JP6787274B2 - 細胞吸引支援システム - Google Patents

Description

本発明は、細胞あるいは細胞成分の吸引作業を支援する細胞吸引支援システムに係り、特に、大量の細胞を対象とした吸引作業に適した細胞吸引支援システムに関する。

生命システムの研究等においては、細胞培養ウェル内の多くの細胞の中から特徴的な細胞を特定し、その細胞あるいはその細胞の成分を吸引する作業が頻繁に行なわれる。例えば、新たな薬剤を発見したり設計したりする創薬プロセスにおいては、多数の候補化合物の中から、薬効・活性を示すものを探し出す創薬スクリーニング工程が行なわれるが、この工程においては、候補化合物が与えられた細胞培養ウェル内の細胞群から、著しく特異な変化を示す細胞を選び出し、その細胞あるいは細胞成分を吸引し、質量分析等の解析が行なわれる。

細胞を吸引する場合には、吸引チップを装着した吸引ピペットや分注装置を用いて、顕微鏡で吸引対象の細胞を確認しながら細胞吸引作業を行なう。細胞成分を吸引する場合には、ナノスプレーチップと呼ばれる微細なチップを用いて、顕微鏡で吸引対象の細胞を確認しながら細胞成分吸引作業を行なう。

細胞や細胞成分を吸引する作業は、個々の細胞を目視しながら、分析対象とする細胞を選定して吸引を行なうため、大量の細胞を処理する場合は非常に手間がかかり、オペレータの負担が大きかった。この負担を軽減するために、大量の細胞の中から分析対象の候補となる細胞を簡易に検出し、即座に吸引作業を行なえる細胞吸引支援システムが特許文献１に開示されている。

特開２０１６−０００００７号公報

ところで、細胞や細胞成分を吸引した検体は、常温では、酵素反応がしやすいため、吸引した時点のタンパク質と、しばらく常温保管した後のタンパク質の性質が異なってくる場合がある。このような酵素反応が進行した場合、質量分析の結果の正確さに悪影響を及ぼすおそれがある。

そこで、本発明は、大量の細胞中の特徴的な細胞を対象とした吸引作業の支援を行なう細胞吸引支援システムにおいて、吸引した時点の検体の性質を維持できるようにすることを目的とする。

上記課題を解決するため、本発明の細胞吸引支援システムは、細胞培養容器中の細胞群の中から特定の細胞あるいは細胞成分を吸引する作業を支援する細胞吸引支援システムであって、前記細胞群の顕微鏡画像を取得する画像取得部と、前記取得した画像から細胞を識別し、それぞれの細胞についての特徴量を算出するとともに、特徴量が所定の条件を満たす細胞を検出する画像処理部と、検出された細胞が区別できる状態で、前記細胞群に関する情報を表示する表示部と、前記細胞群に関する情報において、特定の細胞の指定を受け付けると、その細胞が所定の吸引位置に来るように前記細胞培養容器を移動させるとともに、前記吸引位置に吸引用のチップを移動させる動作制御部と、吸引後のチップを格納する検体ラックを保持するとともに、前記チップを冷却する冷却ユニットと、を備えることを特徴とする。
ここで、前記冷却ユニットは、ペルチェ素子を用いた冷却器と、前記冷却器と接触し、前記チップ先端を収容する穴が形成された伝熱材とを備えることができる。
また、前記冷却ユニットは、前記吸引後のチップを前記検体ラックに格納する際に開けられる開閉式の断熱カバーを備えることができる。

本発明によれば、大量の細胞中の特徴的な細胞を対象とした吸引作業の支援を行なう細胞吸引支援システムにおいて、吸引した時点の検体の性質を維持できるようになる。

本実施形態に係る細胞吸引支援システムの構成を示す図である。 ９６穴式の検体ラックを示す図である。 冷却ユニットの構成を示す図である。 細胞吸引支援システムの動作を説明するフローチャートである。 解析結果の表示例を示す図である。 細胞吸引前の吸引ユニットの移動動作を説明する図である。 細胞吸引時の吸引ユニットとマイクロプレートの移動動作を説明する図である。 細胞吸引時のチップ位置の微調整を説明する図である。 細胞吸引後の吸引ユニットの移動動作を説明する図である。 明視野照明の形状例について説明する図である。

本発明の実施の形態について図面を参照して説明する。図１は、本実施形態に係る細胞吸引支援システム１０の構成を示す図である。細胞吸引支援システム１０は、細胞あるいは細胞成分の吸引処理を支援する装置であり、光学系部２００と吸引動作部３００と情報処理部４００とを備えている。以降では、特に区別をしない限り、細胞の吸引は、１個の細胞の吸引のみならず、細胞内小器官等の細胞成分の吸引も含むものとする。

光学系部２００は、複数のウェルが形成されたマイクロプレート１１０を載置するＸＹステージ２０１、対物レンズ２１１を含んだ顕微鏡２１０、明視野照明２１３、ダイクロイックミラー２２０、変倍レンズ２２１、明視野観察用カメラ２２２、共焦点スキャナ部２３０を備えている。

なお、ＸＹステージ２０１に載置するのは、細胞培養容器であればよく、マイクロプレート１１０に限られず、細胞培養ディッシュ、カバーガラスチャンバ、シャーレ等であってもよい。

また、本実施形態では、共焦点２色の蛍光観察と明視野観察を行なう構成を例に光学系部２００を説明するが、光学系部２００はこの構成に限られない。例えば、共焦点スキャナ部２３０や明視野観察系を省いて落射蛍光１色の構成としたり、共焦点１色の構成としたり、共焦点１色と明視野の構成等であってもよい。

共焦点スキャナ部２３０は、ダイクロイックミラー２３１、ピンホールアレイディスク（ニポウディスク）２３２、マイクロレンズアレイディスク２３３、リレーレンズ２３４、ダイクロイックミラー２３５、第１バンドパスフィルタ２３７ａ、第１レンズ２３７ａ、蛍光観察用第１カメラ２３８ａ、第２バンドパスフィルタ２３６ｂ、第２レンズ２３７ｂ、蛍光観察用第２カメラ２３８ｂ、励起用光源部２３９を備えている。

明視野観察では、明視野照明２１３をマイクロプレート１１０に向けて照射する。明視野信号光は、顕微鏡２１０を通ってダイクロイックミラー２２０によって反射され、変倍レンズ２２１によって明視野観察用カメラ２２２で結像する。なお、明視野照明２１３は、中央部分に空間が形成されており、例えば、円環体（ドーナツ状）である。

蛍光観察では、特定の波長を持つ励起光束を励起用光源部２３９からマイクロプレート１１０に向けて出射する。励起された試料から励起光束よりも長い波長の蛍光信号が発せられ、ピンホールアレイディスク２３２を通過した蛍光信号が共焦点画像となる。蛍光信号は、ダイクロイックミラー２３１によって反射され、リレーレンズ２３４を介して、蛍光観察用第１カメラ２３８ａおよび蛍光観察用第２カメラ２３８ｂで結像する。

複数波長の励起光源を同時に用いることに対応するため、蛍光信号を分光する特性を有するダイクロイックミラー２３５を設置している。さらに、画像のＳ／Ｎ比向上と蛍光信号の必要な波長帯域のみを通すために第１バンドパスフィルタ２３６、第２バンドパスフィルタ２３６ｂが設置されている。試料が発する蛍光波長は様々であり、例えば、フィルタホイル等を用いて必要な波長に対応したバンドパスフィルタ２３６を複数用意することが望ましい。

吸引動作部３００は、ＸＹＺステージ３１０、吸引用ユニット３２０、チップラック３４１、検体ラック３４２、冷却ユニット３５０を備えている。チップラック３４１には、細胞あるいは細胞成分を吸引するためのチップ３３０が複数個配置されている。検体ラック３４２には、細胞あるいは細胞成分を吸引したチップ３３０が格納される。本実施形態において、検体ラック３４２は、冷却ユニット３５０に保持されている。

吸引用ユニット３２０は、ＸＹＺステージによりＸ軸、Ｙ軸、Ｚ軸方向に移動する。細胞の吸引作業を行なう際には、チップラック３４１からチップ３３０を取得して装着する。そして、マイクロプレート１１０方向に移動し、所定の吸引場所でウェルから細胞を吸引する。吸引場所は、例えば、顕微鏡２１０の光軸上とすることができる。

この際に、ＸＹステージ２０１は、吸引対象の細胞が吸引場所に位置するように、マイクロプレート１１０を移動させる。これにより、チップ３３０と吸引対象の細胞とが上下に重なることになる。なお、明視野照明２１３は、吸引作業時に吸引用ユニット３２０と干渉しないために円環体となっている。

細胞吸引後には、吸引用ユニット３２０は、検体ラック３４２方向に移動し、細胞吸引済みのチップ３３０をリリースして格納する。細胞吸引済みのチップ３３０を格納する検体ラック３４２は、例えば、創薬分野のデファクトスタンダードであるＡＮＳＩ／ＳＬＡＳ１−２００４で定義された形式に従うことができる。図２は、一例として９６穴式の検体ラック３４２を示している。

図３は、検体ラック３４２を保持する冷却ユニット３５０を示している。冷却ユニット３５０は、検体ラック３４２を囲うような形状となっており、先端に検体３３３が収容されたチップ３３０を冷却するための、冷却器３５１を備えている。

冷却器３５１は、例えば、一般的なペルチェ素子を好適に用いることができる。検体３３３を効率的に冷却するため、熱伝導性のよいアルミニウム等の材料で形成された伝熱材３５２を用いている。伝熱材３５２は、９６穴式の検体ラック３４２に対応して、９６個の穴が設けられ、個々の穴にチップ３３０先端の検体３３３が入るように形成され、冷却器３５１の冷却側と接触している。一方、冷却器３５１の排熱側にはヒートシンク３５６が設けられている。

冷却器３５１と伝熱材３５２とを周囲から隔離するため、断熱材３５３で囲むとともに、上部に可動式の断熱カバー３５４を設置している。断熱カバー３５４は、吸引用ユニット３２０の動きに合わせて図示しない駆動機構により開閉する。すなわち、通常は閉じた状態とし、細胞吸引済みのチップ３３０を格納する際に開くようにする。

冷却器３５１、伝熱材３５２、断熱材３５３、断熱カバー３５４、ヒートシンク３５６の各部品は筐体３５５によって支持され、検体ラック３４２を保持した状態で、細胞吸引支援システム１０に収められている。細胞吸引支援システム１０の使用時には、ペルチェ素子等で構成された冷却器３５１に通電し、検体３３３をあらかじめ設定した冷却温度に冷却する。例えば、冷却温度を−１０℃に設定した場合、冷却開始後５分程度で目的温度に達することが確かめられた。

このように、本実施形態では、検体ラック３４２を保持するとともに、チップ３３０を冷却する冷却ユニット３５０を備えているため、検体の酵素反応を止めることができ、吸引した時点の検体の性質を維持することができる。これにより、質量分析等の後工程の分析結果の正確さを保持することができる。

情報処理部４００は、ＰＣ等の情報処理装置を用いて構成することができ、画像取得部４１０、画像処理部４２０、表示部４３０、操作受付部４４０、動作制御部４５０、記録部４６０を備えている。

画像取得部４１０は、明視野観察用カメラ２２２、蛍光観察用第１カメラ２３８ａ、蛍光観察用第２カメラ２３８ｂから画像を取得する。

画像処理部４２０は、画像取得部４１０が取得した画像に対して、画像処理を行なった上で、種々の解析を行なう。具体的には、テンプレートマッチング等により、細胞・細胞器官の認識を行ない、識別されたそれぞれの細胞について、大きさ・輝度・タンパク量・イオン量等の特徴量を算出する。また、算出された特徴量を用いて細胞に関する情報のリスト化、グラフ化等の処理を行なう。

表示部４３０は、画像取得部４１０が取得した画像や、画像処理部４２０の解析結果の表示処理を行なう。操作受付部４４０は、オペレータからの各種操作を受け付ける。

動作制御部４５０は、ＸＹステージ２０１、ＸＹＺステージ３１０の動作を制御し、マイクロプレート１１０、吸引用ユニット３２０を移動させる。記録部４６０は、画像取得部４１０が取得した画像や画像処理部４２０の解析結果等を記録する。

次に、細胞吸引支援システム１０の動作について図４のフローチャートを参照して説明する。なお、以下に説明する動作は一例であり、細胞吸引支援システム１０は、オペレータの解析方針等により種々の手順で細胞吸引作業を行なうことができる。

まず、オペレータから解析に必要な試料等のセットを受け付ける（Ｓ１０１）。すなわち、オペレータは、細胞が培養されたマイクロプレート１１０を細胞吸引支援システム１０の所定の位置にセットする。この際に、必要に応じて蛍光染色を行なう。また、吸引目的に応じたチップ３３０をチップラック３４１に載置する。例えば、細胞成分の吸引を行なう場合には、ナノスプレーチップを載置し、１個の細胞の吸引を行なう場合には、通常の吸引チップを載置する。

次いで、操作受付部４４０を介して、オペレータから撮影条件等を受け付けるとともに（Ｓ１０２）、解析内容等を受け付ける（Ｓ１０３）。撮影条件の受け付けでは、例えば、共焦点、落射蛍光、位相差等の光学系の指定や、波長の設定、撮影間隔・トータル撮影時間等の設定が行なわれる。共焦点を指定することで、細胞吸引の際に３次元的な成分選択が容易となる。

解析内容の受け付けでは、特徴量の算出対象、着目する細胞の検出条件の設定が行なわれる。特徴量は、輝度、大きさ等することができる。検出条件の設定では、特徴量の閾値等が設定でき、検出条件を満たす細胞が自動的に検出される。

そして、撮影範囲の設定を受け付けて（Ｓ１０４）、明視野観察用カメラ２２２、蛍光観察用第１カメラ２３８ａ、蛍光観察用第２カメラ２３８ｂで撮影を実行する（Ｓ１０５）。一部のカメラを用いるようにしてもよい。

撮影を行なうと、画像取得部４１０が画像を取得して、画像処理部４２０が画像処理による解析を行なう（Ｓ１０６）。画像処理による解析では、抽出条件を満たす細胞を検出する。そして、表示部４３０が解析結果の表示を行なう（Ｓ１０７）。解析結果の表示では、検出条件を満たす細胞が明らかになるようにする。

具体的には、例えば、図５（ａ）に示すように、顕微鏡画像中に検出条件を満たす細胞を明示することで行なうことができる。また、図５（ｂ）に示すように、認識された細胞をリスト表示し、検出条件を満たす細胞をハイライト表示することで行なうこともできる。さらには、図５（ｃ）に示すように、認識された細胞の特徴量に基づいて散布図を表示することもできる。本図の例では、大きさと輝度を軸として散布図を描き、検出条件を満たす細胞を強調表示している。解析結果の表示は、これらの例に限られず、種々の形態とすることができる。

オペレータは、解析結果に対して、特定の細胞を吸引対象として指定することができる。吸引対象の指定は、任意の細胞に対して行なうようにしてもよいし、検出された細胞を順次自動的に指定するようにしてもよい。

オペレータが任意の細胞を指定する場合は、例えば、図５（ａ）〜（ｃ）に示す顕微鏡画像に対して、吸引対象とする細胞をクリックすればよい。画像処理部４２０では、個々の細胞を識別しているため、表示画像中で特定の細胞が指定されると、マイクロプレート１１０中のその細胞を特定することができる。

図４のフローチャートの説明に戻って、吸引対象の細胞が指定されない場合（Ｓ１０８：Ｎｏ）は、再度撮影範囲を設定し（Ｓ１０４）、以降の処理を繰り返す。

吸引対象の細胞が指定されると（Ｓ１０８：Ｙｅｓ）、動作制御部４５０が、ＸＹステージ２０１を制御して、吸引対象細胞を吸引位置に移動させる（Ｓ１０９）。吸引位置は、例えば、顕微鏡２１０の光軸上とする。

また、ＸＹＺステージ３１０を制御して、図６に示すように、吸引用ユニット３２０をチップラック３４１方向に移動させて、新規のチップ３３０を吸引用ユニット３２０に装着する（Ｓ１１０）。なお、本図中および次に説明する図７では、検体ラック３４２が露出して描かれているが、実際は、冷却ユニット３５０の断熱カバー３５４は閉じておくようにする。

そして、ＸＹＺステージ３１０を制御して、図７に示すように、チップ３３０が吸引位置に一致するように吸引用ユニット３２０を移動させる（Ｓ１１１）。このとき、明視野照明２１３は中央が空間となっているため、吸引用ユニット３２０と干渉しないようになっている。

処理（Ｓ１１０）と処理（Ｓ１１１）の結果、吸引対象細胞とチップ３３０とが吸引位置で上下に重なることになる。このため、対象となる細胞の吸引を容易に行なうことができる。ただし、画像取得時から細胞が移動している場合もあり、また、細胞中の特定の器官を吸引対象とする場合等もあるため、オペレータから吸引用ユニット３２０あるいはマイクロプレート１１０の位置の微調整を受け付けることができる（Ｓ１１２）。この際に、吸引用ユニット３２０のＺ軸方向の調整も受け付けるようにしてもよい。

位置の微調整では、図８に示すように、顕微鏡画像を表示部４３０にリアルタイムで表示し、操作受付部４４０を介してオペレータから移動指示を受け付けることができる。この際に、蛍光観察画像でもチップ３３０の位置が把握できるように、チップ３３０の先端に蛍光物質を塗布しておくことが望ましい。あるいは、吸引用ユニット３２０のチップ装着部付近にＬＥＤ光源を設け、チップ３３０先端方向を所定の波長光で照射することで、チップ３３０を可視化するようにしてもよい。

位置の微調整が終了すると、細胞の吸引を実行する（Ｓ１１３）。この際に、細胞吸引前後の画像を撮影するようにする。これにより、吸引作業の確実性を事後的にも確認することができる。

細胞の吸引後は、図９に示すように、動作制御部４５０がＸＹＺステージ３１０を制御して、吸引用ユニット３２０を検体ラック３４２方向に移動させて、細胞吸引済みチップ３３０を検体ラック３４２でリリースして保管する（Ｓ１１４）。この動作時のみ、冷却ユニット３５０の断熱カバー３５４を開け、リリース後に閉じるようにする。

リリース後において、検体ラック３４２を保持する冷却ユニット３５０により細胞吸引済みチップ３３０が冷却されるため、吸引した時点の検体の性質を維持することができる。また、記録部４６０は、吸引作業時に撮影した画像を、細胞吸引済みチップ３３０と関連付けて記録する。

処理（Ｓ１０５）で撮影した画像中の他の細胞に対する吸引指示があれば（Ｓ１１５：Ｙｅｓ）、細胞を吸引位置に移動させる処理（Ｓ１０９）以降の処理を繰り返す。

処理（Ｓ１０５）で撮影した画像中の他の細胞に対する吸引指示がなければ（Ｓ１１５：Ｎｏ）、さらに他の画像を撮影して吸引作業を継続する場合（Ｓ１１６：Ｙｅｓ）は、撮影範囲を設定する処理（Ｓ１０４）以降の処理を繰り返す。一方、他の画像を撮影しない場合（Ｓ１１６：Ｎｏ）は、吸引作業を終了する。

以上説明したように、本実施形態の細胞吸引支援システム１０では、細胞を撮影し、画像処理により特徴的な細胞を検出し、吸引対象とされた細胞を吸引位置に移動させる一連の動作を行なうようにしている。これにより、大量の細胞中の特徴的な細胞を対象とした吸引作業を行なうオペレータの作業負荷を大きく軽減している。

また、検体ラック３４２を保持するとともに、チップ３３０を冷却する冷却ユニット３５０を備えているため、検体の酵素反応を止めることができ、吸引した時点の検体の性質を維持することができる。これにより、質量分析等の後工程の分析結果の正確さを保持することができる。

細胞吸引支援システム１０による吸引作業は、１つの細胞の吸引を行なうことに加え、チップ３３０としてナノスプレーチップを用いることで、特定の細胞の成分を吸引することも可能である。この場合、高感度に質量分析を行なうことができる。また、１つの細胞を吸引対象とする場合には、特定の細胞を選択することにより、大量の細胞からの細胞の剥離、選択、除去等の処理も行なうことができ、再生医療の分野等での応用が期待できる。

なお、上述のように、細胞吸引時に吸引用ユニット３２０と干渉しないように、明視野照明２１３は中央が空間となっている。明視野照明２１３は、中央部分が空間となっていれば足り、図１０（ａ）に示すような円環体（ドーナツ状）に限られず、例えば、図１０（ｂ）に示すような矩形枠状であってもよい。さらには、図１０（ｃ）、図１０（ｄ）に示すように、複数の部分に分割した形状であってもよい。

１０…細胞吸引支援システム、１１０…マイクロプレート、２００…光学系部、２０１…ＸＹステージ、２１０…顕微鏡、２１１…対物レンズ、２１３…明視野照明、２２０…ダイクロイックミラー、２２１…変倍レンズ、２２２…明視野観察用カメラ、２３０…共焦点スキャナ部、２３１…ダイクロイックミラー、２３２…ピンホールアレイディスク、２３３…マイクロレンズアレイディスク、２３４…リレーレンズ、２３５…ダイクロイックミラー、２３６…バンドパスフィルタ、２３７…レンズ、２３８…蛍光観察用カメラ、２３９…励起用光源部、３００…吸引動作部、３１０…ＸＹＺステージ、３２０…吸引用ユニット、３３０…チップ、３３３…検体、３４１…チップラック、３４２…検体ラック、３５０…冷却ユニット、３５１…冷却器、３５２…伝熱材、３５３…断熱材、３５４…断熱カバー、３５５…筐体、３５６…ヒートシンク、４００…情報処理部、４１０…画像取得部、４２０…画像処理部、４３０…表示部、４４０…操作受付部、４５０…動作制御部、４６０…記録部

Claims (3)

1. 細胞培養容器中の細胞群の中から特定の細胞あるいは細胞成分を吸引する作業を支援する細胞吸引支援システムであって、
   前記細胞群の顕微鏡画像を取得する画像取得部と、
   前記取得した画像から細胞を識別し、それぞれの細胞についての特徴量を算出するとともに、特徴量が所定の条件を満たす細胞を検出する画像処理部と、
   検出された細胞が区別できる状態で、前記細胞群に関する情報を表示する表示部と、
   前記細胞群に関する情報において、特定の細胞の指定を受け付けると、その細胞が所定の吸引位置に来るように前記細胞培養容器を移動させるとともに、前記吸引位置に吸引用のチップを移動させる動作制御部と、
   吸引後のチップを格納する複数個の貫通穴が形成された検体ラックを保持するとともに、前記チップを冷却する冷却ユニットと、
   を備え、
   前記冷却ユニットは、冷却器と、
   前記冷却器と接触する伝熱材であって、前記チップ先端を収容する穴が、前記検体ラックに形成された貫通穴に対応して複数個形成された伝熱材とを備えている
   ことを特徴とする細胞吸引支援システム。
2. 前記冷却器は、ペルチェ素子を用いていることを特徴とする請求項１に記載の細胞吸引支援システム。
3. 前記冷却ユニットは、
   前記吸引後のチップを前記検体ラックに格納する際に開けられる開閉式の断熱カバーを備えていることを特徴とする請求項１または２に記載の細胞吸引支援システム。