JP6519219B2 - リーキーガット改善剤の評価方法 - Google Patents

Description

本発明は、腸管透過性が亢進する病態であるリーキーガットの改善剤を評価する方法に関する。

人体を構成するヒトの細胞は、６０兆個存在すると言われている一方、体内に存在する微生物は６００兆個存在することが知られている。腸内に存在する細菌は、腸上皮のエネルギー源を提供する一方、エンドトキシンの発生源となり、様々な疾病の原因になると考えられている。腸管内におけるバリア機能は上記のエンドトキシンを代表とする有害な物質が体内に取り込まれるのを防御する機能として極めて重要であり、腸管上皮細胞同士がタイトジャンクションで裏打ちされることにより、通常、腸管内の物質は非特異的に腸管を経由して体内へ侵入することはできない。しかし近年、肥満や疲労、ストレスやアルコール摂取といった負荷によって腸管のバリア機能が低下し、腸管の透過性が亢進することによって、エンドトキシンを代表とする有害な物質が体内に侵入することが分かってきており、このような状態はリーキーガット（腸管壁浸漏症候群）とも呼ばれている（非特許文献１を参照）。

このような腸管における透過性亢進と具体的な病態との関係は不明な点が多いが、例えばクローン病や過敏性腸症候群（ＩＢＳ）などでは腸管透過性が亢進していることが知られている。したがって、腸管透過性亢進を予防又は治療する薬剤の開発は、これらの疾患の予防又は治療にも有効であることが期待される。

現在に至るまで、腸管の透過性亢進を十分に改善させる薬剤は開発されていない。既報では、腸管の栄養源として利用されやすいグルタミンや（非特許文献２を参照）、腸内細菌叢を改善させる乳酸菌による透過性亢進の改善作用が報告されている（非特許文献３を参照）。しかし、これらの物質の効果は十分とは言えず、更なる薬剤探索を進める必要がある。このように薬剤探索が進まない状況の一因として、腸管透過性の亢進という状態を反映した簡易的なモデルが存在しないことが考えられる。

腸管透過性を評価する手法として最も簡便と考えられるものは、培養細胞を用いた各種試験である。これらの試験は主にタイトジャンクションという腸管透過性をコントロールするシステムの１つを評価するものだが、生体における腸管透過性は、タイトジャンクション以外にもムチン層による物理的な保護作用や血流に乗るまでの防御機構など、複数の要素が関与している。

一方、動物を用いたモデルとしては、長期に渡って高脂肪食や高ショ糖食を与えたり（非特許文献５を参照）、炎症惹起物質であるデキストラン硫酸ナトリウム（以下、ＤＳＳ）を大腸に投与することにより腸管透過性を亢進させるもモデルが存在する（非特許文献５を参照）。しかし、これらのモデルでは、腸管透過性を動物で評価するのに時間がかかり、効率的に薬剤探索を行うことが困難である。また、長期モデルでは腸管透過性亢進以外の病態が生じている、という大きな欠点が挙げられる。すなわち、高脂肪食や高ショ糖食を長期間負荷すれば、例えば糖代謝や脂質代謝に変化が生じ当該変化と腸透過性亢進が複雑に影響しあうため、例えば当該代謝に影響を与える薬剤がヒットしてする可能性が高まる。また、ＤＳＳを投与すると大腸内で炎症反応が生じ当該炎症反応が腸透過性亢進に影響を与えるため、例えば当該炎症反応に影響を与える薬剤がヒットする可能性が高まる。すなわち、これらのモデルでは腸管透過性への影響のみを純粋に評価できるとは言い難い。

診断と治療、１０２（７）：１０８５−９（２０１４） Ｄｉｇ Ｄｉｓ Ｓｃｉ． ５７（４）：１０００−１２（２０１２） Ｅｕｒ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｎｕｔｒ． ６６（１０）：１１１０−５（２０１２） Ｄｉａｂｅｔｅｓ． ５７（６）：１４７０−８１（２００８） Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ． １８４（９）：２５１６−２７（２０１４）

本発明の目的は、新規な腸管透過性亢進モデルを提供することにあり、さらには短期間で効率的に薬剤の評価が可能な新規の薬剤評価方法を提供することにある。

本発明者らは、前期課題を解決すべく鋭意検討した結果、アスピリンを投与することによって、既存の手法より短期間で腸管透過性亢進を予防又は治療する薬剤を評価可能な系の構築に至り、本発明を完成するに至った。

すなわち本発明は、次の通りである。
（１）哺乳動物にアスピリンを投与し、腸管透過性の亢進量を評価する方法。
（２）非ヒト哺乳動物にアスピリンを投与し、血液中のフルオレセインイソチオシアネートデキストランを測定することによって、腸管透過性の亢進量を評価する方法。
（３） 以下の工程（Ａ）〜（Ｄ）、
（Ａ）非ヒト哺乳動物にアスピリン、フルオレセインイソチオシアネートデキストラン及び被験物質を投与する工程、
（Ｂ）非ヒト哺乳動物の血液を採取する工程、
（Ｃ）血液中のフルオレセインイソチオシアネートデキストランを定量する工程、
（Ｄ）被験物質非投与群と比較して、上記（Ｃ）における定量値を低下させる被験物質を腸管透過性亢進の予防又は治療剤として選択する工程、
を含む腸管透過性亢進の予防又は治療剤のスクリーニング方法。
（４）非ヒト哺乳動物がマウス又はラットである（１）〜（３）のいずれかに記載の方法。

本発明により、哺乳動物、好ましくは非ヒト哺乳動物にアスピリンを投与することによって、短期間で効率的に腸管透過性亢進への影響を評価することが可能となった。また、本発明の方法は、既存の評価方法と比較して腸管透過性亢進以外の病態が生じることなく腸管透過性を単独で評価可能という点で有用である。本発明により腸管透過性亢進を予防又は治療する優れた薬剤の探索が可能となる。

アスピリン投与後の腸管透過性の時間依存的変化を示したグラフである（* p<0.05 （Steel検定 vs. Control） n=5）。 アスピリン投与後の腸管透過性の用量依存的変化を示したグラフである（* p<0.05 （Steel検定 vs. Control） n=5）。 アスピリン投与回数による腸管透過性の変化を示したグラフである（*** p<0.001 （Dunnett type多重比較 vs. Control） n=5） イブプロフェン投与回数による腸管透過性の変化を示したグラフである（* p<0.05 （Steel検定 vs. Control） n=4〜5）。

本発明の一つの態様は、哺乳動物にアスピリンを投与し、腸管透過性の亢進量を評価する方法である。
また、本発明の一つの態様は、非ヒト哺乳動物にアスピリンを投与し、血液中のフルオレセインイソチオシアネートデキストランを測定することによって、腸管透過性の亢進量を評価する方法である。

腸管透過性の亢進とは、肥満や疲労、ストレスやアルコール摂取といった負荷によって腸管のバリア機能が低下し、腸管の透過性が上昇した状態を意味し、この状態は「リーキーガット」と表現されることもある。腸管の透過性が上昇し、非特異的に腸管を通して血流に外来性の物質が侵入することは、各種病態が生じる危険因子ともなり得る。

腸管透過性の亢進を評価するためには、指標となる物質を投与した後、腸管透過性の亢進に伴い腸管から血液中に移行する指標物質を使用することが好ましい。本発明は当該指標物質としてフルオレセインイソチオシアネートデキストラン（ＦＩＴＣ−Ｄ）を使用する。ＦＩＴＣ−Ｄは分子量約４０００〜１１０００ＫＤａの分子であり、腸管のバリア機能が正常な場合は経口投与後に腸管まで移動しても腸管で吸収されることなく体外へ排出される。しかし、腸管のバリア機能が破壊され腸管透過性が亢進するとＦＩＴＣ−Ｄは腸管から血液中に移行する。したがって、ＦＩＴＣ−Ｄの血液中への移行量を測定することにより腸管透過性の亢進量を評価することができる。ＦＩＴＣ−Ｄの投与方法はＦＩＴＣ−Ｄが血液に入らず直接腸管に到達する方法であれば何ら限定されないが、例えば経口投与、腸内投与が挙げられ、好ましくは経口投与である。

ＦＩＴＣ−Ｄは、その分子量の面から腸管透過性の亢進の程度を特異的に評価する点で優れている。分子量がさらに小さい物質を使用した場合、腸管のバリア機能破壊とは無関係に、例えば通常の吸収機構を通じて腸管から血液中への移行が進んでしまう可能性があるが、ＦＩＴＣ−Ｄは十分な分子量を有しているため、そのような正常な機構による血液中への取り込みを最小限とすることができる。血液中に取り込まれたＦＩＴＣ−Ｄの量は、血液中のＦＩＴＣの蛍光値を測定するという簡便な方法で定量することが可能であり、多数の検体を短時間で評価可能な点で優れている。

ＦＩＴＣ−Ｄの哺乳動物（好ましくは非ヒト哺乳動物）への投与量は試験条件により適宜調整することが可能であるが、例えば非ヒト哺乳動物がマウスの場合は、好ましくは１０〜５０００ｍｇ／ｋｇ、さらに好ましくは１００〜１０００ｍｇ／ｋｇである。また、ＦＩＴＣ−Ｄ投与後、一定時間経過後に血液を採取し血液中に取り込まれたＦＩＴＣ−Ｄの量を測定するが、ＦＩＴＣ−Ｄ投与後血液採取までの時間は、好ましくは１０分から３時間、さらに好ましくは３０分から２時間である。

腸管透過性の亢進を誘発する物質としては、例えば腸管に障害を与える物質が好ましい。腸管に障害を与える物質としては例えばＮＳＡＩＤが挙げられるが、本願発明ではＮＳＡＩＤの中でもアスピリンを選択した点に特徴を有する。アスピリンは意外にも単回投与により腸管透過性の亢進を誘発した。したがって、アスピリンを使用することにより例えばわずか１日の試験で腸管透過性の亢進を評価することが可能となる。なお、アスピリンの投与は単回が好ましいが、試験目的により１日に２〜３回程度の複数回投与することも可能である。また、２〜３日程度連続投与することも可能である。アスピリンの投与方法は何ら限定されず、例えば経口投与、皮下投与、静脈内投与が挙げられ、好ましくは経口投与である。アスピリンの投与量は試験条件により適宜調整することが可能であるが、例えば非ヒト哺乳動物がマウスの場合は、好ましくは１０〜１０００ｍｇ／ｋｇ、さらに好ましくは３０〜５００ｍｇ／ｋｇである。また、アスピリン投与後、一定時間経過後に血液を採取し血液中に取り込まれたＦＩＴＣ−Ｄの量を測定するが、アスピリン投与後血液採取までの時間は、好ましくは３０分から１０時間、さらに好ましくは１時間から８時間である。

本発明の一つの態様は、以下の工程（Ａ）〜（Ｄ）の工程を含む腸管透過性亢進の予防又は治療剤のスクリーニング方法である。
（Ａ）非ヒト哺乳動物にアスピリン、フルオレセインイソチオシアネートデキストラン及び被験物質を投与する工程。
（Ｂ）非ヒト哺乳動物の血液を採取する工程。
（Ｃ）血液中のフルオレセインイソチオシアネートデキストランを定量する工程。
（Ｄ）被験物質非投与群と比較して、上記（Ｃ）における定量値を低下させる被験物質を腸管透過性亢進の予防又は治療剤として選択する工程。

ＦＩＴＣ−Ｄ、アスピリンの投与条件、血液中のＦＩＴＣ−Ｄを定量する条件等は上述の通りである。

本発明では被験物質とアスピリンを同時に又は別々に投与することにより、アスピリンが誘発する腸管透過性亢進を被験物質がどの程度低下させるか定量的に評価することが可能である。被験物質の効果を判定するためには（ｉ）被験物質を投与せずアスピリンのみを投与した群と（ｉｉ）被験物質とアスピリンを同時に又は別々に投与した群、をそれぞれ用意し、アスピリン投与後一定時間後に（ｉ）群及び（ｉｉ）群の非ヒト哺乳動物の血液を採取し、血液中のＦＩＴＣ−Ｄを定量し比較すればよい。（ｉ）群の血液中ＦＩＴＣ−Ｄ量と比較して（ｉｉ）群の血液中ＦＩＴＣ−Ｄ量が顕著に低下している場合、投与した被験物質に腸管透過性亢進の予防又は治療剤としての高い有用性が期待できる。

本発明は上述の通り、アスピリンとＦＩＴＣ−Ｄを使用することにより短時間で簡便な測定が可能となるので、被験物質の効率的なスクリーニングを行うことができる。さらに、短期間で評価を行うことにより腸管透過性亢進以外の要素の影響を最小限とすることができ、腸管透過性亢進を選択的に評価可能という点で有用である。

被験物質としては、特に限定されず、例えば低分子合成化合物、動植物抽出物、ペプチド、核酸が挙げられる。被験物質の投与量は被験物質ごとに適宜調整すればよく何ら限定されない。

本発明の方法により見出された被験物質は腸管透過性亢進の予防又は治療剤として利用可能であり、更には腸管透過性亢進に密接に関連した疾患であるクローン病、過敏性腸症候群（ＩＢＳ）、花粉症、食物アレルギー、アトピー性皮膚炎、下痢、便秘、アルコール摂取による肝臓障害等の疾患の予防又は治療剤として利用可能である。これらの予防又は治療剤は、例えば医薬品や食品等の有効成分として使用することが可能である。

本発明で評価する腸管部位としては、例えば十二指腸、空腸、回腸、結腸、直腸が挙げられる。また、本発明で使用する非ヒト哺乳動物としては例えばマウス、ラット、モルモット、イヌ、サルが挙げられ、好ましくはマウス又はラットである。

以下に試験例を挙げ、本発明について具体的に説明する。

試験例１ アスピリン投与後の腸管透過性の経時変化
１７時間以上絶食したマウスに対し、アスピリンを経口で１００ｍｇ／ｋｇ投与し、１、２、４、６時間後にＦＩＴＣ−Ｄを経口で６００ｍｇ／ｋｇ投与した後、１時間後に麻酔下で腹大静脈より血液を採取した（血液採取はアスピリン投与２、３、５、７時間後）。採取した血液は、ヘパリンを３ｕｎｉｔ添加したチューブに移し攪拌、遠心分離を行った後、ＥｎＶｉｓｉｏｎマルチラベルカウンターを使用してＦＩＴＣを４８５ｎｍで励起し、５２０ｎｍで蛍光を測定した。
＜試験結果＞
アスピリン投与後の血中ＦＩＴＣ−Ｄ濃度の経時変化は、１、２、４、６時間後（アスピリン投与２、３、５、７時間後）全ての群で増加し、腸管透過性が亢進していた（図１）。特に２、４時間後（アスピリン投与３、５時間後）で顕著な腸管透過性亢進が認められた。

試験例２ アスピリン投与量依存的な腸管透過性の変化
１７時間以上絶食したマウスに対し、アスピリンを経口で３０ｍｇ／ｋｇ、１００ｍｇ／ｋｇ、３００ｍｇ／ｋｇ投与し、４時間後にＦＩＴＣ−Ｄを経口で６００ｍｇ／ｋｇ投与した後、１時間後に麻酔下で腹大静脈より血液を採取した（アスピリン投与５時間後）。採取した血液は、ヘパリンを３ｕｎｉｔ添加したチューブに移し攪拌、遠心分離を行った後、ＥｎＶｉｓｉｏｎマルチラベルカウンターを使用してＦＩＴＣを４８５ｎｍで励起し、５２０ｎｍで蛍光を測定した。
＜試験結果＞
アスピリンの単回投与により用量依存的に血液中のＦＩＴＣ−Ｄ濃度の増加が認められ、特にアスピリン３００ｍｇ／ｋｇにおいてコントロール群（アスピリン非投与群）と比較して有意な増加が認められた（図２）。

試験例３ アスピリン投与回数依存的な腸管透過性の変化
各群のアスピリン投与は、１Ｄａｙ群は血液採取日のみ、２Ｄａｙ群は血液採取日前日と血液採取日に、１日１回で行った（３００ｍｇ／ｋｇ経口投与）。血液採取当日のアスピリン投与前に１７時間以上絶食した。血液採取当日には、マウスを群分けした後、アスピリンを経口投与し、４時間後にＦＩＴＣ−Ｄを経口で６００ｍｇ／ｋｇ投与した。ＦＩＴＣ−Ｄ投与１時間後に麻酔下で腹大静脈より血液を採取した。採取した血液は、ヘパリンを３ｕｎｉｔ添加したチューブに移し攪拌、遠心分離を行った後、ＥｎＶｉｓｉｏｎマルチラベルカウンターを使用してフルオレセインイソチオシアネートを４８５ｎｍで励起し、５２０ｎｍで蛍光を測定した。
＜試験結果＞
アスピリン投与回数による変化を検討した結果、１日間もしくは２日間投与で有意な血中ＦＩＴＣ−Ｄ濃度の増加が認められた（図３）。

試験例４ イブプロフェン投与回数依存的な腸管透過性の変化
アスピリン以外のＣＯＸ阻害剤としてイブプロフェンを使用し、腸管透過性の影響を評価した。イブプロフェンを経口で１２０ｍｇ／ｋｇの用量で投与した点以外は試験例３と同様の条件で試験を行った。
＜試験結果＞
イブプロフェンを単回投与（１Ｄａｙ）したマウスでは、アスピリン投与時のような腸管透過性の亢進は認められず、２回投与（２Ｄａｙ）したマウスにおいて腸管透過性の亢進が認められた（図４）。

本発明により、哺乳動物（好ましくは非ヒト哺乳動物）を用いた短期間で効率的な腸管透過性亢進の評価が可能となった。また、本発明の方法は、既存の評価方法と比較して腸管透過性を単独で評価可能という点で有用である。本発明により腸管透過性亢進を予防又は治療する優れた薬剤の効率的な探索が可能となった。

Claims (4)

1. 非ヒト哺乳動物にアスピリンを経口投与し、腸管透過性の亢進量を評価する方法。
2. 非ヒト哺乳動物にアスピリンを経口投与し、血液中のフルオレセインイソチオシアネートデキストランを測定することによって、腸管透過性の亢進量を評価する方法。
3. 以下の工程（Ａ）〜（Ｄ）、
   （Ａ）非ヒト哺乳動物にアスピリン、フルオレセインイソチオシアネートデキストラン及び被験物質を経口投与する工程、
   （Ｂ）非ヒト哺乳動物の血液を採取する工程、
   （Ｃ）血液中のフルオレセインイソチオシアネートデキストランを定量する工程、
   （Ｄ）被験物質非投与群と比較して、上記（Ｃ）における定量値を低下させる被験物質を腸管透過性亢進の予防又は治療剤として選択する工程、
   を含む腸管透過性亢進の予防又は治療剤のスクリーニング方法。
4. 非ヒト哺乳動物がマウス又はラットであり、アスピリン投与後血液採取までの時間が３０分から１０時間である請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。

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