ES2835306T3 - Composición que comprende escirpusina a y escirpusina b y potencial contra la obesidad de la misma - Google Patents
Composición que comprende escirpusina a y escirpusina b y potencial contra la obesidad de la misma Download PDFInfo
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Abstract
Composición que comprende una fracción de acetato de etilo del extracto de rizomas de Cyperus rotundus estandarizado para que contenga 5 % de los estilbenos totales para su uso en un procedimiento de reducción de la obesidad en seres humanos, comprendiendo dicho procedimiento la epata de administrar a dichos seres humanos por vía oral dos veces al día la composición para lograr los efectos de reducción del peso corporal, índice de masa corporal y circunferencia de la cintura.
Description
DESCRIPCIÓN
Composición que comprende escirpusina a y escirpusina b y potencial contra la obesidad de la misma Referencia cruzada a las solicitudes relacionadas
La presente invención es una solicitud PCT de la solicitud de EE.UU 14705111 presentada el 6 de mayo de 2015 que es una solicitud de patente de continuación en parte de E13944634 presentada el 17 de julio de 2013 que a su vez es una presentación no provisional de solicitud de patente provisional 61672849 presentada el 18 de julio de 2012.
Antecedentes de la invención
Campo de la invención
La invención en general se refiere a composiciones para la inhibición de la adipogénesis. Más específicamente, la presente invención divulga una composición que comprende la escirpusina A y la escirpusina B y el potencial contra la adipogénesis/contra la obesidad de las mismas.
Descripción de la técnica anterior
La escirpusina A como dímero de hidroxiestilbeno de la uva de vinificación de Xinjiang ha sido previamente reportada por Kong Q y otros en J Sci Food Agric. 15 de Abril de 2010; 90(5):823-8. La escirpusina A se ha destacado por su actividad inhibidora de la agregación del péptido beta-amiloide (Riviere C y otros (2010)), inhibición del oxígeno singlete y actividad protectora del ADN (Kong Q y otros (2010)) y actividad inhibidora de la betasecretasa (Jeon SY y otros (2007)).
La escirpusina B es un dímero vasodilatador de piceatanol bien establecido y se obtiene en grandes cantidades del maracuyá (Sano S y otros, "Identification of the strong vaso- relaxing substance scirpusin B, a dimer of piceatannol, from passion fruit (Passiflora edulis) seeds, J Agric Food Chern. 8 de Junio de 2011; 59 (11): 6209-13La escirpusina B también se destaca por su leve actividad GSH (Maruki-Uchida H y otros (2013)) y propiedades contra el VIH (Yang GX y otros (2005)).
Se ha informado previamente que el extracto en hexano de extractos de rizoma deCyperus rotundus exhibe propiedades contra la obesidad. (La administración de extracto de rizomas de Cyperus rotundus previene el aumento de peso en ratas obesas Zucker. Lemaure y otros 2007. Phytother Res. 21: 724 -730.). La fracción en hexano se ha caracterizado por contener a- Cipernona, Rotundeno, p-selineno, Calameneno, Cipereno, d-cadineno, Ciperotundona, Cadaleno, Patchoulenona, Nootcateno, Sugeonol, g-calacoreno, cobusona, Ciperol, Isocobusona y Epi-a-selinenoYadav y otros International Journal of Pharmaceutical and Clinical Research 2010; 2 (1): 20-22). Pero la presente invención divulga la actividad contra la obesidad en la fracción de acetato de etilo de Cyperus rotundus. Esta fracción de acetato de etilo no contiene ninguno de los muchos constituyentes de la fracción en hexano. La presente fracción de acetato de etilo contiene compuestos derivados de estilbenoides.
El documento de EE.UU 2014/0024706 A1 divulga una composición que comprende escirpusina A y escirpusina B y su potencial contra la obesidad. El documento también divulga procedimientos para inhibir la adipogénesis usando una composición que comprende escirpusina A y escirpusina B y procedimientos para manejar terapéuticamente la obesidad en mamíferos usando una composición que comprende escirpusina A y escirpusina B. El documento divulga además un procedimiento para obtener composiciones que comprenden A. escirpusina A y escirpusina B y B. piceatanol y sus dímeros escirpusina A y escirpusina B mediante el fraccionamiento guiado por bioactividad de los rizomas de Cyperus rotundus. En el procedimiento el polvo deCyperus rotundus se extrajo con hexano para obtener una fracción soluble en hexano y material gastado. El material gastado se extrajo adicionalmente con metanol para obtener una fracción activa soluble en metanol y material gastado. La fracción soluble en metanol se solubilizó en metanol acuoso y se repartió sucesivamente con cloroformo (CHCh), acetato de etilo (EtOAc) y metanol para obtener la capa en cloroformo, la capa en acetato de etilo y la capa acuosa en metanol respectivamente. La capa en cloroformo, la capa en acetato de etilo y la capa acuosa en metanol se sometieron a un fraccionamiento guiado por bioactividad adicional, en el que el parámetro de bioactividad fue la capacidad de la capa en cloroformo, la capa en acetato de etilo y la capa acuosa en metanol para inhibir la adipogénesis en adipocitos de ratón 3T3-L1 (adipocitos de mamíferos).
Por tanto, el objetivo principal de la presente memoria descriptiva es divulgar una composición alternativa que comprende escirpusina A y escirpusina B y su potencial contra la adipogénesis/contra la obesidad.
Es un objetivo de la presente invención divulgar una composición alternativa que comprende escirpusina A y escirpusina B para su uso en un procedimiento de reducción de la obesidad en mamíferos.
Otro objetivo de la presente invención es divulgar una composición alternativa que comprende escirpusina A y escirpusina B para un uso alternativo.
La presente invención cumple los objetivos mencionados anteriormente y proporciona otras ventajas relacionadas. Sumario de la invención
La presente invención se define en las reivindicaciones anexas. La memoria descriptiva divulga composiciones que comprenden escirpusina A y escirpusina B y su potencial contra la adipogénesis/contra la obesidad. La memoria descriptiva también divulga un procedimiento para manejar la obesidad en mamíferos usando una composición que comprende escirpusina A y escirpusina B. La presente memoria descriptiva divulga además un procedimiento para obtener composiciones que comprenden A. escirpusina A y escirpusina B y B. piceatanol y sus dímeros escirpusina A y escirpusina. B mediante el fraccionamiento guiado por bioactividad de los rizomas de Cyperus rotundus. Otras características y ventajas de la presente memoria descriptiva resultarán evidentes a partir de la siguiente descripción más detallada, tomada junto con las imágenes adjuntas, que ilustran, a manera de ejemplo, el principio de la invención.
Descripción detallada de los dibujos
La Figura 1 muestra un diagrama de flujo que divulga las etapas para extraer principios activos de los rizomas de Cyperus rotundus.
La Figura 2, 2a, 2b y la Figura 3, 3a, 3b y 3c muestran el análisis por LC-MS de las subfracciones III y IV, respectivamente, de la capa en acetato de etilo enriquecida naturalmente con dímeros de piceatanol, escirpusina A y escirpusina B.
La Figura 4 y 5 muestran los datos del HRMS indicando que los valores de [M+H] obtenidos en el mismo se corresponden muy bien con la estructura del dímero y los datos reportados (Sano y otros, 2011) sobre el mismo. La Figura 6 muestra la reducción gráfica del peso corporal en seres humanos obesos a los que se les administró la fracción de acetato de etilo del extracto de rizomas de Cyperus rotundusestandarizados al 5 % de estilbenos totales. La Figura 6a muestra la reducción gráfica del índice de masa corporal en seres humanos obesos a los que se les administró la fracción de acetato de etilo del extracto de rizomas de Cyperus rotundus estandarizados al 5 % del total de estilbenos. La Figura 6b muestra la reducción gráfica de la circunferencia de la cintura en seres humanos obesos a los que se les administró la fracción de acetato de etilo del extracto de rizomas de Cyperus rotundus estandarizados al 5 % de los estilbenos totales.
La Figura 7 muestra las fotografías de la reducción de la circunferencia de la cintura en seres humanos obesos (hombres) a los que se les administró la fracción de acetato de etilo del extracto de rizomas deCyperus rotundus estandarizados al 5 % de los estilbenos totales.
Las Figuras 8a, 8b y 8c muestran las fotografías de la reducción de la circunferencia de la cintura en seres humanos obesos (mujeres) a los que se les administró la fracción de acetato de etilo del extracto de rizomas de Cyperus rotundus estandarizados al 5 % de los estilbenos totales.
Las Figuras 9a, 9b, 9c, 9d y 9e muestran los cambios en los lípidos sistémicos en seres humanos obesos a los que se les administró la fracción de acetato de etilo del extracto de rizomas de Cyperus rotundus estandarizados al 5 % de los estilbenos totales.
Descripción de los aspectos más preferidos
En el aspecto más preferido, la presente memoria descriptiva se refiere a una composición anti-adipogénica/contra la obesidad que comprende escirpusina A y escirpusina B representadas por STR # 1 y STR # 2 respectivamente. En otro aspecto más preferido, la presente memoria descriptiva se refiere a un procedimiento para inhibir la adipogénesis en células de mamíferos, comprendiendo dicho procedimiento la etapa de poner en contacto células adipogénicas de mamíferos con una composición que comprende escirpusina A y escirpusina B representadas por STR # 1 y STR # 2 respectivamente.
En otro aspecto más preferido, la presente memoria descriptiva se refiere al procedimiento de inhibir terapéuticamente la obesidad provocada por adipogénesis en mamíferos, comprendiendo dicho procedimiento la etapa de suplementación dietética de una composición que comprende escirpusina A y escirpusina B representada por STR # 1 y STR # 2 respectivamente para un mamífero que necesita dicha inhibición terapéutica.
En otro aspecto más preferido, la presente memoria descriptiva se refiere al uso de una composición que comprende escirpusina A y escirpusina B representada por STR # 1 y STR # 2 para inhibir la adipogénesis en células de mamífero.
En un aspecto alternativo, la presente memoria descriptiva también se refiere a un procedimiento para el fraccionamiento guiado por bioactividad de los rizomas de Cyperus rotundus para obtener composiciones antiadipogénicas/contra la obesidad que comprenden A. escirpusina A y escirpusina B representadas por STR # 1 y STR # 2 y B. piceatanol y sus dímeros escirpusina A y escirpusina B representadas por STR # 1 y STR # 2 respectivamente, comprendiendo dicho procedimiento las etapas de:
1) Secar los rizomas de Cyperus rotundus y pulverizar los mismos para formar un polvo grueso;
2) Extraer el polvo del paso 1 con 3 volúmenes de hexano seguido de calentamiento, reflujo durante
3) 3 horas y filtrado para obtener la fracción soluble en hexano y el material gastado;
4) Extraer el material gastado del paso 2 con 3 volúmenes de metanol seguido de calentamiento, reflujo durante 3 horas y filtrado para obtener la fracción activa soluble en metanol y el material gastado;
5) Solubilizar la fracción activa soluble en metanol del paso 3 en metanol acuoso y particionar sucesivamente con cloroformo (CHCh), acetato de etilo (EtOAc) y metanol para obtener la capa en cloroformo, la capa en acetato de etilo y la capa acuosa en metanol respectivamente;
6) Someter la capa en cloroformo, la capa en acetato de etilo y la capa acuosa en metanol a un fraccionamiento guiado por bioactividad adicional, en el que el parámetro de bioactividad es la capacidad de la capa en cloroformo, la capa en acetato de etilo y la capa acuosa en metanol para inhibir la adipogénesis en adipocitos de ratón 3T3-L1 (adipocitos de mamíferos);
7) Calcular los valores de IC50 (Hg/ml) para la inhibición de la adipogénesis ejemplificados por la capa en cloroformo, la capa en acetato de etilo y la capa acuosa en metanol (0, 9,39 y 66,42 respectivamente);
8) Fraccionar la capa en acetato de etilo usando el fraccionamiento en columna para identificar el biomarcador de bioactividad (inhibición de la adipogénesis), dicho fraccionamiento incluye la etapa en donde las fracciones se eluyen con polaridad creciente de metanol: cloroformo para producir subfracciones de la capa en acetato de etilo (fracción);
9) Someter las subfracciones del paso 7 para análisis de bioactividad (contra la adipogénesis);
10) Identificar las subfracciones más bioactivas del paso 8 y someter las mismas a análisis por LC-MS para identificar los principios bioactivos de escirpusina A y escirpusina B; y
11) Someter las subfracciones del paso 7 a través de HPLC preparativa para obtener el dímero purificado y someter las mismas a espectroscopía de masas de alta resolución (HRMS), cromatografía líquida-espectrometría de masas (LC-MS/MS) y espectroscopia de resonancia magnética nuclear (RMN) para confirmar la masa y las estructuras de los principios bioactivos de la escirpusina.
Los presentes inventores investigaron el extracto en hexano referido en la epata 2 anterior y encontraron que no estaban presentes la escirpusina A y la escirpusina B. Por tanto, el extracto en hexano en la epata 1 es constitucionalmente diferente de la fracción de acetato de etilo detallada en la epata 7. Así, el extracto de acetato de etilo de Cyperus rotundus es bastante diferente del extracto de hexano que fue objetivo de investigación en Lemaure y otros 2007. Phytother Res. 21: 724-730.
Las siguientes secciones de esta memoria descriptiva consisten en ejemplos ilustrativos de los aspectos más preferidos de la presente memoria descriptiva.
Ejemplo 1: Fraccionamiento guiado por bioactividad de los rizomas de Cyperus rotundus (Figura 1) Procedimiento:
Rizomas secos de Cyperus rotundus se pulverizaron para formar un polvo grueso. Después, el polvo pulverizado se extrajo con 3 volúmenes de hexano seguido de calentamiento, reflujo durante 3 horas y filtrado para obtener la fracción soluble en hexano y el material gastado. El material gastado se extrae adicionalmente con 3 volúmenes de
metanol seguido de calentamiento, reflujo durante 3 horas y filtrado para obtener la fracción activa soluble en metanol y el material gastado. La fracción soluble en metanol se solubiliza en metanol acuoso y se particiona sucesivamente con cloroformo (CHCh), acetato de etilo (EtOAc) y metanol para obtener la capa en cloroformo, la capa en acetato de etilo y la capa acuosa en metanol respectivamente. La capa en cloroformo, la capa en acetato de etilo y la capa acuosa en metanol se someten a un fraccionamiento guiado por bioactividad adicional, en el que el parámetro de bioactividad fue la capacidad de la capa en cloroformo, la capa en acetato de etilo y la capa en metanol acuoso para inhibir la adipogénesis en adipocitos de ratón 3T3-L1 (adipocitos de mamíferos). Los pasos de la técnica de tinción Oil Red O adaptada de Salazar Olivo y otros (1995), Wu Z y otros (1998), Fu M y otros (2005) para estudiar el grado de inhibición de la adipogénesis se explica en el Ejemplo 1A a continuación en la presente memoria. Los resultados se mencionan en la Tabla A.
Ejemplo 1A: La diferenciación terminal de los adipocitos se acompaña de la acumulación de grandes cantidades de lípidos en grandes vesículas citoplasmáticas. Un ensayo común para medir la diferenciación de adipocitos en cultivos celulares es con el tinte Oil Red-O (ORO). El ORO es un tinte rojo brillante soluble en lípidos que es un indicador confiable de la diferenciación de adipocitos.
Principio: El Oil Red O (Solvente Rojo 27, Sudan Rojo 5B, CI 26125 y C26H24N40) es un tinte diazo lisocromo (tinte soluble en grasa) que se usa para teñir triglicéridos y lípidos neutros en secciones congeladas y algunas lipoproteínas en secciones de parafina. Tiene la apariencia de un polvo rojo con la máxima absorción a 518(359) nm. El Oil Red O es uno de los tintes usados para la tinción de Sudán. Tintes similares incluyen Sudan III, Sudan IV y Sudan Black B. La tinción debe realizarse en muestras frescas, ya que la fijación con alcohol elimina los lípidos. El Oil Red O reemplazó en gran medida a Sudan III y Sudan IV, ya que proporciona un color rojo mucho más profundo y, por lo tanto, las manchas son mucho más fáciles de ver. El Oil red O es un tinte soluble en aceite. Los colorantes solubles en aceite exhiben una mayor solubilidad del colorante en sustancias lipoides en los tejidos/células, que en los solventes de colorantes hidroalcohólicos habituales. Por lo tanto, manchará profundamente las células.
Se siembran células 3T3-L1, aproximadamente 60 X 104 células durante 48-72 horas para obtener una confluencia de 70-80 %. Después de 48 h, se añaden 200 pl de AIM (medio de inducción de adipogénesis) recién preparado. 72 horas después, se añaden a los pocillos 200 pl de APM (medio de progresión de la adipogénesis) con los compuestos de prueba en concentraciones diferentes. Las células se incuban durante 48 horas en una atmósfera humidificada (37 °C) de CO2 al 5 % y 95 % de aire. El sobrenadante se recoge y se almacena para la estimación de leptina, adiponectina, IL-6 y TNF-alfa. Las células se fijan añadiendo 100 pl de formalina al 10 % y se realiza la tinción ORO. La DO se lee a 492 nm en un lector de microplacas.
Los resultados se expresan como valores IC50 mediante el uso del software Graph Pad Prism. El porcentaje de inhibición de la adipogénesis se calcula como sigue.
% de Inhibición = C-T/T * 100
Donde C es la absorbancia del Oil red O en células diferenciadas/indiferenciadas
T es la absorbancia de Oil Red O en células diferenciadas/indiferenciadas tratadas con muestra.
Tabla A
La capa en acetato de etilo ilustró la mejor bioactividad en términos de inhibición de la adipogénesis con un valor de IC50 (pg/ml) de 9,39. A continuación, esta fracción se sometió a fraccionamiento en columna para identificar el biomarcador de bioactividad (inhibición de la adipogénesis). El fraccionamiento en columna implicó la etapa de eluir subfracciones de la capa en acetato de etilo con polaridad creciente de la mezcla de metanol: cloroformo. Las subfracciones de la capa en acetato de etilo se etiquetan como I, II, III y IV y se someten a evaluación de bioactividad (contra la adipogénesis). Las etapas esenciales de la evaluación de la actividad anti-adipogénica implican el procedimiento descrito en la presente memoria antes del Ejemplo 1A. Los resultados se resumen en la presente memoria a continuación en la Tabla B.
Tabla B
Las subfracciones III y IV se sometieron luego a LC-MS con ambas fracciones enriquecidas en dímeros de piceatanol escirpusina A y escirpusina B (La Figuras 2 y 3). El análisis por LC-MS/MS se realizó en un espectrómetro Thermo Electronics Finnigan LCQ Advantage MAX usando una columna RP C18 (250 x 4,6 mm, tamaño de partícula de 5 |j). El sistema constaba de un detector PDA de topógrafo Thermo-Finnigan, una bomba LC y un muestreador automático. La fase móvil incluyó una ejecución en gradiente durante 35 minutos con el solvente (A) ácido acético al 0,1 % en agua y el solvente (B) acetonitrilo. La concentración del solvente B aumentó de 5 % durante 0- 5 minutos, de 5 - 60 % durante 5-20 minutos, de 60 -100 % durante 20-25 minutos, de 100 -5 % durante 25-27 minutos y se mantuvo constante a 5 % durante 27-35 minutos. La fase estacionaria incluyó Thermo BDS hipersil, columna C18 (Dimensión- 250 mm x 4,6 mm); Tasa de flujo: 1 ml/min; Rango de detección: 260 nm.
Parámetros de ionización: Modo positivo APCI, voltaje de fuente - 4,50 kV, temperatura capilar - 225 grados, voltaje capilar - 43.00 V.
Interpretación de datos: Se informa que la masa de escirpusina A es 470,13. La masa [M+H] observada a 18,77 min en modo de ionización positiva usando el protocolo anterior es 471,08. Se informa que la masa de escirpusina B es 486. La masa [M+H] observada a los 17,94 min en modo de ionización positiva es 487,05.
El primer nivel de confirmación de la presencia de dímeros de piceatanol en el extracto de Cyperus fue en base a esta información preliminar sobre la masa. La escirpusina A se confirmó directamente mediante comparación directa con una muestra auténtica de escirpusina A.
Las subfracciones se sometieron luego a HPLC preparativa para obtener el dímero escirpusina B purificado que luego se estudió usando las herramientas analíticas de espectroscopia de masas de alta resolución (HRMS), cromatografía liquida-espectrometría de masas (LC-MS/MS) y espectroscopia de resonancia magnética nuclear (NMR) para ser confirmados como escirpusina B. Los datos del HRMs indicaron [M+H] = 487,138 que coincidía muy bien con la estructura del dímero y reportó datos (Sano y otros, 2011) sobre el mismo (La Figuras 4 y 5 ) y la estructura de la escirpusina B también se confirmó usando una sonda criogénica RMN (La Figura 6). El compuesto se identificó después de compararlo con los datos disponibles en la literatura (Sano y otros, 2011). Datos de RMN (CD30D): 8: 56,73; 93,50; 95,39; 100,79; 102,93; 105,87 X 2; 112,21; 112,63; 114,83; 114,91; 117,03; 118,42; 118,61; 122,17; 129,46; 129,53; 133,53; 135,60; 144,90; 145,01; 145,09; 145,21; 146,27; 158,36; 158,56 x 2; 161,46. El espectro de RMN APT (Prueba de Protones Adjunta) obtenido a 500 MHz confirmó aún más la estructura de escirpusina B. También se aisló una muestra auténtica de escirpusina B a partir de frutos de la pasión aislados por Sano y otros, 2011 y se comparó directamente con la escirpusina B aislada por nosotros de Cyperus rotundus como se describió anteriormente y la identidad de los tiempos de retención de HPLC, los datos de espectrometría de masas y los datos de RMN corroboraron la presencia de escirpusina B en Cyperus rotundus de la forma más convincente.
Ejemplo 2
Evaluación de la eficacia del efecto contra la obesidad de extractos de CYPRO-AF (fracción activa de acetato de etilo) y CYPRO-D1 (sub fracción de acetato de etilo enriquecida naturalmente en dímeros de piceatanol, escirpusina A y escirpusina B) en ratones.
Objetivo de la prueba: El objetivo del estudio fue evaluar la eficacia de los extractos Cypro-AF y Cypro-D1 para el efecto contra la obesidad en ratones C57.
Detalles del sistema de prueba:
Detalles del rendimiento de la prueba
Mantenimiento
Agolpamiento: El agrupamiento de los animales se realizó el último día de aclimatación mediante el procedimiento de estratificación y aleatorización del peso corporal. El agrupamiento de los animales se realizó de manera que la variación del peso corporal de los animales usados no supere ± 20 % del peso corporal medio de cada grupo.
Diseño del Estudio: Los animales se dividieron en 6 grupos, a saber, los grupos 1, 2, 3, 4, 5 y 6 que consiste en 10 animales (5 machos y 5 hembras) cada uno. Los detalles del grupo, las dosis y el número/sexo de los animales por grupo se presentan en la siguiente tabla:
Detalles de formulación y administración
Los elementos de prueba Cypro-AF y Cypro-DI se disolvieron en agua destilada para formular diferentes dosis. Los elementos de prueba recién formulados se administraron por vía oral mediante sonda. El volumen de administración por animal se mantuvo en 10 ml/kg de peso corporal para todos los animales durante el período de estudio. La siguiente tabla proporcionó detalles de la formulación de prueba.
Inducción de la obesidad: Los animales del grupo de control G1 se alimentaron con alimento de dieta de control normal D12450B que contenía 10 kcal% de grasa y los animales del grupo G2 a G6 se alimentaron con alimento de dieta alta en grasas D12492 que contenía 60 kcal% de grasa durante la inducción de la obesidad y durante el estudio principal.
Estudio principal:
El estudio principal se inició después de la inducción de la obesidad. Las 3 dosis de Cypro-AF y 1 dosis de Cypro-D1 se administraron a los animales desde el día 28 diariamente de forma consecutiva durante un período de 27 días. La alimentación de las dietas continuadas en el estudio principal se realizó en inducción de obesidad. Los animales del grupo de control G1 y el grupo de control G2 con dieta alta en grasas se administraron con agua destilada, mientras que otros animales del grupo recibieron elementos de prueba desde el día 28 al día 54 del período de estudio. El volumen de dosis de administración se mantuvo de acuerdo con el peso corporal semanal de los animales individuales. La duración total del estudio fue de 61 días (7 días de período de aclimatación 27 días de inducción de la obesidad 27 días del estudio principal).
Observaciones
Las siguientes observaciones se hicieron durante el período de estudio.
Consumo de alimentos
Se registró el consumo de alimento animal individual. Se calculó y registró el consumo de alimento medio semanal. Peso corporal
Los pesos corporales de los animales individuales se registraron el día de la recepción el día 1 y luego semanalmente (± 1 día) durante el período de estudio.
Observaciones clínicas
Todos los animales se observaron clínicamente dos veces al día durante el período de estudio.
Patología clínica
Al finalizar el período de estudio, se recolectaron muestras de sangre de los animales en tubos que contenían anticoagulante de potasio etilen diamida tetraacético (K2-EDTA) para hematología y sin anticoagulante para química clínica. Las muestras de sangre recogidas en tubos sin anticoagulante se centrifugaron a 3000 rpm durante 10 minutos para obtener el suero. Se recogieron muestras de sangre de forma humanitaria del procedimiento de punción del plexo retroorbitario bajo anestesia suave con éter con la ayuda de un tubo capilar fino. Se analizaron los siguientes parámetros hematológicos y de química clínica.
Hematología
Los siguientes parámetros hematológicos se estimaron usando Sysmex, KX-21 (Transasia Bio-Medicals Ltd., India):
Química clínica
Los siguientes parámetros de química clínica se analizaron usando el "analizador Erba Mannheim Chern Touch" (Transasia Bio-Medicals Ltd., India) de muestras de suero.
Patología
Después de la finalización del período de estudio, el día 55, todos los animales se sacrificaron humanitariamente exponiéndolos a un exceso de dióxido de carbono en la cámara de gas y se sometieron a la siguiente necropsia macroscópica externa e interna.
Necropsia macroscópica
Los animales se sometieron a exámenes patológicos macroscópicos externos e internos.
Pesos de órganos
Los siguientes órganos de todos los animales se recortaron de cualquier tejido adherido, según correspondiera, y se pesaron en húmedo lo antes posible para evitar que se secaran: Cerebro, timo, hígado, glándulas suprarrenales, riñones (órganos emparejados), bazo, corazón, ovarios/testículos (órganos emparejados).
Peso de los depósitos de grasa
Se recogieron y pesaron los siguientes depósitos de grasa de todos los animales.
1. Grasa del epidídimo
2. Grasa marrón
3. Grasa de ovario
Análisis estadístico y preparación de informes
Los datos primarios obtenidos del presente estudio se sometieron a procesamiento estadístico informático. La impresión de la computadora de los datos (en forma de apéndice) se verificó con los datos originales sin procesar. Después de la verificación, los datos se sometieron a ANOVA unidireccional (análisis de varianza) con la prueba posterior de Dunnett para los datos sobre pesos corporales, parámetros hematológicos y de química clínica, pesos de órganos usando GraphPad Prism versión 5.01, GraphPad Software. Todos los análisis y comparaciones serán evaluados al 95 % de nivel de confianza (P<0,05), indicado por el designado por los superíndices de a donde G1 se compara con G3, G4, G5 y G6 y b donde G2 se compara con G3, G4, G5 y G6 a lo largo del informe como se indica a continuación: *: Estadísticamente significativo (P<0,05) cuando corresponda.
Los datos se sometieron a un análisis estadístico ANOVA unidireccional comparando lo siguiente:
Grupo G1 {grupo de control (con 10 kcal% de grasa)} al grupo G3 {CYPRO-Af 50 mg/kg Dieta alta en grasas (con 60 kcal% de grasa)}, grupo G4 {CYPRO-AF -100 mg/kg Dieta alta en grasas (con 60 kcal% de grasa)}, grupo G5 {CYPRO-AF 200 mg/kg Dieta alta en grasas (con 60 kcal% de grasa) y grupo G6 {CYPRO-D1 10 mg/kg Dieta alta en grasas (con 60 kcal% de grasa} como se representa a continuación:
G2 -Control de dieta alta en grasas (con 60 kcal% de grasa) al grupo G3 {CYPRO-AF 50 mg/kg Dieta alta en grasas (con 60 kcal% de grasa)}, grupo G4 {CYPRO-AF -100 mg/kg Dieta alta en grasas (con 60 kcal% de grasa)}, grupo G5 {CYPRO-AF 200 mg/kg Dieta alta en grasas (con 60 kcal% de grasa)} y grupo G6 {CYPRO-D1 10 mg/kg Dieta alta en grasas (con 60 kcal% de grasa)} como se muestra a continuación:
Resultados
Consumo de alimentos
El sumario del consumo de alimentos medio semanal de animales machos y hembras se presenta en la Tabla 1 y Tabla 2 respectivamente. No hubo diferencias estadísticamente significativas en el consumo de alimentos de los animales durante el período de estudio.
Tabla 1- Resumen del consumo de alimento medio semanal (g) de animales machos
Tabla -2: Sumario del consumo de alimento medio semanal (G) de animales hembras
Peso corporal
El sumario del peso corporal semanal de los animales machos y hembras se presenta en la Tabla 3 y la Tabla 4, respectivamente.
Tabla -3: Sumario del peso corporal (G) de los animales machos
Tabla- 4: Sumario del peso corporal (G) de los animales hembras
En los animales machos, hubo un aumento estadísticamente significativo en los valores de peso corporal semanal medio del día 21 en el grupo G3 {CYPRO-AF- 50 mg/kg Dieta alta en grasas (con 60 kcal% de grasa)}, grupo G4 {CYPRO-AF - 100 mg/kg Dieta alta en grasas (con 60 kcal% de grasa)}, grupo G5 {CYPRO-AF -200 mg/kg Dieta alta en grasas (con 60 kcal% de grasa)} y grupo G6 {CYPRO-D1 - 10 mg/kg Dieta alta en grasas (con 60 kcal% de grasa)} en comparación con el grupo G1 {Grupo de control (con 10 kcal% de grasa)}. Se consideró que estos cambios se debían a la diferencia en el contenido de grasa del alimento.
En los animales machos, hubo un aumento estadísticamente significativo en los valores de peso corporal semanal medio del día 28 en el grupo G4 {CYPRO-AF - 100 mg/kg Dieta alta en grasas (con 60 kcal% de grasa)}, grupo G5 {CYPRO-AF -200 mg/kg Dieta alta en grasas (con 60 kcal% de grasa)} y grupo G6 {CYPRO-D1 - 10 mg/kg Dieta
alta en grasas (con 60 kcal% de grasa)} en comparación con el grupo G1 {Grupo de control (con 10 kcal% de grasa)}. Se consideró que estos cambios se debían a la diferencia en el contenido de grasa del alimento.
En los animales machos, hubo una disminución en los valores de peso corporal semanal medio de los días 35, 42, 49 y 55 en el grupo G3 {CYPRO-AF- 50 mg/kg Dieta alta en grasas (con 60 kcal% de grasa)}, grupo G4 {CYPRO-AF- 100 mg/kg Dieta alta en grasas (con 60 kcal% de grasa)}, grupo G5 {CYPRO-AF-200 mg/kg Dieta alta en grasas (con 60 kcal% de grasa)} y grupo G6 {CYPRO -D1 - 10 mg/kg Dieta alta en grasas (con 60 kcal% de grasa)} en comparación con el grupo G1 {Grupo de control (con 10 kcal% de grasa)}. Se consideró que estos cambios se debían a la administración de elementos de prueba.
En los animales hembras, hubo un aumento estadísticamente significativo en los valores de peso corporal semanal medio del día 21 en el grupo G4 {CYPRO-AF - 100 mg/kg Dieta alta en grasas (con 60 kcal% de grasa)}, grupo G5 {CYPRO-AF -200 mg/kg Dieta alta en grasas (con 60 kcal% de grasa)} y grupo G6 {CYPRO-D1 - 10 mg/kg Dieta alta en grasas (con 60 kcal% de grasa)} en comparación con el grupo G1 {Grupo de control (con 10 kcal% de grasa)}. Se consideró que estos cambios se debían a la diferencia en el contenido de grasa del alimento.
En los animales hembras, hubo un aumento estadísticamente significativo en los valores de peso corporal semanal medio del día 28 en el grupo G3 {CYPRO-AF - 50 mg/kg Dieta alta en grasas (con 60 kcal% de grasa)}, grupo G4 {CYPRO-AF - 100 mg/kg Dieta alta en grasas (con 60 kcal% de grasa)}, grupo G5 {CYPRO-AF -200 mg/kg Dieta alta en grasas (con 60 kcal% de grasa)} y grupo G6 {CYPRO-D1 - 10 mg/kg Dieta alta en grasas (con 60 kcal% de grasa)} en comparación con el grupo G1 {Grupo de control (con 10 kcal% de grasa)}. Se consideró que estos cambios se debían a la diferencia en el contenido de grasa del alimento.
En los animales hembras, hubo una disminución en los valores de peso corporal semanal medio de los días 35, 42, 49 y 55 en el grupo G3 {CYPRO-AF - 50 mg/kg Dieta alta en grasas (con 60 kcal% de grasa)}, grupo G4 {CYPRO-AF - 100 mg/kg Dieta alta en grasas (con 60 kcal% de grasa)}, grupo G5 {CYPRO- AF -200 mg/kg Dieta alta en grasas (con 60 kcal% de grasa)} y grupo G6 {CYPRO -D1 - 10 mg/kg Dieta alta en grasas (con 60 kcal% de grasa)} en comparación con el grupo G1 {Grupo de control (con 10 kcal% de grasa)}. Se consideró que estos cambios se debían a la administración de elementos de prueba.
Observaciones clínicas
El sumario de los signos clínicos de animales machos y hembras se presenta en la Tabla 5 y la Tabla 6, respectivamente. Se encontró que los animales tenían un estado de salud normal y saludable durante las observaciones clínicas durante el período de estudio.
Tabla -5: Sumario de las observaciones de signos clínicos en machos
Tabla- 6: Sumario de observaciones de signos clínicos en los animales hembras
Hematología
El sumario de las estimaciones de los parámetros hematológicos de animales machos y hembras se presenta en la Tabla-7 y Tabla-8 respectivamente.
Tabla -7: Sumario de hematología de los animales machos
Tabla -7 (Continuación): Sumario de hematología de los animales machos
Tabla -8: Sumario de hematología de los animales hembras
TABLA- 8 (Continuación) Sumario de hematología de los animales hembras
Comparación de análisis estadístico de parámetros hematológicos entre G1 a G3, G4, G5 y G6
Concentración media de hemoglobina corpuscular (MCHC)
En los animales machos, hubo un aumento estadísticamente significativo en el valor medio de MCHC del grupo G4 {CYPRO-AF -100 mg/kg Dieta alta en grasas (con 60 kcal% de grasa)} en comparación con el grupo G1 {Grupo de control (con 10 kcal% de grasa) )}. Estos cambios pueden considerarse incidentales ya que no hubo una respuesta dependiente de la dosis.
Volumen corpuscular medio y hemoglobina corpuscular media
En los animales hembras, hubo un aumento estadísticamente significativo en los valores medios de MCV y MCH del grupo G3 {CYPRO-AF -50 mg/kg Dieta alta en grasas (con 60 kcal% de grasa)} en comparación con el grupo G1 {Grupo de control (con 10 kcal% de grasa)}. Estos cambios pueden considerarse incidentales ya que no hubo una respuesta dependiente de la dosis.
Hemoglobina corpuscular media y concentración de hemoglobina corpuscular media
En las hembras, hubo un aumento estadísticamente significativo en los valores medios de MCH y MCHC del grupo G5 {CYPRO-AF -200 mg/kg Dieta alta en grasas (con 60 kcal% de grasa)} en comparación con el grupo G2 {Grupo control de dieta alta en grasas (con 60 kcal% de grasa)}. Este cambio puede considerarse incidental ya que no hubo una respuesta dependiente de la dosis.
Química clínica
El sumario de las estimaciones de los parámetros de química clínica de animales machos y hembras se presenta en la Tabla-9 y Tabla-10, respectivamente.
Tabla 9
Tabla 9 continuación
Tabla- 10
Tabla 10 continuación
Comparación de análisis estadístico de parámetros de química clínica entre G1 a Q3, G4, G5 y G6
Proteínas totales
En los animales hembras, hubo una disminución estadísticamente significativa en los valores medios de proteína total del grupo G3 {CYPRO-AF -50 mg/kg Dieta alta en grasas (con 60 kcal% de grasa)} y del grupo G4 {Cy PRO-AF - 100 mg/kg Dieta alta en grasas (con 60 kcal% de grasa)} en comparación con el grupo G1 {Grupo de control (con 10 kcal% de grasa)}. Se consideró que estos cambios se debían a la diferencia en el contenido de grasa del alimento.
Triglicéridos
En los animales hembras, hubo una disminución estadísticamente significativa en los valores medios de triglicéridos del grupo G3 {CYPRO-AF -50 mg/kg Dieta alta en grasas (con 60 kcal% de grasa)}, grupo G4 {CYPRO-AF -100 mg/kg Dieta alta en grasas (con 60 kcal% de grasa)}, grupo G5 {CYPRO-AF -200 mg/kg Dieta alta en grasas (con 60 kcal% de grasa)} y grupo G6 {CYPRO-D1 -10 mg/kg Dieta alta en grasas (con 60 kcal% de grasa)} en comparación con el grupo G1 {Grupo de control (con 10 kcal% de grasa)}. Se consideró que estos cambios se debían a la diferencia en el contenido de grasa del alimento.
Colesterol total
En los animales machos, hubo un aumento estadísticamente significativo en el valor medio de colesterol total del grupo G3 {CYPRO-AF -50 mg/kg Dieta alta en grasas (con 60 kcal% de grasa)} y del grupo G6 {CYPRO-D1 10 mg/kg Dieta alta en grasas (con 60 kcal% de grasa)} en comparación con el grupo G1 {Grupo de control (con 10 kcal% de grasa)}. Se consideró que estos cambios se debían a la diferencia en el contenido de grasa del alimento. En los animales hembras, hubo un aumento estadísticamente significativo en los valores medios de colesterol total del grupo G5 {CYPRO-AF -200 mg/kg Dieta alta en grasas (con 60 kcal% de grasa)} en comparación con el grupo G1 {Grupo de control (con 10 kcal% de grasa)}. Este cambio puede considerarse debido a la diferencia en el contenido de grasa del alimento.
Lípidos de alta densidad
En los animales machos, hubo una disminución estadísticamente significativa en el valor medio de lípidos de alta densidad del grupo G5 {CYPRO-AF - 200 mg/kg Dieta alta en grasas (con 60 kcal% de grasa)} en comparación con el grupo G1 {Grupo de control (con 10 kcal% de grasa)}. Este cambio puede considerarse debido a la diferencia en el contenido de grasa del alimento.
Lípidos de baja densidad
En los animales machos, hubo un aumento estadísticamente significativo en el valor medio de lípidos de baja densidad del grupo G3 {CYPRO-AF -50 mg/kg Dieta alta en grasas (con 60 kcal% de grasa)}, grupo G4 {CYPr O-AF -100 mg/kg Dieta alta en grasas (con 60 kcal% de grasa)} y grupo G6 {CYPRO-D1 -10 mg/kg Dieta alta en grasas (con 60 kcal% de grasa)} en comparación con el grupo G1 {Grupo de control (con 10 kcal% de grasa) )}. Se consideró que estos cambios se debían a la diferencia en el contenido de grasa del alimento.
Lípidos de muy baja densidad
En los animales hembras, hubo un aumento estadísticamente significativo en el valor medio de lípidos de muy baja densidad del grupo G5 {CYPRO-AF - 200 mg/kg Dieta alta en grasas (con 60 kcal% de grasa)} en comparación con el grupo G1 {Grupo de control (con 10 kcal% de grasa)}. Este cambio puede considerarse debido a la diferencia en el contenido de grasa del alimento.
Comparación de análisis estadístico de parámetros de química clínica entre G2 a G3, G4, G5 y G6 Triglicéridos
En los animales machos, hubo una disminución en los valores medios de triglicéridos del grupo G3 {CYPRO-AF 50 mg/kg Dieta alta en grasas (con 60 kcal% de grasa)}, grupo G4 {CYPRO-AF -100 mg/kg Dieta alta en grasas (con 60 kcal% de grasa)}, grupo G5 {CYPRO-AF 200 mg/kg Dieta alta en grasas (con 60 kcal% de grasa)} y grupo G6 {CYPRO-D1 10 mg/kg Dieta alta en grasas (con 60 kcal% de grasa)} en comparación con el grupo g 2 Control de dieta alta en grasas (con 60 kcal% de grasa). Esta disminución en los cambios en los valores medios de triglicéridos podría deberse al efecto de los elementos de prueba.
En los animales hembras, hubo una disminución estadísticamente significativa en los valores medios de triglicéridos del grupo G6 {CYPRO-D1 10 mg/kg Dieta alta en grasas (con 60 kcal% de grasa)} en comparación con el grupo G2 Control de dieta alta en grasas (con 60 kcal% de grasa ). Esta disminución en los cambios en los valores medios de triglicéridos podría deberse al efecto de los elementos de prueba.
Hubo una disminución en los valores medios de triglicéridos del grupo G3 {CYPRO-AF 50 mg/kg Dieta alta en grasas (con 60 kcal% de grasa)}, grupo G4 {CYPRO-AF 100 mg/kg Dieta alta en grasas (con 60 kcal% de grasa)} y grupo G5 {CYPRO-AF 200 mg/kg Dieta alta en grasas (con 60 kcal% de grasa)} en comparación con el grupo g 2 Control de dieta alta en grasas (con 60 kcal% de grasa). Esta disminución en los cambios en los valores medios de triglicéridos podría deberse al efecto de los elementos de prueba.
Colesterol total
En los animales machos, hubo una disminución en los valores medios de colesterol total del grupo G3 {CYPRO-AF 50 mg/kg Dieta alta en grasas (con 60 kcal% de grasa)}, grupo G4 {CYPRO-AF -100 mg/kg Dieta alta en grasas (con 60 kcal% de grasa)} y grupo G5 {CYPRO-AF 200 mg/kg Dieta alta en grasas (con 60 kcal% de grasa)} en comparación con el grupo G2 Control de dieta alta en grasas (con 60 kcal% de grasa). Esta disminución en los cambios en los valores medios de colesterol total podría deberse al efecto de los elementos de prueba.
En los animales hembras, hubo una disminución en los valores medios de colesterol total del grupo G3 {CYPRO-AF 50 mg/kg Dieta alta en grasas (con 60 kcal% de grasa)}, grupo G4 {CYPRO-AF 100.mg/kg Dieta alta en grasas(con 60 kcal% de grasa)} y grupo G6 {CYPRO-D1 10 mg/kg Dieta alta en grasas (con 60 kcal% de grasa)} en comparación con el grupo G2 Control de dieta alta en grasas (con 60 kcal% de grasa). Esta disminución en los cambios en los valores medios de colesterol total podría deberse al efecto de los elementos de prueba.
Lípidos de alta densidad
En los animales machos, hubo una disminución estadísticamente significativa en los valores medios de lípidos de alta densidad del grupo G3 {CYPRO-AF 50 mg/kg Dieta alta en grasas (con 60 kcal% de grasa)}, grupo G4 {CYPRO-AF -100 mg/kg Dieta alta en grasas (con 60 kcal% de grasa)}, grupo G5 {CYPRO-AF 200 mg/kg Dieta alta en grasas (con 60 kcal% de grasa)} y grupo G6 {CYPRO-D1 10 mg/kg Dieta alta en grasas ( con 60 kcal% de grasa)} en comparación con el grupo G2 Control de dieta alta en grasas (con 60 kcal% de grasa).
La disminución estadísticamente significativa en los cambios medios en los valores de lípidos de alta densidad podría deberse al efecto de los elementos de prueba.
En los animales hembras, hubo una disminución estadísticamente significativa en los valores medios de lípidos de alta densidad del grupo G3 {CYPRO-AF 50 mg/kg Dieta alta en grasas (con 60 kcal% de grasa)}, grupo G4 {CYPRO-AF 100 mg/kg Dieta alta en grasas (con 60 kcal% de grasa)}, grupo G5 {CYPRO-AF 200 mg/kg Dieta alta en grasas (con 60 kcal% de grasa)} y grupo G6 {CYPRO-D1 10 mg/kg Dieta alta en grasas (con 60 kcal% de grasa)} en comparación con el grupo G2 Control de dieta alta en grasas (con 60 kcal de % de grasa). Estas disminuciones en los cambios medios en los valores de lípidos de alta densidad podrían deberse al efecto de los elementos de prueba.
Lípidos de baja densidad
En los animales machos, hubo una disminución en los valores medios de lípidos de baja densidad del grupo G5 {CYPRO-AF 200 mg/kg Dieta alta en grasas (con 60 kcal% de grasa)} en comparación con el grupo G2 Control de dieta alta en grasas (con 60 kcal% de grasa ). Esta disminución en los cambios medios en los valores de lípidos de baja densidad podría deberse al efecto de los elementos de prueba.
Valores de lípidos de muy baja densidad
En los animales machos, hubo una disminución en los valores medios de lípidos de muy baja densidad del grupo G3 {CYPRO-AF 50 mg/kg Dieta alta en grasas (con 60 kcal% de grasa)}, grupo G4 {CYPr O-AF -100 mg/kg Dieta alta en grasas (con 60 kcal% de grasa)}, grupo G5 {CYPRO-AF 200 mg/kg Dieta alta en grasas (con 60 kcal% de grasa)} y grupo G6 {CYPRO-D1 10 mg/kg Dieta alta en grasas (con 60 kcal% de grasa)} en comparación con el grupo G2 Control de dieta alta en grasas (con 60 kcal% de grasa). Esta disminución en los cambios medios en los valores de lípidos de muy baja densidad podría deberse al efecto de los elementos de prueba.
En animales hembras, hubo una disminución marginal en los valores medios de lípidos de muy baja densidad del grupo G3 {CYPRO-AF 50 mg/kg Dieta alta en grasas (con 60 kcal% de grasa)}, grupo G4 {CYPr O-AF 100 mg/kg Dieta alta en grasas (con 60 kcal% de grasa)} y grupo G6 {CYPRO-D1 10 mg/kg Dieta alta en grasas (con 60 kcal% de grasa)} en comparación con el grupo G2 Control de dieta alta en grasas (con 60 kcal% de grasa). Estas disminuciones en los cambios medios en los valores de lípidos de muy baja densidad podrían deberse al efecto de los elementos de prueba.
Conclusión: A partir del presente estudio, puede concluirse que los elementos de prueba Cypro-AF y Cypro-D1 tuvieron un efecto en la disminución de parámetros como las concentraciones de HDL, Triglicéridos, Colesterol, LDL y VLDL en animales C57 machos y hembras obesos inducidos por una dieta alta en grasas a 50, 100 y 200 mg/kg
de peso corporal de Cypro-AF y 10 mg/kg de peso corporal de Cypro-DI. No se observaron cambios estadísticos significativos en los pesos de los órganos y los depósitos de grasa en la necropsia de los animales.
Ejemplo 3 -El efecto de Cyperus rotundus, fracción de acetato de etilo que comprende piceatanol y sus dímeros escirpusina A y escirpusina B para el control del peso en seres humanos -Estudios de eficacia, seguridad y tolerabilidad.
Detalles del estudio
Los objetivos primarios incluyeron (i) Estudiar la eficacia del extracto de Cyperus rotundus para el control del peso en pacientes obesos; y (ii) Estudiar la seguridad y tolerabilidad del extracto de Cyperus rotundus para el control del peso en pacientes obesos.
El objetivo secundario incluyó el estudio del inicio de la actividad del extracto de Cyperus rotundus en el control del peso de pacientes obesos.
Las medidas del resultado primario incluyeron, (i) disminución del peso corporal y del índice de masa corporal; (ii) disminución de la circunferencia de la cintura y la relación cintura :cadera (medidas antropométricas); (iii) disminución de los valores de colesterol, triglicéridos, LDL y VLDL desde la línea de base; (iv) aumento de los valores de HDL desde el inicio; y (v) evidencia fotográfica obtenida de los sujetos desde el inicio y en la última visita mientras se ocultaba su identidad.
Las medidas del resultado secundario incluyeron evaluar la tolerabilidad del material de estudio en términos de eventos adversos y otros signos o síntomas físicos en los sujetos del estudio.
Demografía del sujeto (Tabla 11)
Tabla 11
Formulaciones ilustrativas usadas en el estudio en seres humanos (Tablas 12 y 13)
Tabla 12
Tabla 13
El material de estudio activo y el placebo descritos en la presente memoria se formularon anteriormente como cápsulas de gelatina dura marrón/marrón de tamaño "00" con un peso de relleno de 560 mg. Al ser un estudio doble ciego, tanto la cápsula de material de estudio activo como la cápsula de placebo fueron idénticas en todos los aspectos físicos como tamaño, forma y peso. Un lote seleccionado al azar de material de estudio activo cuando se analizó mostró 36,18 mg de piceatanol y escirpusina B en promedio por cápsula. En aspectos más ilustrativos, las formulaciones ilustrativas que comprenden el extracto de Cyperus rotundus se estandarizaron para contener más del 3 % de los estilbenos totales, incluidos piceatanol, escirpusina A y escirpusina B. En el ejemplo ilustrativo, enunciado en la Tabla 12, el extracto de Cyperus rotundus se ha estandarizado para que contenga un 5 % de los estilbenos totales, incluidos piceatanol, escirpusina A y escirpusina B.
El ensayo se llevó a cabo en el Government Ayurveda Medical College, Mysore, India. El estudio se inició solo después de obtener una opinión favorable escrita del comité de ética institucional. No se realizaron más cambios o enmiendas al protocolo aprobado durante el curso del estudio. El ensayo se llevó a cabo de acuerdo con los principios enunciados en la Declaración de Helsinki (Edimburgo, 2000) y la guía tripartita armonizada de la ICH sobre Buenas Prácticas Clínicas (BPC). Se proporcionó a todos los sujetos información escrita y oral sobre el estudio en un idioma comprensible para el sujeto.
Este estudio aleatorizado, doble ciego, de grupos paralelos, controlado con placebo, tuvo un total de 5 visitas al sitio clínico por parte de los sujetos del estudio, además de la visita de cribado. El calendario de evaluaciones se representa en la Tabla 14.
Tabla 14
Los sujetos se incluyeron en el estudio si se indicaba "Sí" a todos los criterios de inclusión y "No" a cualquiera de los criterios de exclusión. Criterios de inclusión: 1) Pacientes masculinos y/o femeninos 2) Edad entre 20 y 65 años 3) Niveles elevados de colesterol sérico más de 200 mg por dL 4) Triglicéridos séricos elevados más de 150 mg por dL 5) LDL sérico elevado más de 130 mg por dL y o VLDL sérico elevado más de 40 mg por dL 6) IMC entre > 30 a 40 kg/m2 7) Dispuesto a acudir a visitas de seguimiento regulares 8) Capaz de dar su consentimiento informado por escrito. Criterios de Exclusión: 1) Ingesta de agentes para la pérdida de peso de venta libre, supresores del apetito de acción central en los seis meses anteriores, 2) Síndromes fisiopatológicos/genéticos asociados con la obesidad (síndrome de Cushing, síndrome de Turner, síndrome de Prader willi), 3) Pacientes con evidencia de malignidad 4) Pacientes con diabetes mellitus mal controlada (HbA1c> 10 %), 5) Pacientes con hipertensión mal controlada (> 160/100 mm Hg), 6) Pacientes con medicación prolongada (> 6 semanas) con corticosteroides, antidepresivos, anticolinérgicos, etc. o cualquier otro fármaco que pueda influir en el resultado del estudio, 7) Pacientes que padecen una enfermedad sistémica importante que requiera tratamiento farmacológico a largo plazo (artritis reumatoide, rizomeculosis, trastornos psico-neuroendocrinales, etc.), 8) Pacientes con antecedentes de fibrilación auricular, síndrome coronario agudo, infarto del miocardio, accidente cerebrovascular o arritmia grave en los últimos 6 meses, 9) Paciente sintomático con evidencia clínica de insuficiencia cardíaca, 10) Pacientes con trastorno hepático grave concurrente (definido como Aspartato Amino Transferasa (AST) y/o Alanina Amino Transferasa (ALT), Bilirrubina total, 11) Fosfatasa alcalina (ALP)> 2,5 veces el límite superior normal) o Trastornos renales (definido como S. Creatinina> 1,2 mg/dL), Disfunción Pulmonar Grave (asma bronquial no controlada y/o Enfermedad Pulmonar Obstructiva Crónica [EPOC]), o cualquier otra condición que pueda poner en peligro el estudio, 12) Historia de VIH y otras infecciones virales, 13 ) Alcohólicos y/o drogadictos, 14) Terapia quirúrgica previa para la obesidad, 15) Historial de hipersensibilidad a cualquiera de los extractos de hierbas o suplementos dietéticos, 16) Mujer embarazada/lactante, 17) Pacientes que hayan completado su participación en cualquier otro ensayo clínico durante los últimos seis (06) meses, 18) Cualquier otra condición que el Investigador Principal considere que pueda poner en peligro el estudio.
Aleatorización, asignación de tratamiento y procedimientos de estudio
Al tratarse de un estudio piloto, no se requirió del cálculo formal del tamaño de muestra. A cada participante se le asignó un código de aleatorización de 6 dígitos y los productos de investigación fueron distribuidos por el personal del sitio de acuerdo con la lista de códigos de aleatorización generada por un estadístico independiente. El doble cegamiento de los productos en investigación se logró mediante un cegamiento independiente de los kits de administración y, por lo tanto, tanto el personal del centro clínico como los participantes permanecieron cegados al tratamiento recibido durante la duración del estudio. Se capturaron los datos demográficos de todos los sujetos inscritos en la visita de cribado (Tabla 11). Se incluyó en el estudio a pacientes obesos que no habían recibido ningún otro tratamiento en los 3 meses anteriores. Se recomendó a todos los sujetos inscritos que se adhirieran al programa de eventos (Tabla 14) del estudio. Los sujetos inscritos se asignaron entre los grupos activo y placebo en proporción 1: 1. Los sujetos usaron este producto de forma ambulatoria y se les pidió que se autoadministraran dos cápsulas de gelatina por día (cada una con un peso de 560 mg) ya sea activo o placebo, al menos 30 minutos antes de una comida, preferentemente por la mañana y por la noche como ingrediente dietético para un período de 90 días. Se programó que regresaran para las evaluaciones clínicas los días 15, 30, 60 y 90. Se realizó un seguimiento telefónico al menos 15 días desde la última visita programada sobre el bienestar del sujeto. La dieta diaria y las actividades físicas se registraron en los diarios de los pacientes que se les proporcionaron en la visita 1. Lo mismo se controló y verificó en visitas posteriores de los investigadores. El cumplimiento del suplemento del estudio se revisó en cada visita mediante el examen de los suplementos devueltos. La recopilación de datos durante este estudio clínico y el análisis estadístico se realizaron por grupos funcionales separados y un estadístico independiente certificado, respectivamente. No se realizaron cambios o enmiendas al protocolo aprobado después de que comenzó el ensayo y no se realizó ningún análisis intermedio durante el período de estudio. Los resultados de seguridad se midieron mediante: 1) Examen físico y datos vitales, 2) Evaluación de los eventos adversos (EA) informados, si los hay, 2) Eventos adversos, si los hay. Los resultados de eficacia se midieron por 1) peso, IMC, circunferencia de la cintura, circunferencia de la cadera y relación cintura-cadera.
Análisis estadístico
Se usó el software de análisis estadístico (SAS) de la versión 9.2 para el análisis de datos para el estudio clínico en seres humanos. Se usaron la prueba t pareada, el análisis de covarianza (ANCOVA) y la prueba de suma de intervalos con signo de Wilcoxon para las variables del conjunto de datos apropiado para alcanzar la mejor conclusión estadística posible entre los grupos que recibieron el placebo y el activo. Un valor de p <0,05 se consideró estadísticamente significativo. Los descriptores de línea de base se resumieron como medias y desviaciones estándar para las variables continuas y como frecuencias y porcentajes para las variables categóricas. Ultima observación llevada a cabo (LOCF), se siguió el procedimiento por intención de tratar para las evaluaciones de eficacia de los sujetos.
Resultados
Ninguno de los sujetos inscritos tenía antecedentes médicos anormales o hallazgos físicos anormales observados en la visita de cribado o durante las visitas del estudio. No se observaron cambios estadísticamente significativos en
los signos vitales entre los grupos de tratamiento en ninguna de las visitas del estudio. De los 30 pacientes aleatorizados, 26 completaron el estudio. La proporción de hombres y mujeres que completaron todas las visitas del estudio es 7:19, 3 mujeres abandonaron el estudio en varios momentos, en el que un análisis al final del estudio reveló que 3 de cada 4 sujetos que abandonaron estaban recibiendo placebo. El porcentaje de cumplimiento del tratamiento de 26 pacientes que completaron el estudio fue bueno. El mínimo fue el 87,22 % y el máximo fue el 100 % de cumplimiento del tratamiento por 19 sujetos del estudio. El ensayo no terminó prematuramente y se detuvo solo después de alcanzar el tamaño de muestra objetivo de 30. No se observaron cambios estadísticamente significativos en los signos vitales (Tabla 15) ni valores de laboratorio anormales clínicamente significativos (Tablas 16 y 17) desde la línea de base hasta las visitas finales y entre los grupos de tratamiento. Se informó un único EA durante todo el período de estudio y, de acuerdo con la opinión del investigador, el evento no estaba "relacionado" con el producto del estudio. No se observaron eventos adversos graves o eventos adversos significativos en este estudio. El análisis de eficacia de estos parámetros primarios revela que el peso, el IMC y la circunferencia de la cintura alcanzaron significación estadística entre los dos grupos de tratamiento al final del estudio, mientras que los otros dos parámetros (circunferencia de la cadera y relación cintura-cadera) no mostraron ninguna significación entre los dos grupos de tratamiento. Se encontró que pocas evaluaciones bioquímicas (Tabla 18) como colesterol total, triglicéridos, lipoproteínas de baja densidad, lipoproteínas de alta densidad y lipoproteínas de muy baja densidad fueron estadísticamente significativas (p<0,01) cuando se compararon entre los dos pacientes del grupo de tratamiento (Tabla 18). Las fotografías de los sujetos antes y después de la duración del estudio indican claramente la eficacia del producto.
Tabla 15
Tabla 16
Tabla 17
Tabla 18
En otro aspecto más preferido, la presente memoria descriptiva se refiere a un procedimiento para reducir la obesidad en seres humanos, comprendiendo dicho procedimiento la etapa de administrar a dichos seres humanos por vía oral dos veces al día, la composición que comprende la fracción de acetato de etilo del extracto de rizomas de Cyperus rotundus estandarizado para que contenga el 5 % de los estilbenos totales para lograr los efectos de
reducción del peso corporal, índice de masa corporal y circunferencia de la cintura. En un aspecto más específico, la composición que comprende la fracción de acetato de etilo del extracto de rizomas de Cyperus rotundus estandarizado para que contenga el 5 % de los estilbenos totales consiste esencialmente en piceatanol y sus dímeros. En aspectos aún más específicos, la composición que comprende la fracción de acetato de etilo del extracto de rizomas de Cyperus rotundus estandarizado para que contenga el 5 % de los estilbenos totales consiste esencialmente en piceatanol, escirpusina A y escirpusina B.
En otro aspecto más preferido, la presente memoria descriptiva se refiere a un procedimiento para tratar la hipercolesterolemia en seres humanos, comprendiendo dicho procedimiento la etapa de administrar a dichos seres humanos por vía oral dos veces al día, la composición que comprende la fracción de acetato de etilo del extracto de rizomas de Cyperus rotundus estandarizado para que contenga el 5 % de los estilbenos totales para lograr los efectos de (a) reducción en los niveles sistémicos de colesterol total, lipoproteínas de baja densidad (LDL), lipoproteínas de muy baja densidad (VLDL) y triglicéridos séricos y (b) mejora en los niveles sistémicos de lipoproteínas de alta densidad (HDL). En un aspecto más específico, la composición que comprende la fracción de acetato de etilo del extracto de rizomas de Cyperus rotundus estandarizado para que contenga el 5 % de los estilbenos totales consiste esencialmente en piceatanol y sus dímeros. En aspectos aún más específicos, la composición que comprende la fracción de acetato de etilo del extracto de rizomas de Cyperus rotundus estandarizado para que contenga el 5 % de los estilbenos totales consiste esencialmente en piceatanol, escirpusina A y escirpusina B.
Como aspecto ilustrativo adicional, la presente memoria descriptiva se refiere a un procedimiento para reducir la obesidad en seres humanos, comprendiendo dicho procedimiento la etapa de administrar a dichos seres humanos por vía oral dos veces al día, la composición que comprende la fracción de acetato de etilo del extracto de rizomas de Cyperus rotundus estandarizado para que contenga más del 3 % de los estilbenos totales para lograr los efectos de reducción del peso corporal, índice de masa corporal y circunferencia de la cintura. En un aspecto más específico, la composición que comprende la fracción de acetato de etilo del extracto de rizomas de Cyperus rotundus estandarizado para que contenga más del 3 % de los estilbenos totales consiste esencialmente en piceatanol y sus dímeros. En aspectos aún más específicos, la composición que comprende la fracción de acetato de etilo del extracto de rizomas de Cyperus rotundus estandarizado para que contenga más del 3 % de los estilbenos totales consiste esencialmente en piceatanol, escirpusina A y escirpusina B.
Como ejemplo ilustrativo adicional, la presente memoria descriptiva también se refiere a un procedimiento para tratar la hipercolesterolemia en seres humanos, comprendiendo dicho procedimiento la etapa de administrar a dichos seres humanos por vía oral dos veces al día, la composición que comprende la fracción de acetato de etilo del extracto de rizomas de Cyperus rotundus estandarizado para que contenga más del 3 % de los estilbenos totales para lograr los efectos de (a) reducción en los niveles sistémicos de colesterol total, lipoproteínas de baja densidad (LDL), lipoproteínas de muy baja densidad (VLDL) y triglicéridos séricos y (b) mejora de los niveles sistémicos de lipoproteínas de alta densidad (HDL). En un aspecto más específico, la composición que comprende la fracción de acetato de etilo del extracto de rizomas de Cyperus rotundus estandarizado para que contenga más del 3 % de los estilbenos totales consiste esencialmente en piceatanol y sus dímeros. En aspectos aún más específicos, la composición que comprende la fracción de acetato de etilo del extracto de rizomas de Cyperus rotundus estandarizado para que contenga más del 3 % de los estilbenos totales consiste esencialmente en piceatanol, escirpusina A y escirpusina B.
Si bien se han divulgado en aspectos preferidos, el ámbito de la invención debe interpretarse únicamente junto con las reivindicaciones adjuntas.
Claims (8)
1. Composición que comprende una fracción de acetato de etilo del extracto de rizomas de Cyperus rotundus estandarizado para que contenga 5 % de los estilbenos totales para su uso en un procedimiento de reducción de la obesidad en seres humanos, comprendiendo dicho procedimiento la epata de administrar a dichos seres humanos por vía oral dos veces al día la composición para lograr los efectos de reducción del peso corporal, índice de masa corporal y circunferencia de la cintura.
2. Composición que comprende la fracción de acetato de etilo del extracto de rizomas de Cyperus rotundus estandarizado para que contenga 5 % de los estilbenos totales para su uso en un procedimiento de tratamiento de la hipercolesterolemia en seres humanos, comprendiendo dicho procedimiento la etapa de administrar a dichos seres humanos por vía oral dos veces al día la composición para lograr los efectos de (a) reducción de los niveles sistémicos de colesterol total, lipoproteínas de baja densidad (LDL), lipoproteínas de muy baja densidad (VLDL) y triglicéridos séricos y (b) mejora de los niveles sistémicos de lipoproteínas de alta densidad (HDL).
3. Composición que comprende la fracción de acetato de etilo del extracto de rizomas de Cyperus rotundus estandarizado para que contenga 5 % de los estilbenos totales para su uso en el procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 o en el procedimiento de acuerdo con la reivindicación 2 en el que la composición consiste esencialmente en piceatanol y dímeros del mismo.
4. Composición que comprende la fracción de acetato de etilo del extracto de rizomas de Cyperus rotundus estandarizado para que contenga 5 % de los estilbenos totales para su uso en los procedimientos de acuerdo con la reivindicación 3 en el que la composición consiste esencialmente en una combinación de piceatanol, escirpusina B y escirpusina A.
5. Composición que comprende la fracción de acetato de etilo del extracto de rizomas de Cyperus rotundus estandarizado para que contenga más del 3 % de los estilbenos totales para su uso en un procedimiento de reducción de la obesidad en seres humanos, comprendiendo dicho procedimiento la etapa de administrar a dichos seres humanos por vía oral dos veces al día la composición para lograr los efectos de reducción del peso corporal, índice de masa corporal y circunferencia de la cintura.
6. Composición que comprende la fracción de acetato de etilo del extracto de rizomas de Cyperus rotundus estandarizado para que contenga más del 3 % de los estilbenos totales para su uso en un procedimiento de tratamiento de la hipercolesterolemia en seres humanos, comprendiendo dicho procedimiento la etapa de administrar a dichos seres humanos por vía oral dos veces al día la composición para lograr los efectos de (a) reducción de los niveles sistémicos de colesterol total, lipoproteínas de baja densidad (LDL), lipoproteínas de muy baja densidad (VLDL) y triglicéridos séricos y (b) mejora de los niveles sistémicos de lipoproteínas de alta densidad ( HDL).
7. Composición que comprende la fracción de acetato de etilo del extracto de rizomas de Cyperus rotundus estandarizado para que contenga más del 3 % de los estilbenos totales para su uso en el procedimiento de acuerdo con la reivindicación 5 o en el procedimiento de acuerdo con la reivindicación 6, en el que la composición consiste esencialmente en piceatanol y dímeros del mismo.
8. Composición que comprende la fracción de acetato de etilo del extracto de rizomas de Cyperus rotundus estandarizado para que contenga más del 3 % de los estilbenos totales para su uso en los procedimientos de acuerdo con la reivindicación 7 en el que la composición consiste esencialmente en una combinación de piceatanol, escirpusina B y escirpusina A.
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