JP6759243B2 - スキルプシンａおよびスキルプシンｂを含む組成物ならびにその抗肥満能 - Google Patents

スキルプシンａおよびスキルプシンｂを含む組成物ならびにその抗肥満能 Download PDF

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Description

関連出願の相互参照
本発明は、２０１２年７月１８日に出願された仮特許出願第６１６７２８４９号の非仮出願である２０１３年７月１７日に出願された米国特許出願第１３９４４６３４号の一部継続特許出願である２０１５年５月６日に出願された米国特許出願第１４７０５１１１号のＰＣＴ出願であり、これらはいずれも参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本発明は、一般に、脂肪生成抑制のための組成物に関する。より具体的には、本発明は、スキルプシンＡおよびスキルプシンＢを含む組成物ならびにその抗脂肪生成／抗肥満能を開示する。
新彊（Ｘｉｎｊｉａｎｇ）ワイン用ブドウ由来のヒドロキシスチルベン二量体としてのスキルプシンＡは既にＫｏｎｇ ＱらによりJ Sci Food Agric. 2010 Apr 15;90(5):823-8に報告されている。スキルプシンＡは、そのアミロイド−ベータ−ペプチド凝集抑制活性（Riviere C et al (2010)）、一重項酸素消去およびＤＮＡ保護活性（Kong Q et al (2010)）ならびにベータ−セクレターゼ抑制活性（Jeon SY et al (2007)）に関して注目されている。
スキルプシンＢは、ピセアタンノールの確立された血管弛緩性二量体であり、パッションフルーツから大量に得られている（Sano S et al, “Identification of the strong vaso-relaxing substance scirpusin B, a dimer of piceatannol, from passion fruit (Passiflora edulis) seeds, J Agric Food Chern. 2011 Jun 8; 59(11):6209-13）。スキルプシンＢも、その穏やかなＧＳＨ活性（Maruki-Uchida H et al (2013)）および抗−ＨＩＶ特性（Yang GX et al (2005)）のために注目されている。
ハマスゲ（Ｃｙｐｅｒｕｓ ｒｏｔｕｎｄｕｓ）根茎抽出物のヘキサン抽出物が抗肥満特性を示すことは既に報告されている（Administration of Cyperus rotundus rhizomes extract prevents Weight Gain in Obese Zucker rats. Lemaure et al. 2007. Phytother Res. 21: 724-730）。このヘキサン画分はα−シペルノン、ロツンデン、β−セリネン、カラメネン、シペレン、ｄ−カジネン、シペロツンドン、カダレン、パッチュレノン、ノオトカトン（Ｎｏｏｔｋａｔｅｎｅ）、スゲオノール、ｇ−カラコレン、コブソン、シペロール、イソコブソンおよびエピ−ａ−セリネンを含有することで特徴付けられた（Yadav et al. International Journal of Pharmaceutical and Clinical Research 2010; 2(1): 20-22）。しかし、本発明はハマスゲの酢酸エチル画分の抗肥満活性を開示する。この酢酸エチル画分はヘキサン画分の多くの構成成分のいずれも含有しない。本酢酸エチル画分は、今までのところ研究者によりハマスゲ内に存在すると報告されていない１群の化合物であるスチルベノイド由来化合物を含有する。従って、それは、スチルベノイド由来化合物の存在およびさらにその抗肥満作用の特有の組合せの予想外の発見である。また、ハマスゲの根茎の生物活性指針分画（ｂｉｏａｃｔｉｖｉｔｙ ｇｕｉｄｅｄ ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ）の後、酢酸エチル層の副画分が、二量体のスキルプシンＡおよびスキルプシンＢと共にピセアタンノールが濃縮されている別の副画分と比較して優れた抗脂肪生成効果を示す２つのピセアタンノール二量体スキルプシンＡおよびスキルプシンＢの濃縮された存在によって特徴付けられたことも驚くべき知見である。従って、本発明の発明者は、ハマスゲ根茎の酢酸エチル画分中のスキルプシンＡおよびスキルプシンＢの存在ならびにその抗脂肪生成／抗肥満能を初めて示す。
従って、本発明の主たる目的は、スキルプシンＡおよびスキルプシンＢの組成物ならびにその抗脂肪生成／抗肥満能を開示することである。
本発明の別の目的は、スキルプシンＡおよびスキルプシンＢを含む組成物を用いて哺乳動物細胞における脂肪生成を抑制する方法を開示することである。
本発明の別の目的は、スキルプシンＡおよびスキルプシンＢを含む組成物を用いて哺乳動物において肥満を管理する方法を開示することである。
本発明のさらに別の目的は、ハマスゲの根茎の生物活性指針分画によって、Ａ．スキルプシンＡおよびスキルプシンＢならびに、Ｂ．ピセアタンノールならびにその二量体スキルプシンＡおよびスキルプシンＢを含む組成物を得る方法を開示することである。
本発明は、前記目的をかなえ、さらに関連する利点を提供する。
本発明は、スキルプシンＡおよびスキルプシンＢを含む組成物ならびにその抗脂肪生成／抗肥満能を開示する。本発明はまた、スキルプシンＡおよびスキルプシンＢを含む組成物を用いて哺乳動物において肥満を管理する方法も開示する。本発明はさらに、ハマスゲの根茎の生物活性指針分画によって、Ａ．スキルプシンＡおよびスキルプシンＢ、ならびにＢ．ピセアタンノールならびにその二量体スキルプシンＡおよびスキルプシンＢを含む組成物を得る方法を開示する。本発明のその他の特徴および利点は、例として本発明の原理を示す添付の図面を参照した以下のより詳細な説明から明らかとなろう。
図１は、ハマスゲの根茎から活性成分を抽出するステップの概要を示すフローチャートを示す。 図２は、ピセアタンノール二量体スキルプシンＡおよびスキルプシンＢが天然に富化された酢酸エチル層の副画分ＩＩＩのＬＣ−ＭＳ分析を示す。 図２ａは、ピセアタンノール二量体スキルプシンＡおよびスキルプシンＢが天然に富化された酢酸エチル層の副画分ＩＩＩのＬＣ−ＭＳ分析を示す。 図２ｂは、ピセアタンノール二量体スキルプシンＡおよびスキルプシンＢが天然に富化された酢酸エチル層の副画分ＩＩＩのＬＣ−ＭＳ分析を示す。 図３は、ピセアタンノール二量体スキルプシンＡおよびスキルプシンＢが天然に富化された酢酸エチル層の副画分ＩＶのＬＣ−ＭＳ分析を示す。 図３ａは、ピセアタンノール二量体スキルプシンＡおよびスキルプシンＢが天然に富化された酢酸エチル層の副画分ＩＶのＬＣ−ＭＳ分析を示す。 図３ｂは、ピセアタンノール二量体スキルプシンＡおよびスキルプシンＢが天然に富化された酢酸エチル層の副画分ＩＶのＬＣ−ＭＳ分析を示す。 図３ｃは、ピセアタンノール二量体スキルプシンＡおよびスキルプシンＢが天然に富化された酢酸エチル層の副画分ＩＶのＬＣ−ＭＳ分析を示す。 図４は、ＨＲＭＳで得られた［Ｍ＋Ｈ］値が、二量体の構造および報告されているデータ（Sano et al., 2011）と極めて良く一致することを示すＨＲＭＳのデータを示す。 図５は、ＨＲＭＳで得られた［Ｍ＋Ｈ］値が、二量体の構造および報告されているデータ（Sano et al., 2011）と極めて良く一致することを示すＨＲＭＳのデータを示す。 図６は、総スチルベン５％に規格化されたハマスゲ根茎抽出物の酢酸エチル画分を投与された肥満した人の体重減少をグラフで示す。 図６ａは、総スチルベン５％に規格化されたハマスゲ根茎抽出物の酢酸エチル画分を投与された肥満した人の肥満度指数の低下をグラフで示す。 図６ｂは、総スチルベン５％に規格化されたハマスゲ根茎抽出物の酢酸エチル画分を投与された肥満した人の腹囲（ｗａｉｓｔ ｃｉｒｃｕｍｆｅｒｅｎｃｅ）の減少をグラフで示す。 図７は、総スチルベン５％に規格化されたハマスゲ根茎抽出物の酢酸エチル画分を投与された肥満した人（男性）の腹囲減少の写真を示す。 図８ａは、総スチルベン５％に規格化されたハマスゲ根茎抽出物の酢酸エチル画分を投与された肥満した人（女性）の腹囲減少の写真を示す。 図８ｂは、総スチルベン５％に規格化されたハマスゲ根茎抽出物の酢酸エチル画分を投与された肥満した人（女性）の腹囲減少の写真を示す。 図８ｃは、総スチルベン５％に規格化されたハマスゲ根茎抽出物の酢酸エチル画分を投与された肥満した人（女性）の腹囲減少の写真を示す。 図９ａは、総スチルベン５％に規格化されたハマスゲ根茎抽出物の酢酸エチル画分を投与された肥満した人の全身性脂質の変化を示す。 図９ｂは、総スチルベン５％に規格化されたハマスゲ根茎抽出物の酢酸エチル画分を投与された肥満した人の全身性脂質の変化を示す。 図９ｃは、総スチルベン５％に規格化されたハマスゲ根茎抽出物の酢酸エチル画分を投与された肥満した人の全身性脂質の変化を示す。 図９ｄは、総スチルベン５％に規格化されたハマスゲ根茎抽出物の酢酸エチル画分を投与された肥満した人の全身性脂質の変化を示す。 図９ｅは、総スチルベン５％に規格化されたハマスゲ根茎抽出物の酢酸エチル画分を投与された肥満した人の全身性脂質の変化を示す。
最も好ましい実施形態において、本発明は、それぞれＳＴＲ＃１およびＳＴＲ＃２で表わされるスキルプシンＡおよびスキルプシンＢを含む抗脂肪生成／抗肥満組成物に関する。
別の最も好ましい実施形態において、本発明は、哺乳動物細胞において脂肪生成を抑制する方法に関し、前記方法はそれぞれＳＴＲ＃１およびＳＴＲ＃２で表わされるスキルプシンＡおよびスキルプシンＢを含む組成物を脂肪生成性哺乳動物細胞と接触させるステップを含む。
別の最も好ましい実施形態において、本発明は、哺乳動物において脂肪生成により引き起こされる肥満を治療的に抑制する方法に関し、前記方法はそれぞれＳＴＲ＃１およびＳＴＲ＃２で表わされるスキルプシンＡおよびスキルプシンＢを含む組成物を、前記治療的抑制を必要とする哺乳動物に食事補給するステップを含む。
別の最も好ましい実施形態において、本発明は、ＳＴＲ＃１およびＳＴＲ＃２で表わされるスキルプシンＡおよびスキルプシンＢを含む組成物の、哺乳動物細胞における脂肪生成を抑制するための使用に関する。
代わりの実施形態において、本発明はまた、Ａ．ＳＴＲ＃１およびＳＴＲ＃２で表わされるスキルプシンＡおよびスキルプシンＢならびにＢ．ピセアタンノールならびにその二量体であるそれぞれＳＴＲ＃１およびＳＴＲ＃２で表わされるスキルプシンＡおよびスキルプシンＢを含む抗脂肪生成／抗肥満組成物を得るための、ハマスゲの根茎の生物活性指針分画のプロセスにも関し、前記プロセスは以下のステップを含む：
１）ハマスゲの根茎を乾燥し、これを粉砕して粗い粉末を形成する；
２）ステップ１の粉末を３容量のヘキサンで抽出し、続いて加熱還流を３時間行い、ろ過してヘキサン可溶性画分および使用済材料（ｓｐｅｎｔ ｍａｔｅｒｉａｌ）を得る；
３）ステップ２の使用済材料を３容量のメタノールで抽出し、続いて３時間加熱還流し、ろ過してメタノール可溶性活性画分および使用済材料を得る；
４）ステップ３のメタノール可溶性活性画分を水性メタノールに可溶化し、クロロホルム（ＣＨＣｌ3）、酢酸エチル（ＥｔＯＡｃ）およびメタノールで連続して分別して、それぞれクロロホルム層、酢酸エチル層および水性メタノール層を得る；
５）クロロホルム層、酢酸エチル層および水性メタノール層をさらなる生物活性指針分画に供する、ここで生物活性パラメーターはクロロホルム層、酢酸エチル層および水性メタノール層の、３Ｔ３−Ｌ１マウス脂肪細胞（哺乳動物脂肪細胞）内での脂肪生成を抑制する能力である；
６）クロロホルム層、酢酸エチル層および水性メタノール層により示される脂肪生成抑制に対するＩＣ50（μｇ／ｍｌ）値（それぞれ０、９．３９および６６．４２）を計算する；
７）カラム分画を用いて酢酸エチル層を分画して生物活性（脂肪生成抑制）バイオマーカーを同定する、前記分画は増大する極性のメタノール：クロロホルムで画分を溶出して酢酸エチル層（画分）の副画分を得るステップを含む；
８）ステップ７の副画分を生物活性（抗脂肪生成）分析に供する；
９）ステップ８の最も生物活性の高い副画分を同定し、これをＬＣ−ＭＳ分析に供して生物活性成分スキルプシンＡおよびスキルプシンＢを同定する；
１０）ステップ７の副画分を分取用ＨＰＬＣに供して精製された二量体を得る、これを高分解能質量分析（ＨＲＭＳ）、液体クロマトグラフィー−質量分析（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）および核磁気共鳴分光分析（ＮＭＲ）に供してスキルプシン生物活性成分の質量および構造を確認する。
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本発明者は、先のステップ２で言及したヘキサン抽出物を研究し、スキルプシンＡおよびスキルプシンＢが存在しないことを見出した。従って、ステップ１のヘキサン抽出物は、ステップ７で詳述した酢酸エチル画分とは構成上異なる。すなわち、ハマスゲの酢酸エチル抽出物は、Lemaure et al. 2007. Phytother Res. 21: 724-730における研究の対象であったヘキサン抽出物とは全く異なる。
本明細書の以下の欄は、本発明の最も好ましい実施形態の例示的な例からなる。
（例１）ハマスゲの根茎の生物活性指針分画（図１）
方法：
ハマスゲの乾燥した根茎を粉砕して粗い粉末を形成した。粉砕した粉末を次に３容量のヘキサンで抽出し、続いて３時間加熱還流し、ろ過してヘキサン可溶性画分および使用済材料を得た。この使用済材料をさらに３容量のメタノールで抽出し、続いて３時間加熱還流し、ろ過してメタノール可溶性活性画分および使用済材料を得る。メタノール可溶性画分を水性メタノールに可溶化し、クロロホルム（ＣＨＣｌ3）、酢酸エチル（ＥｔＯＡｃ）およびメタノールで連続して分別して、それぞれクロロホルム層、酢酸エチル層および水性メタノール層を得る。クロロホルム層、酢酸エチル層および水性メタノール層をさらなる生物活性指針分画に供する。ここで、生物活性パラメーターは、クロロホルム層、酢酸エチル層および水性メタノール層の、３Ｔ３−Ｌ１マウス脂肪細胞（哺乳動物脂肪細胞）内で脂肪生成を抑制する能力であった。脂肪生成抑制の程度を研究するためにSalazar Olivo et al (1995)、Wu Z et al (1998)、Fu M et al (2005)から適合させたオイルレッドＯ染色技術のステップは以下の例１Ａで説明する。結果は表Ａに示す。
（例１Ａ）脂肪細胞の最終分化は大きい細胞質性小胞内の大量の脂質の蓄積を伴う。細胞培養において脂肪細胞分化を測定する一般的なアッセイは染料オイルレッドＯ（ＯＲＯ）を用いる。ＯＲＯは、脂肪細胞分化の信頼性の高い指標である脂質可溶性の鮮やかな赤色の染料である。
原理：オイルレッドＯ（ソルベントレッド２７、スダンレッド５Ｂ、Ｃ．Ｉ．２６１２５、およびＣ26Ｈ24Ｎ4Ｏ）は、凍結切片上の中性のトリグリセリドおよび脂質ならびにパラフィン切片上のある種のリポタンパク質を染色するのに使用されるリソクロム（脂溶性染料）ジアゾ染料である。５１８（３５９）ｎｍに最大の吸収をもつ赤色粉末の外観を有する。オイルレッドＯはスダン染色に使用される染料の１つである。類似の染料には、スダンＩＩＩ、スダンＩＶ、およびスダンブラックＢがある。アルコール固定により脂質が除かれるので、染色は新鮮なサンプルに対して行わなければならない。オイルレッドＯは、ずっと深い赤色を提供し、従って染色を目視するのがずっと容易になるので、スダンＩＩＩおよびスダンＩＶの大部分に取って代わった。オイルレッドＯは油溶性染料である。油溶性染料は、通常の水性アルコール染料溶媒に対するより、組織／細胞内のリポイド物質に対してより大きい染料の溶解性を示し、従って細胞を深く染色する。
３Ｔ３−Ｌ１細胞のおよそ６０×１０4細胞を４８−７２時間播種して７０−８０％のコンフルエンスにする。４８時間後、新しく調製したＡＩＭ（脂肪生成誘導培地）を２００μｌ加える。７２時間後、２００μｌのＡＰＭ（脂肪生成増殖培地）をいろいろな濃度の試験化合物と共にウェルに加える。細胞を、５％ＣＯ2および９５％空気の加湿雰囲気（３７℃）中で４８時間インキュベートする。上清を集め、レプチン、アディポネクチン、ＩＬ−６およびＴＮＦ−アルファの評価のために保存する。１００μｌの１０％ホルマリンを加えることによって細胞を固定し、ＯＲＯ染色を行う。マイクロプレートリーダーでＯＤを４９２ｎｍで読み取る。
結果は、グラフパッドプリズムソフトウェアを用いてＩＣ50値として表す。脂肪生成の抑制パーセントは次式で計算される。
％抑制＝Ｃ−Ｔ／Ｔ＊１００
ここで、Ｃは分化／未分化細胞におけるオイルレッドＯの吸光度であり、Ｔはサンプルの処理した分化／未分化細胞におけるオイルレッドＯの吸光度である。
酢酸エチル層は脂肪生成抑制に関してＩＣ50（μｇ／ｍｌ）値９．３９の最良の生物活性を示した。この画分を次にカラム分画に供して生物活性（脂肪生成抑制）バイオマーカーを同定した。カラム分画は、酢酸エチル層の副画分を増大する極性のメタノール：クロロホルム混合物で溶出するステップを含んでいた。酢酸エチル層の副画分をＩ、ＩＩ、ＩＩＩおよびＩＶと標識し、生物活性（抗脂肪生成）評価に供する。抗脂肪生成活性評価の本質的なステップは上記例１Ａで概要を述べた手順を含む。結果を下記表Ｂにまとめて示す。

次に、いずれの画分もピセアタンノール二量体のスキルプシンＡおよびスキルプシンＢが富化されている副画分ＩＩＩおよびＩＶをＬＣ−ＭＳに供した（図２および３）。ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析は、ＲＰ Ｃ１８カラム（２５０×４．６ｍｍ、５μ粒径）を用いてＴｈｅｒｍｏ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ Ｆｉｎｎｉｇａｎ ＬＣＱ Ａｄｖａｎｔａｇｅ ＭＡＸ分光計で行った。この系は、Ｔｈｅｒｍｏ−Ｆｉｎｎｉｇａｎ ｓｕｒｖｅｙｏｒ ＰＤＡ検出器、ＬＣポンプおよびオートサンプラーからなっていた。移動相は、水中０．１％酢酸の溶媒（Ａ）およびアセトニトリルの溶媒（Ｂ）を用いた３５分間の勾配流（Ｇｒａｄｉｅｎｔ ｒｕｎ）を含んでいた。溶媒Ｂの濃度は、０〜５分で５％から、５〜２０分で５〜６０％に、２０〜２５分で６０〜１００％に増大し、２５〜２７分で１００〜５％に、２７〜３５分は５％で一定のままであった。固定相はＴｈｅｒｍｏ ＢＤＳ ｈｙｐｅｒｓｉｌ、Ｃ１８カラム（寸法−２５０ｍｍ×４．６ｍｍ）を含んでいた；流量：１ｍｌ／分；検出範囲：２６０ｎｍ。
イオン化パラメーター：ＡＰＣＩポジティブモード、電源電圧−４．５０ｋＶ、キャピラリー温度−２２５度、キャピラリー電圧−４３．００Ｖ。
データ解釈：スキルプシンＡの質量は４７０．１３と報告されている。上記プロトコルを用いて陽イオン化モードにおいて１８．７７分で観察された質量［Ｍ＋Ｈ］は４７１．０８である。スキルプシンＢの質量は４８６と報告されている。陽イオン化モードにおいて１７．９４分で観察された質量［Ｍ＋Ｈ］は４８７．０５である。
ハマスゲ（Ｃｙｐｅｒｕｓ）抽出物中のピセアタンノールの二量体の存在の第１のレベルの確認は質量に関するこの予備情報に基づいていた。スキルプシンＡは、スキルプシンＡの真正のサンプルとの直接比較によって直接確認した。
その後、副画分を分取用ＨＰＬＣに供して精製された二量体スキルプシンＢを得、これを次に分析手段高分解能質量分析（ＨＲＭＳ）、液体クロマトグラフィー−質量分析（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）および核磁気共鳴分光分析（ＮＭＲ）を用いて調べてスキルプシンＢであることを確認した。ＨＲＭＳのデータは［Ｍ＋Ｈ］＝４８７．１３８を示し、これは二量体の構造および報告されているデータ（Sano et al., 2011）と極めて良く一致しており（図４および５）、またスキルプシンＢの構造は低温プローブＮＭＲ（図６）を用いても確認された。この化合物は文献（Sano et al., 2011）で利用可能なデータとの比較の後に同定された。ＮＭＲデータ（ＣＤ3ＯＤ）：δ：５６．７３、９３．５０、９５．３９、１００．７９、１０２．９３、１０５．８７×２、１１２．２１、１１２．６３、１１４．８３、１１４．９１、１１７．０３、１１８．４２、１１８．６１、１２２．１７、１２９．４６、１２９．５３、１３３．５３、１３５．６０、１４４．９０、１４５．０１、１４５．０９、１４５．２１、１４６．２７、１５８．３６、１５８．５６×２、１６１．４６。５００ＭＨｚで得られたＡＰＴ（Ａｔｔａｃｈｅｄ Ｐｒｏｔｏｎ Ｔｅｓｔ）ＮＭＲスペクトルによって、スキルプシンＢの構造をさらに確認した。また、スキルプシンＢの真正のサンプルをSano et al., 2011により単離されたパッションフルーツから単離し、本発明者が上記のようにハマスゲから単離したスキルプシンＢと直接比較した。ＨＰＬＣ保持時間、質量スペクトルデータおよびＮＭＲデータの同一性はハマスゲ内のスキルプシンＢの存在を最も納得できる形で裏付けた。
（例２）
マウスにおけるＣＹＰＲＯ−ＡＦ（活性な酢酸エチル画分）およびＣＹＰＲＯ−Ｄ１（ピセアタンノール二量体のスキルプシンＡおよびスキルプシンＢが天然に富化された酢酸エチル副画分）抽出物の抗肥満効果の有効性評価
試験の目的：この研究の目的は、Ｃ５７マウスにおける抗肥満効果に対するＣｙｐｒｏ−ＡＦおよびＣｙｐｒｏ−Ｄ１抽出物の有効性を評価することであった。
試験系の詳細：
試験性能の詳細
飼育
グルーピング：動物のグルーピングは順化の最後の日に体重ランダム化および階層化法によって行った。動物のグルーピングは、使用した動物の体重変動が各群の平均体重の±２０％を超えないようにして行った。
研究デザイン：動物を６つの群、すなわち、各々１０匹の動物（５匹のオスおよび５匹のメス）からなる群１、２、３、４、５および６に分けた。群の詳細、用量および群当たりの動物の数／性別を次の表に示す：
製剤の詳細および投与量
試験品Ｃｙｐｒｏ−ＡＦおよびＣｙｐｒｏ−Ｄｌを、異なる用量を製剤化するための蒸留水に溶解させた。新しく製剤化された試験品を強制飼養により経口経路で投与した。動物当たりの投与量の容量は研究期間を通じて全ての動物で１０ｍｌ／ｋｇ体重に維持した。次表に試験製剤の詳細を示す。

肥満誘発：Ｇ１対照群の動物に１０ｋｃａｌ％の脂肪を含有する標準の対照食飼料Ｄ１２４５０Ｂを給餌し、Ｇ２〜Ｇ６群の動物には肥満誘発中および主研究中に６０ｋｃａｌ％の脂肪を含有する高脂肪食飼料Ｄ１２４９２を給餌した。
主研究：
肥満の誘発後主研究を開始した。２８日目から２７日の期間毎日連続して３用量のＣｙｐｒｏ−ＡＦおよび１用量のＣｙｐｒｏ−Ｄ１を動物に投与した。主研究において続けた食餌の給餌は肥満の誘発で行った。Ｇ１対照およびＧ２高脂肪食対照群の動物には蒸留水を投与する一方、他の群の動物は２８日〜５４日の研究期間の間試験品を受けた。投与の容量は個々の動物の１週間の体重に応じて維持した。研究の合計持続時間は６１日であった（７日の順化期間＋２７日の肥満誘発＋２７日の主研究）。
観察
研究期間中次の観察を行った。
飼料摂取量
個々の動物の飼料摂取量を記録した。１週間の平均飼料摂取量を計算し、記録した。
体重
個々の動物の体重を１日目の受け取った日に記録し、その後研究期間中１週間（±１日）毎に記録した。
臨床観察
全ての動物を研究期間中毎日二回臨床観察した。
臨床病理学
研究期間の終了時、動物から血液サンプルを、血液学のためにはエチレンジアミン四酢酸カリウム（Ｋ２−ＥＤＴＡ）抗凝固剤を含有するチューブに、また臨床化学のためには抗凝固剤なしでチューブに集めた。抗凝固剤なしでチューブに集めた血液サンプルを３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して血清を得た。血液サンプルは微細な毛細管を用いて軽いエーテル麻酔下で後眼窩叢穿刺法で人道的に集めた。以下の血液学および臨床化学パラメーターを分析した。
血液学
Ｓｙｓｍｅｘ、ＫＸ−２１（Ｔｒａｎｓａｓｉａ Ｂｉｏ−Ｍｅｄｉｃａｌｓ Ｌｔｄ．、Ｉｎｄｉａ）を用いて以下の血液学パラメーターを評価した：
臨床化学
「Ｅｒｂａ Ｍａｎｎｈｅｉｍ Ｃｈｅｒｎ Ｔｏｕｃｈ アナライザー」（Ｔｒａｎｓａｓｉａ Ｂｉｏ−Ｍｅｄｉｃａｌｓ Ｌｔｄ．、Ｉｎｄｉａ）を用いて、血清サンプルから次の臨床化学パラメーターを分析した。
病理学
研究期間の終了後、５５日目に、全ての動物をガス室で過剰の二酸化炭素に曝露することにより人道的に屠殺し、以下の外的および内的全体解剖（ｇｒｏｓｓ ｎｅｃｒｏｐｓｙ）に供した。
全体解剖
動物を外的および内的全体病理検査（ｇｒｏｓｓ ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ ｅｘａｍｉｎａｔｉｏｎ）に供した。
臓器重量
全ての動物の次の臓器から必要に応じてあらゆる付着組織を取り除き、乾燥を避けるためにできるだけ早く湿ったまま秤量した：脳、胸腺、肝臓、副腎、腎臓（対臓器）、脾臓、心臓、卵巣／睾丸（対臓器）。
脂肪沈着重量
全ての動物の次の脂肪沈着を集め、秤量した。
１．副睾丸脂肪
２．褐色脂肪
３．卵巣脂肪
統計解析および報告書作成
本研究で得られた生のデータをコンピューターによる統計処理に供した。データのコンピュータープリントアウト（付属書の形）を元の生のデータで検証した。検証後、データを、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍバージョン５．０１、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅを用いて体重、血液学および臨床化学パラメーター、臓器重量に関するデータに対するＤｕｎｎｅｔｔの事後検定で一元配置ＡＮＯＶＡ（分散分析）に供した。全ての分析および比較は、以下に述べる報告全体に亘って、Ｇ１をＧ３、Ｇ４、Ｇ５、およびＧ６と比較する場合の上付き文字ａならびにＧ２をＧ３、Ｇ４、Ｇ５、およびＧ６と比較する場合の上付き文字ｂによる表示により示された９５％の信頼性レベル（Ｐ＜０．０５）で評価される：＊：適用できる場合は常に統計的に有意である（Ｐ＜０．０５）。
データを以下のように比較することにより一元配置ＡＮＯＶＡ統計解析に供した：
以下に示すような、Ｇ１群｛対照群（脂肪１０ｋｃａｌ％）｝対Ｇ３群｛ＣＹＰＲＯ−ＡＦ５０ｍｇ／ｋｇ＋高脂肪食（脂肪６０ｋｃａｌ％）｝、Ｇ４群｛ＣＹＰＲＯ−ＡＦ−１００ｍｇ／ｋｇ＋高脂肪食（脂肪６０ｋｃａｌ％）｝、Ｇ５群｛ＣＹＰＲＯ−ＡＦ２００ｍｇ／ｋｇ＋高脂肪食（脂肪６０ｋｃａｌ％）およびＧ６群｛ＣＹＰＲＯ−Ｄ１ １０ｍｇ／ｋｇ＋高脂肪食（脂肪６０ｋｃａｌ％）｝：
以下に示すような、Ｇ２−高脂肪食対照（脂肪６０ｋｃａｌ％）対Ｇ３群｛ＣＹＰＲＯ−ＡＦ５０ｍｇ／ｋｇ＋高脂肪食（脂肪６０ｋｃａｌ％）｝、Ｇ４群｛ＣＹＰＲＯ−ＡＦ−１００ｍｇ／ｋｇ＋高脂肪食（脂肪６０ｋｃａｌ％）｝、Ｇ５群｛ＣＹＰＲＯ−ＡＦ２００ｍｇ／ｋｇ＋高脂肪食（脂肪６０ｋｃａｌ％）｝およびＧ６群｛ＣＹＰＲＯ−Ｄ１ １０ｍｇ／ｋｇ＋高脂肪食（脂肪６０ｋｃａｌ％）｝：

結果
飼料摂取量
オスおよびメスの動物の週平均飼料摂取量の要約をそれぞれ表１および表２に示す。研究期間中動物の飼料摂取量に統計的有意差はなかった。
体重
オスおよびメスの動物の１週間の体重の要約をそれぞれ表３および表４に示す。
オスの動物において、Ｇ３群｛ＣＹＰＲＯ−ＡＦ−５０ｍｇ／ｋｇ＋高脂肪食（脂肪６０ｋｃａｌ％）｝、Ｇ４群｛ＣＹＰＲＯ−ＡＦ−１００ｍｇ／ｋｇ＋高脂肪食（脂肪６０ｋｃａｌ％）｝、Ｇ５群｛ＣＹＰＲＯ−ＡＦ−２００ｍｇ／ｋｇ＋高脂肪食（脂肪６０ｋｃａｌ％）｝およびＧ６群｛ＣＹＰＲＯ−Ｄ１−１０ｍｇ／ｋｇ＋高脂肪食（脂肪６０ｋｃａｌ％）｝で、Ｇ１群｛対照群（脂肪１０ｋｃａｌ％）｝と比較して、２１日目の平均週間体重値に統計的に有意な増大があった。これらの変化は飼料の脂肪含有量の差に起因すると考えられた。
オスの動物において、Ｇ４群｛ＣＹＰＲＯ−ＡＦ−１００ｍｇ／ｋｇ＋高脂肪食（脂肪６０ｋｃａｌ％）｝、Ｇ５群｛ＣＹＰＲＯ−ＡＦ−２００ｍｇ／ｋｇ＋高脂肪食（脂肪６０ｋｃａｌ％）｝およびＧ６群｛ＣＹＰＲＯ−Ｄ１−１０ｍｇ／ｋｇ＋高脂肪食（脂肪６０ｋｃａｌ％）｝で、Ｇ１群｛対照群（脂肪１０ｋｃａｌ％）｝と比較して、２８日目の平均週間体重値に統計的に有意な増大があった。これらの変化は飼料の脂肪含有量の差に起因すると考えられた。
オスの動物において、Ｇ３群｛ＣＹＰＲＯ−ＡＦ−５０ｍｇ／ｋｇ＋高脂肪食（脂肪６０ｋｃａｌ％）｝、Ｇ４群｛ＣＹＰＲＯ−ＡＦ−１００ｍｇ／ｋｇ＋高脂肪食（脂肪６０ｋｃａｌ％）｝、Ｇ５群｛ＣＹＰＲＯ−ＡＦ−２００ｍｇ／ｋｇ＋高脂肪食（脂肪６０ｋｃａｌ％）｝およびＧ６群｛ＣＹＰＲＯ−Ｄ１−１０ｍｇ／ｋｇ＋高脂肪食（脂肪６０ｋｃａｌ％）｝で、Ｇ１群｛対照群（脂肪１０ｋｃａｌ％）｝と比較して、３５、４２、４９および５５日目の平均週間体重値が減少した。これらの変化は試験品の投与に起因すると考えられた。
メスの動物において、Ｇ４群｛ＣＹＰＲＯ−ＡＦ−１００ｍｇ／ｋｇ＋高脂肪食（脂肪６０ｋｃａｌ％）｝、Ｇ５群｛ＣＹＰＲＯ−ＡＦ−２００ｍｇ／ｋｇ＋高脂肪食（脂肪６０ｋｃａｌ％）｝およびＧ６群｛ＣＹＰＲＯ−Ｄ１−１０ｍｇ／ｋｇ＋高脂肪食（脂肪６０ｋｃａｌ％）｝で、Ｇ１群｛対照群（脂肪１０ｋｃａｌ％）｝と比較して、２１日目の平均週間体重値に統計的に有意な増大があった。これらの変化は飼料の脂肪含有量の差に起因すると考えられた。
メスの動物において、Ｇ３群｛ＣＹＰＲＯ−ＡＦ−５０ｍｇ／ｋｇ＋高脂肪食（脂肪６０ｋｃａｌ％）｝、Ｇ４群｛ＣＹＰＲＯ−ＡＦ−１００ｍｇ／ｋｇ＋高脂肪食（脂肪６０ｋｃａｌ％）｝、Ｇ５群｛ＣＹＰＲＯ−ＡＦ−２００ｍｇ／ｋｇ＋高脂肪食（脂肪６０ｋｃａｌ％）｝およびＧ６群｛ＣＹＰＲＯ−Ｄ１−１０ｍｇ／ｋｇ＋高脂肪食（脂肪６０ｋｃａｌ％）｝で、Ｇ１群｛対照群（脂肪１０ｋｃａｌ％）｝と比較して、２８日目の平均週間体重値に統計的に有意な増大があった。これらの変化は飼料の脂肪含有量の差に起因すると考えられた。
メスの動物において、Ｇ３群｛ＣＹＰＲＯ−ＡＦ−５０ｍｇ／ｋｇ＋高脂肪食（脂肪６０ｋｃａｌ％）｝、Ｇ４群｛ＣＹＰＲＯ−ＡＦ−１００ｍｇ／ｋｇ＋高脂肪食（脂肪６０ｋｃａｌ％）｝、Ｇ５群｛ＣＹＰＲＯ−ＡＦ−２００ｍｇ／ｋｇ＋高脂肪食（脂肪６０ｋｃａｌ％）｝およびＧ６群｛ＣＹＰＲＯ−Ｄ１−１０ｍｇ／ｋｇ＋高脂肪食（脂肪６０ｋｃａｌ％）｝で、Ｇ１群｛対照群（脂肪１０ｋｃａｌ％）｝と比較して、３５、４２、４９および５５日目の平均週間体重値が減少した。これらの変化は試験品の投与に起因すると考えられた。
臨床観察
オスおよびメスの動物の臨床兆候の要約をそれぞれ表−５および表−６に示す。動物は、研究期間中の臨床観察の間健康状態が健常で正常であることが分かった。
血液学
オスおよびメスの動物の血液学パラメーター評価の要約をそれぞれ表−７および表−８に示す。
Ｇ１対Ｇ３、Ｇ４、Ｇ５、およびＧ６の間の血液学パラメーター統計解析比較
平均赤血球ヘモグロビン濃度（ＭＣＨＣ）
オスの動物において、Ｇ１群｛対照群（脂肪１０ｋｃａｌ％）｝と比較してＧ４群｛ＣＹＰＲＯ−ＡＦ−１００ｍｇ／ｋｇ＋高脂肪食（脂肪６０ｋｃａｌ％）｝の平均ＭＣＨＣ値に統計的に有意な増大があった。これらの変化は、容量依存性応答がなかったので偶発的であったと考えることができる。
平均赤血球容積および平均赤血球ヘモグロビン
メスの動物において、Ｇ１群｛対照群（脂肪１０ｋｃａｌ％）｝と比較してＧ３群｛ＣＹＰＲＯ−ＡＦ−５０ｍｇ／ｋｇ＋高脂肪食（脂肪６０ｋｃａｌ％）｝で平均ＭＣＶおよびＭＣＨ値に統計的に有意な増大があった。これらの変化は、容量依存性応答がなかったので偶発的であったと考えることができる。
平均赤血球ヘモグロビンおよび平均赤血球ヘモグロビン濃度
メスの動物において、Ｇ２群｛高脂肪食対照群（脂肪６０ｋｃａｌ％）｝と比較してＧ５群｛ＣＹＰＲＯ−ＡＦ−２００ｍｇ／ｋｇ＋高脂肪食（脂肪６０ｋｃａｌ％）｝の平均ＭＣＨおよびＭＣＨＣ値に統計的に有意な増大があった。この変化は、容量依存性応答がなかったので偶発的であったと考えることができる。
臨床化学
オスおよびメスの動物の臨床化学パラメーター評価の要約をそれぞれ表−９および表−１０に示す。
Ｇ１対Ｑ３、Ｇ４、Ｇ５、およびＧ６間の臨床化学パラメーター統計解析比較
総タンパク質
メスの動物において、Ｇ１群｛対照群（脂肪１０ｋｃａｌ％）｝と比較して、Ｇ３群｛ＣＹＰＲＯ−ＡＦ−５０ｍｇ／ｋｇ＋高脂肪食（脂肪６０ｋｃａｌ％）｝およびＧ４群｛ＣＹＰＲＯ−ＡＦ−１００ｍｇ／ｋｇ＋高脂肪食（脂肪６０ｋｃａｌ％）｝の平均総タンパク質値に統計的に有意な低下があった。これらの変化は飼料の脂肪含有量の差に起因すると考えられた。
トリグリセリド
メスの動物において、Ｇ３群｛ＣＹＰＲＯ−ＡＦ−５０ｍｇ／ｋｇ＋高脂肪食（脂肪６０ｋｃａｌ％）｝、Ｇ４群｛ＣＹＰＲＯ−ＡＦ−１００ｍｇ／ｋｇ＋高脂肪食（脂肪６０ｋｃａｌ％）｝、Ｇ５群｛ＣＹＰＲＯ−ＡＦ−２００ｍｇ／ｋｇ＋高脂肪食（脂肪６０ｋｃａｌ％）｝およびＧ６群｛ＣＹＰＲＯ−Ｄ１−１０ｍｇ／ｋｇ＋高脂肪食（脂肪６０ｋｃａｌ％）｝の平均トリグリセリド値に、Ｇ１群｛対照群（脂肪１０ｋｃａｌ％）｝と比較して統計的に有意な低下があった。これらの変化は飼料の脂肪含有量の差に起因すると考えられた。
総コレステロール
オスの動物において、Ｇ３群｛ＣＹＰＲＯ−ＡＦ−５０ｍｇ／ｋｇ＋高脂肪食（脂肪６０ｋｃａｌ％）｝およびＧ６群｛ＣＹＰＲＯ−Ｄ１ １０ｍｇ／ｋｇ＋高脂肪食（脂肪６０ｋｃａｌ％）｝の平均総コレステロール値に、Ｇ１群｛対照群（脂肪１０ｋｃａｌ％）｝と比較して統計的に有意な増大があった。これらの変化は飼料の脂肪含有量の差に起因すると考えられた。
メスの動物において、Ｇ１群｛対照群（脂肪１０ｋｃａｌ％）｝と比較して、Ｇ５群｛ＣＹＰＲＯ−ＡＦ−２００ｍｇ／ｋｇ＋高脂肪食（脂肪６０ｋｃａｌ％）｝の平均総コレステロール値に統計的に有意な増大があった。この変化は飼料の脂肪含有量の差に起因すると考えることができる。
高密度脂質
オスの動物において、Ｇ１群｛対照群（脂肪１０ｋｃａｌ％）｝と比較して、Ｇ５群｛ＣＹＰＲＯ−ＡＦ−２００ｍｇ／ｋｇ＋高脂肪食（脂肪６０ｋｃａｌ％）｝の平均高密度脂質値に統計的に有意な低下があった。この変化は飼料の脂肪含有量の差に起因すると考えることができる。
低密度脂質
オスの動物において、Ｇ３群｛ＣＹＰＲＯ−ＡＦ−５０ｍｇ／ｋｇ＋高脂肪食（脂肪６０ｋｃａｌ％）｝、Ｇ４群｛ＣＹＰＲＯ−ＡＦ−１００ｍｇ／ｋｇ＋高脂肪食（脂肪６０ｋｃａｌ％）｝およびＧ６群｛ＣＹＰＲＯ−Ｄ１−１０ｍｇ／ｋｇ＋高脂肪食（脂肪６０ｋｃａｌ％）｝の平均低密度脂質値に、Ｇ１群｛対照群（脂肪１０ｋｃａｌ％）｝と比較して統計的に有意な増大があった。これらの変化は飼料の脂肪含有量の差に起因すると考えられた。
超低密度脂質
メスの動物において、Ｇ５群｛ＣＹＰＲＯ−ＡＦ−２００ｍｇ／ｋｇ＋高脂肪食（脂肪６０ｋｃａｌ％）｝の平均超低密度脂質値に、Ｇ１群｛対照群（脂肪１０ｋｃａｌ％）｝と比較して統計的に有意な増大があった。この変化は飼料の脂肪含有量の差に起因すると考えることができる。
Ｇ２対Ｇ３、Ｇ４、Ｇ５、およびＧ６間の臨床化学パラメーター統計解析比較
トリグリセリド
オスの動物において、Ｇ２群の高脂肪食対照（脂肪６０ｋｃａｌ％）と比較して、Ｇ３群｛ＣＹＰＲＯ−ＡＦ５０ｍｇ／ｋｇ＋高脂肪食（脂肪６０ｋｃａｌ％）｝、Ｇ４群｛ＣＹＰＲＯ−ＡＦ−１００ｍｇ／ｋｇ＋高脂肪食（脂肪６０ｋｃａｌ％）｝、Ｇ５群｛ＣＹＰＲＯ−ＡＦ２００ｍｇ／ｋｇ＋高脂肪食（脂肪６０ｋｃａｌ％）｝およびＧ６群｛ＣＹＰＲＯ−Ｄ１ １０ｍｇ／ｋｇ＋高脂肪食（脂肪６０ｋｃａｌ％）｝の平均トリグリセリド値が低下した。この平均トリグリセリド値が低下した変化は試験品の効果であることができよう。
メスの動物において、Ｇ６群｛ＣＹＰＲＯ−Ｄ１ １０ｍｇ／ｋｇ＋高脂肪食（脂肪６０ｋｃａｌ％）｝の平均トリグリセリド値に、Ｇ２群の高脂肪食対照（脂肪６０ｋｃａｌ％）と比較して統計的に有意な低下があった。この平均トリグリセリド値が低下した変化は試験品の効果であることができよう。
Ｇ２群の高脂肪食対照（脂肪６０ｋｃａｌ％）と比較して、Ｇ３群｛ＣＹＰＲＯ−ＡＦ５０ｍｇ／ｋｇ＋高脂肪食（脂肪６０ｋｃａｌ％）｝、Ｇ４群｛ＣＹＰＲＯ−ＡＦ１００ｍｇ／ｋｇ＋高脂肪食（脂肪６０ｋｃａｌ％）｝およびＧ５群｛ＣＹＰＲＯ−ＡＦ２００ｍｇ／ｋｇ＋高脂肪食（脂肪６０ｋｃａｌ％）｝の平均トリグリセリド値が低下した。これらの平均トリグリセリド値が低下した変化は試験品の効果であることができよう。
総コレステロール
オスの動物において、Ｇ２群の高脂肪食対照（脂肪６０ｋｃａｌ％）と比較して、Ｇ３群｛ＣＹＰＲＯ−ＡＦ５０ｍｇ／ｋｇ＋高脂肪食（脂肪６０ｋｃａｌ％）｝、Ｇ４群｛ＣＹＰＲＯ−ＡＦ−１００ｍｇ／ｋｇ＋高脂肪食（脂肪６０ｋｃａｌ％）｝およびＧ５群｛ＣＹＰＲＯ−ＡＦ２００ｍｇ／ｋｇ＋高脂肪食（脂肪６０ｋｃａｌ％）｝の平均総コレステロール値が低下した。この平均総コレステロール値が低下した変化は試験品の効果であることができよう。
メスの動物において、Ｇ２群の高脂肪食対照（脂肪６０ｋｃａｌ％）と比較して、Ｇ３群｛ＣＹＰＲＯ−ＡＦ５０ｍｇ／ｋｇ＋高脂肪食（脂肪６０ｋｃａｌ％）｝、Ｇ４群｛ＣＹＰＲＯ−ＡＦ１００．ｍｇ／ｋｇ＋高脂肪食（脂肪６０ｋｃａｌ％）｝、およびＧ６群｛ＣＹＰＲＯ−Ｄ１ １０ｍｇ／ｋｇ＋高脂肪食（脂肪６０ｋｃａｌ％）｝の平均総コレステロール値が低下した。この平均総コレステロール値が低下した変化は試験品の効果であることができよう。
高密度脂質
オスの動物において、Ｇ３群｛ＣＹＰＲＯ−ＡＦ５０ｍｇ／ｋｇ＋高脂肪食（脂肪６０ｋｃａｌ％）｝、Ｇ４群｛ＣＹＰＲＯ−ＡＦ−１００ｍｇ／ｋｇ＋高脂肪食（脂肪６０ｋｃａｌ％）｝、Ｇ５群｛ＣＹＰＲＯ−ＡＦ２００ｍｇ／ｋｇ＋高脂肪食（脂肪６０ｋｃａｌ％）｝およびＧ６群｛ＣＹＰＲＯ−Ｄ１ １０ｍｇ／ｋｇ＋高脂肪食（脂肪６０ｋｃａｌ％）｝の平均高密度脂質値に、Ｇ２群の高脂肪食対照（脂肪６０ｋｃａｌ％）と比較して統計的に有意な低下があった。
平均高密度脂質値の統計的に有意な低下の変化は試験品の効果であることができよう。
メスの動物において、Ｇ２群の高脂肪食対照（脂肪６０ｋｃａｌ％）と比較して、Ｇ３群｛ＣＹＰＲＯ−ＡＦ５０ｍｇ／ｋｇ＋高脂肪食（脂肪６０ｋｃａｌ％）｝、Ｇ４群｛ＣＹＰＲＯ−ＡＦ１００ｍｇ／ｋｇ＋高脂肪食（脂肪６０ｋｃａｌ％）｝、Ｇ５群｛ＣＹＰＲＯ−ＡＦ２００ｍｇ／ｋｇ＋高脂肪食（脂肪６０ｋｃａｌ％）｝およびＧ６群｛ＣＹＰＲＯ−Ｄ１ １０ｍｇ／ｋｇ＋高脂肪食（脂肪６０ｋｃａｌ％）｝の平均高密度脂質値に統計的に有意な低下があった。これらの平均高密度脂質値が低下した変化は試験品の効果であることができよう。
低密度脂質
オスの動物において、Ｇ２群の高脂肪食対照（脂肪６０ｋｃａｌ％）と比較して、Ｇ５群｛ＣＹＰＲＯ−ＡＦ２００ｍｇ／ｋｇ＋高脂肪食（脂肪６０ｋｃａｌ％）｝の平均低密度脂質値が低下した。この平均低密度脂質値が低下した変化は試験品の効果であることができよう。
超低密度脂質値
オスの動物において、Ｇ２群の高脂肪食対照（脂肪６０ｋｃａｌ％）と比較して、Ｇ３群｛ＣＹＰＲＯ−ＡＦ５０ｍｇ／ｋｇ＋高脂肪食（脂肪６０ｋｃａｌ％）｝、Ｇ４群｛ＣＹＰＲＯ−ＡＦ−１００ｍｇ／ｋｇ＋高脂肪食（脂肪６０ｋｃａｌ％）｝、Ｇ５群｛ＣＹＰＲＯ−ＡＦ２００ｍｇ／ｋｇ＋高脂肪食（脂肪６０ｋｃａｌ％）｝およびＧ６群｛ＣＹＰＲＯ−Ｄ１ １０ｍｇ／ｋｇ＋高脂肪食（脂肪６０ｋｃａｌ％）｝の平均超低密度脂質値が低下した。この平均超低密度脂質値が低下した変化は試験品の効果であることができよう。
メスの動物において、Ｇ２群の高脂肪食対照（脂肪６０ｋｃａｌ％）と比較して、Ｇ３群｛ＣＹＰＲＯ−ＡＦ５０ｍｇ／ｋｇ＋高脂肪食（脂肪６０ｋｃａｌ％）｝、Ｇ４群｛ＣＹＰＲＯ−ＡＦ１００ｍｇ／ｋｇ＋高脂肪食（脂肪６０ｋｃａｌ％）｝、およびＧ６群｛ＣＹＰＲＯ−Ｄ１ １０ｍｇ／ｋｇ＋高脂肪食（脂肪６０ｋｃａｌ％）｝の平均超低密度脂質値がわずかに低下した。これらの平均超低密度脂質値が低下した変化は試験品の効果であることができよう。
結論：本研究から、試験品のＣｙｐｒｏ−ＡＦおよびＣｙｐｒｏ−Ｄ１は、高脂肪食で誘発された肥満したオスおよびメスのＣ５７動物において、５０、１００および２００ｍｇ／ｋｇ体重のＣｙｐｒｏ−ＡＦおよび１０ｍｇ／ｋｇ体重のＣｙｐｒｏ−Ｄｌで、ＨＤＬ、トリグリセリド、コレステロール、ＬＤＬおよびＶＬＤＬ濃度のようなパラメーターを低下させる効果があったと結論することができる。動物の剖検に際して、臓器重量および脂肪沈着に有意な統計的変化は観察されなかった。
（例３）
ピセアタンノールならびにその二量体のスキルプシンＡおよびスキルプシンＢを含むハマスゲの酢酸エチル画分の、ヒトにおける体重管理に対する効果−有効性、安全性および許容性の研究。
研究の詳細
基本的な目的には、（ｉ）肥満した患者の体重管理に対するハマスゲ抽出物の有効性を研究すること；ならびに（ｉｉ）肥満した患者の体重管理に対するハマスゲ抽出物の安全性および許容性を研究することがあった。
二次的な目的には、肥満した患者の体重管理におけるハマスゲ抽出物の活性の発現の研究があった。
基本的な測定結果には、（ｉ）体重および肥満度指数の低下；（ｉｉ）腹囲およびウエスト：ヒップの比（身体計測値）の低下；（ｉｉｉ）コレステロール、トリグリセリド、ＬＤＬおよびＶＬＤＬ値のベースラインからの低下；（ｉｖ）ＨＤＬ値のベースラインからの増大；ならびに（ｖ）基準時および最後の来院時に被検者から得られた写真による証拠（身元は示さない）が含まれた。
二次的な測定結果には、研究対象における有害事象およびその他の身体的兆候または症状に関する研究材料の許容性を評価することが含まれていた。
被検者の人口統計（表１１）
ヒトの研究で使用した具体的な製剤（表１２および１３）

本明細書中上記した活性な研究材料およびプラセボを、充填質量（ｆｉｌｌ ｗｅｉｇｈｔ）５６０ｍｇのサイズ「００」のブラウン／ブラウンハードゼラチンカプセルとして製剤化した。二重盲検研究として、活性な研究材料カプセルおよびプラセボカプセルは両方とも、大きさ、形状および質量のような全ての物理的な側面が同じであった。活性な研究材料のランダムに選択したバッチは分析するとカプセル当たり平均して３６．１８ｍｇのピセアタンノールおよびスキルプシンＢを示した。より具体的な実施形態において、ハマスゲ抽出物を含む具体的な製剤は、ピセアタンノール、スキルプシンＡおよびスキルプシンＢを含む総スチルベンを３％より多く含有するように規格化した。表１２に明記された例示的な例においては、ピセアタンノール、スキルプシンＡおよびスキルプシンＢを含む総スチルベンを５％含有するように規格化されたハマスゲ抽出物が示されている。
試験はＧｏｖｅｒｎｍｅｎｔ Ａｙｕｒｖｅｄａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ、Ｍｙｓｏｒｅ、Ｉｎｄｉａで行われた。研究は、組織の倫理委員会からの承認意見書が得られた後に開始した。研究の間承認されたプロトコルには変化も修正も加えなかった。試験は、ヘルシンキ宣言（Ｅｄｉｎｂｕｒｇｈ、２０００）に明記されている原理およびＧｏｏｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｒａｃｔｉｃｅ（ＧＣＰ）に関するＩＣＨ ｈａｒｍｏｎｉｚｅｄ ｔｒｉｐａｒｔｉｔｅ ｇｕｉｄｅｌｉｎｅに従って行った。被検者が理解できる言語による研究に関する文書および口頭の情報が全ての被検者に提供された。
このランダム化、二重盲検、並行群、プラセボ対照の研究は、スクリーニングのための来院は別として、研究対象による臨床施設への全部で５回の来院を含んでいた。評価のスケジュールを表１４に示す。
被検者は、組み入れ基準の全部に「Ｙｅｓ」を示し、除外基準のいずれにも「Ｎｏ」を示したら研究に含めた。組み入れ基準：１）男性および／または女性の患者、２）年齢２０〜６５歳、３）２００ｍｇ／ｄＬを超える上昇した血清コレステロールレベル、４）１５０ｍｇ／ｄＬを超える上昇した血清トリグリセリド、５）１３０ｍｇ／ｄＬを超える上昇した血清ＬＤＬおよび／または４０ｍｇ／ｄＬを超える上昇した血清ＶＬＤＬ、６）≧３０〜４０Ｋｇ／ｍ2のＢＭＩ、７）定期的な追跡調査のための来院の意思、８）同意書を提出できること。除外基準：１）過去６カ月以内の市販の減量剤（ｗｅｉｇｈｔ ｌｏｓｓ ａｇｅｎｔ）、中枢作用性食欲抑制剤の摂取、２）肥満に関連する病態生理学／遺伝的症候群（クッシング症候群、ターナー症候群、プラダーウィリー症候群）、３）悪性腫瘍の兆候がある患者、４）管理不良の糖尿病（Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｍｅｌｌｉｔｕｓ）（ＨｂＡ１ｃ＞１０％）がある患者、５）管理不良の高血圧症（＞１６０／１００ｍｍＨｇ）がある患者、６）コルチコステロイド、抗うつ薬、抗コリン作用薬、等またはその他の研究の結果に影響を及ぼす可能性がある何らかの薬物を長期にわたって（＞６週）投薬している患者、７）長期の薬物処置を必要とする主要な全身性疾患（関節リウマチ、ライゾームキュローシス（Ｒｈｉｚｏｍｅｃｕｌｏｓｉｓ）、精神神経内分泌病（Ｐｓｙｃｈｏ−Ｎｅｕｒｏ−Ｅｎｄｏｃｒｉｎａｌ ｄｉｓｏｒｄｅｒ）、等）を患っている患者、８）最近６カ月に心房細動、急性冠症候群、心筋梗塞、脳卒中または重篤な不整脈の既往歴がある患者、９）心臓麻痺の臨床的証拠のある症状を示す患者、１０）重篤な肝障害を併発している患者（アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）および／またはアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、総ビリルビンと定義される、１１）アルカリ性ホスファターゼ（ＡＬＰ）正常値上限の２．５倍超）または腎障害（血清クレアチニン＞１．２ｍｇ／ｄＬと定義される）、重篤な肺機能不全（コントロール不良の気管支喘息および／または慢性閉塞性肺疾患［ＣＯＰＤ］）、またはその他の研究を台無しにしかねない何らかの状態、１２）ＨＩＶおよびその他のウィルス感染の病歴、１３）アルコール依存症および／または薬物乱用者、１４）肥満の外科的治療歴、１５）ハーブ抽出物または栄養補助食品に対する過敏性の病歴、１６）妊娠／授乳中の女性、１７）過去６カ月以内に何らかの他の臨床試験に関与した患者、１８）主任研究者が研究を危うくしかねないと考える何らかの他の状態。
ランダム化、処置割当および研究手順
これはパイロット研究であったので、正式のサンプルサイズは計算されなかった。各参加者は６桁のランダム化コードが割り当てられ、臨床試験用製品は独立した統計学者により作成されたランダム化コードリストに従って施設要員によって投薬された。臨床試験用製品に対する二重盲検は投薬キットの独立盲検（ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｂｌｉｎｄｉｎｇ）により行われ、従って臨床施設職員および参加者はいずれも研究期間の間中受けた処置について知らないままであった。被検者の人口統計は全ての登録された被検者に対してスクリーニング来院時に記録した（表１１）。過去３カ月に他の処置を何も受けていない肥満した患者をこの研究に登録した。全ての登録された被検者は研究の事象スケジュール（表１４）を順守するように勧告された。登録された被検者は１：１の割合で活性群およびプラセボ群に割り振られた。被検者はこの製品を通院ベースで使用し、毎日活性またはプラセボの２つのゼラチンカプセル（各々重量５６０ｍｇ）を、食事の少なくとも３０分前に、好ましくは朝晩、食事成分として９０日の期間自分で服用するように求められ、臨床評価のために１５日目、３０日目、６０日目および９０日目に戻る予定にされた。電話による追跡調査は最後の予定された来院から少なくとも１５日後に被検者の健康状態について行われた。日々の食生活および身体活動は来院１に患者に提供された患者のスケジュール帳に記録された。これは次の来院時に研究者によってチェックされ検証された。研究補遺の順守は各来院時戻った補遺の検査によって確かめた。この臨床研究の間のデータ収集および統計解析はそれぞれ別の機能性群および認証された独立した統計学者によって行われた。試験開始後は承認されたプロトコルに変化または修正がなされたことはなく、試験期間中は暫定的な分析は行われなかった。安全性の結果は、１）身体検査およびバイタル、２）ある場合は、報告された有害事象（ＡＥ）の評価、２）ある場合は、有害事象によって測定された。有効性の結果は、１）体重、ＢＭＩ、腹囲、ヒップ周りおよびウエストヒップ比によって測定された。
統計解析
バージョン９．２ソフトウェアの統計解析ソフトウェア（ＳＡＳ）をヒトの臨床研究のデータ分析のために使用した。適当なデータセット可変量が活性およびプラセボ受容群間で最良の可能な統計的結論に達するように対応のあるｔ検定、共分散分析（ＡＮＣＯＶＡ）およびウィルコクソン符号順位和検定を使用した。「ｐ」値＜０．０５は統計的に有意と考えられた。ベースライン記述子は連続可変量に対する平均および標準偏差として、ならびにカテゴリー変数に対する頻度およびパーセント割合として要約した。被検者の有効性評価のために方法を処理する目的であるＬａｓｔ Ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎ Ｃａｒｒｙ Ｆｏｒｗａｒｄ（ＬＯＣＦ）に従った。
結果
登録された被検者のいずれも、スクリーニングのための来院時または研究のための来院中異常な病歴も異常な身体所見も観察されなかった。研究のための来院時のいずれも、処置群間で、バイタルの統計的に有意な変化は観察されなかった。３０人のランダム化された患者のうち、２６人が研究を完結した。全ての研究のための来院を完結した男性対女性の被検者の比は７：１９であり、３人の女性が様々な時点で研究から脱落した。ここで、研究終了時の分析で、４人の脱落した被検者のうちの３人はプラセボを受けていたことが明らかになった。研究を完結した２６人の患者の処置順守のパーセント割合は良好であった。最小は８７．２２％で、最大は１９人の研究対象による１００％の処置順守であった。試験は時期尚早に終了されることはなく、３０の目標のサンプルサイズに到達した後に停止した。最終の来院時までのベースラインから、また処置群間で、バイタルの統計的に有意な変化も（表１５）、臨床的に有意な異常な実験室値も（表１６および１７）観察されなかった。全研究期間中単一のＡＥが報告され、研究者の見解によると、この事象は研究製品と「関係がなかった」。この研究では重篤な有害事象も有意な有害事象も認められなかった。これらの基本的なパラメーターの有効性分析によって、質量、ＢＭＩおよび腹囲は研究終了までに２つの処置群間で統計的有意性に到達したが、他の２つのパラメーター（ヒップ周りおよびウエストヒップ比）は２つの処置群間でいかなる有意性も示さなかったことが明らかになる。総コレステロール、トリグリセリド、低密度リポタンパク質、高密度リポタンパク質および超低密度リポタンパク質のようないくつかの生化学的な評価（表１８）は、２つの処置群の患者間で比較したとき統計的に有意である（ｐ＜０．０１）ことが判明した（表１８）。研究期間の前後の被検者の写真は製品の有効性を明瞭に示している。
別の最も好ましい実施形態において、本発明はヒトにおいて肥満を低減する方法に関し、前記方法は、総スチルベンを５％含有するように規格化されたハマスゲ根茎抽出物の酢酸エチル画分を含む組成物を前記ヒトに経口で一日二回投与して、体重、肥満度指数および腹囲の低下の効果を達成するステップを含む。より具体的な実施形態において、総スチルベンを５％含有するように規格化されたハマスゲ根茎抽出物の酢酸エチル画分を含む組成物はピセアタンノールおよびその二量体から本質的になる。さらにより具体的な実施形態において、総スチルベンを５％含有するように規格化されたハマスゲ根茎抽出物の酢酸エチル画分を含む組成物はピセアタンノール、スキルプシンＡおよびスキルプシンＢから本質的になる。
さらに別の最も好ましい実施形態において、本発明はヒトにおいて高コレステロール血症を治療する方法に関し、前記方法は、総スチルベンを５％含有するように規格化されたハマスゲ根茎抽出物の酢酸エチル画分を含む組成物を前記ヒトに経口で一日二回投与して、（ａ）総コレステロール、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）、超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）および血清トリグリセリドの全身性レベルの低下ならびに（ｂ）高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）の全身性レベルの増進の効果を達成するステップを含む。より具体的な実施形態において、総スチルベンを５％含有するように規格化されたハマスゲ根茎抽出物の酢酸エチル画分を含む組成物はピセアタンノールおよびその二量体から本質的になる。さらにより具体的な実施形態において、総スチルベンを５％含有するように規格化されたハマスゲ根茎抽出物の酢酸エチル画分を含む組成物はピセアタンノール、スキルプシンＡおよびスキルプシンＢから本質的になる。
追加の具体的な実施形態として、本発明はヒトにおいて肥満を低減する方法に関し、前記方法は、３％より多い総スチルベンを含有するように規格化されたハマスゲ根茎抽出物の酢酸エチル画分を含む組成物を前記ヒトに経口で一日二回投与して、体重、肥満度指数および腹囲の低下の効果を達成するステップを含む。より具体的な実施形態において、３％より多い総スチルベンを含有するように規格化されたハマスゲ根茎抽出物の酢酸エチル画分を含む組成物はピセアタンノールおよびその二量体から本質的になる。さらにより具体的な実施形態において、３％より多い総スチルベンを含有するように規格化されたハマスゲ根茎抽出物の酢酸エチル画分を含む組成物はピセアタンノール、スキルプシンＡおよびスキルプシンＢから本質的になる。
さらなる追加の例示的な例として、本発明はまたヒトにおいて高コレステロール血症を治療する方法にも関し、前記方法は、３％より多い総スチルベンを含有するように規格化されたハマスゲ根茎抽出物の酢酸エチル画分を含む組成物を前記ヒトに経口で一日二回投与して、（ａ）総コレステロール、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）、超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）および血清トリグリセリドの全身性レベルの低下ならびに（ｂ）高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）の全身性レベルの増進の効果を達成するステップを含む。より具体的な実施形態において、３％より多い総スチルベンを含有するように規格化されたハマスゲ根茎抽出物の酢酸エチル画分を含む組成物はピセアタンノールおよびその二量体から本質的になる。さらにより具体的な実施形態において、３％より多い総スチルベンを含有するように規格化されたハマスゲ根茎抽出物の酢酸エチル画分を含む組成物はピセアタンノール、スキルプシンＡおよびスキルプシンＢから本質的になる。
好ましい実施形態に関連して本発明を説明してきたが、当業者には明白に理解されるように、本発明はそれに限定されない。むしろ、本発明の範囲は添付されている特許請求の範囲のみに関連して解釈されるべきである。
本発明のまた別の態様は、以下のとおりであってもよい。
〔１〕ヒトにおいて肥満を低減する方法であって、総スチルベンを５％含有するように規格化されたハマスゲ根茎抽出物の酢酸エチル画分を含む組成物を前記ヒトに経口で一日二回投与して、体重、肥満度指数および腹囲の低下の効果を達成するステップを含む、方法。
〔２〕ヒトにおいて高コレステロール血症を治療する方法であって、総スチルベンを５％含有するように規格化されたハマスゲ根茎抽出物の酢酸エチル画分を含む組成物を前記ヒトに経口で一日二回投与して、（ａ）総コレステロール、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）、超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）および血清トリグリセリドの全身性レベルの低下ならびに（ｂ）高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）の全身性レベルの増進の効果を達成するステップを含む、方法。
〔３〕総スチルベンを５％含有するように規格化されたハマスゲ根茎抽出物の酢酸エチル画分を含む組成物がピセアタンノールおよびその二量体から本質的になる、前記〔１〕および〔２〕に記載の方法。
〔４〕総スチルベンを５％含有するように規格化されたハマスゲ根茎抽出物の酢酸エチル画分を含む組成物が、ピセアタンノール、スキルプシンＢおよびスキルプシンＡの組合せから本質的になる、前記〔３〕に記載の方法。
〔５〕ヒトにおいて肥満を低減する方法であって、３％より多い総スチルベンを含有するように規格化されたハマスゲ根茎抽出物の酢酸エチル画分を含む組成物を前記ヒトに経口で一日二回投与して、体重、肥満度指数および腹囲の低下の効果を達成するステップを含む、方法。
〔６〕ヒトにおいて高コレステロール血症を治療する方法であって、３％より多い総スチルベンを含有するように規格化されたハマスゲ根茎抽出物の酢酸エチル画分を含む組成物を前記ヒトに経口で一日二回投与して、（ａ）総コレステロール、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）、超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）および血清トリグリセリドの全身性レベルの低下ならびに（ｂ）高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）の全身性レベルの増進の効果を達成するステップを含む、方法。
〔７〕３％より多い総スチルベンを含有するように規格化されたハマスゲ根茎抽出物の酢酸エチル画分を含む組成物がピセアタンノールおよびその二量体から本質的になる、前記〔５〕および〔６〕に記載の方法。
〔８〕３％より多い総スチルベンを含有するように規格化されたハマスゲ根茎抽出物の酢酸エチル画分を含む組成物が、ピセアタンノール、スキルプシンＢおよびスキルプシンＡの組合せから本質的になる、前記〔７〕に記載の方法。

Claims (2)

  1. 総スチルベンを５％含有するハマスゲ根茎抽出物の酢酸エチル画分を含む、ヒトにおいて高コレステロール血症を治療するための医薬組成物であって、前記医薬組成物が、前記ヒトに経口で一日二回投与され、（ａ）総コレステロール、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）、超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）および血清トリグリセリドの全身性レベルの低下ならびに（ｂ）高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）の全身性レベルの増進の効果が達成され、
    前記酢酸エチル画分が、以下のステップ、
    １．ハマスゲの根茎を乾燥し、これを粉砕して粗い粉末を形成するステップ、
    ２．ステップ１の粉末を３容量のヘキサンで抽出し、続いて加熱還流を３時間行い、ろ過してヘキサン可溶性画分および使用済材料を得るステップ、
    ３．ステップ２の使用済材料を３容量のメタノールで抽出し、続いて３時間加熱還流し、ろ過してメタノール可溶性活性画分および使用済材料を得るステップ、及び
    ４．ステップ３のメタノール可溶性活性画分を水性メタノールに可溶化し、クロロホルム（ＣＨＣｌ 3 ）、酢酸エチル（ＥｔＯＡｃ）およびメタノールで連続して分別して、酢酸エチル層として前記酢酸エチル画分を得るステップ、
    を含むプロセスによって得られる、医薬組成物。
  2. ３％より多い総スチルベンを含有するハマスゲ根茎抽出物の酢酸エチル画分を含む、ヒトにおいて高コレステロール血症を治療するための医薬組成物であって、前記医薬組成物が、前記ヒトに経口で一日二回投与され、（ａ）総コレステロール、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）、超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）および血清トリグリセリドの全身性レベルの低下ならびに（ｂ）高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）の全身性レベルの増進の効果が達成され、
    前記酢酸エチル画分が、以下のステップ、
    １．ハマスゲの根茎を乾燥し、これを粉砕して粗い粉末を形成するステップ、
    ２．ステップ１の粉末を３容量のヘキサンで抽出し、続いて加熱還流を３時間行い、ろ過してヘキサン可溶性画分および使用済材料を得るステップ、
    ３．ステップ２の使用済材料を３容量のメタノールで抽出し、続いて３時間加熱還流し、ろ過してメタノール可溶性活性画分および使用済材料を得るステップ、及び
    ４．ステップ３のメタノール可溶性活性画分を水性メタノールに可溶化し、クロロホルム（ＣＨＣｌ 3 ）、酢酸エチル（ＥｔＯＡｃ）およびメタノールで連続して分別して、酢酸エチル層として前記酢酸エチル画分を得るステップ、
    を含むプロセスによって得られる、医薬組成物。
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