JP6782886B2 - 腸粘膜の透過性の診断薬、診断方法、診断装置 - Google Patents

Description

本発明は、腸粘膜の透過性を評価する技術に関し、特に、リーキーガットシンドローム（Ｌｅａｋｙ Ｇｕｔ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ：腸管壁浸漏症候群）の程度を評価する技術、および、その誘発因子若しくは抑制因子を特定若しくは評価する技術に関する。

腸粘膜の透過性に基づく疾病は種々あり、たとえば、リーキーガットシンドローム（以降において、単にＬＧＳと適宜表記する。）が知られている。ＬＧＳは、腸粘膜から食物分子や異物などが血液中に侵入してしまう症状をいい、これに伴い下痢が生じたり、アレルギー症状が生じたりすると考えられている。

ＬＧＳであるか否かを判定する方法としては、ラクツロース−マンニトール試験が知られている。
これは、被験者がラクツロース（分子量≒３４０）１０ｇとマンニトール（分子量≒１８０）５ｇとを同時に服用し、尿中のラクツロースとマンニトールとの濃度比（Ｌ／Ｍ比）を測定することにより、腸管のダメージすなわち浸漏程度を評価する方法である。被験者が健常である場合には、分子量の観点から、マンニトールは腸粘膜を通過し、ラクツロースはほとんど腸粘膜を通過しないことを利用した試験である。なお、測定には、液体クロマトグラフ質量分析計等を用いる。

また、動物実験としてはＦＩＴＣ−ｄｅｘｔｒａｎ試験も知られている。
これは、平均分子量約４０００のＦＩＴＣ−ｄｅｘｔｒａｎ（蛍光標識デキストラン）を経口投与し、その血中濃度を測定する試験である。なお、測定には、蛍光定量装置等を用いる。

しかしながら従来では、以下の問題点があった。
まず、ＬＧＳは、十分な定義が未確定であり、その検出方法や診断方法が確立されていない、という問題点があった。これは、反対に、検出方法や診断方法が確立されていないので定義が未確定である、ともいえる。

実際、ラクツロース−マンニトール試験も、尿を用いるため、腎臓障害がある場合には正確な測定ができない。また、ラクツロースやマンニトールのような糖は、特殊なトランスポータにより腸粘膜から吸収されるので、トランスポータ自体による輸送障害の可能性もある。
また、ラクツロースの分子量は比較的小さいため、より大きな分子量のものまで腸が吸収してしまう（血液へ移行してしまう）状態となっているか否かの評価ができない、という問題点もあった。

一方、ＦＩＴＣ−ｄｅｘｔｒａｎは、分子量がある程度大きいものの、ＦＩＴＣに毒性がありヒトに対して用いることができない、という問題点があった。

更には、腸炎罹患者や高脂肪食過剰摂取者の血液中には平均分子量５０００〜８０００のリポ多糖が入っているという報告が多数存在し、この程度の大きな分子量の浸漏性を評価する技術がそもそも存在しない、という問題点もあった。

すなわち、従来では、ＬＧＳをはじめとした腸粘膜の透過性の評価は間接的であり、信頼性も高くなく、評価範囲が狭小であるという問題点があった。

特開２０１６−１５１５５９号公報

本発明は上記に鑑みてなされたものであって、腸粘膜の透過性の程度を直接的に信頼性高く評価できる技術を提供することを目的とする。一例として、ＬＧＳといった腸粘膜透過性亢進の診断技術を提供することを目的とする。
また、本発明は、腸粘膜の透過性に影響を与える飲食物を判定する技術を提供することを目的とする。一例として、ＬＧＳを誘発する飲食物または抑制する飲食物を判定する技術を提供することを目的とする。
また、本発明は、腸粘膜の透過性を正常化する医薬またはその候補物質の客観的な評価を与える技術を提供することを目的とする。一例として、ＬＧＳ治療薬、ＬＧＳ緩和薬、腸粘膜透過性調整薬の開発を促進する技術を提供することを目的とする。

請求項１に記載の発明は、キチンおよび／またはキトサンを主成分とする、腸粘膜の透過性を評価するための診断薬である。
なお、この診断薬は、経口投与用であっても注腸投与用であってもよいものとする。診断対象はヒト以外であってもよい。

請求項２に記載の発明は、被験者に経口投与または注腸投与し、所定時間経過後に血中濃度を測定するように用いられることを特徴とする、キチンおよび／またはキトサンを主成分とする、腸粘膜の透過性を評価するための診断薬である。
所定時間は、適宜設定すればよいが、経口投与の場合は３０分、注腸投与の場合は５分とすることができる。

請求項３に記載の発明は、キチンおよび／またはキトサンの重量平均分子量を１０００〜１１６００の範囲に調製したことを特徴とする請求項１または２に記載の診断薬である。
重量平均分子量を１０００〜１１６００に調製するとは、（１）平均分子量が１０００〜１１６００のいずれかに一つある、（２）平均分子量のピークが１０００〜１１６００の間に複数ある、（３）１０００〜１１６００までの分子量のものが事実上一様に存在する、のいずれであってもよいものとする。（１）の場合は、その分子量のものが腸粘膜を透過していくか、を確認できる。（２）の場合は、各ピークの半値幅が狭い剤を用い、一回の試験にて、おおよそどこまでの分子量のものが腸粘膜を透過していくか、を精度よく確認できる。（３）の場合も、一回の試験にて、おおよそどこまでの分子量のものが腸粘膜を透過していくか、を確認できる。

請求項４に記載の発明は、投与量を、体重１ｋｇ当たり８．３３ｍｇ〜２０．８３ｍｇの範囲とすることを特徴とする請求項２に記載の診断薬である。
ラクツロース−マンニトール試験より摂取量が少なく、被験者の負担を小さくすることができる。

請求項５に記載の発明は、動物（ただしヒト以外の動物とする。）にキチンおよび／またはキトサンを経口投与または注腸投与し、所定時間経過後に血中の当該投与物の濃度を測定することにより、当該動物の腸粘膜の透過性を評価することを特徴とする診断方法である。
投与物の濃度とは、キチンのみを投与したのであればキチン濃度を、キトサンのみを投与したのであればキトサン濃度を、キチンとキトサンとの混合物を投与したのであればキチンとキトサンとの混合物の濃度を、それぞれ意味する。

請求項６に記載の発明は、経口投与および所定時間経過後の血中濃度測定による、または、注腸投与および所定時間経過後の血中濃度測定による、腸粘膜の透過性の評価用としての、キチンおよび／またはキトサンの使用である。
キチンおよび／またはキトサンの重量平均分子量は１０００〜１１６００の範囲に調製したものであることが好ましい。
投与量は、ヒトであれば体重１ｋｇ当たり８．３３ｍｇ〜２０．８３ｍｇの範囲とすることが好ましい。

請求項７に記載の発明は、被験者に単数若しくは複数の特定の飲食物を飲食させ、当該飲食中または当該飲食の前または後にキチンおよび／またはキトサンを経口摂取させ、当該経口摂取から所定時間経過後に血中の当該摂取物の濃度を測定することにより、当該飲食物が当該被験者の腸粘膜の透過性に影響する要因となり得るか否かを判定する、飲食物評価方法である。
キチンおよび／またはキトサンの重量平均分子量は１０００〜１１６００の範囲に調製したものであることが好ましい。
摂取量は、体重１ｋｇ当たり８．３３ｍｇ〜２０．８３ｍｇの範囲とすることが好ましい。
影響するとは、腸粘膜の透過性ないし浸漏性を大きくすることも小さくすることも含む。ＬＧＳに関しては、浸漏性を大きくするとは、ＬＧＳを誘発する、悪化させることを意味し、浸漏性を小さくするとは、ＬＧＳを抑制する、緩和する、改善する、治癒することを意味する。
特定の単数の飲食物とは、ＬＧＳの抑制の観点からは、たとえば、ヨーグルトや乳清飲料を挙げることができる。これに伴い腸内フローラを整えることを謳う食品の客観的な性能指標を与えることも可能となる。
複数の特定の飲食物とは、ＬＧＳ誘発の観点からは、たとえば、牡蠣とワイン、ポークステーキとビール、を挙げることができる。
本発明によれば、個々人についての誘発因子、抑制因子のスクリーニングが可能となる。
飲食の前または後とは、たとえば、飲食開始前２０分や、飲食終了後１５分を挙げることができる。

請求項８に記載の発明は、被験者に単数若しくは複数の特定の飲食物を飲食させ、当該飲食中または当該飲食の前または後にキチンおよび／またはキトサンを経口摂取させ、当該経口摂取から所定時間経過後に血中の当該摂取物の濃度を測定することにより、当該飲食物が当該被験者の腸粘膜の透過性に影響する要因となり得るか否かを判定するために用いられることを特徴とする、キチンおよび／またはキトサンを主成分とする飲食物評価薬である。
キチンおよび／またはキトサンの重量平均分子量は１０００〜１１６００の範囲に調製したものであることが好ましい。
摂取量は、体重１ｋｇ当たり８．３３ｍｇ〜２０．８３ｍｇの範囲とすることが好ましい。

請求項９に記載の発明は、ある物質を投与し、これとは別にキチンおよび／またはキトサンを経口投与または注腸投与し、前記ある物質の投与前後に前記経口投与物または前記注腸投与物の血中濃度を測定することにより、前記ある物質に腸粘膜の透過性の正常化作用があるか否か、正常化作用がある場合にはそれがどの程度であるか、を評価する評価方法である。
ある物質の投与対象はヒトであってもヒト以外の動物であってもよい。
キチンおよび／またはキトサンの重量平均分子量は１０００〜１１６００の範囲に調製したものであることが好ましい。
経口投与量または注腸投与量は、ヒトである場合には体重１ｋｇ当たり８．３３ｍｇ〜２０．８３ｍｇの範囲とすることが好ましい。

請求項１０に記載の発明は、ある物質を投与し、これとは別に経口投与または注腸投与する評価剤であって、前記ある物質の投与前後に前記評価剤の血中濃度を測定することにより、前記ある物質に腸粘膜の透過性の正常化作用があるか否か、正常化作用がある場合にはそれがどの程度であるか、を評価するための、キチンおよび／またはキトサンを主成分とする評価剤である。
ある物質の投与対象はヒトであってもヒト以外の動物であってもよい。
キチンおよび／またはキトサンの重量平均分子量は１０００〜１１６００の範囲に調製したものであることが好ましい。
投与量は、ヒトである場合には体重１ｋｇ当たり８．３３ｍｇ〜２０．８３ｍｇの範囲とすることが好ましい。

請求項１１に記載の発明は、被験者から採取した血液中のキチンおよび／またはキトサンの濃度を測定する濃度測定手段と、濃度測定手段により測定された濃度に基づいて当該被験者の腸粘膜の透過性を評価する評価手段と、を具備したことを特徴とする診断装置である。
腸粘膜透過性評価装置ということもできる。

本発明によれば、腸粘膜の透過性の程度を直接的に信頼性高く評価できる。
また、本発明によれば、腸粘膜の透過性に影響を与える飲食物を判定することができる。
また、本発明によれば、腸粘膜の透過性を正常化する医薬またはその候補物質の客観的な評価が可能となる。

ＡＯモデルとＩＲモデルとの試験概要である。 腸管の正常な状態と、ＬＧＳが誘発された状態と、を示した写真である。 ＡＯモデルについて、ラクツロース−マンニトール試験をおこなった結果である。 ＡＯモデルについて、ＦＩＴＣ−ｄｅｘｔｒａｎ試験をおこなった結果である。 ＩＲモデルについて、ＦＩＴＣ−ｄｅｘｔｒａｎ試験をおこなった結果である。 ＡＯモデルとＩＲモデルについての、キチン−キトサン濃度の測定結果である。 重量平均分子量が１０００，３０００，１１６００のキチン−キトサンを主成分とする試料の分布の様子を示したグラフである。 ＩＲ（２０）モデルについて、各分子量におけるキチン−キトサンの血中濃度を示した図である。 ＩＲ（１０）モデルについて、各分子量におけるキチン−キトサンの血中濃度を示した図である。 ＩＲ（２０）モデルについて、重量平均分子量１０００の診断剤を１．２５ｍｇ／ｍｏｕｓｅ、０．６２５／ｍｏｕｓｅとしてそれぞれ経口投与し、血中濃度を測定した結果を示した図である。 診断薬の分子量の分布態様と濃度測定結果の模式図である。 精製試料の分子量分布の様子を示した図である。 ＩＲ（２０）モデルについて、精製試料を用いたキチン−キトサン濃度の測定結果および腸管の外観とＨＥ染色像である。 精製試料をマウスに経口投与したＩＲ（１０）モデルにおいて、循環血中のキチン−キトサン量の経時変化を測定したグラフである。 虚血再灌流処置を施していないマウスに精製試料を静脈投与した場合の、キチン−キトサンの血中濃度の経時変化を測定したグラフである。 ＯＶＡアレルギーの誘導のプロトコルを示した説明図である。 ＯＶＡ−ＩｇＥマウスを用いた、キチン−キトサンの血中濃度を示した図である。 高脂肪食モデルおよびＮＡＳＨ誘発食モデルについて、キチンキトサンの血中濃度を示した図である。 ＤＳＳ誘発潰瘍性大腸炎モデルにおける、発症前の腸全体像とＨＥ染色像を示した写真である。ＤＳＳを投与していない比較像も示している。 ＤＳＳ誘発潰瘍性大腸炎モデルにおける、発症前のキチン−キトサンの血中濃度を示した図である。 腸粘膜の透過性の亢進と炎症や障害の発生のタイムラグを示す概念図である。

＜ＬＧＳ誘発モデルの構築＞
本実施の形態では、腸管の浸漏性を評価する例としてＬＧＳを想定し、まず、その誘発試験をおこなった。
一つは、アスピリンとオメプラゾールを用いるモデルである（以降ではＡＯモデルと適宜称することとする）。条件は、文献（Innate Immun. 2015 Jul;21(5):537-45）をもとに改変した。
概略は、マウスの体重１ｋｇあたり、アスピリン１００ｍｇ（１００ｍｇ／ｋｇ）を１日２回、６日間経口投与し、オメプラゾール１０ｍｇ（１０ｍｇ／ｋｇ）を１日２回、６日間腹腔内投与し、７日目にＬＧＳの程度を測定する、という試験である。

もう一つは、腸管虚血再還流モデルである（以降ではＩＲモデルと適宜称することとする）。条件は、文献（Gastroenterology. 2001 Feb;120(2):460-9.）などをもとに改変した。
概略は、腸管を３０分間クリップし続け虚血状態とし、その後クリップを外して再灌流し、３０分後にＬＳＧの程度を測定する、という試験である。なお、虚血時間の３０分を明示する表記としてＩＲ（３０）モデルと適宜表記する。

両モデルの概要を図１に示した。なお、図１ｂでは、後述のＩＲ（２０）モデルとＩＲ（１０）モデルも示した
図２に、腸管の外観写真、ＨＥ染色像、電子顕微鏡写真を示した。正常組織に比して、ＡＯモデルでは、腸絨毛に割れが見られ、軽度のＬＧＳが生じていると認められる。また、ＩＲ（３０）モデルでは、腸絨毛が大きく損傷し、重度のＬＧＳが生じていると認められる。

＜ＬＧＳの程度評価＞
上記モデルを用いて、分子量の違いによる浸漏性を確かめることとした。
まず、ＡＯモデルについて、ラクツロース−マンニトール試験をおこなった。ラクツロースとマンニトールを共に５００ｍｇ／ｋｇ経口投与し、４時間蓄尿してＬ／Ｍ比を測定した。結果を図３に示す。アスピリンとオメプラゾールをいずれも投与せず、ＬＧＳを誘発させていないマウス、すなわちコントロールに比べて、ＡＯモデルではＬ／Ｍ比が２倍程度上昇している。このことから、マンニトールのような分子量が３００を超えるものの浸漏性が高まった状態となっていることが確認できた。

次に、ＡＯモデルについて、ＦＩＴＣ−ｄｅｘｔｒａｎ試験をおこなった。ＦＩＴＣ−デキストランを６００ｍｇ／ｋｇ経口投与し、６０分後に採血してその血漿中の濃度を測定した。結果を図４に示す。コントロールと比べて、血漿中のデキストランがある程度上昇することが確認できた（図４ｂ）。
また、ＩＲ（３０）モデルについて、ＦＩＴＣ−ｄｅｘｔｒａｎ試験をおこなった。ＦＩＴＣ−デキストランを６００ｍｇ／ｋｇ経口投与し、３０分後に虚血を開始し、再灌流３０分後に採血してその血漿中の濃度を測定した。結果を図５に示す。コントロールに比べて、血漿中のデキストラン濃度は１５倍程度も上昇していた。

図４ａと図５とを比較すれば明らかなように、ＩＲ（３０）モデルは、ＡＯモデルに比して、分子量の大きなものをより容易に血液へ移行させるようになっている状態を検証可能なモデルであるといえる。換言すれば、ＩＲ（３０）モデルは重度のＬＧＳを評価可能なモデルといえる。
翻って、図３と図４ｂを比較すると、ＡＯモデルは、分子量の大きなものを、容易に血液に移行させるまでには至っていない状態を検証可能なモデルであるといえる。換言すれば、ＡＯモデルは軽度のＬＧＳを評価可能なモデルといえる。

＜キチン−キトサンを用いたＬＧＳの評価＞
次に、キチン−キトサンを用いたＬＧＳの評価をおこなった。
まず、カニ類の甲殻に、脱タンパク処理、脱カルシウム処理、脱アセチル処理を施し、キチンとキトサンとの混合物を得た。続いてキチンとキトサンの混合物を低分子化し、重量平均分子量７９００のキチン−キトサン試料を得た。低分子化の方法は、キチンとキトサンの混合物を濃塩酸で加水分解する方法（特許５７１４９６３号）や、塩酸または、酢酸、クエン酸、乳酸等の有機酸で溶解した後、キトサナーゼ酵素を用いて低分子化する方法があり（特開２０１３−７９２１７）、特に限定されない。

次に、ＡＯモデルについては、７日目に上記試料２．５０ｍｇを経口投与し、６０分後に採血し、血漿中のキチン−キトサンの濃度を測定した（図１ａ参照）。
また、ＩＲ（３０）モデルについては、虚血開始３０分前に上記試料２．５０ｍｇを経口投与し、再灌流３０分後に採血し、血漿中のキチン−キトサンの濃度を測定した（図１ｂ参照）。

測定に際しては、まず、定法により血液から血漿を抽出し、血漿中のキチン−キトサンを、亜硝酸分解法により構成単糖であるキトース（２，５−アンヒドロ−Ｄ−マンノース）に分解した。次に、そのアルデヒド基にＭＢＴＨ（３−メチル−２−ベンゾチアゾリノンヒドラゾン塩酸塩）と塩化鉄（III）とを反応させ、青色に発色させた。最後に、青色の程度を吸光度測定装置にて測定し、その色素量に基づいて濃度算出をおこなった。

結果を図６に示す。図示したように、ＡＯモデルより、ＩＲ（３０）モデルの方が、より顕著にキチン−キトサンを血中に移行させていることが確認できる。これは用いた試料の分子量が大きく、図４ｂと図５との関係と符合する。
そこで、本願発明者らは、キチン−キトサンのＬＧＳの程度の診断薬、ひいては、腸粘膜の透過性を診断する診断薬（腸粘膜の透過性を評価する評価薬）としての適用可能性を検討することとした。なお、上記では吸光度により濃度評価をおこなったが、これに限定することなく、血中濃度が検出できれば特にキチンとキトサンとを区別する必要がない。したがって、本願では、キチン−キトサンと表記し、これは、キチンおよび／またはキトサンを意味するものとする。

まず、塩酸または有機酸の溶解液を調製し、ＵＦ膜（分画分子量３０００、６０００、１００００等）を用いて、重量平均分子量７９００のキチン−キトサン試料を、重量平均分子量１０００、３０００、７９００，１１６００のキチン−キトサンに分画した。図７に調製した試料の分布の様子を示した。また、重量平均分子量の測定方法も付記した。

次に、ＩＲモデルについて、上記試料をそれぞれ２．５ｍｇ経口投与し、キチン−キトサンの血中濃度を測定した。なお、虚血時間が３０分では腸管のダメージが大きすぎると考え、ここでは、虚血時間を２０分に短縮して試験をおこなった。これをＩＲ（２０）モデルと表記するものとする。

ＩＲ（２０）モデルについて、各分子量におけるキチン−キトサンの血中濃度の測定結果を図８に示した。なお、図ではコントロール、すなわち、虚血再灌流なし、の結果も記した。図から明らかなように、重量平均分子量１１６００の濃度はやや小さくなっているものの、概ねどの分子量の試料も血中へ移行してしまっている。
そこで、虚血時間を１０分としてＬＧＳの程度を更に弱め、中程度のＬＧＳを誘発させて、試料のスクリーニング性を検討した。この試験をＩＲ（１０）モデルと表記するものとする。

ＩＲ（１０）モデルについて、各分子量におけるキチン−キトサンの血中濃度の測定結果を図９に示した。図に現れているように、重量平均分子量が小さい試料ほど浸漏しやすく、重量平均分子量が大きな試料ほど浸漏しにくいことが確認できる。

以上の実験から、キチン−キトサンを用いれば、どの程度の分子量のものが腸管から浸漏していくか、また、どの程度の分子量のものがどの程度腸管から浸漏していく状態となっているか、を評価可能となる。

すなわち、経口投与および所定時間経過後の血中濃度測定による、腸粘膜の透過性の評価用として、キチンおよび／またはキトサンを使用することができる。
これは、キチンおよび／またはキトサンを主成分として、腸粘膜の透過性を評価するための診断薬を得ることができた、ともいえる。
また、被験者に経口摂取させ、所定時間経過後に血中濃度を測定するように用いられることを特徴とする、キチンおよび／またはキトサンを主成分とする、腸粘膜の透過性を評価するための診断薬を得ることができた、ともいえる。
腸粘膜透過性亢進に対する評価技術を得ることができた、ともいえる。
なお、図８および図９に示したように、ＩＲモデルは、虚血時間を調整することにより軽度から重度まで任意の程度のＬＧＳを誘発可能であり、汎用性のある客観的な評価系を構築可能なモデルといえる。

なお、ＩＲ（２０）モデルについて、重量平均分子量１０００の診断薬を１．２５ｍｇ／ｍｏｕｓｅ、０．６２５ｍｇ／ｍｏｕｓｅとしてそれぞれ経口投与し、投与量を少なくした場合の血中濃度を測定した。結果を図１０に示す。図から明らかなように、０．６２５ｍｇ／ｍｏｕｓｅであっても、有意な濃度測定が可能であることがわかった。これを体重６０ｋｇのヒトに換算すると、診断薬の投与量は１．２５ｇとなる。また、コントロールも加味した測定限界から、理論上は６０ｋｇのヒトに０．５００ｇの経口摂取でも有意な濃度測定が可能である。すなわち、投与量ないし摂取量は、体重１ｋｇ当たり８．３３ｍｇ〜２０．８３ｍｇの範囲とすればよい。体重５ｋｇの子供から体重２００ｋｇの成人までを考慮すると、経口摂取量は、０．０４ｇ〜４．２０ｇの範囲とすることができる、ともいえる。いずれにせよ、ラクツロース−マンニトール試験のような１５ｇもの経口摂取が必要でなく、被験者の負担が軽減される診断薬であるということができる。
注腸投与する場合も同様と考えられる。

また、検出系にも依存するが、診断薬の重量平均分子量は２００〜２００００、好ましくは１０００〜１１６００の範囲に調製することが好ましい。図１１は、診断薬の分子量の分布態様と濃度測定結果の模式図である。図１１ａは、シングルピークの診断薬を示している。この分子量まではすくなくとも浸漏する状態となっているか否かの判定が可能となる。図１１ｂは、マルチピークの診断薬を示している。どの程度の分子量までが浸漏しやすくなっているかを判定できる。図１１ｃは、分子量の広がりが一様である診断薬である。これも、どの程度の分子量までが浸漏しやすくなっているかを判定できる。

以上の診断薬または診断方法は、次の利点を有する。
・毒性がない（ヒトに使える。動物実験も可能である。）。
・経口投与できる。
・腸を含め、生体内で産生されない（直接的な濃度測定が可能である。）。
・生体内で分解されにくい（直接的な濃度測定が可能である。）。
・正常状態では、腸管からほとんど吸収されない。
・分子量の調製が可能である。

＜高度精製キチン−キトサンを用いた試験＞
次に、分子量の分布がよりシャープなキチン−キトサンを用いて試験をおこなうこととした。図１２は、以降の試験で用いたキチン−キトサン試料の分子量分布の様子を示した図である。図７に比べ分布はシャープであって、別途分析した結果、分子量８２３から１９８４までのもの（塩酸塩としては分子量約１０００から１２００までのもの）が全体の９８ｗｔ％を占めており、高度に精製された試料である。なお、この試料を精製試料と適宜称することとする。

ＩＲ（２０）モデルについて、精製試料を用いて血清中のキチン−キトサン濃度を測定した。測定結果および腸管の外観とＨＥ染色像とを図１３に示す。ＨＥ染色像からは粘膜障害が少し進んでいる程度という所見であるが、図８と同様に、血液中へ分子量１０００程度のキチン−キトサンが浸漏する状態となっていることが確認できる。

＜安全性確認＞
精製試料をマウスに経口投与したＩＲ（１０）モデルにおいて、循環血中のキチン−キトサン量の経時変化を測定した。再灌流３０分後からの経時変化を図１４に示す。経口投与量は２．５ｍｇ／ｍｏｕｓｅとした。

マウスの循環血量は、体重の１／１３の量であると見積もり、体重が２５ｇであるとすると、１．９３ｍｌとなる。一方、図１４に示したＡＵＣ（Ａｒｅａ Ｕｎｄｅｒ ｔｈｅ Ｃｕｒｖｅ）は、０〜８ｈで１６２．１６μｇ／ｍｌであった。したがって、８時間の間に循環血中に浸漏したキチン−キトサン量は１６２．１６＊１．９３＝３１２．９７μｇである。以上からから、経口投与量の１２．５％の精製試料が循環血中に浸漏したといえる（３１２．９７／２．５＝０．１２５）。なお、８時間後もマウスは生きたままであった。

また、無処置すなわち虚血再灌流処置を施していないマウスに精製試料２．５ｍｇを静脈投与して、キチン−キトサンの血中濃度の経時変化を測定した。測定結果を図１５に示す。静脈投与しても血中濃度は７０μｇ／ｍｌ程度であり（外挿により投与直後を見積もっても１５０μｇ／ｍｌ程度であり）、血中からキチン−キトサンは２時間程度までで急速に消失することが確認された（対数スケールにプロットし直すと濃度減衰は直線的であった）。なおこれは腎排泄によるものと思われる。なお、静脈投与によるショック症状は認められず２時間後もマウスは生きたままであった。

この２つの試験を考慮すると次のことがいえる。
１）試験後もマウスは生き続けており、キチン−キトサンは生体にとって安全であることが改めて確認できた（少なくともただちに重篤な影響を及ぼすものである可能性は極めて低い）。
２）血中から速やかに消失する点からも、キチン−キトサンは生体にとって安全といえる。
３）上記条件下では、８時間後も血中にキチン−キトサンが血液中から検出されているため、投与後ある程度時間がたっても濃度測定が可能であり、診断薬・評価薬として使い勝手が良い。また、経時的な変化も把握可能となる。
４）血中に浸漏すると速やかに消失するので、経口投与や注腸投与により、腸の浸漏性や透過性のリアルタイムの状態把握が可能となる。より純粋に腸の状態把握ができるともいえる。

＜ＩＲモデル以外による透過性評価＞
次に、虚血再灌流のような腸に直接的に負荷をかけた上記評価試験以外のモデルについて透過性ないし浸漏性の評価をおこなうこととした。

＜食物アレルギーモデルによる透過性評価＞
まず、卵アレルギーを有するマウスすなわちＯＶＡ−ＩｇＥマウスについて、小腸の粘膜透過性評価をおこなうこととした。ＯＶＡアレルギー誘導プロトコルは図１６に示すとおりであり、まず、マウス腹腔内にＯＶＡ（オボアルブミン）を投与して感作させ、その後経口投与を続けて、感作から２８日後にＯＶＡと精製試料とを経口投与して評価をおこなった。なお、ＯＶＡ−ＩｇＥマウスには食物アレルギーの典型的症状である重度の下痢が認められた。

キチン−キトサンの血中濃度測定結果を図１７に示す。なお、比較のため、ラクツロース−マンニトール試験を行った結果も示した。図示したように、食物アレルギー由来の下痢が生じている場合には腸の透過性が高まった状態となっている、という知見を得ることができた。なお、ラクツロース−マンニトール試験より透過性の高まりを明確に判断可能であることもわかった。

＜高脂肪食モデルおよびＮＡＳＨ誘発食モデルによる透過性評価＞
続いて、高脂肪食と非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）誘発食とをそれぞれ与え続けたマウスについて、透過性評価をおこなうことした。

高脂肪食とＮＡＳＨ誘発食の成分は次のとおりである。

高脂肪食モデル：上記高脂肪食を６週齢雄性Ｃ５７ＢＬ／６マウスに５週間自由摂取させてから、水も餌も与えずに２１時間経過後に精製試料を２．５ｍｇ経口投与し、その１時間後に下大静脈から採血し、キチン−キトサン量を測定した。
ＮＡＳＨ誘発食モデル：上記ＮＡＳＨ誘発食を６週齢雄性Ｃ５７ＢＬ／６マウスに４週間自由摂取させてから、水も餌も与えずに２１時間経過後に精製試料を２．５ｍｇ経口投与し、その１時間後に下大静脈より採血し、キチン−キトサン量を測定した。

結果を図１８に示す。高脂肪食については透過性は高まっていないものの、ＮＡＳＨ誘発食の場合は明らかに透過性が高まっている。このことから、まず、非アルコール性脂肪肝炎では腸の透過性が高まった状態となっている、といえることが確認できた。次に、この組成の高脂肪食のこの期間の摂取では腸の浸漏性は高まっていないことから、翻って、キチン−キトサンを用いれば、どのような食事がどのように腸に影響を与えるかのスクリーニングが可能であることがわかった。

＜ＤＳＳ誘発潰瘍性大腸炎モデルによる透過性評価＞
次に、ＤＳＳ（デキストラン硫酸ナトリウム）により潰瘍性大腸炎を誘発させたマウスについて、透過性評価をおこなうこととした。

潰瘍性大腸炎モデル：まずＤＳＳ２．５ｗｔ％溶解水をマウスに自由に飲水させた。自由飲水を開始してから７２時間後に精製試料を注腸投与または経口投与し、注腸投与したものについては投与後１時間後に、経口投与したものについては投与後４時間後に、それぞれキチン−キトサンの血中濃度を測定した。

図１９は、ＤＳＳを７２時間（３日間）飲水させた場合と飲水させなかった場合との腸全体像とＨＥ染色像である。図示した様に、自由飲水開始７２時間では腸粘膜に炎症は認められず、腸全体でも明瞭な変化は観測されなかった。
しかしながら、図２０に示した様に、経口投与であっても、注腸投与であっても、血中へのキチン−キトサンの浸漏が観測された。そして、継続観測したところ、ＤＳＳを自由飲水していたマウスは飲水開始９６時間（４日間）後には炎症を生じることを別途確認した。

すなわち、驚くべきことに、キチン−キトサンを用いることにより、潰瘍性大腸炎の発症前の腸粘膜の異常透過性亢進が検出可能であることが確認できた。

＜薬理作用の評価剤としてのキチン−キトサン＞
潰瘍性大腸炎に限らず、図２１に示すように、一般的に腸粘膜の透過性の亢進は炎症や障害の発生よりもっと前に生じると考えられる。従って、キチン−キトサンを用いて透過性や浸漏性を把握することにより、発症前診断や発症予防、発症予測、また、治療薬等の薬理作用の評価が可能となる。

まず、食物摂取等により炎症が起こる場合、従来では、どれが原因食物または原因食物群であるか、発症に至るまで摂取を継続しないと判断ができなかったところ、発症前に摂取をやめることができ、負担が軽減され、効果的なスクリーニングが可能となる。

次に、ＬＧＳ治療薬、ＬＧＳ緩和薬、腸粘膜透過性調整薬などを創薬する際のスクリーニングにも用いることができる。すなわち、ある物質（候補物質）を投与し、これとは別にキチンおよび／またはキトサンを経口投与または注腸投与し、候補物質の投与前後にキチンおよび／またはキトサンの血中濃度を測定することにより、候補物質に腸粘膜の透過性の正常化作用があるか否か、正常化作用がある場合にはそれがどの程度であるか、を評価することができる。このように用いられるようにした、キチンおよび／またはキトサンを主成分とする評価剤として提供しても良い。

また、潰瘍性大腸炎やクローン病といった炎症性腸疾患（ＩＢＤ：Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ Ｂｏｗｅｌ Ｄｉｓｅａｓｅ）や好酸球性胃腸炎に対する知見を集積していくことも可能となる。過敏性腸症候群に対する知見も集積可能となる。すなわち、病態の活動期や寛解を判定したり、治療効果や薬効評価を判定したり、病態予測をしたりすることが可能となる。

＜診断薬の応用＞
また、図１８に示した結果も考慮すると、キチン−キトサンは、飲食物の評価薬として用いることもできる。
すなわち、被験者に単数若しくは複数の特定の飲食物を飲食させ、当該飲食中または当該飲食の前または後にキチン−キトサンを主成分とする評価薬を経口摂取させ、当該経口摂取から所定時間経過後に血中の当該キチン−キトサンの濃度を測定することにより、当該飲食物が当該被験者の腸粘膜の透過性に影響を及ぼしているか、を判定することができる。
ＬＧＳでいえば、ＬＧＳを誘発させているか、または、ＬＧＳを抑制しているか、を判定することができる。なお、評価薬の経口摂取は、飲食物の種類等にしたがって、適宜、飲食前、飲食中、または、飲食後とすればよい。

この評価薬を用いれば、一般的な誘発因子や抑制因子をスクリーニングすることが可能となるばかりでなく、個々人についての誘発因子や抑制因子をスクリーニングすることも可能となる。すなわち、個々人のリスクファクターを特定可能となる。
たとえば、被験者に評価薬をまず飲んでもらい、次に、ビールをのみながら肉を食べてもらうとする。並行して１０分おきに採血することにより、経時的なＬＧＳの推移を見ることができる。この結果、その人にとっては、その飲食の組み合せは、２０分程度で中程度のＬＧＳを発症するので、そのような食べ合わせをしないように、と忠告することが可能となる。

更に、この飲食物評価薬を用いれば、たとえば、腸内フローラや腸内環境を整えることを謳う食品、すなわちプロバイオティック食品に対して、客観的な性能指標を与えることが可能となる。更には、プレバイオティック食品の評価も可能となる。

なお、以上の技術を応用した診断装置を構築することもできる。
すなわち、被験者から採取した血液中のキチンおよび／またはキトサンの濃度を測定する濃度測定手段と、濃度測定手段により測定された濃度に基づいて当該被験者の腸粘膜の透過性を評価する評価手段と、を具備することにより、診断装置を得ることができる。

濃度測定手段は、その要素技術として、たとえば、クロマトグラフィーを用いることができる。試料導入から濃度算出までは、汎用技術を用いて適宜自動化してもよい。

評価手段は、たとえば、得られたクロマトグラムのピークの位置や高さの解析、ピーク面積の算出などにより、浸漏性の程度を判定することができる。単に重度のＬＧＳである、軽度のＬＧＳであるといった判定に留まらず、ピークの分布やムラに基づき、過去のデータも加味して、中程度のＬＧＳや重度のＬＧＳは生じない体質であるが常に軽度のＬＧＳを発症する体質である、運動をすると中程度のＬＧＳが発症する体質である、ＬＧＳでなく別の腸疾患である、といったことも診断可能となる。

このほか、特異的検出抗体を作製し、これを用いたＥＬＩＳＡキットを採用するようにしてもよい。これにより、多量のサンプルを一度に評価可能となる。

なお、測定や診断に用いた血液は人体に戻すことなく廃棄されるものとする。

本発明によれば、ＬＧＳの客観的な指標や診断系を構築することができる。また、ＬＧＳの様々な疾病への関与を探求可能となる。たとえば、慢性腎障害、気管支ぜんそく、Ｉ型糖尿病、食物アレルギー、アルコール性肝炎、非アルコール性脂肪肝炎、などとの関連性を調べることが可能となる。腸疾患の治療薬の開発に資することもできる。

Claims (11)

1. キチンおよび／またはキトサンを主成分とする、腸粘膜の透過性を評価するための診断薬。
2. 被験者に経口投与または注腸投与し、所定時間経過後に血中濃度を測定するように用いられることを特徴とする、キチンおよび／またはキトサンを主成分とする、腸粘膜の透過性を評価するための診断薬。
3. キチンおよび／またはキトサンの重量平均分子量を１０００〜１１６００の範囲に調製したことを特徴とする請求項１または２に記載の診断薬。
4. 投与量を、体重１ｋｇ当たり８．３３ｍｇ〜２０．８３ｍｇの範囲とすることを特徴とする請求項２に記載の診断薬。
5. 動物（ただしヒト以外の動物とする。）にキチンおよび／またはキトサンを経口投与または注腸投与し、所定時間経過後に血中の当該投与物の濃度を測定することにより、当該動物の腸粘膜の透過性を評価することを特徴とする診断方法。
6. 経口投与および所定時間経過後の血中濃度測定による、または、注腸投与および所定時間経過後の血中濃度測定による、腸粘膜の透過性の評価用としての、キチンおよび／またはキトサンの使用。
7. 被験者に単数若しくは複数の特定の飲食物を飲食させ、当該飲食中または当該飲食の前または後にキチンおよび／またはキトサンを経口摂取させ、当該経口摂取から所定時間経過後に血中の当該摂取物の濃度を測定することにより、当該飲食物が当該被験者の腸粘膜の透過性に影響する要因となり得るか否かを判定する、飲食物評価方法。
8. 被験者に単数若しくは複数の特定の飲食物を飲食させ、当該飲食中または当該飲食の前または後にキチンおよび／またはキトサンを経口摂取させ、当該経口摂取から所定時間経過後に血中の当該摂取物の濃度を測定することにより、当該飲食物が当該被験者の腸粘膜の透過性に影響する要因となり得るか否かを判定するために用いられることを特徴とする、キチンおよび／またはキトサンを主成分とする飲食物評価薬。
9. ある物質を投与し、これとは別にキチンおよび／またはキトサンを経口投与または注腸投与し、前記ある物質の投与前後に前記経口投与物または前記注腸投与物の血中濃度を測定することにより、前記ある物質に腸粘膜の透過性の正常化作用があるか否か、正常化作用がある場合にはそれがどの程度であるか、を評価する評価方法。
10. ある物質を投与し、これとは別に経口投与または注腸投与する評価剤であって、前記あ
    る物質の投与前後に前記評価剤の血中濃度を測定することにより、前記ある物質に腸粘膜の透過性の正常化作用があるか否か、正常化作用がある場合にはそれがどの程度であるか、を評価するための、キチンおよび／またはキトサンを主成分とする評価剤。
11. 被験者から採取した血液中のキチンおよび／またはキトサンの濃度を測定する濃度測定手段と、
    濃度測定手段により測定された濃度に基づいて当該被験者の腸粘膜の透過性を評価する評価手段と、
    を具備したことを特徴とする診断装置。