JP6757980B2 - 多能性幹細胞から生殖細胞への分化誘導方法 - Google Patents
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Description
[1] ヒト多能性幹細胞からヒト始原生殖細胞様(PGC様)細胞を製造する方法であって、以下の工程I)及びII)を含む、方法:
I)ヒト多能性幹細胞を、アクチビンAおよびGSK3β阻害剤を含む培養液中で培養することにより中胚葉様細胞を製造する工程、
II)工程I)で得られた中胚葉様細胞を、BMPを含む培養液中で培養する工程。
[2] 前記工程I)の培養を60時間未満実施する、[1]に記載の方法。
[3] 前記工程I)の培養を42時間実施する、[2]記載の方法。
[4] 前記GSK3β阻害剤が、CHIR99021である、[1]に記載の方法。
[5] 前記工程I)において、培養液が線維芽細胞増殖因子受容体(FGFR)阻害剤をさらに含む、[1]から[4]のいずれか1項に記載の方法。
[6] 前記FGFR阻害剤が、PD173074である、[5]に記載の方法。
[7] 前記工程I)において、培養液がbFGFおよびBMPを含まない、[1]から[6]のいずれか1項に記載の方法。
[8] 前記工程II)において、培養液が、SCF、EGFおよびLIFから成る群より選択される少なくとも一つのサイトカインをさらに含む、[1]から[7]のいずれか1項に記載の方法。
[9] 前記多能性幹細胞が、無血清及び無フィーダー条件下で培養された多能性幹細胞である、[1]から[8]のいずれか1項に記載の方法。
[10] 前記無フィーダー条件下での培養が、ラミニン511またはラミニン511断片上での培養である、[9]に記載の方法。
[11] さらに、III)前記工程II)で得られた細胞から、PECAM (CD31)、INTEGRINα6 (CD49f)、INTEGRINβ3(CD61)、KIT (CD117)、EpCAM、PODOPLANINおよび TRA1-81から成る群より選択される少なくとも一つの細胞表面マーカーが陽性である細胞を選択する工程を含む、[1]から[10]のいずれか1項に記載の方法。
[12] 前記工程III)が、INTEGRINα6 (CD49f)及びEpCAMの二重陽性細胞を選択する工程である、[11]に記載の方法。
[13] 前記ヒト多能性幹細胞が、ヒトiPS細胞である、[1]から[12]のいずれか1項に記載の方法。
[14] [1]から[13]のいずれか1項に記載の方法により製造される、ヒト始原生殖細胞様(PGC様)細胞を含む細胞集団。
[15] PECAM (CD31)、INTEGRINα6 (CD49f)、INTEGRINβ3(CD61)、KIT (CD117)、EpCAM、PODOPLANINおよび TRA1-81から成る群より選択される少なくとも一つの細胞表面マーカーが陽性である細胞を選択することを含む、ヒト始原生殖細胞様(PGC様)細胞の選別方法。
[16] 前記選択が、INTEGRINα6 (CD49f)及びEpCAMの二重陽性細胞を選択することによって行われる、[15]に記載の方法。
[17] 以下の(1)及び(2)を含む、ヒト多能性幹細胞からヒト始原生殖細胞様(PGC様)細胞への分化誘導用試薬キット:
(1)アクチビンAおよびGSK3β阻害剤を含む、ヒト多能性幹細胞から中胚葉様細胞への誘導用試薬、
(2)BMPを含む、中胚葉様細胞からヒト始原生殖細胞様(PGC様)細胞への誘導用試薬。
[18] 前記GSK3β阻害剤が、CHIR99021である、[17]に記載のキット。
[19] 前記(1)の誘導用試薬が、線維芽細胞増殖因子受容体(FGFR)阻害剤をさらに含む、[17]または[18]に記載のキット。
[20] 前記FGFR阻害剤が、PD173074である、[19]に記載のキット。
[21] 前記(2)の誘導用試薬が、SCF、EGFおよびLIFから成る群より選択される少なくとも一つのサイトカインをさらに含む、[17]から[20]のいずれか1項に記載のキット。
[22] さらに、(3)PECAM (CD31)、INTEGRINα6 (CD49f)、INTEGRINβ3(CD61)、KIT (CD117)、EpCAM、PODOPLANINおよび TRA1-81から成る群より選択される少なくとも一つの細胞表面マーカーの各々に対する抗体を含む、ヒト始原生殖細胞様(PGC様)細胞の単離用試薬を含む、[17]から[21]のいずれか1項に記載のキット。
[23] 前記(3)の単離用試薬が、INTEGRINα6 (CD49f)に対する抗体及びEpCAMに対する抗体を含む、[22]に記載のキット。
(i)ES細胞
多能性幹細胞は自体公知の方法により取得することができる。例えば、ES細胞の作製方法としては、哺乳動物の胚盤胞ステージにおける内部細胞塊を培養する方法(Thomson JA, et al., Science. 282, 1145-1147, 1998)が挙げられるが、これらに限定されない。また、ES細胞は、所定の機関より入手でき、さらには市販品を購入することもできる。例えば、ヒトES細胞株であるH1及びH9は、ウィスコンシン大学のWiCell Instituteより入手可能であり、KhES−1、KhES−2及びKhES−3は、京都大学再生医科学研究所より入手可能である。
iPS細胞は、体細胞に核初期化物質を導入することにより作製することができる。
iPS細胞作製のための出発材料として用いることのできる体細胞は、角質化する上皮細胞(例、角質化表皮細胞)、粘膜上皮細胞(例、舌表層の上皮細胞)、外分泌腺上皮細胞(例、乳腺細胞)、ホルモン分泌細胞(例、副腎髄質細胞)、代謝・貯蔵用の細胞(例、肝細胞)、境界面を構成する内腔上皮細胞(例、I型肺胞細胞)、内鎖管の内腔上皮細胞(例、血管内皮細胞)、運搬能をもつ繊毛のある細胞(例、気道上皮細胞)、細胞外マトリックス分泌用細胞(例、線維芽細胞)、収縮性細胞(例、平滑筋細胞)、血液と免疫系の細胞(例、Tリンパ球)、感覚に関する細胞(例、桿細胞)、自律神経系ニューロン(例、コリン作動性ニューロン)、感覚器と末梢ニューロンの支持細胞(例、随伴細胞)、中枢神経系の神経細胞とグリア細胞(例、星状グリア細胞)、色素細胞(例、網膜色素上皮細胞)、及びそれらの前駆細胞(組織前駆細胞)等が挙げられる。細胞の分化の程度に特に制限はなく、未分化な前駆細胞(体性幹細胞も含む)であっても、最終分化した成熟細胞であっても、同様に本発明における体細胞の起源として使用することができる。ここで未分化な前駆細胞としては、例えば、脂肪由来間質(幹)細胞、神経幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、歯髄幹細胞等の組織幹細胞(体性幹細胞)が挙げられる。
本発明において「核初期化物質」とは、体細胞からiPS細胞を誘導することができる物質(群)であれば、タンパク性因子又はそれをコードする核酸(ベクターに組み込まれた形態を含む)、あるいは低分子化合物等のいかなる物質から構成されてもよい。核初期化物質がタンパク性因子又はそれをコードする核酸の場合、好ましくは以下の組み合わせが例示される(以下においては、タンパク性因子の名称のみを記載する)。
(1)Oct3/4、Klf4、c−Myc
(2)Oct3/4、Klf4、c−Myc、Sox2(ここで、Sox2はSox1、Sox3、Sox15、Sox17又はSox18で置換可能である。また、Klf4はKlf1、Klf2又はKlf5で置換可能である。さらに、c−MycはT58A(活性型変異体)、N−Myc又はL−Mycで置換可能である。)
(3)Oct3/4、Klf4、c−Myc、Sox2、Fbx15、Nanog、Eras、ECAT15−2、TclI、β−catenin(活性型変異体S33Y)
(4)Oct3/4、Klf4、c−Myc、Sox2、TERT、SV40 Large T antigen(以下、SV40LT)
(5)Oct3/4、Klf4、c−Myc、Sox2、TERT、HPV16 E6
(6)Oct3/4、Klf4、c−Myc、Sox2、TERT、HPV16 E7
(7)Oct3/4、Klf4、c−Myc、Sox2、TERT、HPV16 E6、HPV16 E7
(8)Oct3/4、Klf4、c−Myc、Sox2、TERT、Bmi1
(上記因子のさらなる情報については、WO2007/069666を参照(但し、上記(2)の組み合わせにおいて、Sox2からSox18への置換、Klf4からKlf1若しくはKlf5への置換については、Nature Biotechnology, 26, 101−106(2008)を参照)。「Oct3/4、Klf4、c−Myc、Sox2」の組み合わせについては、Cell,126, 663−676(2006)、Cell, 131, 861−872(2007)等も参照。「Oct3/4、Klf2(又はKlf5)、c−Myc、Sox2」の組み合わせについては、Nat. Cell Biol., 11, 197−203(2009)も参照。「Oct3/4、Klf4、c−Myc、Sox2、hTERT、SV40LT」の組み合わせについては、Nature, 451, 141−146(2008)も参照。)
(9)Oct3/4、Klf4、Sox2(Nature Biotechnology, 26, 101−106(2008)を参照)
(10)Oct3/4、Sox2、Nanog、Lin28(Science, 318, 1917−1920(2007)を参照)
(11)Oct3/4、Sox2、Nanog、Lin28、hTERT、SV40LT(Stem Cells, 26, 1998−2005(2008)を参照)
(12)Oct3/4、Klf4、c−Myc、Sox2、Nanog、Lin28(Cell Research(2008)600−603を参照)
(13)Oct3/4、Klf4、c−Myc、Sox2、SV40LT(Stem Cells, 26, 1998−2005(2008)も参照)
(14)Oct3/4、Klf4(Nature 454:646−650(2008)、Cell Stem Cell, 2:525−528(2008)を参照)
(15)Oct3/4、c−Myc(Nature 454:646−650(2008)を参照)
(16)Oct3/4、Sox2(Nature, 451, 141−146(2008)、WO2008/118820を参照)
(17)Oct3/4、Sox2、Nanog(WO2008/118820を参照)
(18)Oct3/4、Sox2、Lin28(WO2008/118820を参照)
(19)Oct3/4、Sox2、c−Myc、Esrrb(ここで、EsrrbはEsrrgで置換可能である。Nat. Cell Biol., 11, 197−203(2009)を参照)
(20)Oct3/4、Sox2、Esrrb(Nat. Cell Biol., 11, 197−203(2009)を参照)
(21)Oct3/4、Klf4、L−Myc
(22)Oct3/4、Nanog
(23)Oct3/4
(24)Oct3/4、Klf4、c−Myc、Sox2、Nanog、Lin28、SV40LT(Science, 324:797−801(2009)を参照)
Lin28 NM_145833 NM_024674
Lin28b NM_001031772 NM_001004317
Esrrb NM_011934 NM_004452
Esrrg NM_011935 NM_001438
L−Myc NM_008506 NM_001033081
核初期化物質の体細胞への導入は、該物質がタンパク性因子である場合、自体公知の細胞へのタンパク質導入方法を用いて実施することができる。ヒトへの臨床応用を念頭におく場合、その出発材料たるiPS細胞も遺伝子操作なしに作製されたものであることが好ましい。
従来iPS細胞の樹立効率が低いために、近年、その効率を改善する物質が種々提案されている。よって前記核初期化物質に加え、これら樹立効率改善物質を体細胞に接触させることにより、iPS細胞の樹立効率をより高めることが期待できる。
体細胞の核初期化工程において低酸素条件下で細胞を培養することにより、iPS細胞の樹立効率をさらに改善することができる。本明細書において「低酸素条件」とは、細胞を培養する際の雰囲気中の酸素濃度が、大気中のそれよりも有意に低いことを意味する。具体的には、通常の細胞培養で一般的に使用される5〜10% CO2/95〜90%大気の雰囲気中の酸素濃度よりも低い酸素濃度の条件が挙げられ、例えば雰囲気中の酸素濃度が18%以下の条件が該当する。好ましくは、雰囲気中の酸素濃度は15%以下(例、14%以下、13%以下、12%以下、11%以下など)、10%以下(例、9%以下、8%以下、7%以下、6%以下など)、又は5%以下(例、4%以下、3%以下、2%以下など)である。また、雰囲気中の酸素濃度は、好ましくは0.1%以上(例、0.2%以上、0.3%以上、0.4%以上など)、0.5%以上(例、0.6%以上、0.7%以上、0.8%以上、0.9%以上など)、又は1%以上(例、1.1%以上、1.2%以上、1.3%以上、1.4%以上など)である。
本工程I)で使用する分化誘導用の基本培地としては、例えば、Neurobasal培地、Neural Progenitor Basal培地、NS−A培地、BME培地、BGJb培地、CMRL 1066培地、最小必須培地(MEM)、Eagle MEM培地、αMEM培地、ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)、Glasgow MEM培地、Improved MEM Zinc Option培地、IMDM培地、Medium 199培地、DMEM/F12培地、ハム培地、RPMI 1640培地、Fischer’s培地、及びこれらの混合培地などが挙げられるが、これらに限定されない。
(1)分化誘導前の多能性幹細胞に比して、T、EOMES(Eomesodermin)、EVX1(Even-Skipped Homeobox 1)、SP5(Sp5 transcription factor)、MIXL1(Mix Paired-Like Homeobox 1)および NODALから選択される少なくとも1つの遺伝子発現の上昇、
(2)分化誘導前の多能性幹細胞に比して、POU5F1(POU domain, class 5, transcription factor 1)、NANOGおよびSOX2 (SRY (Sex Determining Region Y)-Box 2)から選択される少なくとも1つの遺伝子発現の低下。
このようにして得られた中胚葉様細胞をBMPの存在下で培養することにより、PGC様細胞へと分化誘導することができる。従って、本発明の第二の側面は、上記(2)の方法により得られた中胚葉様細胞を介して、ヒト多能性幹細胞からヒトPGC様細胞を製造する方法に関する。従って、本発明のヒト多能性幹細胞からヒトPGC様細胞への分化誘導方法は、
I)上記(2)に記載のいずれかの方法に従ってヒト多能性幹細胞から中胚葉様細胞を製造する工程;及び
II)工程I)で得られた中胚葉様細胞をBMPの存在下で培養する工程
を含む。
本発明はまた、前記工程I)及びII)により製造される、多能性幹細胞に由来するPGC様細胞を含む細胞集団も提供する。該細胞集団は、PGC様細胞の精製された集団であることが好ましく、上述の工程III)を経ることで精製された細胞集団であることが好ましい。
倫理ガイドライン
すべての動物実験は京都大学および滋賀医科大学の倫理ガイドラインにしたがって実施した。hiPSCsからhPGCLCsの誘導実験は、京都大学治験審査委員会(施設内倫理委員会)によって承認された。
hiPSC株(201B7,585A1,585B1)(Takahashi K, et al.,Cell. 131, 861-872, 2007およびOkita K, et al., Stem Cells. 31, 458-466, 2013)は、マイトマイシンC(MMC)処理SNLフィーダー細胞下で、従来法[20% (v/v) Knockout Serum Replacement(KSR; Life Technologies)、1% GlutaMax (Life Technologies)、0.1 mM 非必須アミノ酸、4 ng/ml 組換えヒトbFGF (Wako)、および0.1 mM 2−メルカプトエタノールを添加したダルベッコ変法イーグル培地(DMEM/F12; Life Technologies)] で維持培養し、続いてフィーダーフリー条件[組換えラミニン511(rLN511E8) (iMatrix-511,Nippi)被覆細胞培養プレート上、StemFitTM( Ajinomoto,Tokyo,Japan) 培地]に順応させた(Nakagawa M, et al.,Sci Rep. 4, 3594, 2014)。継代培養および分化誘導に際し、細胞をシングルセルに分離するためTrypLE Select (Life Technologies)と0.5mM EDTA/PBSの1:1混合溶液で処理し、10 μMのROCKインヒビター(Y-27632;Wako Pure Chemical Industries)を播種後24時間添加した。
BLIMP1-p2A-tdTomato(以下、BTという)またはTFAP2C-p2A-eGFP(以下、AGという) knockin hiPSC株を単離するためのドナーベクターの構築のため、BLIMP1のホモロジーアーム[left(5-prime)arm: 1148bp;right (3-prime)arm: 1192 bp]およびTFAP2Cのホモロジーアーム [left arm: 1144 bp; right arm:1162 bp]をPCRにて増幅し、pCR2.1 vector (TOPO TA Cloning; Life Technologies)へサブクローニングした。それぞれloxP部位が隣接したPGK-Neo カセットまたは PGK-Puroカセットを有するp2A-tdTomato フラグメントまたはp2A-eGFP フラグメントをPCR増幅し、GeneArt Seamless Cloning & Assembly Kit (Life Technologies)を使用してホモロジーアームを含有した上記記載のサブクローンベクターのBLIMP1コード配列または TFAP2Cコード配列の3’末端に挿入した。次に、MC1-DT-A-polyAカセットを制限酵素 NotI/XbaI または SacI/KpnIによって、それぞれBLIMP1-p2A-tdTomatoドナーベクターまたは TFAP2C-p2A-eGFPドナーベクターの右(3’)ホモロジーアームの下流に導入した。
BLIMP1-1eft (5-prime),NN NN NG NI HD HD NG NN NG NI NI NI NN NN NG HD NI NI NI;
BLIMP1-right (3-prime),HD NG NG NI NI NN NN NI NG HD HD NI NG NG NN NN NG NG HD;
TFAP2C-left,NN NN NI NN NI NI NT HD NI HD NI NN NN NI NI NI NG;
TFAP2C-right,NI HD NG HD NG HD HD NG NI NI HD HD NG NG NG HD NG。
BLIMP1-p2A-tdTomato ノックイン遺伝子座または TFAP2C-p2A-eGFPノックイン遺伝子座を有するhiPSCsは、内胚葉分化を目的として、2% B27 (Life Technologies)、100 ng/mlアクチビンA(Peprotech,#120-14)、および3μM CHIR99021 (Biovision,#1677-5)を含むRPMI1640 (Wako Pure Chemical Industries)中、iMatrix-511被覆プレートに播種して培養した。また、当該iPSCsは、栄養外胚葉への分化を目的として、10 ng/ml BMP4 を含むbFGF非含有StemFitTM(HumanZyme,#HZ-1078)中、iMatrix-511 (Nippi,892001)被覆プレートに播種して培養した。
BLIMP1-p2A-tdTomato; BLIMP1-/- knockin/knockout hiPSC株を単離するドナーベクターの構築を目的として、BLIMP1 exon 4 [left (5-prime)arm: 1517 bp; right (3-prime)arm: 1446 bp]に隣接するホモロジーアームをPCRで増幅し、pCR2.1 vectorへサブクローンした。LoxP部位に隣接するPGK-Neoカセットを有する2A-tdTomato-SV40 polyAフラグメントをPCRで増幅し、続いて、GeneArt Seamless Cloning & Assembly Kitを用いて、イントロン4の付加的な30 bp配列を、エクソン4アナログの代わりに挿入した。次に、MC1-DT-A-polyAカセットを、制限酵素 XhoI と SacI を用いて、右(3’末端)ホモロジーアームの下流に導入した。
left (5-prime),HD NI HD HD NI HD NG NG HD NI NG NG NN NI HD NN NN HD;
right (3-prime),NI NN HD NN HD NI NG HD HD NI NN NG NG NN HD NG NG NG。
hiPSCsを100 ng/mlデメコルチン含有培地で8時間インキュベートした。アキュターゼ(Sigma-Aldrich)によって分離した後、細胞をあらかじめ温めた低張緩衝液(Genial Genetics,GGS-JL006b)で処理し、37℃で30分間インキュベートした。続いて細胞をカーノイズ溶液(メタノールと酢酸の3:1混合液)で固定し、水に浸した紙シート上のガラススライドに滴下した。DAPI染色によって蛍光された染色体を数えることによって核型を決定した。Gバンド解析は株式会社日本遺伝子研究所(Sendai,Japan)によって行われた。
初期中胚葉様細胞(iMeLCs)は、StemFitTMで維持されたhiPSCsを、50 ng/ml アクチビンA,3 μM of CHIR99021 および 10 μM ROCK 阻害剤 (Y-27632; Wako Pure Chemical Industries)を含有するGK15培地[15% KSR, 0.1 mM NEAA, 2 mM L-glutamine,1 mM sodium pyruvate および 0.1 mM 2-メルカプトエタノールを含むGMEM (Life Technologies)] 中で、ヒトプラズマフィブロネクチン(Millipore,FC010)で被覆した12ウエルプレートに1ウエルあたり1.0-2.0x 105個播種して誘導した。1000 U/m1 LlF (Millipore,#LIF1005),200 ng/ml BMP4,100 ng/ml SCF (R&D Systems,455-MC),50 ng/ml EGF (R&D Systems,236-EG)、および 10μM ROCK 阻害剤を添加したGK15中で、low-cell-binding V-bottom96ウエルプレート(Thermo,81100574)に1ウエルあたり3.0 x 103個播種して誘導した。条件検討のため、iMeLCs または hPGCLC誘導のために、それぞれPD173074 (StemGent,#04-0008)または LDN193189 (StemGent,#04-0074)を添加した。このほかにも、CHIR99021に代えてWNT3A(R&D Systems,5036-WN)を、BMP4に代えてBMP2 (R&D Systems,355-BM)、BMP7 (R&D Systems,354-BP)、または BMP8A( R&D Systems,1073-BP)を使用した。
hPGCLCsを含む浮遊集合体を、0.05% Trypsin-EDTA/PBSに37℃10分間処理して分離した。FBS および0.1 % BSAを含むPBSで洗浄した後、細胞集塊を除去するために細胞懸濁液をセルストレーナー(BD Biosciences)を用いてろ過し、遠心分離した。回収した細胞をFACS buffer(PBS中0.1% BSA)に懸濁し、フローサイトメーター(ARIA III;BD Biosciences)で解析した。hPGCLCs またはhiPSCsの解析では、分離した細胞をAPC-結合抗ヒトCD326 (EpCAM)、 BV421-結合抗ヒト/マウスCD49f、 PE-結合抗-TRA-1-60、または FITC-結合抗-SSEA-4で染色した。さらに、Alexa fluor 647-結合抗-OCT3/4、Alexa Fluor 647-結合抗-NANOG または V450-結合抗-SOX2を用いた細胞内染色は、BD cytofix/Cytoferm Fixation/Permeabilization kit (BD,554714)を使用し、製造元の説明書にしたがって行った。用いた抗体を表1に示す。
cyESCs (CMK9)(カニクイザルES細胞)は、Dr.Suemori (Fujioka T, et al., Int J Dev Biol. 48, 1149-1154, 2004および;Suemori H, et al., Dev Dyn. 222, 273-279, 2001)より入手し、マウス胎児フィーダー細胞(mouse embryonic feeders (MEFs))と共に、常法のhESC培地[20%(vol/vol) KSR(Life Technologies)、1 mM of sodium pyruvate (Life Technologies、2 mM GlutaMax (Life Technologies)、0. 1 mM 非必須アミノ酸(Life Technologies)、0. 1 mM 2-メルカプトエタノール(Sigma-Aldrich)、1000 U/mL ESGRO mouse LIF( Millipore)、4 ng/ml 組換えヒト bFGF (Wako Pure Chemical Industries) を添加したDMEM/FI2 (Life Technologies)]で培養した。SC3-seq解析(Nakamura T, et al.,Nucleic Acids Res. 43, e60. 2015)を行うに際して、細胞は、CTK 溶液[0.25% トリプシン(Life Technologies)、0. 1 mg/mL of コラゲナーゼ IV (Life Technologies)、1 mM of CaCl2(Nacalai Tesque)]で処理後、37℃で約10分間、0.25% trypsin/PBS (Sigma-Aldrich)中で37℃、約10分間インキュベートした。その後、1% (vol/vol) KSR/PBS中に分散しシングルセルを得た。
PCRを行うためのRNA抽出は、RNeasy Micro Kit (QIAGEN)を用いて、製造者説明にしたがって行われた。1 ngの精製全RNAを使用したcDNAの合成と増幅、およびRNAシークエンスのためのcDNAライブラリーの構築は、Nakamura T, et al., Nucleic Acids Res. 43, e60. 2015に記載の方法により実施した。Q-PCRは、CFX384 real-time qPCR system (Bio-Rad)を使用して、Power SYBR Green PCR Master mix (Life Technologies)とともに増幅したcDNAを測定することで行われた。PPIA および ARBPの平均ΔCt値に標準化したΔCt (log2 スケール)を計算することにより、遺伝子発現レベルを評価した。用いたプライマーを表2(ヒト遺伝子)および表3(カニクイサル遺伝子)に示す。
ゲノムシークエンス[マウスGRCm38/mm10 、ヒトGRCh37/hg19、およびカニクイザル (Macaca fascicularis)MacFas5.0 ]および転写アノテーション(transcript annotation)(マウスref_GRCm38、ヒトref_GRCh37、およびカニクイザル ref_MacFas5.0 )をNCBI ftpサイト (ftp://ftp-trace.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/Macaca_fascicularis)から得た。
カニクイザル遺伝子とヒト遺伝子とを比較するために、ゲノム座標比較(genomic coordinate comparison)によって遺伝子の1対1対応表を作成した。初めに、すべてのヒト転写アノテーション(すべてのエキソンデータを含むref_GRCh37)を、LiftOver utility(https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgLiftOver)を使用して、カニクイザルのゲノム座標に変換した。LiftOver (hg19ToMacFas5.over.chain and macFas5ToHg19.over.chain)に使用されたチェーンファイル(chain files)を、 http://hgdownload-test.cse.ucsc.edu/goldenPath/から得た。次に、MacFas5.0座標におけるヒトゲノムアノテーションをref_MacFas5.0と比較し、続いて、MacFas5.0転写産物を座標化するための探索を行った。ref_MacFas5.0における同一の方法を実施して、ref_MacFas5.0における転写アノテーションがLiftOverを使用してhg19座標に変換され、さらに座標化したヒト転写産物の探索を行った。全17,932遺伝子を二種類の比較を用いて同定したところ、ヒト(24,968)およびカニクイザル遺伝子(29,437)の間で確定的に一致する遺伝子が認められた。ヒトおよびマウス遺伝子(ref_GRCm38,26,556 遺伝子)において、同一の比較を実施し、15,941遺伝子が一致する遺伝子が認められた。KLF2遺伝子はref_MacFas5.0でアノテートされなかったため、ヒトKLF2の対応する領域において本遺伝子のアノテーションをref_MacFas5.0 reference gff fileに追加した。
特異的に発現する遺伝子を解析するために、UHC 解析 (R3.1.1のEuclidean distancesおよびWard distance機能を伴う hclust 機能)およびPCA解析(R3.1.1のprcomp 機能)を用いた。このとき、最大log2(RPM+1)値が4より小さい遺伝子は除外した。hPGCLC誘導において特異的に発現する遺伝子(DEGs)を、一方向分散分析テスト(one-way Anova test)のP値(偽陽性率< 0.01、R3.1. 1の価値関数によって計算)および二つの逐次的時点間の折りたたみ変化(fold changes)(> 2)に基づいて選抜した。野生型の試料と比較したBLIMP1-/-細胞におけるDEGsは、student t-検定のP値(<0.05)および折りたたみ変化(> 2) に基づいて選抜した。GO解析はDAVID web tool (Huang da W, et al.,Nat Protoc. 4, 44-57, 2009)を使用して実施した。ヒートマップを、R3.1.1、gplotsパッケージのheatmap.2 functionを使用して作成した。RNA-seq データとGSE30056 データ (Affymetrix GeneChip Mouse Genome 430 2.0 Array)を比較するために、mESCsのRNA-seqデータを、mESCsアレイデータの標準曲線を用いて標準化した値を算出した。
hPGCLCsの免疫蛍光染色のため、iMeLCを介してBTAG 585B1-868 hiPSCsから誘導した8日目の細胞塊中のBTAG陽性細胞を、FACSで選別した後、BTAG 585B1-868 hiPSCsと1:1の比率で混合してMASコートスライドガラス(Matsunami)に広げた。このスライドを4%パラホルムアルデヒド(PFA)で15分間固定し、PBSで3回、PBSTで1回洗浄した。室温で5分間、0.5% triton Xを含むPBSで透過処理し、PBSで3回洗浄した。次に、本スライドをブロッキング溶液(5% normal goat serum,0. 2% tween 20,1xPBS)中、室温で2時間インキュベートし、4℃で一晩ブロッキング溶液に一次抗体を添加してインキュベーションした。PBSで6回洗浄した後、二次抗体を含むブロッキング溶液および1μg/mL の DAPIで本スライドを50分間インキュベートした。PBSで6回洗浄した後、Vectashield mounting medium (Vector Laboratories)を使用して共焦点レーザー走査顕微鏡解析(Olympus FV1000)を行った。5mCの免疫蛍光染色のために、4N HCl/0.1 % Triton X中で室温10分間処理したスライドを、PBSで2回洗浄した後ブロッキング溶液で処理した。使用した一次抗体および二次抗体に記載した。
二重生殖細胞系レポーターを有するhiPSCsの確立
hiPSCsから生殖細胞分化へのインビトロ誘導条件を調べるために、BLIMP1 (PRDM1としても知られる)およびTFAP2C (AP2γとしても知られる)に対するレポーターを有するhiPSC株を樹立した。BLIMP1 とTFAP2Cは、ヒトの生殖細胞で発現することが報告されているから有用と考えられた (Eckert D, et al., BMC Dev Biol. 8, 106, 2008およびPauls K, et al., Int J Cancer. 115, 470-477, 2005)。
最初に、前のう胚形成マウス外胚葉に酷似した過渡的状態であるmEpiLCsをmPGCLCsへ誘導する条件で(Hayashi K, et al.,Cell. 146, 519-532, 2011)、BTAG 585B1-868 hiPSCsが、hPGCLCsに直接誘導され得るかを調べた。BTAG hiPSCsをシングルセルに分離し、ROCK阻害剤存在下で、骨誘導因子4 (BMP4)、幹細胞因子(SCF)、白血病抑制因子(LIF)、および上皮成長因子(EGF) (3,000 細胞/細胞塊)などの主要なサイトカインを添加した、GMEM + 15% knockout serum replacement (KSR) (GK15)中、浮遊条件で培養した(図1B) (Watanabe K, et al., Nat Biotechnol. 25, 681-686, 2007)。
hiPSCs からBTAG陽性細胞を誘導する場合の遺伝子発現の動態を、定量的PCRによって調べた。hiPSCsは、多分化マーカー遺伝子であるPOU5F1、NANOGおよび SOX2を高または中程度のレベルで発現する一方で、KLF2、KLF4、TCL1B、TFCP2L1、ESRRB、およびDPPA3などの、マウスにおける原始的な多分化能に関連する遺伝子の発現は低い、または発現が確認できず(図1F)、Nakamura T, et al., Nucleic Acids Res. 43, e60. 2015の報告と一致した。しかし、hiPSCsは、ZFP42 およびPRDM14を比較的高いレベルで発現することに留意すべきである(図1F)。hiPSCsは、PGCs(BLIMP1, TFAP2C,NANOS3, DPPA3, DAZL、および DDX4)、神経外胚葉(PAX6 およびSOX1)、中胚葉(T,EOMES,EVX1, SP5,MIXL1, MSX2,および NODAL)並びに内胚葉(GATA4,GATA6,SOX17,および FOXA2)に関連する遺伝子が発現しない、または非常に低い発現しか認められなかった(図1F)。
さらに、サイトカイン刺激6日目のBTAG陽性細胞は、POU5F1 およびNANOG の発現を著しく増加させたが、SOX2にはその傾向が見えなかった (図1F)。これは、hPGCsがSOX2の発現を欠いている結果(de Jong J, et al.,J Pathol. 215, 21-30, 2008; Perrett RM, et al.,Biol Reprod. 78, 852-858, 2008)と矛盾するものはない。BLIMP1、TFAP2Cおよび NANOS3などのマウス早期PGCマーカーは、SOX17と同様に、高い発現レベルを示したが、DPPA3の発現は低く、DAZL およびDDX4などの後期PGC遺伝子は実質的な発現が確認できなかった(図1F)。BTAG陽性細胞において、マウスPGCの特定に必須なT および PRDM14 の発現量は低かった(図1F)。さらに、BTAG陽性細胞がマウスの原始多能性(KLF4,TCL1B,およびTFCP2L1)、中胚葉(EVX1 および MSX2)並びに内胚葉(GATA4)と関連する遺伝子を増加させることを見出した(図1F)。早期hPGCsの遺伝子発現特性に関する情報が欠如しているため確定は難しいが、BTAG陽性細胞が早期hPGCsに相当し得ることをこれらの知見は示唆している。これらは、hPSCが、生殖細胞運命を決定する能力を有する前/近‐のう胚形成外胚葉様の状態を表し得ることを示唆する。
初期中胚葉様状態を介したBTAG陽性細胞の強力な誘導
BTAG陽性細胞はhiPSCsから直接誘導されるが、細胞塊には死細胞が相当数含まれ、得られるBTAG陽性細胞は比較的少量であった (図1E)。浮遊細胞塊形成を経た生殖細胞分化への直接的な誘導は最適な経路ではない可能性があることから、hiPSCsを、生殖細胞分化誘導のための適切な前駆体へ誘導するための条件を検討した。生殖細胞分化に先立って、BMP4 および WNT3シグナルにより誘導される中胚葉系統への誘導が活性化されるというマウスにおける知見に基づいて(Aramaki S, et al., Dev Cell. 27, 516-529, 2013およびSaitou M, et al.,Nature. 418, 293-300, 2002)、BTAG陽性細胞を誘導するための前駆体を誘導するため、種々の細胞外マトリックス(ECM)構成成分の使用と同様に、hiPSCsをBMP4,WNT3,および他のシグナリング分子に前もって接触させる効果を調べた。
hPGCLCsとしてのBTAG陽性細胞の転写および誘導経路の解析
BTAG陽性細胞の特性および誘導経路をさらに理解するために、Nakamura T, et al., Nucleic Acids Res. 43, e60. 2015の技術を使用して、hiPSCs、iMeLCs、iMeLCsから誘導2日目(d2)、4日目(d4)、6日目(d6)および8日目(d8)のBTAG陽性細胞、およびhiPSCsから直接誘導された6日目(d6)のBTAG陽性細胞についてグローバルトランスクリプションプロファイル、ヒトPGCsに類似すると推測される非ヒト霊長類(カニクイザル;Macaca fascicularis)の生殖腺PGCsのグローバルトランスクリプションプロファイル、およびmPGCLCs (mESCs,mEpiLCs,d2 ,d4 ,d6 mPGCLCs)の特定に関連するグローバルトランスクリプションプロファイルを以下のとおり詳細に比較した。
d2 mPGCLC遺伝子のヒト相同遺伝子の多くが、hPGCLC誘導において、比較的一定した発現を示した(発現しないかまたは同レベルで発現する)。一方、d2 hPGCLC遺伝子のマウス相同遺伝子の少数のみが、d2 mPGCLCsにおける一過性の上方制御を示した(図4Eおよび図4G)。したがって、WNT5A、WNT5B、CFC1、EVX1、SNAI2および CDX2を含むが、Hox遺伝子を含まない、わずか16遺伝子が、d2 hPGCLC遺伝子およびd2 mPGCLC遺伝子において共通であった(図4Eおよび図12F)。
hPGCLCsの表面マーカーの探索
hiPSCsからhPGCLCsの誘導および同定を、蛍光レポーターなしで行うために、hPGCLCsを識別する表面マーカーを探索した。スクリーニングしたいくつかの表面マーカーのうち[PECAM (CD31),INTEGRINα6 (CD49f),INTEGRINβ3(CD61),KIT (CD117),EpCAM,PODOPLANIN,および TRA1-81]、EpCAM (APC-A channel) および INTEGRINα6 (Horizon V450-A channel)の組合せが、BTAG 585B1-868 hiPSCs から誘導された6日目細胞塊を、3つの別の個体群へと分離した。すなわち、高EpCAM および 高INTEGRINα6 (P3 gate)、高EpCAM および 低INTEGRINα6 (P4 gate),低 EpCAM および 低INTEGRINα6 (P5 gate)へと分離した (図5A)。高EpCAMおよび高INTEGRINα6個体群 (P3 gate)は、BTAG陽性hPGCLCsにほぼ同一であり (高EpCAMおよび高INTEGRINα6細胞の約98.9%がBTAG陽性細胞であった; BT:PE-Texas Red-A channel; AG: FITC-A channel)。他の個体群は、実質的にBTAGが陰性/弱陽性であった(図5A)。誘導の2日目には高EpCAMおよび高INTEGRINα6個体群は識別可能であり(約37%)、BTAG陽性個体群と実質的に同一であった(高EpCAMおよび高INTEGRINα6細胞の約98%がBTAG陽性であった)。その後、少なくとも8日目まで残存した(図5B)。
hPGCLC特定におけるBLIMP1の重要な機能
マウスPGCの特定に重要な転写因子であるBLIMP1のhPGCLCを特定するための役割について調べた。TALEN相同組換えストラテジーを使用して、TFAP2C-2A-EGFP対立遺伝子を有するhiPSC株を作製し(AG 585B1-17,19)、tdTomatoが発現してBLIMP1がターゲット対立遺伝子でノックアウトされるように、BLIMP1遺伝子のエクソン4をtdTomatoで入れ替えた(図6A、図14Aおよび図14B)。フレームシフト欠失のある他の対立遺伝子およびtdTomatoによって置換された、BLIMP対立遺伝子を一つ含むものと同様に(BLIMP1 homozygously knocked out clones: BLIMP1-/-)、BLIMP1をヘテロ接合的にターゲットしてノックアウトした数個のクローンを単離した(BTAG; BLIMP1+/-)(図6Aおよび図14B)。
Claims (20)
- ヒト多能性幹細胞からヒト始原生殖細胞様(PGC様)細胞を製造する方法であって、以下の工程I)及びII)を含む、方法:
I)ヒト多能性幹細胞を、アクチビンAおよびGSK3β阻害剤を含む培養液中で培養することにより中胚葉様細胞を製造する工程、
II)工程I)で得られた中胚葉様細胞を、BMPを含む培養液中で培養する工程。 - 前記工程I)の培養を60時間未満実施する、請求項1に記載の方法。
- 前記工程I)の培養を42時間実施する、請求項2に記載の方法。
- 前記GSK3β阻害剤が、CHIR99021である、請求項1に記載の方法。
- 前記工程I)において、培養液が線維芽細胞増殖因子受容体(FGFR)阻害剤をさらに含む、請求項1から4のいずれか1項に記載の方法。
- 前記FGFR阻害剤が、PD173074である、請求項5に記載の方法。
- 前記工程I)において、培養液がbFGFおよびBMPを含まない、請求項1から6のいずれか1項に記載の方法。
- 前記工程II)において、培養液が、SCF、EGFおよびLIFから成る群より選択される少なくとも一つのサイトカインをさらに含む、請求項1から7のいずれか1項に記載の方法。
- 前記多能性幹細胞が、無血清及び無フィーダー条件下で培養された多能性幹細胞である、請求項1から8のいずれか1項に記載の方法。
- 前記無フィーダー条件下での培養が、ラミニン511またはラミニン511断片上での培養である、請求項9に記載の方法。
- さらに、III)前記工程II)で得られた細胞から、PECAM (CD31)、INTEGRINα6 (CD49f)、INTEGRINβ3(CD61)、KIT (CD117)、EpCAM、PODOPLANINおよびTRA1-81から成る群より選択される少なくとも一つの細胞表面マーカーが陽性である細胞を選択する工程を含む、請求項1から10のいずれか1項に記載の方法。
- 前記工程III)が、INTEGRINα6 (CD49f)及びEpCAMの二重陽性細胞を選択する工程である、請求項11に記載の方法。
- 前記ヒト多能性幹細胞が、ヒトiPS細胞である、請求項1から12のいずれか1項に記載の方法。
- 以下の(1)及び(2)を含む、ヒト多能性幹細胞からヒト始原生殖細胞様(PGC様)細胞への分化誘導用試薬キット:
(1)アクチビンAおよびGSK3β阻害剤を含む、ヒト多能性幹細胞から中胚葉様細胞への誘導用試薬、
(2)BMPを含む、中胚葉様細胞からヒト始原生殖細胞様(PGC様)細胞への誘導用試薬。 - 前記GSK3β阻害剤が、CHIR99021である、請求項14に記載のキット。
- 前記(1)の誘導用試薬が、線維芽細胞増殖因子受容体(FGFR)阻害剤をさらに含む、請求項14または15に記載のキット。
- 前記FGFR阻害剤が、PD173074である、請求項16に記載のキット。
- 前記(2)の誘導用試薬が、SCF、EGFおよびLIFから成る群より選択される少なくとも一つのサイトカインをさらに含む、請求項14から17のいずれか1項に記載のキット。
- さらに、(3)PECAM (CD31)、INTEGRINα6 (CD49f)、INTEGRINβ3(CD61)、KIT (CD117)、EpCAM、PODOPLANINおよび TRA1-81から成る群より選択される少なくとも一つの細胞表面マーカーの各々に対する抗体を含む、ヒト始原生殖細胞様(PGC様)細胞の単離用試薬を含む、請求項14から18のいずれか1項に記載のキット。
- 前記(3)の単離用試薬が、INTEGRINα6 (CD49f)に対する抗体及びEpCAMに対する抗体を含む、請求項19に記載のキット。
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