JP6796649B2 - 組換え微生物を利用した金属ナノ粒子及び金属硫化物ナノ粒子の製造方法 - Google Patents

組換え微生物を利用した金属ナノ粒子及び金属硫化物ナノ粒子の製造方法 Download PDF

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Description

本発明は組換え微生物を利用した金属ナノ粒子及び金属硫化物ナノ粒子の製造方法に関するもので、さらに詳しくは重金属吸着タンパク質であるファイトケラチン合成酵素とメタロチオネインが同時に発現する組換え微生物を利用して金属ナノ粒子及び金属硫化物ナノ粒子を製造する方法に関するものである。
ナノテクノロジー技術に対する関心が増大されて、物理、化学、材料、電気、電子など多様な分野において、ナノメートルサイズの新しい素材を開発しようとする多様な研究が活発に行われている。特に金属ナノ構造を利用した素材の場合、既存の技術で作られたバルク素材では具現することが難しかった高効率の電子、光、光電子、電子素子、バイオ活性分子検出素子及び触媒などを作るのに応用することができて、医学、化粧品、エネルギー変換及び貯蔵などにも利用され、その応用範囲が広く、多様であるために（Ｓｈｅｄｂａｌｋａｒ Ｕ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖ Ｃｏｌｌｏｉｄ Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ Ｓｃｉ， ２０９：４０−４８，２０１４；Ｆａｎ Ｗ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈｙｓ Ｃｈｅｍ Ｃｈｅｍ Ｐｈｙｓ，１５（８）：２６３２−２６４９，２０１３； Ｋｏｒｂｅｋａｎｄｉ Ｈ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２９（４）：２７９−３０６，２００９）、新規な金属ナノ粒子を合成したり、既存に存在していた金属ナノ粒子としても、これに対する新規な特性を究明するための研究が活発に行われている。
既存の金属ナノ粒子の製造には金属元素に化学物質の還元剤を使用して合成する化学的方法が主に利用されたが、この方法は有毒な有機溶媒及び高額の触媒を必要として高温や高圧の条件を要求するので、環境汚染の問題とともに、エネルギー効率と経済性が落ちるという短所があった。したがって、新環境的で経済的な代案として還元酵素を有している生物体を利用した生物学的方法が提案された。実際に、微生物、酵素、植物などを利用して金属元素から金属ナノ粒子を合成した事例が報告されている（Ｐａｚａ ＧＡ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ Ｊ Ｍｏｌ Ｓｃｉ １５（８）：１３７２０−１３７３７，２０１４；Ｈｕｌｋｏｔｉ ＮＩ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｌｌｏｉｄｓ Ｓｕｒｆ Ｂ Ｂｉｏｉｎｔｅｒｆａｃｅｓ，１２１：４７４−４８３，２０１４；Ｍｏｇｈａｄｄａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，２０（９）：１６５４０−１６５６５，２０１５；Ｐａｒｋ ＴＪ ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，１−１４，２０１５）。しかしながら、このような方法らは生物体の有した自体の生体機構をそのまま利用したことでナノ粒子の合成に適用される元素は金、銀、銅、カドミウム、鉄、セレニウム程度に制限されるという限界を有している（Ｑｕｅｓｔｅｒ Ｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｎ，５４−５５：１−２７，２０１３；Ｂｈａｒｄｅ Ａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｎａｎｏｓｃｉ Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌ，７（１２）：４３６９−４３７７，２００７；Ｓｈｅｄｂａｌｋｅｒ Ｕ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖ Ｃｏｌｌｏｉｄ Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ Ｓｃｉ，２０９：４０−４８，２０１４；Ｓｒｉｒａｍ ＭＩ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ，９０６：３３−４３，２０１２；Ｇｕｒｕｎａｔｈａｎ Ｓ ｅｔ ａｌ．， Ｃｏｌｌｏｉｄｓ Ｓｕｒｆ Ｂ Ｂｉｏｉｎｔｅｒｆａｃｅｓ，７４（１）３２８−３３５，２００９）。
また、本発明者らは微生物に重金属の吸着タンパク質を発現する組換え微生物を利用して亜鉛（Ｚｎ）、セレニウム（Ｓｅ）、テルル（Ｔｅ）、セシウム（Ｃｓ）、銅（Ｃｕ）、鉛（Ｐｂ）、ニッケル（Ｎｉ）、マンガン（Ｍｎ）、水銀（Ｈｇ）、コバルト（Ｃｏ）及びクロム（Ｃｒ）のような元素から金属ナノ粒子を製造したが（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，ＡＣＳ Ｎａｎｏ ６（８）：６９９８−７００８，２０１２；大韓民国登録特許第１０−０７５５７４６号）、その他の多様な金属元素を利用して金属ナノ粒子を製造するのに限界があり、その収率も低い問題点があった。
一方、金属硫化物のナノ粒子は独特で優秀な特性のために次世代の電極材料及びエネルギー貯蔵材料として注目されている（Ｒｕｉ Ｘ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｎｏｓｃａｌｅ，６（１７）：９８８９−９９２４，２０１４）。これによって、金属硫化物のナノ粒子の製造方法に関する従来技術が報告されているが、金属の前駆体とチオール化合物を反応させて硫化金属結晶を得る方法に関する硫前駆体としてチオール化合物を利用した硫化金属ナノ結晶の製造方法（大韓民国登録特許第１０−０６２１３０９号）、太陽電池のバッファー層使用のための板状型または線形のインジウム複合体ナノ物質（大韓民国登録特許第１０−１３０５５５４号）、硫化すずの先駆物質を加熱し、硫化すずのナノ粒子を製造する硫化すずのナノ粒子の製造方法及びこれを利用したリチウムイオン電池の製造方法（大韓民国登録特許第１０−０８９６６５６号）などがある。しかしながら、上記方法は３００℃以上の高い反応温度が必要で、トルエンなどの有機溶媒を使用し、親環境的ではなく、後続熱処理が必要であるために製造原価の側面で不利な短所がある。また、半導体物質として使用されるＣｄｓ、ＰｂＳ（Ｊｏｏ Ｊ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ，１２５（３６）：１１１００−１１１０５，２００３）は、環境的側面から否定的影響を及ぼすため、カドミウム及び鉛を基盤とする金属硫化物ではない他の元素を利用する金属硫化物ナノ粒子の合成が必要な実情である。
従って、本発明者らは、既存に合成されなかった多様な金属ナノ粒子及び金属硫化物のナノ粒子を製造しようと鋭意努力した結果、重金属の吸着タンパク質であるメタロチオネインとファイトケラチン合成酵素を同時に発現する組換え微生物を利用して培養条件を最適化させる場合、従来に金属ナノ粒子の合成のための元素として報告されたことのない元素から金属ナノ粒子と金属硫化物のナノ粒子の製造が可能であることを確認しただけでなく、既存の方法で製造されていた金属ナノ粒子の収率が顕著に増加されることを確認し、本発明を完成するようになった。
本背景技術の部分に記載された上記情報は、単に本発明の背景に対する理解を向上させるためのものであり、これに本発明の属する技術分野で通常の知識を有する者にとって既に公知された先行技術を形成する情報を含まないことができる。
本発明の目的は組換え微生物を利用して単一金属ナノ粒子を製造する方法を提供することにある。
本発明の他の目的は組換え微生物を利用して複合金属ナノ粒子を製造する方法を提供することにある。
本発明のまた他の目的は組換え微生物を利用して金属硫化物のナノ粒子を製造する方法を提供することにある。
本発明のまた他の目的は、上記製造された金属ナノ粒子の用途を提供することにある。
前記の目的を達成するために、本発明は（ａ）メタロチオネインをコードする遺伝子及びファイトケラチン合成酵素をコードする遺伝子が導入された組換え微生物を培養する段階：（ｂ）亜鉛（Ｚｎ）、セレニウム（Ｓｅ）、テルル（Ｔｅ）、セシウム（Ｃｓ）、銅（Ｃｕ）、鉛（Ｐｂ）、ニッケル（Ｎｉ）、マンガン（Ｍｎ）、水銀（Ｈｇ）、コバルト（Ｃｏ），クロム（Ｃｒ）、カドミウム（Ｃｄ）、ストロンチウム（Ｓｒ）、鉄（Ｆｅ）、金（Ａｕ）、銀（Ａｇ）、プラセオジム（Ｐｒ）、ガドリニウム（Ｇｄ）、バリウム（Ｂａ）、ジルコニウム（Ｚｒ）、モリブデン（Ｍｏ）、インジウム（Ｉｎ）、すず（Ｓｎ）、ランタン（Ｌａ）、セリウム（Ｃｅ）、ネオジウム（Ｎｄ）、サマリウム（Ｓｍ）、イットリウム（Ｙ）、アルミニウム（Ａｌ）及びユーロピウム（Ｅｕ）で構成された群から選択される金属イオンを添加した後、追加で培養して単一金属ナノ粒子を生成させる段階；及び（ｃ）前記生成された単一金属ナノ粒子を回収する段階を含む単一の金属ナノ粒子の製造方法を提供する。
本発明はまた、（ａ）メタロチオネインをコードする遺伝子及びファイトケラチン合成酵素をコードする遺伝子が導入された組換え微生物を培養する段階：（ｂ）亜鉛（Ｚｎ）、セレニウム（Ｓｅ）、テルル（Ｔｅ）、セシウム（Ｃｓ）、銅（Ｃｕ）、鉛（Ｐｂ）、ニッケル（Ｎｉ）、マンガン（Ｍｎ）、水銀（Ｈｇ）、コバルト（Ｃｏ），クロム（Ｃｒ）、カドミウム（Ｃｄ）、ストロンチウム（Ｓｒ）、鉄（Ｆｅ）、金（Ａｕ）、銀（Ａｇ）、プラセオジム（Ｐｒ）、ガドリニウム（Ｇｄ）、バリウム（Ｂａ）、ジルコニウム（Ｚｒ）、モリブデン（Ｍｏ）、インジウム（Ｉｎ）、すず（Ｓｎ）、ランタン（Ｌａ）、セリウム（Ｃｅ）、ネオジウム（Ｎｄ）、サマリウム（Ｓｍ）、イットリウム（Ｙ）、アルミニウム（Ａｌ）及びユーロピウム（Ｅｕ）で構成された群から選択される２つ以上の金属イオンを添加した後、追加で培養して複合金属ナノ粒子を生成させる段階；及び（ｃ）上記生成された複合金属ナノ粒子を回収する段階を含む複合金属ナノ粒子の製造方法を提供する。
本発明はまた、（ａ）メタロチオネインをコードする遺伝子及びファイトケラチン合成酵素をコードする遺伝子が導入された組換え微生物を培養する段階：（ｂ）ｉ）亜鉛（Ｚｎ）、セレニウム（Ｓｅ）、テルル（Ｔｅ）、セシウム（Ｃｓ）、銅（Ｃｕ）、鉛（Ｐｂ）、ニッケル（Ｎｉ）、マンガン（Ｍｎ）、水銀（Ｈｇ）、コバルト（Ｃｏ），クロム（Ｃｒ）、カドミウム（Ｃｄ）、ストロンチウム（Ｓｒ）、鉄（Ｆｅ）、金（Ａｕ）、銀（Ａｇ）、プラセオジム（Ｐｒ）、ガドリニウム（Ｇｄ）、バリウム（Ｂａ）、ジルコニウム（Ｚｒ）、モリブデン（Ｍｏ）、インジウム（Ｉｎ）、すず（Ｓｎ）、ランタン（Ｌａ）、セリウム（Ｃｅ）、ネオジウム（Ｎｄ）、サマリウム（Ｓｍ）及びユーロピウム（Ｅｕ）で構成された群から選択される金属イオン；及びｉｉ）硫（Ｓ）を含む化合物を添加した後、追加で培養して金属硫化物のナノ粒子を生成させる段階；及び（ｃ）上記生成された金属硫化物のナノ粒子を回収する段階を含む金属硫化物のナノ粒子の製造方法を提供する。
本発明はまた、亜テルル酸銀（Ａｇ２ＴｅＯ３）のナノ粒子を含む造影剤を提供する。
本発明はまた、亜テルル酸銀（Ａｇ２ＴｅＯ３）のナノ粒子を含む電極を提供する。
図１は本発明による発現ベクターｐＹＪ−ＭＴの遺伝子地図である。 図２は本発明による発現ベクターｐＹＪ−ＰＣＳの遺伝子地図である。 図３は本発明による発現ベクターｐＹＪ−ＭＴ−ＰＣＴの遺伝子地図である。 図４はバリウム（Ｂａ）とジルコニウム（Ｚｒ）の非晶質ナノ粒子の電子顕微鏡写真とＸ線分光分析グラフである［ （ａとｂ）バリウム；（ｃとｄ）ジルコニウム；（ａとｃ）電子顕微鏡写真；（ｂとｄ）、Ｘ線分光分析グラフ]。 図５は遷移元素であるモリブデン（Ｍｏ）、インジウム（Ｉｎ）、すず（Ｓｎ）の結晶質ナノ粒子の電子顕微鏡写真及び分光分析グラフである［ （ａとｂ）モリブデン；（ｃとｄ）インジウム；（ｅとｆ）すず；（ａ，ｃ及びｅ）電子顕微鏡写真；（ｂ，ｄ及びｆ）、Ｘ線分光分析グラフ］。 図６はランタン族の元素であるランタン（Ｌａ）、セリウム（Ｃｅ）、プラセオジム（Ｐｒ）の非晶質ナノ粒子の電子顕微鏡写真及び分光分析グラフである［（ａとｂ）ランタン；（ｃとｄ）セリウム；（ｅとｆ）プラセオジム；（ａ，ｃ及びｅ）電子顕微鏡写真；（ｂ，ｄ及びｆ）、Ｘ線分光分析グラフ］。 図７はバリウム（Ｂａ）とジルコニウム（Ｚｒ）のナノ粒子のＦＴ−ＩＲスペクトルを示したものである ［（ａ）バリウム；（ｂ）ジルコニウム］。 図８はモリブデン（Ｍｏ）、インジウム（Ｉｎ）、すず（Ｓｎ）のナノ粒子のＦＴ−ＩＲスペクトルを示したものである ［（ａ）モリブデン；（ｂ）インジウム；（ｃ）すず］。 図９はランタン（Ｌａ）、セリウム（Ｃｅ）、プラセオジム（Ｐｒ）のナノ粒子のＦＴ−ＩＲスペクトルを示したものである ［（ａ）ランタン；（ｂ）セリウム；（ｃ）プラセオジム］。 図１０は組換え微生物を利用して合成された磁性の特性を有する金属結晶質のナノ粒子である酸化コバルト鉄（ＣｏＦｅ２Ｏ４） 、酸化ニッケル鉄（ＮｉＦｅ２Ｏ４）、酸化マンガン亜鉛 （ＺｎＭｎ２Ｏ４）、酸化鉄亜鉛（ＺｎＦｅ２Ｏ４）の電子顕微鏡写真とＸ線分光分析グラフを示したものである［（ａ）酸化コバルト鉄（ＣｏＦｅ２Ｏ４）の電子顕微鏡写真；（ｂ）酸化コバルト鉄（ＣｏＦｅ２Ｏ４）のＸ線分光分析グラフ；（ｃ）酸化ニッケル鉄（ＮｉＦｅ２Ｏ４）の電子顕微鏡写真；（ｄ）酸化ニッケル鉄（ＮｉＦｅ２Ｏ４）のＸ線分光分析グラフ；（ｅ）酸化マンガン亜鉛 （ＺｎＭｎ２Ｏ４）の電子顕微鏡写真；（ｆ）酸化マンガン亜鉛 （ＺｎＭｎ２Ｏ４）のＸ線分光分析グラフ；（ｇ）酸化鉄亜鉛（ＺｎＦｅ２Ｏ４）の電子顕微鏡写真；（ｈ）酸化鉄亜鉛（ＺｎＦｅ２Ｏ４）のＸ線分光分析グラフ］。 図１１は組換え微生物を利用して合成された磁性の特性を有する金属ナノ粒子である酸化コバルト鉄（ＣｏＦｅ２Ｏ４） 、酸化ニッケル鉄（ＮｉＦｅ２Ｏ４）、酸化マンガン亜鉛 （ＺｎＭｎ２Ｏ４）、酸化鉄亜鉛（ＺｎＦｅ２Ｏ４）のＸ線回折分析グラフを示したものである［（ａ）酸化コバルト鉄（ＣｏＦｅ２Ｏ４）；（ｂ）酸化ニッケル鉄（ＮｉＦｅ２Ｏ４）；（ｃ）酸化マンガン亜鉛 （ＺｎＭｎ２Ｏ４）；（ｄ）酸化鉄亜鉛（ＺｎＦｅ２Ｏ４）のＸ線回折分析グラフ］。 図１２は組換え微生物を利用して合成された磁性の特性を有する金属ナノ粒子の酸化コバルト鉄（ＣｏＦｅ２Ｏ４） 、酸化ニッケル鉄（ＮｉＦｅ２Ｏ４）、酸化マンガン亜鉛（ＺｎＭｎ２Ｏ４）、酸化鉄亜鉛（ＺｎＦｅ２Ｏ４）のＦＴ−ＩＲスペクトルを示したものである。 図１３は組換え微生物を利用して合成された磁性の特性を有する金属ナノ粒子の酸化コバルト鉄（ＣｏＦｅ２Ｏ４） 、酸化ニッケル鉄（ＮｉＦｅ２Ｏ４）、酸化マンガン亜鉛（ＺｎＭｎ２Ｏ４）、酸化鉄亜鉛（ＺｎＦｅ２Ｏ４）の磁気履歴曲線（Ｍ−Ｈ ｃｕｒｖｅ）を示したものである［（ａ）酸化コバルト鉄（ＣｏＦｅ２Ｏ４）；（ｂ）酸化ニッケル鉄（ＮｉＦｅ２Ｏ４）；（ｃ）酸化マンガン亜鉛 （ＺｎＭｎ２Ｏ４）；（ｄ）酸化鉄亜鉛（ＺｎＦｅ２Ｏ４）の磁気履歴曲線（Ｍ−Ｈ ｃｕｒｖｅ）グラフ］。 図１４は組換え微生物を利用して製造された亜テルル酸銀（Ａｇ２ＴｅＯ３）の結晶ナノ粒子の透過電子顕微鏡写真（ａ）及びＸ線回折分析グラフ（ｂ）を示したものである。 図１５は組換え微生物を利用して製造された多様な大きさを有する亜テルル酸銀（Ａｇ２ＴｅＯ３）のナノ粒子の透過電子顕微鏡写真（ａ）、（ｂ）及び金属イオン濃度とナノ粒子の大きさの相関関係を示したグラフ（ｃ）、Ｘ線回折分析グラフ（ｄ）を示したものである。 図１６は組換え微生物を利用して亜テルル酸銀（Ａｇ２ＴｅＯ３）のナノ粒子の表面官能基を示すＦＴ−ＩＲグラフを示したものである。 図１７は組換え微生物を利用して製造された亜テルル酸銀（Ａｇ２ＴｅＯ３）のナノ粒子の磁性特性を示す磁気履歴曲線（Ｍ−Ｈ ｃｕｒｖｅ）のグラフを示す。 図１８は組換え微生物を利用して製造された亜テルル酸銀（Ａｇ２ＴｅＯ３）のナノ粒子の電気化学的特性を示すＣＶ曲線（Ｃｙｃｌｉｃ ｖｏｌｔａｍｍｏｇｒａｍｓ）を示す。 図１９は金属硫化物である硫化銀（Ａｇ２Ｓ）、硫化インジウム（ＩｎＳ）、硫化マンガン（ＭｎＳ）、硫化すず（ＳｎＳ）の結晶ナノ粒子の電子顕微鏡写真及び分光分析グラフである［（ａとｂ）硫化銀；（ｃとｄ）硫化インジウム；（ｅとｆ）硫化マンガン；（ｇとｈ）硫化すず；（ａ，ｃ，ｅ及びｇ）電子顕微鏡写真；（ｂ，ｄ，ｆ及びｈ）分光分析グラフ］。 図２０は硫化銀（Ａｇ２Ｓ）、硫化インジウム（ＩｎＳ）、硫化マンガン（ＭｎＳ）、硫化すず（ＳｎＳ）のナノ粒子の官能基を示すＦＴ−ＩＲスペクトルを示したものである［（ａ）硫化銀；（ｂ）硫化インジウム；（ｃ）硫化マンガン；（ｄ）硫化すず］。 図２１は組換え微生物を利用してＣｏ、Ｎｉ、Ｚｎ、Ｃｄイオンを含む培地内のｐＨを増加させなく、金属ナノ粒子を合成した場合（ａ，ｃ，ｅ，ｇ）及びＣｏ、 Ｎｉ、Ｚｎ、Ｃｄイオンを含む培地内のｐＨを増加させた後、金属ナノ粒子を合成した場合（ｂ，ｄ，ｆ，ｈ）の形態を示したものである。 図２２は培地内のｐＨの増加によって、組換え微生物を利用して合成された金属ナノ粒子のＸ線回折分析グラフを示したものである。 図２３は組換え微生物を利用してＬａ、Ｃｅ、Ｐｒ、Ｎｄ、Ｓｍ、Ｅｕ、Ｇｄイオンを含む培地内のｐＨを増加させないことで、非晶質の金属ナノ粒子で合成された形態（ａ，ｃ，ｅ，ｇ，ｉ，ｋ，ｍ）；Ｌａ、Ｃｅ、Ｐｒ、Ｎｄ、Ｓｍ、Ｅｕ、Ｇｄイオンを含む培地内のｐＨを増加させた後、結晶性を有する金属ナノ粒子で合成された形態（ｂ，ｄ，ｆ，ｈ，ｊ，ｌ，ｎ）を示したものである。 図２４は培地内のｐＨの増加によって、組換え微生物を利用して合成された結晶質の金属ナノ粒子のＸ線回折分析グラフを示したものである。
他の方式で定義されない限り、本明細書で使用されたあらゆる技術的及び科学的用語は、本発明が属する技術分野で熟練された専門家によって通常的に理解されるものと同一な意味を有する。一般的に本明細書で使用された命名法は、本技術分野において周知であり、通常的に使用されるものである。
本発明では、生物学的方法を利用して多様な金属ナノ粒子を合成しようと、二つの重金属の吸着タンパク質であるメタロチオネインとファイトケラチン合成酵素を同時に発現する組換え微生物を多様な金属元素が添加された培地で培養して単一金属ナノ粒子が合成されることを確認した。
本発明の一実施例では組換え微生物を培養した後、それぞれバリウム（Ｂａ）、ジルコニウム（Ｚｒ）、モリブデン（Ｍｏ）、インジウム（Ｉｎ）、すず（Ｓｎ）、ランタン（Ｌａ）、セリウム（Ｃｅ）またはプラセオジム（Ｐｒ）などの単一金属イオンを添加して追加培養する場合、非晶質の単一金属ナノ粒子が合成されることを確認することができた。一方、上記の組換え微生物はコバルト（Ｃｏ）、ニッケル（Ｎｉ）、亜鉛（Ｚｎ）またはカドミウム（Ｃｄ）イオンを添加して培養する場合、単一の金属ナノ粒子を合成しないことが確認されたが、上記金属イオンを添加してｐＨを上向調整した後培養する場合、それぞれ酸化コバルト（Ｃｏ３Ｏ４）、水酸化ニッケル（Ｎｉ（ＯＨ）２）、過酸化亜鉛（ＺｎＯ）、水酸化カドミウム（Ｃｄ（ＯＨ）２）の結晶質金属ナノ粒子が生成されることを確認することができた。また、上記組換え微生物はランタン（Ｌａ）、セリウム（Ｃｅ）、プラセオジム（Ｐｒ）、ネオジウム（Ｎｄ）、サマリウム（Ｓｍ）、ユーロピウム（Ｅｕ）またはガドリニウム（Ｇｄ）イオンを添加して培養する場合、非晶質の単一金属ナノ粒子を合成したが、上記金属イオンを添加してｐＨを上向調整した後培養する場合、それぞれ結晶質の水酸化ランタン（Ｌａ（ＯＨ）３）、酸化セリウム（ＣｅＯ２）、水酸化プラセオジム（Ｐｒ（ＯＨ）３）、水酸化ネオジウム（Ｎｄ（ＯＨ）３）、水酸化サマリウム （Ｓｍ（ＯＨ）３）、水酸化ユーロピウム（Ｅｕ（ＯＨ）３）または水酸化ガドリニウム （Ｇｄ（ＯＨ）３）の単一金属ナノ粒子が生成されることが確認された。
したがって、本発明は第１観点で、（ａ）メタロチオネインをコードする遺伝子及びファイトケラチン合成酵素をコードする遺伝子が導入された組換え微生物を培養する段階：（ｂ）亜鉛（Ｚｎ）、セレニウム（Ｓｅ）、テルル（Ｔｅ）、セシウム（Ｃｓ）、銅（Ｃｕ）、鉛（Ｐｂ）、ニッケル（Ｎｉ）、マンガン（Ｍｎ）、水銀（Ｈｇ）、コバルト（Ｃｏ）、クロム（Ｃｒ）、カドミウム（Ｃｄ）、ストロンチウム（Ｓｒ）、鉄（Ｆｅ）、金（Ａｕ）、銀（Ａｇ）、プラセオジム（Ｐｒ）、ガドリニウム（Ｇｄ）、バリウム（Ｂａ）、ジルコニウム（Ｚｒ）、モリブデン（Ｍｏ）、インジウム（Ｉｎ）、すず（Ｓｎ）、ランタン（Ｌａ）、セリウム（Ｃｅ）、ネオジウム（Ｎｄ）、サマリウム（Ｓｍ）、イットリウム（Ｙ）、アルミニウム（Ａｌ）及びユーロピウム（Ｅｕ）で構成された群から選択される金属イオンを添加した後、追加で培養して単一金属ナノ粒子を生成させる段階；及び（ｃ）上記生成された単一金属ナノ粒子を回収する段階を含む単一金属ナノ粒子の製造方法に関するものである。
本発明において、上記添加された金属イオンは亜鉛（Ｚｎ）、セレニウム（Ｓｅ）、テルル（Ｔｅ）、セシウム（Ｃｓ）、銅（Ｃｕ）、鉛（Ｐｂ）、ニッケル（Ｎｉ）、マンガン（Ｍｎ）、水銀（Ｈｇ）、コバルト（Ｃｏ）、クロム（Ｃｒ）、カドミウム（Ｃｄ）、ストロンチウム（Ｓｒ）、鉄（Ｆｅ）、金（Ａｕ）、銀（Ａｇ）、プラセオジム（Ｐｒ）、ガドリニウム（Ｇｄ）、バリウム（Ｂａ）、ジルコニウム（Ｚｒ）、モリブデン（Ｍｏ）、インジウム（Ｉｎ）、すず（Ｓｎ）、ランタン（Ｌａ）、セリウム（Ｃｅ）、ネオジウム（Ｎｄ）、サマリウム（Ｓｍ）、イットリウム（Ｙ）、アルミニウム（Ａｌ）及びユーロピウム（Ｅｕ）で構成された群から選択されることができるが、これに限定されることではない。
本発明において、上記生成された金属ナノ粒子は酸化コバルト（Ｃｏ３Ｏ４）、水酸化ニッケル（Ｎｉ（ＯＨ）２）、過酸化亜鉛（ＺｎＯ）、水酸化カドミウム（Ｃｄ（ＯＨ）２）、水酸化コバルト（Ｃｏ（ＯＨ）２）、炭酸バリウム（ＢａＣＯ３）、水酸化ランタン（Ｌａ（ＯＨ）３）、酸化セリウム（ＣｅＯ２）、水酸化プラセオジム（Ｐｒ（ＯＨ）３）、水酸化ネオジウム（Ｎｄ（ＯＨ）３）、水酸化サマリウム（Ｓｍ（ＯＨ）３）、水酸化ユーロピウム（Ｅｕ（ＯＨ）３）、水酸化セリウム（Ｃｅ（ＯＨ）３）、水酸化イットリウム（Ｙ（ＯＨ）３）、水酸化アルミニウム（Ａｌ（ＯＨ）３）及び水酸化ガドリニウム（Ｇｄ（ＯＨ）３）で構成された群から選択されることができるが、これに限定されることではない。
本発明で上記単一金属ナノ粒子の表面官能基は、赤外線分光器４００〜４０００ cm−１の範囲で、３３００〜３０００cm−１（ＯＨ ｇｒｏｕｐｓ）、２９６０−２８５０cm-1（Ｃ−Ｈ）、１６５０〜１６６０cm-1（ａｍｉｄｅ Ｉ）、１５４０〜１５３５cm-1（ａｍｉｄｅ ＩＩ）、１２４０〜１２３４cm-1（ａｍｉｄｅ ＩＩＩ）及び１１５０〜１０３０cm-1（Ｃ＝Ｏ）で構成されていることを確認することができた。
本発明では上記（ｂ）段階の初期ｐＨを７．３〜７．７に調整した後培養する場合、培養時間が経過することによってｐＨが８．０〜９．０へ上昇するようになり、金属ナノ粒子が最大効率で生成されることを確認することができた。また、金属ナノ粒子が最大効率で生成される際の培地のポテンション（Ｅｈ）は−０．５Ｖ〜＋０．５Ｖであることを確認することができた。
したがって、本発明において、（ｂ）段階培地のｐＨは組換え微生物を追加で培養して単一金属ナノ粒子を生成する最適のｐＨである８．０ないし９．０に到達されるように上向調整することを特徴とすることができる。
このために、（ｂ）段階培地の培養前の初期ｐＨを７．３ないし７．７に上向調節することが好ましく、７．４〜７．６に上向調節することがより好ましい。
本発明において、（ａ）段階の培地は培養前の初期ｐＨが６ないし７、好ましくは６．４〜６．６であることを特徴とすることができる。
このように、微生物の培養段階と金属ナノ粒子の生成段階のｐＨを調節することにより、既存に合成が難しかった金属ナノ粒子の合成が可能であるが、ｐＨの上向調節によって合成が可能な金属ナノ粒子は酸化コバルト（Ｃａ３Ｏ４）、水酸化ニッケル（Ｎｉ（ＯＨ）２）、過酸化亜鉛（ＺｎＯ）及び水酸化カドミウム（Ｃｄ（ＯＨ）２）で構成された群から選択されることができるが、これに限定されることではない。
また、 酸化コバルト（Ｃａ３Ｏ４）、水酸化ニッケル（Ｎｉ（ＯＨ）２）、過酸化亜鉛（ＺｎＯ）、水酸化カドミウム（Ｃｄ（ＯＨ）２）、水酸化ランタン（Ｌａ（ＯＨ）３）、 酸化セリウム（ＣｅＯ２）、 水酸化プラセオジム（Ｐｒ（ＯＨ）３）、 水酸化ネオジウム（Ｎｄ（ＯＨ）３）、水酸化サマリウム （Ｓｍ（ＯＨ）３）、水酸化ユーロピウム （Ｅｕ（ＯＨ）３）及び水酸化ガドリニウム（Ｇｄ（ＯＨ）３）の単一金属ナノ粒子はｐＨを調節しない場合には非晶質であったが、ｐＨを上向調節することによって結晶質のナノ粒子が生成された。
本発明の他の実施例では上記組換え微生物を培養した後、それぞれｉ）コバルトと鉄を添加した培地（Ｃｏ，ＣｏＣｌ２，０．５ｍＭ，Ｆｅ，Ｆｅ（ＮＯ）３・６Ｈ２Ｏ，０．５ｍＭ）では酸化コバルト鉄（ＣｏＦｅ２Ｏ４） 、ｉｉ）ニッケルと鉄を添加した培地（Ｎｉ，ＮｉＣｌ２・６Ｈ２Ｏ ，０．５ｍＭ，Ｆｅ， Ｆｅ（ＮＯ）３・６Ｈ２Ｏ，０．５ｍＭ）では酸化ニッケル鉄（ＮｉＦｅ２Ｏ４）、ｉｉｉ）亜鉛とマンガンを添加した培地（Ｚｎ，ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ，０．５ｍＭ，ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ）では酸化マンガン亜鉛（ＺｎＭｎ２Ｏ４）、ｉＶ）亜鉛と鉄（Ｚｎ，ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ，０．５ｍＭ，Ｆｅ，Ｆｅ（ＮＯ）３ ・６Ｈ２Ｏ，０．５ｍＭ）イオンを添加した培地では酸化鉄亜鉛（ＺｎＦｅ２Ｏ４）、ｖ）銀（Ａｇ，ＡｇＮＯ３，０．２５，０．５ｍＭ）とテルル（Ｔｅ，ＮａＴｅＯ３，０．２５，０．５ｍＭ）イオンを添加した培地では亜テルル酸銀（Ａｇ２ＴｅＯ３）の複合金属ナノ粒子が合成されることを確認した。
したがって、本発明は第２観点で、（ａ）メタロチオネインをコードする遺伝子及びファイトケラチン合成酵素をコードする遺伝子が導入された組換え微生物を培養する段階；（ｂ）亜鉛（Ｚｎ）、セレニウム（Ｓｅ）、テルル（Ｔｅ）、セシウム（Ｃｓ）、銅（Ｃｕ）、鉛（Ｐｂ）、ニッケル（Ｎｉ）、マンガン（Ｍｎ）、水銀（Ｈｇ）、コバルト（Ｃｏ）、クロム（Ｃｒ）、カドミウム（Ｃｄ）、ストロンチウム（Ｓｒ）、鉄（Ｆｅ）、金（Ａｕ）、銀（Ａｇ）、プラセオジム（Ｐｒ）、ガドリニウム（Ｇｄ）、バリウム（Ｂａ）、ジルコニウム（Ｚｒ）、モリブデン（Ｍｏ）、インジウム（Ｉｎ）、すず（Ｓｎ）、ランタン（Ｌａ）、セリウム（Ｃｅ）、ネオジウム（Ｎｄ）、サマリウム（Ｓｍ）、イットリウム（Ｙ）、アルミニウム（Ａｌ）及びユーロピウム（Ｅｕ）で構成された群から選択される二つ以上の金属イオンを添加した後、追加で培養して複合金属ナノ粒子を生成させる段階；及び（ｃ）上記生成された複合金属ナノ粒子を回収する段階を含む複合金属ナノ粒子の製造方法に関するものである。
本発明において、上記添加された金属イオンは亜鉛（Ｚｎ）、セレニウム（Ｓｅ）、テルル（Ｔｅ）、セシウム（Ｃｓ）、銅（Ｃｕ）、鉛（Ｐｂ）、ニッケル（Ｎｉ）、マンガン（Ｍｎ）、水銀（Ｈｇ）、コバルト（Ｃｏ）、クロム（Ｃｒ）、カドミウム（Ｃｄ）、ストロンチウム（Ｓｒ）、鉄（Ｆｅ）、金（Ａｕ）、銀（Ａｇ）、プラセオジム（Ｐｒ）、ガドリニウム（Ｇｄ）、バリウム（Ｂａ）、ジルコニウム（Ｚｒ）、モリブデン（Ｍｏ）、インジウム（Ｉｎ）、すず（Ｓｎ）、ランタン（Ｌａ）、セリウム（Ｃｅ）、ネオジウム（Ｎｄ）、サマリウム（Ｓｍ）、イットリウム（Ｙ）、アルミニウム（Ａｌ）及びユーロピウム（Ｅｕ）で構成された群から選択される二つ以上の金属イオンであることができるが、これに限定されることではない。
本発明において、上記方法によって生成された複合金属ナノ粒子は酸化マンガン亜鉛 （ＺｎＭｎ２Ｏ４）、酸化鉄亜鉛（ＺｎＦｅ２Ｏ４）、酸化ニッケル鉄（ＮｉＦｅ２Ｏ４）、酸化コバルト鉄（ＣｏＦｅ２Ｏ４） 、セレン化カドミウム（ＣｄＳｅ）、亜鉛カドミウム（ＣｄＺｎ）、テルル化カドミウム（ＣｄＴｅ）、亜鉛セレニド（ＳｅＺｎ）、カドミウムセレニド亜鉛（ＣｄＳｅＺｎ）、ストロンチウムガドリニウムス（ＳｒＧｄ）、プラセオジムガドリニウム（ＰｒＧｄ）、カドミウムセシウム（ＣｄＣｓ）、コバルト鉄（ＦｅＣｏ）、コバルト鉄ニッケル化合物（ＦｅＣｏＮｉ）及び亜テルル酸銀（Ａｇ２ＴｅＯ３）で構成されていることを確認することができた。
本発明で、上記の複合金属ナノ粒子の表面官能基は、赤外線分光器４００〜４０００cm-1の範囲で、３３００〜３０００cm-1（Ｏ−Ｈ）、２９６０〜２８５０cm-1（Ｃ−Ｈ）、１６５０〜１６６０cm-1（ａｍｉｄｅ Ｉ）、１５４０〜１５３５cm-1（ａｍｉｄｅ ＩＩ）、１２４０〜１２３４cm-1（ａｍｉｄｅ ＩＩＩ）及び１１５０〜１０３０cm-1（Ｃ＝Ｏ）で構成されていることを確認することができた。
上記方法によって合成された金属ナノ粒子の中、酸化コバルト鉄（ＣｏＦｅ２Ｏ４）の ナノ粒子の場合、強磁性を示す物質であり、酸化ニッケル鉄（ＮｉＦｅ２Ｏ４）、酸化マンガン亜鉛（ＺｎＭｎ２Ｏ４）、酸化鉄亜鉛（ＺｎＦｅ２Ｏ４）のナノ粒子の場合、常磁性物質であることを確認することができた。
特に、本発明の第２観点で、銀（Ａｇ）とテルル（Ｔｅ）を同時に添加する場合、亜テルル酸銀（Ａｇ２ＴｅＯ３）のナノ粒子が合成されており、上記亜テルル酸銀（Ａｇ２ＴｅＯ３）のナノ粒子の表面官能基は３３００〜３０００cm-1（Ｏ−Ｈ）、２９６０〜２８５０cm-1（Ｃ−Ｈ）、１６５０〜１６６０cm-1（ａｍｉｄｅ Ｉ）、１５４０〜１５３５cm-1（ａｍｉｄｅ ＩＩ）、１２４０〜１２３４cm-1（ａｍｉｄｅ ＩＩＩ）、１１５０〜１０３０cm-1（Ｃ＝Ｏ）で構成されていることを確認することができた。
したがって、本発明は第３観点で、メタロチオネインとファイトケラチン合成酵素を同時に発現する組換え微生物を利用して合成された亜テルル酸銀（Ａｇ２ＴｅＯ３）のナノ粒子の新規な用途に関するものである。
亜テルル酸銀（Ａｇ２ＴｅＯ３）のナノ粒子は反磁性体を示すところ、造影剤で使用されることができて、上記の造影剤は光学映像、磁気共鳴映像、精密核医学映像及び超音波映像で構成された群から選択される映像に使用されることができるが、これに限定されていない。
併せて、亜テルル酸銀（Ａｇ２ＴｅＯ３）のナノ粒子は走査速度によって他のＣＶ ｃｕｒｖｅを示し、陰極（Ａｎｏｄｅ）で０．３０Ｖ及び０．４０Ｖ近くでピークと陽極（Ｃａｔｈｏｄｅ）で−０．５０Ｖ、−０．２０Ｖ付近でピークを現す電気化学的特性を示すところ、電極の構成成分で使用されることができて、上記電極はリチウムイオン電池、燃料電池、太陽電池、水素電池及び二次電池で構成された群から選択される電池に使用されることができるが、これに限定されことではない。例えば、本発明の金属ナノ粒子は、リチウムイオン電池、特にリチウムイオン２次電池のためのアノードに使用されることができて、また本発明による電気活性物質を含むリチウムイオン電池、特にリチウムイオン２次電池のためのアノードに使用されることができる。
本発明による亜テルル酸銀（Ａｇ２ＴｅＯ３）のナノ粒子はバイオセンサーの構成成分及び半導体素子で使用されることができる。
このほかにも、本発明は合成された金属ナノ粒子が内在的に有している特性または活性を利用し、多様な用途に活用することができて、例えば、電極活性化の用途、グルコース酸化用触媒、一酸化炭素の酸化用触媒、炭素化合物の酸化用触媒、ｐｙｒａｎｏ［２，３−ｄ］ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅｓ合成用触媒、コバルト化合物の合成用触媒、鉄化合物の合成用触媒、蓄電池用の造成物、バッテリー用の造成物、リチウム二次電池用の造成物、光電子素子、半導体素子、発光ダイオード、磁気冷却素子、薬物伝達用の担体、放射線治療増強剤、ＭＲＩ造影剤、医療診断用の造成物、高密度磁性記録媒体用の造成物、電磁波吸収剤用の造成物、抗菌用の造成物、口腔疾患の治療／予防用の造成物、赤外線検出用の造成物、Ｘ線検出用の造成物、ガンマ線検出用の造成物、磁性冷媒用の造成物、永久磁石用の原料、バイオセンサー、グラフェンチューブ用の造成物、食品添加剤用の造成物、タバコフィルター用の造成物、塗料顔料用の造成物、ペンキ乾燥剤用の造成物、陶磁器の着色剤用の造成物などに活用が可能であるが、これに限定されることではない。
また、本発明の金属ナノ粒子は微生物の発生及び増殖が抑制されなければならない任意の分野に使用されることができて、具体的に医療機器、欄干、ドアのとって、携帯電話、キーボードなどに有利に利用される。また、本発明は、皮膚、粘膜及び毛髪の脱臭のような消毒及び一般的な抗菌処理に、好ましくは手及び傷の消毒に有用で、個人及び家事用の管理用途のための、または産業及び病院の応用のための多様な製品形態または造成物に、抗菌剤として使用されることができて、このような用途は次を非制限的に含む。肌及び毛髪管理のための化粧品の造成物、例えば、ローション；クリーム；オイル；ゲル；パウダー；ワイプ；スプレー、ステッキ及びロールオン（ｒｏｌｌ−ｏｎ）のような脱臭剤；シャワーゲルのような洗浄剤；入浴添加剤；液体及び固形石鹸（合成界面活性剤及び飽和及び／又は不飽和脂肪酸の塩を基材でする)；水性及び/又はアルコール性溶液、例えば、皮膚用洗浄液；保湿洗浄用布；手消毒剤；シャンプー；リンスなど；たとえばゲル、ペースト、クリーム又は水性製剤（口腔洗浄剤）形態の口腔衛生の造成物；軽質表面洗浄剤、例えば、消毒用スプレー、液体または粉末；食器用または洗濯用洗剤（液体または固体）、床用ワックス、ガラス洗浄剤など；及び産業及び病院用の応用（例、機器、医療機器、手袋の殺菌；コンタクトレンズ、コンタクトレンズのケース、コンタクトレンズの保管液、コンタクトレンズの洗浄液）。
本発明の他の実施例では上記組換え微生物を利用して銀（Ａｇ，ＡｇＮＯ３，０．５ｍＭ）、インジウム（Ｉｎ、ＩｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ，０．５ｍＭ）、マンガン（Ｍｎ，ＭｎＳＯ４・５Ｈ２Ｏ，０．５ｍＭ）またはすず（Ｓｎ，ＳｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ，０．５ｍＭ）と共に硫（Ｓ，Ｎａ２Ｓ，１ｍＭ）を添加して１２時間の間、追加で培養した結果、それぞれ硫化銀、硫化インジウム、硫化マンガンまたは硫化すずのナノ粒子が生成されることを確認した。
したがって、本発明は第４の観点で、（ａ）メタロチオネインをコードする遺伝子及びファイトケラチン合成酵素をコードする遺伝子が導入された組換え微生物を培養する段階：（ｂ）ｉ）亜鉛（Ｚｎ）、セレニウム（Ｓｅ）、テルル（Ｔｅ）、セシウム（Ｃｓ）、銅（Ｃｕ）、鉛（Ｐｂ）、ニッケル（Ｎｉ）、マンガン（Ｍｎ）、水銀（Ｈｇ）、コバルト（Ｃｏ）、クロム（Ｃｒ）、カドミウム（Ｃｄ）、ストロンチウム（Ｓｒ）、鉄（Ｆｅ）、金（Ａｕ）、銀（Ａｇ）、プラセオジム（Ｐｒ）、ガドリニウム（Ｇｄ）、バリウム（Ｂａ）、ジルコニウム（Ｚｒ）、モリブデン（Ｍｏ）、インジウム（Ｉｎ）、すず（Ｓｎ）、ランタン（Ｌａ）、セリウム（Ｃｅ）、ネオジウム（Ｎｄ）、サマリウム（Ｓｍ）及びユーロピウム（Ｅｕ）で構成された群から選択される金属イオン；及びｉｉ）硫（Ｓ）を添加した後、追加で培養して金属硫化物のナノ粒子を生成させる段階；及び（ｃ）上記生成された金属硫化物のナノ粒子を回収する段階を含む金属硫化物のナノ粒子の製造方法を提供する。
本発明において、上記添加された金属イオンは亜鉛（Ｚｎ）、セレニウム（Ｓｅ）、テルル（Ｔｅ）、セシウム（Ｃｓ）、銅（Ｃｕ）、鉛（Ｐｂ）、ニッケル（Ｎｉ）、マンガン（Ｍｎ）、水銀（Ｈｇ）、コバルト（Ｃｏ）、クロム（Ｃｒ）、カドミウム（Ｃｄ）、ストロンチウム（Ｓｒ）、鉄（Ｆｅ）、金（Ａｕ）、銀（Ａｇ）、プラセオジム（Ｐｒ）、ガドリニウム（Ｇｄ）、バリウム（Ｂａ）、ジルコニウム（Ｚｒ）、モリブデン（Ｍｏ）、インジウム（Ｉｎ）、すず（Ｓｎ）、ランタン（Ｌａ）、セリウム（Ｃｅ）、ネオジウム（Ｎｄ）、サマリウム（Ｓｍ）及びユーロピウム（Ｅｕ）で構成された群から選択されることができるが、これに限定されることではい。
本発明において、上記生成された金属硫化物のナノ粒子は硫化銀（Ａｇ２Ｓ）、硫化インジウム（ＩｎＳ）、硫化マンガン（ＭｎＳ）、硫化亜鉛（ＺｎＳ）、硫化銅（ＣｕＳ）、硫化カドミウム（ＣｄＳ）、 硫化金（ＡｕＳ）、硫化ニッケル（ＮｉＳ）、硫化コバルト(（ＣｏＳ）、硫化水銀（ＨｇＳ）及び硫化すず（ＳｎＳ）で構成された群から選択されることができるが、これに限定されることではない。
本発明において、上記金属硫化物のナノ粒子の表面官能基は、赤外線分光器４００〜４０００cm−１の範囲で３３００〜３０００cm−１（Ｏ−Ｈ）、２９６０〜２８５０cm−１（Ｃ−Ｈ）、１６５０〜１６６０cm−１（ａｍｉｄｅ Ｉ）、１５４０〜１５３５cm−１（ａｍｉｄｅ ＩＩ）、１２４０〜１２３４cm−１（ａｍｉｄｅ ＩＩＩ）、１１５０〜１０３０cm−１（Ｃ＝Ｏ）で構成されていることを確認することができた。
本発明の第１、２、４観点において、上記の微生物はバクテリア、酵母、藻類、古細菌及びカビで構成された群から選択されることができるが、これに限定されることではない。
本発明の第１、２、４観点において、上記メタロチオネインをコードする遺伝子は配列番号１で表示されて、上記ファイトケラチン合成酵素をコードする遺伝子は配列番号２で表示されることができるが、これに限定されることではない。
本発明で、組換え微生物内で生成された金属ナノ粒子は微生物を破砕して、フィルターで細胞沈殿物を取り除いて、濾過された溶液から回収することができる。一つの様態で、微生物の培養液を４℃、３５００ｒｐｍで１５分間、遠心分離した後上層液を捨てて、微生物ペレットを収集した後、ＰＢＳのバッファーで洗浄する過程を三回繰り返した後、細胞の懸濁液をチタンプローブ（４０Ｔ，Ｓｏｎｉｃｓ ａｎｄ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）が装着された超音波粉砕機（ＶＣＸ−６００，Ｓｏｎｉｃｓ ａｎｄ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）を利用して（３秒ｏｎ，３秒ｏｆｆ）粉砕して、８μm ｐｏｒｅ ｓｉｚｅセルロースフィルターと０．１μm ｐｏｒｅ ｓｉｚｅメンブレンフィルター（Ｗｈａｔｍａｎ）を順番に利用して細胞沈殿物を取り除いた後、濾過された溶液のナノ粒子を回収して使用することができる。しかしながら、この他にも細胞内または細胞培養液でナノ粒子を回収するために当業界に知られた方法はすべて応用して使用することができる。
本発明の実施例には特定の培地と培養方法を例示したが、文献に報告されたことのように他の培地を使用した場合も当業界で通常の知識を有した者にとって自明である。
本発明の実施例では大腸菌を微生物に利用したが、他のバクテリア、酵母及びカビを使用できるということも当業者に自明である。また、実施例には導入対象遺伝子で特定菌株由来の遺伝子のみを例示したが、導入される宿主細胞で発現され、同一な活性を示す限り、その制限がないということは当業者に自明である。
本発明で、金属イオンの濃度は５ｍＭ〜０．０１ｍＭであることができて、より好ましくには３ｍＭ〜０．１ｍＭ、より好ましくには２〜０．５ｍＭであることができる。金属イオンの濃度が５ｍＭを超過する場合、既存の文献報告と共に細胞に対する毒性が高くなって、細胞の成長が阻害されることができる（Ｘｉｕ ＺＭ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｎｏ Ｌｅｔｔ．，１２（８）：４２７１−４２７５，２０１２；Ｎｉｅｓ ＤＨ，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，５１（６）：７３０−７５０，１９９９）。一方、金属イオンの濃度を調節して金属ナノ粒子の大きさを調節することができる。
本発明で、金属元素として水溶性金属化合物が使用される。例えば、水溶性金属塩、水溶性金属酸化物塩またはこれらの組合が使用されることができる。
本発明で、用語「プラスミド」は適合した宿主内でＤＮＡを発現させることができる適した調節配列に作動可能に連結されたＤＮＡ配列を含有するＤＮＡ製造物を意味する。 プラスミドはベクター、ファージ粒子、または簡単に潜在的ゲノム挿入物であることができる。適当な宿主で形質転換されると、プラスミドは宿主ゲノムと無関係に複製して機能することができるか、または一部の場合に、ゲノムそのものに統合されることができる。 プラスミドが現在ベクターの最も通常的に使われる形態であるので、本発明の明細書で「プラスミッド（ｐｌａｓｍｉｄ）」及び「ベクター（ｖｅｃｔｏｒ）」は、時には相互交換的に使用される。しかしながら、本発明は当業界に知られて、または知られるようになることと同等の機能を有するベクターの異なる形態を含む。
本発明で、用語「組換え微生物」は遺伝子組み換え技術を利用して、ある生物体の有用な遺伝子を他の微生物に導入したり、宿主微生物の遺伝子の一部を欠失させたり、発現量を調節するなど、特定な目的に合うように遺伝子の一部を変形させて作った微生物をいう。 上記用語は、「遺伝子変形微生物」、「組換え菌株」などの用語に代替して使用することができるということは当業者に自明である。上記の微生物には藻類（ａｌｇａｅ）、細菌類（ｂａｃｔｅｒｉａ）、原生動物類（ｐｒｏｔｏｚｏａ）、糸状菌類（ｆｕｎｇｉ）、酵母類（ｙｅａｓｔ）などが含まれることができて、好ましくバクテリア、酵母及びカビで構成された群から選択されることができ、より好ましく大腸菌を選択することができる。
本発明で用語「結晶質（ｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｅ）」はどのような固体が反復的原子配列状態である結晶を成している状態を意味する。
本発明で用語「非結晶質（ａｍｏｒｐｈｏｕｓ）」はどのような固体が反復的原子配列状態である結晶を成していない状態、つまり非晶質状態を意味する。
本発明で用語「ナノ粒子」は、ナノ単位の直径を有する粒子を意味する。
［実施例］
以下、実施例を通じて本発明をより詳細に説明する。これらの実施例には単に本発明を例示するためのもので、本発明の範囲がこれらの実施例により制限されることと解釈されないことは当業界において通常の知識を有する者にとって自明である。したがって、本発明の実質的な範囲は添付された請求項とそれらの等価物によって定義されるということである。
実施例１．二つの重金属の吸着タンパク質であるメタロチオネインとファイトケラチン合成酵素を同時に発現する発現ベクターの製作
１−１：メタロチオネイン発現ベクターの製作
シュードモナス プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）ＫＴ２４４０の染色体ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ）を鋳型として、配列番号３と４のプライマーにポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を随行して、メタロチオネイン （ｍｅｔａｌｌｏｔｈｉｏｎｅｎｉｎ，ＭＴ）の塩基配列をコードするＭＴ遺伝子の切片を製作した。
［配列番号３］：５’−ＡＴＡＧＡＡＴＴＣＡＴＧＡＡＣＧＡＴＣＡＣＣＡＣＣＡＣＣＡＣＡＡ−３’
［配列番号４］：５’−ＴＡＴＣＴＧＣＡＧＴＴＡＧＧＧＣＧＡＧＡＴＣＧＧＡＴＣＡＣＴＣ−３’
次に、上記の製造されたメタロチオネイン切片をアガロースゲル電気泳動法で、２４３ ｂｐのメタロチオネイン遺伝子の切片を分離して、これを二つの制限酵素ＥｃｏＲＩとＰｓｔＩで切断した。これと同時に誘導可能で、ｔａｃ ｐｒｏｍｏｔｏｒを含むｐＴａｃ１５Ｋプラスミドを二つの制限酵素ＥｃｏＲＩとＰｓｔＩで切断した後、これを上記ＭＴ切片と混合して、Ｔ４ ＤＮＡ ｌｉｇａｓｅで連結して、熱ショック（ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ）の方法を利用して大腸菌ＤＨ５αに形質転換させた。上記の形質転換菌株はカナマイシン（ｋａｎａｍｙｃｉｎ，１００ｇ／Ｌ）抗生剤の含まれたＬＢ培地で選別して、これからｐＹＪ−ＭＴ組換えプラスミドを製作した（図１）。
１−２：ファイトケラチン合成酵素の発現ベクターの製作
シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉｎａｎａ）のファイトケラチン合成酵素（ｐｈｙｔｏｃｈｅｌａｔｉｎ ｓｙｎｔｈａｓｅ，ＰＣＳ）を確保するために、シロイヌナズナの相補的染色体（ｃＤＮＡ）を鋳型として、ファイトケラチン合成酵素の塩基配列をコードするファイトケラチン合成酵素の遺伝子切片を製作した。上記ポリメラーゼ連鎖反応は下記配列番号５と６のプライマーを利用して遂行した。
［配列番号５］：５’− ＡＴＡＧＡＡＴＴＣＡＴＧＧＣＴＡＴＧＧＣＧＡＧＴＴＴＡＴＡＴＣＧＧ −３’
［配列番号６］：５’− ＴＡＴＧＣＡＴＧＣＴＴＡＡＴＡＧＧＣＡＧＧＡＧＣＡＧＣＧＡＧＡＴＣ −３’
次に、上記の製造されたファイトケラチン合成酵素切片をアガロースゲル電気泳動法で、１４５８ｂｐのファイトケラチン合成酵素の遺伝子切片を分離して、これを二つの制限酵素ＥｃｏＲＩとＳｐｈＩで切断した。これと同時に誘導可能で、ｔａｃ ｐｒｏｍｏｔｏｒを含むｐＴａｃ１５Ｋプラスミドを二つの制限酵素ＥｃｏＲＩとＳｐｈＩで切断した後、これを上記ファイトケラチン合成酵素の切片と混合して、Ｔ４ ＤＮＡ ｌｉｇａｓｅで連結して、熱ショック（ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ）の方法を利用して大腸菌ＤＨ５αに形質転換させた。上記の形質転換菌株はカナマイシン（ｋａｎａｍｙｃｉｎ，１００ｇ／Ｌ）抗生剤の含まれたＬＢ平板培地で選別して、これからｐＹＪ−ＰＣＳ組換えプラスミドを製作した（図２）。
１−３：メタロチオネインとファイトケラチン合成酵素を同時に発現するベクターの製作
メタロチオネインとファイトケラチン合成酵素を同時に発現するベクターを製作するために、先に製作されたｐＹＪ−ＭＴとｐＹＪ−ＰＣＳプラスミドからｐＹＪ−ＭＴ−ＰＣＳを製作した。 ｐＹＪ−ＰＣＳベクターを下記配列番号７と８のプライマーを利用してポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を随行した。
［配列番号７］：５’−ＡＴＡＣＴＧＣＡＧＴＴＧＡＣＡＡＴＴＡＡＴＣＡＴＣＧＧＣＴＣＧＴＡＴＡ−３’
［配列番号８］：５’−ＴＡＴＧＣＡＴＧＣＴＴＡＡＴＡＧＧＣＡＧＧＡＧＣＡＧＣＧＡＧＡ−３’
また、アガロースゲル電気泳動法で、１５４５ｂｐのｐＹＪ−ＰＣＳ遺伝子断片を分離した。これと同時にｐＹＪ−ＭＴプラスミドを二つの制限酵素ＰｓｔＩとＳｐｈＩで切断した後、これを上記ｐＹＪ−ＰＣＳの切片と混合して、 Ｔ４ ＤＮＡ ｌｉｇａｓｅで連結して、熱ショック（ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ）の方法を利用して大腸菌ＤＨ５αに形質転換させた。上記の形質転換菌株はカナマイシン（ｋａｎａｍｙｃｉｎ，１００ｇ／Ｌ）抗生剤の含まれたＬＢ平板培地で選別して、これからｐＹＪ−ＭＴ−ＰＣＳ組換えプラスミドを製作した（図３）。
１−４：形質転換された組換え微生物の製造及び重金属の吸着タンパク質の発現誘導
メタロチオネインとファイトケラチン合成酵素を同時に発現するように実施例１−３で製作された組換えプラスミドのｐＹＪ−ＭＴ−ＰＣＳを大腸菌ＤＨ５αに導入した。形質転換された組換え大腸菌をＬＢ液体培地１００ｍＬの含まれた２５０ｍＬフラスコに接種して３７℃で培養した。上記組換え大腸菌の光学密度（Ｏｐｔｉｃａｌ ｄｅｎｓｉｔｙ，ＯＤ）が分光光度計６００ｎｍ波長で０．６の数値を示す時ＩＰＴＧ（Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−Ｄ−１−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）を添加してメタロチオネインとファイトケラチン合成酵素の発現を誘導した。ｐＹＪ−ＭＴ−ＰＣＳに挿入されているｔａｃプロモーターはＩＰＴＧによって作動し、培養液のＩＰＴＧの最終濃度が１ ｍＭになるように添加してその発現を誘導した。
実施例２．組換え微生物を利用した単一金属ナノ粒子の合成及び特性分析
２−１：組換え微生物を利用した単一金属ナノ粒子の合成
上記、実施例１で製造された組換え微生物でメタロチオネインとファイトケラチン合成酵素の発現をＩＰＴＧで誘導して１時間後に大腸菌が培養されているＬＢ液体培地（Ｔｒｙｐｔｏｎｅ １０ｇ／Ｌ，Ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ ５ｇ／Ｌ，ＮａＣｌ ５ｇ／Ｌ，ｐＨ ６．５)にそれぞれバリウム（Ｂａ，（ＣＨ３ＣＯＯ）２Ｂａ，０．５ｍＭ）及びジルコニウム（Ｚｒ，Ｋ２ＺｒＦ６，０．５ｍＭ）、モリブデン（Ｍｏ，Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ，０．５ｍＭ）、インジウム（Ｉｎ，ＩｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ，０．５ｍＭ）、すず（Ｓｎ，ＳｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ，０．５ｍＭ）、ランタン（Ｌａ，Ｌａ（ＮＯ３）３・６Ｈ２Ｏ，０．５ｍＭ）、セリウム（Ｃｅ，Ｃｅ（ＮＯ３）３・６Ｈ２Ｏ，０．５ｍＭ）またはプラセオジム（Ｐｒ，Ｐｒ（ＮＯ３）３・６Ｈ２Ｏ，０．５ｍＭ）を添加し、１２時間の間、追加で培養した。全体培養液を４℃、３５００ ｒｐｍで１５分間、遠心分離した後上層液を捨てて大腸菌ペレットを修得した。ＰＢＳのバッファーで大腸菌を洗浄する過程を三回繰り返した後、凍結乾燥機で真空状態で一日以上乾燥させた。ナノ粒子が合成されたことを透過電子顕微鏡（Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ，ＴＥＭ）（Ｔｅｃｎａｉ Ｆ２０，Ｐｈｉｌｉｐｓ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）と、Ｘ線分光分析機（Ｅｎｅｒｇｙ−ｄｉｓｐｅｒｓｉｖｅ Ｘ−ｒａｙ ｓｐｅｃｔｏｓｃｏｐｙ，ＥＤＸ）（Ｄ／ＭＡＸ−２，５００，Ｒｉｇａｋｕ，Ｊａｐａｎ）ｗｉｔｈ ＣｕＫａ ｒａｄｉａｔｉｏｎ（λ＝１．５４０６Å））を利用して調査した。
その結果、図４ないし図６のように、各金属元素に対応する非晶質の金属ナノ粒子が合成されたことを確認することができた。
２−２：組換え微生物を利用して合成された単一金属ナノ粒子の表面官能基の分析
実施例２−１で製造された単一金属ナノ粒子の表面官能基を確認しようと、常温で赤外線分光器（Ｆｏｕｒｉｅｒ−Ｔｒａｎｓｆｏｒｍ Ｉｎｆｒａｒｅｄ Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ，ＦＴ−ＩＲ）（Ｎｉｃｏｌｅｔ（登録商標）ｉＳ（登録商標）５０，Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＵＳＡ）を利用して４００〜４０００cm−１の範囲で合成された単一金属ナノ粒子を分析した。
その結果、図７ないし図９のように、組換え微生物を通じて合成された単一金属ナノ粒子の表面官能基は、３３００〜３０００cm−１（Ｏ−Ｈ）、２９６０−２８５０cm−１（Ｃ−Ｈ）、１６５０〜１６６０cm−１（ａｍｉｄｅ Ｉ）、１５４０〜１５３５cm−１（ａｍｉｄｅ ＩＩ）、１２４０〜１２３４cm−１（ａｍｉｄｅ ＩＩＩ）、１１５０〜１０３０cm−１（Ｃ＝Ｏ）で構成されていることを確認することができた。
実施例３．組換え微生物を利用した複合金属ナノ粒子の合成及び特性分析
３−１：組換え微生物を利用した複合金属ナノ粒子の合成
実施例１で製造された組換え微生物でメタロチオネインとファイトケラチン合成酵素の発現をＩＰＴＧで誘導して１時間後に、１時間後に大腸菌が培養されているＬＢ液体培地（Ｔｒｙｐｔｏｎｅ １０ｇ／Ｌ，Ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ ５ｇ／Ｌ，ＮａＣｌ ５ｇ／Ｌ，ｐＨ ６．５)にそれぞれｉ）コバルトと鉄（Ｃｏ，ＣｏＣｌ２，０．５ｍＭ，Ｆｅ，Ｆｅ（ＮＯ）３・６Ｈ２Ｏ，０．５ｍＭ)、ｉｉ）ニッケルと鉄（Ｎｉ，ＮｉＣｌ２・６Ｈ２Ｏ，０．５ｍＭ，Ｆｅ，Ｆｅ（ＮＯ）３・６Ｈ２Ｏ，０．５ｍＭ)、ｉｉｉ） 亜鉛とマンガン（Ｚｎ，ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ，０．５ｍＭ，Ｍｎ，ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ，０．５ｍＭ) 、ｉｖ） 亜鉛と鉄（Ｚｎ，ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ，０．５ｍＭ，Ｆｅ，Ｆｅ（ＮＯ）３・６Ｈ２Ｏ，０．５ｍＭ）イオンを添加して１２時間の間、追加で培養した。 全体培養液を４℃、３５００ｒｐｍで１５分間、遠心分離した後上層液を捨てて大腸菌ペレットを集めた。ＰＢＳバッファーで大腸菌を洗浄する過程を三回繰り返した後、凍結乾燥機で真空状態で一日以上乾燥させた。ナノ粒子が合成されたことを透過電子顕微鏡を利用して調査した。
その結果、図１０に示したことのように、それぞれｉ）コバルトと鉄を添加した培地では酸化コバルト鉄（ＣｏＦｅ２Ｏ４） 、ｉｉ）ニッケルと鉄を添加した培地では酸化ニッケル鉄（ＮｉＦｅ２Ｏ４）、ｉｉｉ）亜鉛とマンガンを添加した培地では酸化マンガン亜鉛 （ＺｎＭｎ２Ｏ４）、ｉｖ）亜鉛と鉄（Ｚｎ，Ｋ２ＺｎＦ６，１ｍＭ）イオンを添加した培地では酸化鉄亜鉛（ＺｎＦｅ２Ｏ４）の複合金属ナノ粒子が合成されることを透過電子顕微鏡（Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ，ＴＥＭ）（Ｔｅｃｎａｉ Ｆ２０，Ｐｈｉｌｉｐｓ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）で確認することができた。
一方、図１１に示したことのように、組換え大腸菌を利用して合成された酸化コバルト鉄（ＣｏＦｅ２Ｏ４）、酸化ニッケル鉄（ＮｉＦｅ２Ｏ４）、酸化マンガン亜鉛 （ＺｎＭｎ２Ｏ４）、酸化鉄亜鉛（ＺｎＦｅ２Ｏ４）ナノ粒子の決定構造をＸ線回折分析機（Ｘ−ｒａｙ Ｄｉｆｆｒａｃｔｉｏｎ，ＸＲＤ）（Ｄ／ＭＡＸ−２，５００，Ｒｉｇａｋｕ，Ｊａｐａｎ）ｗｉｔｈ ＣｕＫａ ｒａｄｉａｔｉｏｎ（λ＝１．５４０６Å））を利用して確認することができた。
３−２：合成された複合金属ナノ粒子の表面官能基の確認
実施例３−１で製造された複合金属ナノ粒子の表面官能基を確認しようと、常温で赤外線分光器（Ｆｏｕｒｉｅｒ−Ｔｒａｎｓｆｏｒｍ Ｉｎｆｒａｒｅｄ Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ，ＦＴ−ＩＲ）（Ｎｉｃｏｌｅｔ（登録商標）ｉＳ（登録商標）５０，Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＵＳＡ）を利用して４００〜４０００cm−１の範囲で合成された複合金属ナノ粒子を分析した。
その結果、図１２に示したことのように、合成された複合金属ナノ粒子の表面官能基は、３３００〜３０００cm−１（Ｏ−Ｈ）、２９６０−２８５０cm−１（Ｃ−Ｈ）、１６５０〜１６６０cm−１（ａｍｉｄｅ Ｉ）、１５４０〜１５３５cm−１（ａｍｉｄｅ ＩＩ）、１２４０〜１２３４cm−１（ａｍｉｄｅ ＩＩＩ）、１１５０〜１０３０cm−１（Ｃ＝Ｏ）で構成されていることを確認することができた。
３−３：合成された複合金属ナノ粒子の磁性特性の分析
実施例３−１で製造されたナノ粒子の磁性特性を確認しようと、ＳＱＵＩＤ−ＶＳＭ機能を備えたＭＰＭＳ３（磁気測定システム）装備（ＳＱＵＩＤ−ＶＳＭ）（Ｑｕａｎｔｕｍ Ｄｅｓｉｇｎ，ＵＳＡ）を利用して磁気履歴曲線（Ｍ−Ｈ ｃｕｒｖｅ）を確認した。 磁気履歴曲線の測定は３００Ｋ、−５０Ｋ Ｏｅ〜＋５０Ｋ Ｏｅで測定された。
その結果、図１３に示したことのように、酸化コバルト鉄（ＣｏＦｅ２Ｏ４）ナノ粒子の場合、強磁性を示す物質であり、酸化ニッケル鉄（ＮｉＦｅ２Ｏ４）、酸化マンガン亜鉛（ＺｎＭｎ２Ｏ４）、酸化鉄亜鉛（ＺｎＦｅ２Ｏ４）ナノ粒子の場合、常磁性物質であることを確認することができた。
実施例４．組換え微生物を利用した複合金属ナノ粒子の亜テルル酸銀（Ａｇ ２ ＴｅＯ ３ ）の合成及び特性分析
４−１：組換え微生物を利用した複合金属ナノ粒子の合成
実施例１で製造された組換え微生物でメタロチオネインとファイトケラチン合成酵素の発現をＩＰＴＧで誘導して１時間後に、１時間後に大腸菌が培養されているＬＢ液体培地（Ｔｒｙｐｔｏｎｅ １０ｇ／Ｌ，Ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ ５ｇ／Ｌ，ＮａＣｌ ５ｇ／Ｌ，ｐＨ ６．５)に銀（Ａｇ，ＡｇＮＯ３，０．２５，１ｍＭ）及びテルル（Ｔｅ，ＮａＴｅＯ３，０．２５，１ｍＭ）イオンを添加して１２時間の間、追加で培養した。全体培養液を４℃、３５００ｒｐｍで１５分間、遠心分離した後上層液を捨てて大腸菌ペレットを集めた。ＰＢＳバッファーで大腸菌を洗浄する過程を三回繰り返した後、凍結乾燥機で真空状態で一日以上乾燥させた。ナノ粒子が合成されたことを透過電子顕微鏡を利用して調査した。
その結果、図１４及び図１５に示したことのように、銀とテルルを添加した培地で組換え大腸菌によって多様な大きさを有する亜テルル酸銀（Ａｇ２ＴｅＯ３）のナノ粒子が合成されることを透過電子顕微鏡（Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ，ＴＥＭ）（Ｔｅｃｎａｉ Ｆ２０，Ｐｈｉｌｉｐｓ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）で確認することができて、Ｘ線回折分析（Ｄ／ＭＡＸ−２，５００，Ｒｉｇａｋｕ，Ｊａｐａｎ）ｗｉｔｈ ＣｕＫａ ｒａｄｉａｔｉｏｎ（λ＝１．５４０６Å））を通じて、上記のナノ粒子が亜テルル酸銀（Ａｇ２ＴｅＯ３）であることをもう一度確認することができた。
４−２：合成された亜テルル酸銀（Ａｇ ２ ＴｅＯ ３ ）ナノ粒子の表面官能基の確認
実施例４−１で製造された亜テルル酸銀（Ａｇ２ＴｅＯ３）ナノ粒子の表面官能基を確認しようと、常温で赤外線分光器（Ｆｏｕｒｉｅｒ−Ｔｒａｎｓｆｏｒｍ Ｉｎｆｒａｒｅｄ Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ，ＦＴ−ＩＲ）（Ｎｉｃｏｌｅｔ（登録商標）ｉＳ（登録商標）５０，Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＵＳＡ）を利用して４００〜４０００cm−１の範囲で亜テルル酸銀（Ａｇ２ＴｅＯ３）を分析した。
その結果、図１６に示したことのように、合成された亜テルル酸銀（Ａｇ２ＴｅＯ３）ナノ粒子の表面官能基は、３３００〜３０００cm−１（Ｏ−Ｈ）、２９６０−２８５０cm−１（Ｃ−Ｈ）、１６５０〜１６６０cm−１（ａｍｉｄｅ Ｉ）、１５４０〜１５３５cm−１（ａｍｉｄｅ ＩＩ）、１２４０〜１２３４cm−１（ａｍｉｄｅ ＩＩＩ）、１１５０〜１０３０cm−１（Ｃ＝Ｏ）で構成されていることを確認することができた。
４−３：合成された亜テルル酸銀（Ａｇ ２ ＴｅＯ ３ ）ナノ粒子の磁性特性の確認
実施例４−１で製造された亜テルル酸銀（Ａｇ２ＴｅＯ３）ナノ粒子の磁性特性を確認しようと、ＳＱＵＩＤ−ＶＳＭ機能を備えたＭＰＭＳ３（磁気測定システム）装備（ＳＱＵＩＤ−ＶＳＭ）（Ｑｕａｎｔｕｍ Ｄｅｓｉｇｎ，ＵＳＡ）を利用して磁気履歴曲線（Ｍ−Ｈ ｃｕｒｖｅ）を確認した。磁気履歴曲線の測定は３００Ｋ温度、−７０Ｋ Ｏｅ〜＋７０Ｋ Ｏｅ 範囲の磁場の強さで行われた。
その結果、図１７に示したことのように、合成された亜テルル酸銀（Ａｇ２ＴｅＯ３）ナノ粒子が反磁性体であることを確認することができた。
４−４：合成された亜テルル酸銀（Ａｇ ２ ＴｅＯ ３ ）ナノ粒子の電気化学的特性の確認
実施例４−１で製造された亜テルル酸銀（Ａｇ２ＴｅＯ３）ナノ粒子の電気化学的特性を確認しようと、電気化学分析装置（Ｐｏｔｅｎｔｉｏｓｔａｔ； Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ ａｐｐｌｉｅｄ ｒｅｓｅａｒｃｈ，ＶＳＰ）を利用した。ナノ粒子の電気化学的特性は１Ｍ ＮａＯＨ水溶液内で循環ボルタンメトリー（Ｃｙｃｌｉｃ ｖｏｌｔａｍｍｅｔｒｙ，ＣＶ）を利用して測定した。このために製造された亜テルル酸銀（Ａｇ２ＴｅＯ３）ナノ粒子をガラス炭素電極（Ｇｌａｓｓｙｃａｒｂｏｎ ｅｌｅｃｔｒｏｄｅ）の上に乾燥させて作業電極にして、対電極としては白金線（Ｐｔ ｗｉｒｅ）を、基準電極としては銀／塩化銀（Ａｇ／ＡｇＣｌ）を使用した。循環ボルタンメトリーの測定は‐０．４〜＋０．５Ｖの電圧領域で１０、２０、３０、５０、１００ ｍＶ／Ｓの異なる走査速度で測定した。
その結果、図１８に示したことのように、走査速度によって異なるＣＶ ｃｕｒｖｅを示し、陰極（Ａｎｏｉｄｅ）で０．３０ Ｖ及び０．４０ Ｖ付近でピークと陽極（Ｃａｔｈｏｄｅ）で−０．５０ Ｖ、−０．２０ Ｖ付近でピークを示す電気化学的特徴を有する物質であることを確認することができた。
実施例５．組換え微生物を利用した金属硫化物ナノ粒子の合成及び特性分析
５−１：組換え微生物を利用した金属硫化物ナノ粒子の合成
実施例１で製造された組換え微生物でメタロチオネインとファイトケラチン合成酵素の発現をＩＰＴＧで誘導して１時間後に、１時間後に大腸菌が培養されているＬＢ液体培地（Ｔｒｙｐｔｏｎｅ １０ｇ／Ｌ，Ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ ５ｇ／Ｌ，ＮａＣｌ ５ｇ／Ｌ，ｐＨ ６．５)にそれぞれ銀（Ａｇ，ＡｇＮＯ３，１ｍＭ）、インジウム（Ｉｎ，ＩｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ，１ｍＭ）、マンガン（Ｍｎ，ＭｎＳＯ４・５Ｈ２Ｏ ，１ｍＭ）またはすず（Ｓｎ，ＳｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ ，１ｍＭ）とともに硫（Ｓ，Ｎａ２Ｓ，１ｍＭ）を添加して１２時間の間、追加で培養した。
全体培養液を４℃、３５００ｒｐｍで１５分間、遠心分離した後上層液を捨てて大腸菌ペレットを集めた。ＰＢＳバッファーで大腸菌を洗浄する過程を三回繰り返した後、凍結乾燥機で真空状態で一日以上乾燥させた。ナノ粒子が合成されることを透過電子顕微鏡（Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ，ＴＥＭ）（Ｔｅｃｎａｉ Ｆ２０，Ｐｈｉｌｉｐｓ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）と、 Ｘ線分光分析機（Ｅｎｅｒｇｙ−ｄｉｓｐｅｒｓｉｖｅ Ｘ−ｒａｙ ｓｐｅｃｔｏｓｃｏｐｙ，ＥＤＸ）（Ｄ／ＭＡＸ−２，５００，Ｒｉｇａｋｕ，Ｊａｐａｎ）ｗｉｔｈ ＣｕＫａ ｒａｄｉａｔｉｏｎ（λ＝１．５４０６Å））を利用して調査した。
その結果、図１９のとおり、銀（Ａｇ）、インジウム（Ｉｎ）、マンガン（Ｍｎ）またはすず（Ｓｎ）と硫をともに添加した培地でそれぞれ金属硫化物の硫化銀（Ａｇ２Ｓ）、硫化インジウム（ＩｎＳ）、硫化マンガン（ＭｎＳ）または硫化すず（ＳｎＳ）のナノ粒子が合成されることを透過電子顕微鏡とＸ線分光分析で確認することができた。
５−２：合成された金属硫化物ナノ粒子の表面官能基の分析
実施例５−１で製造された金属硫化物ナノ粒子の表面官能基を確認しようと、常温で赤外線分光器（Ｆｏｕｒｉｅｒ−Ｔｒａｎｓｆｏｒｍ Ｉｎｆｒａｒｅｄ Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ，ＦＴ−ＩＲ）（Ｎｉｃｏｌｅｔ（登録商標）ｉＳ（登録商標）５０，Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＵＳＡ）を利用して４００〜４０００cm−１の範囲で合成された金属化合物のナノ粒子を分析した。
その結果、図２０のとおり、組換え微生物を通じて合成された金属硫化物のナノ粒子の表面官能基は、３３００〜３０００cm−１（Ｏ−Ｈ）、２９６０−２８５０cm−１（Ｃ−Ｈ）、１６５０〜１６６０cm−１（ａｍｉｄｅ Ｉ）、１５４０〜１５３５cm−１（ａｍｉｄｅ ＩＩ）、１２４０〜１２３４cm−１（ａｍｉｄｅ ＩＩＩ）、１１５０〜１０３０cm−１（Ｃ＝Ｏ）で構成されていることを知ることができた。
実施例６．培地内ｐＨの増加を通じた金属ナノ粒子の合成
一部金属の場合、実施例１で製造された組換え微生物を培養する培地に金属イオンを添加しても金属ナノ粒子が合成されないことが示された。つまり、実施例１で製造された組換え大腸菌でメタロチオネインとファイトケラチン合成酵素の発現をＩＰＴＧで誘導して１時間後に大腸菌が培養されているＬＢ液体培地（Ｔｒｙｐｔｏｎｅ １０ｇ／Ｌ，Ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ ５ｇ／Ｌ，ＮａＣｌ ５ｇ／Ｌ，ｐＨ ６．５)にそれぞれコバルト（Ｃｏ，ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ，０．５ｍＭ)、ニッケル（Ｎｉ，ＮｉＣｌ２・６Ｈ２Ｏ，０．５ｍＭ)、亜鉛（Ｚｎ，ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ，０．５ｍＭ)またはカドミウム（Ｃｄ，ＣｄＣｌ２，０．５ｍＭ)イオンを添加して１２時間の間、追加で培養した。全体培養液を４℃、３５００ｒｐｍで１５分間、遠心分離した後上層液を捨てて大腸菌ペレットを集めた。ＰＢＳバッファーで大腸菌を洗浄する過程を三回繰り返した後、凍結乾燥機で真空状態で一日以上乾燥させた。本過程を通じて、ナノ粒子の合成の可否をを透過電子顕微鏡（Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ，ＴＥＭ）（Ｔｅｃｎａｉ Ｆ２０，Ｐｈｉｌｉｐｓ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を通じて調査したが、合成されるナノ粒子の形態を観察することができなくて、組換え大腸菌の形態だけが確認された(図２１ａ，ｃ，ｅ，ｇ)。
よって、本発明者らは金属結合力を有する酵素がｐＨ変化によって金属ナノ粒子の結合力に差異があるという仮定下でｐＨを変化して金属ナノ粒子の合成を誘導した。つまり、実施例１で製造された組換え大腸菌でメタロチオネインとファイトケラチン合成酵素の発現をＩＰＴＧで誘導して１時間後に大腸菌が培養されているＬＢ液体培地（Ｔｒｙｐｔｏｎｅ １０ｇ／Ｌ，Ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ ５ｇ／Ｌ，ＮａＣｌ ５ｇ／Ｌ，ｐＨ ６．５)の初期ｐＨを７．５に上昇させた後、それぞれコバルト（Ｃｏ，ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ，０．５ｍＭ)、ニッケル（Ｎｉ，ＮｉＣｌ２・６Ｈ２Ｏ，０．５ｍＭ)、亜鉛（Ｚｎ，ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ，０．５ｍＭ)またはカドミウム（Ｃｄ，ＣｄＣｌ２，０．５ｍＭ)イオンを添加して１２時間の間、追加で培養した。１２時間後、培養液のｐＨは８〜８．５まで増加された。この後、全体培養液を４℃、３５００ｒｐｍで１５分間、遠心分離した後上層液を捨てて大腸菌ペレットを集めた。ＰＢＳバッファーで大腸菌を洗浄する過程を三回繰り返した後、凍結乾燥機で真空状態で一日以上乾燥させた。本過程を通じて、ナノ粒子の合成の可否をを透過電子顕微鏡（Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ，ＴＥＭ）（Ｔｅｃｎａｉ Ｆ２０，Ｐｈｉｌｉｐｓ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を通じて調査した結果、金属ナノ粒子が合成されたことを確認することができて、特にこれらが結晶質で合成されることを知ることができた（図２１ ｂ，ｄ，ｆ，ｈ）。これらの金属ナノ粒子の結晶構造は、Ｘ線回折分析（（Ｄ／ＭＡＸ−２，５００，Ｒｉｇａｋｕ，Ｊａｐａｎ）ｗｉｔｈ ＣｕＫａ ｒａｄｉａｔｉｏｎ（λ＝１．５４０６Å））を通じて確認した結果、コバルト（Ｃｏ）、ニッケル（Ｎｉ）、亜鉛（Ｚｎ）またはカドミウム（Ｃｄ）イオンを添加した場合、それぞれ酸化コバルト（Ｃｏ３Ｏ４）、水酸化ニッケル（Ｎｉ（ＯＨ）２）、過酸化亜鉛（ＺｎＯ）、水酸化カドミウム（Ｃｄ（ＯＨ）２）の金属ナノ粒子が生成されることで確認された（図２２）。
実施例７．培地内ｐＨの増加を通じた結晶金属ナノ粒子の合成
実施例１で製造された組換え微生物でメタロチオネインとファイトケラチン合成酵素の発現をＩＰＴＧで誘導して１時間後に大腸菌が培養されているＬＢ液体培地（Ｔｒｙｐｔｏｎｅ １０ｇ／Ｌ，Ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ ５ｇ／Ｌ，ＮａＣｌ ５ｇ／Ｌ，ｐＨ ６．５)にランタン（Ｌａ，Ｌａ（ＮＯ３）３・６Ｈ２Ｏ，０．５ｍＭ)、セリウム（Ｃｅ、Ｃｅ（ＮＯ３）３・６Ｈ２Ｏ，０．５ｍＭ)、プラセオジム（Ｐｒ，Ｐｒ（ＮＯ３）３・６Ｈ２Ｏ，０．５ｍＭ)、ネオジウム（Ｎｄ，Ｎｄ（ＮＯ３）３・６Ｈ２Ｏ，０．５ｍＭ)、サマリウム（Ｓｍ，Ｓｍ（ＮＯ３）３・６Ｈ２Ｏ，０．５ｍＭ)、ユーロピウム（Ｅｕ，Ｅｕ（ＮＯ３）３・６Ｈ２Ｏ，０．５ｍＭ)またはガドリニウム（Ｇｄ，Ｇｄ（ＮＯ３）３・６Ｈ２Ｏ，０．５ｍＭ)イオンを添加して１２時間の間、追加で培養した。全体培養液を４℃、３５００ｒｐｍで１５分間、遠心分離した後上層液を捨てて大腸菌ペレットを集めた。ＰＢＳバッファーで大腸菌を洗浄する過程を三回繰り返した後、凍結乾燥機で真空状態で一日以上乾燥させた。本過程を通じて、ナノ粒子の合成の可否をを透過電子顕微鏡（Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ，ＴＥＭ）（Ｔｅｃｎａｉ Ｆ２０，Ｐｈｉｌｉｐｓ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を通じて調査したが、合成されるナノ粒子の形態はすべて非晶質であることが確認され、結晶質ナノ粒子は合成されないことで示された（図２３ ａ，ｃ，ｅ，ｇ，ｉ，ｋ，ｍ）。
これに先立って、金属ナノ粒子の合成の段階で培地の初期ｐＨ調節が既存に合成されなかった金属の結晶質ナノ粒子の合成を誘導したという点に着目し、本発明者らは、金属ナノ粒子合成の段階で培地の初期ｐＨを調節してみることにした。つまり、実施例１で製造された組換え大腸菌でメタロチオネインとファイトケラチン合成酵素の発現を ＩＰＴＧで誘導して１時間後に大腸菌が培養されているＬＢ液体培地（Ｔｒｙｐｔｏｎｅ １０ｇ／Ｌ，Ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ ５ｇ／Ｌ，ＮａＣｌ ５ｇ／Ｌ，ｐＨ ６．５)の初期ｐＨを７．５に上昇させた後、それぞれランタン（Ｌａ，Ｌａ（ＮＯ３）３・６Ｈ２Ｏ，０．５ｍＭ)、セリウム（Ｃｅ、Ｃｅ（ＮＯ３）３・６Ｈ２Ｏ，０．５ｍＭ)、プラセオジム（Ｐｒ，Ｐｒ（ＮＯ３）３・６Ｈ２Ｏ，０．５ｍＭ)、ネオジウム（Ｎｄ，Ｎｄ（ＮＯ３）３・６Ｈ２Ｏ，０．５ｍＭ)、サマリウム（Ｓｍ，Ｓｍ（ＮＯ３）３・６Ｈ２Ｏ，０．５ｍＭ)、ユーロピウム（Ｅｕ，Ｅｕ（ＮＯ３）３・６Ｈ２Ｏ，０．５ｍＭ)またはガドリニウム（Ｇｄ，Ｇｄ（ＮＯ３）３・６Ｈ２Ｏ，０．５ｍＭ)イオンを添加して１２時間の間、追加で培養した。１２時間後、培養液のｐＨは８〜８．５まで増加された。以後、 全体培養液を４℃、３５００ｒｐｍで１５分間、遠心分離した後上層液を捨てて大腸菌ペレットを集めた。ＰＢＳバッファーで大腸菌を洗浄する過程を三回繰り返した後、凍結乾燥機で真空状態で一日以上乾燥させた。本過程を通じて、ナノ粒子の合成の可否をを透過電子顕微鏡（Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ，ＴＥＭ）（Ｔｅｃｎａｉ Ｆ２０，Ｐｈｉｌｉｐｓ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）で調査した結果、ｐＨ調節前、非晶質で合成された金属ナノ粒子がｐＨ調節によって結晶質で合成されることを確認することができて(図２３ ｂ，ｄ，ｆ，ｈ、ｊ、ｉ，ｎ)、Ｘ線回折分析（（Ｄ／ＭＡＸ−２，５００，Ｒｉｇａｋｕ，Ｊａｐａｎ）ｗｉｔｈ ＣｕＫａ ｒａｄｉａｔｉｏｎ（λ＝１．５４０６Å））を通じてこれらの結晶構造を追加で確認した結果（図２４）、ランタン（Ｌａ）、セリウム（Ｃｅ）、プラセオジム（Ｐｒ）、ネオジウム（Ｎｄ）、サマリウム（Ｓｍ）、ユーロピウム（Ｅｕ）またはガドリニウム（Ｇｄ）イオンを添加した場合、それぞれ水酸化ランタン（Ｌａ（ＯＨ）３）、酸化セリウム（ＣｅＯ２）、水酸化プラセオジム（Ｐｒ（ＯＨ）３）、水酸化ネオジウム（Ｎｄ（ＯＨ）３）、水酸化サマリウム（Ｓｍ（ＯＨ）３）、水酸化ユーロピウム（Ｅｕ（ＯＨ）３）または水酸化ガドリニウム（Ｇｄ（ＯＨ）３）の結晶質金属ナノ粒子が生成されることで確認された（図２４）。
以上で本発明内容の特定な部分を詳細に記述したところ、当業界の通常の知識を有する者において、このような具体的技術は単に好ましい実施例のみであり、これによる本発明の範囲が制限されることではないことは明白である。したがって、本発明の実質的な範囲は添付された請求項とそれらの等価物によって定義されるといえる。
本発明によると、従来生物学的方法で合成が難しかった金属をナノ粒子の形態で合成する方法を提供することによって、新環境的で経済的に金属ナノ粒子の合成が可能にして、金属と硫を利用して金属硫化物ナノ粒子の合成も可能にしただけでなく、従来化学的または生物学的方法で製造された金属ナノ粒子でも、本発明の製造方法を利用してその収率が顕著に上昇するようにした。また、合成されたナノ粒子の磁性特性、電気化学的特性、触媒活性を確認することによって、光電子、電池、造影剤、半導体素子、電子素子、バイオセンサー、触媒、医学、化粧品、エネルギー貯蔵の分野にまで多様な用途に適用できるようにした。
一態様において、本発明は以下を提供する。
[項目１]
次の段階を含む単一の金属ナノ粒子の製造方法：
（ａ）メタロチオネインをコードする遺伝子及びファイトケラチン合成酵素をコードする遺伝子が導入された組換え微生物を培養する段階：
（ｂ）亜鉛（Ｚｎ）、セレニウム（Ｓｅ）、テルル（Ｔｅ）、セシウム（Ｃｓ）、銅（Ｃｕ）、鉛（Ｐｂ）、ニッケル（Ｎｉ）、マンガン（Ｍｎ）、水銀（Ｈｇ）、コバルト（Ｃｏ），クロム（Ｃｒ）、カドミウム（Ｃｄ）、ストロンチウム（Ｓｒ）、鉄（Ｆｅ）、金（Ａｕ）、銀（Ａｇ）、プラセオジム（Ｐｒ）、ガドリニウム（Ｇｄ）、バリウム（Ｂａ）、ジルコニウム（Ｚｒ）、モリブデン（Ｍｏ）、インジウム（Ｉｎ）、すず（Ｓｎ）、ランタン（Ｌａ）、セリウム（Ｃｅ）、ネオジウム（Ｎｄ）、サマリウム（Ｓｍ）、イットリウム（Ｙ）、アルミニウム（Ａｌ）及びユーロピウム（Ｅｕ）で構成された群から選択される金属イオンを添加した後、さらに培養して単一金属ナノ粒子を生成させる段階；及び
（ｃ）前記生成された単一金属ナノ粒子を回収する段階。
[項目２]
前記微生物はバクテリア、酵母、藻類、古細菌及びカビで構成された群から選択されることを特徴とする、項目１に記載の単一の金属ナノ粒子の製造方法。
[項目３]
前記メタロチオネインをコードする遺伝子は配列番号１で表示されるものであり、前記ファイトケラチン合成酵素をコードする遺伝子は配列番号２で表示されるものであることを特徴とする、項目１に記載の単一の金属ナノ粒子の製造方法。
[項目４]
前記（ｂ）段階の培地のｐＨは、前記組換え微生物を追加で培養して単一金属ナノ粒子を生成する最適のｐＨである８．０〜９．０に到達するように調整されることを特徴とする、項目１に記載の単一の金属ナノ粒子の製造方法。
[項目５]
前記（ｂ）段階の培地は、培養前の初期ｐＨが７．３〜７．７に調節されることを特徴とする、項目４に記載の単一の金属ナノ粒子の製造方法。
[項目６]
前記（ａ）段階の培地は、培養前の初期ｐＨが６〜７であることを特徴とする、項目５に記載の単一の金属ナノ粒子の製造方法。
[項目７]
前記生成された単一金属ナノ粒子は結晶質であることを特徴とする、項目１に記載の単一の金属ナノ粒子の製造方法。
[項目８]
前記生成された 金属ナノ粒子は酸化コバルト（Ｃｏ ３ Ｏ ４ ）、水酸化ニッケル（Ｎｉ（ＯＨ） ２ ）、過酸化亜鉛（ＺｎＯ）、水酸化カドミウム（Ｃｄ（ＯＨ） ２ ）、水酸化コバルト（Ｃｏ（ＯＨ） ２ ）、炭酸バリウム（ＢａＣＯ ３ ）、水酸化ランタン（Ｌａ（ＯＨ） ３ ）、酸化セリウム（ＣｅＯ ２ ）、水酸化プラセオジム（Ｐｒ（ＯＨ） ３ ）、水酸化ネオジウム（Ｎｄ（ＯＨ） ３ ）、水酸化サマリウム（Ｓｍ（ＯＨ） ３ ）、水酸化ユーロピウム（Ｅｕ（ＯＨ） ３ ）、水酸化セリウム（Ｃｅ（ＯＨ） ３ ）、水酸化イットリウム（Ｙ（ＯＨ） ３ ）、水酸化アルミニウム（Ａｌ（ＯＨ） ３ ）及び水酸化ガドリニウム（Ｇｄ（ＯＨ） ３ ））で構成された群から選択されることを特徴とする、項目１に記載の単一の金属ナノ粒子の製造方法。
[項目９]
前記生成された金属ナノ粒子は酸化コバルト（Ｃｏ ３ Ｏ ４ ）、水酸化ニッケル（Ｎｉ（ＯＨ） ２ ）、過酸化亜鉛（ＺｎＯ）及び水酸化カドミウム（Ｃｄ（ＯＨ） ２ ）で構成された群から選択されることを特徴とする、項目４に記載の単一の金属ナノ粒子の製造方法。
[項目１０]
前記生成された金属ナノ粒子は水酸化ランタン（Ｌａ（ＯＨ） ３ ）、酸化セリウム（ＣｅＯ ２ ）、水酸化プラセオジム（Ｐｒ（ＯＨ） ３ ）、水酸化ネオジウム（Ｎｄ（ＯＨ） ３ ）、水酸化サマリウム（Ｓｍ（ＯＨ） ３ ）、水酸化ユーロピウム（Ｅｕ（ＯＨ） ３ ）及び水酸化ガドリニウム（Ｇｄ（ＯＨ） ３ ））で構成された群から選択されることを特徴とする、項目７に記載の単一の金属ナノ粒子の製造方法。
[項目１１]
次の段階を含む複合金属ナノ粒子の製造方法：
（ａ）メタロチオネインをコードする遺伝子及びファイトケラチン合成酵素をコードする遺伝子が導入された組換え微生物を培養する段階：
（ｂ）亜鉛（Ｚｎ）、セレニウム（Ｓｅ）、テルル（Ｔｅ）、セシウム（Ｃｓ）、銅（Ｃｕ）、鉛（Ｐｂ）、ニッケル（Ｎｉ）、マンガン（Ｍｎ）、水銀（Ｈｇ）、コバルト（Ｃｏ），クロム（Ｃｒ）、カドミウム（Ｃｄ）、ストロンチウム（Ｓｒ）、鉄（Ｆｅ）、金（Ａｕ）、銀（Ａｇ）、プラセオジム（Ｐｒ）、ガドリニウム（Ｇｄ）、バリウム（Ｂａ）、ジルコニウム（Ｚｒ）、モリブデン（Ｍｏ）、インジウム（Ｉｎ）、すず（Ｓｎ）、ランタン（Ｌａ）、セリウム（Ｃｅ）、ネオジウム（Ｎｄ）、サマリウム（Ｓｍ）、イットリウム（Ｙ）、アルミニウム（Ａｌ）及びユーロピウム（Ｅｕ）で構成された群から選択される２つ以上の金属イオンを添加した後、さらに培養して複合金属ナノ粒子を生成させる段階；及び
（ｃ）上記生成された複合金属ナノ粒子を回収する段階。
[項目１２]
前記微生物はバクテリア、酵母、藻類、古細菌及びカビで構成された群から選択されることを特徴とする、項目１１に記載の複合金属ナノ粒子の製造方法。
[項目１３]
前記メタロチオネインをコードする遺伝子は配列番号１で表示されるものであり、前記ファイトケラチン合成酵素をコードする遺伝子は配列番号２で表示されるものであることを特徴とする、項目１１に記載の 複合金属ナノ粒子の製造方法。
[項目１４]
前記生成された複合金属ナノ粒子は酸化マンガン亜鉛 （ＺｎＭｎ ２ Ｏ ４ ）、酸化鉄亜鉛（ＺｎＦｅ ２ Ｏ ４ ）、酸化ニッケル鉄（ＮｉＦｅ ２ Ｏ ４ ）、酸化コバルト鉄（ＣｏＦｅ ２ Ｏ ４ ）、セレン化カドミウム（ＣｄＳｅ）、亜鉛カドミウム（ＣｄＺｎ）、テルル化カドミウム（ＣｄＴｅ）、亜鉛セレニド（ＳｅＺｎ）、カドミウムセレニド亜鉛（ＣｄＳｅＺｎ）、ストロンチウムガドリニウムス（ＳｒＧｄ）、プラセオジムガドリニウム（ＰｒＧｄ）、カドミウムセシウム（ＣｄＣｓ）、コバルト鉄（ＦｅＣｏ）、コバルト鉄ニッケル化合物（ＦｅＣｏＮｉ）及び亜テルル酸銀（Ａｇ ２ ＴｅＯ ３ ）で構成される群から選択されることを特徴とする、項目１１に記載の 複合金属ナノ粒子の製造方法。
[項目１５]
項目１１に記載の方法で製造された亜テルル酸銀（Ａｇ ２ ＴｅＯ ３ ）のナノ粒子を含む造影剤。
[項目１６]
項目１１に記載の方法で製造された亜テルル酸銀（Ａｇ ２ ＴｅＯ ３ ）のナノ粒子を含む電極。
[項目１７]
次の段階を含む金属硫化物のナノ粒子の製造方法：
（ａ）メタロチオネインをコードする遺伝子及びファイトケラチン合成酵素をコードする遺伝子が導入された組換え微生物を培養する段階：
（ｂ）ｉ）亜鉛（Ｚｎ）、セレニウム（Ｓｅ）、テルル（Ｔｅ）、セシウム（Ｃｓ）、銅（Ｃｕ）、鉛（Ｐｂ）、ニッケル（Ｎｉ）、マンガン（Ｍｎ）、水銀（Ｈｇ）、コバルト
（Ｃｏ），クロム（Ｃｒ）、カドミウム（Ｃｄ）、ストロンチウム（Ｓｒ）、鉄（Ｆｅ）、金（Ａｕ）、銀（Ａｇ）、プラセオジム（Ｐｒ）、ガドリニウム（Ｇｄ）、バリウム（Ｂａ）、ジルコニウム（Ｚｒ）、モリブデン（Ｍｏ）、インジウム（Ｉｎ）、すず（Ｓｎ）、ランタン（Ｌａ）、セリウム（Ｃｅ）、ネオジウム（Ｎｄ）、サマリウム（Ｓｍ）及びユーロピウム（Ｅｕ）で構成された群から選択される金属イオン；及びｉｉ）硫（Ｓ）を添加した後、さらに培養して金属硫化物のナノ粒子を生成させる段階；及び
（ｃ）前記生成された金属硫化物のナノ粒子を回収する段階。
[項目１８]
前記微生物はバクテリア、酵母、藻類、古細菌及びカビで構成された群から選択されることを特徴とする、項目１７に記載の金属硫化物のナノ粒子の製造方法。
[項目１９]
前記メタロチオネインをコードする遺伝子は配列番号１で表示されるものであり、前記ファイトケラチン合成酵素をコードする遺伝子は配列番号２で表示されるものであることを特徴とする、項目１７に記載の金属硫化物のナノ粒子の製造方法。
[項目２０]
前記生成された金属硫化物のナノ粒子は、硫化銀（Ａｇ ２ Ｓ）、硫化インジウム（ＩｎＳ）、硫化マンガン（ＭｎＳ）、硫化亜鉛（ＺｎＳ）、硫化銅（ＣｕＳ）、硫化カドミウム（ＣｄＳ）、 硫化金（ＡｕＳ）、硫化ニッケル（ＮｉＳ）、硫化コバルト(（ＣｏＳ）、硫化水銀（ＨｇＳ）及び硫化すず（ＳｎＳ）で構成された群から選択されることを特徴とする、項目１７に記載の金属硫化物のナノ粒子の製造方法。

Claims (7)

  1. 単一の金属ナノ粒子の製造方法であって、
    （ａ）メタロチオネインをコードする遺伝子及びファイトケラチン合成酵素をコードする遺伝子が導入された組換え微生物を培養する段階；
    （ｂ）段階（ａ）の培地に、ニッケル（Ｎｉ）、カドミウム（Ｃｄ）、プラセオジム（Ｐｒ）、ガドリニウム（Ｇｄ）、ランタン（Ｌａ）、ネオジウム（Ｎｄ）、サマリウム（Ｓｍ）及びユーロピウム（Ｅｕ）で構成された群から選択される金属イオンを添加した後、さらに培養して単一金属水酸化物結晶ナノ粒子を生成させる段階；及び
    （ｃ）前記生成された単一金属水酸化物結晶ナノ粒子を回収する段階；
    を含み、ここで、前記（ｂ）段階の培地のｐＨは、前記組換え微生物を追加で培養して単一金属水酸化物結晶ナノ粒子を生成する最適のｐＨである８．０〜９．０に到達するように調整されることを特徴とする、単一の金属水酸化物結晶ナノ粒子の製造方法。
  2. 前記微生物はバクテリア、酵母、藻類、古細菌及びカビで構成された群から選択されることを特徴とする、請求項１に記載の単一の金属水酸化物結晶ナノ粒子の製造方法。
  3. 前記メタロチオネインをコードする遺伝子は配列番号１で表示されるものであり、前記ファイトケラチン合成酵素をコードする遺伝子は配列番号２で表示されるものであることを特徴とする、請求項１に記載の単一の金属水酸化物結晶ナノ粒子の製造方法。
  4. 前記（ｂ）段階の培地は、培養前の初期ｐＨが、７．３〜７．７に上向調節されることを特徴とする、請求項１に記載の単一の金属水酸化物結晶ナノ粒子の製造方法。
  5. 前記（ａ）段階の培地は、培養前の初期ｐＨが６〜７であることを特徴とする、請求項４に記載の単一の金属水酸化物結晶ナノ粒子の製造方法。
  6. 前記生成された金属水酸化物結晶ナノ粒子は水酸化ニッケル（Ｎｉ（ＯＨ）２）、水酸化カドミウム（Ｃｄ（ＯＨ）２）、水酸化ランタン（Ｌａ（ＯＨ）３）、水酸化プラセオジム（Ｐｒ（ＯＨ）３）、水酸化ネオジウム（Ｎｄ（ＯＨ）３）、水酸化サマリウム（Ｓｍ（ＯＨ）３）、水酸化ユーロピウム（Ｅｕ（ＯＨ）３）及び水酸化ガドリニウム（Ｇｄ（ＯＨ）３））で構成された群から選択されることを特徴とする、請求項１に記載の単一の金属水酸化物結晶ナノ粒子の製造方法。
  7. 水酸化ランタン（Ｌａ（ＯＨ）３）、水酸化プラセオジム（Ｐｒ（ＯＨ）３）、水酸化ネオジウム（Ｎｄ（ＯＨ）３）、水酸化サマリウム（Ｓｍ（ＯＨ）３）、水酸化ユーロピウム（Ｅｕ（ＯＨ）３）及び水酸化ガドリニウム（Ｇｄ（ＯＨ）３））で構成された群から選択される前記生成された金属水酸化物結晶ナノ粒子は、ｐＨを調節することで、非晶質構造から結晶質構造に生成されることを特徴とする、請求項６に記載の単一の金属水酸化物結晶ナノ粒子の製造方法。
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