CN114371206B - 稳定均一纳米孔的制备方法 - Google Patents

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Abstract

一种稳定均一纳米孔的制备方法，将纳米孔单体与粒径均匀的脂质囊泡生理缓冲液悬浊液混合孵育，在脂质囊泡上形成均匀稳定的纳米孔前体；依次加入解锁剂使脂质囊泡上的纳米孔前体形成纳米孔，加入交联剂使形成的纳米孔结构更稳固，加入表面活性剂破坏脂质囊泡，使纳米孔进入水溶液，形成纳米孔与脂质的混合液；经分离纯化得到分子量一致、孔径均一、结构稳固的纳米孔。本发明得到的成孔蛋白能够在特制的脂质囊泡上形成预成孔复合物，再结合使用交联剂和表面活性剂使得纳米孔的结构更加稳固、成孔成功率更高。

Description

稳定均一纳米孔的制备方法
技术领域
本发明涉及的是一种生物纳米材料领域的技术，具体是一种工程化的结构稳定、孔径大于3纳米且孔径均一的纳米孔制备方法。
背景技术
纳米孔传感器通过脂质双分子膜等会将包含电解液的两个腔室分隔开，而将纳米孔镶嵌于分隔材料上导通两个腔室，离子会在电偏压作用下自由过孔产生恒定的开孔电流；而当生物溶液中分子物质因受到电泳力进入纳米孔后，纳米孔被部分阻塞过孔时，其中的离子流动会受到部分阻碍，其阻碍的程度与生物分子进入孔中的物质的大小、形状等密切相关，也受到纳米孔本身的结构与孔径大小影响。天然蛋白纳米孔相较于基于其它材料所制的纳米孔而言优点在于生物蛋白材料易于获得且能够可以进行原子精度上的修饰改造，使其适用于不同的分子检测场景。然而由天然纳米孔，特别是通过蛋白单体自组装形成的大孔径纳米孔往往结构不稳定、孔径大小不均匀，从而造成实验成功率低且复现难度高等问题，严重影响了其在实际检测中的应用潜力。
发明内容
本发明针对现有基于生物蛋白材料的自组装纳米孔的性质表现往往较差，提出一种稳定均一纳米孔的制备方法，其得到的成孔蛋白能够在特制的脂质囊泡上形成预成孔复合物，再结合使用交联剂和表面活性剂使得纳米孔的结构更加稳固、成孔成功率更高。
本发明是通过以下技术方案实现的：
本发明涉及一种稳定均一纳米孔的制备方法，将纳米孔单体与粒径均匀的脂质囊泡生理缓冲液悬浊液混合孵育，在脂质囊泡上形成均匀稳定的纳米孔前体；依次加入解锁剂使脂质囊泡上的纳米孔前体形成纳米孔，加入交联剂使形成的纳米孔结构更稳固，加入表面活性剂破坏脂质囊泡，使纳米孔进入水溶液，形成纳米孔与脂质的混合液；经分离纯化得到分子量一致、孔径均一、结构稳固的纳米孔。
所述的纳米孔单体，采用但不限于PFO突变体单体蛋白，其能够在脂质膜中组装形成纳米孔前体并停留在前体阶段为纳米孔单体进入脂质膜后自发聚合形成包含单体数量固定的纳米孔前体，每个单体内部两个半胱氨酸巯基形成二硫键阻止纳米孔前体结构进一步改变，使其停留在前体阶段；由于每一单体内部的半胱氨酸巯基形成二硫键阻止单体结构进一步改变，从而使形成的纳米孔前体可以在前体阶段充分自组装，几乎所有纳米孔前体都可以形成完整的、包含数量一致的环状结构。
所述的纳米孔单体，优选经纯化处理。
所述的脂质囊泡，优选为磷脂和胆固醇配置得到悬浊液后，反复挤压通过径迹蚀刻膜，形成的粒径均匀的脂质囊泡。
所述的解锁剂能够解离纳米孔前体中每个单体内部形成的形成二硫键，即使每一单体内部的二硫键断裂，从而脂质囊泡表面纳米孔前体进一步形成孔径匀一的成熟纳米孔，其采用但不限于二硫苏糖醇DTT还原剂或β-巯基乙醇。
所述的交联剂能够使成熟的环状纳米孔各单体间形成连接键，获得结构稳定的纳米孔，其采用但不限于戊二醛。
所述的表面活性剂能够使制备的纳米孔在水溶液中充分分散，且易于进入脂质膜，从而方便包覆在纳米孔的跨膜结构域上并协助其插入脂质膜，得到单通道分子检测系统，其采用但不限于低于临界胶束浓度的非离子型表面活性剂或两性离子表面活性剂。
所述的分离纯化，包括低温透析、高效蛋白液相色谱法或者Native-PAGE切胶的方式分离回收得到蛋白。
本发明涉及上述方法制备得到的纳米孔，由电子显微镜或者原子力显微镜成像检测其结构均匀性。
本发明涉及上述方法制备得到的纳米孔的应用，将两个装有盐溶液的小室通过脂质膜隔离，在脂质膜上插入上述蛋白纳米孔，通过隔离小室中的电极施加跨膜电压，检测经过纳米孔的电流变化，从而制备得到单通道分子检测系统，用于溶液中特定分子检测。
所述的特定分子检测，具体步骤包括：在检测获得稳定连续的单个或多个纳米孔电流后，在隔离小室盐溶液中加入待检测分子，记录纳米孔电流的变化，并统计电流变化幅度与时间。
技术效果
相比现有用于传感的一般是孔径较小的纳米孔，本发明针对更容易出现不稳定、孔径不均一(单体组装数量不同)情况的孔径较大的纳米孔，在脂质膜上单体自组装形成成孔前体，通过突变让蛋白停留直至单体充分组装形成成孔前体，保证大部分成孔前体包含相同数量的单体，即孔径大小均一。然后再加入解锁剂，使孔前体变为孔，再加入交联剂，使孔结构稳定。
附图说明
图1为本发明流程图；
图2为实施例制备得到的纳米孔NativePAGE电泳图；
图3为实施例制备得到的纳米孔AFM成像图；
图4为实施例制备得到的纳米孔单通道电生理实验数据图；
图5为实施例制备得到的纳米孔电导数据统计图。
具体实施方式
以下具体实施例中所涉及的实验试剂浓度和实验时长都可以根据应用目的和天然蛋白材料的改变而做调整，说明书中内容仅以产气荚膜梭菌溶素O(Perfringolysin O,PFO)蛋白为实施对象阐述本发明的基本构想，在不冲突的情况下，以下实施例及实施例中的特征可以相互组合。
如图1所示，为本实施例涉及一种基于工程化的天然成孔蛋白的大孔径纳米通道制作方法，本实施例中使用的蛋白是胆固醇依赖型细菌毒素蛋白PFO的突变体，具体方法包括以下步骤：
步骤1)PFO突变体单体蛋白的纯化：
针对PFO单体序列的G57和S190(即位于蛋白质序列第57位的甘氨酸和位于第190位的苏氨酸)位点通过基因工程突变为半胱氨酸位点，将带有6个组氨酸标签的PFO序列插入到大肠杆菌质粒中，37℃下220rpm过夜培养并用IPTG诱导细菌大量表达PFO蛋白。收集菌体后连续冻融，使用细菌裂解液破坏大肠杆菌细胞壁和细胞膜使菌体内蛋白流出，Ni-NTASuper Flowbeads和蛋白偶联2小时后用不同浓度的咪唑进行洗涤和洗脱，由此能够得到大量纯化的PFO蛋白单体，SDS-PAGE电泳鉴定PFO单体。
步骤2)脂质囊泡的制作：
用氯仿溶解EggPC和胆固醇粉末，分别配制浓度为25mg/mL和20mg/mL的溶液。取出适量脂质和胆固醇配制囊泡悬浮液(摩尔百分比为1：1)，混合均匀并在水浴27℃条件下使用旋蒸仪真空干燥1小时。往经过真空干燥的混合脂质体加入1xPBS配制成终浓度2mg/ml的溶液后，选择粒径为0.2微米的滤膜并搭好脂质挤出器，来回推拉脂质挤出器5次以上得到直径均一的脂质囊泡体。
步骤3)蛋白纳米孔的预制备：
将步骤1)得到的PFO突变体单体蛋白和步骤2)得到的脂质囊泡以1：1的质量比混合孵育2小时，孵育后的PFO-囊泡混合物中PFO突变体蛋白会形成纳米孔前体复合物，加入解锁剂(如二硫苏糖醇DTT还原剂)使纳米孔前体能够顺利插入脂质体，加入交联剂使形成的纳米孔结构更稳固，继而在4℃条件下以20000g离心力离心10min，弃上清，再加入PBS缓冲液反复吹吸。将清洗过的PFO-囊泡混合物沉淀加入PBS缓冲液重悬，加入DDM洗涤剂(最终质量分数0.2％)溶解，37℃金属浴震荡30分钟。
步骤4)纳米孔复合物的分离纯化：
将金属浴结束后PFO-囊泡混合物用1000kDa的透析袋在4℃下进行透析过夜，透析液为质量分数为0.05％DDM和交联剂混合液，完成提纯。或是进行Native-PAGE梯度凝胶电泳分离特定亚基数目的PFO复合物，使用梯度混合器配制4-13％梯度胶作为下层胶，以无水乙醇覆盖，待其凝固后除去乙醇，浇注浓度为3.5％的上层胶并插入凝胶梳，静置于65℃烘箱待其凝固，用溶解后的PFO-囊泡混合物进行上样，在4-7℃低温条件下电泳，电泳结果如图2所示。电泳及染色操作完成后切下所需的PFO环状复合物条带并充分研磨，加入质量分数为0.05％DDM和交联剂混合液，4℃金属浴震荡2天，完成提纯。
本实施例通过原子力显微镜检测制备得到的纳米孔：首先使用LB拉膜仪制备单层的磷脂分子层(eggPC),按照1：1mol％混合POPC和胆固醇在聚四氟乙烯小孔上制备脂质双分子层后将单层eggPC膜垂直盖在上面，加入完成制备的PFO纳米孔(0.03mg/mL)孵育1小时左右进行AFM成像，得到如图3所示的成像结果，如图可见纳米孔孔径均一、结构稳定。
本实施例进一步对制备得到的纳米孔进行电生理实验检测：用氯仿溶解DPHPC，吹干后加入烷类溶剂溶解。电生理实验所用装置为特氟龙材料特制成的杯子，其杯壁上有一直径200-250微米的孔洞；一个绝缘性的槽子总共有4个小凹槽和2个大凹槽，其中一个大凹槽用以搭载杯子，槽子后端开孔可用螺丝拧紧；装置搭载起来时杯子内为反式腔，槽子另一大凹槽为顺式腔，用盐桥连接大小凹槽并用氧化过的氯化银电极接通数据采集系统。在杯子上小孔预涂之后往槽子和杯子中加入1M氯化钠溶液(4-羟乙基哌嗪乙磺酸HEPES 10mM，乙二胺四乙酸EDTA 1mM,pH7.4)，在槽子的小孔中加入3M氯化钠溶液(4-羟乙基哌嗪乙磺酸HEPES 10mM，乙二胺四乙酸EDTA 1mM，pH 7.4)，搭上盐桥并用氧化过的氯化银电极将槽子和杯子接入电生理数据采集系统。用毛细玻璃管(其尖端用高温酒精灯烧制成圆珠)蘸取少量脂质涂抹于孔上，完成脂质双分子层的制备；往杯子一侧加入0.2-1毫摩/升蛋白通道复合物，当PFO纳米孔成功上膜后其在+50mV的外加电压下电流显示为135PA左右，即电导大小约为2.69nS，如图4所示，为使用预制备的PFO突变体纳米孔的单通道电生理实验数据，如图5所示，为149组PFO纳米孔电生理实验得到的电导数据统计，所制备的PFO纳米孔的电导为2.63±0.19nS。
综上，本方法获得PFO纳米孔电流稳定，不同PFO纳米孔电导变化范围很小，表明PFO纳米孔结构稳定且不同PFO纳米孔之间孔径十分接近。
上述具体实施可由本领域技术人员在不背离本发明原理和宗旨的前提下以不同的方式对其进行局部调整，本发明的保护范围以权利要求书为准且不由上述具体实施所限，在其范围内的各个实现方案均受本发明之约束。

Claims (5)

1.一种稳定均一纳米孔的制备方法，其特征在于，将纳米孔单体与粒径均匀的脂质囊泡生理缓冲液悬浊液混合孵育，在脂质囊泡上形成均匀稳定的纳米孔前体；依次加入解锁剂使脂质囊泡上的纳米孔前体形成纳米孔，加入交联剂使形成的纳米孔结构更稳固，加入表面活性剂破坏脂质囊泡，使纳米孔进入水溶液，形成纳米孔与脂质的混合液；经分离纯化得到分子量一致、孔径均一、结构稳固的纳米孔；
所述的纳米孔单体，采用PFO突变体单体蛋白；
所述的脂质囊泡，为磷脂和胆固醇配制得到悬浊液后，通过滤膜并搭好脂质挤出器并反复挤压，形成的粒径均匀的脂质囊泡；
所述的解锁剂解离纳米孔前体中每个单体内部形成二硫键，即使每一单体内部的二硫键断裂，从而脂质囊泡表面纳米孔前体进一步形成孔径匀一的成熟纳米孔；
所述的解锁剂采用二硫苏糖醇DTT还原剂或β-巯基乙醇；
所述的交联剂使成熟的环状纳米孔各单体间形成连接键，获得结构稳定的纳米孔；
所述的交联剂采用戊二醛；
所述的表面活性剂使制备的纳米孔在水溶液中充分分散，且易于进入脂质膜，从而方便包覆在纳米孔的跨膜结构域上并协助其插入脂质膜，得到单通道分子检测系统；
所述的表面活性剂采用低于临界胶束浓度的非离子型表面活性剂或两性离子表面活性剂。
2.根据权利要求1所述的稳定均一纳米孔的制备方法，其特征是，所述的纳米孔单体中每个单体内部两个半胱氨酸巯基形成二硫键阻止纳米孔前体结构进一步改变，使其停留在前体阶段。
3.根据权利要求1或2所述的稳定均一纳米孔的制备方法，其特征是，所述的纳米孔单体经纯化处理。
4.一种基于权利要求1～3中任一所述方法制备得到的纳米孔的应用，其特征在于，将两个装有盐溶液的小室通过脂质膜隔离，在脂质膜上插入所述纳米孔，通过隔离小室中的电极施加跨膜电压，检测经过纳米孔的电流变化，从而制备得到单通道分子检测系统，用于溶液中特定分子检测。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征是，所述的检测，具体步骤包括：在检测获得稳定连续的单个或多个纳米孔电流后，在隔离小室盐溶液中加入待检测分子，记录纳米孔电流的变化，并统计电流变化幅度与时间。
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