JP2022172064A - 膜貫通ナノ細孔 - Google Patents
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Abstract
Description
流れることを生じる。このイオンの流れは、電流として測定されることができる。単一チャネル記録法を使用する好適な電気的測定技術は、例えば、WO2000/28312号(特許文献1)、および、D.Stoddart et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.,2010,106,7702-7(非特許文献1)に記載されている。マルチチャネル記録技術もまた、例えば、WO2009/077734号(特許文献2)および国際出願第WO2011/067559号(特許文献3)に記載されている。光学的測定は、電気的測定(Soni GV et al.,Rev Sci Instrum.2010 Jan;81(1):014301(非特許文献2))と組み合わせられ得る。あるいは、膜結合ナノ細孔を通るイオンの流れは、膜を横切ってイオン勾配を提供することによって達成され得る。
1)チャネル内腔は、チャネル内腔内側の大きな生体分子の分子を収容するために少なくとも約5nm幅であるべきであり、チャネル内の大きな生体分子の結合は、検体が細孔入口で結合する場合よりもより高い読み出し感度を生じる。
2)細孔は、電気的な読み出しにおいて一定のベースレベルを達成する(すなわち、バックグラウンドノイズを低減する)ように構造的に定義されるべきである。および、
3)細孔寸法は、細孔を異なる生体分子サイズに適合するように容易に調整可能であるべきである。
従来技術システムの上記欠点のうちの少なくとも1つを克服もしくは軽減するか、または関連技術システムに有用な代替物を少なくとも提供することが、本発明の目的である。
i.少なくとも1つの足場ポリヌクレオチド鎖と、
ii.複数のステープルポリヌクレオチド鎖と、
iii.疎水性修飾ポリヌクレオチド鎖であって、ポリヌクレオチド鎖および疎水性部分を含む、少なくとも1つの疎水性修飾ポリヌクレオチド鎖と、を含み、
複数のステープルポリヌクレオチド鎖の各々が、少なくとも1つの足場ポリヌクレオチド鎖とハイブリダイズして、膜貫通ナノ細孔の三次元構造を形成し、少なくとも1つの疎水性修飾ポリヌクレオチド鎖が、少なくとも1つの足場ポリヌクレオチド鎖の一部分にハイブリダイズし、
膜貫通ナノ細孔が、少なくとも約5nmの最小内部幅を有する中央チャネルを画定する、膜貫通ナノ細孔に関する。
好適には、膜貫通領域は、少なくとも1つのキャップ領域に隣接して配置されている。1つのキャップ領域が存在する実施形態では、膜貫通領域は、ナノ細孔の一端に位置する。
i.本発明の第2の態様に従った膜を設けることと、
ii.ナノ細孔を試験基質と接触させ、ナノ細孔を通るイオンの流れまたはナノ細孔を横切る電子流を確立することと、
iii.ナノ細孔を通るイオン流または膜貫通ナノ細孔のうちの1つ以上を横切る電子流を測定することと、を含む方法を提供する。
i.本発明の第2の態様に従った膜を設けることと、
ii.ナノ細孔内のチャネルの最小内部幅未満の直径を有する少なくとも1つの生体分子を提供することと、
iii.少なくとも1つの生体分子がナノ細孔を通過するまで培養することと、を含む、方法を提供する。
i.少なくとも1つの疎水性アンカーを含む少なくとも1つの足場ヌクレオチド鎖であって、疎水性アンカーが、ポリヌクレオチド鎖および疎水性部分を含む、少なくとも1つの足場ヌクレオチド鎖と、
ii.複数のステープルポリヌクレオチド鎖と、を含み、
複数のステープルポリヌクレオチド鎖の各々が、少なくとも1つの足場ポリヌクレオチド鎖とハイブリダイズして、膜貫通ナノ細孔の三次元構造を形成し、
膜貫通ナノ細孔が、少なくとも約5nmの最小内部幅を有する中央チャネルを画定する、膜貫通ナノ細孔を提供する。
本発明は、膜貫通ナノ細孔であって、
i.少なくとも1つの足場ポリヌクレオチド鎖と、
ii.複数のステープルポリヌクレオチド鎖と、
iii.少なくとも1つの疎水性修飾ポリヌクレオチド鎖であって、ポリヌクレオチド鎖および疎水性部分を含む、少なくとも1つの疎水性修飾ポリヌクレオチド鎖と、を含み、
前記複数のステープルポリヌクレオチド鎖の各々が、前記膜貫通ナノ細孔の三次元構造を形成するように、前記少なくとも1つの足場ポリヌクレオチド鎖とハイブリダイズして、前記少なくとも1つの疎水性修飾ポリヌクレオチド鎖が、前記少なくとも1つの足場ポリヌクレオチド鎖の一部分とハイブリダイズし、
前記膜貫通ナノ細孔が、少なくとも約5nmの最小内部幅を有する中央チャネルを画定する、膜貫通ナノ細孔を提供し、
好ましくは、前記少なくとも1つの足場鎖、前記複数のステープルポリヌクレオチド鎖の各々、および前記疎水性修飾ポリヌクレオチド鎖の前記ポリヌクレオチド鎖が、DNAを含む、
好ましくは、前記ナノ細孔のアセンブリが、DNA折り紙技術によるものである、
好ましくは、前記ナノ細孔の前記中央チャネルの前記最小内部幅が、約5nm~約20nmである、
好ましくは、前記ナノ細孔の前記中央チャネルの前記最小内部幅が、約5nm~約10nmである、
好ましくは、前記ナノ細孔の前記中央チャネルの前記最小内部幅が、7.5nmである、
好ましくは、前記ナノ細孔が、膜貫通領域と、少なくとも1つのキャップ領域とを含む、
好ましくは、前記膜貫通領域が、前記少なくとも1つのキャップ領域に隣接して配置されている、
好ましくは、1つのキャップ領域が存在し、前記膜貫通領域が、前記ナノ細孔の一端に位置する、
好ましくは、前記膜貫通領域が、前記チャネルと同軸の約1nm~約7nm、約3nm~約5nm、約20nm~約70nm、若しくは、約40nm~約50nmの寸法を有する、
好ましくは、前記ナノ細孔が、1つ以上のアダプタポリヌクレオチド鎖をさらに含み、前記少なくとも1つの疎水性修飾ポリヌクレオチド鎖が、前記1つ以上のアダプタポリヌクレオチド鎖を介して前記ナノ細孔にハイブリダイズし、前記1つ以上のアダプタポリヌクレオチド鎖が、各々、第1の末端および第2の末端を有し、前記アダプタポリヌクレオチド鎖の前記第1の末端が、前記少なくとも1つの足場ポリヌクレオチド鎖とハイブリダイズし、前記アダプタポリヌクレオチド鎖の前記第2の末端が、前記少なくとも1つの疎水性修飾ポリヌクレオチド鎖とハイブリダイズする、
好ましくは、前記アダプタポリヌクレオチド鎖中の前記ポリヌクレオチドがDNAを含む、
好ましくは、前記少なくとも1つの疎水性部分が脂質を含む、
好ましくは、前記脂質が、ステロール、アルキル化フェノール、フラボン、飽和および不飽和脂肪酸、ならびに合成脂質分子(ドデシル-ベータ-D-グルコシドを含む)からなる群から選択される、
好ましくは、-前記ステロールが、コレステロール、コレステロールの誘導体、フィトステロール、エルゴステロール、および胆汁酸からなる群から選択される、-前記アルキル化フェノールが、メチル化フェノール、およびトコフェロールからなる群から選択される、-前記フラボンが、フラバノン含有化合物、および6-ヒドロキシフラボンからなる群から選択される、-前記飽和および不飽和脂肪酸が、ラウリン酸、オレイン酸、リノール酸、およびパルミチン酸の誘導体からなる群から選択される、および/または、-前記合成脂質分子が、ドデシル-ベータ-D-グルコシドである、
好ましくは、前記足場鎖のヌクレオチド配列が、m13mp18 DNA(配列番号1)のDNA配列を含む、
好ましくは、前記複数のステープル鎖のヌクレオチド配列が、配列番号2~218を含む群から選択される、
好ましくは、前記1つ以上のアダプタ鎖のヌクレオチド配列が、配列番号219~241を含む群から選択される、
好ましくは、前記少なくとも1つの疎水性修飾ヌクレオチド鎖の配列が、配列番号242または243を含む群から選択される、
好ましくは、前記ナノ細孔が、四辺形の形状である、前記チャネルの長手方向軸に対して垂直な断面を有する、
好ましくは、前記四辺形が、正方形である、
好ましくは、前記膜貫通ナノ細孔が、修飾されており、前記中央チャネルが、1つ以上の狭窄部を含む。
好ましくは、前記膜が、脂質二重層を含む、
好ましくは、膜が、ポリマーで形成された半流動体膜を含む、
好ましくは、前記半流動体膜を形成する前記ポリマーが、両親媒性合成ブロックコポリマーで構成されている、
好ましくは、 前記両親媒性合成ブロックコポリマーが、親水性コポリマーブロックと疎水性コポリマーブロックとで構成されている、
好ましくは、前記親水性コポリマーブロックが、ポリ(エチレングリコール)(PEG/PEO)、およびポリ(2-メチルオキサゾリン)からなる群から選択され、前記疎水性コポリマーブロックが、ポリジメチルシロキサン(PDMS)、ポリ(カプロラクトン)(PCL)、ポリ(ラクチド)(PLA)、およびポリ(メチルメタクリレート)(PMMA)からなる群から選択される、
好ましくは、前記ポリマー膜が、両親媒性ブロックコポリマーポリ2-(メタクリロイルオキシ)エチルホスホリルコリン-b-ジイソプロピルアミノ)エチルメタクリレート(PMPC-b-PDPA)で構成されている、
好ましくは、前記膜が、小胞、ミセル、平面膜、または液滴の形態である、
好ましくは、前記膜が、固相基質を含む。
i.請求項26~34のいずれか一項に記載の膜を提供することと、
ii.前記ナノ細孔を試験基質と接触させ、前記ナノ細孔を通るイオンの流れ、または前記ナノ細孔を横切る電子流を確立することと、
iii.前記ナノ細孔を通る前記イオン流、または前記膜貫通ナノ細孔のうちの1つ以上を横切る前記電子流を測定することと、を含む方法を提供し、
好ましくは、前記イオンの流れが、前記膜の第1の側から前記膜の第2の側である、
好ましくは、前記分子センシングが、検体の検出または特徴付けであり、イオン流または電子流の変化が、前記検体の指標である、
好ましくは、前記方法が、ステップ(iii)の後に、前記試験基質が存在しない場合の前記1つ以上の膜貫通ナノ細孔を通るまたは横切るイオン流または電子流と比較した、前記1つ以上の膜貫通ナノ細孔を通るまたは膜を横切るイオン流または電子流の変化によって、前記試験基質の存在を判定するさらなるステップを含む、
好ましくは、前記試験基質が、球状タンパク質、ポリヌクレオチド-タンパク質構築物、標識ポリヌクレオチド、または標識タンパク質である。
i.請求項26~34のいずれか一項に記載の膜を提供することと、
ii.前記ナノ細孔内のチャネルの前記最小内部幅未満の直径を有する少なくとも1つの生体分子を提供することと、
iii.前記少なくとも1つの生体分子が前記ナノ細孔を通過するまで培養することと、を含む、方法を提供し、
好ましくは、前記少なくとも1つの生体分子が、前記ナノ細孔を通過すると、前記ナノ細孔を通って戻るのを防止する物理的変化を施される、
好ましくは、前記少なくとも1つの生体分子が、球状タンパク質、ポリヌクレオチド-タンパク質構築物、標識ポリヌクレオチド、または標識タンパク質である。
i.少なくとも1つの疎水性アンカーを含む少なくとも1つの足場ヌクレオチド鎖であって、前記疎水性アンカーが、ポリヌクレオチド鎖および疎水性部分を含む、足場ヌクレオチド鎖と、
ii.複数のステープルポリヌクレオチド鎖と、を含み、
前記複数のステープルポリヌクレオチド鎖の各々が、前記膜貫通ナノ細孔の三次元構造を形成するように、前記少なくとも1つの足場ポリヌクレオチド鎖とハイブリダイズし、
前記膜貫通ナノ細孔が、少なくとも約5nmの最小内部幅を有する中央チャネルを画定する、膜貫通ナノ細孔を提供し、
好ましくは、前記少なくとも1つの足場鎖の前記ポリヌクレオチド、前記複数のステープルポリヌクレオチド鎖の各々、および前記少なくとも1つの疎水性アンカーが、DNAを含む。
天然、およびトリ(エチレングリコール)(TEG)リンカーを含むコレステロール標識DNAポリヌクレオチドを、Integrated DNA Technologies(Leuven、ベルギー)またはATDbio(Southampton、英国)から購入し、それぞれ1μmolスケールで脱塩またはHPLC精製を用いた。1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(DOPE)、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DOPC)、および1,2-ジフィタノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DPhPC)を、Avanti Polar Lipids(Alabaster、アラバマ州)から入手した。M13mp18 DNAは、New England Biolabs(Ipswich、英国)からのものであった。PEG350-FAMは、CHEM Quest(英国)を入手形成した。他に記述されない限り、他の全ての試薬および溶媒は、Sigma-Aldrichから購入した。
DNA折り紙ナノ細孔は、CaDNAnoソフトウェアの正方格子バージョンを使用して設計した(Douglas S.M.,Marblestone A.H.,Teerapittayanon S.,Vazquez A.,Church G.M.,Shih W.M.Nucleic Acids Res.37,5001-5006(2009))。構造設計の剛性を評価するために、CaDNAnoおよびCanDo(Castro C.E.,et al.Nat.Methods8,221-229(2011))を用いて鎖経路モデリングを数サイクル行った。7249nt長の単一鎖M13mp18 DNAを足場鎖として選択した。それぞれ図6および2に示されるように、足場を中間の灰色で、ステープル鎖を濃い灰色で強調して、DNAナノ細孔および2D DNAマップを表現する。設計では、脂質アンカーは、5’または3’末端にコレステロールを担持するDNAポリヌクレオチドを介して細孔に付着している。これらのコレステロール修飾アンカー鎖は、アダプタポリヌクレオチドを介して細孔にハイブリダイズし、アダプタが仲介する結合によって、高価なコレステロール修飾ポリヌクレオチドの数を2つまでに制限することが可能である。ステープル鎖、アダプタ鎖、およびコレステロール修飾アンカー鎖のDNA配列を、表1に提供する。
DNAナノ細孔は、14mMのMgCl2を追加した1×TAE緩衝液、ならびにそれぞれ最終濃度4.2nMおよび100nMのM13mp18足場およびステープルの混合物を含有するワンポット反応において、NP-Cをまずアニーリングすることによって形成した。アセンブリは、5分当たり1℃の冷却速度で80℃~60℃の第1のアニーリング段階と、300分当たり1℃の冷却速度で60℃~20℃の第2の段階とを含む7日間のプロトコルを使用して行った。コレステロール脂質アンカーを含むナノ細孔NPを形成するために、サイズ排除クロマトグラフィー(下記参照)を用いて精製を受けたNP-Cを、コレステロール修飾アンカーポリヌクレオチド(細孔の結合部位あたり1.1当量の鎖、最大24部位)と混合し、30℃で12時間培養した。
アセンブリ生成物を、任意選択的に0.015%SDSを追加した標準的な1×TAE緩衝液中で、1.5%アガロースゲル電気泳動を使用して分析した。DNA細孔試料(10μL)を、6×ゲル充填緩衝液(2μL)と混合し、次いでウェルに充填した。ゲルを、8°Cで1時間の間、70Vで泳動させた。1000塩基対マーカー(New England Biolabs)を参照標準として使用した。臭化エチジウム溶液を用いた染色および紫外線照射によって、DNAバンドを可視化した。染色の前に、SDS含有ゲルを脱イオン水で20分間洗浄した。
組み立てられたナノ細孔を、Superdex 200 10/300GLカラム(GE Healthcare)を装備したAKTA精製器100/10を使用して、8℃で毎分0.5mLの流速を使用して、サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)を介して過剰なステープルから精製した。溶出液を260、280および295nmでのUV-vis吸光を介して監視し、折り畳みDNA細孔を含有する画分をプールした。
DNA折り紙細孔NP-Cを、タイプEスキャナー(Veeco Instruments、Santa Barbara、米国)およびシリコン先端の窒化物カンチレバー(Bruker、Camarillo、米国)を備えたMultimode VIII AFMを使用して、液体中のタッピングモードを使用して画像化した。新たに切断されたマイカをSECで精製したDNA細孔溶液(100μL)と共に15分間培養した。余分な液体を吸い取り、14mMのMgCl2および4mMのNiCl2を追加した1×TAE緩衝液(100μL)と交換した。
平面脂質二重層の電気生理学的電流測定のために、多電極キャビティアレイ(MECA)チップ(IONERA、Freiburg、ドイツ)を備えた、集積チップに基づいた平行二重層記録設定(parallel bilayer recording setup)(Orbit 16、Nanion Technologies、Munich、ドイツ)を使用した(Burns J.R.,Seifert A.,Fertig N.,Howorka S.A.Nat.Nanotechnol.11,152-156(2016)、Del Rio Martinez J.M.,Zaitseva E.,Petersen S.,Baaken G.,Behrends J.C.Small 11,119-125(2015))。二重層は、オクタン(10mg mL-1)中に溶解したDPhPCを、磁気撹拌棒を介して広げることによって形成した。電解液は、1MのKClおよび10mMのHEPES、pH8.0であった。細孔挿入のために、コレステロール固定DNAナノ細孔と0.5%のOPOE(1MのKCl、10mMのHEPES中のn-オクチルオリゴオキシエチレン、pH8.0)との2:1混合物を二重層のシス側に添加した。細孔の挿入を容易にするために、+30mVの正電圧を印加した。現在のステップを検出することによって、正常な組み込みを観察した。電流トレースを、2.873kHzでベッセルフィルタし、PATCHMASTERソフトウェア(HEKA Elektronik)を備えたEPC-10パッチクランプ増幅器(HEKA Elektronik、Lambrecht/Pfalz、ドイツ)を用いて10kHzで取得した。Clampfit(Molecular Devices、Sunnyvale、CA、米国)を使用して単一チャネル分析を実施した。
オーブンで乾燥させた丸底フラスコ(10mL)にDOPE(0.3mmol、50μL)およびDOPC(0.7mmol、550μL)の溶液を添加し、20分間ロータリーエバポレーターを使用して溶媒を真空下で除去し、超高真空下で3時間の間薄膜を乾燥させることによって、巨大単層小胞(GUV)を形成した。PEG350-FAM(10μM)を含有するソルビトール(1M、1mL)の溶液をフラスコに添加し、溶液を30秒間超音波処理して発蛍光団で満たした小胞を形成した。20分の培養後、GUV懸濁液の一部分(1μL)を8ウェルガラスチャンバ(LabTek)内のPBS(200μL)に添加した。小胞を5分間沈降させた後、NP/OPOE(12.5μlの0.5%OPOE、37.5μlのPBS、100μLのSEC精製NP、35℃で30分間培養)の混合物、またはOPOE/アンカー-コレステロール鎖(12.5μLの0.5%OPOE、37.5μLのPBS、100μLのSEC精製アンカー-コレステロール鎖、35℃で30分間培養)の混合物を添加した。515nmでの励起および適切な発光フィルタを使用して、GUVの蛍光画像を収集した。
本発明に従った膜貫通DNAナノ細孔10の一実施形態を、図1に示す。この実施形態では、DNA二重鎖を、およそ7.5nm×7.5nmの内部寸法を有する広いチャネルの内腔を作製するために、正方形に配置し、相互連結する。上の「ナノ細孔電流記録法」の段落で概説したように、広い細孔が、正常に脂質二重層に挿入され、従来技術のより小さい直径のDNAナノ細孔よりも高い電圧でかなり少ない閉鎖を示している(例えば、ダグラスS.M.,Marblestone A.H.,Teerapittayanon S.,Vazquez A.,Church G.M.,Shih W.M.Nucleic Acids Res.37,5001-5006(2009)、Zheng J.,et al.Nature461,74-77(2009)、Rothemund P.W.Nature440,297-302(2006)、Fu J.,et al.Nat.Nanotechnol.9,531-536(2014)、Burns J.R.,et al.Angew.Chem.Int.Ed.52,12069-12072(2013)、およびSeifert A.,Gopfrich K.,Burns J.R.,Fertig N.,Keyser U.F.,Howorka S.ACS Nano9,1117-1126(2015)参照)。
V.,Wieneke R.,Tampe R.,Rant U.Nat.Nanotechnol.7,257-263(2012)、Yusko E.C.,et al.Nat.Nanotechnol.6,253-260(2011)、Oukhaled A.,et al.ACS Nano5,3628-3638(2011))、タイプIの事象は、細孔とタンパク質の短い一時的な接触と解釈される(図11A、明るい緑色)一方で、タイプIIは、DNAチャネルを通じたトリプシンの動きを表しているように見える(図11B、濃い緑色)。この解釈は、(i)タイプIIの事象のより長い持続時間と、細孔を通る予想された長い輸送プロセスとの間の一致によって立証される。さらなる立証としては、(ii)タイプIIの事象の実験的振幅と、30%の計算上の遮断レベルとの間の一致である。後者の値は、トリプシンと細孔内腔との断面積比から誘導した。最後に、電流遮断の狭い分布は、概ね一定幅のチャネルを通って移動するタンパク質によって引き起こされる電流遮断の均質性に則している。
PMPC-b-PDPA膜ポリマーソームの合成
2-(メタクリロイルオキシ)エチルホスホリルコリンモノマー(MPC、純度99.9%)(例えば、Biocompactibles UK)、2-(ジイソプロピルアミノ)エチルメタクリレート(DPA)、および残りの化学物質は、Sigma Aldrichから購入した。ブロックコポリマーPMPC-PDPAは、公開されているプロトコルに従って原子移動ラジカル重合(ATRP)によって合成した。[L.Ruiz-Perez,J.Madsen,E.Themistou,J.Gaitzsch,L.Messager,S.P.Armes,G.Battaglia,Polym.Chem.2015,6,2065-2068]要するに、EtOH(5mL)中のモルホリノエチルブロモイソ酪酸エステル(ME-Br、前述の合成)中の溶液[H.Lomas,I.Canton,S.MacNeil,J.Du,S.P.Armes,A.J.Ryan,A.L.Lewis,G.Battaglia,Adv.Mater.2007,19,4238-4243.](0.190g、0.68mmol、1当量)を、丸底フラスコに入れた後、MPC(5.000g、1.70mmol、25当量)を添加した。混合物を撹拌し、さらに30分間窒素でパージし、30℃に加熱した。次いで、2,2’-ビピリジン(bpy)(0.223g、1.42mmol、2当量)および臭化銅(I)(Cu(I)Br)(0.097g、0.68mmol、1当量)の混合物を、一定の窒素流下で添加した。混合物を60分間撹拌して、高粘性の褐色の物質を得、NMRでサンプリングして変換率の程度を推定した。その間に、EtOH(13mL)中のDPA(12.27g、57.6mmol、85当量)の溶液を調製し、別のフラスコ中で60分間窒素でパージした。DPA溶液を重合混合物に添加し、反応溶液をさらに10分間パージし、30℃で一晩放置した。18時間後、1H NMR分析により、変換率が>99%であることを確認した。反応混合物をEtOH(30mL)中に希釈すると、溶液は徐々に緑色に変わり、銅系触媒の酸化を示した。混合物をシリカに通過させ、溶媒を部分的に蒸発させて不透明な溶液を得、次いでこれを各透析サイクルにつき8~14時間の間CH2Cl2、MeOH、および水(各2回)に対して透析した(MWCO1000Da)。ポリマーを凍結乾燥させ、真空下で2時間の間120℃で乾燥させて13.3g(77%)の収量を生じた。CDCl3/MeOD(3:1)の混合物の1H NMR分析は、ポリマーの組成がPMPC25-PDPA72であると決定した。サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)は、多分散性指数(PDI)が1.22の値を有することを立証した。全てのポリマーソーム分散液は、薄膜水和法によって調製した(J.Gaitzsch,D.Appelhans,L.Wang,G.Battaglia,B.Voit,Angew.Chem.Int.Ed.2012,51,4448-4451)。典型的には、ブロックコポリマーPMPC25-PDPA72を、CHCl3とMeOHとの混合物(2:1、5mL)に溶解し、次いで30℃の真空下で一晩乾燥させた。得られた乾燥ポリマーフィルムを、PBS(5mL)中で水和し、激しく撹拌した。撹拌下で7週間後、ポリマー小胞懸濁液を遠心分離サイクルを通じて精製した。要するに、アリコート(500μL)を1000RCFで10分間遠心分離した。上清をさらに23,000RCFで20分間遠心分離し、得られたペレットをPBS(450μL)に再懸濁し、20分間超音波処理して、ポリマー小胞の単分散懸濁液を得た。ポリマーソーム懸濁液内のPMPC25-PDPA72の濃度を、UV-vis分光法によって測定した。典型的には、ポリマーソーム懸濁液(20μL)をPBS、pH2.0に1:10で希釈し、吸光度をλ=220nmで記録した。PMPC25-PDPA72の濃度を、ポリマーの較正曲線を使用して計算した。ポリマーソームのサイズおよびその分布は、段落1.8に記載されているように動的光散乱法によって決定した。懸濁液の単位体積中のポリマーソームの数を計算するために、PMPC25-PDPA72の濃度およびポリマーソームのサイズを、いくつかの式に基づくMatlab(登録商標)スクリプトの入力変数として使用した。式(1)に従うと、ポリマーソームの数Npは、実験的に決定されたポリマー鎖の総数Ncを、ポリマーソーム当たりのポリマー鎖の数Naggで割ることによって得られる。
ナノ細孔の溶液(0.005μM、25μL、10mMのTris、10mMのNiCl2中、pH7.4)を新たに切断したマイカに添加し、5分間室温で培養した。次いで上清を除去し、続いて緩衝溶液(25μL、10mMのTris、pH7.4)を添加して、NiCl2の濃度を~1mMに低減した。
ブタのトリプシン(1000~2000U/mg)を、公開されている手順(L.Wang,L.Chierico,D.Little,N.Patikarnmonthon,Z.Yang,M.Azzouz,J.Madsen,S.P.Armes,G.Ba
ttaglia,Angew.Chem.Int.Ed.2012,51,11122-11125)に従って、電気穿孔法によってポリマーソーム中にカプセル化してもよい。
カプセル化トリプシンを含有するSEC精製ポリマーソームを用いてナノリアクターアッセイを実行した。ポリマーソームの懸濁液(14μMトリプシン、0.62mg mL-1ポリマー、50μL)、ならびにDNAナノ細孔NP-3CまたはNP-0C(1μM、25μL)およびB-NAR-AMCペプチド(1mM、25μL)の溶液をPBS、pH7.4(100μL)に添加した。ネガティブコントロール用に、DNAナノ細孔溶液をPBS、pH7.4(25μL)と置き換えた。ポリマーソームおよびDNAナノ細孔を含まないポジティブコントロール用に、B-NAR-AMCペプチド(1mM、25μL)およびトリプシン溶液(25μM、50μL)を、PBS、pH7.4(125μL)と混合した。ポジティブコントロールにおける即時反応を回避するために、より低濃度のトリプシン(500nM、50μL)を使用して変換率を低下させた。全ての測定値は、Carry Eclipse蛍光分光光度計で記録した。各混合物の蛍光発光は、λexc=380nmで400~600nmの間で監視した。
Claims (17)
- 膜貫通ナノ細孔であって、
i.少なくとも1つの足場ポリヌクレオチド鎖と、
ii.複数のステープルポリヌクレオチド鎖と、
iii.少なくとも1つの疎水性修飾ポリヌクレオチド鎖であって、ポリヌクレオチド鎖および疎水性部分を含む、少なくとも1つの疎水性修飾ポリヌクレオチド鎖と、を含み、
前記複数のステープルポリヌクレオチド鎖の各々が、前記膜貫通ナノ細孔の三次元構造を形成するように、前記少なくとも1つの足場ポリヌクレオチド鎖とハイブリダイズして、前記少なくとも1つの疎水性修飾ポリヌクレオチド鎖が、前記少なくとも1つの足場ポリヌクレオチド鎖の一部分とハイブリダイズし、
前記膜貫通ナノ細孔が膜貫通領域を含み、前記膜貫通領域が複数のDNA二本鎖の壁厚を有し、かつ、前記膜貫通領域が少なくとも約5nmの最小内部幅を有する中央チャネルを画定する、膜貫通ナノ細孔。 - 前記足場鎖ポチヌクレオチド鎖の各々、前記複数のステープルポリヌクレオチド鎖の各々、および前記疎水性修飾ポリヌクレオチド鎖の各々が、DNAを含む、請求項1に記載の膜貫通ナノ細孔。
- 前記ナノ細孔のアセンブリが、DNA折り紙技術によるものである、請求項1に記載の膜貫通ナノ細孔。
- 前記ナノ細孔の前記中央チャネルの前記最小内部幅が、約5nm~約20nmである、請求項1に記載の膜貫通ナノ細孔。
- 前記ナノ細孔が、少なくとも1つのキャップ領域を含み、前記膜貫通領域が、前記少なくとも1つのキャップ領域に隣接して配置され、そして、1つのキャップ領域が存在し、前記膜貫通領域が、前記ナノ細孔の一端に位置する、請求項1に記載の膜貫通ナノ細孔。
- 前記膜貫通領域が、前記チャネルと同軸の約1nm~約7nmの大きさを有する、請求項5に記載の膜貫通ナノ細孔。
- 前記キャップ領域が、前記チャネルと同軸の約20nm~約70nmの大きさを有する、請求項5に記載の膜貫通ナノ細孔。
- 前記ナノ細孔が、1つ以上のアダプタポリヌクレオチド鎖をさらに含み、前記少なくとも1つの疎水性修飾ポリヌクレオチド鎖が、前記1つ以上のアダプタポリヌクレオチド鎖を介して前記ナノ細孔にハイブリダイズし、前記1つ以上のアダプタポリヌクレオチド鎖が、各々、第1の末端および第2の末端を有し、前記アダプタポリヌクレオチド鎖の前記第1の末端が、前記少なくとも1つの足場ポリヌクレオチド鎖とハイブリダイズし、前記アダプタポリヌクレオチド鎖の前記第2の末端が、前記少なくとも1つの疎水性修飾ポリヌクレオチド鎖とハイブリダイズする、請求項1に記載の膜貫通ナノ細孔。
- 前記アダプタポリヌクレオチド鎖中の前記ポリヌクレオチドがDNAを含む、請求項8に記載の膜貫通ナノ細孔。
- 前記少なくとも1つの疎水性部分が脂質を含み、前記脂質が、ステロール、アルキル化フェノール、フラボン、飽和および不飽和脂肪酸、ならびに合成脂質分子(ドデシル-ベータ-D-グルコシドを含む)からなる群から選択される、請求項1に記載の膜貫通ナノ細孔。
- -前記ステロールが、コレステロール、コレステロールの誘導体、フィトステロール、エルゴステロール、および胆汁酸からなる群から選択される、
-前記アルキル化フェノールが、メチル化フェノール、およびトコフェロールからなる群から選択される、
-前記フラボンが、フラバノン含有化合物、および6-ヒドロキシフラボンからなる群から選択される、
-前記飽和および不飽和脂肪酸が、ラウリン酸、オレイン酸、リノール酸、およびパルミチン酸の誘導体からなる群から選択される、および/または
-前記合成脂質分子が、ドデシル-ベータ-D-グルコシドである、請求項10に記載の膜貫通ナノ細孔。 - 前記ナノ細孔が、
m13mp18DNA(配列番号1)のDNA配列を含む前記足場鎖のポリヌクレオチド配列、および、
配列番号2~218を含む群から選択される前記1つ以上のステープル鎖のポリヌクレオチド配列、からなる群から選択される少なくとも1つのポリヌクレオチド配列を含む、請求項1に記載の膜貫通ナノ細孔。 - 前記ナノ細孔が、
配列番号219~241を含む群から選択される前記アダプタ鎖のポリヌクレオチド配列、および、
配列番号242または243を含む群から選択される、疎水性修飾ポリヌクレオチド鎖のポリヌクレオチド配列、からなる群から選択される少なくとも1つのポリヌクレオチド配列を含む、請求項8に記載の膜貫通ナノ細孔。 - 前記ナノ細孔が、四辺形の形状である、前記チャネルの長手方向軸に対して垂直な断面を有する、請求項1に記載の膜貫通ナノ細孔。
- 前記四辺形が、正方形である、請求項14に記載の膜貫通ナノ細孔。
- 前記膜貫通ナノ細孔が、修飾されており、前記中央チャネルが、1つ以上の狭窄部を含む、請求項1に記載の膜貫通ナノ細孔。
- 生物学的センサであって、請求項1に記載のナノ細孔と、1つ以上の膜貫通ナノ細孔を通るイオン流を測定するための装置と、を含む、生物学的センサ。
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