WO2009125547A1 - 培養装置の制御装置及び制御プログラム - Google Patents

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WO2009125547A1
WO2009125547A1 PCT/JP2009/001336 JP2009001336W WO2009125547A1 WO 2009125547 A1 WO2009125547 A1 WO 2009125547A1 JP 2009001336 W JP2009001336 W JP 2009001336W WO 2009125547 A1 WO2009125547 A1 WO 2009125547A1
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WO
WIPO (PCT)
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culture
image
observation
target object
culture apparatus
Prior art date
Application number
PCT/JP2009/001336
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
魚住孝之
三村正文
清田泰次郎
Original Assignee
株式会社ニコン
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 株式会社ニコン filed Critical 株式会社ニコン
Publication of WO2009125547A1 publication Critical patent/WO2009125547A1/ja

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M41/00—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation
    • C12M41/46—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation of cellular or enzymatic activity or functionality, e.g. cell viability

Definitions

  • the present invention relates to a control apparatus and control program for a culture apparatus having a culture observation function.
  • ART In Assisted Reproductive Technology (ART), for example, in vitro fertilization (IVF) and microinsemination (ICSI), 5-20 eggs collected from one maternal body at a time.
  • IVF in vitro fertilization
  • ICSI microinsemination
  • 5-20 eggs collected from one maternal body at a time are fertilized in vitro, and the fertilized eggs are placed one by one in a medium drop of about 20 ⁇ l made on a culture vessel. The surface of the medium drop is coated with mineral oil, and the whole culture container is accommodated in the culture apparatus in that state. In this environment, the fertilized egg begins to divide.
  • blastocyst The person in charge of culturing observes the growth state of the fertilized egg at regular intervals, and if necessary, replaces the medium and scores the fertilized egg. A few days later, a good blastocyst that has grown to a state called a blastocyst is returned to the mother's body. Other blastocysts are stored frozen.
  • the fertilized egg may float in the medium drop, even if the person in charge of culture specifies the position coordinates of the fertilized egg in advance in the culture apparatus, the fertilized egg may fall out of the observation field. For this reason, the person in charge of culture has to specify the position coordinates for each observation.
  • the number of eggs collected from a single mother is about 5 to 20, and these need to be managed in a lump, so the number of position coordinates specified by the person in charge of culture at the maximum is 20 It extends to places.
  • Patent Document 2 discloses a technique for tracking a cell floating in the observation field of view, a specific technique necessary for performing the tracking is not disclosed, and the cell may deviate from the observation field of view. Sex is not expected.
  • the present invention has been made in view of the above problems, and an object of the present invention is to provide a control device and a control program for a culture device that can save the user's trouble of specifying a point to be observed.
  • the control device of the culture apparatus of the present invention includes a temperature-controlled room that accommodates the culture container, a first imaging optical system that images a predetermined area of the culture container in the temperature-controlled room at a first magnification, and the culture in the temperature-controlled room And a second imaging optical system that images a region narrower than the predetermined region of the container at a second magnification higher than the first magnification, the culture device control device comprising: a predetermined region of the culture container; A wide-field observation unit that images the first imaging optical system; and a search unit that searches for a target object having a predetermined characteristic in the predetermined region based on an image acquired by the wide-field observation unit through the imaging; A microscopic observation unit that causes the second imaging optical system to image the target object detected by the search unit from the predetermined area; and a recording unit that records an image acquired by the microscopic observation unit through the imaging. It is characterized by having .
  • search means may search for an object having a circular outline as the target object.
  • the searching means may search for an object having a luminance variance value equal to or greater than a threshold among the objects having a circular outline as the target object.
  • the search means may search for an object having a circular contour whose sum of luminance differential values is equal to or greater than a threshold as the target object.
  • control device for the culture apparatus of the present invention when the search means cannot detect the target object, changes the imaging condition of the first imaging optical system, and then the wide field observation means, the search A re-operation means for re-activating the means may be further provided.
  • the recording unit may exclude an image including the target object having a luminance variance value less than a threshold from the images to be recorded among images acquired by the microscopic observation unit.
  • the recording means may exclude an image including the target object whose sum of luminance differential values is less than a threshold among the images acquired by the microscopic observation means from the recording target.
  • control device of the culture apparatus of the present invention determines whether or not the image to be recorded has a predetermined characteristic by the recording means, and notifies the user of the predetermined characteristic when there is a predetermined characteristic. Notification means for performing this may be further provided.
  • the culture apparatus control program of the present invention includes a temperature-controlled room that accommodates a culture container, a first imaging optical system that images a predetermined area of the culture container in the temperature-controlled room at a first magnification, and the culture in the temperature-controlled room
  • a control program executed by a computer of a culture apparatus comprising: a second imaging optical system that images a region narrower than the predetermined region of the container at a second magnification higher than the first magnification.
  • a target object having a predetermined characteristic in the predetermined region based on a wide-field observation procedure in which the first imaging optical system images the predetermined region and an image acquired by the imaging in the wide-field observation procedure A search procedure, a microscopic observation procedure for causing the second imaging optical system to image the target object detected from the predetermined region in the search procedure, and an image acquired by the imaging of the microscopic observation procedure.
  • an object having a circular outline may be searched as the target object.
  • an object having a luminance dispersion value equal to or larger than a threshold among objects having a circular outline may be searched as the target object.
  • an object having a circular outline whose total sum of luminance differential values is equal to or greater than a threshold may be searched as the target object.
  • an image including the target object whose luminance variance value is less than a threshold value may be excluded from the recording target.
  • an image including the target object whose sum of luminance differential values is less than a threshold may be excluded from the recording target.
  • FIG. 3 is a schematic diagram showing a configuration of an observation unit 28.
  • FIG. 3 is a circuit block diagram of the incubator 11.
  • FIG. (A) is the schematic which looked at the culture container 30 of this embodiment from the upper surface
  • (B) is the schematic of the cross section of the culture container 30.
  • FIG. It is an operation
  • FIG. 6 is a diagram for explaining egg images I 1 ′ to I 7 ′. It is a flowchart of the search process of a cyclic
  • This embodiment is an embodiment of an incubator.
  • FIG. 1 is a front view of the incubator of the present embodiment
  • FIG. 2 is a front view of the incubator when the front door 18 is opened.
  • the incubator 11 includes a first housing 12 that cultures living cells and a second housing 13 that houses the control unit 14. Arranged at the top of the second housing 13.
  • An operation panel 56 is provided on the front surface of the second housing 13, and the operation panel 56 is provided with a monitor, an input button, and the like. Inside the second housing 13, the control unit 14 and a part of the observation unit 28 are arranged.
  • a temperature-controlled room 15 (FIG. 2) covered with a heat insulating material is formed inside the first housing 12.
  • the temperature-controlled room 15 communicates with the outside through a front opening 16 (FIG. 2) formed on the front surface of the first housing 12 and a carry-in / out port 17 (FIG. 2) formed on the left side surface of the first housing 12. is doing.
  • the front opening 16 (FIG. 2) can be opened and closed by a double door front door 18, and the carry-in / out port 17 (FIG. 2) can be opened and closed by a sliding automatic door 19 (FIG. 1).
  • the size of the carry-in / out port 17 is set to a size through which the culture container 30 (FIG. 2) can pass.
  • An opening 20 (FIG. 2) is formed on the bottom surface of the first housing 12 at a position on the right side when viewed from the front side, and a part of the observation unit 28 projects from the opening 20 (FIG. 2). ing.
  • the wall of the temperature-controlled room 15 incorporates a temperature adjusting device, a spraying device, a gas introduction unit, an environmental sensor unit, and the like.
  • the temperature adjusting device has a Peltier element, and heats or cools the temperature-controlled room 15 (FIG. 2) by the Peltier effect.
  • a spraying apparatus sprays in the temperature-controlled room 15 (FIG. 2), and adjusts the humidity in the temperature-controlled room 15 (FIG. 2).
  • the gas introduction unit is connected to a carbon dioxide cylinder outside the incubator. By introducing carbon dioxide from the carbon dioxide cylinder into the temperature-controlled room 15 (FIG. 2), carbon dioxide in the temperature-controlled room 15 (FIG. 2). Adjust the density.
  • the environmental sensor unit detects the temperature, humidity, and carbon dioxide concentration in the temperature-controlled room 15 (FIG. 2).
  • a stocker 25 Inside the first housing 12, a stocker 25, a container carry-in / out mechanism 26 (FIG. 2), and a container transport mechanism 27 are disposed, and a part of the observation unit 28 is also disposed as described above.
  • the placement location of the stocker 25 is the left side of the temperature-controlled room 15 (FIG. 2) when viewed from the front of the first housing 12.
  • the stocker 25 has a plurality of shelves, and the culture container 30 can be stored in each shelf.
  • the lowermost stage of the stocker 25 is continuous with the carry-in / out port 17 (FIG. 2) of the first housing 12, and a container carry-in / out mechanism 26 (see FIG. 2) for carrying the culture container 30 into and out of the lowermost space. 2) is installed.
  • the arrangement location of the soot container transport mechanism 27 is the center of the temperature-controlled room 15 (FIG. 2) when viewed from the front of the first housing 12.
  • the container transport mechanism 27 delivers the culture container 30 (FIG. 2) to and from the stocker 25, the container carry-in / out mechanism 26 (FIG. 2), and the observation unit 28.
  • the arrangement location of the cocoon observation unit 28 is on the right side of the temperature-controlled room 15 (FIG. 2) when viewed from the front of the first housing 12.
  • the observation unit 28 includes a sample table 47 (FIG. 2), an arm 48 (FIG. 2) protruding above the sample table 47 (FIG. 2), and a main body portion 49 (FIG. 2).
  • the sample stage 47 (FIG. 2) and the arm 48 (FIG. 2) are located on the temperature-controlled room 15 (FIG. 2) side of the first housing 12, and the main body portion 49 (FIG. 2) is the second housing 13. Located on the side.
  • FIG. 3 is a schematic diagram showing the configuration of the observation unit 28.
  • the observation unit 28 includes a sample stage 47, a first illumination unit 51, a second illumination unit 52, a microscopic observation unit 53, a container observation unit 54, and an image processing unit 55. ing.
  • the microscopic observation part 53 is built in the main body part 49, and the illumination part 51 is arranged in a position facing the microscopic observation part 53 in the arm 48.
  • the microscopic observation unit 53 and the first illumination unit 51 constitute a microscope for phase difference observation (for microscopic observation).
  • the container observation unit 54 is housed in the arm 48, and the second illumination unit 52 is disposed at a position facing the container observation unit 54 in the main body portion 49.
  • These container observation part 54 and the 2nd illumination part 52 comprise the observation system for whole observation (for wide field observation).
  • the sample stage 47 is made of a translucent material, and the culture vessel 30 is placed thereon.
  • the sample stage 47 is composed of a high-precision stage, and the culture vessel 30 is moved in the horizontal direction (XY direction), thereby observing the culture vessel 30 with a phase difference observation microscope (microscopic observation unit 53 and first illumination unit 51). ) Or the optical path of the observation system for whole observation (the container observation unit 54 and the second illumination unit 52).
  • the sample stage 47 can adjust the focus of the microscope for phase difference observation by changing the positional relationship between the culture vessel 30, the microscope for phase difference observation and the Z direction. Further, the sample stage 47 can change the observation point of the microscope for phase difference observation by changing the positional relationship in the XY direction between the culture vessel 30 and the microscope for phase difference observation.
  • the observation unit 28 can capture the entire image of the culture vessel 30 in color in a state where the culture vessel 30 is inserted into the optical path of the observation system for overall observation (the vessel observation unit 54 and the second illumination unit 52).
  • an image acquired by this imaging is referred to as an “entire image”.
  • the observation unit 28 captures a partial enlarged phase difference image of the culture vessel 30 in a state where the culture vessel 30 is inserted into the optical path of a phase difference observation microscope (microscopic observation unit 53 and first illumination unit 51). can do.
  • a phase difference observation microscope microscopic observation unit 53 and first illumination unit 51.
  • an image acquired by this imaging is referred to as a “phase difference image”.
  • the combination of the objective lens 61 and the phase filter 62 of the microscopic observation unit 53 can be switched between at least two types of combinations having different observation magnifications.
  • switching is performed between a combination for 2 ⁇ observation (objective lens 61 low and phase filter 62 low ) and a combination for 10 ⁇ observation (objective lens 61 high and phase filter 62 high ).
  • the observation unit 28 can acquire a phase difference image (low magnification phase difference image) with a magnification of 2 in a state where the objective lens 61 low and the phase filter 62 low are set in the optical path, and the objective lens 61 high and the phase With the filter 62 high set in the optical path, a phase difference image (high magnification phase difference image) of 10 times magnification can be acquired.
  • a phase difference image high magnification phase difference image
  • the image processing unit 55 performs various types of image processing on the image acquired by the observation unit 28 (any one of the whole image, the low magnification phase difference image, and the high magnification phase difference image).
  • Image processing that can be executed by the image processing unit 55 includes color detection processing (described later) for detecting a colored region from an input image, and ring search processing (described later) for searching a circular pattern from the input image. ) And blastocyst discrimination processing (described later) for discriminating whether or not the input image is an image of a blastocyst.
  • FIG. 4 is a circuit block diagram of the incubator 11.
  • the control unit 14 of the incubator 11 includes a door opening / closing mechanism 19 a of the automatic door 19, a temperature adjusting device 21, a spraying device 22, a gas introduction unit 23, an environmental sensor unit 24, a container carry-in / out mechanism 26, and container conveyance.
  • the mechanism 27, the observation unit 28, the monitor 56a, and the input button 56b are connected.
  • the control unit 14 comprehensively controls each part of the incubator 11 according to a predetermined control program.
  • the control unit 14 maintains the inside of the temperature-controlled room 15 at a predetermined environmental condition by controlling the temperature adjusting device 21, the spraying device 22, the gas introducing unit 23, and the environment sensor unit 24, respectively.
  • the control unit 14 controls the observation unit 28 and the container transport mechanism 27 based on the observation schedule input by the user, and automatically executes the observation sequence of the culture container 30.
  • an “IVF mode” described later is mounted as an operation mode of the control unit 14 related to observation.
  • the user can specify the operation mode of the control unit 14 to the incubator 11 through the monitor 56a and the input button 56b.
  • control unit 14 has a storage unit 14a composed of a hard disk, a non-volatile memory, or the like, and can store various data described later.
  • FIG. 5A is a schematic view of the culture vessel 30 of the present embodiment as viewed from above
  • FIG. 5B is a schematic cross-sectional view of the culture vessel 30.
  • the culture vessel 30 of this embodiment is a so-called dish, and its diameter is about 35 mm.
  • a plurality of medium drops D of about 20 ⁇ l (here, 7) are irregularly arranged.
  • each medium drop D contains a fertilized egg collected from a common mother at a common time. Contains one a.
  • the diameter of each medium drop D is about 7 mm, and the diameter of each fertilized egg a is about 100 ⁇ m.
  • Each medium drop D is colored with a reagent such as phenol red.
  • the medium drop D is attached to the bottom surface of the culture container 30, but the fertilized egg a may float inside the medium drop D.
  • control unit 14 in the IVF mode of this embodiment will be described.
  • FIG. 6 is an operation flowchart of the control unit 14 in the IVF mode of the present embodiment.
  • Step S101 The control unit 14 carries the culture container 30 into the temperature-controlled room 15 according to the user's operation and instructs the container transport mechanism 27 to transport the culture container 30.
  • the container transport mechanism 27 transports the culture container 30 and places it on a predetermined position of the sample table 47.
  • Step S102 The control unit 14 instructs the observation unit 28 to acquire the entire image of the culture vessel 30.
  • the observation unit 28 arranges the culture vessel 30 in the optical path of the observation system for the whole observation (the vessel observation unit 54 and the second illumination unit 52), and acquires the whole image I whole as shown in FIG.
  • the entire image I whole is displayed on the monitor 56a. Note that seven images of medium drop D (drop images) ID are shown in the whole image I whole .
  • Step S103 The control unit 14 instructs the image processing unit 55 to perform color detection processing on the entire image I whole acquired in Step S102.
  • the image processing unit 55 detects a plurality of red regions (regions colored with phenol red) in the entire image I whole .
  • the control unit 14 assigns drop numbers 1 to 7 to the plurality of areas detected by the image processing unit 55 in the arrangement order. As a result, the seven drop images ID are labeled.
  • the drop image I D that drop number i is assigned is referred to as "I Di" (see FIG. 8).
  • the control unit 14 Based on the position coordinates of the sample stage 47 in the X and Y directions and the center coordinates of the individual drop images I D1 to I D7 in the entire image I whole , the control unit 14, as shown in FIG.
  • the coordinates (x 1 , y 1 ) to (x 7 , y 7 ) of the center of the medium drop are calculated, and these coordinates (x 1 , y 1 ) to (x 7 , y 7 ) are used as the drop numbers 1 to 7 Are stored in the storage unit 14 a as management data of the culture vessel 30.
  • control unit 14 causes the user to input an observation schedule (such as a time lapse observation time interval) of the culture vessel 30 and writes the observation schedule into the management data of the culture vessel 30.
  • an observation schedule such as a time lapse observation time interval
  • control unit 14 instructs the container transport mechanism 27 to store the culture container 30 in the stocker 25.
  • the container transport mechanism 27 stores the culture container 30 in the stocker 25. Thereby, the registration of the culture vessel 30 is completed.
  • Step S104 The control unit 14 compares the observation schedule written in the management data of the culture vessel 30 with the current date and time to determine whether or not the observation start time of the culture vessel 30 has come. When the observation start time has come, the process proceeds to step S105, and when the observation start time has not come, the process waits.
  • Step S105 The control unit 14 instructs the container transport mechanism 27 to transport the culture container 30.
  • the container transport mechanism 27 unloads the culture container 30 from the stocker 25 and places it on a predetermined position of the sample table 47. At this time, the drop number i is set to the initial value “1”.
  • Step S106 The control unit 14 observes the coordinates (x i , y i ) corresponding to the current drop number i in order to obtain the medium drop image (drop image I i ) corresponding to the current drop number i. It reads out from the management data of the container 30 and designates it to the observation unit 28, and instructs the observation unit 28 to acquire a low-magnification phase difference image of the object located at the coordinates (x i , y i ).
  • the observation unit 28 arranges the culture vessel 30 in the optical path of the microscope for phase difference observation (the microscopic observation unit 53 and the first illumination unit 51), and the combination of the objective lens 61 and the phase filter 62 is for double observation.
  • the combination (objective lens 61 low and phase filter 62 low ) is set.
  • the visual field size (4 mm ⁇ 4 mm) of the objective lens 61 low is smaller than the size of one medium drop (diameter 7 mm). Therefore, the observation unit 28 moves the optical axis position of the objective lens 61 low with respect to the culture vessel 30 stepwise around the coordinates (x i , y i ), and performs a low-magnification phase difference image I as shown in FIG. ia to I id are acquired in order. The whole of these low-magnification phase difference images I ia to I id is a drop image I i .
  • the low-magnification phase difference images I ia to I id are referred to as “partial drop images I ia to I id ”. Note that image acquisition may be performed at once by setting the visual field size of the objective lens 61 low to the visual field size of one medium drop.
  • the observation unit 28 performs autofocus control by a contrast method when acquiring individual images.
  • This autofocus control adjusts the height (position in the Z direction) of the sample stage 47 while monitoring the contrast of the image, and stops the sample stage 47 at such a height that the contrast reaches a peak.
  • Information on the focus position (the height of the focus surface) at the time of acquisition of each of the partial drop images I ia to I id is stored by the control unit 14.
  • the observation unit 28 can limit the focus adjustment range of the autofocus control in accordance with an instruction from the control unit 14.
  • the focus adjustment range is set sufficiently wide.
  • Step S107 The control unit 14 instructs the image processing unit 55 to perform a circular pattern search process (described later) on each of the partial drop images I ia to I id acquired in step S106.
  • the image processing unit 55 detects a circular pattern Ic from each of the partial drop images I ia to I id by a circular pattern search process (described later).
  • control unit 14 the position coordinates of the XY direction of the sample stage 47, on the basis of the center coordinates of the circular pattern Ic in drop image I i, any cyclic pattern (fertilized eggs that is reflected in the drop image I i and bubbles
  • the center coordinates (x i1 ′, y i1 ′) to (x im ′, y im ′) are calculated.
  • the number of annular patterns Ic detected from the drop image I i is assumed to be “m”.
  • the detected annular pattern Ic is likely to be an image of the fertilized egg.
  • bubbles b i may be attached to the surface of the culture vessel 30 or the interface between the medium drop D and the mineral oil O, and the contour of the image of the bubbles b i is also changed. Appears as a halo on the phase difference image. Therefore, the annular pattern Ic detected in this step is an image of a fertilized egg a i or an image of bubbles b i .
  • Step S108 In order to distinguish the image of the fertilized egg a i and the image of the bubble b i , the control unit 14 determines the luminance dispersion value (or the luminance differential value) inside the individual annular pattern Ic detected in step S107. Sum) is calculated and each is compared with a threshold value. Then, the control unit 14 regards only the annular pattern Ic that is equal to or greater than the threshold value as an image of the fertilized egg a i .
  • the coordinates of the center of the fertilized egg a i in the culture container 30 are set as (x i ′, y i ′).
  • the number of fertilized eggs placed in one medium drop is 1, the number of images of fertilized eggs a i detected in this step is 1 or less. In particular, in the following cases, fertilization is performed. The number of eggs a i is zero.
  • both the bubble b i and the fertilized egg a i exist in the field of view of the objective lens 61 low , and the bubble b
  • the position of i in the optical axis direction (Z direction) is away from the position of the fertilized egg a i in the optical axis direction, and the bubble b i is in focus.
  • the image of the fertilized egg a i is not detected from any of the partial drop images I ia to I id .
  • Step S109 The control unit 14 determines whether or not an image of the fertilized egg a i is detected in Step S108. If an image of the fertilized egg a i is detected, the process proceeds to Step S111, where the fertilized egg a i If no image is detected, the process proceeds to step S110 to reacquire the drop image I i (partial drop images I ia to I id ) with the drop number i.
  • Step S110 The control unit 14 instructs the observation unit 26 to exclude the range in the vicinity of the previous focus plane from the focus adjustment range when each of the partial drop images I ia to I id is acquired, and also the drop image.
  • step S106 After instructing the observation unit 26 to shift the imaging center of I i (the center of the partial drop images I ia to I id ) from the current coordinates (x i , y i ) by a predetermined distance ( ⁇ x, ⁇ y), step S106 Return to.
  • Each of ⁇ x and ⁇ y is a distance corresponding to one fertilized egg. If the acquisition conditions of the drop image I i (partial drop images I ia to I id ) are changed in this way, the possibility that an image of the fertilized egg a i is detected can be increased.
  • Step S111 The control unit 14 specifies the coordinates (x i ′, y i ′) to the observation unit 28, and acquires a high-magnification phase difference image of the object located at the coordinates (x i ′, y i ′). An instruction is given to the observation unit 28.
  • the observation unit 28 arranges the culture vessel 30 in the optical path of the microscope for phase difference observation (the microscopic observation unit 53 and the first illumination unit 51), and the combination of the objective lens 61 and the phase filter 62 is used for 10 ⁇ observation.
  • the combination (objective lens 61 high and phase filter 62 high ) is set.
  • the size of the visual field of the objective lens 61 high (0.8 mm ⁇ 0.8 mm) is larger than the size of one fertilized egg (diameter 100 ⁇ m). Therefore, the observation unit 28 matches the optical axis position of the objective lens 61 high with respect to the culture vessel 30 to the coordinates (x i ′, y i ′), and in that state, for example, a high-magnification phase difference image I as shown in FIG. Get i '.
  • This high-magnification phase difference image I i ′ is a detailed image of the fertilized egg a i having the drop number i. Therefore, hereinafter, the high-magnification phase difference image I i ′ is referred to as “egg image I i ′”.
  • the control unit 14 restricts the focus adjustment range of the autofocus control only to the vicinity of the focus surface of the partial drop image from which the image of the fertilized egg a i is detected. As a result, the possibility of focusing on an object other than the fertilized egg a i (such as bubbles b i and scratches) is suppressed.
  • Step S112 The control unit 14 associates the egg image I i ′ acquired in Step S111 with the drop number i, and stores it in the storage unit 14a as observation data of the culture vessel 30. As a result, the egg image I i ′ is managed by the drop number i.
  • Step S113 The control unit 14 determines whether or not the current drop number is the final value (here, “7”). If the final value, the process proceeds to step S114. After incrementing the number by 1, the process returns to step S106. Therefore, the processing in steps S106 to S112 is executed for all drop numbers 1 to 7. As a result, seven egg images I 1 ′ to I 7 ′ are accumulated in the observation data of the culture container 30.
  • Step S114 The control unit 14 instructs the container transport mechanism 27 to transport the culture container 30.
  • the container transport mechanism 27 transports the culture container 30 from the sample stage 47 to a predetermined storage position of the stocker 25.
  • Step S115 The control unit 14 reads the eggs image I 1 ' ⁇ I 7' stored in the step S112, the image processing so as to perform a blastocyst ⁇ specific processing for each of those eggs image I 1 ' ⁇ I 7'
  • the unit 55 is instructed.
  • the image processing unit 55 performs blastocyst discrimination processing by template matching or the like. Specifically, the image processing unit 55 compares the feature image extracted in advance from the high-magnification phase difference image of the blastocyst with the feature image extracted from the egg image I i ′, and there is a certain correlation between them.
  • the egg image I i ′ is regarded as an image of a blastocyst. Since the blastocyst has directionality, this comparison is repeated while rotating the feature image.
  • Step S116 The control unit 14 determines whether or not there is an image of the blastocyst in the egg images I 1 ′ to I 7 ′. If there is, the control unit 14 returns to Step S104 after executing Step S117. If it does, the process immediately returns to step S104. Therefore, steps S105 to S117 are executed every time the observation start time comes. As a result, the egg images I 1 ′ to I 7 ′ are accumulated in the observation data of the culture container 30 for each observation period.
  • Step S117 The control unit 14 displays on the monitor 56a that one or more blastocysts have been generated in the culture vessel 30. Therefore, the user can take appropriate measures for fertilized eggs in the culture container 30 at an early stage.
  • the control unit 14 may send an email to the user's personal computer (or mobile) at this timing. The mail transmission is performed via a communication circuit (not shown) provided in the control unit 14 (step S117).
  • the incubator 11 automatically detects the medium drop based on the entire image (step S103), so that it is possible to save the user from specifying the position of the medium drop. Further, since the medium drop detection (step S103) is performed based on the color distribution of the entire image, the accuracy is high.
  • the incubator 11 since the incubator 11 according to the present embodiment automatically detects a fertilized egg based on the drop image (step S107), it is possible to save the user from specifying the position of the fertilized egg.
  • the detection of the fertilized egg is performed by a circular pattern search process (described later) for the drop image, it is fast and accurate.
  • the circular pattern detected in the circular pattern search process is an image of the fertilized egg. It is determined again whether or not (step S108). Therefore, the detection accuracy of a fertilized egg is high.
  • the incubator 11 of the present embodiment changes the acquisition condition of the drop image when the image of the fertilized egg is not detected from the drop image based on the possibility that the fertilized egg cannot be focused (step S109 NO). (Step S110), the drop image is reacquired. Therefore, there is little possibility that the detection of a fertilized egg will fail.
  • the user of the incubator 11 simply stores the culture container 30 in the incubator 11 and inputs an observation schedule (time-lapse observation time interval, etc.) to the incubator 11 to display a detailed image of the fertilized egg floating in the medium drop. 11 can be automatically acquired.
  • an observation schedule time-lapse observation time interval, etc.
  • FIG. 13 is a flowchart of the circular pattern search process by the image processing unit 55.
  • Step S301 The image processing unit 55 inputs an image.
  • the input image is an image 60 as shown in FIG.
  • the image 60 there are three kinds of annular patterns 61a, 61b, 61c having different sizes and one partial annular pattern 61d.
  • Step S302 The image processing unit 55 performs a bright portion extraction process on the image 60.
  • Step S303 The image processing unit 55 sets a measurement point on the pixel of pixel number i.
  • Step S304 As shown in FIG. 15, the image processing unit 55 measures the luminance distribution I (r) of the line-shaped region 66 starting from the measurement point 65. Note that “r” represents a position on the line-shaped region 66 by a distance from the measurement point 65, and is hereinafter referred to as “radial position”.
  • the image processing unit 55 repeats the measurement of the luminance distribution I (r) a plurality of times while changing the rotational position ⁇ of the line-shaped region 66 around the measurement point 65 by a predetermined angle (for example, 45 °).
  • a predetermined angle for example, 45 °.
  • Step S305 The image processing unit 55 integrates all the luminance distributions I (r) measured in step S304 to obtain an integrated luminance distribution V (r).
  • This integrated luminance distribution V (r) represents the integrated luminance distribution over the ⁇ direction of the line-shaped region 66.
  • the integrated luminance distribution V (r) One peak as shown in FIG. 16 appears.
  • the radial position P2 that gives a peak to the integrated luminance distribution V (r) is determined by the radius of the annular pattern (or partial annular pattern).
  • Step S306 The image processing unit 55 determines whether or not the maximum value of the integrated luminance distribution V (r) exceeds the threshold value Ti2. If the threshold value Ti2 is exceeded, the process proceeds to step S307. If the maximum value of the integrated luminance distribution V (r) is equal to or less than the threshold value Ti2, the pixel number i is incremented by 1, and the process returns to step S303.
  • Step S307 As shown in FIG. 17, the image processing unit 55 sets a ring-shaped region 67 having the measurement point 65 as the center and the radial position r equal to the value P2, and the luminance distribution I ( ⁇ of the ring-shaped region 67 ). Then, the image processing unit 55 repeats the measurement of the luminance distribution I ( ⁇ ) a plurality of times while changing the radial position r of the ring-shaped region 67 in the vicinity of the value P2.
  • Step S308 The image processing unit 55 integrates all the luminance distributions I ( ⁇ ) measured in step S307 to obtain an integrated luminance distribution V ( ⁇ ).
  • This integrated luminance distribution V ( ⁇ ) represents the integrated luminance distribution over the r direction of the ring-shaped region 66.
  • the integrated luminance distribution V ( ⁇ ) is substantially equal as shown in FIG. It becomes like.
  • the integrated luminance distribution V ( ⁇ ) is non-uniform.
  • Step S308 The image processing unit 55 calculates a variance value of the integrated luminance distribution V ( ⁇ ) measured in step S308, and determines whether or not the calculated variance value is smaller than a predetermined threshold value Tv2. If the variance is smaller than the threshold value Tv2, the process proceeds to step S309. If the variance is greater than or equal to the threshold value Tv2, the pixel number i is incremented by 1, and the process returns to step S303.
  • Step S309 The image processor 55 outputs the coordinates of the current measurement point 65 set on the image 60 as the annular pattern existence position, and outputs the value of the current radial position P2 as the radius of the annular pattern. To do. Then, the pixel number i is incremented by 1, and the process returns to step S303. Note that the processing from step S303 to step S309 is repeated until the pixel number i reaches the maximum value N (description of step S309 above).
  • a circular pattern of any size can be detected at high speed.
  • FIG. 19 is an operation flowchart of the control unit 14 in the IVF mode of the present embodiment. In FIG. 19, the same steps as those in FIG. 19
  • Step S101 The control unit 14 places the culture vessel 30 on a predetermined position of the sample stage 47 in the same procedure as Step S101 in FIG.
  • Step S102 The control unit 14 acquires the entire image I whole of the culture vessel 30 in the same procedure as Step S102 of FIG.
  • Step S103 The control unit 14 uses the same procedure as Step S103 in FIG. 6 to determine the coordinates (x 1 , y 1 ) to (x 7 , y 7 ) of the centers of the seven medium drops in the culture container 30 as the culture container.
  • 30 management data is stored in the storage unit 14a. Further, the control unit 14 causes the user to input an observation schedule of the culture vessel 30, writes the observation schedule into the management data, and stores the culture vessel 30 in the stocker 25.
  • Step S104 The control unit 14 determines whether or not the observation start time of the culture vessel 30 has arrived in the same procedure as Step S104 of FIG. When the observation start time has come, the process proceeds to step S105, and when the observation start time has not come, the process waits.
  • Step S105 The control unit 14 places the culture vessel 30 at a predetermined position on the sample stage 47 in the same procedure as Step S105 of FIG. At this time, the drop number i is set to the initial value “1”.
  • Step S106 The control unit 14 obtains the drop image I i (that is, the partial drop images I ia to I id ) in the same procedure as Step S106 in FIG. 6, and each of the partial drop images I ia to I id . Information on the focus position (the height of the focus surface) is stored.
  • Step S107 The control unit 14 performs the same procedure as Step S107 in FIG. 6 with the coordinates (x i1 ′) of the center of all the annular patterns (including both fertilized eggs and bubbles) shown in the drop image I i. , Y i1 ′) to (x im ′, y im ′) are calculated.
  • Step S211 The control unit 14 specifies the coordinate groups (x i1 ′, y i1 ′) to (x im ′, y im ′) to the observation unit 28 and coordinates (x i1 ′, y i1 ′) to ( The observation unit 28 is instructed to sequentially acquire a high-magnification phase difference image of an object located at x im ′, y im ′).
  • the observation unit 28 arranges the culture vessel 30 in the optical path of the microscope for phase difference observation (the microscopic observation unit 53 and the first illumination unit 51), and the combination of the objective lens 61 and the phase filter 62 is used for 10 ⁇ observation.
  • the combination (objective lens 61 high and phase filter 62 high ) is set.
  • the observation unit 28 performs high magnification while sequentially aligning the optical axis position of the objective lens 61 high with respect to the culture vessel 30 to the coordinates (x i1 ′, y i1 ′) to (x im ′, y im ′).
  • the phase difference images I i1 ′ to I im ′ are acquired.
  • Each of the high-magnification phase difference images I i1 ′ to I im ′ includes one annular pattern (fertilized egg or bubble).
  • the high-magnification phase difference images I i1 ′ to I im ′ are referred to as “annular pattern images I i1 ′ to I im ′”.
  • Step S208 The control unit 14 calculates the luminance dispersion value (or the sum of the luminance differential values) inside the annular pattern existing in each of the annular pattern images I i1 ′ to I im ′, and compares it with the threshold value. And the control unit 14 considers the cyclic
  • Step S209 The control unit 14, egg image I i 'is determined whether or not the detected, egg image I i' in step S208 if is not detected, the drop image I i (partial drop Drop number i The process proceeds to step S110 to reacquire images I ia to I id ).
  • Step S110 The control unit 14 changes the acquisition conditions for the drop image I i (partial drop images I ia to I id ) in the same procedure as step S110 in FIG. 6, and then returns to step S106.
  • Step S112 The control unit 14 stores the egg image I i ′ detected in step S208 as observation data of the culture container 30 in the storage unit 14a as in step S112 of FIG.
  • Step S113 The control unit 14 determines whether or not the current drop number is the final value (7) in the same procedure as Step S111 of FIG. 6, and if it is the final value, proceeds to Step S112 ′. If it is not the final value, the current drop number is incremented by 1, and the process returns to step S106.
  • Step S114 The control unit 14 transports the culture vessel 30 from the sample stage 47 to a predetermined storage position of the stocker 25 in the same procedure as Step S114 of FIG.
  • Step S115 The control unit 14 performs blastocyst discrimination processing on each of the egg images I 1 ′ to I 7 ′ in the same procedure as Step S115 in FIG.
  • Step S116 The control unit 14 determines whether or not there is a blastocyst image in the egg images I 1 ′ to I 7 ′ in the same procedure as Step S116 in FIG. Is returned to step S104, and if not, the process immediately returns to step S104.
  • Step S117 The control unit 14 displays on the monitor 56a that one or more blastocysts have been generated in the culture vessel 30 in the same procedure as step S117 in FIG. 6, and returns to step S104. Therefore, the user can take appropriate measures for fertilized eggs in the culture container 30 at an early stage.
  • the incubator 11 of the present embodiment determines whether or not the circular pattern detected in the circular pattern search process is an image of a fertilized egg, not a low-magnification phase difference image (drop image) but a high-magnification phase difference. This is performed based on an image (annular pattern image). Therefore, according to the incubator 11 of this embodiment, although the number of high-magnification phase difference images to be acquired is larger than that of the first embodiment, it is possible to improve the accuracy of discrimination.
  • the incubator 11 of any of the above-described embodiments may operate the control unit 14 as follows. That is, when the number of executions of step S110 exceeds the predetermined number, the control unit 14 determines that it is impossible to detect a fertilized egg regarding the current drop number, and displays that on the monitor 56a (warning display). I do.
  • control unit 14 may send an e-mail to the user's personal computer (or mobile) at this timing in order to issue a warning in real time to the user away from the incubator.
  • the incubator 11 performs a search on a partial drop image in order to reduce the amount of calculation in the circular pattern search process (step S107) during the second and subsequent observations (after the second round).
  • the range may be limited only to the vicinity of the detection position in the previous round.
  • an area near the detection position in the previous round may be searched preferentially.
  • the incubator 11 of any of the above-described embodiments automatically detects the medium drop from the culture container 30, but instead of automatically detecting the medium drop, the user may designate the position of the medium drop. Good.
  • the incubator 11 of any of the above-described embodiments determines the focus adjustment range at the time of acquisition of the drop image, egg image, and annular pattern image in the VIF mode. You may restrict
  • phase difference observation method is applied to the microscopic observation unit 53 of any of the above-described embodiments as a method of observing cultured cells that are transparent objects
  • other observation methods that can observe transparent objects
  • a differential interference observation method, a dark field observation method, a polarization observation method, or the like may be applied.
  • the current measurement point is located at the center of the circular pattern or fan-shaped pattern, one distinct peak appears in the differential waveform V ′ (r), but the current measurement point is circular. If it is not located at the center of the pattern or fan-shaped pattern, one distinct peak does not appear in the differential waveform V ′ (r). Therefore, if the differential waveform V ′ (r) is used instead of the integrated luminance distribution V (r) in the next step S306, the circular pattern search is performed in the same manner as the circular pattern is detected in the circular pattern search process. A circular pattern can be detected by processing.
  • the incubator 11 of the above-described embodiment is equipped with a VIF mode in which cells (here, fertilized eggs) included in each of a plurality of medium drops are observed.
  • VIF mode in which cells (here, fertilized eggs) included in each of a plurality of medium drops are observed.
  • These modes may be installed.
  • a mode in which a plurality of cells included in one medium are observed may be installed.
  • the image processing unit 55 may execute a part of the processing by the control unit 14.
  • control unit 14 may execute part or all of the processing by the image processing unit 55.
  • control unit 14 built in the incubator 11 executes the control program of the incubator 11, but part or all of the control program is connected to the incubator 11.
  • the terminal device may execute.

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Abstract

本発明は、観察対象となるべきポイントを指定するユーザの手間を省くことを目的とする。そのために、本発明の培養装置の制御装置は、培養容器を収容する恒温室（１２）と、前記恒温室内の前記培養容器の所定領域を第１拡大倍率で撮像する第１撮像光学系（５３）と、前記恒温室内の前記培養容器の前記所定領域よりも狭い領域を前記第１拡大倍率より高い第２拡大倍率で撮像する第２撮像光学系（５３）とを備えた培養装置の制御装置であって、前記培養容器の所定領域を前記第１撮像光学系に撮像させる広視野観察手段（１４）と、前記広視野観察手段が前記撮像で取得した画像に基づき前記所定領域の中で所定の特徴を有した対象物体を探索する探索手段（５５）と、前記探索手段が前記所定領域から検出した前記対象物体を前記第２撮像光学系に撮像させる微視的観察手段（１４）と、前記微視的観察手段が前記撮像で取得した画像を記録する記録手段（１４ａ）とを備える。

Description

培養装置の制御装置及び制御プログラム
　本発明は、培養物の観察機能を備えた培養装置の制御装置及び制御プログラムに関する。
　生殖補助医療技術（ＡＲＴ：Assisted Reproductive Technology）、例えば体外受精（ＩＶＦ：In-vitro Fertilization）や顕微授精（ＩＣＳＩ：Intracytoplasmic Sperm Injection）では、一人の母体から一度に採取された５～２０個の卵子を体外受精させ、それらの受精卵を培養容器上に作られた２０μｌ程度の培地ドロップに１個ずつ入れる。培地ドロップの表面はミネラルオイルでコートされ、その状態で培養容器ごと培養装置へ収容される。この環境下で、受精卵は分裂を開始する。
　培養担当者は、受精卵の生育状態を一定期間毎に観察し、必要に応じて培地の交換や受精卵のスコア付けを行う。そして数日後に胚盤胞と呼ばれる状態にまで成長した良好な胚盤胞は、母体へ戻される。それ以外の胚盤胞は冷凍保存される。
　以上の手順を踏むＩＶＦ又はＩＣＳＩに例えば特許文献１に記載の培養装置を適用すれば、環境暴露による受精卵のダメージを抑えながら、受精卵の観察・記録・管理を自動で行うことができる。
特開２００７－６８４１号公報 特開２００１－２６４３１８号公報
　　しかしながら、特許文献１の培養装置を現状のまま適用した場合、次のような問題が生じる。
　先ず、受精卵は培地ドロップ内を浮遊する可能性があるので、培養担当者が予め培養装置へ受精卵の位置座標を指定したとしても、観察視野から受精卵が外れる可能性がある。このため、培養担当者は観察の度に位置座標を指定し直さなければならない。
　しかも、一人の母体から採取される卵の個数は５～２０個程度であり、これらは一括して管理される必要があるので、培養担当者が一度に指定する位置座標の数は最大で２０箇所にも及ぶ。
　因みに、特許文献２には、観察視野内を浮遊する細胞を追跡する技術が開示されているものの、追跡を行うために必要な具体的手法は開示されておらず、細胞が観察視野から外れる可能性も想定されていない。
　本発明は、以上の問題に鑑みてなされたものであり、観察対象となるべきポイントを指定するユーザの手間を省くことのできる培養装置の制御装置及び制御プログラムを提供することを目的とする。
　本発明の培養装置の制御装置は、培養容器を収容する恒温室と、前記恒温室内の前記培養容器の所定領域を第１拡大倍率で撮像する第１撮像光学系と、前記恒温室内の前記培養容器の前記所定領域よりも狭い領域を前記第１拡大倍率より高い第２拡大倍率で撮像する第２撮像光学系と、を備えた培養装置の制御装置であって、前記培養容器の所定領域を前記第１撮像光学系に撮像させる広視野観察手段と、前記広視野観察手段が前記撮像で取得した画像に基づき前記所定領域の中で所定の特徴を有した対象物体を探索する探索手段と、前記探索手段が前記所定領域から検出した前記対象物体を前記第２撮像光学系に撮像させる微視的観察手段と、前記微視的観察手段が前記撮像で取得した画像を記録する記録手段とを備えたことを特徴とする。
　なお、前記探索手段は、円形状の輪郭を有した物体を前記対象物体として探索してもよい。
　また、前記探索手段は、円形状の輪郭を有した物体のうち、輝度分散値が閾値以上であるものを前記対象物体として探索してもよい。
　また、前記探索手段は、円形状の輪郭を有した物体のうち、輝度微分値の総和が閾値以上であるものを前記対象物体として探索してもよい。
　また、本発明の培養装置の制御装置は、前記探索手段が前記対象物体を検出できなかった場合には、前記第１撮像光学系の撮像条件を変更してから前記広視野観察手段、前記探索手段を再動作させる再動作手段を更に備えてもよい。
　また、前記記録手段は、前記微視的観察手段が取得した画像のうち、輝度分散値が閾値未満である前記対象物体を含む画像を、前記記録の対象から排除してもよい。
　また、前記記録手段は、前記微視的観察手段が取得した画像のうち、輝度微分値の総和が閾値未満である前記対象物体を含む画像を、前記記録の対象から排除してもよい。
　また、本発明の培養装置の制御装置は、前記記録手段が前記記録の対象とした画像に所定の特徴があるか否かを判別し、所定の特徴があった場合はユーザへその旨を通知する通知手段を更に備えてもよい。
　本発明の培養装置の制御プログラムは、培養容器を収容する恒温室と、前記恒温室内の前記培養容器の所定領域を第１拡大倍率で撮像する第１撮像光学系と、前記恒温室内の前記培養容器の前記所定領域よりも狭い領域を前記第１拡大倍率より高い第２拡大倍率で撮像する第２撮像光学系と、を備えた培養装置のコンピュータが実行する制御プログラムであって、前記培養容器の所定領域を前記第１撮像光学系に撮像させる広視野観察手順と、前記広視野観察手順の前記撮像で取得した画像に基づき前記所定領域の中で所定の特徴を有した対象物体を探索する探索手順と、前記探索手順において前記所定領域から検出した前記対象物体を前記第２撮像光学系に撮像させる微視的観察手順と、前記微視的観察手順の前記撮像で取得した画像を記録する記録手順とを含むことを特徴とする。
　なお、前記探索手順では、円形状の輪郭を有した物体を前記対象物体として探索してもよい。
　また、前記探索手順では、円形状の輪郭を有した物体のうち、輝度分散値が閾値以上であるものを前記対象物体として探索してもよい。
　また、前記探索手順では、円形状の輪郭を有した物体のうち、輝度微分値の総和が閾値以上であるものを前記対象物体として探索してもよい。
　また、前記記録手順では、前記微視的観察手順で取得された画像のうち、輝度分散値が閾値未満である前記対象物体を含む画像を、前記記録の対象から排除してもよい。
　また、前記記録手順では、前記微視的観察手順で取得された画像のうち、輝度微分値の総和が閾値未満である前記対象物体を含む画像を、前記記録の対象から排除してもよい。
本実施形態のインキュベータの正面図である。 正面扉１８が開放されたときにおけるインキュベータの正面図である。 観察ユニット２８の構成を示す概略図である。 インキュベータ１１の回路ブロック図である。 （Ａ）は、本実施形態の培養容器３０を上面から見た概略図であり、（Ｂ）は、培養容器３０の断面の概略図である。 第１実施形態のＩＶＦモードにおける制御ユニット１４の動作フローチャートである。 全体画像Ｉｗｈｏｌｅを説明する図である。 ステップＳ１０３の処理を説明する図である。 部分ドロップ画像Ｉｉａ～Ｉｉｄを説明する図である。 ステップＳ１０７の処理を説明する図である。 受精卵ａｉと気泡ｂｉとの関係を説明する図である。 卵画像Ｉ１’～Ｉ７’を説明する図である。 環状パターンの探索処理のフローチャートである。 画像処理部５５に入力された画像の例である。 ステップＳ３０４，Ｓ３０５の処理を説明する図である。 測定点６５が環状パターン又は部分環状パターンの中心に位置していた場合の積算輝度分布Ｖ（ｒ）の例を示す図である。 ステップＳ３０７，Ｓ３０８の処理を説明する図である。 測定点６５が環状パターンの中心に位置していた場合の積算輝度分布Ｖ（θ）の例を示す図である。 第２実施形態のＩＶＦモードにおける制御ユニット１４の動作フローチャートである。
　［第１実施形態］
　以下、本発明の第１実施形態を説明する。本実施形態はインキュベータの実施形態である。
　先ず、本実施形態のインキュベータの構造を説明する。
　図１は、本実施形態のインキュベータの正面図であり、図２は、正面扉１８が開放されたときにおけるインキュベータの正面図である。図１，図２に示すとおり、インキュベータ１１は、生体細胞の培養を行う第１筐体１２と、制御ユニット１４を収納する第２筐体１３とを有しており、第１筐体１２は第２筐体１３の上部に配置される。
　第２筐体１３の前面には操作パネル５６が設けられており、その操作パネル５６には、モニタや入力釦などが設けられている。第２筐体１３の内部には、制御ユニット１４と、観察ユニット２８の一部とが配置される。
　第１筐体１２の内部には、断熱材で覆われた恒温室１５（図２）が形成されている。この恒温室１５は、第１筐体１２の正面に形成された正面開口１６（図２）と、第１筐体１２の左側面に形成された搬出入口１７（図２）とによって外部と連絡している。このうち正面開口１６（図２）は、観音開きの正面扉１８によって開閉可能であり、搬出入口１７（図２）は、スライド式の自動扉１９（図１）によって開閉可能である。なお、搬出入口１７のサイズは培養容器３０（図２）が通過可能なサイズに設定されている。また、第１筐体１２の底面には、正面側からみて右寄りの位置に開口２０（図２）が形成されており、その開口２０（図２）から観察ユニット２８の一部が突設されている。
　恒温室１５の壁面には、温度調整装置、噴霧装置、ガス導入部、環境センサユニットなどが内蔵されている。このうち温度調整装置はペルチェ素子を有しており、ペルチェ効果によって恒温室１５（図２）の加熱または冷却を行う。噴霧装置は、恒温室１５（図２）内に噴霧を行って恒温室１５（図２）内の湿度を調整する。ガス導入部は、インキュベータ外の二酸化炭素ボンベと接続されており、その二酸化炭素ボンベから恒温室１５（図２）へと二酸化炭素を導入することにより、恒温室１５（図２）内の二酸化炭素濃度を調整する。環境センサユニットは、恒温室１５（図２）内の温度、湿度、二酸化炭素濃度をそれぞれ検出する。
　第１筐体１２の内部には、ストッカー２５と、容器搬出入機構２６（図２）と、容器搬送機構２７とが配置され、前述したとおり観察ユニット２８の一部も配置されている。
　ストッカー２５の配置箇所は、第１筐体１２の正面からみて恒温室１５（図２）の左側である。ストッカー２５は、複数の棚を有しており、各々の棚に培養容器３０を収納することができる。ストッカー２５の最下段は、第１筐体１２の搬出入口１７（図２）に連続しており、その最下段のスペースには、培養容器３０を搬出入するための容器搬出入機構２６（図２）が設置される。
  容器搬送機構２７の配置箇所は、第１筐体１２の正面からみて恒温室１５（図２）の中央である。この容器搬送機構２７は、ストッカー２５、容器搬出入機構２６（図２）、観察ユニット２８との間で培養容器３０（図２）の受け渡しを行う。
  観察ユニット２８の配置箇所は、第１筐体１２の正面からみて恒温室１５（図２）の右側である。この観察ユニット２８は、試料台４７（図２）と、試料台４７（図２）の上方に張り出したアーム４８（図２）と、本体部分４９（図２）とを有している。このうち試料台４７（図２）及びアーム４８（図２）が第１筐体１２の恒温室１５（図２）の側に位置し、本体部分４９（図２）が第２筐体１３の側に位置している。
　図３は、観察ユニット２８の構成を示す概略図である。図３に示すとおり、観察ユニット２８は、試料台４７と、第１照明部５１と、第２照明部５２と、顕微観察部５３と、容器観察部５４と、画像処理部５５とを有している。
　このうち、顕微観察部５３は本体部分４９に内蔵されており、照明部５１は、アーム４８のうち、顕微観察部５３と対向する位置に配置される。これらの顕微観察部５３と第１照明部５１とが、位相差観察用（微視的観察用）の顕微鏡を構成する。
　また、容器観察部５４はアーム４８に収納されており、第２照明部５２は、本体部分４９のうち、容器観察部５４と対向する位置に配置される。これらの容器観察部５４と第２照明部５２とが、全体観察用（広視野観察用）の観察系を構成する。
　試料台４７は、透光性の材質で構成されており、その上に培養容器３０が載置される。この試料台４７は、高精度なステージからなり、培養容器３０を水平方向（ＸＹ方向）に移動させることにより、培養容器３０を位相差観察用の顕微鏡（顕微観察部５３及び第１照明部５１）の光路へ挿入したり、全体観察用の観察系（容器観察部５４及び第２照明部５２）の光路へ挿入したりすることができる。
　また、試料台４７は、培養容器３０と位相差観察用の顕微鏡とＺ方向の位置関係を変化させることにより、位相差観察用の顕微鏡の焦点調節を行うことができる。また、試料台４７は、培養容器３０と位相差観察用の顕微鏡とのＸＹ方向の位置関係を変化させることにより、位相差観察用の顕微鏡の観察ポイントを変更することができる。
　観察ユニット２８は、培養容器３０を全体観察用の観察系（容器観察部５４及び第２照明部５２）の光路へ挿入した状態で、培養容器３０の全体像をカラーで撮像することができる。以下、この撮像によって取得される画像を「全体画像」という。
　また、観察ユニット２８は、培養容器３０を位相差観察用の顕微鏡（顕微観察部５３及び第１照明部５１）の光路へ挿入した状態で、培養容器３０の一部の拡大位相差像を撮像することができる。以下、この撮像によって取得される画像を「位相差画像」という。
　なお、顕微観察部５３の対物レンズ６１及び位相フィルタ６２の組み合わせは、観察倍率の異なる少なくとも２種類の組み合わせの間で切り替えることが可能である。ここでは、２倍観察用の組み合わせ（対物レンズ６１ｌｏｗ及び位相フィルタ６２ｌｏｗ）と、１０倍観察用の組み合わせ（対物レンズ６１ｈｉｇｈ及び位相フィルタ６２ｈｉｇｈ）との間で切り替わるものとする。
　よって、観察ユニット２８は、対物レンズ６１ｌｏｗ及び位相フィルタ６２ｌｏｗを光路に設定した状態で倍率２倍の位相差画像（低倍位相差画像）を取得することができ、対物レンズ６１ｈｉｇｈ及び位相フィルタ６２ｈｉｇｈを光路に設定した状態で倍率１０倍の位相差画像（高倍位相差画像）を取得することができる。なお、観察ユニット２８による低倍位相差画像の拡大倍率は、前述した全体画像の拡大倍率よりも高い。
　画像処理部５５は、観察ユニット２８が取得した画像（全体画像、低倍位相差画像、高倍位相差画像の何れか）に対して各種の画像処理を施す。画像処理部５５が実行可能な画像処理には、入力された画像の中から色付いた領域を検出する色検出処理（後述）と、入力された画像から環状パターンを探索する環体探索処理（後述）と、入力された画像が胚盤胞の画像であるか否かを判別する胚盤胞判別処理（後述）とがある。
　次に、インキュベータ１１の電気系統を説明する。
　図４は、インキュベータ１１の回路ブロック図である。図４に示すとおり、インキュベータ１１の制御ユニット１４は、自動扉１９の扉開閉機構１９ａ、温度調整装置２１、噴霧装置２２、ガス導入部２３、環境センサユニット２４、容器搬出入機構２６、容器搬送機構２７、観察ユニット２８、モニタ５６ａ、入力釦５６ｂとそれぞれ接続されている。
　制御ユニット１４は、所定の制御プログラムに従ってインキュベータ１１の各部を統括的に制御する。一例として、制御ユニット１４は、温度調整装置２１、噴霧装置２２、ガス導入部２３、環境センサユニット２４をそれぞれ制御して恒温室１５内を所定の環境条件に維持する。また、制御ユニット１４は、ユーザが入力した観察スケジュールに基づいて、観察ユニット２８および容器搬送機構２７を制御して、培養容器３０の観察シーケンスを自動的に実行する。
　なお、本実施形態のインキュベータ１１では、観察に関する制御ユニット１４の動作モードとして、後述する「ＩＶＦモード」が搭載されているものとする。ユーザは、ユーザがモニタ５６ａ及び入力釦５６ｂを介して制御ユニット１４の動作モードをインキュベータ１１へ指定することができる。
　また、制御ユニット１４は、ハードディスクや不揮発性メモリなどで構成された記憶部１４ａを有しており、後述する各種のデータを記憶しておくこともできる。
　次に、本実施形態の培養容器３０を説明する。
　図５（Ａ）は、本実施形態の培養容器３０を上面から見た概略図であり、図５（Ｂ）は、培養容器３０の断面の概略図である。図５（Ａ），（Ｂ）に示すとおり、本実施形態の培養容器３０は、所謂ディッシュからなり、その直径は約３５ｍｍである。培養容器３０の底面には、２０μｌ程度の培地ドロップＤが複数個（ここでは７個とする。）、不規則に並べて形成されている。
　個々の培地ドロップＤの表面及び間隙は、乾燥を防ぐため無色透明のミネラルオイルＯで満たされており、個々の培地ドロップＤの中には、共通の母体から共通の時期に採取された受精卵ａが１個ずつ入っている。個々の培地ドロップＤの直径は、約７ｍｍであり、個々の受精卵ａの直径は、約１００μｍである。
　なお、個々の培地ドロップＤは、フェノールレッドなどの試薬で色付けされている。また、培地ドロップＤは、培養容器３０の底面に付着しているが、受精卵ａは、培地ドロップＤの内部を浮遊する可能性がある。
　次に、本実施形態のＩＶＦモードにおける制御ユニット１４の動作を説明する。
　図６は、本実施形態のＩＶＦモードにおける制御ユニット１４の動作フローチャートである。
　ステップＳ１０１：制御ユニット１４は、ユーザの操作に応じて培養容器３０を恒温室１５へ搬入すると共に、培養容器３０の搬送を容器搬送機構２７へ指示する。容器搬送機構２７は、その培養容器３０を搬送し、試料台４７の所定位置へ載置する。
　ステップＳ１０２：制御ユニット１４は、培養容器３０の全体画像を取得するよう観察ユニット２８へ指示する。観察ユニット２８は、培養容器３０を全体観察用の観察系（容器観察部５４及び第２照明部５２）の光路へ配置し、その状態で例えば図７に示すような全体画像Ｉｗｈｏｌｅを取得し、その全体画像Ｉｗｈｏｌｅをモニタ５６ａへ表示する。なお、全体画像Ｉｗｈｏｌｅには、７個の培地ドロップＤの像（ドロップ像）ＩＤが写っている。
　ステップＳ１０３：制御ユニット１４は、ステップＳ１０２で取得された全体画像Ｉｗｈｏｌｅへ色検出処理を施すよう画像処理部５５へ指示する。画像処理部５５は、全体画像Ｉｗｈｏｌｅの中で赤色付いた複数の領域（フェノールレッドにより色付けされた領域）を検出する。制御ユニット１４は、画像処理部５５が検出した複数の領域に対し、配置順にドロップ番号１～７を付与する。これによって、７個のドロップ像ＩＤにラベリングが施される。以下、ドロップ番号ｉが付与されたドロップ像ＩＤを「ＩＤｉ」と表記する（図８参照）。
　そして、制御ユニット１４は、試料台４７のＸＹ方向の位置座標と、全体画像Ｉｗｈｏｌｅにおける個々のドロップ像ＩＤ１～ＩＤ７の中心座標とに基づき、図８に示すとおり、培養容器３０における個々の培地ドロップの中心の座標（ｘ１，ｙ１）～（ｘ７，ｙ７）を算出し、それらの座標（ｘ１，ｙ１）～（ｘ７，ｙ７）をドロップ番号１～７にそれぞれ対応付けてから培養容器３０の管理データとして記憶部１４ａに記憶する。
　その一方で、制御ユニット１４は、培養容器３０の観察スケジュール（タイムラプス観察の時間間隔など）をユーザに入力させ、その観察スケジュールを培養容器３０の管理データへ書き込む。
　その後、制御ユニット１４は、培養容器３０をストッカー２５へ収納するよう容器搬送機構２７へ指示する。容器搬送機構２７は、培養容器３０をストッカー２５へ収納する。これによって、培養容器３０の登録が終了する。
　ステップＳ１０４：制御ユニット１４は、培養容器３０の管理データに書き込まれた観察スケジュールと現在日時とを比較して、培養容器３０の観察開始時期が到来したか否かを判別する。観察開始時期が到来した場合にはステップＳ１０５に移行し、観察開始時期が到来していない場合には待機する。
　ステップＳ１０５：制御ユニット１４は、培養容器３０の搬送を容器搬送機構２７に指示する。容器搬送機構２７は、培養容器３０をストッカー２５から搬出して試料台４７の所定位置に載置する。この時点で、ドロップ番号ｉは初期値「１」に設定される。
　ステップＳ１０６：制御ユニット１４は、現在のドロップ番号ｉに対応する培地ドロップの画像（ドロップ画像Ｉｉ）を取得するために、現在のドロップ番号ｉに対応する座標（ｘｉ，ｙｉ）を観察容器３０の管理データから読み出して観察ユニット２８へ指定すると共に、座標（ｘｉ，ｙｉ）に位置する物体の低倍位相差画像を取得するよう観察ユニット２８へ指示する。観察ユニット２８は、培養容器３０を位相差観察用の顕微鏡（顕微観察部５３及び第１照明部５１）の光路へ配置すると共に、対物レンズ６１及び位相フィルタ６２の組み合わせを、２倍観察用の組み合わせ（対物レンズ６１ｌｏｗ及び位相フィルタ６２ｌｏｗ）に設定する。
　ここで、対物レンズ６１ｌｏｗの視野サイズ（４ｍｍ×４ｍｍ）は、培地ドロップ１個分のサイズ（直径７ｍｍ）よりも小さい。そこで、観察ユニット２８は、培養容器３０に対する対物レンズ６１ｌｏｗの光軸位置を座標（ｘｉ，ｙｉ）の周りでステップ状に移動させながら、図９に示すような低倍位相差画像Ｉｉａ～Ｉｉｄを順に取得する。それら低倍位相差画像Ｉｉａ～Ｉｉｄの全体がドロップ画像Ｉｉである。よって以下では、低倍位相差画像Ｉｉａ～Ｉｉｄを「部分ドロップ画像Ｉｉａ～Ｉｉｄ」と称す。なお、対物レンズ６１ｌｏｗの視野サイズを培地ドロップ１個分の視野サイズにして、画像取得を一括で行ってもよい。
　なお、観察ユニット２８は、個々の画像を取得する際に、コントラスト方式によるオートフォーカス制御を行う。このオートフォーカス制御は、画像のコントラストを監視しながら試料台４７の高さ（Ｚ方向の位置）を調節し、そのコントラストがピークとなるような高さで試料台４７を停止させるものである。部分ドロップ画像Ｉｉａ～Ｉｉｄの各々の取得時におけるピント位置（フォーカス面の高さ）の情報は、制御ユニット１４によって記憶される。
　因みに、観察ユニット２８は、オートフォーカス制御の焦点調節範囲を、制御ユニット１４からの指示に応じて制限することができる。但し、或るドロップ番号ｉの部分ドロップ画像Ｉｉａ～Ｉｉｄを最初に取得するときのオートフォーカス制御では、焦点調節範囲は十分に広く設定される。
　ステップＳ１０７：制御ユニット１４は、ステップＳ１０６で取得された部分ドロップ画像Ｉｉａ～Ｉｉｄの各々へ環状パターンの探索処理（後述）を施すよう画像処理部５５へ指示する。画像処理部５５は、環状パターンの探索処理（後述）により、部分ドロップ画像Ｉｉａ～Ｉｉｄの各々から、例えば図１０に示すように環状パターンＩｃを検出する。
　そして、制御ユニット１４は、試料台４７のＸＹ方向の位置座標と、ドロップ画像Ｉｉにおける環状パターンＩｃの中心座標とに基づき、ドロップ画像Ｉｉに写っている全ての環状パターン（受精卵と気泡との双方を含む）の中心の座標（ｘｉ１’，ｙｉ１’）～（ｘｉｍ’，ｙｉｍ’）を算出する。なお、ここでは説明上、ドロップ画像Ｉｉから検出された環状パターンＩｃの個数を「ｍ」とおく。
　通常、受精卵の像の輪郭部は位相差画像上にハロとなって現れるので、検出された環状パターンＩｃは、受精卵の像である可能性が高い。但し、図１１に示すとおり、培養容器３０の表面や培地ドロップＤとミネラルオイルＯとの界面などには気泡ｂｉが付着している可能性があり、気泡ｂｉの像の輪郭部も位相差画像上にハロとなって現れる。よって、本ステップで検出される環状パターンＩｃは、受精卵ａｉの像又は気泡ｂｉの像である。
　ステップＳ１０８：制御ユニット１４は、受精卵ａｉの像と気泡ｂｉの像とを区別するために、ステップＳ１０７で検出された個々の環状パターンＩｃの内部の輝度分散値（又は輝度微分値の総和）を算出し、それぞれ閾値と比較する。そして、制御ユニット１４は、閾値以上となった環状パターンＩｃのみを受精卵ａｉの像とみなす。以下、培養容器３０における受精卵ａｉの中心の座標を（ｘｉ’，ｙｉ’）とおく。
　なお、１個の培地ドロップに入れられる受精卵の個数は１であるので、本ステップにおいて検出される受精卵ａｉの像の個数は１以下であり、特に、以下のような場合には受精卵ａｉの個数がゼロとなる。
　（１）部分ドロップ画像Ｉｉａ～Ｉｉｄの何れかの取得時に、図１１に示すとおり、対物レンズ６１ｌｏｗの視野内に気泡ｂｉと受精卵ａｉとの双方が存在し、その気泡ｂｉの光軸方向（Ｚ方向）の位置が受精卵ａｉの光軸方向の位置と離れており、しかも、気泡ｂｉの方にピントが合っていた場合。この場合、部分ドロップ画像Ｉｉａ～Ｉｉｄの何れからも受精卵ａｉの像は検出されない。
　（２）受精卵ａｉの像が、部分ドロップ画像Ｉｉａ～Ｉｉｄの境界部に位置していた場合。この場合、受精卵ａｉの像が部分ドロップ画像Ｉｉａ～Ｉｉｄの何れかに描くパターンは、全環状ではなく部分環状となってしまうので、受精卵ａｉの像は環状パターンの探索処理で検出されない。
　ステップＳ１０９：制御ユニット１４は、ステップＳ１０８で受精卵ａｉの像が検出されたか否かを判別し、受精卵ａｉの像が検出された場合はステップＳ１１１へ移行し、受精卵ａｉの像が検出されなかった場合は、ドロップ番号ｉのドロップ画像Ｉｉ（部分ドロップ画像Ｉｉａ～Ｉｉｄ）を再取得するべくステップＳ１１０へ移行する。
　ステップＳ１１０：制御ユニット１４は、部分ドロップ画像Ｉｉａ～Ｉｉｄの各々を取得するときの焦点調節範囲から、前回のフォーカス面の近傍の範囲を除外するよう観察ユニット２６へ指示すると共に、ドロップ画像Ｉｉの撮像中心（部分ドロップ画像Ｉｉａ～Ｉｉｄの中心）を現在の座標（ｘｉ，ｙｉ）から所定距離（Δｘ，Δｙ）だけずらすよう観察ユニット２６へ指示してから、ステップＳ１０６へ戻る。なお、Δｘ，Δｙの各々は、受精卵１個分に相当する距離である。このようにしてドロップ画像Ｉｉ（部分ドロップ画像Ｉｉａ～Ｉｉｄ）の取得条件を変更すれば、受精卵ａｉの像が検出される可能性を高めることができる。
　ステップＳ１１１：制御ユニット１４は、座標（ｘｉ’，ｙｉ’）を観察ユニット２８へ指定すると共に、座標（ｘｉ’，ｙｉ’）に位置する物体の高倍位相差画像を取得するよう観察ユニット２８へ指示する。観察ユニット２８は、培養容器３０を位相差観察用の顕微鏡（顕微観察部５３及び第１照明部５１）の光路へ配置すると共に、対物レンズ６１及び位相フィルタ６２の組み合わせを、１０倍観察用の組み合わせ（対物レンズ６１ｈｉｇｈ及び位相フィルタ６２ｈｉｇｈ）に設定する。
　ここで、対物レンズ６１ｈｉｇｈの視野のサイズ（０．８ｍｍ×０．８ｍｍ）は、受精卵１個分のサイズ（直径１００μｍ）よりも大きい。そこで、観察ユニット２８は、培養容器３０に対する対物レンズ６１ｈｉｇｈの光軸位置を座標（ｘｉ’，ｙｉ’）へ一致させ、その状態で、例えば図１２に示すような高倍位相差画像Ｉｉ’を取得する。この高倍位相差画像Ｉｉ’が、ドロップ番号ｉの受精卵ａｉの詳細画像である。よって、以下では高倍位相差画像Ｉｉ’を「卵画像Ｉｉ’」と称す。
　なお、卵画像Ｉｉ’の取得に当たり、制御ユニット１４は、オートフォーカス制御の焦点調節範囲を、受精卵ａｉの像の検出元となった部分ドロップ画像のフォーカス面の近傍のみに制限する。これによって、受精卵ａｉ以外の物体（気泡ｂｉやキズなど）にピントの合う可能性が抑えられる。
　ステップＳ１１２：制御ユニット１４は、ステップＳ１１１で取得した卵画像Ｉｉ’をドロップ番号ｉに対応付け、それを培養容器３０の観察データとして記憶部１４ａへ記憶する。これによって、卵画像Ｉｉ’がドロップ番号ｉにより管理されることになる。
　ステップＳ１１３：制御ユニット１４は、現在のドロップ番号が最終値（ここでは「７」）であるか否かを判別し、最終値であればステップＳ１１４へ移行し、最終値でなければ現在のドロップ番号を１だけインクリメントしてからステップＳ１０６へ戻る。したがって、ステップＳ１０６～Ｓ１１２の処理は、全てのドロップ番号１～７について実行される。その結果、培養容器３０の観察データには、７個の卵画像Ｉ１’～Ｉ７’が蓄積されることになる。
　ステップＳ１１４：制御ユニット１４は、培養容器３０の搬送を容器搬送機構２７に指示する。容器搬送機構２７は、培養容器３０を試料台４７からストッカー２５の所定の収納位置に搬送する。
　ステップＳ１１５：制御ユニット１４は、ステップＳ１１２で保存された卵画像Ｉ１’～Ｉ７’を読み出し、それら卵画像Ｉ１’～Ｉ７’の各々に対し胚盤胞判別処理を施すよう画像処理部５５へ指示する。画像処理部５５は、胚盤胞判別処理をテンプレートマッチングなどにより行う。具体的に、画像処理部５５は、胚盤胞の高倍位相差画像から予め抽出した特徴画像と、卵画像Ｉｉ’から抽出された特徴画像とを比較し、両者に一定以上の相関があった場合に、その卵画像Ｉｉ’を胚盤胞の画像とみなす。なお、胚盤胞には方向性があるので、この比較は、特徴画像を回転させながら繰り返される。
　ステップＳ１１６：制御ユニット１４は、卵画像Ｉ１’～Ｉ７’の中に胚盤胞の画像があったか否かを判別し、あった場合はステップＳ１１７を実行してからステップＳ１０４に戻り、無かった場合は即座にステップＳ１０４へ戻る。したがって、ステップＳ１０５～Ｓ１１７は、観察開始時期が到来する毎に実行される。その結果、卵画像Ｉ１’～Ｉ７’が観察時期毎に、培養容器３０の観察データに蓄積される。
　ステップＳ１１７：制御ユニット１４は、培養容器３０の中で１又は複数の胚盤胞が生成された旨をモニタ５６ａへ表示する。したがって、ユーザは培養容器３０の受精卵に対する適切な措置を早期に講じることが可能となる。なお、インキュベータ１１から離れたユーザへリアルタイムで通知を行うために、制御ユニット１４は、このタイミングでユーザのパーソナルコンピュータ（又はモバイル）へメールを送信してもよい。メールの送信は、制御ユニット１４に備えられた不図示の通信回路を介して行われる（以上、ステップＳ１１７）。
　以上、本実施形態のインキュベータ１１は、全体画像に基づき培地ドロップを自動的に検出するので（ステップＳ１０３）、培地ドロップの位置をユーザが指定する手間が省ける。また、培地ドロップの検出（ステップＳ１０３）は、全体画像の色分布に基づき行われるので、正確性が高い。
　また、本実施形態のインキュベータ１１は、ドロップ画像に基づき受精卵を自動的に検出するので（ステップＳ１０７）、受精卵の位置をユーザが指定する手間が省ける。また、受精卵の検出（ステップＳ１０７）は、ドロップ画像に対する環状パターンの探索処理（後述）によって行われるので、高速かつ正確である。
　また、本実施形態のインキュベータ１１は、環状パターンの探索処理（ステップＳ１０７）で受精卵と共に気泡が検出される可能性を踏まえ、環状パターンの探索処理で検出した環状パターンが受精卵の像であるか否かを改めて判別する（ステップＳ１０８）。したがって、受精卵の検出精度は高い。
　さらに、本実施形態のインキュベータ１１は、受精卵にピントが合わない可能性を踏まえ、ドロップ画像から受精卵の像が検出されなかった場合（ステップＳ１０９ＮＯ）には、ドロップ画像の取得条件を変更してから（ステップＳ１１０）、ドロップ画像の再取得を行う。したがって、受精卵の検出に失敗する可能性は少ない。
　したがって、インキュベータ１１のユーザは、培養容器３０をインキュベータ１１へ収納し、観察スケジュール（タイムラプス観察の時間間隔など）をインキュベータ１１へ入力するだけで、培地ドロップ内を浮遊する受精卵の詳細画像をインキュベータ１１に自動取得させることができる。
　［環状パターンの探索処理］
　以下、画像処理部５５による環状パターンの探索処理を詳しく説明する。
　図１３は、画像処理部５５による環状パターンの探索処理のフローチャートである。
　ステップＳ３０１：画像処理部５５は、画像を入力する。説明上、ここでは入力された画像を図１４に示すような画像６０とする。画像６０には、サイズの異なる３種類の環状パターン６１ａ，６１ｂ，６１ｃと、１つの部分環状パターン６１ｄとが存在している。
　なお、画像６０のハッチング部分は、相対的に輝度の低い部分を表わし、画像６０の非ハッチング部分は相対的に輝度の高い部分を表している。また、画像６０の各画素には画素番号（ｉ＝１～Ｎ）が付与されており、この時点で画素番号ｉは初期値「０」に設定される。
　ステップＳ３０２：画像処理部５５は、画像６０へ明部抽出処理を施す。
　ステップＳ３０３：画像処理部５５は、画素番号ｉの画素上に測定点を設定する。
　ステップＳ３０４：画像処理部５５は、図１５に示すとおり、測定点６５を起点としたライン状領域６６の輝度分布Ｉ（ｒ）を測定する。なお、「ｒ」は、ライン状領域６６上の位置を測定点６５からの距離で表したものであり、以下、「径位置」と称す。
　さらに、画像処理部５５は、測定点６５を中心としたライン状領域６６の回転位置θを所定角度（例えば４５°）ずつ変化させながら、輝度分布Ｉ（ｒ）の測定を複数回繰り返す。因みに、回転位置θの１回の変化量が４５°の場合、測定の繰り返し回数は８回となる。
　ステップＳ３０５：画像処理部５５は、ステップＳ３０４で測定された全ての輝度分布Ｉ（ｒ）を積算して積算輝度分布Ｖ（ｒ）を取得する。この積算輝度分布Ｖ（ｒ）は、ライン状領域６６のθ方向に亘る積算輝度分布を表す。
　ここで仮に、現在の測定点６５が図１４に示した環状パターン６１ａ，６１ｂ，６１ｃ，部分環状パターン６１ｄの何れかの中心に位置していた場合、積算輝度分布Ｖ（ｒ）には、図１６に示すような際だった１つのピークが現れる。そして、積算輝度分布Ｖ（ｒ）にピークを与えるような径位置Ｐ２は、環状パターン（又は部分環状パターン）の半径によって決まる。
　一方、仮に、現在の測定点６５が図１４に示した環状パターン６１ａ，６１ｂ，６１ｃ，部分環状パターン６１ｄの何れの中心にも位置していなかった場合、積算輝度分布Ｖ（ｒ）には、図１６に示すような際だった１つのピークが現れることはない。その場合、複数の小さなピークが現れるはずである。
　ステップＳ３０６：画像処理部５５は、積算輝度分布Ｖ（ｒ）の最大値が閾値Ｔｉ２を超えているか否かを判別する。閾値Ｔｉ２を超えている場合、ステップＳ３０７へ進み、積算輝度分布Ｖ（ｒ）の最大値が閾値Ｔｉ２以下の場合、画素番号ｉを１だけインクリメントしてからステップＳ３０３へ戻る。
　ステップＳ３０７：画像処理部５５は、図１７に示すとおり、測定点６５を中心とし、かつ径位置ｒが値Ｐ２に等しいリング状領域６７を設定し、そのリング状領域６７の輝度分布Ｉ（θ）を測定する。そして、画像処理部５５は、リング状領域６７の径位置ｒを値Ｐ２の近傍で変化させながら、輝度分布Ｉ（θ）の測定を複数回繰り返す。
　ステップＳ３０８：画像処理部５５は、ステップＳ３０７で測定された全ての輝度分布Ｉ（θ）を積算して積算輝度分布Ｖ（θ）を取得する。この積算輝度分布Ｖ（θ）は、リング状領域６６のｒ方向に亘る積算輝度分布を表す。
　ここで仮に、現在の測定点６５が図１４に示した環状パターン６１ａ，６１ｂ，６１ｃの何れかの中心に位置していた場合、積算輝度分布Ｖ（θ）は、図１８に示すとおり略一様になる。
　一方、仮に、現在の測定点６５が図１４に示した部分環状パターン６１ｄの中心に位置していた場合、積算輝度分布Ｖ（θ）は、非一様となる。
　ステップＳ３０８：画像処理部５５は、ステップＳ３０８で測定された積算輝度分布Ｖ（θ）の分散値を算出し、算出した分散値が所定の閾値Ｔｖ２より小さいか否かを判別する。分散が閾値Ｔｖ２より小さい場合はステップＳ３０９へ進み、分散が閾値Ｔｖ２以上の場合は、画素番号ｉを１だけインクリメントしてからステップＳ３０３へ戻る。
　ステップＳ３０９：画像処理部５５は、画像６０上に設定された現在の測定点６５の座標を、環状パターンの存在位置として出力すると共に、現在の径位置Ｐ２の値を、環状パターンの半径として出力する。そして、画素番号ｉを１だけインクリメントしてからステップＳ３０３へ戻る。なお、ステップＳ３０３～ステップＳ３０９の処理は、画素番号ｉが最大値Ｎとなるまで繰り返される（以上、ステップＳ３０９の説明）。
　以上の環状パターンの探索処理によれば、任意のサイズの環状パターンを高速に検出することができる。
　［第２実施形態］
　以下、本発明の第２実施形態を説明する。本実施形態もインキュベータの実施形態である。ここでは、第１実施形態との相違点のみ説明する。相違点は、ＩＶＦモードにおける制御ユニット１４の動作にある。
　図１９は、本実施形態のＩＶＦモードにおける制御ユニット１４の動作フローチャートである。図１９において、図６と同じステップには同じ符号を付した。
　ステップＳ１０１：制御ユニット１４は、図６のステップＳ１０１と同様の手順で培養容器３０を試料台４７の所定位置へ載置する。
　ステップＳ１０２：制御ユニット１４は、図６のステップＳ１０２と同様の手順で培養容器３０の全体画像Ｉｗｈｏｌｅを取得する。
　ステップＳ１０３：制御ユニット１４は、図６のステップＳ１０３と同様の手順で、培養容器３０における７個の培地ドロップの中心の座標（ｘ１，ｙ１）～（ｘ７，ｙ７）を培養容器３０の管理データとして記憶部１４ａに記憶する。また、制御ユニット１４は、培養容器３０の観察スケジュールをユーザに入力させ、その観察スケジュールをその管理データへ書き込み、培養容器３０をストッカー２５へ収納する。
　ステップＳ１０４：制御ユニット１４は、図６のステップＳ１０４と同様の手順で、培養容器３０の観察開始時期が到来したか否かを判別する。観察開始時期が到来した場合にはステップＳ１０５に移行し、観察開始時期が到来していない場合には待機する。
　ステップＳ１０５：制御ユニット１４は、図６のステップＳ１０５と同様の手順で、培養容器３０を試料台４７の所定位置に載置する。なお、この時点でドロップ番号ｉは初期値「１」に設定される。
　ステップＳ１０６：制御ユニット１４は、図６のステップＳ１０６と同様の手順で、ドロップ画像Ｉｉ（つまり部分ドロップ画像Ｉｉａ～Ｉｉｄ）を取得すると共に、部分ドロップ画像Ｉｉａ～Ｉｉｄの各々のピント位置（フォーカス面の高さ）の情報を記憶する。
　ステップＳ１０７：制御ユニット１４は、図６のステップＳ１０７と同様の手順で、ドロップ画像Ｉｉに写っている全ての環状パターン（受精卵と気泡との双方を含む）の中心の座標（ｘｉ１’，ｙｉ１’）～（ｘｉｍ’，ｙｉｍ’）を算出する。
　ステップＳ２１１：制御ユニット１４は、座標群（ｘｉ１’，ｙｉ１’）～（ｘｉｍ’，ｙｉｍ’）を観察ユニット２８へ指定すると共に、座標（ｘｉ１’，ｙｉ１’）～（ｘｉｍ’，ｙｉｍ’）に位置する物体の高倍位相差画像を順に取得するよう観察ユニット２８へ指示する。
　観察ユニット２８は、培養容器３０を位相差観察用の顕微鏡（顕微観察部５３及び第１照明部５１）の光路へ配置すると共に、対物レンズ６１及び位相フィルタ６２の組み合わせを、１０倍観察用の組み合わせ（対物レンズ６１ｈｉｇｈ及び位相フィルタ６２ｈｉｇｈ）に設定する。
　観察ユニット２８は、培養容器３０に対する対物レンズ６１ｈｉｇｈの光軸位置を、それらの座標（ｘｉ１’，ｙｉ１’）～（ｘｉｍ’，ｙｉｍ’）へ順次に一致させながら、高倍位相差画像Ｉｉ１’～ Ｉｉｍ’を取得する。高倍位相差画像Ｉｉ１’～Ｉｉｍ’の各々には、環状パターン（受精卵又は気泡）が１つずつ写っている。以下、高倍位相差画像Ｉｉ１’～Ｉｉｍ’を「環状パターン画像Ｉｉ１’～Ｉｉｍ’」と称す。
　ステップＳ２０８：制御ユニット１４は、環状パターン画像Ｉｉ１’～Ｉｉｍ’の各々に存在する環状パターンの内部の輝度分散値（又は輝度微分値の総和）を算出し、それぞれ閾値と比較する。そして、制御ユニット１４は、閾値以上となった環状パターン画像を、卵画像Ｉｉ’とみなす。但し、本ステップでは、卵画像Ｉｉ’が検出されない可能性もある。
　ステップＳ２０９：制御ユニット１４は、ステップＳ２０８で卵画像Ｉｉ’が検出されたか否かを判別し、卵画像Ｉｉ’が検出されなかった場合は、ドロップ番号ｉのドロップ画像Ｉｉ（部分ドロップ画像Ｉｉａ～Ｉｉｄ）を再取得するべくステップＳ１１０へ移行する。
　ステップＳ１１０：制御ユニット１４は、図６のステップＳ１１０と同様の手順で、ドロップ画像Ｉｉ（部分ドロップ画像Ｉｉａ～Ｉｉｄ）の取得条件を変更してから、ステップＳ１０６へ戻る。
　ステップＳ１１２：制御ユニット１４は、図６のステップＳ１１２と同様に、ステップＳ２０８で検出された卵画像Ｉｉ’を培養容器３０の観察データとして記憶部１４ａへ記憶する。
　ステップＳ１１３：制御ユニット１４は、図６のステップＳ１１１と同様の手順で、現在のドロップ番号が最終値（７）であるか否かを判別し、最終値であればステップＳ１１２’へ移行し、最終値でなければ現在のドロップ番号を１だけインクリメントしてからステップＳ１０６へ戻る。
　ステップＳ１１４：制御ユニット１４は、図６のステップＳ１１４と同様の手順で、培養容器３０を試料台４７からストッカー２５の所定の収納位置に搬送する。
　ステップＳ１１５：制御ユニット１４は、図６のステップＳ１１５と同様の手順で、卵画像Ｉ１’～Ｉ７’の各々に胚盤胞判別処理を施す。
　ステップＳ１１６：制御ユニット１４は、図６のステップＳ１１６と同様の手順で、卵画像Ｉ１’～Ｉ７’の中に胚盤胞の画像があったか否かを判別し、あった場合はステップＳ１１７を実行してからステップＳ１０４へ戻り、無かった場合は即座にステップＳ１０４へ戻る。
　ステップＳ１１７：制御ユニット１４は、図６のステップＳ１１７と同様の手順で、培養容器３０の中で１又は複数の胚盤胞が生成された旨をモニタ５６ａへ表示し、ステップＳ１０４へ戻る。したがって、ユーザは培養容器３０の受精卵に対する適切な措置を早期に講じることが可能となる。
　以上、本実施形態のインキュベータ１１は、環状パターンの探索処理で検出された環状パターンが受精卵の像であるか否かの判別を、低倍位相差画像（ドロップ画像）ではなく、高倍位相差画像（環状パターン画像）に基づき行う。したがって、本実施形態のインキュベータ１１によれば、取得すべき高倍位相差画像の数が第１実施形態のそれより多くなるものの、判別の正確性を高めることができる。
　［実施形態の変形例］
　なお、上述した何れかの実施形態のインキュベータ１１は、制御ユニット１４を次のように動作させてもよい。すなわち、制御ユニット１４は、ステップＳ１１０の実行回数が所定回数を上回った時点で、現在のドロップ番号に関する受精卵の検出は不可能であったと判断し、モニタ５６ａへその旨の表示（警告表示）を行う。
　なお、インキュベータから離れたユーザへリアルタイムで警告を行うために、制御ユニット１４は、このタイミングでユーザのパーソナルコンピュータ（又はモバイル）へメールを送信してもよい。
　また、上述した何れかの実施形態のインキュベータ１１は、２回目以降の観察時（第２ラウンド以降）に、環状パターンの探索処理（ステップＳ１０７）の演算量を減らすため、部分ドロップ画像上の探索範囲を前ラウンドにおける検出位置の近傍のみに制限してもよい。或いは、部分ドロップ画像上の探索範囲を制限する代わりに、前ラウンドにおける検出位置の近傍の領域を優先的に探索してもよい。
　また、上述した何れかの実施形態のインキュベータ１１は、培養容器３０から培地ドロップを自動的に検出したが、培地ドロップを自動的に検出する代わりに、培地ドロップの位置をユーザに指定させてもよい。
　また、培地ドロップの大凡の厚さは既知なので、上述した何れかの実施形態のインキュベータ１１は、ＶＩＦモードにおけるドロップ画像、卵画像、環状パターン画像の取得時における焦点調節範囲を、培地ドロップの厚さに相当する範囲に制限してもよい。
　また、上述した何れかの実施形態の顕微観察部５３には、透明物体である培養細胞を観察する方法として位相差観察法が適用されたが、透明物体を観察することのできる他の観察方法、例えば、微分干渉観察法、暗視野観察法、偏光観察法などが適用されてもよい。
　但し、受精卵の像が環状ではなく円状となるような観察方法（微分干渉観察法、偏光観察法など）を適用する場合は、前述した環状パターンの探索処理の代わりに円状パターンの探索処理が適用される。円状パターンの探索処理は、図１３のフローチャートにおいて、ステップＳ３０５とＳ３０６との間に、積算輝度分布Ｖ（ｒ）をその微分波形（絶対値）Ｖ’（ｒ）へと変換するステップを挿入したものである。
　仮に、現在の測定点が円状パターン又は扇状パターンの中心に位置していた場合、微分波形Ｖ’（ｒ）には際だった１つのピークが現れるが、仮に、現在の測定点が円状パターン又は扇状パターンの中心に位置していなかった場合、微分波形Ｖ’（ｒ）には際だった１つのピークが現れることは無い。したがって、次のステップＳ３０６において微分波形Ｖ’（ｒ）を積算輝度分布Ｖ（ｒ）の代わりに使用すれば、環状パターンの探索処理で環状パターンを検出したのと同様に、円状パターンの探索処理で円状パターンを検出することができる。
　因みに、上述した環状パターンの探索処理及び円状パターンの探索処理の詳細は、特開２００８－１５７１４号公報にも開示されている。
　また、上述した実施形態のインキュベータ１１には、複数の培地ドロップの各々に１つずつ含まれる細胞（ここでは受精卵）を観察対象としたＶＩＦモードが搭載されていたが、観察対象の異なる他のモードが搭載されてもよい。例えば、１つの培地に含まれる複数の細胞を観察対象としたモードが搭載されてもよい。
　また、上述した何れかの実施形態のインキュベータ１１では、制御ユニット１４による処理の一部を画像処理部５５が実行してもよい。
　また、上述した何れかの実施形態のインキュベータ１１では、画像処理部５５による処理の一部又は全部を、制御ユニット１４が実行してもよい。
　また、上述した何れかの実施形態のインキュベータ１１では、インキュベータ１１の制御プログラムをインキュベータ１１に内蔵された制御ユニット１４が実行したが、その制御プログラムの一部又は全部を、インキュベータ１１に接続された端末装置が実行してもよい。

Claims (14)

  1. 　培養容器を収容する恒温室と、
    　前記恒温室内の前記培養容器の所定領域を第１拡大倍率で撮像する第１撮像光学系と、
    　前記恒温室内の前記培養容器の前記所定領域よりも狭い領域を前記第１拡大倍率より高い第２拡大倍率で撮像する第２撮像光学系と、
    　を備えた培養装置の制御装置であって、
    　前記培養容器の所定領域を前記第１撮像光学系に撮像させる広視野観察手段と、
    　前記広視野観察手段が前記撮像で取得した画像に基づき前記所定領域の中で所定の特徴を有した対象物体を探索する探索手段と、
    　前記探索手段が前記所定領域から検出した前記対象物体を前記第２撮像光学系に撮像させる微視的観察手段と、
    　前記微視的観察手段が前記撮像で取得した画像を記録する記録手段と、
    　を備えたことを特徴とする培養装置の制御装置。
  2. 　請求項１に記載の培養装置の制御装置において、
    　前記探索手段は、
    　円形状の輪郭を有した物体を前記対象物体として探索する
    　ことを特徴とする培養装置の制御装置。
  3. 　請求項２に記載の培養装置の制御装置において、
    　前記探索手段は、
    　円形状の輪郭を有した物体のうち、輝度分散値が閾値以上であるものを前記対象物体として探索する
    　ことを特徴とする培養装置の制御装置。
  4. 　請求項２に記載の培養装置の制御装置において、
    　前記探索手段は、
    　円形状の輪郭を有した物体のうち、輝度微分値の総和が閾値以上であるものを前記対象物体として探索する
    　ことを特徴とする培養装置の制御装置。
  5. 　請求項３又は請求項４に記載の培養装置の制御装置において、
    　前記探索手段が前記対象物体を検出できなかった場合には、前記第１撮像光学系の撮像条件を変更してから前記広視野観察手段、前記探索手段を再動作させる再動作手段を更に備えた
    　ことを特徴とする培養装置の制御装置。
  6. 　請求項２に記載の培養装置の制御装置において、
    　前記記録手段は、
    　前記微視的観察手段が取得した画像のうち、輝度分散値が閾値未満である前記対象物体を含む画像を、前記記録の対象から排除する
    　ことを特徴とする培養装置の制御装置。
  7. 　請求項２に記載の培養装置の制御装置において、
    　前記記録手段は、
    　前記微視的観察手段が取得した画像のうち、輝度微分値の総和が閾値未満である前記対象物体を含む画像を、前記記録の対象から排除する
    　ことを特徴とする培養装置の制御装置。
  8. 　請求項１～請求項７の何れか一項に記載の培養装置の制御装置において、
    　前記記録手段が前記記録の対象とした画像に所定の特徴があるか否かを判別し、所定の特徴があった場合はユーザへその旨を通知する通知手段を更に備えた
    　ことを特徴とする培養装置の制御装置。
  9. 　培養容器を収容する恒温室と、
    　前記恒温室内の前記培養容器の所定領域を第１拡大倍率で撮像する第１撮像光学系と、
    　前記恒温室内の前記培養容器の前記所定領域よりも狭い領域を前記第１拡大倍率より高い第２拡大倍率で撮像する第２撮像光学系と、
    　を備えた培養装置のコンピュータが実行する制御プログラムであって、
    　前記培養容器の所定領域を前記第１撮像光学系に撮像させる広視野観察手順と、
    　前記広視野観察手順の前記撮像で取得した画像に基づき前記所定領域の中で所定の特徴を有した対象物体を探索する探索手順と、
    　前記探索手順において前記所定領域から検出した前記対象物体を前記第２撮像光学系に撮像させる微視的観察手順と、
    　前記微視的観察手順の前記撮像で取得した画像を記録する記録手順と、
    　を含むことを特徴とする培養装置の制御プログラム。
  10. 　請求項９に記載の培養装置の制御プログラムにおいて、
    　前記探索手順では、
    　円形状の輪郭を有した物体を前記対象物体として探索する
    　ことを特徴とする培養装置の制御プログラム。
  11. 　請求項１０に記載の培養装置の制御プログラムにおいて、
    　前記探索手順では、
    　円形状の輪郭を有した物体のうち、輝度分散値が閾値以上であるものを前記対象物体として探索する
    　ことを特徴とする培養装置の制御プログラム。
  12. 　請求項１０に記載の培養装置の制御プログラムにおいて、
    　前記探索手順では、
    　円形状の輪郭を有した物体のうち、輝度微分値の総和が閾値以上であるものを前記対象物体として探索する
    　ことを特徴とする培養装置の制御プログラム。
  13. 　請求項１０に記載の培養装置の制御プログラムにおいて、
    　前記記録手順では、
    　前記微視的観察手順で取得された画像のうち、輝度分散値が閾値未満である前記対象物体を含む画像を、前記記録の対象から排除する
    　ことを特徴とする培養装置の制御プログラム。
  14. 　請求項１０に記載の培養装置の制御プログラムにおいて、
    　前記記録手順では、
    　前記微視的観察手順で取得された画像のうち、輝度微分値の総和が閾値未満である前記対象物体を含む画像を、前記記録の対象から排除する
    　ことを特徴とする培養装置の制御プログラム。
    　
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