JP6787787B2 - 膜の製造方法 - Google Patents

Description

本発明は、膜(membranes)の製造方法に関する。特に、本発明は、水濾過膜の製造方法に関する。

従来のナノ濾過又は逆浸透水濾過膜は、何十年もの間知られている。代表的には、それらは、担体膜（しばしばポリスルホン又はポリエーテルスルホン）をキャスティングする；得られたキャストをジアミンの水溶液に浸漬する；その膜表面から過剰物を除去する；その膜を三官能性アシルハライドの有機溶液中に浸漬する；そして得られた生成物を硬化してポリアミド層を形成することによって調製される。水洗し、そして、必要であれば、第二の被覆を行う。

膜タンパク質は、両親媒性ＡＢＡブロックコポリマーから製造されたベシクル（vesicles）の壁中に取り込まれ得ることが、ＷＯ０１／３２１４６から知られている。この文献は、その重合体の性質の広範な議論を含んでおり、その重合体がその両鎖端に重合性基を有し得ることを開示している。これらの重合性基は、自己集合したベシクルの形成後に重合されることができ、重合はもっぱらベシクル内で起こる。ＷＯ２００４／０１１６００は、アクアポリンを、トリブロックコポリマー中に取り込んで、全ての不純物を除いて水だけを通す膜を形成できることを、開示している。これらの開示以来、商業的に実行可能な膜貫通タンパク質を取り込んだ膜、特にアクアポリンに基づく水濾過膜を開発すべく、多くの研究がなされてきた。課題は、必要な条件に耐えるために、物理的に十分に強健で(robust)実用的な膜を製造することである。

ＷＯ２００９／０７６１７４は、ブロックコポリマー及びアクアポリンに基づく実質的に平坦な膜を製造する方法を記載している。Dong et al, J. Mem. Sci. 2012, 409-410, 34-43は、アクアポリンを取り込んだブロックコポリマーのベシクルを創作し、次いで、担体の表面上に平面単層ポリマーをデポジットするために、そのベシクルを、ベシクル破裂方法を用いて破壊している。ＷＯ２０１０／１４６３６５は、アクアポリンをその中に埋め込んでいてもよいベシクルを油相中に懸濁させて液膜を形成することを記載している。Zhao et al, J. Membrane Sci. 2012, 422-428によれば、アクアポリン膜を製造する様々な提案された方法は、生体層（bio-layers）をつなぐポリマー、生体膜の穴区画の並び（biomembrane aperture partition arrays）、ベシクル融合による脂質二重層膜を支持する膜、及び膜の細孔上に浮遊するベシクル（vesicles suspended over membrane pores）を包含するが、これらの殆どが、要求される高い静水圧に耐えることができない。課題に対するチャオ（Zhao）自身の解法は、実際において、上述の従来の膜製造法を、ジアミン水溶液へのアクアポリン積載脂質ベシクル（即ちリポソーム）の付加によって修飾して、用いることである。その結果、ポリアミド層中に埋め込まれたリポソームが得られる。チャオは、得られた結果を、肯定的に報告しているが、水の流量（flux）のわずかな増加が得られているものの（図４(a)）、従来の膜と比べて、溶質を除去する膜の能力の向上は見られない（図５）ことが、提供されたデータから明らかである。このことは、アクアポリン積載リポソームがポリアミドにより完全に取り囲まれるようになり、従って、膜を通じる水の一次流量はポリアミド経由であり（即ち基膜の従来の経路経由）、そしてアクアポリンチャネル経由はほんの一部分のみだからであると思われる。やはりチャオ（Zhao）等からであるＷＯ２０１３／０４３１１８は、同じ技術を記載しており、ブロックコポリマーがベシクルを形成するために使用できること、アクアポリンを含んでいても含んでいなくてもよいこと、そしてポリアミド層中に埋め込まれていることが、やはり開示されている。これもまた、ポリアミド経由であって、もっぱらアクアポリンチャネル経由ではない、水の流量が得られることを、その結果は明らかに示している。

Xie et al, J. Mater. Chem A, 2013, 1, 7592、及びＷＯ２０１３／１８０６５９は、(i)主として（９５％）メタクリレート末端基を有するがいくらかの（３％）カルボン酸末端基をも含むポリマーに基づく自己集合ポリマーベシクル中へアクアポリンを取り込み；(ii)そのメタクリレート末端基をＵＶ光を用いて架橋し；(iii)その架橋されたベシクルを、担体上に、分離されたベシクルがその担体表面上に互いに離れて配列されるような濃度で、デポジットし及び共有結合的に固定化し；そして(iv)「サーフェイスインプリンティング」として知られている方法によって個々のベシクルの間に薄いポリマー層を創生することを含む方法を、記載している。この方法では、アクアポリン水チャネルの遮断を避けるために、固定化されたベシクルのサイズがインプリントされたポリマー層の厚さより大きいことが重要である。その方法は、水濾過の間、高い機械的強度と安定性を示すと言われているが、インプリントされたポリマー層が全ての溶質及び水分子の透過防止に十分なほどには密（dense）ではないことが最も重要な問題であるとも述べられている。更に、そのようなシステムでは、非常に限られた流速しか得ることができない。

ＷＯ０１／３２１４６ ＷＯ２００４／０１１６００ ＷＯ２００９／０７６１７４ ＷＯ２０１０／１４６３６５ ＷＯ２０１３／０４３１１８ ＷＯ２０１３／１８０６５９

Dong et al, J. Mem. Sci. 2012, 409-410, 34-43 Zhao et al, J. Membrane Sci. 2012, 422-428 Xie et al, J. Mater. Chem A, 2013, 1, 7592

従って、膜貫通タンパク質を取り込んだ物理的に強健な（robust）膜、特に水濾過のために効果的に作用するアクアポリンを使用する膜、を導く方法に対する必要性がまだ残っている。

本発明は、多孔質担体及び、その担体表面に共有結合され、その中に取り込まれた膜貫通タンパク質を有する多数のベシクルを含む層を、含有し、該ベシクルは両親媒性のブロックコポリマーから形成されている、濾過膜(filtration membrene)であって、該層内で、ベシクルが互いに共有結合して凝集した集団（coherent mass）を形成していることを特徴とする濾過膜を提供する。その層の厚さは、ベシクルの平均直径よりも大きいであろう。絶対値において、その層の厚さは、好適には、少なくとも０．０４μｍ(microns)である。

本発明は、更に、本発明による濾過膜の製造方法を提供し、その方法は、その中に取り込まれた膜貫通タンパク質を有するベシクルの水性懸濁液を供給し、該ベシクルは反応性末端基を有する両親媒性ブロックコポリマーから形成されている；該ベシクル懸濁液を、多孔質担体の表面上にデポジットし（depositing）；そして異なるベシクル間及びベシクルと該表面の間に、共有結合が形成されるような反応条件を供給することを含む。

好ましくは、その濾過膜は水濾過膜であり、そして好ましくはその膜貫通タンパク質はアクアポリンである。本明細書及び特許請求の範囲を通じて、別段の解釈を要しない限り、濾過膜への言及は、水濾過膜への特定的な言及を含むように解釈すべきであり、膜貫通タンパク質への言及は、アクアポリンへの特定的な言及を含むように解釈すべきである。

上述のシェ（Xie）の方法とは完全に対照的に、本発明必須の特徴は、担体が、多数のベシクルが互いに密に充填したベシクル層を有している（carries）ことである。層中の充填は、例えば、六方密充填（hexagonal close packing）であってよい。担体表面に存在するベシクル層は、ベシクルの平均直径よりも厚く、即ち、それはベシクルの単層により供されるだろう厚さよりも大きな厚さである。その層は、ベシクルの平均直径の少なくとも２倍、例えば少なくとも１０倍、好ましくは少なくとも５０倍、より好ましくは少なくとも１５０倍、及び最も好ましくは少なくとも２００倍に等しい厚さを有するべきことが好ましい。好ましくは、その層は、ベシクルの平均直径の５００倍を超えず、例えば３００倍を超えない。従って、例えば、その層は、ベシクルの平均直径の２〜５００倍、例えば５０〜３００倍、特に２００〜３００倍の厚さを有していてよい。絶対値において、ベシクル層の厚さは、好ましくは少なくとも０．０１μｍ(microns)、例えば少なくとも０．０４μｍ、例えば少なくとも０.１μｍ、例えば少なくとも０．２μｍ、例えば少なくとも２μｍ、好ましくは少なくとも１０μｍ、より好ましくは少なくとも３０μｍ、及び最も好ましくは少なくとも４０μｍである。その層については、特に好ましい最大の厚さは無い。その層は、例えば１００μｍまでの厚さ、例えば６０μｍまでの厚さを有していてよい。よって、例えば、その層は、０．０１〜１００μｍ、例えば０．０４〜１００μｍ、例えば０．２〜１００μｍ、好ましくは１０〜６０μｍ、特に４０〜６０μｍの厚さを有していてよい。

強健性の増加のため、完成した膜内のベシクル層は、好ましくは保護トップコーティング層又は担体層の反対側上に第二の担体層が、供されている。このトップコーティングは、例えば、ローリング工程の間の機械的損傷から追加的に保護する。それは、例えば、親水性ポリマー、例えばポリビニルアルコールを含むことができる。

本発明の方法は、いくつかの異なった方法で行うことができる。第一の好ましい態様では、下記を含む、本発明の膜の製造方法が提供される：
(a)その中に取り込まれた膜貫通タンパク質を有するベシクルの水性懸濁液を供給する、該ベシクルは反応性末端基Ｘを有する両親媒性ブロックコポリマーから形成されている；
(b)ポリマーの末端基Ｘと反応する、少なくとも２個の反応性基Ｙを有する多官能性結合剤を供給する；
(c)ポリマーの末端基Ｘかまたは反応性基Ｙと反応する表面を有する担体の上に、該ベシクル懸濁液及び該多官能性結合剤をデポジットする（depositing）；及び
(d)末端基Ｘと基Ｙとの反応、及び末端基Ｘかまたは基Ｙと該担体表面との反応を引き起こす。

第二の好ましい態様では、下記を含む、本発明の膜の製造方法が提供される：
(a)その中に取り込まれた膜貫通タンパク質を有するベシクルの第一の水性懸濁液を供給する、該ベシクルは反応性末端基Ｘを有する両親媒性ブロックコポリマーから形成されている；
(b)その中に取り込まれた膜貫通タンパク質を有するベシクルの第二の水性懸濁液を供給する、該ベシクルはポリマーの末端基Ｘと反応する反応性末端基Ｙを有する両親媒性ブロックコポリマーから形成されている；
(c)ポリマーの末端基Ｘか又は基Ｙと反応する表面を有する担体の上に、該両ベシクル懸濁液をデポジットする；及び
(d)末端基Ｘと末端基Ｙとの反応、及び末端基Ｘかまたは末端基Ｙと該担体表面との反応を引き起こす。

本発明方法は、任意に結合剤（linker）を介して互いに結合しており、又担体表面とも結合した、物理的に強健な（robust）ポリマーベシクル層に、帰着する。

本発明で用いる全てのブロックコポリマー分子が反応性末端基を有すべきことは、必要ではない。反応性末端基を有するブロックコポリマーの割合は重要ではない。但し、ベシクルの二次的集団内かまたは多官能性結合剤内の反応性基と反応して、凝集した集団を形成するのに十分な基があることを条件とする。一般的には、ベシクルを形成するために用いられるブロックコポリマー分子の少なくとも１０％、例えば少なくとも２０％、例えば少なくとも３０％、例えば少なくとも４０％、例えば少なくとも６０％、又は１００％までが、官能性末端基Ｘ又はＹを有しているだろう。類似して、ただ一種類の末端基Ｘ又はＹが存在していることは、必要ではない。例えば、複数のブロックコポリマーのブレンドを用いることが望ましく、そのコポリマーの一つは一つの反応性末端基Ｘ(1)例えば−ＮＨ_２基を含む末端基を含み、第二のコポリマーは異なる反応性末端基Ｘ(2)を含んでいる。

ある特定のポリマー分子上の末端基は互いに同じであってもよく、それらは異なっていてもよいが、好ましくはそれらは同じである。例えば、一つの末端基が反応性末端基Ｘであってよく、一方他の末端基が非反応性基であってよい。各基の正確な性質は、勿論、方法の性質に依存するし、担体の表面の性質にも依存する。

好適な反応性基としては、アミン基（例えば、カルボン酸基、活性化カルボン酸基及び／又はアジド基と反応性）、カルボン酸基、活性化カルボン酸基及び／又はアジド基（例えば、アミン基Ｙと反応性）、及び「クリックケミストリー」基（例えば、アジド基又はアルキン基、これらはそれぞれアルキン基又はアジド基Ｙと反応性である）を、包含する。アミン基の使用が、特に好ましい。

広範な種類のアミン系末端基を利用でき、そしてこれらは−ＮＨ_２基及び／又は−ＮＨ−基を含むことができる。そのような末端基を有する両親媒性ブロックコポリマーが供給されるとき、そのブロックコポリマーが自己集合してベシクルとなる能力が高められることが見出された：これは驚きであり、一般的に、ベシクル形成に最も影響を与える両親媒性ブロックコポリマーの特性は、(i)そのブロックのサイズと性質及び(ii)そのポリマーの多分散性であることが予期される。

多官能性結合剤を用いるとき、その剤に存在する反応性基は、互いに同じであっても、又はそれらが異なっていてもよい。それらは、ベシクル中に存在する相補的反応性基と及び／又は担体表面と反応するようであるのに違いない。望ましい基は、上述の通りである。多官能性試薬を用いるとき、その試薬は、例えば３又は４個の反応性基を含み得るが、好ましくはそれは２個の反応性基を含み、そしてここでの多官能性試薬へのあらゆる言及は、特に二官能性試薬への言及を含むと解釈されるべきである。

本発明の好ましい態様において、ベシクルはアミン基を包含する反応性基を含む；そして、活性化カルボン酸基又はアジド基例えばフェニルアジド基である相補的反応性基が供される。

本発明の一つの態様において、担体表面は、１以上の工程において、相補的反応性基Ｘ及び／又はＹと反応できる特定の反応性基Ｚを導入するために、官能基化されることができる。好適な基としては、アミン基（例えば、カルボン酸基又は活性化カルボン酸基Ｘ及び／又はＹと反応性）；カルボン酸基又は活性化カルボン酸基（例えば、アミン基Ｘ及び／又はＹと反応性）；及び「クリックケミストリー」基（例えば、アルキン基又はアジド基Ｘ及び／又はＹと反応性のアジド基又はアルキン基）を、包含する。表面の多段階官能基化の一つの例は、酸例えば塩酸を用いて、ポリアクリロニトリル表面を加水分解して、表面にカルボン酸基を導入することであり、それは、続いて、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）を用いて、活性化され、次いで、例えばプロパルギルアミンを用いてアルキン基に、又は例えばアミノ−トリエチレングリコール−アジドを用いてアジド基に、変換されることができる。しかし、本発明の他の態様では、担体表面の官能基化をする必要がないであろう。何故ならばＸ及び／又はＹが担体を形成している物質中に既に存在する基と反応できるからである。例えば、Ｙがアジド基であってよく：そのような基は、一度ＵＶ光で活性化されると反応性が高められて、担体物質中に存在する多くのポリマー中に存在するＣ−Ｈ結合と反応できるようになる。特に、アジド基殊にフェニルアジド基は、ポリスルホンと共有結合できる。ポリスルホンは、後述するように、本発明で用いる好ましい担体物質である。

活性化カルボン酸基に言及した場合、これは、あらゆる従来の活性化カルボン酸基を包含するものと解釈されるべきであり、例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルのような活性化エステル、又は酸ハライドが包含される。そのような活性化技術は、当分野で良く知られている。好ましい態様において、活性化カルボン酸末端基は、カルボン酸基をＥＤＣ及びＮＨＳと反応させることによって調製される。これは、タンパク質のコンジュゲーション及び固定化の分野においてたびたび用いられる良く知られた技術である。カルボキシル基とＥＤＣ及びＮＨＳとの反応によって、アミン反応性のＮＨＳエステルの形成がされる結果となる。

多官能性結合剤を用いる場合、それが、Ｘ基及びＹ基と反応して、ベシクルと一緒に、結合が起きるように、十分に反応できる限りにおいて、その正確な性質は、決定的なことではない。

好適な多官能性結合剤としては、ホモ二官能性クロスリンカー(crosslinkers)、即ち両末端に同じ官能性を有するクロスリンカーを包含する。アミン基と結合できる例としては以下のものを包含する：

(i)ＮＨＳエステル類。代表的エステルは以下のものを含む：

ジスクシンイミジルグルタレート：

ビス（スクシンイミジル）ポリエチレングリコール：
例えば、ビス（スクシンイミジルペンタ（エチレングリコール））；

エチレングリコールビス（スルホスクシンイミジルスクシネート）：

３，３’−ジチオビス（スルホスクシンイミジルプロピオネート）：

ビス（スルホスクシンイミジル）スベレート）：

ジスクシンイミジルタルトレート：

このタイプの試薬は、弱アルカリ性条件下、例えばｐＨ７．２〜８．５、例えばｐＨ７．２〜８．０で、一級アミンと反応して、安定なアミド結合を生じる。反応温度は、典型的には、０〜３０℃の範囲、例えば４〜２５℃である。その反応は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドを生成するが、これは透析又は脱塩によって除去できる。その反応は、例えば、ｐＨ７．２〜８．０のＰＢＳ緩衝液中、室温又は４℃で０．５〜４時間で、行うことができる。

スルホＮＨＳエステルは、ＮＨＳ環上に、−ＳＯ_３基を含んでいる。これは、反応の化学には影響しないが、そのような試薬は水溶性を上昇させる傾向がある。

(ii)イミドエステル類。代表的イミドエステルは以下のもの（しばしば二塩酸塩として得られる）を含む：

ジメチルアジピミデート：

ジメチル３，３’−ジチオビスプロピオンイミデート：

ジメチルスベリミデート：

ジメチルピメリミデート：

ジメチルアジピミデート：

イミドエステルは、一級アミンと反応して、アミジン結合を生じる。一級アミンに対する特異性を確実にするために、反応は、典型的には、ホウ酸緩衝液中で、アミンを含まない条件下（ｐＨ９〜１１、例えばｐＨ１０）で、行われる。

(iii)ゲニピン（genipin）、下記式を有する：

(iv)エポキシド類、例えば下記トリグリシジルアミン：

(v)ジアルデヒド化合物類、例えば、ＨＯＣ-(ＣＨ_２)_ｘ-ＣＨＯ、ここで、ｘは１〜６である。代表的なジアルデヒドとしては、グルタルアルデヒド、スクシンジアルデヒド、グリオキサール、マロンジアルデヒド、及びフタルアルデヒドを包含する。

(vi)ＣＯＯＨ−ＰＥＧ−ＣＯＯＨ。この試薬は水溶性であり、そしてもし望むならばＥＤＣ／ＮＨＳで活性化して、アミンとの反応性を供することができる。

好適な多官能性結合剤としては、ヘテロ二官能性クロスリンカー、即ち両末端に異なる官能性を有するクロスリンカーをも包含する。例としては以下のものを包含する：

１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（通常、塩酸塩の形態で得られる）：

カルビトール：

エポキシド類、例えば、トリグリシドアラミン（triglycidalamine）;
ＣＯＯＨ−ＰＥＧ−ＮＨ_２；
スルホスクシンイミジル ６−（４’−アジド−２’−ニトロフェニルアミノ）ヘキサノエート；
ポリ（２−ヒドロキシエチル−ｃｏ−２−メタクリロキシエチルアスパルタミド）；

Ｎ，Ｎ’−ジスクシンイミジルカーボネート：

ｐ−アジドベンゾイルヒドラジド：

本発明方法は、「クリックケミストリー」を利用でき、それは、例えば、アジドとアルキンの反応を利用できる。例えば、一級アミンとＮＨＳエステルとの反応によって、アルキン基を、基Ｘ又はＹとして、導入できる。多くのアジド−ＰＥＧ−アジドリンカーは、商業的に入手できる。

好ましくは、多官能性結合剤は、(ＣＨ_２)_ｍ鎖を含む、ここでｍは２〜２０、好ましくは３〜１０、特に３〜９である。特に好ましい二官能性結合剤は、市販品のＮ−スルホスクシンイミジル−６−（４’−アジド−２’−ニトロフェニルアミノ）ヘキサノエートである。このものは、下記式を有する：

スルホスクシンイミド基は、活性化されたカルボン酸エステルである反応性基Ｙであり、アミノ基と自発的に反応できる。フェニルアジド基は、光の無い条件下で不活性な基Ｙであるが、ＵＶ光を用いて活性化されたときは、反応性が高くなって、アミン基と容易に反応する。アミン基が無い場合には、活性化された基は、より低い反応性の基とも反応でき、ある環境下においてはＣ−Ｈ結合とさえ反応する；特に、それは、ポリスルホン中の芳香族性Ｃ−Ｈ基と反応することができる。

前述の本発明方法の工程(d)、即ち相補的反応基ＸとＹとの反応、及びＸかまたはＹと担体表面との反応を起こすことを成し遂げる条件は、勿論、様々な反応性基の性質に依存するだろう。いくつかの態様では、反応性基は、好適な条件下に、一度一緒に接触すれば、互いに自発的に反応するだろう。他の態様では、光活性化基が存在しており、そこで反応物が互いに接触され、引き続いて光照射されて反応が起きる。本発明方法の好ましい態様では、末端基Ｘと接触して反応する第一の基Ｙ、及び末端基Ｘ及びＵＶ光で照射される担体表面と反応する第二の基Ｙを有する多官能性試薬を用いて、両機構が結合される。

従って、本発明方法の一つの態様の各工程は、以下の様に行うことができる：
(a)その中に取り込まれた膜貫通タンパク質を有するベシクルの水溶液を供給する、該ベシクルは反応性末端基Ｘを有する両親媒性ブロックコポリマーから形成されている；
(b)ポリマーの末端基Ｘと反応する、少なくとも２個の反応性基Ｙを有する多官能性結合剤好ましくは二官能性結合剤を供給する、基Ｙはポリマーの末端基Ｘと第一の反応条件設定下で反応する第一の反応性基Ｙ(1)、及びポリマーの末端基Ｘと、第一の反応条件設定下では反応しないが、第二の反応条件設定下では反応する第二の反応性基Ｙ(2)を含んでいる；
(b’)第一の反応条件設定下に、該ベシクルの水溶液を該多官能性結合剤と混合して、反応性基Ｙ(1)が、ポリマーの末端基Ｘと反応するようにする；
(c)得られた溶液を、望ましいベシクル層を生成するのに十分な量で、第二の反応性基Ｙ(2)と反応する担体上にデポジットする；及び
(d)第二の反応条件設定を適用することによって、末端基Ｘと第二の反応性基Ｙ(2)との反応、及び第二の反応性基Ｙ(2)と該担体表面との反応を起こさせる。

二つの反応工程を異ならせる、どのような好適な反応条件も使用され得る。例えば、第一の反応条件設定は、第一の温度で基Ｘ及びＹ(1)が反応することを含むことができ、一方第二の反応条件設定が、第二のより高い温度で基Ｘ及びＹ(2)が反応することを含むことができる。しかしながら、好ましい態様においては、Ｘ及びＹ(1)が接触して自発的に、又は必要なら加熱によって、反応し、一方、Ｘ及びＹ(2)が、光照射により活性化したときにのみ反応する。従って、特に好ましい方法は、以下を含む：
(a)その中に取り込まれた膜貫通タンパク質を有するベシクルの水溶液を供給する、該ベシクルは反応性末端基Ｘを有する両親媒性ブロックコポリマーから形成されている；
(b)ポリマーの末端基Ｘと反応する、少なくとも２個の反応性基Ｙを有する多官能性結合剤好ましくは二官能性結合剤を供給する、基Ｙはポリマーの末端基Ｘと接触すると反応する第一の反応性基Ｙ(1)、及びポリマーの末端基Ｘと光照射すると反応する第二の反応性基Ｙ(2)を含んでいる；
(b’)第一の反応性基Ｙ(2)がポリマーの末端基Ｘと反応するような条件下に、該ベシクルの水溶液を該多官能性結合剤と混合する；
(c)得られた溶液を、望ましいベシクル層を生成するのに十分な量で、第二の反応性基Ｙ(2)と反応する担体上にデポジットする；及び
(d)末端基Ｘと第二の反応性基Ｙ(2)との反応、及び第二の反応性基Ｙ(2)と該担体表面との反応を起こすように、光照射を適用する。

特に好ましい態様では、本発明は、以下を含む方法を提供する：
(a)その中に取り込まれた膜貫通タンパク質を有するベシクルの水溶液を供給する、該ベシクルは末端アミン基を有する両親媒性ブロックコポリマーから形成されている；
(b)下記ヘキサノエートのスクシンイミジル基がポリマーの末端アミン基と反応するような条件下で、該ベシクルの水溶液をＮ−スルホスクシンイミジル−６−（４’−アジド−２’−ニトロフェニルアミノ）ヘキサノエートと混合する；
(c)得られた溶液を、担体上にデポジットする；及び
(d)該ヘキサノエートのアジド基が、ポリマーの末端アミン基及び該担体表面と反応を起こすように、該デポジット（deposit）にＵＶ光を照射する。この態様において、好ましくは、ブロックコポリマーは、後述する好ましいポリマーの一つ、特に、アミン末端[(ポリ)２−メチル−２−オキサゾリン][(ポリ)ジメチルシロキサン][(ポリ)２−メチル−２−オキサゾリン]である。

上記の全ての態様において、工程(c)においてデポジットされる懸濁液の量は、担体表面に連続したベシクル層を供するのに十分な量である。一般的には、工程(d)が行われた後に、この層が、ベシクルの平均直径よりも大きい厚さを有する凝集した集団を形成するか、又は絶対値において少なくとも０．０４μｍの厚さを有するようにする。

本発明方法を成し遂げるために、非常に広範囲の反応条件を使用できる。一つの態様において、多官能性結合剤を用いるとき、用いる多官能性結合剤の量は、適度な架橋を確実にするために、存在する反応性基Ｙの全量が、存在するポリマー末端基Ｘの全量の過剰量にあるようにするだろう。ｐＨ、温度及びその他の反応条件の調節は、常法通りであり、当業者が通常実施する範囲内である。

両親媒性ブロックコポリマーは、好適には、親水性及び疎水性ブロックを有するダイブロックコポリマーＡＢ、又は、好ましくは、親水性両末端ブロック及び疎水性内側ブロックを有するトリブロックコポリマーＡＢＡである。ベシクルの形成におけるこのようなコポリマーの使用は、良く知られており、そして非常に広範囲の親水性ポリマー及び疎水性ポリマーがブロックＡ及びＢを形成できる。

疎水性ポリマーとしては、例えば、ポリシロキサン類、例えばポリジメチルシロキサン又はポリジフェニルシロキサン、パーフルオロポリエーテル、ポリスチレン、ポリオキシプロピレン、ポリ酢酸ビニル、ポリオキシブチレン、ポリイソプレン、ポリブタジエン、ポリ塩化ビニル、ポリアルキルアクリレート類、ポリアルキルメタクリレート類、ポリアクリロニトリル、ポリプロピレン、ポリテトラヒドロフラン、ポリメタクリレート類、ポリアクリレート類、ポリスルホン類、ポリビニルエーテル類、及びポリ（プロピレンオキシド）、及びこれらのコポリマー類を包含する。

疎水性セグメントは、好ましくは、大方の量の疎水性モノマーを含んでいる。疎水性モノマーは、典型的には水に不溶性のホモポリマーを与え、そして１０重量％よりも少ない水を吸収し得る。

好適な疎水性モノマーは、ジメチルシロキサン類、Ｃ_１−Ｃ_１８アルキル及びＣ_３−Ｃ_１８シクロアルキルアクリレート類及びメタクリレート類、Ｃ_３−Ｃ_１８アルキルアクリルアミド類及び−メタクリルアミド類、アクリロニトリル、メタクリロニトリル、ビニルＣ_１−Ｃ_１８アルカノエート類、Ｃ_２−Ｃ_１８アルケン類、Ｃ_２−Ｃ_１８ハロアルケン類、スチレン、（低級アルキル）スチレン、Ｃ_４−Ｃ_１２アルキルビニルエーテル類、Ｃ_２−Ｃ_１０パーフルオロ−アルキルアクリレート類及びメタクリレート類、及び対応する部分的フッ素化アクリレート類及びメタクリレート類、Ｃ_３−Ｃ_１２パーフルオロアルキルエチルチオカルボニルアミノエチルアクリレート類及びメタクリレート類、アクリロキシ−及びメタクリロキシアルキルシロキサン類、Ｎ−ビニルカルバゾール、マレイン酸のＣ_１−Ｃ_１２アルキルエステル類、フマリン酸、イタコン酸、メサコン酸、酢酸ビニル、プロピオン酸ビニル、酪酸ビニル、吉草酸ビニル、クロロプレン、塩化ビニル、塩化ビニリデン、ビニルトルエン、ビニルエチルエーテル、パーフルオロヘキシルエチルチオカルボニルアミノエチルメタクリレート、イソボルニルメタクリレート、トリフルオロエチルメタクリレート、ヘキサ−フルオロイソプロピルメタクリレート、ヘキサフルオロブチルメタクリレート、トリストリメチルシリロキシシリルプロピルメタクリレート、及び３−メタクリロキシプロピルペンタメチルジシロキサンである。

疎水性ポリマーとしては、一種類のポリマーを又は一種類のポリマーを超えて、上述の二種類以上のものを含むことができる。

好ましい疎水性ポリマーは、ポリシロキサン、特に（ポリ）ジメチルシロキサンである。

一つのセグメントＢの平均分子量（ｇ／ｍｏｌ）は、好ましくは、約５００〜約５０，０００の範囲内、好ましくは約８００〜約１５，０００の範囲内、より好ましくは約１，０００〜約１２，０００の範囲内、特に好ましくは約５，０００〜約１２，０００の範囲内である。

疎水性セグメントＢに加えて、両親媒性コポリマーは、少なくとも一種、好ましくは二種のセグメントＡを含み、セグメントＡは少なくとも一種の親水性ポリマーを含んでいる。親水性ポリマーは、例えば、ポリオキサゾリン、ポリエチレングリコール、ポリエチレンオキシド、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリアクリルアミド、ポリ（メタ）アクリル酸、ポリエチレンオキシド−ｃｏ−ポリプロピレンオキシドブロックコポリマー、ポリ（ビニルエーテル）、ポリ（Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド）、ポリアクリル酸、ポリアシルアルキレンイミン、ポリヒドロキシアルキルアクリレート類、例えばヒドロキシエチルメタクリレート、ヒドロキシエチルアクリレート、ヒドロキシプロピルアクリレート、及びポリオール類、及びこれらのコポリマーである。

親水性セグメントは、好ましくは、大方の量の親水性モノマーを含んでいる。親水性コモノマーは、典型的には水溶性のホモポリマーを与え、又は少なくとも１０重量％の水を吸収し得る。

好適な親水性モノマーとしては、水酸基−１−置換（hydroxy 1-substituted）低級アルキルアクリレート類及びメタクリレート類、アクリルアミド、メタクリルアミド、（低級アルキル）アクリルアミド類及びメタクリルアミド類、Ｎ，Ｎ−ジアルキル−アクリルアミド類、エトキシ化アクリレート類及びメタクリレート類、ポリエチレングリコール−モノメタクリレート類及びポリエチレングリコールモノメチルエーテルメタクリレート類、ヒドロキシ置換（低級アルキル）アクリルアミド類及びメタクリルアミド類、ヒドロキシ置換低級アルキルビニルエーテル類、ビニルスルホン酸ナトリウム、スチレンスルホン酸ナトリウム、２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸、Ｎ−ビニルピロール、Ｎ−ビニル−２−ピロリドン、２−ビニルオキサゾリン、２−ビニル−４，４’−ジアルキルオキサゾリン−５−オン、２−及び４−ビニルピリジン、合計３〜５個の炭素原子を有するビニル化(vinylically)不飽和カルボン酸、アミノ（低級アルキル）−（ここで、用語アミノは四級アンモニウムをも包む）、モノ（低級アルキルアミノ）（低級アルキル）及びジ（低級アルキルアミノ）（低級アルキル）アクリレート類及びメタクリレート類、アリルアルコール、３−トリメチルアンモニウム ２−ヒドロキシプロピルメタクリレートクロライド（Blemer,QA、例えばNippon Oilから）、ジメチルアミノエチルメタクリレート（ＤＭＡＥＭＡ）、ジメチルアミノエチルメタクリルアミド、グリセロールメタクリレート、及びＮ−（１，１−ジメチル−３−オキソブチル）アクリルアミドを包含する。

そのようなポリマーを製造できる親水性モノマーの特定な例は、環状イミノエーテル類、ビニルエーテル類、エポキシド含有環状エーテル類、環状不飽和エーテル類、Ｎ−置換アジリジン類、β−ラクトン類及びβ−ラクタム類である。更なる好適なモノマーとしては、ケテンアセタール類、ビニルアセタール類及びホスホラン類を包含する。好適な環状イミノエーテル類としては、２−オキサゾリンを包含する。もしも、２位にアルケニル基を有する２−オキサゾリンを、親水性モノマーとして使用すると、両親媒性セグメント化コポリマーのセグメントＡ（側鎖中の）内に、重合性不飽和基が供給されて、重合生成物を得る最終の重合に必要な重合性不飽和基として又はポリマーの調製において直接的架橋の可能性をもたらす付加的重合性不飽和基として、役立つ。最も好ましい環状イミノエーテルは、２−Ｃ_１−３アルキルオキサゾリン、特に２−メチルオキサゾリンである。最も好ましいビニルエーテル類は、メチルビニルエーテル、エチルビニルエーテル及びメトキシエチルビニルエーテルである。

好ましい親水性ポリマーブロックは、（ポリ）２−Ｃ_１−３アルキル−２−オキサゾリン、特に（ポリ）２−メチル−２−オキサゾリンである。

一つのセグメントＡの平均分子量（ｇ／ｍｏｌ）は、好適には、約２００〜約５０，０００の範囲内、好ましくは約８００〜約１５，０００の範囲内、より好ましくは約１，０００〜約１２，０００の範囲内、特に好ましくは約５，０００〜約１２，０００の範囲内である。

重合によるブロックコポリマーの合成は良く知られており、出発セグメント上で共重合される一以上のセグメントの長さは、その共重合のために加えられるモノマー（親水性又は疎水性）の量を調節することによって、及び／又は適当な連鎖停止キャッピング剤の付加によって、容易に制御することができる。この様にして、各セグメントのサイズ及びその割合は、容易に制御できる。

当分野で良く知られているように、親水性及び疎水性ブロックの絶対的及び相対的長さは、ベシクル形成用のコポリマーの適合性を決定するにおいて、重要である（いわゆるポリマー疎水性割合）。更に、各ブロックの長さは、ベシクル壁の厚さが、膜貫通タンパク質がベシクル壁中に、チャネルが封鎖されることなく、容易に取り込まれ得るように、膜貫通タンパク質の長さと広範に相当するようであるべきである。例えば、ベシクル壁の厚さは、１ｎｍ〜５０ｎｍの範囲内であることができる。疎水性ブロックＢの長さは特に重要であり、そしてこれは、好ましくは、１５０反復単位よりも大きくあるべきでない。

本発明で用いるのに特に好ましいブロックコポリマーは、ＰＡＯＸＡ−ａ−ＰＤＭＳ−ｂ−ＰＡＯＸＡ−ａ、特にＰＭＯＸＡ−ａ−ＰＤＭＳ−ｂ−ＰＭＯＸＡ−ａであり、ここで、ＰＡＯＸＡは（ポリ）２−Ｃ_１−３アルキル−２−オキサゾリンであり、ＰＭＯＸＡは（ポリ）２−メチル−２−オキサゾリンであり、そしてＰＤＭＳは（ポリ）ジメチルシロキサンである。好ましくは、各ａは、独立して、５〜１００の間好ましくは１０〜１００の間の数であり、ｂは、５〜１５０の間好ましくは２０〜１５０の間の数である。さまざまなＰＡＯＸＡ−ＰＤＭＳ−ＰＡＯＸＡポリマーが市販されており、そしてその他のものは公知の方法で容易に合成できる。

反応性末端基Ｘは、コポリマーの最初の合成に続いて存在していてもよいし、コポリマー合成に続いて導入されてもよい。例えば、特定のモノマーを用いたとき、例えばポリブタジエン又はポリイソプレンのようなジエンポリマーであるとき、又はもしも、親水性セグメントを製造するために用いるモノマーが不飽和側鎖を含んでいる場合、例えば２−アリル−オキサゾリンである場合には、コポリマーが既に適当な末端基を有することができる。代替的に、適当なキャッピング剤を用いることによって重合を止めたときには、ポリマーが既に反応性末端基を有することができる。もしも、最初の合成に続いて存在していない場合は、適切なブロックの末端で、適当な反応によって反応性基を導入することが可能である。この目的のためには、成長するセグメントの重合を、適当な鎖長に達してその鎖端にキャップされた開始基が存在しているときに、止めることができる。例えば、ヒドロキシスチレン、アリルアルコール、ヒドロキシエチルメタクリレート、プロパルギルアルコール、アリルアミン類及びプロパルギルアミン等の特定の試薬を用いるか、又はＫＯＨ／ＥｔＯＨ又は一級アミン類を用いて、セグメントの成長末端に−ＯＨ又は−ＮＨ−基又は不飽和基を残しておいて、止めることができる。また、水酸基は、共重合において、適当なコモノマー例えば２−ヒドロキシ−アルキルオキサゾリン類を用いることによって、コポリマーに導入することができる。水酸基又は−ＮＨ−基は、次いで、例えば重合性不飽和基を持つイソシアネートと反応させることができる。そのような二官能性化合物の好ましい例は、ビニルイソシアネート、アリルイソシアネート、アクリロイルイソシアネート、スチレンイソシアネート、ビニルベンジルイソシアネート、及びプロパルギルイソシアネートである。他の反応性基は、当業者に知られている方法によって、導入することができる。

特に好ましい態様では、本発明で用いるポリマーは、アミン末端基を有している。最も好ましくは、ポリマーは、アミン末端ＰＡＯＸＡ−ａ−ＰＤＭＳ−ｂ−ＰＡＯＸＡ−ａ、例えば前述のＰＡＯＸＡ−ＰＤＭＳ−ＰＡＯＸＡポリマーの一つでアミン末端基を持っているものである。

アミン末端基としては、−ＮＨ_２基、又は−ＮＨ−基、又は両者を、含み得る。本発明の特に好ましい態様では、両親媒性ブロックコポリマーは、式−ＮＨＲを有する末端基Ｘで終結する。ここで、Ｒは、少なくとも１個、例えば１、２又は３個の−ＮＨ_２基で置換された炭素数１〜６個の直鎖状又は分枝状であってよいアルキル基を表す。好ましくは、そのような末端基Ｘは、式−ＮＨ−ＣＨ−(ＮＨ_２)_２又は、好ましくは、−ＮＨ−(ＣＨ_２)_ｎ−ＮＨ_２を有しており、ここで、ｎは２〜６、好ましくは２〜４の整数、特に２である。そのような末端基は、−ＯＨ末端基を有するポリマーを、適当な反応性アミンＮＨ_２Ｒと反応させることによって、導入することができる。この反応性アミンとしては、例えばジアミン、例えばＨ_２Ｎ−(ＣＨ_２)_ｎ−ＮＨ_２、特にＨ_２Ｎ−(ＣＨ_２)_２−ＮＨ_２、又はトリアミン、例えばＮ([ＣＨ_２]_ｎＮＨ_２)_３又はＣＨ([ＣＨ_２]_ｎＮＨ_２)_３、例えばＣＨ(ＮＨ_２)_３又はトリス(３−アミノプロピル)アミンである。分枝状のオリゴマーイミン類も又使用できる。

ＰＡＯＸＡ−ａ−ＰＤＭＳ−ｂ−ＰＡＯＸＡ−ａのタイプの両親媒性ブロックコポリマーで、ＰＡＯＸＡが（ポリ）２−Ｃ_１−３アルキル−２−オキサゾリンであり、ＰＤＭＳが（ポリ）ジメチルシロキサンであり、−ＮＨ_２基又は−ＮＨ−基の両者、即ち一級及び二級アミン基の両者、特に−ＮＨ−ＣＨ−(ＮＨ_２)_２又は−ＮＨ−(ＣＨ_２)_ｎ−ＮＨ_２を含む、末端基を含むものは、新規であり、我々の同じくペンディング中のレファレンスＮｏ．２２８８３ＷＯの出願においてクレームしている。そのようなポリマーから形成され、その中に取り込まれた膜貫通タンパク質を有するベシクルも又新規であり、我々の同じくペンディング中の出願においてクレームしている。

ブロックコポリマーは、当分野で良く知られている方法で、ベシクルの形態で調製することができる。一般的には、これらの方法は、溶剤置換か又は溶剤を用いない再水和を含む。溶剤置換法においては、ブロックコポリマーは、水と混合する前に、有機溶剤に溶解される。混合後、及び任意に有機溶剤除去後、自発的に自己集合して、結果としてベシクルを生成する。溶剤を用いない再水和においては、乾燥したブロックコポリマーは、水性媒体と接触せしめられ、そこで、水和が起こり、自発的に自己集合したベシクルを結果的に生成する。溶剤を用いない再水和の特別な場合の薄膜（thin-film）再水和方法では、ブロックコポリマーは、有機溶剤に溶解され、次いで薄いフィルムが形成されるような条件下で有機溶剤が除去される。このフィルムは、次いで、水と接触させられて、水和される。

望ましいサイズを有し、低い多分散性のベシクルは、公知の方法、例えば、細孔サイズが分かっている一以上の膜(membranes)を通した、大きい単層及び多層の薄層状多分散ベシクル(uni- and multi-lamellar polydisperse vesicles)の押出によって、得ることができる。トラックエッチドポリカーボネートメンブレン、例えばミリポア社から市販のアイソポア（Isopore、商標）メンブレンは、この目的のために好適である。好適には、本発明で用いるベシクルは、３０〜１０，０００ｎｍ、好ましくは５０〜１０００ｎｍ、より好ましくは１００〜４００ｎｍ、特に１５０〜２５０ｎｍの範囲の平均直径を有している。

ミセルの様な他の自己集合構造よりもむしろベシクルを形成する、公知のＰＡＯＸＡ−ａ−ＰＤＭＳ−ｂ−ＰＡＯＸＡ−ａポリマーの性質は、主に、各ブロックの絶対的及び相対的なサイズに依存する。従って、ポリマーが−ＯＨ基末端であるとき、及び各ブロックが比較的高い分子量であるとき、例えば、ＰＡＯＸＡ_１４ＰＤＭＳ_５５ＰＡＯＸＡ_１４又はより高級であると、ミセルが形成される傾向にあり、これは、もしもベシクルが必要であるならば、より低分子量のポリマーを使用することが必要であることを意味している。驚くべきことに、−ＮＨ_２及び−ＮＨ−基の両者を含む末端基の存在が大きな違いを生じ、そして、そのような末端基を有する、ＰＡＭＯＸＡ−ａ−ＰＤＭＳ−ｂ−ＰＡＯＸＡ−ａ、例えばＰＡＯＸＡ_１４ＰＤＭＳ_５５ＰＡＯＸＡ_１４特にＰＭＯＸＡ_１４ＰＤＭＳ_５５ＰＭＯＸＡ_１４、例えば：
Ｈ_２Ｎ−(ＣＨ_２)_ｎ−ＮＨ−ＰＡＯＸＡ_１４ＰＤＭＳ_５５ＰＡＯＸＡ_１４−ＮＨ−(ＣＨ_２)_ｎ−ＮＨ_２
特に
Ｈ_２Ｎ−(ＣＨ_２)_ｎ−ＮＨ−ＰＭＯＸＡ_１４ＰＤＭＳ_５５ＰＭＯＸＡ_１４−ＮＨ−(ＣＨ_２)_ｎ−ＮＨ_２
の使用は、ベシクル調製のために、特に有用であることが証明された。

全体として、官能基末端ポリマー、特にアミン末端ポリマーの使用は、相補的多官能性結合剤と共に、実用的濾過膜の公知の製造法に比して、大きな利点を与える。

しかし、ベシクルは形成されるが、膜貫通タンパク質特にアクアポリンの存在下で、ベシクル形成工程を行うことができ、これによって、膜貫通タンパク質は、ベシクルの壁中に取り込まれる様になる。一般的に、その工程は、そのタンパク質の完全性及び生物的機能を維持することを助長する界面活性剤の存在下で、行われる。従って、上記再水和工程は、好ましくは界面活性剤も含む膜貫通タンパク質の水溶液を用いて、行うことができる。アクアポリンの使用が好ましく、そしてアクアポリンは、広範な製造条件下に、強健である。

アクアポリンは、生物細胞の膜貫通タンパク質であり、その機能は水を選択的に輸送し他の如何なる分子も通さないことである；そのタンパク質の輸送チャネルは、それを通して、水がどちらの方向にも流れ得る二方向チャネルである。それらは、多くのヒト細胞タイプによって、又細菌及び植物細胞によって、発現されている。アクアポリンタンパク質ファミリーの如何なる異なるメンバーも、本発明に使用することができる。好適なアクアポリンとしては、Aqp4、Aqp1及び、特にAqpZが包含される。アクアポリンは、単量体、二量体、四量体及びさらに高いオリゴマーの形態でも、一次配列の変異、コンジュゲート及び切形(truncated)の変種でも、存在することができる。アクアポリンの生物的機能、即ち選択的水輸送が維持される限り、これらのいずれも、本発明に使用することができる。

望ましい輸送特性を有する他の如何なる膜貫通タンパク質も、本発明に使用することができる。自然に又は非自然に生じる変異体及びそのようなタンパク質のオーソログ（orthologs）又はパラログ（paralogs）を含む、そのような膜貫通タンパク質の変異体を使用することができる。そのようなタンパク質は、例えば、以下のものである：

● モノトピック膜タンパク質（Monotopic Membrane Proteins）
○ シクロオキシゲナーゼ(Cyclooxygenases)
・雄羊プロスタグランジンH2シンターゼ-1 (シクロオキシゲナーゼ-1又はCOX-1): Ovis aries
・雄羊プロスタグランジンH2シンターゼ-1 (COX-1) R120Q/ネイティブヘテロダイマー(Native Heterodimer): Ovis aries
・アスピリンアセチル化(Aspirin Acetylated) COX-1
・シクロオキシゲナーゼ-2: Mus Musculus
○ スクアレン−ホーペンサイクラーゼ(Squalene-Hopene Cyclases)
・スクアレン−ホーペンサイクラーゼ: Alicyclobacillus acidocaldarius
○ モノアミンオキシダーゼ(Monoamine Oxidases)
・モノアミンオキシダーゼ B: ヒトミトコンドリア外膜
・モノアミンオキシダーゼ A: ラットミトコンドリア外膜
・モノアミンオキシダーゼ A: ヒトミトコンドリア外膜
・G110A ミュータント
○ ヒドロラーゼ(Hydrolases)
・脂肪酸アミドヒドロラーゼ: Rattus norvegicus
○ オキシドレダクターゼ(モノトピック)[Oxidoreductases (Monotopic)]
・スルフィド:デシルユビキノンとの複合体におけるキノンオキシドレダクターゼ: Aquifex aeolicus
・電子伝達フラボプロテイン-ユビキノンオキシドレダクターゼ(ETF-QO): Sus scrofa
○ ペプチドグリカングリコシルトランスフェラーゼ(Peptidoglycan Glycosyltransferases)
・ペプチドグリカングリコシルトランスフェラーゼ: Staphylococccus aureus
・ペプチドグリカングリコシルトランスフェラーゼ ペニシリン−結合タンパク質 1a (PBP1a): Aquifex aeolicus
・ペプチドグリカングリコシルトランスフェラーゼ ペニシリン−結合タンパク質1b (PBP1b): Escherichia coli
○ ペプチダーゼ(Peptidases)
・シグナルペプチダーゼ (SPase): Escherichia coli
・シグナルペプチドペプチダーゼ (SppA), ネイティブタンパク質(native protein): Eschericia coli
○ デヒドロゲナーゼ(Dehydrogenases)
・グリセロール-3-ホスフェートデヒドロゲナーゼ (GlpD, ネイティブ): Escherichia coli
○ ジヒドロオロテートデヒドロゲナーゼ(Dihydroorotate Dehydrogenases) (DHODH, class 2)
・ジヒドロオロテートデヒドロゲナーゼ: Escherichia coli
・ジヒドロオロテートデヒドロゲナーゼ: Rattus rattus
・ジヒドロオロテートデヒドロゲナーゼ, アポフォーム(apo form): Homo sapiens
・ジヒドロオロテートデヒドロゲナーゼ: Plasmodium falciparum 3d7
○ ポリメラーゼ(Polymerases)
・TagF テイコ酸ポリメラーゼ: Staphylococcus epidermidis
○ ADP-リボース化ファクター(ADP-Ribosylation Factors)
・ADP-リボース化ファクター (ARF1), ミリストイル化(myristoylated): Saccharomyces cerevisiae
・ADP-リボース化ファクター (ARF1*GTP), ミリストイル化: Saccharomyces cerevisiae
○ イソメラーゼ(Isomerases)
・RPE65 視覚サイクルレチノイドイソメラーゼ: Bos Taurus

● 膜貫通タンパク質：β-バレル(Transmembrane Proteins: Beta-Barrel)
○ β-バレル膜タンパク質：多量体(Beta-Barrel Membrane Proteins: Multimeric)
・ポーリン(Porin): Rhodobacter capsulatus
・ポーリン: Rhodopeudomonas blastica
・OmpK36 オスモポーリン(osmoporin): Klebsiella pneumonia
・Omp32 アニオン選択ポーリン(anion-selective porin): Comamonas acidovorans
・Omp32 アニオン選択ポーリン: Delftia acidovorans
・OmpF マトリックスポーリン(Matrix Porin): Escherichia coli
・OmpC オスモポーリン: Escherichia coli
・OmpG モノメリックポーリン(*monomeric* porin): Escherichia coli
・PhoE: Escherihia coli
・LamB マルトポーリン(Maltoporin): Salmonella typhimurium
・LamB マルトポーリン: Escherichia coli
・LamB マルトポーリン: Escherichia coli
・ScrY スクロース特異的ポーリン(sucrose-specific porin): Salmonella typhimurium
・MspA マイコバクテリアポーリン(mycobacterial porin): Mycobacterium smegmatis
・OprP ホスフェート特異的トランスポーター(phosphate-specific transporter): Pseudomonas aeruginosa
・OprD 塩基性アミノ酸取込みチャネル: Pseudomonas aeruginosa
・OpdK 炭化水素トランスポーター: Pseudomonas aeruginosa
・PorB 外膜タンパク質, 天然構造(native structure): Neisseria meningitides
○ β-バレル膜タンパク質：単量体/二量体(Beta-Barrel Membrane Proteins: Monomeric/Dimeric)
・TolC 外膜タンパク質: Escherichia coli
・TolC 外膜タンパク質, リガンドブロック(ligand blocked): Escherichia coli
・TolC 外膜タンパク質(Y362F, R367E): Escherichia coli
・C2フォーム(Form)
・P2:2:2フォーム
・VceC 外膜タンパク質: Vibrio cholera
・OprM 薬物排出外膜タンパク質: Pseudomonas aeruginosa
・CusC 重金属排出外膜タンパク質: Escherichia coli
・CusBA 重金属流出複合外膜タンパク質: Escherichia coli
・BenF-ライクポーリン(推定): Pseudomonas fluorescens
・OprM 薬物排出外膜タンパク質: Pseudomonas aeruginosa
・apo BtuB コバラミントランスポーター: Escherichia coli
・BtuB: Escherichia coli
・apo BtuB メソ結晶化による(by in meso crystallization): Escherichia coli
・コリシン(Colicin) I 受容体: Escherichia coli
・OmpA: Escherichia coli, 2.5オングストローム
・OmpA ４個の短縮ループと共に(with four shortened loops): Escherichia coli
・β-バレルプラットフォーム(β-barrel platform)(BBP)と呼ばれる
・OmpT 外膜プロテアーゼ: Escherichia coli
・Pla プラスミノーゲン活性化因子(ネイティブ 1): Yersinia pestis
・OmpW 外膜タンパク質: Escherichia coli
・斜方晶形(Orthorhomibic Form)
・三方晶形(Trigonal Form)
・OprG 外膜タンパク質: Pseudomonas aeruginosa
・OmpX: Escherichia coli
・TtoA 外膜タンパク質(OMP): Thermus thermophilus HB27
・OmpLA (PldA) 外膜ホスホリパーゼ A モノマー: Escherichia coli
・OmpLA (PldA) 活性部位変異体(active-site mutant)(N156A): Escherichia coli
・OpcA 接着タンパク質(adhesin protein): Neisseria meningitidis
・NspA 表面タンパク質: Neisseria meningitides
・NalP 自動トランスポーター輸送体ドメイン(autotransporter translocator domain): Neisseria meningitides
・NanC ポーリン(Porin), KdgMポーリンファミリー用モデル(model for KdgM porin family): Escherichia coli
・Hia1022-1098 トリメリック自動トランスポーター(trimeric autotransporter): Haemophilus influenza
・Hia992-1098
・EspP 自動トランスポーター, 開裂後状態(postcleavage state): Escherichia coli
・EstA 自動トランスポーター, フルレングス(full length): Pseudomonas aeruginosa
・PagP 外膜パルミトイルトランスフェラーゼ(palimitoyl transferease): Escherichia coli
・FadL 長鎖脂肪酸トランスポーター: Escherichia coli
・FadL 長鎖脂肪酸トランスポーターA77E/S100R ミュータント: Escherichia coli
・ΔS3 キンク(kink)
・P34A ミュータント
・N33A ミュータント
・ΔNPA ミュータント
・G212E ミュータント
・FadL 長鎖脂肪酸トランスポーター同族体: Pseudomonas aeruginosa
・FauA アルカリギン(alcaligin)外膜トランスポーター: Bordetella pertusssis
・TodX 炭化水素トランスポーター: Pseudomonas putida
・TbuX 炭化水素トランスポーター: Ralstonia pickettii
・Tsx ヌクレオシドトランスポーター(アポタンパク質): Eschericia coli
・FhuA, フェリクロム-鉄受容体: Escherichia coli
・FepA, フェリックエンテロバクチン(Ferric enterobactin) 受容体: Escherichia coli
・FecA, シデロフォア(siderophore)トランスポーター: Escherichia coli
・HasR ヘム取込み受容体: Serratia marcescens
・Ile671Gly ミュータント
・FptA, ピオチェリン(pyochelin)外膜受容体: Pseudomonas aeruginosa
・FpvA, ピオベルジン(Pyoverdine)受容体: Pseudomonas aeruginosa
・FpvA, ピオベルジン受容体アポフォーム(apo form): Pseudomonas aeruginosa
・Pピルスアッシャー(pilus usher)トランスロケーションドメイン(translocation domain), PapC130-640: Escherichia coli
○ β-バレル膜タンパク質：ミトコンドリア外膜(Beta-Barrel Membrane Proteins: Mitochondrial Outer Membrane)
・VDAC-1 電位依存アニオンチャネル(voltage dependent anion channel): Human
・VDAC-1 電位依存アニオンチャネル: Murine
○ Omp85-TpsB外膜トランスポータースーパーファミリー(Omp85-TpsB Outer Membrane Transporter Superfamily)
・FhaC 糸状ヘマグルチニントランスポーター(Filamentous Hemagglutinin Transporter): Bordetella pertussis
・TeOmp85-N POTRA ドメイン: Thermosynechococcus anaOmp85-N Anabaena sp. PCC7120
・BamA: Escherichia coli
・BamE: Escherichia coli
○ ノンコンスティテューティブ。β-シートポアフォーミングトキシン(Non-constitutive. Beta-sheet Pore-forming Toxins)
・α−ヘモリシン(Alpha-hemolysin): Staphylococcus aureus
・LukF: Staphylococcus aureus
・パーフリンゴリシン(Perfringolysin) O (PFO) プロトマー(protomer): Clostridium perfringens
・炭疽病防御抗原(Anthrax Protective Antigen) (PA)及び致死因子(Lethal Factor) (LF) プレチャネル複合体(Prechannel Complex): Bacillus anthraciss
・リンパ球プレフォリンモノマー(Lymphocyte preforin monomer): Mus musculus

● 膜貫通タンパク質：α-ヘリカル(Transmembrane Proteins:Alpha-Helical)
○ ノンコンスティテューティブα-ヘリカルポアフォーミングトキシン(Non-constitutive. Alpha-helical Pore-forming Toxins.)
・細胞溶解素(Cytolysin) A (ClyA, aka HlyE): Escherichia coli
・FraC イソギンチャクからの真核性ポア形成トキシン(eukaryotic pore-forming toxin from sea anemone): Actinia fragacea
○ 外膜タンパク質(Outer Membrane Proteins)
・Wza 莢膜多糖のトランスロコン(translocon for capsular polysaccharides): Escherichia coli
・ポーリンBモノマー: Corynebacterium glutamicum
・Type IV 外膜分泌複合体(secretion complex): Escherichia coli
・バクテリオロドプシン(Bacteriorhodopsin) (BR): Halobacterium salinarium
・ハロロドプシン(Halorhodopsin) (HR): Halobacterium salinarium
・ハロロドプシン(HR): Natronomonas pharaonis
・感覚(Sensory)ロドプシン(Rhodopsin)I(SRI): Anabaena (Nostoc) sp. PCC7120
・感覚ロドプシン II (SRII): Natronomonas pharaonis
・アーカエロドプシン(Archaerhodopsin)-1 (aR-1): Halorubrum sp. aus-1
・アーカエロドプシン-2 (aR-2): Haloroubrum sp. aus-2
・キサントロドプシン(Xanthorhodopsin): Salinibacter ruber
○ Gタンパク質共役受容体(G Protein-Coupled Receptors) (GPCRs)
・ロドプシン: ウシロッドアウターセグメント(Bovine Rod Outer Segment) (Bos Taurus)
・ロドプシン: イカ(Squid) (Todarodes pacificus)
・β1アドレナリン受容体(adrenergic receptor) (engineered): Meleagris gallopavo (七面鳥)
・β2アドレナリン受容体: Homo sapiens
・メチル化β2アドレナリン受容体: Homo sapiens
・A2A アデノシン(adenosine)受容体: Homo sapiens
・CXCR4 ケモカイン(Chemokine)受容体: Homo sapiens
・ドーパミン(Dopamine) D3受容体: Homo sapiens
○ 自律的フォールディング「膜タンパク質」(Autonomously Folding "Membrane Proteins") (Sec-independent)
・ミスティック膜統合タンパク質(Mistic membrane-integrating protein): Bacillus subtilis
○ グリコプロテイン(Glycoproteins)
・グリコホリン(Glycophorin) A膜貫通ドメインダイマー(transmembrane-domain dimer): Homo sapiens
○ スネアプロテインファミリー(SNARE Protein Family)
・シンタキシン(Syntaxin) 1A/SNAP-25/シナプトブレビン（Synaptobrevin）-2 複合体: ratus ratus
○ インテグリン接着受容体(Integrin Adhesion Receptors)
・ヒトインテグリン αIIbβ3 膜貫通細胞質ヘテロダイマー(transmembrane-cytoplasmic heterodimer): Homo sapiens

○ ヒスチジンキナーゼ受容体(Histidine Kinase Receptors)
・ArcB (1-115) 好気性呼吸コントロールセンサー膜ドメイン(Aerobic Respiration Control sensor membrane domain): Escherichia coli
・QseC (1-185) センサータンパク質膜ドメイン(Sensor protein membrane domain): Escherichia coli
・KdpD (397-502) センサータンパク質膜ドメイン: Escherichia coli
○ 免疫受容体(Immune Receptors)
・TCR-CD3複合体の膜貫通ζ-ζダイマー: Homo sapiens
・DAP12 ダイメリック(dimeric): Homo sapiens
○ チャネル：カリウム及びナトリウムイオン選択性(Channels: Potassium and Sodium Ion-Selective)
・KcsA カリウムチャネル, H+ゲート(gated): Streptomyces lividans
・KcsA カリウムチャネル E71H-F103A 不活性化状態ミュータント(inactivated-state mutant) 閉鎖状態(closed state): Streptomyces lividans
・KcsA カリウムチャネル E71I モデルゲーティング(modal-gating)ミュータント: Streptomyces lividans
・KvAP 電位依存性カリウムチャネル(Voltage-gated potassium Channel): Aeropyrum pernix
・Kv1.2 電位依存性カリウムチャネル: Rattus norvegicus
・Kv1.2/Kv2.1電位依存性カリウムチャネル キメラ(chimera): Rattus norvegicus
・F233W ミュータント
・MthK カリウムチャネル, Ca++ゲート(gated): Methanothermobacter thermautotrophicus
・ヒト BKチャネル Ca2+-活性化アパラタス(activation apparatus):Homo sapiens
・Kir3.1-原核(Prokaryotic)Kirキメラ:Mus musculus & Burkholderia xenovornas
・Kir2.2 内向き整流カリウムチャネル(Inward-Rectifier Potassium Channel): Gallus gallus
・KirBac1.1 内向き整流カリウムチャネル: Burkholderia pseudomallei
・MlotiK1 環状ヌクレオチド調節(cyclic nucleotide-regulated) K+-チャネル: Mesorhizobium loti
・mGIRK1 G-タンパク質ゲート(Gated)内向き整流カリウムチャネル: Mus musculus
・NaK チャネル (Na+複合体): Bacillus cereus
・D66/S70E ミュータント
・D66N ミュータント
・D66E ミュータント
・CNG-mimicking NaKチャネルミュータント: Bacillus cereus
・NaK チャネル; K+選択ミュータント: Bacillus cereus
○ チャネル：他のイオンチャネル(Channels: Other Ion Channels)
・GluA2 グルタメート受容体 (AMPA-サブタイプ): Rattus norvegicus
・M2 プロトンチャネル: Influenza A
・M2 プロトンチャネル: Influenza B
・ASIC1 酸センシング(Acid-Sensing)イオンチャネル: Gallus gallus
・ATP-ゲート(gated) P2X4 イオンチャネル (アポタンパク質): Danio rerio (zebra fish)
・ニコチン性アセチルコリン受容体ポア(Pore): Torpedo marmorata
・原核(Prokaryotic)ペンタメリック リガンドゲート(ligand-gated)イオンチャネル (pLGIC): Erwinia chrysanthemi
・原核ペンタメリック リガンドゲートイオンチャネル (GLIC): Gloebacter violaceus
・E221A ミュータント
・原核ペンタメリック リガンドゲートイオンチャネル (GLIC), 野性型(wildtype)-TBSb 複合体: Gloebacter violaceus
・野性型-TEAs複合体
・E221D-TEAs複合体
・野性型-TMAs複合体
・野性型-ブロモリドカイン(bromo-lidocaine)複合体
・野性型-Cd2+複合体
・野性型-Zn2+複合体
・野性型-Cs+複合体
・MscL機械感受性チャネル(Mechanosensitive channel): Mycobacterium tuberculosis
・MscS 電位調節(voltage-modulated)機械感受性チャネル: Escherichia coli
・CorA Mg2+トランスポーター: Thermotoga maritime
・MgtE Mg2+トランスポーター: Thermus thermophiles
・SLAC1 アニオンチャネル, TehA ホモログ(homolog) (野性型): Haemophilus influenza
・F262A ミュータント
・F262L ミュータント
・F262V ミュータント
・G15D ミュータント
○ チャネル：プロテインコンダクティング(Channels: Protein-Conducting)
・SecYEβプロテインコンダクティングチャネル: Methanococcus jannaschii
○ チャネル：アクアポリン及びグリセロポリン(Channels: Aquaporins and Glyceroporins)
・AQP0 アクアポリン水チャネル: ウシ水晶体
・AQP1 アクアポリン水チャネル: ヒト赤血球
・AQP1 アクアポリン水チャネル: ウシ赤血球
・AQP4 アクアポリン水チャネル: ラットグリア細胞(glial cells)
・S180D ミュータント
・AQP4 アクアポリン水チャネル: Human
・AQP5 アクアポリン水チャネル (HsAQP5): Human
・AqpM アクアポリン水チャネル: Methanothermobacter marburgensis
・AqpZ アクアポリン水チャネル: Escherichia coli
・AqpZ アクアポリン (C9S/C20S), T183C ミュータント: Escherichia coli
・L170C ミュータント
・AqpZ アクアポリン ミュータント F43W : Escherichia coli
・H17G/T183F ミュータント
・F43WH174G/T183F ミュータント
・SoPIP2;1 植物アクアポリン: Spinacia oleracea
・GlpF グリセリンファシリテーターチャネル(glycerol facilitator channel): Escherichia coli
・GlpF グリセリンファシリテーターチャネル, W84F/F200T-ミュータント: Escherichia coli
・PfAQP アクアグリセロポリン(aquaglyceroporin): Plasmodium falciparum
・Aqy1 イーストアクアポリン (pH 3.5): Pischia pastoris
○ チャネル：ホルメートニトレートトランスポーターファミリー(Channels : Formate Nitrate Transporter (FNT) Family)
・FocA, ペンタメリックアクアポリン様ホルマートトランスポーター(formate transporter): Escherichia coli
・FocA ホルマート無しのホルマートトランスポータ(formate transporter without formate): Vibrio cholera
・FocA ホルマートトランスポータ: Salmonela typhimurium
○ チャネル：尿素トランスポーター(Channels: Urea Transporters)
・尿素トランスポーター: Desulfovibrio vulgaris
・コネキシン(Connexin) 26 (Cx26; GJB2) ギャップ結合(gap junction): Human
○ チャネル：Amt/Rhタンパク質(Channels: Amt/Rh proteins)
・AmtB アンモニアチャネル(ミュータント): Escherichia coli
・AmtB アンモニアチャネル(野性型): Escherichia coli
・H168E ミュータント
・H168A ミュータント
・H168F ミュータント
・H318A ミュータント
・H318 ミュータント
・H318F ミュータント
・H168A/H318A ミュータント
・Amt-1 アンモニアチャネル: Archaeoglobus fulgidus
・Rh タンパク質, アンモニア又はCO2チャネルの可能性: Nitrosomonas europaea
・Human Rh C グリコプロテインアンモニアトランスポーター: Homo sapiens
○ 膜内プロテアーゼ(Intramembrane Proteases)
・GlpG ロンボイドファミリー(rhomboid-family)膜内プロテアーゼ: Eschericia coli
・W136A ミュータント
・S201T 活性部位(Active-Site) ミュータント
・GlpG ロンボイドファミリー膜内ペプチダーゼ: Haemophilus influenzae
・Site-2 プロテアーゼ (S2P). 膜内メタロプロテアーゼ: Methanocaldococcus jannaschii
・シグナルペプチドペプチダーゼ (SppA), ネイティブタンパク質(native protein): Escherichia coli
○ 膜結合メタロプロテアーゼ(Membrane-Bound Metalloproteases)
・apo-FtsH ATP-依存メタロプロテアーゼ: Thermotoga maritima

○ H+/Cl-交換トランスポーター(H+/Cl- Exchange Transporters)
・H+/Cl-交換トランスポーター: Salmonella typhimurium
・H+/Cl-交換トランスポーター: Escherichia coli
・E148A ミュータント
・E148Q ミュータント
・S107A/E148Q/445A ミュータント
・モノメリック H+/Cl-交換トランスポーター: Escherichia coli
・+/Cl-真核(Eukaryotic)交換トランスポーター: Cyanidioschyzon merolae
・H+/Cl-真核交換トランスポーター: Synechocystis sp. pcc 6803
○ 細菌の水銀無毒化タンパク質(Bacterial Mercury Detoxification Proteins)
・MerF Hg(II)トランスポーター: Morganella morganii
○ マルチドラッグ流出トランスポーター(Multi-Drug Efflux Transporters)
・AcrB 細菌のマルチドラッグ流出トランスポーター: Escherichia coli
・AcrB 細菌のマルチドラッグ流出トランスポーター, アポタンパク質, N109A ミュータント: Escherichia coli
・AcrB 細菌のマルチドラッグ流出トランスポーター, D407A ミュータント: Escherichia coli
・MexB 細菌のマルチドラッグ流出トランスポーター: Pseudomonas aeruginosa
・CusA メタルイオン流出ポンプ: Escherichia coli
・EmrE 細菌のマルチドラッグ流出トランスポーター: Escherichia coli
・NorM マルチドラッグ及びトキシン化合物排出 (MATE) トランスポーター(アポフォーム): Vibrio cholera
○ エイコサノイド及びグルタチオン代謝における膜結合タンパク質(Membrane-Associated Proteins in Eicosanoid and Glutathione Metabolism) (MAPEG)
・ミクロソームプロスタグランジン(Microsomal Prostaglandin) E シンターゼ 1: Human
・５−リポキシゲナーゼ−活性化タンパク質 (FLAP)とBound MK-591インヒビター: Human
・ロイコトリエン(Leukotriene) LTC4シンターゼ: Human
○ メジャーファシリテータースーパーファミリートランスポーター(Major Facilitator Superfamily (MFS) Transporters)
・LacY ラクトースパーミアーゼ(Lactose Permease)トランスポーター (C154G ミュータント): Escherichia coli
・LacY ラクトースパーミアーゼ(野生型)とTDG: Escherichia coli
・FucP 外向きコンホメーション(outward-facing conformation)のフコーストランスポーター: Escherichia coli
・N162A ミュータント
・GlpT グリセロール-3-ホスフェートトランスポーター: Escherichia coli
・EmrD 多剤(Multidrug)トランスポーター: Escherichia coli
・PepTSo オリゴペプチド-プロトン同伴輸送(symporter): Shewanella oneidensis
○ 溶質ナトリウム同伴輸送ファミリー(Solute Sodium Symporter (SSS) Family)
・vSGLT ナトリウムガラクトース(Sodium Galactose)トランスポーター: Vibrio parahaemolyticus
・K294A ミュータント
○ 核酸塩基カチオン共輸送-1ファミリー(Nucleobase-Cation-Symport-1 (NCS1) Family)
・Mhp1 ベンジル-ヒダントイントランスポーター: Microbacterium liquefaciens
○ ベタイン/コリン/カルニチントランスポーターファミリー(Betaine/Choline/Carnitine Transporter (BCCT) Family)
・BetP グリシンベタイントランスポーター: Corynebacterium glutamicum
・CaiT カルニチントランスポーター: Escherichia coli
・CaiT カルニチントランスポーター: Proteus mirabilis
○ アミノ酸/ポリアミン/オルガノカチオンスーパーファミリー(Amino Acid/Polyamine/Organocation (APC) Superfamily)
・AdiC アルギニン:アグマチンアンチポーター: Escherichia coli
・N22A, L123W ミュータント
・N101A ミュータント
・apo ApcT Na+-インディペンデント(independent)アミノ酸トランスポーター: Methanocaldococcus jannaschii
○ アミノ酸二次トランスポーター(Amino Acid Secondary Transporters)
・LeuTAa ロイシントランスポーター: Aquifex aeolicus
・野性型 LeuT トランスポーター: Aquifex aeolicus
・E290S ミュータント
・ミュータント LeuT トランスポーターと窒素酸化物スピンラベル(Spin Label) (F177R1): Aquifex aeolicus
・I204R1 ミュータント
・グルタメートトランスポーターホモログ(Glutamate Transporter Homologue) (GltPh): Pyrococcus horikoshii
・アスパルテート(Aspartate)トランスポーター Li+-結合状態(GltPh): Pyrococcus horikoshii
○ カチオン拡散ファシリテーターファミリー(Cation Diffusion Facilitator (CDF) Family)
・YiiP 亜鉛トランスポーター: Escherichia coli
○ アンチポーター(Antiporters)
・NhaA Na+/H+アンチポーター: Escherichia coli
・ミトコンドリアADP/ATPキャリア: ウシ心臓ミトコンドリア
○ エネルギー-カップリングファクタートランスポーター(Energy-Coupling Factor (ECF) Transporters)
・RibU, リボフラビントランスポーターのS成分: Staphylococcus aureus

○ ATP結合カセットトランスポーター(ATP Binding Cassette (ABC) Transporters)
・BtuCD ビタミンB12トランスポーター: Escherichia coli
・Sav1866 多剤トランスポーター: Staphylococcus aureus
・モリブデン酸塩トランスポーター ModB2C2: Archaeoglobus fulgidus
・ModBC モリブデン酸塩ABCトランスポーター: Methanosarcina acetivorans
・HI1470/1 推定(Putative) メタルキレートタイプABCトランスポーター: Haemophilus influenza
・MsbA リピド(Lipid) "フリッパーゼ(flippase)"とbound AMPPNP: Salmonella typhimurium
・P-グリコプロテイン(Glycoprotein): Mus musculus (マウス)
・MalFGK2-MBP マルトース取込みトランスポーター複合体: Escherichia coli
・MetNI メチオニン取込みトランスポーター複合体: Escherichia coli
・FbpC 鉄イオン(ferric iron)取込みトランスポーター ヌクレオシド結合ドメイン: Neisseria gonorrhoeae
○ K+トランスポーターのスーパーファミリー(Superfamily of K+ Transporters) (SKT proteins)
・TrkH カリウムイオントランスポーター: Vibrio parahaemolyticus
・カルシウムATPアーゼ: ウサギ筋小胞体(sarcoplasmic reticulum)
・Na,K-ATPアーゼ: ブタ腎臓
・Na,K-ATPアーゼ: サメ
・Na,K-ATPアーゼ制御タンパク質 FXYD1: Human
・ホスホランバン(Phospholamban)ホモペンタマー: ヒト筋小胞体
・形質膜(Plasma Membrane) H+-ATPアーゼ: Arabidopsis thaliana
○ V−タイプATPアーゼ(V-type ATPase)
・VタイプNa+-ATPアーゼのロータ(Rotor): Enterococcus hirae
・V1−ATPアーゼ複合体: Thermus thermophiles
・A3B3 V1−ATPアーゼの複合体: Thermus thermophilus
○ F−タイプATPアーゼ(F-type ATPase)
・ウシ心臓ミトコンドリアからのF1−ATPアーゼ: Bos Taurus
・ATP シンターゼ(F1c10): S. cerevisiae
・F1 ATPアーゼ: S. cerevisiae
・Na+-依存性F-ATPシンターゼのロータ(Rotor) (c11): Ilyobacter tartaricus
・ホウレンソウ葉緑体のH+-依存性F-ATPシンターゼのロータ(Rotor) (c14): Spinacia oleracea
・好アルカリ性シアノバクテリアのH+-依存性F-ATPシンターゼのロータ(Rotor) (c15): Spirulina platensis
・H+-依存性F-ATPシンターゼのロータ(Rotor) (c13): Bacillus pseudofirmus
・H+-依存性F-ATPシンターゼのペリフェラルストーク(Peripheral stalk): Thermus thermophilus
○ ホスホトランスフェラーゼ(Phosphotransferases)
・ジアシルグリセロールキナーゼ(DAGK): Escherichia coli
○ ヒドロラーゼ(Hydrolases)
・エストロンスルファターゼ(Estrone Sulfatase): ヒト胎盤

○ オキシゲナーゼ(Oxygenases)
・粒状メタンモノオキシゲナーゼ(pMMO): Methylococcus capsulatus
・粒状メタンモノオキシゲナーゼ(pMMO): Methylosinus trichosporium OB3b
○ オキシドレダクターゼ(Oxidoreductases)
・スルフィド(Sulfide):キノンオキシドレダクターゼ: Aquifex aeolicus
・電子伝達フラボプロテイン-ユビキノンオキシドレダクターゼ (ETF-QO): Sus scrofa
・グリセロール-3-ホスフェートデヒドロゲナーゼ (GlpD, ネイティブ): Escherichia coli
・NarGHI 硝酸レダクターゼA: Escherichia coli
・K86A ミュータント
・H66Y ミュータント
・NrfH シトクロムCキノール(Quinol)デヒドロゲナーゼ: Desulfovibrio vulgaris
・DsbB-DsbA ペリプラズムオキシダーゼ複合体: E. coli
・DsbB-Fab 複合体: Eschericia coli
・wtDsbB-DsbA(Cys133A)-Q8 複合体: E. coli
・ビタミンK エポキシドレダクターゼ: Synechococcus sp.
○ Mo/W ビス-MGDオキシドレダクターゼ (Mo/W bis-MGD Oxidoreductases)
・ポリスルフィドレダクターゼ PsrABC (ネイティブ): Thermus thermophiles
○ 電子伝達系複合体：複合体I(Electron Transport Chain Complexes: Complex I)
・複合体 Iメンブレンドメイン: Escherichia coli
・複合体 I コンプリート(complete): Thermus thermophiles
○ 電子伝達系複合体:複合体II(Electron Transport Chain Complexes:Complex II)
・ネイティブ フマル酸塩(Fumarate)レダクターゼ複合体: Escherichia coli
・フマル酸塩レダクターゼ複合体: Wolinella succinogenes
・ギ酸塩(Formate)デヒドロゲナーゼ-N: Escherichia coli
・コハク酸塩(Succinate)デヒドロゲナーゼ (複合体 II): Escherichia coli
・コハク酸塩: ユビキノンオキシドレダクターゼ (SQR, 複合体 II): ブタ心臓ミトコンドリア
・コハク酸塩: ユビキノンオキシドレダクターゼ (SQR, 複合体 II): ニワトリ心臓ミトコンドリア
○ 電子伝達系複合体：複合体III(Electron Transport Chain Complexes: Complex III) [シトクロムbc 1(Cytochrome bc1)]
・シトクロム bc1: Bos Taurus
・シトクロム bc1: Gallus gallus
・シトクロム bc1: Sarcomyces cerevisiae
・シトクロム bc1: Rhodobacter Sphaeroides
○ 電子伝達系複合体：酸素光合成のシトクロムb6f(Electron Transport Chain Complexes: Cytochrome b6f of Oxygenic Photosynthesis)
・シトクロム b6f複合体: Mastigocladus laminosus
・シトクロム b6f複合体: Chlamydomonas reinhardtii
・シトクロム b6f複合体: Nostoc sp. PCC 7120
○ 電子伝達系複合体：複合体IV(Electron Transport Chain Complexes: Complex IV) [シトクロムCオキシダーゼ (Cytochrome C Oxidase)]
・シトクロムCオキシダーゼ, aa3: Bos taurus (ウシ) 心臓ミトコンドリア
・シトクロムCオキシダーゼ, aa3: Paracoccus denitrificans
・N131D ヴァリアント(Variant)
・シトクロムオキシダーゼ, cbb3: Pseudomonas stutzeri
・シトクロム ba3: Thermus thermophiles
・シトクロムCオキシダーゼ 野性型: Rhodobacter sphaeroides
・ユビキノンオキシダーゼ, シトクロム bo3: E. coli
○ 酸化窒素レダクターゼ(Nitric Oxide Reductases)
・酸化窒素レダクターゼ: Pseudomonas aeruginosa
○ 光化学系(Photosystems)
・光化学系 I: Thermosynechococcus elongates
・光化学系 I (植物): Psium sativum
・光化学系 II: Thermosynechococcus elongates
・光化学系 II: Thermocynechococcus vulcanus
○ 集光性複合体(Light-Harvesting Complexes)
・集光性複合体: Rhodopseudomonas acidophila
・集光性複合体: Rhodospirillum molischianum
・集光性複合体 LHC-II, ホウレンソウ光化学系 II: Spinacia oleracia
・集光性複合体 CP29, ホウレンソウ光化学系 II: Spinacia oleracia
・集光性複合体 LHC-II, エンドウ光化学系 II: Pisum sativum
○ 光合成反応中心(Photosynthetic Reaction Centers)
・光合成反応中心: Blastochloris viridis
・光合成反応中心: Rhodobacter sphaeroides
・光合成反応中心: Thermochromatium tepidum

担体は、任意の好適な多孔質物質から、調製することができる。例えば、逆浸透膜又は限外濾過膜において用いられるような、従来の膜担体に基づくことができる。かかる担体としては、例えば、ポリオレフィン、セルロース、再生セルロース、酢酸セルロース、ポリアクリロニトリル、ポリエーテルスルホン、又はポリスルホンから、調製することができる。本発明の好ましい態様では、該担体は、ポリスルホンから調製される。

担体膜の化学的官能性は、低分子量であっても高分子であってもよい添加物の形態で、注型ドープ（casting dope）に届けることができ、或いは担体表面の官能基化、例えば化学的処理、グラフト重合又はプラズマ重合によって、もたらし得る。これらの手段によって、例えば以下の担体の化学的変換を果たすことができる：アミン基のカルボン酸基への変換、又はその逆；アルデヒドのアミンへの変換；及び水酸基のカルボン酸基への変換。全てのこの様な反応は、当分野で良く知られている。

多孔質限外濾過膜は、例えば、ポリマーを溶解した溶液を、非常に遅い様式で溶剤の蒸発を制御する一連の空気流ダクトの下を、通過させるエアーキャスティング（air casting）；溶解したポリマーを、移動ベルト上に広げて、液体バス中を貫流させて、バス中の液体をラッカー中の溶剤と交換させ、そして細孔（pores）の形成を起こさせる溶剤又はエマーションキャスティング（solvent or emersion casting）；与えられた溶剤系におけるポリマーの溶解性を駆り立てる（drive）ために、熱を用いるサーマルキャスティング（thermal casting）;によって調製することができる。ラッカーは、次いで、冷却されている移動ベルト上に、キャストされる。ラッカー中の熱を冷して、沈殿を起こさせ始め、そして細孔（pores）を形成させる。その方法に典型的に使用される物質としては、限定されるものではないが、再生セルロース、硝酸セルロース、酢酸セルロース、ポリアミド、ポリスルホン、ポリ（エーテルスルホン）、ポリカーボネート、ポリ（エーテルイミド）、ポリ（２，６−ジメチル−１，４−フェニレンオキシド）、ポリイミド、ポリ（フッ化ビニリデン）、ポリテトラフルオロエチレン、ポリプロピレン、ポリアクリロニトリル、ポリ（メチルメタクリレート）、ポリビニルアルコール、及びポリジメチルシロキサンを包含する。キャストの形態（morphology）は、最終モジュールの形状（configuration）によって、調節される。それは、例えば、らせん状に巻きとったエレメント用の平面シート；中空繊維エレメント用の中空繊維；又は管状であってよい。

ベシクルの凝集した集団を含む層を有する膜であって、該層が規定の厚さを有するものの製造は、担体に適用されるベシクル溶液中に存在するベシクルの濃度を調節することによって、及び／又は担体上にデポジットする溶液の量によって、達成することができる。

Xie et al, J. Mater. Chem A, 2013, 1, 7592は、ポリマーベシクルの調製中に架橋することを含む方法を開示するが、この架橋は、そのポリマーベシクルの構造や寸法を変えるものではなく（２欄、ｐ７５９６、最初の段落）、常に、本発明のＸ基に相当する架橋性末端基の間の内部架橋である。類似して、ＷＯ０１／３２１４６に開示された架橋は、常に内部架橋である。本発明のベシクルにおいても、存在する様々な基の性質に依存して、内部架橋を起こすことは勿論可能であるが、好ましくは多官能性結合剤を介して、外部架橋も又起こることが本発明の本質的な特徴である。Xie et al,によって及びZhao et al,のJ. Membrane Sci. 2012, 422-428及びＷＯ２０１３／０４３１１８によって開示された各方法に対して、本発明の有利な点は、ポリマーベシクルの壁中に埋め込まれた膜貫通タンパク質を通じる以外には、膜を通じる如何なる可能な経路も最小化されており、その一方、担体膜の単位表面積当りの多数の可能な膜貫通タンパク質が供されているので、膜を通じた流量（flux）が最大化されていることにある。その方法は技術的に簡便であり、そして得られた膜は物理的に強健である。

実施例１の工程１で調製したポリマーのＮＭＲスペクトルを示した図である。 実施例２の工程４の分画分子量の実験結果を示した図である。 実施例１の工程５の流量試験の実験結果を示した図である。 実施例１で調製した膜の走査型電子顕微鏡写真を示した図である。 実施例１で調製した膜の走査型電子顕微鏡写真を示した図である。 実施例２の動的光散乱の測定結果を示した図である。 ７Ａ及び７Ｂは、実施例４で調製したベシクルのＬＳＭの画像の顕微鏡写真を示した図である。 実施例４で記載した様に、ベシクルにアクアポリンＺタンパク質を取り込んだ影響を示したグラフの図である。 実施例４の膜の顕微鏡写真を示した図である。 実施例４の膜におけるポリブタジエンの内部架橋の影響を示した図である。

以下の実施例は、本発明を説明するものである。

実施例１
原料等:
● ２−メチル−２−オキサゾリン, シグマ社
● トリエチルアミン, シグマ社
● ヘキサン, 無水, シグマ社
● エチレンジアミン, シグマ社
● トリフルオロメタンスルホン酸, シグマ社
● 酢酸エチル, シグマ社
● アクアポリン−Ｚストック溶液 １％オクチルグルコシド及び１００ｍＭ ＮａＭＰＯＳ緩衝液（ｐＨ７．５）中１ｍｇ／ｍｌ
● １００ｍＭ ＮａＭＰＯＳ緩衝液（ｐＨ７．５）
● クロロホルム（純度９８％以上(Puriss)）
● オクチルグルコシド(Anatrace社)
● アミン官能性ポリマーベシクル ＮａＭＯＰＳ中１０ｍｇ／ｍｌ
● ＰｏＰＲ(タンパク質に対するポリマーの割合, 質量)
● Ｎ−スルホスクシンイミジル−６−（４’−アジド−２’−ニトロフェニルアミノ）ヘキサノエート, sulfo-SANPAH (Pierce; 製品No. 22589)
● デキストラン(Dextrans) (American Polymer Standards Corporation)
● ３６５ｎｍＵＶランプ (Entela UVP)
● ４７ｍｍメンブレンスタンプ(Membrane stamp)
● ２５ｍｍメンブレンスタンプ
● ポリスルホン膜(membrane); 細孔径(pore size)１５０ｎｍ(分画(cut-off)１０００ｋＤａ超)

１）ポリマーの調製−一級／二級−アミン末端ポリ−２−メチルオキサゾリン−ポリ−ジ−メチル−シロキサン−ポリ−２−メチルオキサゾリン（ＰＭＯＸＡ−ＰＤＭＳ−ＰＭＯＸＡ）
工程ａ）．α，ω−ヒドロキシ−ブチル−ポリ−ジ−メチル−シロキサン（ＰＤＭＳ）の合成：
分子量４０００ｇ／ｍｏｌを目標として、９３．０３ｇ（０．３４モル）のオクタメチルシクロテトラシロキサン及び６．９７ｇ（０．００２５モル）の１，３−ビス（ヒドロキシブチル）−テトラメチルジシロキサンを、アルゴン吸気口、温度計及び凝縮器を備えた三つ口丸底パイレックス(Pyrex)反応器中に、仕込んだ。トリフルオロ酢酸６．５５ｇ（０．０５７５５モル）を加えた。反応混合物を、６０℃で４８時間加熱した。この時間後、過剰のトリフルオロ酢酸を、水抽出物が中性になるまで、蒸留水で抽出した。次いで、反応混合物を、高真空下にストリップオフさせて、環状副生物を除去した。エステル基を、ＴＨＦ及び同容量の５％炭酸ナトリウム水溶液中で、４０〜４５℃で４８時間の弱塩基触媒加水分解によって、更にアルコールに変換した。有機相及び水相を、分離した。ＴＨＦを留去することによって、８３．７２ｇの生成物を回収した。生成物は、プロトンＮＭＲで分子量を、及びクロロホルム中のＧＰＣで分子量分布を、評価された。

工程ｂ）．一級／二級−アミン末端ＰＭＯＸＡ−ＰＤＭＳ−ＰＭＯＸＡの合成
上記工程ａにあるようにして合成されたヒドロキシル末端ＰＤＭＳを、ポリＰＭＯＸＡ−ＰＤＭＳ−ＰＭＯＸＡ両親媒性ブロックコポリマーの合成に用いた。

５０ｇ（０．０１２モル）のＰＤＭＳを、三つ口丸底フラスコ中で、高真空下に、２４時間保持した。次のステップで、反応フラスコを、乾燥アルゴンで満たし、ポリマーを乾燥ヘキサン（２００ｍｌ）に溶解し、隔膜（septum）を通して三つ口フラスコに加えた。次いで、冷却した（０〜５℃）ＰＤＭＳを、２．４５ｇ（０．０２４モル）のトリエチルアミンの存在下に、６．６２ｇ（０．０２３４６モル）のトリフルオロメタンスルホン酸無水物を滴下して加えることによって活性化させ、そして３時間後反応させた。活性化されたＰＤＭＳを、アルゴン下に更に濾過し、減圧下にヘキサンを除去した。２５０ｍｌの乾燥酢酸エチルを加えて活性化されたポリマーを再溶解し、そして２３．５ｇ（０．２７モル）の乾燥２−メチルオキサゾリンを、４０℃で加えて、２−メチルオキサゾリンの開環重合を開始させた。アルゴン下で１２時間の反応後、停止剤として、３倍過剰の４．１４ｇ（０．０６９モル）のブチルジアミンを加えた。高真空下に生成物を回収し、プロトンＮＭＲ（図１に示した）で分子量を、及びクロロホルム中のＧＰＣで分子量分布を、評価した。生成物は、エタノール中に１００％溶解し、ヘキサン中に９９．５％溶解しなかった。残りの０．５％は、プロトンＮＭＲに示される様に、未反応ＰＤＭＳであることが分かった。

２）．ポリマーベシクル／プロテオ(proteo)−ベシクルの調製：
５０ｍｇのＡＢＡブロックコポリマーを、丸底フラスコ（パイレックス(Pyrex)１００ｍｌ）中で、２ｍｌのクロロホルム中に溶解した。次いで、クロロホルムを高真空下に除去して、ポリマーの薄いフィルムを作成した。このフィルムを、５ｍｌ緩衝液（コントロール）か又は５ｍｌアクアポリン−Ｚストック水溶液で、水和し、終夜撹拌した。これらのサンプルにおいて、加えるタンパク質の量を、タンパク質に対するポリマーの割合で、１:１〜１：１２００で変化させた。次いで、界面活性剤を、ＮａＭＯＰＳ緩衝液中で、３０ｋＤａ透析膜中で透析して除去した。次に、得られた生成物を、トラックエッチド膜（track-etched membranes）を通して、均一な２００ｎｍのサイズに押し出した。

３）．被覆(Coating)
このステップでは、デポジットされたベシクルの濃度を一定に保って、動的光散乱法(マルバーン社、ゼータサイザーナノ)において、カウントレート（250kcps）を、静的アテニュエーター（static attenuator）と調和させることによって、モニターした。

Sulfo-SANPAH(SS)溶液（１００ｍＭ ＮａＭＯＰＳ（ｐＨ７．５）中１０ｍＭ）を、ステップ（１）にあるように調製したベシクルと、光の無い状態で、反応させた（２５０μＬのベシクル溶液を５０μＬのＳＳと、１５分間結合させた）。一連の４７ｍｍポリスルホン膜（(NanoH2O Inc製、１５０ｎｍ）を、打ち抜きプレスでカットし、テフロン膜ホルダー内に置き、脱イオン水ですすいだ。過剰な水を圧縮空気で除去し、そして各３００μＬのＳＳ−活性化ベシクル／プロテオ−ベシクル溶液を、ポリスルホン担体膜上に置いた。その膜ホルダーを、次いで、光源から約５ｃｍのＵＶ光下に置き、そして防護のために３０分間ホイルでカバーした。次に、１ｍｌのピペットを用いて、膜表面に触れることなく、過剰な反応物を膜表面から除いた。上記各ステップを３回繰り返し、膜をホルダーから取り出し、２５ｍｍ直径の膜サンプルを、打ち抜きプレスを用いて、被覆された部分から、カットした。次いで、振動テーブル上で、これらを、過剰な１００ｍＭ ＮａＭＯＰＳ（ｐＨ７．５）中で、試験前に、少なくとも１時間すすいだ。

４）．分画分子量の実験
ステップ（２）の２５ｍｍの各サンプルについて、それらの分画分子量、即ち与えられた分子量の少なくとも９０％の分子がその膜によって保持されるポイントを測定することによって、高分子物質を保持する能力を試験した。

リン酸緩衝液（０．０３Ｍ Ｎａ_２ＨＰＯ_４＋０．０３Ｍ ＫＨ_２ＰＯ_４）を、０．２μｍの膜で予め濾過し、溶液の調製に使用する前に、ｐＨを７．２に合わせた。標準デキストラン（ＤＸＴ）を、リン酸緩衝液に溶解した（ＤＸＴ１６５ｋＤａ，３２５ｋＤａ，５４８ｋＤａ，１３００ｋＤａ，及び５０００ｋＤａ，ＤＸＴ０．５０５ｋＤａ，４ｋＤａ，６ｋＤａ，１１ｋＤａ，２０ｋＤａ，及び２８ｋＤａ）。全てのデキストラン溶液を、リン酸緩衝液で、０．５ｍｇ／ｍｌに希釈し、使用前に、０．２μｍのＰＥＳ膜を用いて、予め濾過した。全ての濾過実験は、１０ｍｌのアミコン(Amicon)撹拌式限外濾過セル(Model 8010, ミリポア社製)中で、行った。
全てのサンプルは、下記プロトコールに従って、評価された：
● １０ｍｌ容量の脱イオン水を、２０psiで濾過して、細孔構造(pore structure)及びシステム全体を濡らす。
● フィード(feed)ラインを、デキストラン溶液フィードと共に、デジタルペリスタポンプ(サーモフィッシャーサイエンス社製)に接続し、セルを２０psiに再加圧し、濾液流量を５μｍ／ｓにセットする。
● 平衡化のため２，０００μＬの水を濾過し、膜の下流のデッドボリュームを洗い出した後、濾過溶液のサンプル８００μＬを採取する。
● １ｍｌの浸透サンプルを、濾過後のセルから、直接採取する。
● 脱イオン水でシステム全体を、洗浄し、そしてすすぐ。
● 撹拌速度は６００ｒｐｍに保ち、全ての実験は室温（２２±３℃）で行った。

浸透は、高圧液体クロマトグラフィーを用いて、更に評価した（ＨＰＬＣカラム；ＰＬ１１４９−６８４０，分子量１０，０００〜２００，０００、ＰＬ１１２０−６８３０，分子量１００〜３０，０００、ＰＬ１１４９−６８６０，分子量２００，０００〜＞１０，０００，０００）。浸透クロマトグラムへのフィードの比較が、保持係数及び膜の分画分子量(molecular cut-off)の計算を可能にした。

結果を図２に示す。図２は、本発明の全ての膜は、全てのより高い分子量の分子を保持しているが、一方コントロールの膜は、３，０００ｋＤａを超過した分画分子量(molecular weight cut-off)で、顕著により低い性能であることを、示している。

５）．流量試験
ステップ（２）の２５ｍｍの各膜について、撹拌式試験セル（アミコン１０ｍｌ、モデル８０１０, ミリポア社製)を用いて、フィードを純水として、純水を透過する能力を調べた。システムを閉じて、試験前に少なくとも５分間の撹拌をセットした。続いて、圧力を１barから５barまで徐々に上昇させ、１分以内に膜表面を通って通過した純水量を表すデータポイントを、１bar間隔毎に収集した（透過水を、各圧力で別々に集めた）。実験は、比較のため、現在市場で商業的に入手できるベストの水濾過膜であるミリポア社のバイオマックス(Biomax)３０ｋＤａをも、含めた。

結果を図３に示す。図３において、ＬＭＨ／ｂａｒは純水のlitre/m^２/hour/bar、即ち圧力修正(pressure-corrected)流量であり、ＰｏＰｒはポリマー：タンパク質の割合を表す（ＰｏＰｒが高くなるほど、アクアポリンタンパク質の含量が低くなることに留意）。

ステップ２において、アクアポリンタンパク質無しで、ベシクルの被覆をして調製したコントロール膜は、試験した全て膜の中で、最も低い流量であった。本発明の全ての膜は、顕著により良い性能を示し、アクアポリン含量がより高くなるとより高い流束(fluxes)に導かれ、アクアポリン含量が最も高い膜は、市販の膜よりも顕著に性能が優れていた。

図４及び５は、本発明の膜の走査型電子顕微鏡写真を示す。図４（倍率１０００倍）において、スポンジ状の外観を持つ下層はポリスルホン担体であり、キャスティング工程（casting process）によるマクロボイド（macrovoid）を有する。上層は、アクアポリン含有ベシクルの凝集した集団（coherent mass）を含む連続被覆膜（coating）である。図５（倍率２０，０００倍）において、組織（textured）外観を有する走査型電子顕微鏡写真の下の部分は、ポリスルホン担体であり、一方、薄い最上層は、アクアポリン含有ベシクルの凝集した集団を含む連続被覆膜である。これらの二つの層の間の境界の輝くラインは、ベシクル層がポリスルホンに共有結合した境界層である。

実施例２及び３
ベシクルの調製及びベシクルを互いに共有結合させるための様々なポリマー末端基の適合性を確認するために、モデル実験を行った。代替的ポリマーを、以下の様にして、調製した。

（ａ）カルボキシル末端ポリ−２−メチルオキサゾリン−ポリ−ジ−メチル−シロキサン−ポリ−２−メチルオキサゾリン（ＰＭＯＸＡ−ＰＤＭＳ−ＰＭＯＸＡ）
実施例１のステップ(a)にあるようにして合成したヒドロキシル末端ポリマーＭｎ＝４２６２ｇ／ｍｏｌ（ＰＤＭＳ）を、ポリＰＭＯＸＡ−ＰＤＭＳ−ＰＭＯＸＡ両親媒性ブロックコポリマーの合成に用いた。５０ｇ（０．０１１７３モル）のＰＤＭＳを、三つ口丸底フラスコ中で、高真空下に、２４時間保持した。次のステップで、反応フラスコを、乾燥アルゴンで満たし、ポリマーを乾燥ヘキサン（２００ｍｌ）に溶解し、隔膜を通して三つ口フラスコに加えた。次いで、冷却した（０〜５℃）ＰＤＭＳを、２．４５ｇ（０．０２４モル）のトリエチルアミンの存在下に、６．６２ｇ（０．０２３４６モル）のトリフルオロメタンスルホン酸無水物を滴下して加えることによって活性化させ、そして３時間後反応させた。活性化されたＰＤＭＳを、次いで、アルゴン下に濾過し、減圧下にヘキサンを除去した。２５０ｍｌの乾燥酢酸エチルを加えて活性化されたポリマーを再溶解し、そして２３．５ｇ（０．２７モル）の乾燥２−メチルオキサゾリンを、４０℃で加えて、２−メチルオキサゾリンの開環重合を開始させた。アルゴン下で１２時間の反応後、トリエチルアミン３．０５ｇ（０．０３０モル）の存在下で、停止剤として、脱プロトン化マロン酸を、１．３倍過剰の３．１２ｇ（０．０３０モル）加えた。高真空下に生成物を回収し、プロトンＮＭＲで分子量を、及びクロロホルム中のＧＰＣで分子量分布を、評価した。

（ｂ）ヒドロキシ末端ポリ−２−メチルオキサゾリン−ポリ−ジ−メチル−シロキサン−ポリ−２−メチルオキサゾリン（ＰＭＯＸＡ−ＰＤＭＳ−ＰＭＯＸＡ）
上記実施例１のステップ(a)に記載されるようにして合成したヒドロキシル末端シリコンＭｎ＝４２６２ｇ／ｍｏｌ（ＰＤＭＳ）を、ポリＰＭＯＸＡ−ＰＤＭＳ−ＰＭＯＸＡ両親媒性ブロックコポリマーの合成に用いた。

５０ｇ（０．０１１７３モル）のＰＤＭＳを、三つ口丸底フラスコ中で、高真空下に、２４時間保持した。次のステップで、反応フラスコを、乾燥アルゴンで満たし、ポリマーを乾燥ヘキサン（２００ｍｌ）に溶解し、隔膜を通して三つ口フラスコに加えた。次いで、冷却した（０〜５℃）ＰＤＭＳを、２．４５ｇ（０．０２４モル）のトリエチルアミンの存在下に、６．６２ｇ（０．０２３４６モル）のトリフルオロメタンスルホン酸無水物を滴下して加えることによって活性化させ、そして３時間後反応させた。活性化されたＰＤＭＳを、アルゴン下に濾過し、減圧下にヘキサンを除去した。２５０ｍｌの乾燥酢酸エチルを加えて活性化されたポリマーを再溶解し、そして２３．５ｇ（０．２７モル）の乾燥２−メチルオキサゾリンを、４０℃で加えて、２−メチルオキサゾリンの開環重合を開始させた。アルゴン下で１２時間の反応後、停止剤として、水酸化カリウムを、１．３倍過剰（メタノール５０ｍｌ中１．６８ｇ（０．０３０モル））で加えた。高真空下に生成物を回収し、プロトンＮＭＲで分子量を、及びクロロホルム中のＧＰＣで分子量分布を、評価した。

実施例２
実施例１で調製した様に、アミン末端ポリマーから製造した２５０μＬのベシクルを、６４ｍｌの透明なガラスバイアル中に置き、そのバイアルをアルミニウムホイルで包んで、光から防護した。様々な量（０，１，５，１０，２５及び５０μＬ）の二官能性結合剤のSulfo-SANPAH（１００ｍＭ ＮａＭＯＰＳ（ｐＨ７．５）中１０ｍＭ Sulfo-SANPAH）を加え、穏やかに振って混合した。反応を、１５分間起こさせ、続いて１００μＬの溶液を動的光散乱(ＤＬＳ)測定用のキュベットの中に置いた。ＤＬＳは、溶液中の粒子のサイズの測定のための技術である。そのサンプルを、ＵＶランプ下約５ｃｍに置き、蓋とホイルを外し、ランプのスイッチを入れ、そして全体をホイルテントで覆った。全ての場合において、アテニュエーターを６に固定した。ＵＶ下で１５分後、

Sulfo-SANPAHとの反応前には、ＤＬＳはベシクルの直径が２００ｎｍであることを示した。ＵＶ照射して、Sulfo-SANPAHとの反応を起こした後は、肉眼で見ることができる大きな凝集体（aggregates）が形成された。ＤＬＳの結果を、図６に示す。これらの凝集体は、超音波処理下に安定であり、共有結合の存在を示した。

比較として、Sulfo-SANPAHと反応することが期待できないヒドロキシル末端ポリマーを用いて、類似した実験を行った。予期された通り、架橋は起こらず、それゆえＤＬＳで測定した直径における増加は起きなかった。

実施例３
実験は、末端基として活性化されたカルボン酸基を有するポリマーから作成したベシクルを用いて、行った。

原料等
● ＥＤＣ, Pierce (製品No. 22980)
● ＮＨＳ, Pierce (製品No. 24500)
● マルバーン社 ゼータサイザーナノ(ZetasizerNANO) ＤＬＳ
● 超音波バス
● マイクロプローブ付ｐＨメータ
● 上記で得られたカルボキシル末端ポリマーベシクル
● 上記で得られたアミン末端ポリマーベシクル

実験
上記の脱イオン水を用いる薄フィルム水和プロトコールに従って、ベシクルを調製した。得られたポリマーベシクルの平均直径は、ＤＬＳを用いて、約２００ｎｍであることが示された。

９５０μｇのＥＤＣ及び５７０μｇのＮＨＳを１ｍｌのカルボキシルベシクル(carboxylic vesicles)に加えることによって、ＥＤＣ及びＮＨＳで活性化されたカルボキシルベシクルを調製した。次いで、その溶液を、ＨＣｌを用いてｐＨ５に合わせ、室温で３０分間反応させてＥＤＣ−ＮＨＳ活性化ベシクルを、結果として得た。

（コントロール）カルボキシルベシクル（１ｍｌ）及びＥＤＣ−ＮＨＳ活性化ベシクル（１ｍｌ）の各溶液を、同量のアミン官能性ベシクル（１ｍｌ）と反応させた。続いて、全ての溶液のｐＨを、脱イオン水中に希釈したＮａＯＨ溶液で、約７．５に合わせ、少なくとも９０分間反応させた。得られた各サンプル１００μＬを、静的アテニュエーターを５にセットして用いたＤＬＳで試験した。試験後、そのキュベットを１分間超音波処理し、次いで再試験した。

同量のアミンベシクル及びカルボキシルベシクルの反応は、大きな凝集体（ＤＬＳでおよそ２０００ｎｍ）の形成の結果となることが分かった。しかし、超音波処理したとき、これらの凝集体は分散し、結合が共有結合よりもむしろイオン結合であることを示した。対照的に、同量のアミンベシクル及びＥＤＣ−ＮＨＳ活性化カルボキシルベシクルの反応は、大きな凝集体（ＤＬＳで約３６００ｎｍ）の形成の結果となり、それらは、超音波処理したとき、分散せず、凝集体を互いに保持する力は、共有結合であることを示した。

実施例４
ジブロックコポリマーポリブタジエン−ＰＭＯＸＡを用いた一連の実験が、行われた。

ステップ（ａ）：ＰＢ合成
Hillmyer, M. A.; Bates, F.S. 1996,9297,6994-7002のプロトコールに従い、いくらかの修正をして、ポリブタジエンを合成した。ブタジエンのアニオン重合を、開始剤としてsec−ブチル−ブチルリチウムを用いて、−６０〜−５０℃で、ＴＨＦ中で行った。乾いた二口フラスコをオーブン中で一夜乾燥し、一方のポートと他方とに、隔膜（septum）と共に、ラインを取り付けた。そのフラスコを炎で乾燥し、撹拌棒を加えた。３０ｍｌの乾燥溶媒（Dry Solv）ＴＨＦを、カニューレを用いて、その二口フラスコに加えた。１１ｍｌのブタジエン（０．１３モル）を、縮合フラスコ中で、縮合させた。ポリブタジエンを縮合するために、最初に液体窒素を用い、それから、乾燥氷冷アセトン浴を用いて、融解した。これを、その二口フラスコに、カニューレを用いて、移した。７ｍｌ（０．００９８モル）の１．４Ｍ sec−ブチルリチウム開始剤を、すばやく加えた。重合を、３時間進行させた。末端保護（End capping）は、ブタジエンの変換完了後、−６０℃で、２ｍｌ（０．０５１モル）のエチレンオキシドを加えることによって、果たした。次いで、酸性メタノール（５ｍｌ ＨＣｌ：５０ｍｌメタノール）を、溶媒の蒸発によって分離されるポリブタジエンアルコールを遊離させるために、用いた。ポリマーのシクロヘキサン溶液の蒸留水での抽出によって、無機塩を除去した。ポリマーを、水を除くために、高真空下に放置した。ソックスレー抽出器中の分子篩を用いて、乾燥ヘキサン中で、ポリマーを環流することによって、更なる乾燥を成し遂げた。

ステップ（ｂ）：ＰＢ−ＰＭＯＸＡの合成
２０ｇ（０．０２６０モル）のポリブタジエン（Ｍｎ７６９ｇ／ｍｏｌ）を、２．６３ｇ（０．０２６０モル）のトリエチルアミン（シグマアルドリッチ社Ｔ０８８６）の存在下に、アルゴン下−１０℃で、７．３３ｇ（０．０２６０モル）のトリフルオロメタンスルホン酸無水物（シグマアルドリッチ社１７６１７６−５Ｇ）で官能基化させた。有機塩を、更に濾去した。トリフラート官能基化されたＰＢは、２−メチル−２−オキサゾリン（シグマアルドリッチ社１３７４４８）のカチオン開環重合のマクロ開始剤として、用いられた。重合は、無水酢酸エチル（シグマアルドリッチ社２７０９８９）中で、４０℃で１２時間、進行させた。反応は、０．４ｇのエチレンジアミン（シグマアルドリッチ社０３５５０）で停止させた。これにより、一級−及び二級−アミン末端ＰＢ−ＰＭＯＸＡポリマーが得られた。

ポリマーの特性：
ＰＢ_１２−ＯＨ
ＮＭＲ
５．４５ｐｐｍ −ＣＨ＝ＣＨ_２（繰り返し単位）、４．９４ｐｐｍ −ＣＨ＝ＣＨ _２ （繰り返し単位）、２．１２ｐｐｍ ＣＨ（繰り返し単位−主鎖(backbone)）、1.２７ｐｐｍ ＣＨ_２（繰り返し単位−主鎖）、ＣＨ_２及びＣＨ_３ ３．６５ｐｐｍ ０．８２ｐｐｍ−末端基。

ＰＢ_１２−ＰＭＯＸＡ_５−ＮＨ−(ＣＨ_２)−ＮＨ_２
ＮＭＲ
ＰＢ：５．４５ｐｐｍ −ＣＨ＝ＣＨ_２（繰り返し単位）、４．９４ｐｐｍ −ＣＨ＝ＣＨ _２ （繰り返し単位）、２．１２ｐｐｍ ＣＨ（繰り返し単位−主鎖）、1.２７ｐｐｍ ＣＨ_２（繰り返し単位−主鎖）、ＣＨ_２及びＣＨ_３ ３．６５ｐｐｍ ０．８２ｐｐｍ−末端基。ＰＭＯＸＡ：３．４５ｐｐｍ（−ＣＨ _２ −ＣＨ _２ −Ｎ−）、２．１１ｐｐｍ（−Ｎ−ＣＯ−ＣＨ _３ ）。

ステップ（ｃ）：ベシクルの調製
ＰＢ_１２−ＰＭＯＸＡ_５−ＮＨ−(ＣＨ_２)_２−ＮＨ_２ポリマー（５０ｍｇ）を、丸底フラスコ（パイレックス２００ｍｌ）中の１ｍｌクロロホルム中に溶解した。溶剤を、減圧下に、ロータリーエバポレーター上で留去して、薄いポリマーフィルムを生成した。続く３時間の高真空処理によって、痕跡量のクロロホルムを除去した。更に５ｍｌの水を加え、６００ｒｐｍで撹拌した。こうして、１０ｍｇ／ｍｌのベシクル懸濁液を調製した。特性評価（ＬＳＭ、ストップトフロー法、ＤＬＳ）のためのサンプリングにおいて、その懸濁液を、１μｍ、８００ｎｍ、４００ｎｍ、２００ｎｍのポリカーボネートトラックエッチドフィルター（ミリポア社製）を通して、連続的に押し出した。各押出において、特性評価のために懸濁液をサンプリングした。

ベシクルは、以下の様にして、特性評価された。低温透過型電子顕微鏡（クライオ−ＴＥＭ）を粒子の画像化のために使用し、表面官能基化はＬＳＭ（レーザー走査型顕微鏡）の画像化を用いて調べた。

クライオ−ＴＥＭのため、顕微鏡は、ＦＥＩ社のTecnaiG2,TF20であった。サンプルは、ガラス化ロボット（vitrification robot）のVitrobot^ＴＭFEIを用いて、ガラス化（vitrified）した。用いた倍率は、２５０００×（較正倍率３１６２５×）＝スケールバー２００μｍであった。

ＬＳＭ画像化のため、上述のように調製したベシクルの表面に存在するアミン末端基を、イソチオシアン酸テトラメチルローダミン蛍光染料と反応させ（１：１０００モル比）、脱イオン水に対して透析した。透析は、透析液が蛍光サインを示さなくなるまで行い、非特異的結合を除去するため脱イオン水の付加的交換を続けた。ベシクルは、Apochromat 63x/1.4 Oil DIC M27である対物レンズ及び５６１ｎｍのレーザー発振線を備えた、ツァイス社のＬＳＭ７１０倒立共焦点顕微鏡を用いて、可視化した。ピンホールは、５０μｍから７０μｍまで変化させた。これにより、共焦点平面をして、ベシクルを「透視」できるので、ベシクルが焦点の内外を動的に浮遊している懸濁液において、光の縁（rims）（共焦点ポイントのセンターにおけるベシクルのセンター）又は光の円盤（discs）（共焦点ポイントにおけるベシクルのトップ）として、ベシクルが現れる。図７Ａ及び７Ｂは、ベシクルを明瞭に示す２枚の顕微鏡写真サンプルを示す。

ステップ（ｄ）：ベシクルへのタンパク質の挿入
ポリマーベシクルの透水性は、水チャネル膜タンパク質−アクアポリンＺの再構成によって、高められる。フィルム水和工程は、ＰｏＰｒ４００でのタンパク質の付加に適合するために、修正させた。簡単に:水和したベシクルに、タンパク質溶液が、ＰｏＰｒ４００で加えられた。次の各ステップは、標準のベシクル形成プロトコールに従った。

ＰＢ_１２−ＰＭＯＸＡ_５−ＮＨ−(ＣＨ_２)_２−ＮＨ_２ポリマー（５０ｍｇ）を、丸底フラスコ（パイレックス２００ｍｌ）中の１ｍｌクロロホルム中に溶解した。溶剤を、減圧下に、ロータリーエバポレーター上で留去して、薄いポリマーフィルムを生成した。続く３時間の高真空処理によって、痕跡量のクロロホルムを除去した。更に、０．１２４５ｍｇのアクアポリンＺ（アプライド・バイオミメティック社製）を含む１００ｍＭ Ｎａ-ＭＯＰＳ緩衝液５ｍｌ及び０．５％オクチルグルコシド（製品番号Ｏ３１１、ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシド、商品名Anagrade、Anatrace社製）を加え、６００ｒｐｍで撹拌した。１０ｍｇ／ｍｌのプロテオ−ベシクル懸濁液を、２００ｎｍのポリカーボネートトラックエッチドフィルター（ミリポア社製）を通して、押し出した。ストップトフロー分光計を用いて、透過性測定を行った。

ストップトフロー分光法は、タンパク質の挿入を評価するために用いた。これは、アクアポリン水チャネルで再構成されたベシクルの透水性の増加として、測定される。加えられたタンパク質の量がＰｏＰＲ（タンパク質に対するポリマーの割合）が４００と少ない場合で、コントロールベシクルに対する透水性の増加は、４６倍と測定された。結果を、図８に示した。

ステップ（ｅ）：膜の調製
この実施例では、デポジットされたベシクルの濃度を一定に保って、動的光散乱法(マルバーン社、ゼータサイザーナノ)において、カウントレート（250kcps）を、静的アテニュエーター（static attenuator）と調和させることによって、モニターした。

Sulfo-SANPAH(SS)溶液（１００ｍＭ ＮａＭＯＰＳ（ｐＨ７．５）中１０ｍＭ）を、前記で調製したＰＢ−ＰＭＯＸＡ−ＮＨ−(ＣＨ_２)_２−ＮＨ_２ベシクルと、光の無い状態で、反応させた（２５０μＬのベシクル溶液を５０μＬのＳＳと、１５分間結合させた）。一連の４７ｍｍポリスルホン膜（手動でキャストした）を、打ち抜きプレスでカットし、テフロン^Ｒ膜ホルダー内に置き、脱イオン水ですすいだ。過剰な水を圧縮空気で除去し、そして各３００μＬのＳＳ−活性化ベシクル懸濁液を、ポリスルホン担体膜上に置いた。その膜ホルダーを、次いで、光源から約５ｃｍのＵＶ光下に置き、そして防護のために３０分間ホイルでカバーした。次に、１ｍｌのピペットを用いて、膜表面に触れることなく、過剰な反応物を膜表面から除いた。上記各ステップを３回繰り返し、膜をホルダーから取り出し、２５ｍｍ直径の膜サンプルを、打ち抜きプレスを用いて、被覆された部分から、カットした。次いで、振動テーブル上で、これらを、過剰な１００ｍＭ ＮａＭＯＰＳ（ｐＨ７．５）中で、試験前に、少なくとも１時間すすいだ。

図９は、得られた膜の顕微鏡写真であり、担体膜の表面上の架橋された多数のベシクルを含む凝集した集団を示している。

上記工程で調製された膜は、１０μＬか又は１５０μＬのフリーラジカル開始溶液での処理に供した。該溶液の構成：
２５ｍＭ硫酸鉄(II)７水和物、
２５ｍＭピロ亜硫酸ナトリウム、
２５ｍＭペルオキソ二硫酸カリウム
該処理は、ＰＢ疎水性コアの架橋をもたらした。

得られた各膜サンプルについて、標準分画分子量分析技術を用いて、細孔径分布を調べた。前記工程で調製した２５ｍｍの各サンプルについて、それらの分画分子量、即ち与えられた分子量の少なくとも９０％の分子がその膜によって保持されるポイントを測定することによって、高分子物質を保持する能力を試験した。リン酸緩衝液（０．０３Ｍ Ｎａ_２ＨＰＯ_４＋０．０３Ｍ ＫＨ_２ＰＯ_４）を、０．２μｍの膜で予め濾過し、溶液の調製に使用する前に、ｐＨを７．２に合わせた。標準デキストラン（ＤＸＴ）を、リン酸緩衝液に溶解した（ＤＸＴ１６５ｋＤａ，３２５ｋＤａ，５４８ｋＤａ，１３００ｋＤａ，及び５０００ｋＤａ，ＤＸＴ０．５０５ｋＤａ，４ｋＤａ，６ｋＤａ，１１ｋＤａ，２０ｋＤａ，及び２８ｋＤａ）。全てのデキストラン溶液を、リン酸緩衝液で、０．５ｍｇ／ｍｌに希釈し、使用前に、０．２μｍのポリエチレンスルホン膜を用いて、予め濾過した。全ての濾過実験は、１０ｍｌのアミコン(Amicon)撹拌式限外濾過セル(Model 8010, ミリポア社製)中で、行った。全てのサンプルは、下記プロトコールに従って、評価された：
□ １０ｍｌ容量の脱イオン水を、２０psiで濾過して、細孔構造及びシステム全体を濡らす。
□ フィード(feed)ラインを、デキストラン溶液フィードと共に、デジタルペリスタポンプ(サーモフィッシャーサイエンス社製)に接続し、セルを２０psiに再加圧し、濾液流量を５μｍ／sにセットする。
□ 平衡化のため２，０００μＬの水を濾過し、膜の下流のデッドボリュームを洗い出した後、濾液溶液のサンプル８００μＬを採取する。
□ １ｍｌの浸透サンプルを、濾過後のセルから、直接採取する。
□ 脱イオン水でシステム全体を、洗浄し、そしてすすぐ。
□ 撹拌速度は６００ｒｐｍに保ち、全ての実験は室温（２２±３℃）で行った。

浸透は、高圧液体クロマトグラフィーを用いて、更に評価した（ＨＰＬＣカラム；ＰＬ１１４９−６８４０，分子量１０，０００〜２００，０００、ＰＬ１１２０−６８３０，分子量１００〜３０，０００、ＰＬ１１４９−６８６０，分子量２００，０００〜＞１０，０００，０００）。浸透クロマトグラムへのフィードの比較が、保持係数及び膜の分画分子量の計算を可能にした。結果を図１０に示す。図１０は、コントロール膜の分画分子量は、ベシクルで被覆されたときに、半減したことを示している。ベシクルで被覆した膜の分画分子量は、開始剤を用いてポリブタジエンのコア(core)を架橋すると、４０００Ｋａまで減少した。分画分子量の減少は、用いたクロスリンカーの量に依存ずることが、示されている。

Claims (23)

1. 多孔質担体及び、その担体表面に共有結合され、その中に取り込まれた膜貫通タンパク質を有する多数のベシクルを含む層を、含有する濾過膜であって、該ベシクルは反応性末端基を有する両親媒性ブロックコポリマーから形成されており、該膜貫通タンパク質はアクアポリン、グリセロポリン、β−バレル膜貫通タンパク質及びα−ヘリカル膜貫通タンパク質から選ばれるものであり、該層内で、ベシクルが互いに共有結合して凝集した集団であるベシクルの連続層を形成していることを特徴とする濾過膜。
   
2. 該ベシクル層が、ベシクルの平均直径よりも大きい厚さを有している請求項１に記載の膜。
   
3. 該ベシクル層が、ベシクルの平均直径の１０倍よりも大きい厚さを有している請求項２に記載の膜。
   
4. 該ベシクル層が、ベシクルの平均直径の１５０倍よりも大きい厚さを有している請求項３に記載の膜。
   
5. 該ベシクル層が、少なくとも０．０４μｍの厚さを有している請求項１に記載の膜。
   
6. 該ベシクル層が、少なくとも０．２μｍの厚さを有している請求項５に記載の膜。
   
7. 該ベシクル層が、少なくとも４０μｍの厚さを有している請求項６に記載の膜。
   
8. 該ベシクルが、５０〜１００ｎｍの範囲の平均直径を有している請求項１〜７のいずれかの請求項に記載の膜。
   
9. 両親媒性ブロックコポリマーが、（ポリ）２−Ｃ_１−３アルキル−２−オキサゾリンを含む少なくとも一つの親水性ブロック、及び（ポリ）ジメチルシロキサンを含む少なくとも一つの疎水性ブロックを含んでいる請求項１〜８のいずれかの請求項に記載の膜。
   
10. 両親媒性ブロックコポリマーが、（(ポリ)２−Ｃ_１−３アルキル−２−オキサゾリン）_ａ−（(ポリ)ジメチルシロキサン）_ｂ−（(ポリ)２−Ｃ_１−３アルキル−２−オキサゾリン）_ａ であり、ここで各ａは独立して５〜１００の数であり、ｂは５〜１５０の数である請求項９に記載の膜。
    
11. 担体が、ポリオレフィン、ポリエーテルスルホン、ポリスルホン又はポリアクリロニトリルを含む請求項１〜１０のいずれかの請求項に記載の膜。
    
12. 膜貫通タンパク質が、アクアポリンである請求項１〜１１のいずれかの請求項に記載の膜。
    
13. その中に取り込まれた膜貫通タンパク質を有するベシクルの水性懸濁液を供給し、該ベシクルは反応性末端基を有する両親媒性ブロックコポリマーから形成されている；該ベシクル懸濁液を、多孔質担体の表面上にデポジットし；そして異なるベシクル間及びベシクルと該表面の間に、共有結合が形成されるような反応条件を供給することを含む、請求項１〜１２のいずれかの請求項に記載の濾過膜の製造方法。
    
14. 下記を含む、請求項１３に記載の方法：
    (a)その中に取り込まれた膜貫通タンパク質を有するベシクルの第一の水性懸濁液を供給する、該ベシクルは反応性末端基Ｘを有する両親媒性ブロックコポリマーから形成されている；
    (b)その中に取り込まれた膜貫通タンパク質を有するベシクルの第二の水性懸濁液を供給する、該ベシクルはポリマーの末端基Ｘと反応する反応性末端基Ｙを有する両親媒性ブロックコポリマーから形成されている；
    (c)ポリマーの末端基Ｘか又は基Ｙと反応する表面を有する担体の上に、該両ベシクル懸濁液をデポジットする；及び
    (d)末端基Ｘと末端基Ｙの反応、及び末端基Ｘかまたは末端基Ｙと該担体表面の反応を起こさせる。
    
15. 下記を含む、請求項１３に記載の方法：
    (a)その中に取り込まれた膜貫通タンパクを有するベシクルの水性懸濁液を供給する、該ベシクルは反応性末端基Ｘを有する両親媒性ブロックコポリマーから形成されている；
    (b)ポリマーの末端基Ｘと反応する、少なくとも２個の反応性基Ｙを有する多官能性結合剤を供給する；
    (c)ポリマーの末端基Ｘかまたは反応性基Ｙと反応する表面を有する担体の上に、該ベシクル懸濁液及び該多官能性結合剤をデポジットする；及び
    (d)末端基Ｘと基Ｙの反応、及び末端基Ｘかまたは基Ｙと該担体表面の反応を起こさせる。
    
16. 基Ｘがアミン基で、基Ｙがカルボン酸基、活性化カルボン酸基及び／又はアジド基であり；又は基Ｘがカルボン酸基、活性化カルボン酸基及び／又はアジド基で、基Ｙがアミン基であり；又は基Ｘがアジド基で、基Ｙがアルキン基であり；又は基Ｘがアルキン基で、基Ｙがアジド基である、請求項１４か又は請求項１５に記載の方法。
    
17. 基Ｘがアミン基である請求項１６に記載の方法。
    
18. 多官能性結合剤を用い、該多官能性結合剤は、活性化カルボン酸基である一つの基Ｙ及びアジド基である他の基Ｙを含んでいる請求項１７に記載の方法。
    
19. 多官能性結合剤が、−(ＣＨ_２)−_ｍ鎖を含む、ここでｍは２〜２０である、請求項１８に記載の方法。
    
20. 多官能性結合剤が、Ｎ−スルホスクシンイミジル−６−（４’−アジド−２’−ニトロフェニルアミノ）ヘキサノエートである請求項１９に記載の方法。
    
21. 下記を含む、請求項１５〜２０のいずれかの請求項に記載の方法：
    (a)その中に取り込まれた膜貫通タンパク質を有するベシクルの水溶液を供給する、該ベシクルは反応性末端基Ｘを有する両親媒性ブロックコポリマーから形成されている；
    (b)ポリマーの末端基Ｘと反応する、少なくとも２個の反応性基Ｙを有する多官能性結合剤好ましくは二官能性結合剤を供給する、基Ｙはポリマーの末端基Ｘと第一の反応条件設定下で反応する第一の反応性基Ｙ(1)、及びポリマーの末端基Ｘと、第一の反応条件設定下では反応しないが、第二の反応条件設定下では反応する第二の反応性基Ｙ(2)を含んでいる；
    (b’)第一の反応条件設定下に、該ベシクルの水溶液を該多官能性結合剤と混合して、反応性基Ｙ(1)が、ポリマーの末端基Ｘと反応するようにする；
    (c)得られた溶液を、望ましいベシクル層を生成するのに十分な量で、第二の反応性基Ｙ(2)と反応する担体上にデポジットする；及び
    (d)第二の反応条件設定を適用することによって、末端基Ｘと第二の反応性基Ｙ(2)との反応、及び第二の反応性基Ｙ(2)と該担体表面の反応を起こさせる。
    
22. 多官能性結合剤が、接触によりポリマー末端基Ｘと反応することができる第一の反応性基Ｙ(1)、及び光照射によりポリマー末端基Ｘと反応することができる第二の反応性基Ｙ(2)を有しており;工程(d)が光照射の適用により行われる請求項２１に記載の方法。
    
23. ブロックコポリマーが末端アミン基を有し、多官能性結合剤がＮ−スルホスクシンイミジル−６−（４’−アジド−２’−ニトロフェニルアミノ）ヘキサノエートであり、そして工程(d)がＵＶ光の適用により行われる請求項２２に記載の方法。