンのいずれか又は両方である。そして，モノアミンの代謝産物の例は，５−ハイドロキシインドール酢酸（５−ＨＩＡＡ）及び３−メトキシ−４−ハイドロキシフェニルエチレングリコール（MHPG）のいずれか又は両方である。５−ハイドロキシインドール酢酸（５−ＨＩＡＡ）は，セロトニンの主要代謝産物である。一方，３−メトキシ−４−ハイドロキシフェニルエチレングリコール（MHPG）は，ノルアドレナリンの主要代謝産物である。
この医薬組成物は，モノアミンが低下することによる諸症状や疾患の治療剤として利用できるほか，モノアミンが増加することによる生体機能の亢進剤としても利用できる。具体的な用途例は，鎮痛剤及び筋肉増強剤である。
本発明の医薬組成物は，セロトニンおよびノルアドレナリン，またはそれらの主要代謝産物の量を増加させる作用を有する。このため，この医薬組成物は，モノアミン低下による諸症状や疾患の治療剤として，または，モノアミン増加による生体機能の亢進剤として，有用である。
本発明は，医薬組成物に関する。これを本発明の医薬組成物ともよぶ。この医薬組成物は，医薬，薬剤として機能する。この医薬組成物は，間葉系幹細胞を有効成分として含む。この医薬組成物は，治療や予防を含めた各種の目的（例えば筋肉増強，精神安定，鎮痛）を達成するために求められる有効量の間葉系幹細胞を含んでもよい。
間葉系幹細胞には，滑膜細胞，脂肪細胞，骨髄，歯髄，及び歯根膜等の成人の組織からだけでなく，胎盤，臍帯，臍帯血，及び胎児の種々の細胞等から単離されるものも含まれる。増殖工程において増殖させる間葉系幹細胞は，滑膜，臍帯，臍帯血，羊膜，骨髄，及び，脂肪組織からなる群より選択される組織由来であってもよい。間葉系幹細胞の由来組織が，脂肪組織又は臍帯組織であることが好ましい。
間葉系幹細胞は，医薬組成物を投与する患者の自家細胞であることが好ましいが，同種細胞であってもよい。また，間葉系幹細胞は，ヒト間葉系幹細胞であってもよいし，マウス，ラット，ネコ，イヌ等の非ヒト動物由来間葉系幹細胞であってもよい。各組織から間葉系幹細胞を単離する方法は，公知の方法を採用することが可能であり，例えば，コラゲナーゼ法によって組織から間葉系幹細胞を好適に分離することができる。
本発明の医薬組成物は，神経伝達物質であるモノアミン，又は前記モノアミンの代謝産物の産生を促進するための医薬組成物である。この医薬組成物は，モノアミンが低下することによる諸症状や疾患の治療剤として利用できるほか，モノアミンが増加することによる生体機能の亢進剤としても利用できる。
モノアミンの例は，セロトニン及びノルアドレナリンのいずれか又は両方である。そして，モノアミンの代謝産物の例は，５−ハイドロキシインドール酢酸（５−ＨＩＡＡ）及び３−メトキシ−４−ハイドロキシフェニルエチレングリコール（MHPG）のいずれか又は両方である。５−ハイドロキシインドール酢酸（５−ＨＩＡＡ）は，セロトニンの主要代謝産物である。一方，３−メトキシ−４−ハイドロキシフェニルエチレングリコール（MHPG）は，ノルアドレナリンの主要代謝産物である。
モノアミンと称される神経伝達物質は，構造にアミノ基を１つ有する物質であり，インドール骨格を有するセロトニン，そしてカテコール基を有するドーパミン，ノルアドレナリン，アドレナリンに代表される。一般的に，ドーパミンは快楽や喜びの感情に関連し，ノルアドレナリンは怒りや不安の感情に関連し，セロトニンはこれらのモノアミンの機能を制御する機能があるとされる。神経伝達物質として機能するこれらのモノアミンの受容体は，イオンチャネル型である５−ＨＴ３型受容体の他は，Gタンパク質共役型受容体である。
セロトニンは，必須アミノ酸のトリプトファンから合成され，消化管粘膜，血小板，及び脳にそれぞれ，90%，8%，2%程度存在する。腸においては，内分泌細胞の一種である，腸クロム親和性細胞がオータコイドとして分泌し，腸の蠕動運動を促進するため，腸におけるセロトニンの分泌低下は，便秘につながる。消化管で分泌されたセロトニンの一部は血小板に取り込まれる。一方で，脳内でセロトニンを合成するセロトニン神経の細胞体は，脳幹の縫線核に集中するが，その神経線維は中枢神経系に広く投射される。そのため，中枢神経系でセロトニンに制御される機能としては，体温調節，情動，認知機能，覚醒と睡眠，摂食行動など，多岐に渡る。
セロトニンをターゲットとした医薬品としては，選択的セロトニン再取込阻害薬（SSRI）や，セロトニン・ノルアドレナリン再取込阻害薬（SNRI）が存在する。これらは，セロトニントランスポーターを阻害することにより，シナプス間隙のセロトニン濃度を上昇させる抗鬱薬として使用される。鬱病患者の約３８％においては，セロトニン濃度の低下が認められ，これが鬱病の原因の１つとされている。これをモノアミン仮説という。
本発明の医薬組成物は，モノアミンが低下することによる諸症状や疾患の治療剤として利用できるほか，モノアミンが増加することによる生体機能の亢進剤としても利用できる。具体的な用途例は，鎮痛剤及び筋肉増強剤である。セロトニンは，覚醒作用，鎮痛作用，抗うつ作用などがあり，慢性疲労症候群や疼痛，抑うつなどに対して，本医薬組成物の有用性が考えられる。ノルアドレナリンは，心身の覚醒や興奮，交感神経を活性化する作用，昇圧作用，記憶を固定することに重要な，海馬におけるシナプス長期増強の正の制御，判断力や集中力の上昇，心筋の興奮性亢進，鎮痛作用，筋力増強作用などがあるため，疼痛，恐怖，不安，抑うつ，心不全，判断力低下，記憶力低下，筋力低下，副交感神経亢進などに対して，本医薬組成物の有用性が考えられる。
本発明の医薬組成物は，経口投与剤，ドリンク剤，錠剤，又は注射剤として投与できる。注射剤は，静脈内，筋肉内または皮下等に有効成分である医薬組成物を投与することができ，これらのうち静脈内投与がより好ましい。静脈内投与を行う場合，注射剤は，注射器から直接患者に投与してもよく，また点滴バッグ中で点滴液に先ず添加して患者に点滴静注を行ってもよい。
本発明の医薬組成物が注射剤又はドリンク剤の場合，間葉系幹細胞の他に，水，生理食塩水，溶媒，培養上清，ｐＨ調整剤，酸化防止剤（ビタミンＣ），及びトレハロースといった各種素材を含んでもよい。本発明の医薬組成物が錠剤の場合は，賦形剤，担体といった各種素材を含んでもよい。
本発明の医薬組成物の投与方式は，患者や投与対象の症状や目的の程度に応じて，単回投与でもよく，効果が現れるまで２回，又は３回以上の複数回投与を行ってもよい。
本発明の医薬組成物は，汎用の薬剤であることから，主成分として含有される間葉系幹細胞の起源に対して同種（allogeneic）である患者に投与されるのが一般であるが，同系である患者（例えば，間葉系幹細胞の採取源の一卵性双生児）に投与することを妨げるものではなく，また，培養による増殖を経て汎用のものとして製造された本発明の医薬組成物が，その間葉系幹細胞の採取源となったヒトに対して投与されることを妨げるものでもない。
上記投与時における，本発明の医薬組成物中のヒト間葉系幹細胞の密度は１×１０2〜１×１０9個／ｍＬとすることが好ましく，2×１０6〜2×１０7個／ｍＬとすることが更に好ましい。また，ヒトに対する同細胞の投与個数は，意図する投与回数にもよるが，通常，１回の投与につき１×１０5〜１×１０7個／ｋｇ体重の範囲であることが好ましい。但しこれに限られることなく，症状の程度に応じて適宜増減することができる。
本明細書は，間葉系幹細胞，又は間葉系幹細胞を有効成分として含む本発明の医薬組成物を対象に投与する工程を含む，対象の生体内において，神経伝達物質であるモノアミン，又はモノアミンの代謝産物の産生を促進する方法をも提供する。神経伝達物質であるモノアミン，又はモノアミンの代謝産物の産生が促進されたことは，例えば，医薬組成物を対象に投与する前後の対象の血液から分離した血漿，または脳脊髄液から，モノアミン，又はモノアミンの代謝産物の含有量（血中濃度）を測定して，比較することで確認すればよい。
１． 間葉系幹細胞移植によるラット生体中モノアミン濃度定量試験
１−１．間葉系幹細胞の調製：脂肪組織由来間葉系幹細胞（AD-MSC）
（１）初代培養（P0）
脂肪組織由来間葉系幹細胞を用いた再生医療を受ける患者より，投与用細胞の調製に必要な原料となる皮下脂肪組織を分取した後の余剰組織について，研究用利用用途の同意取得の後に皮下脂肪の提供を受け，初代培養に供した。皮下脂肪組織は遠心分離（４００×gで５分間）に供し，上から順に脂質画分，脂肪組織画分，および水性画分の３層に分離した。中層の脂肪組織画分を残して，上層と下層を破棄した。残した脂肪組織画分に対して，組織重量当たり４倍量の０．１５％コラゲナーゼ酵素溶液を添加し，３７℃で１時間浸透させ，酵素処理を行った。脂肪組織が分散された後, 遠心分離（４００×gで５分間）に供し，間葉系幹細胞を含む間質血管細胞画分として，沈殿画分を30 mLのPBS（-）溶液で懸濁した。その後，セルストレーナー（７０μm径）に懸濁液を通液し，通液画分を再度遠心分離（４００×gで５分間）に供し，セルストレーナーに捕捉された組織残渣等は破棄した。沈殿画分を６ mLの無血清培養液（Procul AD; ロート製薬）で懸濁し，T-25フラスコ（CellBIND（登録商標）; Corning）に全量を播種し，インキュベーター内（３７℃,５％ CO2）に静置して初代培養を開始した。
１−１．間葉系幹細胞の調製：脂肪組織由来間葉系幹細胞（AD-MSC）
（１）初代培養（P0）
脂肪組織由来間葉系幹細胞を用いた再生医療を受ける患者より，投与用細胞の調製に必要な原料となる皮下脂肪組織を分取した後の余剰組織について，研究用利用用途の同意取得の後に皮下脂肪の提供を受け，初代培養に供した。皮下脂肪組織は遠心分離（４００×gで５分間）に供し，上から順に脂質画分，脂肪組織画分，および水性画分の３層に分離した。中層の脂肪組織画分を残して，上層と下層を破棄した。残した脂肪組織画分に対して，組織重量当たり４倍量の０．１５％コラゲナーゼ酵素溶液を添加し，３７℃で１時間浸透させ，酵素処理を行った。脂肪組織が分散された後, 遠心分離（４００×gで５分間）に供し，間葉系幹細胞を含む間質血管細胞画分として，沈殿画分を30 mLのPBS（-）溶液で懸濁した。その後，セルストレーナー（７０μm径）に懸濁液を通液し，通液画分を再度遠心分離（４００×gで５分間）に供し，セルストレーナーに捕捉された組織残渣等は破棄した。沈殿画分を６ mLの無血清培養液（Procul AD; ロート製薬）で懸濁し，T-25フラスコ（CellBIND（登録商標）; Corning）に全量を播種し，インキュベーター内（３７℃,５％ CO2）に静置して初代培養を開始した。
（２）継代培養（P0→P1→P2→P3）
３日に１回の頻度で培地全交換を実施し，上澄みは破棄して，フラスコ底面上で増殖する細胞を選択的に増殖した。セミコンフルエントまで増殖したT-25フラスコの細胞に対して，2 mLの酵素溶液（TrypLE Secelt（登録商標）；Thermo Fisher Scientific）を添加し剥離した（３７℃，５分間静置）。細胞をPBS（-）で希釈し，遠心分離（４００×gで５分間）に供した。沈殿した細胞を培養液で懸濁し，トリパンブルー染色法による細胞数計測を行った結果，1.36×106個の生細胞が回収できたため，その全量をT-150フラスコ（CellBIND（登録商標）; Corning）２枚に等分して無血清培養液（Procul AD; ロート製薬）で全量を播種し，インキュベーター内（３７℃,５％ CO2）に静置して継代培養を行った（P0→P1）。
３日に１回の頻度で培地全交換を実施し，上澄みは破棄して，フラスコ底面上で増殖する細胞を選択的に増殖した。播種から3日目にセミコンフルエントまで増殖した細胞に対して，6 mLの酵素溶液（TrypLE Select（登録商標）；Thermo Fisher Scientific）を添加して剥離した（３７℃，５分間静置）。細胞をPBS（-）で希釈し，遠心分離（４００×gで５分間）に供した。沈殿した細胞を無血清培養液（Procul AD; ロート製薬）で懸濁し，トリパンブルー染色法による細胞数計測を行った結果，1.17×107個の生細胞を回収できたため，その一部を3.9×103/cm2細胞濃度でT-150フラスコ８枚に播種を行い継代した（P1→P2）。播種から3日目にセミコンフルエントまで増殖したことを確認後，同様の手順で細胞の回収を行った。その結果，生存率が95.2％であり，生細胞数を5.27×107個回収したことを確認し，凍結保存液（STEMCELL BANKER;日本全薬工業）に懸濁してラットへの投与日まで液体窒素タンクで保管した。
３日に１回の頻度で培地全交換を実施し，上澄みは破棄して，フラスコ底面上で増殖する細胞を選択的に増殖した。セミコンフルエントまで増殖したT-25フラスコの細胞に対して，2 mLの酵素溶液（TrypLE Secelt（登録商標）；Thermo Fisher Scientific）を添加し剥離した（３７℃，５分間静置）。細胞をPBS（-）で希釈し，遠心分離（４００×gで５分間）に供した。沈殿した細胞を培養液で懸濁し，トリパンブルー染色法による細胞数計測を行った結果，1.36×106個の生細胞が回収できたため，その全量をT-150フラスコ（CellBIND（登録商標）; Corning）２枚に等分して無血清培養液（Procul AD; ロート製薬）で全量を播種し，インキュベーター内（３７℃,５％ CO2）に静置して継代培養を行った（P0→P1）。
３日に１回の頻度で培地全交換を実施し，上澄みは破棄して，フラスコ底面上で増殖する細胞を選択的に増殖した。播種から3日目にセミコンフルエントまで増殖した細胞に対して，6 mLの酵素溶液（TrypLE Select（登録商標）；Thermo Fisher Scientific）を添加して剥離した（３７℃，５分間静置）。細胞をPBS（-）で希釈し，遠心分離（４００×gで５分間）に供した。沈殿した細胞を無血清培養液（Procul AD; ロート製薬）で懸濁し，トリパンブルー染色法による細胞数計測を行った結果，1.17×107個の生細胞を回収できたため，その一部を3.9×103/cm2細胞濃度でT-150フラスコ８枚に播種を行い継代した（P1→P2）。播種から3日目にセミコンフルエントまで増殖したことを確認後，同様の手順で細胞の回収を行った。その結果，生存率が95.2％であり，生細胞数を5.27×107個回収したことを確認し，凍結保存液（STEMCELL BANKER;日本全薬工業）に懸濁してラットへの投与日まで液体窒素タンクで保管した。
１−２．間葉系幹細胞の調製：臍帯組織由来間葉系幹細胞（UC-MSC）
（１）初代培養（P0）
通常分娩を行う産婦より同意を得て取得した臍帯組織を，採取の翌日に初代培養に供した。約10 cmの臍帯組織から臍帯血を除去した後，医療用メスで細断し，0.15 % Collagenase溶液に浸して37℃で16時間，シェーカーで緩やかに攪拌させながら酵素処理を行った。臍帯組織の分散を目視で確認した後，PBS(-)で10倍希釈を行った後，1,000×g, 5分の遠心分離に供し，沈殿画分を残して上層を破棄した。その後，沈殿画分をPBS(-)で懸濁した後，70μmのフィルターに供し，通液画分をコニカルチューブ２本に等分した後，400×g, 5分の遠心分離に供し，細胞を含む沈殿画分を，24 mLの無血清培養液（Procul AD; ロート製薬）培地で懸濁した。その後，T-150フラスコ（CellBIND（登録商標）; Corning）1枚に全量を播種し，インキュベーター内（３７℃,５％ CO2）に静置して初代培養を開始した。
（１）初代培養（P0）
通常分娩を行う産婦より同意を得て取得した臍帯組織を，採取の翌日に初代培養に供した。約10 cmの臍帯組織から臍帯血を除去した後，医療用メスで細断し，0.15 % Collagenase溶液に浸して37℃で16時間，シェーカーで緩やかに攪拌させながら酵素処理を行った。臍帯組織の分散を目視で確認した後，PBS(-)で10倍希釈を行った後，1,000×g, 5分の遠心分離に供し，沈殿画分を残して上層を破棄した。その後，沈殿画分をPBS(-)で懸濁した後，70μmのフィルターに供し，通液画分をコニカルチューブ２本に等分した後，400×g, 5分の遠心分離に供し，細胞を含む沈殿画分を，24 mLの無血清培養液（Procul AD; ロート製薬）培地で懸濁した。その後，T-150フラスコ（CellBIND（登録商標）; Corning）1枚に全量を播種し，インキュベーター内（３７℃,５％ CO2）に静置して初代培養を開始した。
（２）継代培養（P0→P1→P2）
2日に１回の頻度で培地全交換を実施し，上澄みは破棄して，フラスコ底面上で増殖する細胞を選択的に増殖した。セミコンフルエントまで増殖したT-150フラスコの細胞に対して，6mLの酵素溶液（TrypLE Select（登録商標）；Thermo Fisher Scientific）を添加し剥離した（３７℃，５分間静置）。細胞をPBS（-）で希釈し，遠心分離（４００×gで５分間）に供した。沈殿した細胞を培養液で懸濁し，トリパンブルー染色法による細胞数計測を行った結果，4.33×106個の生細胞が回収できたため，その全量をT-150フラスコ（CellBIND（登録商標）; Corning）5枚に等分して無血清培養液（Procul AD; ロート製薬）で全量を播種し，インキュベーター内（３７℃,５％ CO2）に静置して継代培養を行った（P0→P1）。2日に１回の頻度で培地全交換を実施し，播種から４日目にセミコンフルエントまで増殖したことを確認後，同様の手順で細胞の回収を行った。
P2において，2.83×107個の生細胞を回収できたため，その一部を6.7×103/cm2細胞濃度でT-150フラスコ10枚に播種を行い継代した（P1→P2）。2日に１回の頻度で培地全交換を実施し，播種から４日目にセミコンフルエントまで増殖したことを確認後，同様の手順で細胞の回収を行った。その結果，生存率が90.5％であり，生細胞数を4.43×107個回収したことを確認し，凍結保存液（STEMCELL BANKER;日本全薬工業）に懸濁して，ラットへの投与日まで液体窒素タンクで保管した。
2日に１回の頻度で培地全交換を実施し，上澄みは破棄して，フラスコ底面上で増殖する細胞を選択的に増殖した。セミコンフルエントまで増殖したT-150フラスコの細胞に対して，6mLの酵素溶液（TrypLE Select（登録商標）；Thermo Fisher Scientific）を添加し剥離した（３７℃，５分間静置）。細胞をPBS（-）で希釈し，遠心分離（４００×gで５分間）に供した。沈殿した細胞を培養液で懸濁し，トリパンブルー染色法による細胞数計測を行った結果，4.33×106個の生細胞が回収できたため，その全量をT-150フラスコ（CellBIND（登録商標）; Corning）5枚に等分して無血清培養液（Procul AD; ロート製薬）で全量を播種し，インキュベーター内（３７℃,５％ CO2）に静置して継代培養を行った（P0→P1）。2日に１回の頻度で培地全交換を実施し，播種から４日目にセミコンフルエントまで増殖したことを確認後，同様の手順で細胞の回収を行った。
P2において，2.83×107個の生細胞を回収できたため，その一部を6.7×103/cm2細胞濃度でT-150フラスコ10枚に播種を行い継代した（P1→P2）。2日に１回の頻度で培地全交換を実施し，播種から４日目にセミコンフルエントまで増殖したことを確認後，同様の手順で細胞の回収を行った。その結果，生存率が90.5％であり，生細胞数を4.43×107個回収したことを確認し，凍結保存液（STEMCELL BANKER;日本全薬工業）に懸濁して，ラットへの投与日まで液体窒素タンクで保管した。
１−３． 投与する細胞懸濁液の調製
ラットへの細胞投与日に，液体窒素タンクに保管された脂肪組織由来間葉系幹細胞，及び臍帯由来間葉系幹細胞を室温で解凍し，解凍後速やかにPBS（-）で希釈した後，400×g, 5分の遠心分離に供した。細胞を含む沈殿画分をPBS(-)で懸濁し，トリパンブルー染色法による計測を行ったところ，脂肪組織由来間葉系幹細胞及び臍帯由来間葉系幹細胞の生存率がそれぞれ91.5%と87.1％であった。これにより，投与に用いる細胞として十分な生存率を維持していることを確認した。次に，再度400×g, 5分の遠心分離に供し，上澄みを破棄して細胞を含む沈殿画分をPBS(-)で懸濁し，ラットへの投与に用いる細胞懸濁液の細胞濃度が5×106 cells/mLに調整した。
ラットへの細胞投与日に，液体窒素タンクに保管された脂肪組織由来間葉系幹細胞，及び臍帯由来間葉系幹細胞を室温で解凍し，解凍後速やかにPBS（-）で希釈した後，400×g, 5分の遠心分離に供した。細胞を含む沈殿画分をPBS(-)で懸濁し，トリパンブルー染色法による計測を行ったところ，脂肪組織由来間葉系幹細胞及び臍帯由来間葉系幹細胞の生存率がそれぞれ91.5%と87.1％であった。これにより，投与に用いる細胞として十分な生存率を維持していることを確認した。次に，再度400×g, 5分の遠心分離に供し，上澄みを破棄して細胞を含む沈殿画分をPBS(-)で懸濁し，ラットへの投与に用いる細胞懸濁液の細胞濃度が5×106 cells/mLに調整した。
１−４． ラットへの投与と測定検体の採取
（１）投与
SDラット（雄性，４週齢，体重180 g前後；日本クレア）に対して，脂肪組織由来間葉系幹細胞，及び臍帯由来間葉系幹細胞の懸濁液を，尾静脈より１匹あたり5×106 cells（1mL）の割合で単回投与した。投与には3０Gの注射針を使用した。また，コントロールとして，PBS(-)投与群も設定し，細胞と同様に尾静脈より1mLを単回投与した。なお，脂肪組織由来間葉系幹細胞投与群，臍帯由来間葉系幹細胞投与群，及びPBS(-)投与群はそれぞれラットの数を６匹と設定した（n=6／群）。細胞またはPBS(-)の投与直後から投与１時間後までの観察において，ラットの運動機能の低下や呼吸困難，振戦等の症状の他，一般状態に異常は確認されなかった。そのため，投与量として安全な範囲で投与されたことを確認した。
（１）投与
SDラット（雄性，４週齢，体重180 g前後；日本クレア）に対して，脂肪組織由来間葉系幹細胞，及び臍帯由来間葉系幹細胞の懸濁液を，尾静脈より１匹あたり5×106 cells（1mL）の割合で単回投与した。投与には3０Gの注射針を使用した。また，コントロールとして，PBS(-)投与群も設定し，細胞と同様に尾静脈より1mLを単回投与した。なお，脂肪組織由来間葉系幹細胞投与群，臍帯由来間葉系幹細胞投与群，及びPBS(-)投与群はそれぞれラットの数を６匹と設定した（n=6／群）。細胞またはPBS(-)の投与直後から投与１時間後までの観察において，ラットの運動機能の低下や呼吸困難，振戦等の症状の他，一般状態に異常は確認されなかった。そのため，投与量として安全な範囲で投与されたことを確認した。
（２）血漿の調整
細胞またはPBS(-)の投与から７日後に，各実験群３匹ずつから約3mLずつ採血を行い，末梢血に10μg／mLのヘパリンを添加して緩やかに混和した後，1,200×g/10分間の遠心分離により血漿画分を得た後，速やかに−８０℃で保管した。
細胞またはPBS(-)の投与から７日後に，各実験群３匹ずつから約3mLずつ採血を行い，末梢血に10μg／mLのヘパリンを添加して緩やかに混和した後，1,200×g/10分間の遠心分離により血漿画分を得た後，速やかに−８０℃で保管した。
（３）脳脊髄液の調整
細胞またはPBS(-)の投与から７日後に，小脳延髄槽に穿刺を行うことにより，各実験群３匹ずつから脳脊髄液を約70μLずつ採取した。採取後，速やかに−８０℃で保管した。
細胞またはPBS(-)の投与から７日後に，小脳延髄槽に穿刺を行うことにより，各実験群３匹ずつから脳脊髄液を約70μLずつ採取した。採取後，速やかに−８０℃で保管した。
１−５． モノアミン定量
採取後に保管した血漿及び脳脊髄液について，HPLC-MS/MSによるモノアミンの定量解析を行った。測定対象物質は，ノルアドレナリンの主要代謝産物の3-メトキシ-4-ハイドロキシフェニルエチレングリコール（MHPG）と，セロトニンの主要代謝産物である５−ハイドロキシインドール酢酸（5-HIAA）とした。これらを測定することにより，その前駆物質であるノルアドレナリンとセロトニンの量も把握することができるため，臨床検査にもMHPGと５−HIAAは活用される物質である。
採取後に保管した血漿及び脳脊髄液について，HPLC-MS/MSによるモノアミンの定量解析を行った。測定対象物質は，ノルアドレナリンの主要代謝産物の3-メトキシ-4-ハイドロキシフェニルエチレングリコール（MHPG）と，セロトニンの主要代謝産物である５−ハイドロキシインドール酢酸（5-HIAA）とした。これらを測定することにより，その前駆物質であるノルアドレナリンとセロトニンの量も把握することができるため，臨床検査にもMHPGと５−HIAAは活用される物質である。
（１）前処理
サンプルの前処理として，血漿サンプルの場合，各検体200μLに，0.4mol/L過塩素酸を200μL加え，攪拌後，遠心分離（17,500×g，4℃，5min）に供し，上澄み画分を固相抽出に供した（Oasis HLB uElution 96-wells Plate 30um；Waters）。固相抽出の手順として，メタノール（200μL），超純水（200μL），検体（200μL），5-HIAA測定時には内部標準物質として5-HIAA-d5（10μL）の順にカラムに供した。次に超純水（200μL）で洗浄し，メタノールで希釈した2% ギ酸（200μL）で溶出し，測定サンプルとした。脳脊髄液サンプルの場合，0.4mol/L過塩素酸を７０μLとして，それ以降は血漿サンプルと同様とした。
サンプルの前処理として，血漿サンプルの場合，各検体200μLに，0.4mol/L過塩素酸を200μL加え，攪拌後，遠心分離（17,500×g，4℃，5min）に供し，上澄み画分を固相抽出に供した（Oasis HLB uElution 96-wells Plate 30um；Waters）。固相抽出の手順として，メタノール（200μL），超純水（200μL），検体（200μL），5-HIAA測定時には内部標準物質として5-HIAA-d5（10μL）の順にカラムに供した。次に超純水（200μL）で洗浄し，メタノールで希釈した2% ギ酸（200μL）で溶出し，測定サンプルとした。脳脊髄液サンプルの場合，0.4mol/L過塩素酸を７０μLとして，それ以降は血漿サンプルと同様とした。
（２）定量解析
測定にはUltimate 3000 Rapid Separation with Q Exactiveシステム（Thermo Fisher Scientific）を用い，カラムはScherzo SS C18，100×3.0mm，3um（Imtakt）を用いた。液体クロマトグラフィーの測定条件として，カラム温度は30℃，グラジエントを掛けるための移動相Aとしてメタノール/水/ギ酸=35/65/0.5を，移動相Bとしてメタノール/100mM ギ酸アンモニウム=40/60を，グラジエントは表１の通りとし，測定サンプルのインジェクト量は５μLとした。質量分析は，イオン化モードはポジティブモード，分解能は17,500，キャピラリー温度は263℃，スプレー電圧は2.5V，定量における質量レンジは，5-HIAAは192.0655→146.055-146.065にて，内部標準物質の5-HIAA-d5は197.0969→151.085-151.095にて，MHPGは167.0703→135.043-135.045にて実施した。
測定にはUltimate 3000 Rapid Separation with Q Exactiveシステム（Thermo Fisher Scientific）を用い，カラムはScherzo SS C18，100×3.0mm，3um（Imtakt）を用いた。液体クロマトグラフィーの測定条件として，カラム温度は30℃，グラジエントを掛けるための移動相Aとしてメタノール/水/ギ酸=35/65/0.5を，移動相Bとしてメタノール/100mM ギ酸アンモニウム=40/60を，グラジエントは表１の通りとし，測定サンプルのインジェクト量は５μLとした。質量分析は，イオン化モードはポジティブモード，分解能は17,500，キャピラリー温度は263℃，スプレー電圧は2.5V，定量における質量レンジは，5-HIAAは192.0655→146.055-146.065にて，内部標準物質の5-HIAA-d5は197.0969→151.085-151.095にて，MHPGは167.0703→135.043-135.045にて実施した。
（３）定量結果
MHPGと5-HIAA定量の結果を図２に示す。
「血漿−MHPG」
図２（ａ）に示される通り，血漿サンプルにおけるMHPGは，コントロールのPBS(-)投与群が4.081 ng/mL，AD-MSC投与群が7.125 ng/mL，UC-MSC投与群が6.391 ng/mLであり，有意差検定の結果，PBS(-)投与群に対してAD-MSC投与群及びUC-MSC投与群は，MHPG濃度の上昇が確認された（p値＜0.05）。
MHPGと5-HIAA定量の結果を図２に示す。
「血漿−MHPG」
図２（ａ）に示される通り，血漿サンプルにおけるMHPGは，コントロールのPBS(-)投与群が4.081 ng/mL，AD-MSC投与群が7.125 ng/mL，UC-MSC投与群が6.391 ng/mLであり，有意差検定の結果，PBS(-)投与群に対してAD-MSC投与群及びUC-MSC投与群は，MHPG濃度の上昇が確認された（p値＜0.05）。
「脳脊髄液−MHPG」
図２（ｂ）に示される通り，血漿サンプルにおけるMHPGは，コントロールのPBS(-)投与群が7.352 ng/mL，AD-MSC投与群が11.602 ng/mL，UC-MSC投与群が19.678 ng/mLであり，有意差検定の結果，PBS(-)投与群に対してAD-MSC投与群及びUC-MSC投与群は，MHPG濃度の上昇が確認された（p値＜0.05）。
図２（ｂ）に示される通り，血漿サンプルにおけるMHPGは，コントロールのPBS(-)投与群が7.352 ng/mL，AD-MSC投与群が11.602 ng/mL，UC-MSC投与群が19.678 ng/mLであり，有意差検定の結果，PBS(-)投与群に対してAD-MSC投与群及びUC-MSC投与群は，MHPG濃度の上昇が確認された（p値＜0.05）。
「血漿−5-HIAA」
図２（c）に示される通り，血漿サンプルにおける５−ＨＩＡＡは，PBS(-)投与群が12.746 ng/mL，AD-MSC投与群が22.450 ng/mL，UC-MSC投与群が19.317 ng/mLであり，有意差検定の結果，PBS(-)投与群に対してAD-MSC投与群及びUC-MSC投与群は，５−ＨＩＡＡ濃度の上昇が確認された（p値＜0.05）
図２（c）に示される通り，血漿サンプルにおける５−ＨＩＡＡは，PBS(-)投与群が12.746 ng/mL，AD-MSC投与群が22.450 ng/mL，UC-MSC投与群が19.317 ng/mLであり，有意差検定の結果，PBS(-)投与群に対してAD-MSC投与群及びUC-MSC投与群は，５−ＨＩＡＡ濃度の上昇が確認された（p値＜0.05）
「脳脊髄液−5-HIAA」
図２（ｄ）に示される通り，血漿サンプルにおける５−ＨＩＡＡは，PBS(-)投与群が4.633 ng/mL，AD-MSC投与群が9.265 ng/mL，UC-MSC投与群が9.519 ng/mLであり，有意差検定の結果，PBS(-)投与群に対してAD-MSC投与群及びUC-MSC投与群は，５−ＨＩＡＡ濃度の上昇が確認された（p値＜0.05）
図２（ｄ）に示される通り，血漿サンプルにおける５−ＨＩＡＡは，PBS(-)投与群が4.633 ng/mL，AD-MSC投与群が9.265 ng/mL，UC-MSC投与群が9.519 ng/mLであり，有意差検定の結果，PBS(-)投与群に対してAD-MSC投与群及びUC-MSC投与群は，５−ＨＩＡＡ濃度の上昇が確認された（p値＜0.05）
以上の結果の通り，脂肪組織由来間葉系幹細胞または臍帯組織由来間葉系幹細胞の全身性投与により，末梢血中及び脳脊髄液中のMHPG及び5−HIAAが増加することが明らかとなり，生体におけるモノアミン産生促進作用を有する医薬組成物として，間葉系幹細胞を活用できることを見出した。
本発明の医薬組成物は，投与された対象の体内において，セロトニン又はノルアドレナリンといったモノアミンと称される神経伝達物質の産生量を増加させるため，精神疾患の治療剤，鎮痛剤，筋力増強剤などとして利用されうる。このため，本発明は，医薬産業において利用されうる。
Claims (5)
- 間葉系幹細胞を有効成分として含む，５−ハイドロキシインドール酢酸（５−ＨＩＡＡ）又は３−メトキシ−４−ハイドロキシフェニルエチレングリコール（MHPG）の産生促進剤。
- 請求項１に記載の剤であって，前記間葉系幹細胞の由来組織が，脂肪組織又は臍帯組織である，剤。
- 請求項１に記載の剤であって，静脈投与される剤である，剤。
- 請求項１に記載の剤であって，末梢血または脊髄液中の５−ハイドロキシインドール酢酸（５−ＨＩＡＡ）又は３−メトキシ−４−ハイドロキシフェニルエチレングリコール（MHPG）の産生を促進するための，剤。
- 間葉系幹細胞を投与された対象の血液から分離した血漿，又は脳脊髄液を用いて，５−ハイドロキシインドール酢酸（５−ＨＩＡＡ）又は３−メトキシ−４−ハイドロキシフェニルエチレングリコール（MHPG）の含有量又は濃度を測定する工程を含む，間葉系幹細胞が対象に有効か否かを確認する方法。
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