CN108603202B - 用于使用重组微生物生成金属纳米粒子和金属硫化物纳米粒子的方法 - Google Patents

用于使用重组微生物生成金属纳米粒子和金属硫化物纳米粒子的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及使用共表达作为重金属吸附蛋白的金属硫蛋白和植物螯合肽合酶的重组微生物来生成金属纳米粒子和金属硫化物纳米粒子的方法，并且涉及通过该方法合成的金属纳米粒子和金属硫化物纳米粒子的用途。本发明提供了一种用于合成难以通过常规生物学方法合成的金属纳米粒子的方法。本发明使得可以以环境友好且成本有效的方式合成金属纳米粒子，并且还使得可以合成金属硫化物纳米粒子。此外，通过使用本发明的方法，甚至以显著增加的产率生成可通过常规化学或生物学方法生成的金属纳米粒子。

Description

用于使用重组微生物生成金属纳米粒子和金属硫化物纳米粒 子的方法
技术领域
本发明涉及使用重组微生物生成金属纳米粒子和金属硫化物纳米粒子的方法，并且更具体地涉及使用共表达金属硫蛋白和植物螯合肽合酶的重组微生物生成金属纳米粒子和金属硫化物纳米粒子的方法，所述金属硫蛋白和植物螯合物合成酶是重金属吸附蛋白。
背景技术
随着对纳米技术的兴趣增加，在各个领域(包括物理学、化学、材料学、电学和电子学)中已经积极开展各种研究来开发纳米级新材料。具体而言，包含金属纳米结构的材料可以应用于高效电子学、光学、光电子学、电子器件、生物活性分子检测装置和催化剂的制造，这些是难以使用现有技术制造的散装材料实现的，并且这些材料也可应用于药品、化妆品、能量转换和储存等，这说明这些材料用于各种广泛的应用中(Shedbalkar U等人,AdvColloid Interface Sci[胶体和界面科学进展],209:40-48,2014；Fan W等人,Phys ChemChem Phys[物理化学与化学物理学],15(8):2632-2649,2013；Korbekandi H等人,CritRev Biotechnol[生物技术关键评论]29(4):279-306,2009)。因此，已经积极进行研究以合成新型金属纳米粒子或发现现有金属纳米粒子的新特性。
在常规金属纳米粒子的生成中，主要使用的是使用化学还原剂从金属元素合成金属纳米粒子的化学方法。然而，此方法的缺点在于，它需要有毒的有机溶剂和昂贵的催化剂，并且需要高温和高压条件，并且因此它引起环境污染问题并且具有低能量效率和经济效率。因此，作为环境友好且成本有效的替代方案，已经提出了使用具有还原酶的生物体的生物学方法。事实上，已经报道了使用微生物、酶、植物或类似物从金属元素合成金属纳米粒子的案例(Paza GA等人,Int J Mol Sci[国际分子科学杂志]15(8):13720-13737,2014；Hulkoti NI等人,Colloids Surf B Biointerfaces[胶体和表面B:生物界面],121:474-483,2014；Moghaddam等人,Molecules[分子],20(9):16540-16565,2015；Park TJ等人,Appl Microbiol Biotechnol[应用微生物学和生物技术],1-14,2015)。然而，此类方法没有变化地使用生物体本身的生物学机制，并且局限性在于，用于合成纳米粒子的元素限于金、银、铜、镉、铁、硒等(Quester K等人,Micron[微米],54-55:1-27,2013；Bharde A等人,JNanosci Nanotechnol[纳米科学与纳米技术杂志],7(12):4369-4377.2007；Shedbalkar U等人,Adv Colloid Interface Sci[胶体和界面科学进展],209:40-48,2014；Sriram MI等人,Methods Mol Biol[分子生物学方法],906:33-43,2012；Gurunathan S等人,ColloidsSurf B Biointerfaces[胶体和表面B:生物界面],74(1):328-335,2009)。
先前，本发明人通过使用表达重金属吸附蛋白的重组微生物由诸如锌(Zn)、硒(Se)、碲(Te)、铯(Cs)、铜(Cu)、铅(Pb)、镍(Ni)、锰(Mn)、汞(Hg)、钴(Co)和铬(Cr)等的元素生成金属纳米粒子(Lee等人,ACS Nano[美国化学学会纳米]6(8):6998-7008,2012；韩国专利号10-0755746)。然而，使用各种其他金属元素生成金属纳米粒子存在局限性，并且存在产率也低的问题。
同时，金属硫化物纳米粒子由于其独特且优异的特性而作为下一代电极材料和储能材料受到关注(Rui X等人,Nanoscale[纳米尺度],6(17):9889-9924,2014)。因此，已经报道了与用于生成金属硫化物纳米粒子的方法有关的现有技术，包括使用硫醇化合物作为硫前体生成金属硫化物纳米晶体的方法，其涉及通过使金属前体与硫醇化合物反应来获得金属硫化物晶体的方法(韩国专利号10-0621309)；用作太阳能电池缓冲器的板状或线性铟复合纳米材料(韩国专利号10-1305554)；通过加热硫化锡前体生成硫化锡纳米粒子的方法和使用它制造锂离子电池的方法(韩国专利号10-0896656)等。然而，上述方法的缺点在于，它们需要300℃或更高的高反应温度，由于使用有机溶剂诸如甲苯而不环保，并且需要随后的热处理过程，就生产成本而言这是不利的。此外，用作半导体材料的CdS和PbS(Joo J等人,J.Am.Chem.Soc[美国化学学会杂志],125(36):11100-11105,2003)具有负面的环境影响，并且因此需要使用除镉或铅基金属硫化物之外的元素来合成金属硫化物纳米粒子。
因此，诸位发明人已经进行了广泛的努力来生成在常规技术中还未合成的各种金属纳米粒子和金属硫化物纳米粒子。结果，诸位发明人已发现，当使用共表达金属硫蛋白和植物螯合肽合酶(其为重金属吸附蛋白)的重组微生物优化培养条件时，可由如下元素生成金属纳米粒子和金属硫化物纳米粒子，这些元素在常规技术中还未作为用于合成金属纳米粒子的元素报道，并且已通过常规方法生成的金属纳米粒子的产率也显著增加，从而完成本发明。
背景技术部分中公开的信息仅用于增强对本发明背景的理解，并且因此可能不包含形成本领域普通技术人员已知的现有技术的信息。
发明内容
本发明的目的是提供使用重组微生物生成单质金属纳米粒子(single-elementmetal nanoparticles)的方法。
本发明的另一个目的是提供使用重组微生物生成金属合金纳米粒子的方法。
本发明的再另一个目的是提供使用重组微生物生成金属硫化物纳米粒子的方法。
本发明的又一个目的是提供所生成的金属纳米粒子的用途。
为达到上述目的，本发明提供一种用于生成单质金属纳米粒子的方法，该方法包括以下步骤：(a)培养引入了金属硫蛋白编码基因和植物螯合肽合酶编码基因的重组微生物；(b)向步骤(a)的培养基中添加选自以下的金属离子：锌(Zn)、硒(Se)、碲(Te)、铯(Cs)、铜(Cu)、铅(Pb)、镍(Ni)、锰(Mn)、汞(Hg)、钴(Co)、铬(Cr)、镉(Cd)、锶(Sr)、铁(Fe)、金(Au)、银(Ag)、镨(Pr)、钆(Gd)、钡(Ba)、锆(Zr)、钼(Mo)、铟(In)、锡(Sn)、镧(La)、铈(Ce)、钕(Nd)、钐(Sm)、钇(Y)、铝(Al)和铕(Eu)，随后进行另外培养，从而生成单质金属纳米粒子；并且(c)回收所生成的单质金属纳米粒子。
本发明还提供了一种用于生成金属合金纳米粒子的方法，该方法包括以下步骤：(a)培养引入了金属硫蛋白编码基因和植物螯合肽合酶编码基因的重组微生物；(b)向步骤(a)的培养基中添加两种或多种选自以下的金属离子：锌(Zn)、硒(Se)、碲(Te)、铯(Cs)、铜(Cu)、铅(Pb)、镍(Ni)、锰(Mn)、汞(Hg)、钴(Co)、铬(Cr)、镉(Cd)、锶(Sr)、铁(Fe)、金(Au)、银(Ag)、镨(Pr)、钆(Gd)、钡(Ba)、锆(Zr)、钼(Mo)、铟(In)、锡(Sn)、镧(La)、铈(Ce)、钕(Nd)、钐(Sm)、钇(Y)、铝(Al)和铕(Eu)，随后进行另外培养，从而生成金属合金纳米粒子；并且(c)回收生成的金属合金纳米粒子。
本发明还提供了一种用于生成金属硫化物纳米粒子的方法，该方法包括以下步骤：(a)培养引入了金属硫蛋白编码基因和植物螯合肽合酶编码基因的重组微生物；(b)向步骤(a)的培养基中添加选自以下的金属离子：i)锌(Zn)、硒(Se)、碲(Te)、铯(Cs)、铜(Cu)、铅(Pb)、镍(Ni)、锰(Mn)、汞(Hg)、钴(Co)、铬(Cr)、镉(Cd)、锶(Sr)、铁(Fe)、金(Au)、银(Ag)、镨(Pr)、钆(Gd)、钡(Ba)、锆(Zr)、钼(Mo)、铟(In)、锡(Sn)、镧(La)、铈(Ce)、钕(Nd)、钐(Sm)、钇(Y)、铝(Al)和铕(Eu)；和ii)硫，随后进行另外培养，从而生成金属硫化物纳米粒子；并且(c)回收生成的金属硫化物纳米粒子。
本发明还提供了一种造影剂，其包含亚碲酸银(Ag2TeO3)纳米粒子。
本发明还提供了一种电极，其包含亚碲酸银(Ag2TeO3)纳米粒子。
附图说明
图1是根据本发明的表达载体pYJ-MT的遗传图谱。
图2是根据本发明的表达载体pYJ-PCS的遗传图谱。
图3是根据本发明的表达载体pYJ-MT-PCS的遗传图谱。
图4显示了钡(Ba)和锆(Zr)的无定形纳米粒子的电子显微照片和X射线光谱图[(a和b)钡；(c和d)锆；(a和c)电子显微照片；(b和d)X射线光谱图]。
图5显示了作为过渡元素的钼(Mo)、铟(In)和锡(Sn)的结晶纳米粒子的电子显微照片和X射线光谱图[(a和b)钼；(c和d)铟；(e和f)锡；(a、c和e)电子显微照片；(b、d和f)X射线光谱图]。
图6显示了作为镧系元素的镧(La)、铈(Ce)和镨(Pr)的无定形纳米粒子的电子显微照片和X射线光谱图[(a和b)镧；(c和d)铈；(e和f)镨；(a、c和e)电子显微照片；(b、d和f)X射线光谱图]。
图7显示钡(Ba)和锆(Zr)纳米粒子的FT-IR光谱[(a)钡；(b)锆]。
图8显示钼(Mo)、铟(In)和锡(Sn)纳米粒子的FT-IR光谱[(a)钼；(b)铟；(c)锡]。
图9显示了镧(La)、铈(Ce)和镨(Pr)的FT-IR光谱[(a)镧；(b)铈；(c)镨]。
图10显示氧化钴铁(CoFe2O4)、氧化镍铁(NiFe2O4)、氧化锌锰(ZnMn2O4)和氧化锌铁(ZnFe2O4)(它们是使用重组微生物合成的磁性结晶金属纳米粒子)的电子显微照片和X射线光谱图[(a)氧化钴铁(CoFe2O4)的电子显微照片；(b)氧化钴铁(CoFe2O4)的X射线光谱图；(c)氧化镍铁(NiFe2O4)的电子显微照片；(d)氧化镍铁(NiFe2O4)的X射线光谱图；(e)氧化锌锰(ZnMn2O4)的电子显微照片；(f)氧化锌锰(ZnMn2O4)的X射线光谱图；(g)氧化锌铁(ZnFe2O4)的电子显微照片；(h)氧化锌铁(ZnFe2O4)的X射线光谱图。
图11显示氧化钴铁(CoFe2O4)、氧化镍铁(NiFe2O4)、氧化锌锰(ZnMn2O4)和氧化锌铁(ZnFe2O4)(它们是使用重组微生物合成的磁性结晶金属纳米粒子)的X射线衍射图[(a)氧化钴铁(CoFe2O4)的X射线衍射图；(b)氧化镍铁(NiFe2O4)的X射线衍射图；(c)氧化锌锰(ZnMn2O4)的X射线衍射图；(d)氧化锌铁(ZnFe2O4)的X射线衍射图。
图12显示了氧化钴铁(CoFe2O4)、氧化镍铁(NiFe2O4)、氧化锌锰(ZnMn2O4)和氧化锌铁(ZnFe2O4)(它们是使用重组微生物合成的磁性金属纳米粒子)的FT-IR光谱。
图13显示氧化钴铁(CoFe2O4)、氧化镍铁(NiFe2O4)、氧化锌锰(ZnMn2O4)和氧化锌铁(ZnFe2O4)(它们是使用重组微生物合成的磁性金属纳米粒子)的磁滞(M-H)曲线[(a)氧化钴铁(CoFe2O4)的M-H曲线；(b)氧化镍铁(NiFe2O4)的M-H曲线；(c)氧化锌锰(ZnMn2O4)的M-H曲线；(d)氧化锌铁(ZnFe2O4)的M-H曲线]。
图14显示使用重组微生物生成的亚碲酸银(Ag2TeO3)的结晶纳米粒子的透射电子显微照片(a)和X射线衍射图(b)。
图15显示了使用重组微生物生成的具有各种尺寸的亚碲酸银(Ag2TeO3)纳米粒子的透射电子显微照片(a)和(b)、显示金属离子浓度与纳米粒子的粒度之间的相关性的图(c)、以及这些纳米粒子的X射线衍射图(d)。
图16是显示使用重组微生物生成的亚碲酸银(Ag2TeO3)纳米粒子的表面官能团的FT-IR图。
图17是显示使用重组微生物生成的亚碲酸银(Ag2TeO3)纳米粒子的磁特性的磁滞(M-H)曲线。
图18显示了指示使用重组微生物生成的亚碲酸银(Ag2TeO3)纳米粒子的电化学特性的循环伏安图。
图19显示了作为金属硫化物的硫化银(Ag2S)、硫化铟(InS)、硫化锰(MnS)和硫化锡(SnS)的结晶纳米粒子的电子显微照片和光谱图[(a和b)硫化银；(c和d)硫化铟；(e和f)硫化锰；(g和h)硫化锡；(a、c、e和g)电子显微照片；(b、d、f和h)光谱图]。
图20显示了指示硫化银(Ag2S)、硫化铟(InS)、硫化锰(MnS)和硫化锡(SnS)纳米粒子的官能团的FT-IR光谱[(a)硫化银；(b)硫化铟；(c)硫化锰；(d)硫化锡]。
图21显示了使用重组微生物在不增加含有Co、Ni、Zn和Cd离子的培养基的pH的情况下合成的金属纳米粒子(a、c、e和g)以及使用重组微生物在增加含有Co、Ni、Zn和Cd离子的培养基的pH后合成的金属纳米粒子(b、d、f和h)的外观。
图22显示了使用重组微生物在增加培养基的pH后的金属纳米粒子的X射线衍射图。
图23显示了使用重组微生物在不增加含有La、Ce、Pr、Nd、Sm、Eu和Gd离子的培养基的pH的情况下合成的无定形金属纳米粒子(a、c、e、g、i、k和m)以及使用重组微生物在增加含有La、Ce、Pr、Nd、Sm、Eu和Gd离子的培养基的pH后合成的结晶金属纳米粒子(b、d、f、h、j、l和n)的外观。
图24显示了使用重组微生物在增加培养基的pH后合成的结晶金属纳米粒子的X射线衍射图。
具体实施方式
除非另外指明，本文所用的所有科学技术术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的那些相同的意义。通常，本文使用的命名法和将在下面描述的实验方法是本领域公知和常用的那些。
在本发明中，为了使用生物学方法合成各种金属纳米粒子，在含有各种金属元素的培养基中培养共表达两种重金属吸附蛋白(金属硫蛋白和植物螯合肽合酶)的重组微生物。结果，发现合成了单质金属纳米粒子。
在本发明的一个实施例中，将重组微生物进行培养，并且然后在含有诸如钡(Ba)、锆(Zr)、钼(Mo)、铟(In)、锡(Sn)、镧(La)、铈(Ce)或镨(Pr)等单质金属离子的培养基中进行另外培养，并且结果，可以看出合成了无定形单一纳米粒子。同时，当在含有钴(Co)、镍(Ni)、锌(Zn)或镉(Cd)离子的培养基中培养该重组微生物时，观察到没有合成单质金属纳米粒子。然而，当在增加培养基的pH后，在含有这些金属离子的培养基中培养该重组微生物时，可以看出生成了氧化钴(Co3O4)、氢氧化镍(Ni(OH)2)、过氧化锌(ZnO)或氢氧化镉(Cd(OH)2)的结晶金属粒子。此外，当在含有镧(La)、铈(Ce)、镨(Pr)、钕(Nd)、钐(Sm)、铕(Eu)或钆(Gd)离子的培养基中培养该重组微生物时，观察到合成了无定形单质金属纳米粒子。然而，当在增加培养基的pH后，在含有上述金属离子的培养基中培养该重组微生物时，观察到生成了氢氧化镧(La(OH)3)、氧化铈(CeO2)、氢氧化镨(Pr(OH)3)、氢氧化钕(Nd(OH)3)、氢氧化钐(Sm(OH)3)、氢氧化铕(Eu(OH)3)或氢氧化钆(Gd(OH)3)的结晶单质金属纳米粒子。
因此，在第一方面，本发明涉及一种用于生成单质金属纳米粒子的方法，该方法包括以下步骤：(a)在培养基中培养引入了金属硫蛋白编码基因和植物螯合肽合酶编码基因的重组微生物；(b)向步骤(a)的培养基中添加选自以下的金属离子：锌(Zn)、硒(Se)、碲(Te)、铯(Cs)、铜(Cu)、铅(Pb)、镍(Ni)、锰(Mn)、汞(Hg)、钴(Co)、铬(Cr)、镉(Cd)、锶(Sr)、铁(Fe)、金(Au)、银(Ag)、镨(Pr)、钆(Gd)、钡(Ba)、锆(Zr)、钼(Mo)、铟(In)、锡(Sn)、镧(La)、铈(Ce)、钕(Nd)、钐(Sm)、钇(Y)、铝(Al)和铕(Eu)，随后进行另外培养，从而生成单质金属纳米粒子；并且(c)回收所生成的单质金属纳米粒子。
在本发明中，所添加的金属离子可选自：锌(Zn)、硒(Se)、碲(Te)、铯(Cs)、铜(Cu)、铅(Pb)、镍(Ni)、锰(Mn)、汞(Hg)、钴(Co)、铬(Cr)、镉(Cd)、锶(Sr)、铁(Fe)、金(Au)、银(Ag)、镨(Pr)、钆(Gd)、钡(Ba)、锆(Zr)、钼(Mo)、铟(In)、锡(Sn)、镧(La)、铈(Ce)、钕(Nd)、钐(Sm)、钇(Y)、铝(Al)和铕(Eu)，但不限于此。
在本发明中，所生成的金属纳米粒子可选自：氧化钴(Co3O4)、氢氧化镍(Ni(OH)2)、过氧化锌(ZnO)、氢氧化镉(Cd(OH)2)、氢氧化钴(Co(OH)2)、碳酸钡(BaCO3)、氢氧化镧(La(OH)3)、氧化铈(CeO2)、氢氧化镨(Pr(OH)3)、氢氧化钕(Nd(OH)3)、氢氧化钐(Sm(OH)3)、氢氧化铕(Eu(OH)3)、氢氧化铈(Ce(OH)3)、氢氧化钇(Y(OH)3)、氢氧化铝(Al(OH)3)和氢氧化钆(Gd(OH)3)，但不限于此。
在本发明中，可以发现在400至4000cm-1的IR光谱范围内，这些单质金属纳米粒子的表面官能团包含3300-3000cm-1(OH基团)、2960-2850cm-1(C-H)、1650-1660cm-1(酰胺I)、1540-1535cm-1(酰胺II)、1240-1234cm-1(酰胺III)和1150-1030cm-1(C＝O)。
在本发明中，当在将初始pH调节到7.3至7.7之后进行步骤(b)中的培养时，可以看出金属纳米粒子以最高效率生成，而pH随着时间的推移增加至8.0至9.0。此外，可以看出，当金属纳米粒子以最高效率生成时，培养基的电位(Eh)为-0.5V至+0.5V。
因此，在本发明中，可以调节步骤(b)中培养基的pH，使其达到8.0-9.0的最佳pH，通过在该最佳pH下对该重组微生物进行另外培养来生成单质金属纳米粒子。
为此，优选地，在另外培养之前，使步骤(b)中培养基的初始pH增加至7.3至7.7，更优选7.4至7.6。
在本发明中，培养前步骤(a)中培养基的初始pH可以是6至7，优选6.4至6.6。
当如上所述调节微生物培养步骤中的pH和金属纳米粒子生成步骤中的pH时，可以合成在常规技术中难以合成的金属纳米粒子。可以通过增加pH合成的金属纳米粒子可以选自：氧化钴(Co3O4)、氢氧化镍(Ni(OH)2)、过氧化锌(ZnO)和氢氧化镉(Cd(OH)2)，但不限于此。
此外，当未调节pH时，这些单质金属纳米粒子(包括氧化钴(Co3O4)、氢氧化镍(Ni(OH)2)、过氧化锌(ZnO)、氢氧化镉(Cd(OH)2)、氢氧化镧(La(OH)3)、氧化铈(CeO2)、氢氧化镨(Pr(OH)3)、氢氧化钕(Nd(OH)3)、氢氧化钐(Sm(OH)3)、氢氧化铕(Eu(OH)3)和氢氧化钆(Gd(OH)3))是无定形的，但随着pH增加生成结晶纳米粒子。
在本发明的另一个实施例中，培养重组微生物，并且然后观察到i)在含钴和铁(Co，CoCl2，0.5mM，Fe，Fe(NO)3·6H2O，0.5mM)的培养基中生成氧化钴铁(CoFe2O4)的金属合金纳米粒子；ii)在含镍和铁(Ni，NiCl2·6H2O，0.5mM，Fe，Fe(NO)3·6H2O，0.5mM)的培养基中生成氧化镍铁(NiFe2O4)的金属合金纳米粒子；iii)在含有锌和锰(Zn，ZnSO4·7H2O，0.5mM，MnCl24H2O)的培养基中生成氧化锌锰(ZnMn2O4)的金属合金纳米粒子；iv)在含有锌和铁离子(Zn，ZnSO4·7H2O，0.5mM，Fe，Fe(NO)3·6H2O，0.5mM)的培养基中生成氧化锌铁(ZnFe2O4)的金属合金纳米粒子；并且v)在含有银(Ag，AgNO3，0.25，0.5mM)和碲(Te，NaTeO3，0.25，0.5mM)离子的培养基中生成亚碲酸银(Ag2TeO3)的金属合金纳米粒子。
因此，在第二方面，本发明涉及一种用于生成金属合金纳米粒子的方法，该方法包括以下步骤：(a)在培养基中培养引入了金属硫蛋白编码基因和植物螯合肽合酶编码基因的重组微生物；(b)向步骤(a)的培养基中添加两种或多种选自以下的金属离子：锌(Zn)、硒(Se)、碲(Te)、铯(Cs)、铜(Cu)、铅(Pb)、镍(Ni)、锰(Mn)、汞(Hg)、钴(Co)、铬(Cr)、镉(Cd)、锶(Sr)、铁(Fe)、金(Au)、银(Ag)、镨(Pr)、钆(Gd)、钡(Ba)、锆(Zr)、钼(Mo)、铟(In)、锡(Sn)、镧(La)、铈(Ce)、钕(Nd)、钐(Sm)、钇(Y)、铝(Al)和铕(Eu)，随后进行另外培养，从而生成金属合金纳米粒子；并且(c)回收生成的金属合金纳米粒子。
在本发明中，所添加的金属离子可以是选自下组的两种或更多种金属离子，该组由以下各项组成：锌(Zn)、硒(Se)、碲(Te)、铯(Cs)、铜(Cu)、铅(Pb)、镍(Ni)、锰(Mn)、汞(Hg)、钴(Co)、铬(Cr)、镉(Cd)、锶(Sr)、铁(Fe)、金(Au)、银(Ag)、镨(Pr)、钆(Gd)、钡(Ba)、锆(Zr)、钼(Mo)、铟(In)、锡(Sn)、镧(La)、铈(Ce)、钕(Nd)、钐(Sm)、钇(Y)、铝(Al)和铕(Eu)，但不限于此。
在本发明中，发现通过上述方法生成的金属合金纳米粒子由以下各项组成：氧化锌锰(ZnMn2O4)、氧化锌铁(ZnFe2O4)、氧化镍铁(NiFe2O4)、氧化钴铁(CoFe2O4)、硒化镉(CdSe)、镉锌(CdZn)、碲化镉(CdTe)、硒化锌(SeZn)、硒化镉锌(CdSeZn)、锶钆(SrGd)、镨钆(PrGd)、镉铯(CdCs)、钴铁(FeCo)、铁钴镍化合物(FeCoNi)和亚碲酸银(Ag2TeO3)。
在本发明中，可以发现在400至4000cm-1的IR光谱范围内，这些金属合金纳米粒子的表面官能团包含3300-3000cm-1(O-H)、2960-2850cm-1(C-H)、1650-1660cm-1(酰胺I)、1540-1535cm-1(酰胺II)、1240-1234cm-1(酰胺III)和1150-1030cm-1(C＝O)。
可以看出，在通过上述方法合成的金属纳米粒子中，氧化钴铁(CoFe2O4)纳米粒子是铁磁性的，并且氧化镍铁(NiFe2O4)、氧化锌锰(ZnMn2O4)和氧化锌铁(ZnFe2O4)纳米粒子是顺磁性的。
具体而言，在第二方面，可以看出，当同时添加银(Ag)和碲(Te)时，合成了亚碲酸银(Ag2TeO3)纳米粒子，并且亚碲酸银(Ag2TeO3)金属合金纳米粒子的表面官能团包含3300-3000cm-1(O-H)、2960-2850cm-1(CH)、1650-1660cm-1(酰胺I)、1540-1535cm-1(酰胺II)、1240-1234cm-1(酰胺III)和1150-1030cm-1(C＝O)。
因此，在第三方面，本发明涉及使用共表达金属硫蛋白和植物螯合肽合酶的重组微生物合成的亚碲酸银(Ag2TeO3)纳米粒子的新用途。
亚碲酸银(Ag2TeO3)纳米粒子是反磁性的，并且因此可用作造影剂，其中该造影剂可以用于选自下组的成像，该组由以下各项组成：光学成像、磁共振成像、精确核医学成像和超声成像，但不限于此。
此外，亚碲酸银(Ag2TeO3)纳米粒子根据扫描速率显示出不同的CV曲线，并且具有在阳极中在约0.30V和0.40V处显示峰并且在阴极中在-0.50V和-0.20V处显示峰的电化学特性。因此，亚碲酸银(Ag2TeO3)纳米粒子可用作电极的组分，其中该电极可以用于选自下组的电池中，该组由以下各项组成：锂离子电池、燃料电池、太阳能电池、氢电池和蓄电池，但不限于此。例如，根据本发明的金属纳米粒子可以用于锂离子电池的阳极，特别是锂离子蓄电池。此外，根据本发明的金属纳米粒子可以用于锂离子电池的阳极，特别是锂离子蓄电池，其包含电活性材料。
根据本发明的亚碲酸银(Ag2TeO3)纳米粒子可用作生物传感器和半导体器件的组件。
此外，根据本发明合成的金属纳米粒子可基于其特性或活性用于各种应用中。可以使用根据本发明的金属纳米粒子的应用的实施例包括但不限于电极活化、用于葡萄糖氧化的催化剂、用于一氧化碳氧化的催化剂、用于碳化合物氧化的催化剂、用于合成吡喃并[2,3-d]嘧啶的催化剂、用于钴化合物合成的催化剂、用于铁化合物合成的催化剂、用于蓄电池的组合物、用于电池的组合物、用于锂蓄电池的组合物、光电子器件、半导体器件、发光二极管、自冷却装置、用于药物递送的载体、放射治疗增强剂、MRI造影剂、用于医疗诊断的组合物、用于高密度磁记录介质的组合物、用于电磁波吸收的组合物、抗菌组合物、用于治疗/预防口腔疾病的组合物、用于IR检测的组合物、用于X射线检测的组合物、用于γ射线检测的组合物、磁性制冷剂组合物、用于永磁体的原料、生物传感器、用于石墨烯管的组合物、食品添加剂组合物、烟草过滤器组合物、涂料颜料组合物、涂料干燥组合物、瓷器着色剂组合物等。
此外，根据本发明的金属纳米粒子可以用于必须抑制微生物的发育和增殖的任何领域。确切地说，金属纳米粒子有利地用于医疗装置、扶手、门把手、移动电话、键盘等。此外，根据本发明的金属纳米粒子可用于皮肤、粘膜和毛发的消毒和一般抗微生物处理，诸如除臭，优选用于手和伤口的消毒，并且可以用作用于个人和家庭护理用途或用于工业和医院应用的各种产品形式的抗微生物剂或组合物，包括但不限于，用于皮肤和头发护理的化妆品组合物，例如乳液；膏剂；油；凝胶；粉剂；湿巾；除臭剂，像喷雾剂、棒状物和滚涂剂；清洁剂，像淋浴凝胶；沐浴添加剂；液体和固体皂(基于合成表面活性剂和饱和和/或不饱和脂肪酸的盐)；水溶液和/或醇溶液，例如皮肤用清洁液；湿制清洁布；洗手液；香波；冲洗剂；等；口腔卫生组合物，例如处于凝胶、糊剂、膏剂或含水制剂(漱口水)形式；硬表面清洁剂，例如消毒喷雾剂、液体或粉剂；盘子或洗衣洗涤剂(液体或固体)、地板蜡、玻璃清洁剂等；以及工业和医院应用(例如，器械、医疗器械、手套的灭菌；隐形眼镜、隐形眼镜盒、隐形眼镜存储溶液、隐形眼镜清洁溶液)。
在本发明的另一个实施例中，发现将该重组微生物在补充有硫(S，Na2S，1mM)和银(Ag，AgNO3,0.5mM)、铟(In，InCl24H2O，0.5mM))、锰(Mn，MnSO45H2O，0.5mM)或锡(Sn，SnCl24H2O，0.5mM)的培养基中另外培养12小时，并且结果，显示生成了硫化银、硫化铟、硫化锰或硫化锡纳米粒子。
因此，在第四方面，本发明涉及一种用于生成金属硫化物纳米粒子的方法，该方法包括以下步骤：(a)在培养基中培养引入了金属硫蛋白编码基因和植物螯合肽合酶编码基因的重组微生物；(b)向步骤(a)的培养基中添加选自以下的金属离子：i)锌(Zn)、硒(Se)、碲(Te)、铯(Cs)、铜(Cu)、铅(Pb)、镍(Ni)、锰(Mn)、汞(Hg)、钴(Co)、铬(Cr)、镉(Cd)、锶(Sr)、铁(Fe)、金(Au)、银(Ag)、镨(Pr)、钆(Gd)、钡(Ba)、锆(Zr)、钼(Mo)、铟(In)、锡(Sn)、镧(La)、铈(Ce)、钕(Nd)、钐(Sm)和铕(Eu)；和ii)硫，随后进行另外培养，从而生成金属硫化物纳米粒子；并且(c)回收生成的金属硫化物纳米粒子。
在本发明中，所添加的金属离子可选自：锌(Zn)、硒(Se)、碲(Te)、铯(Cs)、铜(Cu)、铅(Pb)、镍(Ni)、锰(Mn)、汞(Hg)、钴(Co)、铬(Cr)、镉(Cd)、锶(Sr)、铁(Fe)、金(Au)、银(Ag)、镨(Pr)、钆(Gd)、钡(Ba)、锆(Zr)、钼(Mo)、铟(In)、锡(Sn)、镧(La)、铈(Ce)、钕(Nd)、钐(Sm)和铕(Eu)，但不限于此。
在本发明中，所生成的金属硫化物纳米粒子可选自：硫化银(Ag2S)、硫化铟(InS)、硫化锰(MnS)、硫化锌(ZnS)、硫化铜(CuS)、硫化镉(CdS)、硫化金(AuS)、硫化镍(NiS)、硫化钴(CoS)、硫化汞(HgS)和硫化锡(SnS)，但不限于此。
在本发明中，可以发现在400至4000cm-1的IR光谱范围内，这些金属硫化物纳米粒子的表面官能团包含3300-3000cm-1(O-H)、2960-2850cm-1(C-H)、1650-1660cm-1(酰胺I)、1540-1535cm-1(酰胺II)、1240-1234cm-1(酰胺III)和1150-1030cm-1(C＝O)。
在本发明的第一、第二和第四方面，该微生物可选自：细菌、酵母、藻类、古细菌和真菌，但不限于此。
在本发明的第一、第二和第四方面中，金属硫蛋白编码基因可以由SEQ ID NO:1表示，并且植物螯合肽合酶编码基因由SEQ ID NO:2表示，但它们不受限于此。
在本发明中，可以通过破坏微生物，通过过滤除去细胞碎片，并从经过滤的溶液中收集金属纳米粒子来回收在该重组微生物中生成的金属纳米粒子。在一个实施方案中，可以通过以下来回收这些金属纳米粒子：在3500rpm和4℃下将微生物培养物离心15分钟，除去上清液，收集微生物沉淀，用PBS缓冲液将收集的微生物沉淀洗涤三次，用配备有超声波探头(40T，美国超音速和材料公司(Sonics and Materials Inc.,USA))(打开3秒并且关闭3秒)的超声波仪(VCX-600，美国超音速和材料公司)破坏细胞悬浮液，通过8-μm孔径纤维素过滤器过滤并且然后通过0.1-μm孔径膜过滤器(沃特曼公司(Whatman))过滤来去除细胞碎片，并从经过滤的溶液中收集这些纳米粒子。除了此方法之外，本领域已知的任何方法也可用于从微生物细胞或细胞培养基中回收纳米粒子。
在本发明的实施例中，已经示出了特定的培养基和培养方法，但是对于本领域普通技术人员来说显而易见的是，可以如文献中报道的那样使用其他培养基。在本发明的实施例中，大肠杆菌用作微生物，对于本领域技术人员显而易见的是，可以使用其他细菌、酵母和真菌。此外，尽管以下实施例仅示出了作为待引入基因的特定菌株衍生基因，但是对于本领域技术人员显而易见的是，任何基因都可以没有限制地用作待引入的基因，只要它在被引入的宿主细胞中表达以显示与上述基因相同的活性。
在本发明中，金属离子的浓度可以是5mM至0.01mM，优选3mM至0.1mM，更优选2至0.5mM。如文献中所报道的，如果金属离子的浓度大于5mM，它们对细胞的毒性可能增加以抑制细胞的生长(Xiu ZM等人,Nano Lett.[纳米通讯],12(8):4271-4275,2012；Nies DH,Appl Microbiol Biotechnol[应用微生物学和生物技术],51(6):730-750,1999)。同时，可以通过控制金属离子的浓度来控制金属纳米粒子的尺寸。
在本发明中，含水金属化合物可用作金属元素。例如，可以使用含水金属盐、含水金属氧化物盐或其组合。
如本文所用，术语“质粒”意指如下DNA构建体，其含有与合适的控制序列有效地连接的DNA序列，所述控制序列能够在合适的宿主中实现该DNA的表达。该质粒可以是载体、噬菌体粒子或仅仅是潜在基因组插入物。一旦掺入合适的宿主中，该质粒可以独立于宿主基因组复制和起作用，或者在一些情况下可以整合到基因组本身中。在本说明书中，“质粒”和“载体”有时可互换使用，因为该质粒是最常用的载体形式。然而，本发明旨在包括具有与本领域将已知或已知的那些相同的功能的其他类型的载体。
如本文所用，术语“重组微生物”是指通过针对特定目的修饰基因的一部分而生成的微生物，诸如通过使用遗传重组技术将任何生物体的有用基因引入另一微生物中，使宿主微生物的基因的一部分缺失，或调整表达量。对于本领域技术人员显而易见的是，该术语可以用术语“经遗传修饰的微生物”、“重组菌株”或类似物代替。该微生物可包括藻类、细菌、原生动物、真菌、酵母等。优选地，该微生物可以选自：细菌、酵母和真菌。更优选地，可以选择大肠杆菌。
如本文所用，术语“结晶”意指如下的状态，其中某种固体形成处于重复原子排列状态的晶体。
如本文所用，术语“无定形”是指无定形状态，即如下的状态，其中某种固体不形成处于重复原子排列状态的晶体。
如本文所用，术语“纳米粒子”是指具有纳米单位直径的粒子。
在下文中，将参考实施例更详细地描述本发明。对于本领域普通技术人员显而易见的是，这些实施例仅用于说明目的，而不应解释为限制本发明的范围。因此，本发明的实质范围将由所附权利要求及其等同方案定义。
实施例1：共表达两种重金属吸附蛋白(金属硫蛋白和植物螯合肽合酶)的表达载 体的构建
1-1：金属硫蛋白表达载体的构建
使用恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)KT2440的基因组DNA作为模板，使用SEQID NO:3和4的引物进行聚合酶链式反应(PCR)，从而构建编码金属硫蛋白(MT)的核苷酸序列的金属硫蛋白(MT)基因片段。
SEQ ID NO:3:5'-ATAGAATTCATGAACGATCACCACCACCACAAC-3'
SEQ ID NO:4:5'-TATCTGCAGTTAGGGCGAGATCGGATCACTC-3'
接下来，将构建的金属硫蛋白片段进行琼脂糖凝胶电泳以分离243-bp金属硫蛋白基因片段，然后将其用两种限制酶(EcoRI和PstI)消化。同时，用两种限制酶(EcoRI和PstI)消化可诱导且含有tac启动子的pTac15K质粒，并且然后与MT片段混合并通过T4DNA连接酶连接。通过热休克法将连接产物转化到大肠杆菌DH5α中。在含有卡那霉素抗生素(100g/L)的LB培养基上选择转化菌株，并由其构建pYJ-MT重组质粒(图1)。
1-2：植物螯合肽合酶表达载体的构建
为了从拟南芥获得植物螯合肽合酶(PCS)，使用拟南芥的互补DNA(cDNA)作为模板，通过PCR构建编码植物螯合肽合酶的核苷酸序列的植物螯合肽合酶基因片段。使用SEQID NO:5和6的引物进行PCR。
SEQ ID NO:5:5'-ATAGAATTCATGGCTATGGCGAGTTTATATCGG-3'
SEQ ID NO:6:5'-TATGCATGCTTAATAGGCAGGAGCAGCGAGATC-3'
接下来，将构建的植物螯合肽合酶片段进行琼脂糖凝胶电泳以分离1458-bp植物螯合肽合酶基因片段，然后将其用两种限制酶(EcoRI和SphI)消化。同时，用两种限制酶(EcoRI和SphI)消化可诱导且含有tac启动子的pTac15K质粒，并且然后与植物螯合肽合酶片段混合并通过T4DNA连接酶连接。通过热休克法将连接产物转化到大肠杆菌DH5α中。在含有卡那霉素抗生素(100g/L)的LB平板培养基上选择转化菌株，并由其构建pYJ-PCS重组质粒(图2)。
1-3：共表达金属硫蛋白和植物螯合肽合酶的载体的构建
为了构建共表达金属硫蛋白和植物螯合肽合酶的载体，从如上所述构建的pYJ-MT和pYJ-PCS质粒构建pYJ-MT-PCS。确切地说，使用SEQ ID NO:7和8的引物对pYJ-PCS载体进行聚合酶链式反应(PCR)。
SEQ ID NO:7:5'-ATACTGCAGTTGACAATTAATCATCGGCTCGTATA-3'
SEQ ID NO:8:5'-TATGCATGCTTAATAGGCAGGAGCAGCGAGA-3'
然后，通过琼脂糖凝胶电泳从PCR片段中分离出1545-bp pYJ-PCS基因片段。同时，用两种限制酶(PstI和SphI)消化pYJ-MT质粒，并且然后与pYJ-PCS片段混合并通过T4DNA连接酶连接。通过热休克法将连接产物转化到大肠杆菌DH5α中。在含有卡那霉素抗生素(100g/L)的LB平板培养基上选择转化菌株，并由其构建pYJ-MT-PCS重组质粒(图3)。
1-4：经转化的重组微生物的生成及重金属吸附蛋白表达的诱导
将实施例1-3中构建以便共表达金属硫蛋白和植物螯合肽合酶的重组质粒pYJ-MT-PCS引入大肠杆菌DH5α。将经转化的重组大肠杆菌菌株接种到含有100mL LB液体培养基的250mL烧瓶中，并在37℃下培养。当大肠杆菌菌株在600nm波长下达到0.6的光密度(OD)时，向培养基中加入IPTG(异丙基-D-1-硫代半乳吡喃糖苷)以诱导金属硫蛋白和植物螯合肽合酶的表达。插入pYJ-MT-PCS中的tac启动子可通过IPTG诱导，并将IPTG加入培养基中至终浓度为1mM以诱导表达。
实施例2：使用重组微生物进行的单质金属纳米粒子合成及其表征
2-1：使用重组微生物进行的单质金属纳米粒子合成
在通过IPTG诱导金属硫蛋白和植物螯合肽合酶在上述实施例1中生成的重组微生物中的表达后1小时，将钡(Ba，(CH3COO)2Ba，0.5mM)、锆(Zr，K2ZrF6，0.5mM)、钼(Mo，Na2MoO42H2O，0.5mM)、铟(In，InCl24H2O，0.5mM)、锡(Sn，SnCl24H2O，0.5mM)、镧(La，La(NO3)36H2O，0.5mM)、铈(Ce，Ce(NO3)36H2O，0.5mM)或镨(Pr，Pr(NO3)36H2O，0.5mM)加入已经培养了重组大肠杆菌菌株的LB液体培养基(胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 5g/L，pH 6.5)中，在此之后将该重组微生物另外培养12小时。将培养物在3500rpm和4℃下离心15分钟，在此之后弃去上清液，并收集大肠杆菌沉淀。将大肠杆菌沉淀用PBS缓冲液洗涤三次，并且然后在冷冻干燥器中在真空下干燥一天或更长时间。使用透射电子显微镜法(TEM)(TecnaiF20，荷兰飞利浦公司(Philips))和能量分散X射线光谱法(EDX)((D/MAX-2,500，日本理学株式会社(Rigaku,Japan))用CuKa辐射
Figure BDA0001755727230000151
)来检查纳米粒子的合成。
结果，如图4至图6中可以看出的，合成对应于每种金属元素的无定形金属纳米粒子。
2-2：使用重组微生物合成的单质金属纳米粒子的表面官能团分析
为了确认上述实施例2-1中合成的单质金属纳米粒子的表面官能团，在室温下使用傅立叶变换红外分光光度计(FT-IR)(NicoletTMiSTM50，美国赛墨科技公司(ThermoScientific))在400至4000cm-1范围内分析合成的单质金属纳米粒子。
结果，如图7至图9中可以看出的，使用重组微生物合成的单质金属纳米粒子的表面官能团包含3300-3000cm-1(OH基团)、2960-2850cm-1(C-H)、1650-1660cm-1(酰胺I)、1540-1535cm-1(酰胺II)、1240-1234cm-1(酰胺III)和1150-1030cm-1(C＝O)。
实施例3：使用重组微生物进行的金属合金纳米粒子合成及其表征
3-1：使用重组微生物进行的金属合金纳米粒子合成
在通过IPTG诱导金属硫蛋白和植物螯合肽合酶在上述实施例1中生成的重组微生物中的表达后1小时，将i)钴和铁(Co，CoCl2,0.5mM，Fe，Fe(NO)3·6H2O，0.5mM)，ii)镍和铁(Ni，NiCl2·6H2O，0.5mM，Fe，Fe(NO)3·6H2O，0.5mM)，iii)锌和锰(Zn，ZnSO4·7H2O，0.5mM，MnCl24H2O)，0.5mM，或iv)锌和铁(Zn，ZnSO4·7H2O，0.5mM，Fe，Fe(NO)3·6H2O，0.5mM)离子加入已经培养了重组大肠杆菌菌株的LB液体培养基(胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl5g/L，pH 6.5)中，在此之后将该重组微生物另外培养12小时。将培养物在3500rpm和4℃下离心15分钟，在此之后弃去上清液，并收集大肠杆菌沉淀。将大肠杆菌沉淀用PBS缓冲液洗涤三次，并且然后在冷冻干燥器中在真空下干燥一天或更长时间。使用透射电子显微镜法(TEM)来检查纳米粒子的合成。
结果，如图10所示，通过透射电子显微镜法(TEM)(Tecnai F20，荷兰飞利浦公司)可以看出，i)在补充有钴和铁的培养基中合成了氧化钴铁(CoFe2O4)的金属合金纳米粒子；ii)在补充有镍和铁的培养基中合成了氧化镍铁(NiFe2O4)的金属合金纳米粒子；iii)在补充有锌和锰的培养基中合成了氧化锌锰(ZnMn2O4)的金属合金纳米粒子；并且iv)在补充有锌(Zn，ZnSO4·7H2O，1mM)和铁离子的培养基中合成了氧化锌铁(ZnFe2O4)的金属合金纳米粒子。
同时，如图11所示，可以通过能量分散X射线光谱法(X射线衍射，XRD)((D/MAX-2,500，日本理学株式会社(Rigaku,Japan))用CuKα辐射
Figure BDA0001755727230000161
Figure BDA0001755727230000162
)确认使用重组大肠杆菌菌株合成的氧化钴铁(CoFe2O4)、氧化镍铁(NiFe2O4)、氧化锌锰(ZnMn2O4)和氧化锌铁(ZnFe2O4)的晶体结构。
3-2：合成的金属合金纳米粒子的表面官能团的确认
为了确认上述实施例3-1中合成的金属合金纳米粒子的表面官能团，在室温下使用傅立叶变换红外分光光度计(FT-IR)(NicoletTMiSTM50，美国赛墨科技公司(ThermoScientific))在400至4000cm-1范围内分析合成的金属合金纳米粒子。
结果，如图12中可以看出的，发现使用重组微生物合成的金属合金纳米粒子的表面官能团包含3300-3000cm-1(O-H)、2960-2850cm-1(C-H)、1650-1660cm-1(酰胺I)、1540-1535cm-1(酰胺II)、1240-1234cm-1(酰胺III)和1150-1030cm-1(C＝O)。
3-3：合成的金属合金纳米粒子的磁特性的分析
为了检查实施例3-1中生成的纳米粒子的磁特性，使用具有SQUID-VSM功能的MPMS3(磁特性测量系统)(SQUID-VSM)(美国量子设计公司(Quantum Design))来测量这些纳米粒子的磁滞(M–H)曲线。在300K的温度和-50K Oe至+50K Oe的磁场强度下进行M-H曲线的测量。
结果，如图13所示，可以看出氧化钴铁(CoFe2O4)纳米粒子是铁磁性的，并且氧化镍铁(NiFe2O4)、氧化锌锰(ZnMn2O4)和氧化锌铁(ZnFe2O4)纳米粒子是顺磁性的。
实施例4：使用重组微生物进行的亚碲酸银(Ag2TeO3)金属合金纳米粒子合成及其 表征
4-1：使用重组微生物进行的金属合金纳米粒子合成
在通过IPTG诱导金属硫蛋白和植物螯合肽合酶在上述实施例1中生成的重组微生物中的表达后1小时，将银(Ag，AgNO3，0.25，1mM)和碲(Te，NaTeO3，0.25，1mM)离子加入已经培养了重组大肠杆菌菌株的LB液体培养基(胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 5g/L，pH 6.5)中，在此之后将该重组微生物另外培养12小时。将培养物在3500rpm和4℃下离心15分钟，在此之后弃去上清液，并收集大肠杆菌沉淀。将大肠杆菌沉淀用PBS缓冲液洗涤三次，并且然后在冷冻干燥器中在真空下干燥一天或更长时间。使用透射电子显微镜法(TEM)来检查纳米粒子的合成。
结果，如图14和15所示，通过透射电子显微镜法(TEM)(Tecnai F20，荷兰飞利浦公司)可以看出，通过重组大肠杆菌在补充银和碲的培养基中合成了具有各种尺寸的亚碲酸银(Ag2TeO3)纳米粒子，并且通过能量分散X射线光谱法((D/MAX-2,500，日本理学株式会社(Rigaku,Japan))用CuKa辐射
Figure BDA0001755727230000171
Figure BDA0001755727230000181
)也可以看出，合成的纳米粒子是亚碲酸银(Ag2TeO3)。
4-2：合成的亚碲酸银(Ag2TeO3)纳米粒子的表面官能团的确认
为了确认上述实施例4-1中合成的亚碲酸银(Ag2TeO3)纳米粒子的表面官能团，在室温下使用傅立叶变换红外分光光度计(FT-IR)(NicoletTMiSTM50，美国赛墨科技公司(Thermo Scientific))在400至4000cm-1范围内分析合成的亚碲酸银(Ag2TeO3)纳米粒子。
结果，如图16中可以看出的，发现使用重组微生物合成的亚碲酸银(Ag2TeO3)纳米粒子的表面官能团包含3300-3000cm-1(O-H)、2960-2850cm-1(C-H)、1650-1660cm-1(酰胺I)、1540-1535cm-1(酰胺II)、1240-1234cm-1(酰胺III)和1150-1030cm-1(C＝O)。
4-3：合成的亚碲酸银(Ag2TeO3)纳米粒子的磁特性的分析
为了检查实施例4-1中生成的亚碲酸银(Ag2TeO3)纳米粒子的磁特性，使用具有SQUID-VSM功能的MPMS3(磁特性测量系统)(SQUID-VSM)(美国量子设计公司(QuantumDesign))来测量这些纳米粒子的磁滞(M–H)曲线。在300K的温度和-70K Oe至+70K Oe的磁场强度下进行M-H曲线的测量。
结果，如图17中可以看出的，可以发现合成的亚碲酸银(Ag2TeO3)纳米粒子是反磁性的。
4-4：合成的亚碲酸银(Ag2TeO3)纳米粒子的电化学特性的分析
为了分析实施例4-1中生成的亚碲酸银(Ag2TeO3)纳米粒子的电化学特性，使用电化学分析仪(恒电位仪；普林斯顿应用研究公司(Princeton applied research)，VSP)。通过循环伏安法(CV)在1M NaOH水溶液中测量这些纳米粒子的电化学特性。为此，将生成的亚碲酸银(Ag2TeO3)纳米粒子在玻碳电极上干燥以形成工作电极。此外，铂(Pt)线用作对电极，并且银/氯化银(Ag/AgCl)用作参比电极。通过循环伏安法(CV)进行的测量是在-0.4至+0.5V范围内的电压以及10、20、30、50和100mV/s的不同扫描速率下进行。
结果，如图18所示，可以看出亚碲酸银(Ag2TeO3)纳米粒子根据扫描速率显示出不同的CV曲线，并且具有在阳极中在约0.30V和0.40V处显示峰并且在阴极中在约-0.50V和-0.20V处显示峰的电化学特性。
实施例5：使用重组微生物进行的金属硫化物纳米粒子合成及其表征
5-1：使用重组微生物进行的金属硫化物纳米粒子合成
在通过IPTG诱导金属硫蛋白和植物螯合肽合酶在上述实施例1中生成的重组微生物中的表达后1小时，将硫(S，Na2S，1mM)连同银(Ag，AgNO3，1mM)、铟(In，InCl24H2O，1mM)、锰(Mn，MnSO45H2O，1mM)或锡(Sn，SnCl24H2O，1mM)加入已经培养了重组大肠杆菌菌株的LB液体培养基(胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 5g/L，pH 6.5)中，在此之后将该重组微生物另外培养12小时。
将培养物在3500rpm和4℃下离心15分钟，在此之后弃去上清液，并获得大肠杆菌沉淀。将大肠杆菌沉淀用PBS缓冲液洗涤三次，并且然后在冷冻干燥器中在真空下干燥一天或更长时间。使用透射电子显微镜法(TEM)(Tecnai F20，荷兰飞利浦公司(Philips))和能量分散X射线光谱法(EDX)((D/MAX-2,500，日本理学株式会社(Rigaku,Japan))用CuKa辐射
Figure BDA0001755727230000191
)来检查纳米粒子的合成。
结果，如图19所示，可以看出，使用透射电子显微镜法和能量分散X射线光谱法检查在加入了银(Ag)、铟(In)、锰(Mn)或锡(Sn)和硫的培养基中硫化银(Ag2S)、硫化铟(InS)、硫化锰(MnS)或硫化锡(SnS)的纳米粒子的合成。
5-2：合成的金属硫化物纳米粒子的表面官能团的确认
为了确认上述实施例5-1中合成的金属硫化物纳米粒子的表面官能团，在室温下使用傅立叶变换红外分光光度计(FT-IR)(NicoletTMiSTM50，美国赛墨科技公司(ThermoScientific))在400至4000cm-1范围内分析合成的金属硫化物纳米粒子。
结果，如图20中可以看出的，发现使用重组微生物，通过重组微生物合成的金属硫化物纳米粒子的表面官能团包含3300-3000cm-1(O-H)、2960-2850cm-1(C-H)、1650-1660cm-1(酰胺I)、1540-1535cm-1(酰胺II)、1240-1234cm-1(酰胺III)和1150-1030cm-1(C＝O)。
实施例6：通过增加培养基的pH进行的金属纳米粒子合成
在一些金属的情况下，显示即使将金属离子加入到培养了实施例1中生成的重组微生物的培养基中，也不合成金属纳米粒子。换言之，在通过IPTG诱导金属硫蛋白和植物螯合肽合酶在上述实施例1中生成的重组微生物中的表达后1小时，将钴(Co，CoCl26H2O，0.5mM)、镍(Ni，NiCl26H2O，0.5mM)、锌(Zn，ZnSO47H2O，0.5mM)或镉(Cd，CdCl2，0.5mM)离子加入已经培养了重组大肠杆菌菌株的LB液体培养基(胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl5g/L，pH 6.5)中，在此之后将该重组微生物另外培养12小时。将培养物在3500rpm和4℃下离心15分钟，在此之后弃去上清液，并收集大肠杆菌沉淀。将大肠杆菌沉淀用PBS缓冲液洗涤三次，并且然后在冷冻干燥器中在真空下干燥一天或更长时间。在此程序中，通过透射电子显微镜法(TEM)(Tecnai F20，荷兰飞利浦公司)来检查是否会合成纳米粒子，但是不能观察到合成的纳米粒子的形状，并且仅观察到重组大肠杆菌的外观(图21a、21c、21e和21g)。
因此，假设酶与金属结合的能力可以根据pH的变化而变化，发明人改变pH以诱导金属纳米粒子的合成。换言之，在通过IPTG诱导金属硫蛋白和植物螯合肽合酶在上述实施例1中生成的重组微生物中的表达后1小时，使已经培养了重组大肠杆菌菌株的LB液体培养基(胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 5g/L，pH 6.5)的初始pH增加到7.5，并且然后将钴(Co，CoCl26H2O，0.5mM)、镍(Ni，NiCl26H2O，0.5mM)、锌(Zn，ZnSO47H2O，0.5mM)或镉(Cd，CdCl2，0.5mM)离子加入该LB液体培养基中，在此之后将该重组微生物另外培养12小时。培养12小时后，该培养基的pH增加到8至8.5。此后，将培养物在3500rpm和4℃下离心15分钟，在此之后弃去上清液，并收集大肠杆菌沉淀。将大肠杆菌沉淀用PBS缓冲液洗涤三次，并且然后在冷冻干燥器中在真空下干燥一天或更长时间。在此程序中，通过透射电子显微镜法(TEM)(Tecnai F20，荷兰飞利浦公司)来检查是否会合成金属纳米粒子，并且结果，可以看出合成了金属纳米粒子，并且特别地，合成的金属纳米粒子是结晶(图21b、21d、21f和21h)。通过X射线衍射分析((D/MAX-2,500，日本理学株式会社(Rigaku,Japan))用CuKα辐射
Figure BDA0001755727230000201
)检查这些金属纳米粒子的晶体结构，并且结果，显示当加入钴(Co)、镍(Ni)、锌(Zn)或镉(Cd)离子时，生成氧化钴(Co3O4)、氢氧化镍(Ni(OH)2)、过氧化锌(ZnO)或氢氧化镉(Cd(OH)2)金属纳米粒子(图22)。
实施例7：通过增加培养基的pH进行的结晶金属纳米粒子合成
在通过IPTG诱导金属硫蛋白和植物螯合肽合酶在上述实施例1中生成的重组微生物中的表达后1小时，将镧(La，La(NO3)36H2O，0.5mM)、铈(Ce，Ce(NO3)36H2O，0.5mM)、镨(Pr，Pr(NO3)36H2O，0.5mM)、钕(Nd，Nd(NO3)36H2O，0.5mM)、钐(Sm，Sm(NO3)36H2O，0.5mM)、铕(Eu，Eu(NO3)36H2O，0.5mM)或钆(Gd，Gd(NO3)36H2O，0.5mM)离子加入已经培养了重组大肠杆菌菌株的LB液体培养基(胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 5g/L，pH 6.5)中，在此之后将该重组微生物另外培养12小时。将培养物在3500rpm和4℃下离心15分钟，在此之后弃去上清液，并收集大肠杆菌沉淀。将大肠杆菌沉淀用PBS缓冲液洗涤三次，并且然后在冷冻干燥器中在真空下干燥一天或更长时间。在此程序中，通过透射电子显微镜法(TEM)(Tecnai F20，荷兰飞利浦公司)来检查是否合成纳米粒子，但是显示合成的纳米粒子都是无定形的，并且未合成结晶纳米粒子(图23a、23c、23e、23g、23i、23k和23m)。
因此，基于调节在金属纳米粒子合成步骤中培养基的初始pH诱导还未合成的结晶金属纳米粒子的合成的事实，发明人调整了金属纳米粒子合成步骤中培养基的初始pH。换言之，在通过IPTG诱导金属硫蛋白和植物螯合肽合酶在上述实施例1中生成的重组微生物中的表达后1小时，使已经培养了重组大肠杆菌菌株的LB液体培养基(胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 5g/L，pH 6.5)的初始pH增加至7.5，并且然后将镧(La，La(NO3)36H2O，0.5mM)、铈(Ce，Ce(NO3)36H2O，0.5mM)、镨(Pr，Pr(NO3)36H2O，0.5mM)、钕(Nd，Nd(NO3)36H2O，0.5mM)、钐(Sm，Sm(NO3)36H2O，0.5mM)、铕(Eu，Eu(NO3)36H2O，0.5mM)或钆(Gd，Gd(NO3)36H2O，0.5mM)离子加入该LB液体培养基中，在此之后将该重组微生物另外培养12小时。培养12小时后，该培养基的pH增加到8至8.5。此后，将培养物在3500rpm和4℃下离心15分钟，在此之后弃去上清液，并收集大肠杆菌沉淀。将大肠杆菌沉淀用PBS缓冲液洗涤三次，并且然后在冷冻干燥器中在真空下干燥一天或更长时间。在此程序中，通过透射电子显微镜法(TEM)(Tecnai F20，荷兰飞利浦公司)来检查是否会合成纳米粒子，并且结果，可以看出在调节pH之前合成了无定形金属纳米粒子，而作为pH调节的结果，合成了结晶金属纳米粒子。(图23b、23d、23f、23h、23j、23i和23n)。此外，通过X射线衍射分析((D/MAX-2,500，日本理学株式会社(Rigaku,Japan))用CuKα辐射
Figure BDA0001755727230000221
)检查合成的结晶金属纳米粒子的晶体结构(图24)，并且结果，观察到当加入镧(La)、铈(Ce)、镨(Pr)、钕(Nd)、钐(Sm)、铕(Eu)或钆(Gd)离子时，生成氢氧化镧(La(OH)3)、氧化铈(CeO2)、氢氧化镨(Pr(OH)3)、氢氧化钕(Nd(OH)3)、氢氧化钐(Sm(OH)3)、氢氧化铕(Eu(OH)3)或氢氧化钆(Gd(OH)3)的结晶金属粒子(图24)。
尽管已经参考具体特征详细描述了本发明，但是对于本领域技术人员来说显而易见的是，此描述仅用于优选实施方案，并且不限制本发明的范围。因此，本发明的实质范围将由所附权利要求及其等同方案定义。
工业应用性
根据本发明，提供了一种用于合成难以通过常规生物学方法合成的金属纳米粒子的方法。本发明使得可以以环境友好且成本有效的方式合成金属纳米粒子，并且还可以合成金属硫化物纳米粒子。此外，通过使用本发明的方法，甚至以显著增加的产率生成可通过常规化学或生物学方法生成的金属纳米粒子。此外，鉴定了合成的纳米粒子的磁特性、电化学特性和催化活性，使得本发明可以应用于各种工业领域应用，包括光电子学、电池、造影剂、半导体器件、电子器件、生物传感器、催化剂、药品、化妆品、储能应用。
文本文件
参见所附的文本文件。
序列表
<110> 韩国科学技术院
<120> 用于使用重组微生物生成金属纳米粒子和金属硫化物纳米粒子的方法
<130> PE04751A
<140> PCT/KR2016/015498
<141> 2016-12-29
<150> KR 10-2016-0002710
<151> 2016-01-08
<160> 8
<170> PatentIn版本3.5
<210> 1
<211> 243
<212> DNA
<213> 恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)KT2440
<400> 1
atgaacgatc accaccacca caacgatcaa cgctgcgcgt gtacgcactg ttcctgcact 60
gtggatgcca atgccttgca gcgcgacggc aaggcctatt gctgcgaggc ctgcgccagc 120
ggccaccgca agggtgagcc ctgccggatg caggactgcc attgtggtga gaagccgggc 180
gagagcgcgg tggacaatgc gttggatgaa accttcccag cgagtgatcc gatctcgccc 240
taa 243
<210> 2
<211> 1458
<212> DNA
<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)
<400> 2
atggctatgg cgagtttata tcggcgatct cttccttctc ctccggccat cgacttttct 60
tccgccgaag gcaagctaat cttcaatgaa gcgcttcaga aaggaactat ggaaggattt 120
ttcaggttga tttcgtattt tcagacacaa tccgaacctg cgtattgtgg tttggctagt 180
ctctcagtgg tgttgaatgc tctttctatc gatcctggac gtaaatggaa agggccttgg 240
aggtggtttg atgaatcaat gttggattgc tgcgaacctc tggaagtagt gaaggaaaaa 300
ggcatttcat ttggaaaagt tgtctgtttg gctcattgtt caggagcaaa agttgaggct 360
ttccgtacaa gtcagagcac cattgatgat ttccgcaaat ttgtcgtcaa atgcacgagt 420
tctgagaatt gtcatatgat ctcaacatat caccgaggtg tatttaagca gactgggact 480
ggtcactttt cacctattgg tggctataat gctgagagag atatggcttt gattcttgat 540
gttgctcgtt tcaagtatcc ccctcactgg gttcctctta aacttctttg ggaagccatg 600
gacagtattg atcagtcaac agggaaacgt agagggttca tgctcatatc tagaccacac 660
agagaacccg gattgctcta tactctgagc tgcaaggatg aaagctggat cgaaatagcc 720
aagtatttga aggaagatgt tcctcgtctt gtaagttcac agcatgtaga ttctgtggag 780
aaaatcatat cagttgtgtt caagtcactt ccatcaaatt tcaaccaatt catcagatgg 840
gtggctgaga tccgaattac agaggactca aaccaaaatc tcagcgcaga ggcgaagtct 900
aggctgaaac taaagcaatt ggtgctgaag gaagtgcacg aaactgaact gttcaaacac 960
atcaataagt tcttatccac agtgggttat gaagacagtc tgacttatgc tgctgcaaag 1020
gcttgttgcc aaggagctga aatcttatcc ggaagcccat caaaagagtt ttgttgtcgg 1080
gaaacttgcg tgaaatgcat caaaggtcct gatgactctg aaggcacggt ggtgaccgga 1140
gttgtggtgc gtgatgggaa tgaacaaaag gttgatctgt tagtgccatc gacgcaaact 1200
gagtgtgaat gtggtcctga agcaacttat ccagcaggaa acgatgtgtt cactgcactt 1260
ctattggctt tacctccaca gacatggtca gggatcaaag accaagctct tatgcatgaa 1320
atgaagcagc tcatttccat ggcttccctc ccaactttgc ttcaagaaga ggtattgcat 1380
cttcgacggc aacttcagct gctaaaacga tgccaagaga acaaggaaga ggatgatctc 1440
gctgctcctg cctattaa 1458
<210> 3
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 3
atagaattca tgaacgatca ccaccaccac aac 33
<210> 4
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 4
tatctgcagt tagggcgaga tcggatcact c 31
<210> 5
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 5
atagaattca tggctatggc gagtttatat cgg 33
<210> 6
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 6
tatgcatgct taataggcag gagcagcgag atc 33
<210> 7
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 7
atactgcagt tgacaattaa tcatcggctc gtata 35
<210> 8
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 8
tatgcatgct taataggcag gagcagcgag a 31

Claims (10)

1.用于生成单质金属纳米粒子的方法，该方法包括以下步骤：
(a)在pH为6至7的培养基中培养引入了金属硫蛋白编码基因和植物螯合肽合酶编码基因的重组微生物，以诱导重组微生物中金属硫蛋白和植物螯合肽的表达，其中该金属硫蛋白编码基因具有SEQ ID NO:1的核苷酸序列，并且该植物螯合肽合酶编码基因具有SEQ IDNO:2的核苷酸序列；
(b)使步骤(a)中培养基的pH增加到7.3至7.7并且向步骤(a)的培养基中添加选自以下的金属离子：锌(Zn)、镍(Ni)、钴(Co)、镉(Cd)、镨(Pr)、钆(Gd)、镧(La)、铈(Ce)、钕(Nd)、钐(Sm)、和铕(Eu)，随后进行另外培养；
(c)在步骤(b)的另外培养后，使步骤(b)中培养基的pH增加到8.0至9.0，以产生单质金属纳米粒子；并且
(d)回收所生成的单质金属纳米粒子。
2.如权利要求1所述的方法，其中该微生物选自：细菌、酵母、藻类、古细菌和真菌。
3.如权利要求1所述的方法，其中所生成的单质金属纳米粒子具有结晶结构。
4.如权利要求1所述的方法，其中所生成的金属纳米粒子选自：氧化钴(Co3O4)、氢氧化镍(Ni(OH)2)、氧化锌(ZnO)、氢氧化镉(Cd(OH)2)、氢氧化钴(Co(OH)2)、氢氧化镧(La(OH)3)、氧化铈(CeO2)、氢氧化镨(Pr(OH)3)、氢氧化钕(Nd(OH)3)、氢氧化钐(Sm(OH)3)、氢氧化铕(Eu(OH)3)、和氢氧化钆(Gd(OH)3)。
5.如权利要求1所述的方法，其中所生成的单质金属纳米粒子选自：氧化钴(Co3O4)、氢氧化镍(Ni(OH)2)、氧化锌(ZnO)和氢氧化镉(Cd(OH)2)。
6.如权利要求3所述的方法，其中所生成的单质金属纳米粒子选自：氢氧化镧(La(OH)3)、氧化铈(CeO2)、氢氧化镨(Pr(OH)3)、氢氧化钕(Nd(OH)3)、氢氧化钐(Sm(OH)3)、氢氧化铕(Eu(OH)3)和氢氧化钆(Gd(OH)3)。
7.用于生成亚碲酸银(Ag2TeO3)纳米粒子的方法，该方法包括以下步骤：
(a)在pH为6至7的培养基中培养引入了金属硫蛋白编码基因和植物螯合肽合酶编码基因的重组微生物，以诱导重组微生物中金属硫蛋白和植物螯合肽的表达，其中该金属硫蛋白编码基因具有SEQ ID NO:1的核苷酸序列，并且该植物螯合肽合酶编码基因具有SEQ IDNO:2的核苷酸序列；
(b)使步骤(a)中培养基的pH增加到7.3至7.7并且向步骤(a)的培养基中添加碲(Te)和银(Ag)，随后进行另外培养，从而生成金属合金纳米粒子；
(c)在步骤(b)的另外培养后，使步骤(b)中培养基的pH增加到8.0至9.0，以产生亚碲酸银(Ag2TeO3)粒子；并且
(d)回收生成的亚碲酸银(Ag2TeO3)纳米粒子。
8.如权利要求7所述的方法，其中该微生物选自：细菌、酵母、藻类、古细菌和真菌。
9.一种造影剂，其包含通过如权利要求7所述的方法生成的亚碲酸银(Ag2TeO3)纳米粒子。
10.一种电极，其包含通过如权利要求7所述的方法生成的亚碲酸银(Ag2TeO3)纳米粒子。
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