JP6748643B2 - ペットの動物の歯垢を定量化する方法 - Google Patents

Description

本発明は、伴侶動物の歯垢のレベルおよび／または病変部を検出して定量化する方法、および、口腔衛生製品の試験中におけるそのような情報の使用に関する。開示される方法は、口腔衛生製品に対する長期間の高価な試験を行う必要なく、より短期間での伴侶動物の試験を可能にする。記載される方法は、意識のある状態のペットの動物に対して行われる。

ペットの動物の口腔衛生を維持または改善する必要性が重視されている。劣悪な口腔衛生は歯周病につながり得るものであり、歯周病はペットの動物の健康に対する深刻な影響を有し得る。

ペットの動物、特に犬および猫は、一生を通して歯周病に悩まされることがよく知られている。歯周病の全てのケースにおいて、病気を引き起こす原因物質は歯垢である。歯垢は、細菌性生物膜が堆積したものである。歯垢が除去されない場合、歯垢は硬化して歯石を形成するか、または、歯肉炎、歯肉の後退、最終的には歯の損失、および他の歯周病を生じる。ペットの動物の細菌性堆積物（歯垢）の低減または制御は、通常、機械的手段（例えば、単純に歯をブラッシングすること、または、ペットの動物に、歯から歯垢を掻き取るチューまたはペット用おやつを与えること等）によって行われる。しかし、機械的手段による歯垢の除去は、ペットの動物がペット用おやつまたはチューを噛むことに十分な時間を費やすこと、および／または、ペットの所有者が、ペットの動物の歯を定期的にブラッシングすることを順守すること（これは、所有者がしばしば困難に思うことである）に依拠している。

動物の歯にある歯垢が硬化して歯石になると、更なる歯垢が蓄積し、それにより、歯垢を除去するために機械的手段を使用することの効果が低下し、ペットの動物の歯周病につながり得る。そのような歯石を歯から除去することは、獣医によって、動物を麻酔にかけることによってのみ可能であり、これにはある程度のリスクを伴う。

典型的には、ペットの動物の口腔ケア製品の試験においては、試験は、歯垢を除去および／または制御することについての試験組成物の有効性を評価するよう設計され、試験の継続期間にわたって、歯のブラッシングは行われない。これらの試験は、試験組成物の有効性を決定するために高々２８日間かかり得る。この理由は、歯垢の堆積および歯石の形成の影響をはっきりと観察できるのは２８日目であり、従って、試験組成物の有効性（即ち、歯垢および歯石の堆積の低減における有効性）は、期間が長いほど正確になるからである。

更に、試験中に、熟練した人間が、歯における歯垢および／または歯石のレベルを決定するために、または、最小限でも、試験開始前に歯石除去および歯磨きを行うために、通常は、ペットの動物に全身麻酔をかける必要がある。

米国獣医口腔衛生委員会（Veterinary Oral Health Council：ＶＯＨＣ）は、製品の有効性試験を行う際に、口全体の評価を取得するために評価され得る、猫および犬の歯の推奨リストを提供している。ＶＯＨＣ推奨の歯のリストは以下の通りである。
犬：上顎−Ｉ３、Ｃ、Ｐ３、Ｐ４、Ｍ１。下顎−Ｃ、Ｐ３、Ｐ４、Ｍ１（１８本の歯）。
猫：上顎−Ｃ、Ｐ３、Ｐ４。下顎−Ｃ、Ｐ３、Ｐ４、Ｍ１（１４本の歯）。

ペットの動物の歯垢および／または病変部を検出する標準的な臨床的方法は、ペットの動物を麻酔して、歯垢および／または病変部の存在を示すためにペットの動物の歯を着色する染料を塗布することである。次に、（歯垢／歯石の堆積を評価するスキルに関して訓練された）人間の採点者が、着色の被覆率および染料の明るさを主観的に採点して、各歯における歯垢のレベルおよび厚さを決定し、ペットの動物の歯垢の口全体の評価を決定する。そのような方法は、確立されているローガン−ボイス（Logan and Boyce）法に基づくものである。（Hillsによって開発された）歯肉輪郭歯垢指数（Gingival Contour Plaque Index：ＧＣＰＩ）として知られているより最近の臨床的方法は、意識のある状態の犬に対して行われ得るものであり、人間の採点者は、ＶＯＨＣ推奨の各歯における歯垢の長さを示すために、歯肉輪郭プローブ（測定プローブ）を用いて、歯肉縁の横断方向の歯垢の長さを主観的に測定し、次に、各動物についての口全体の評価を決定し得る。

標準的な臨床的方法は、動物用の複数の全身麻酔剤を必要とすると共に、標準的な臨床的方法およびＧＣＰＩ法の両方には、人間の主観性によって生じるばらつきが生じる。これは、それらの方法の精度を低下させ、このことは、効果を測定するために、より正確で再現可能な方法である場合よりも多数の動物が必要であることを意味する。更に、上記の公知の標準的な臨床的方法は、必要なＶＯＨＣ推奨の歯における歯垢および／または歯石の平均を評価し、次に口全体の評価を取得することによって、被検体の歯垢および／または歯石を検出する方法論を用いる。

従って、上記の方法は実行するのが高価であり、これらの種類の試験を行うことができる場所は世界的に限られている。

従って、より正確で、より主観性が低く、評価の各工程の繰り返しが容易であり、ペットの動物を麻酔する必要がなく、口腔疾患を防止および／または処置するのに必要な高い基準でペットの動物の歯垢のレベルを決定および評価できる、口腔ケア製品の有効性試験の必要性がある。更に、この採点方法のために、さほど高度に訓練されていない人間を用いる必要性、および試験を受ける動物の総数を減らす必要性がある。

本発明の第１の態様において、被検体の口腔内の基質を検出して定量化する方法が提供される。本方法は、（i）蛍光を検出できる画像撮影装置を用いて、意識のある状態の被検体の１以上の歯の１以上の画像を取得する工程と、（ii）画像を解析する工程と、（iii）各被検体の各歯における基質の被覆率を定量化する工程とを含み、試験群の被検体が伴侶動物であることを特徴とする。

本発明の方法によって検出されて定量化される口腔内の基質は、齲蝕病変部、歯垢、細菌、歯石、着色、および／または、それらの任意の組合せであり得る。検出される口腔内の基質は、歯に形成された早期段階の歯垢であるのが好ましい。

本発明の方法に関与する被検体は、伴侶動物であり得る。伴侶動物は、犬、猫、馬、または他の任意の歯周病にかかった、またはかかりやすい伴侶動物であり得る。伴侶動物は犬または猫であるのが好ましい。

動物は、工程（i）の前に、画像が撮影される時間中、おとなしく／静止しているよう訓練され得る。動物を、１以上の画像を撮影するのにかかる時間の長さにわたって静止しているよう訓練することにより、より正確な画像のセットを取得できる。これは明らかに、歯垢の堆積レベルのより正確な評価につながる。

本発明の方法の被検体は、意識がある状態である（即ち、麻酔を受けていない）。

本方法は、動物の口の半分（例えば、動物の口の上半分または下半分）にある歯の１以上の画像を撮影することを含み得る。口の半分は、左半分または右半分であってもよい。１以上の歯は、上半分のみ、即ち、試験郡の動物および対照群の動物の上顎に位置するのが好ましい。本方法は、犬については１８本より少ない歯、および猫については１４本より少ない歯を評価することを含み得る。

基質の被覆率は、１以上の歯の各々の蛍光を発する領域のサイズ、および／または、蛍光の強度によって決定される基質の深さに関するものであり得る。

解析は、定性的光励起蛍光法技術（ＱＬＦ（商標））を用いて行われ得る。

本発明の第２の態様において、伴侶動物である被検体の口腔内の基質を低減、防止、および／または処置することにおける試験組成物の有効性を決定するための試験において、被検体の口腔内の基質を検出して定量化する方法が提供される。本方法は、（i）蛍光を検出できる画像撮影装置を用いて、試験の開始時（０日目）における、意識のある状態の試験群の被検体および意識のある状態の対照群の被検体の１以上の歯の１以上の画像を取得する工程と、（ii）０日目における各被検体の各歯における基質の被覆率を定量化するために、画像を解析する工程と、（iii）試験の継続期間にわたって、試験群の被検体に試験組成物を投与すると共に、対照群の被検体に対照組成物を投与する工程と、（iv）試験中に所定の間隔で、試験群の被検体および対照群の被検体の各々の工程（i）と同じ１以上の歯の１以上の画像を取得する工程と、（v）各被検体の各歯における基質の被覆率およびサイズを決定して定量化して、試験の開始時および試験の各段階における画像と比較するために、画像を解析する工程と、（vi）試験群の被検体と対照群の被検体との１以上の歯の基質の被覆率を比較する工程と、（vii）被検体の口腔内の基質および／または歯周病を低減、防止、および／または処置することにおける試験組成物の有効性を決定する工程とを含む。

試験群の被検体と対照群の被検体とは同じ被検体であってもよい（例えば、クロスオーバー試験設計において）。

本方法は、動物の口の半分（例えば動物の口の上半分または下半分）にある歯の１以上の画像を撮影することを含み得る。口の半分は、左半分または右半分であってもよい。１以上の歯は、上半分のみ、即ち、試験群の動物および対照群の動物の上顎に位置するのが好ましい。本方法は、犬については１８本より少ない歯、および猫については１４本より少ない歯を評価することを含み得る。

本発明の方法において用いられる組成物は、伴侶動物によって消費される、および／または、伴侶動物に投与される任意のペット用製品であり得る。ペット用製品は、ドライタイプ、セミモイストタイプ、ウェットタイプの食餌、液体、ペット用スナック菓子（例えば、スナックバー、ペット用チュー、カリカリしたおやつ、シリアルバー、スナック、ビスケット、および甘味製品）、並びにサプリメント等の食品を含む。食品サプリメントは、別の食品と共にまたは単独で投与可能な、粉末、ソース、トッピング、ビスケット、キブル、ポケットタイプまたはタブレットであり得、食品と混ぜられてもよく、食品に振りかけられてもよく、別々に出されてもよく、または、飲料として提供される液体（例えば、水もしくはミルク等）に追加されてもよい。

組成物は、食品、ペット用おやつ、および／または、ペット用チューであるのが好ましい。

対照組成物は、例えば、National Research Council, 1985, Nutritional Requirements for Dogs, National Academy Press, Washington DC (ISBN:0-309-03496-5)またはAssociation of American Feed Control Officials, Official Publication 1996に記載されているような、該当する犬に対して推奨されるビタイミンおよびミネラルの全てを提供する完全なバランスのとれた食品であり、試験組成物と同等の栄養を有するが、伴侶動物の口腔内の基質および／または歯周病を低減、防止、および／または処置することにおけるいかなる活性成分も有しない、または、何らかの有益な効果を有することを主張していない、任意の市販のペットフード製品であり得る。

試験組成物は、伴侶動物の口腔内の基質および／または歯周病を低減、防止、および／または処置することにおける活性成分を有する、および／または、有益な効果を有すると考えられる任意のペットフード製品であり得る。

典型的には、ペット用製品の試験は、試験組成物の有効性を決定するために高々２８日間かかる。この理由は、試験に関与するペットの動物に対する歯垢の堆積および歯石の形成の影響は、試験期間が長いほど（例えば、２８日目以降に）、試験に関与するペットの動物の歯垢および歯石の形成を可能にするので、より正確に観察できるからである。本発明の方法は、かなり短い期間（最短３日間程度）で試験を行うことができることにより、関与するペットの動物における歯石の形成を防止するという長所を有する。これは、歯から歯垢をより容易に除去でき、試験中に対照フード製品を与えられる動物の口腔衛生を維持できるので、被検体であるペットの動物の健康に明らかに寄与する。

本発明の重要な態様は、人間の採点者に生じ得る、評価のいかなる主観性も取り除くことである。「ＱＬＦ」または類似のソフトウェアプラットフォームの使用は、歯垢および／または歯石のレベルが客観的に評価され、真の定性的および／または定量的な結果が取得されることを確実にする。

更なる重要な態様は、１以上の画像が取得される間に動物が静止しているよう、動物を訓練することである。過去には、歯垢の堆積に関する情報を取得するために、動物を意識の無い状態にするために、麻酔剤が用いられていた。しかし、先に論じたように、伴侶動物に対する麻酔剤の使用には、幾つかのリスクがある。意識のある状態の訓練されていない動物は、非常に動き回る傾向があるので、１以上の歯の１以上の画像を取得するのは非常に困難になる。本発明においては、画像を取得する前に、動物が訓練され得る。訓練は、動物が画像の撮影によって驚かない、または混乱しないので、動物のストレスレベルがより低くなり、動物の健康に寄与するという有益な効果も有する。

第１の態様の全ての態様は、必要な変更を加えて、本発明の第２の態様にも適用される。

口腔内の細菌の幾つか（これらは、伴侶動物の口腔内の歯垢および歯石の時間基準を構成する）は自己蛍光性であることがよく知られている。

蛍光は、吸収された放射より長い波長および低いエネルギーを有する発光である。蛍光は、様々な手段によって検出され得る。具体的には、様々な光源を励起源として用いて、より低いエネルギーの発光（典型的には可視光であるが、必ずしもそうでなくてもよい）を生じさせる。次に、この光は、所与の波長において検出される。

本発明の方法は、蛍光を検出できる画像撮影装置を用いる。そのような装置は、当該技術分野においてよく知られている。

蛍光の検出は、蛍光を検出する任意の装置を用いて行うことができる。蛍光は、被検体の歯の表面および／またはエナメル質内から発せられる。

蛍光の検出は、光を検出する任意の手段および／または装置によって達成され得る。蛍光は、目視によってまたは適切なフィルタを通して見ることができる。蛍光の検出およびその強度の測定は、適切な検出器およびエミッションフィルタを用いて行うことができる。これは、適切な暗い環境に設置されたＣＣＤ検出器の前に配置された適切なフィルタと、適切なソフトウェアとを備えた、デジタルカメラまたは類似の装置であり得る。光を検出する手段および／または装置は、目視用であってもよく、または蛍光の検出を可能にするフィルタを有する特殊な写真手段を有してもよい。

画像撮影装置は、蛍光を検出できるものである。蛍光は、８００ｎｍ未満、好ましくは４５０ｎｍ未満の波長において検出され得る。蛍光放射は４０５ｎｍの波長であるのが最も好ましい。画像撮影装置は、３００〜８００ｎｍ、４００〜５００ｎｍ、３５０〜７００ｎｍ、または４０５〜４５０ｎｍの波長範囲の蛍光を検出できる。

画像撮影装置（例えばデジタルカメラ等）は、試験の開始時（０日目）に、被検体の１以上の歯の最初の画像を撮影でき、後続の画像は、試験中の所定のときに撮影される。

０日目に撮影された画像と、例えば３日目、７日目、１４日目、および／または２１日目に撮影された後続の画像とは、互いに比較され、および／または、試験群の被検体と対照群の被検体との間で比較される。試験中の歯垢形成領域、歯垢形成の低減領域、歯石の形成領域、および／または歯石形成の低減領域はハイライトされ、画像解析ソフトウェアを用いて定性的に採点または定量化され得る。

蛍光の検出は、定性的または定量的に測定され得る。高度に訓練された熟練した人間の採点者を用いる現在の臨床採点方法は、蛍光、またはペットの動物の歯の歯垢を検出するために用いられる染料の色の変化を、定性的および／または（０〜４の点数を与えて）半定性的に決定する。本発明の方法は、試験中の各インターバルにおける歯垢形成の量、および／または歯垢形成の低減の量を比較するために、試験の開始時および試験中の各インターバルにおいて、基質の被覆率を、各被検体の各歯における面積および深さに関して定量化する。

本発明は、定量的光励起蛍光法技術（「ＱＬＦ」）を用い得る。

本発明の方法における基質の解析は、被検体の口腔内の基質および／または歯周病を低減、防止、および／または処置することにおける試験組成物の有効性を決定することを補助できる。

伴侶動物の歯の表面に形成された歯垢の蛍光を検出するために、「ＱＬＦ」が用いられ得る。「ＱＬＦ」は比較的新しい方法であり、現在、人間の歯垢の定量化については妥当性が確認されている。「ＱＬＦ」は、青色光および自然光を用いて、着色剤を用いてまたは用いずに歯垢および歯石の視覚化、およびそれに続く定量化を可能にする。「ＱＬＦ」は、青色光の下における細菌種の自家蛍光に依拠している。画像は、デジタルカメラを用いてリアルタイムで撮影され、歯垢および歯石の被覆率を定量化するために画像解析ソフトウェアを用いて解析される。或いは、より多くの歯垢が見えるようにするために、歯垢は、（当業者に知られている）標準的な染め出し液を用いて染め出され得る。この技術は、ユーザが、ミネラルの損失、歯垢／歯石の深さ、歯垢／歯石のサイズ、着色のサイズ、および重症度等のパラメータを、高い精度および繰り返し性で定量化するのを可能にする。ソフトウェアによる解析は、病変部面積（ｍｍ^２）、歯垢の／歯石の深さ（蛍光の割合（ΔＦ（単位は％））、および病変部の体積（ΔＱ（単位はｍｍ^２））を決定できる。

「ＱＬＦ」は、歯垢／歯石レベルを評価するための方法において用いられるのに適した技術であり、従って、本発明の犬における製品の有効性を試験する方法において用いられるのに適している。「ＱＬＦ」は、ペットの動物に全身麻酔剤を与える必要なく、迅速な試験を可能にする。

本発明は（第３の態様として）、試験中に、試験組成物の有効性を決定するために、１以上の歯における歯垢および／または歯石の存在または量を決定するための、意識のある状態の犬における蛍光の使用にも関する。

第１および第２の態様の全ての特徴は、必要な変更を加えて、第３の態様にも関係する。

典型的には、本発明より前には、被検体の歯石に対する試験組成物の効果を決定するための試験期間は高々２８日間である。典型的には、歯垢に対する有効性を決定するための試験については、本発明は、試験期間は、３日間、５日間、または７日間程度の少ない日数であってもよいと判断した。

本発明の方法は、高々１４日間の試験期間で行われる。幾つかの実施形態では、試験期間は少なくとも７日間である。幾つかの実施形態では、試験期間は３〜７日間である。

本発明の方法は、意識のある状態のペットの動物における歯垢形成の進行を正確に測定できる。

本方法は、当該技術分野において知られている従来の方法の期間よりも短い、例えば３日間、４日間、７日間、１４日間、または２１日間等の期間で、正確な歯垢および／または歯石の検出を行うことを可能にする。

本発明は、被検体に麻酔せずに、１以上の歯に歯垢および／または歯石が存在するか否かの迅速且つ正確な決定を提供できる。

本発明の第４の態様は、「ＱＬＦ」を用いて、猫の口腔内の基質を検出して定量化する方法である。猫は意識があってもよく、または、意識が無くてもよい。

本発明の第４の態様において、猫の口腔内の基質を検出して定量化する方法が提供される。本方法は、（i）蛍光を検出できる画像撮影装置を用いて、猫の１以上の歯の１以上の画像を取得する工程と、（ii）画像を解析する工程と、（iii）猫の各歯における基質の被覆率を定量化する工程とを含む。

検出されて定量化される口腔内の基質は、齲蝕病変部、歯垢、細菌、歯石、着色、および／または、それらの任意の組合せであり得る。検出される口腔内の基質は、歯に形成された早期段階の歯垢であるのが好ましい。

本方法は、猫の口の半分（例えば、猫の口の上半分または下半分）にある歯の１以上の画像を撮影することを含み得る。口の半分は、左半分または右半分であってもよい。１以上の歯は、上半分のみ、即ち、試験群の猫および対照群の猫の上顎に位置するのが好ましい。本方法は、猫の口の中にある１４本より少ない歯を評価することを含み得る。

基質の被覆率は、１以上の歯の各々の蛍光を発する領域のサイズ、および／または、蛍光の強度によって決定される基質の深さに関するものであり得る。

解析は、定性的光励起蛍光法技術（「ＱＬＦ」）を用いて行われる。

本発明の第５の態様において、猫の口腔内の基質を低減、防止、および／または処置することにおける試験組成物の有効性を決定するための試験において、猫の口腔内の基質を検出して定量化する方法が提供される。本方法は、（i）蛍光を検出できる画像撮影装置を用いて、試験の開始時（０日目）における試験群の猫および対照群の猫の１以上の歯の１以上の画像を取得する工程と、（ii）０日目における各被検体の各歯における基質の被覆率を定量化するために、画像を解析する工程と、（iii）試験の継続期間にわたって、試験群の被検体に試験組成物を投与すると共に、対照群の被検体に対照組成物を投与する工程と、（iv）試験中に所定の間隔で、試験群の猫および対照群の猫の各々の工程（i）と同じ１以上の歯の１以上の画像を取得する工程と、（v）各被検体の各歯における基質の被覆率およびサイズを決定して定量化して、試験の開始時および試験の各段階における画像と比較するために、画像を解析する工程と、（vi）試験群の猫と対照群の猫との１以上の歯の基質の被覆率を比較する工程と、（vii）猫の口腔内の基質および／または歯周病を低減、防止、および／または処置することにおける試験組成物の有効性を決定する工程とを含む。

試験群の猫と対照群の猫とは同じ猫であってもよい（例えば、クロスオーバー試験設計において）。

猫は意識があってもよく、または意識が無くてもよい。

本方法は、猫の口の半分（例えば、猫の口の上半分または下半分）にある歯の１以上の画像を撮影することを含み得る。口の半分は、左半分または右半分であってもよい。１以上の歯は、上半分のみ、即ち、試験群の猫および対照群の猫の上顎に位置するのが好ましい。本方法は、猫の口の中にある１４本より少ない歯を評価することを含み得る。

本発明の方法において用いられる組成物は、猫によって消費されるおよび／または猫に投与される任意のペット用製品であり得る。ペット用製品は、例えば、ドライタイプ、セミモイストタイプ、ウェットタイプの食餌、液体、ペット用スナック菓子（例えば、スナックバー、ペット用チュー、カリカリしたおやつ、シリアルバー、スナック、ビスケット、および甘味製品）、並びにサプリメント等の食品を含む。食品サプリメントは、別の食品と共にまたは単独で投与可能な、粉末、ソース、トッピング、ビスケット、キブル、ポケットタイプまたはタブレットであり得、食品と混ぜられてもよく、食品に振りかけられてもよく、別々に出されてもよく、または、飲料として提供される液体（例えば、水もしくはミルク等）に追加されてもよい。

組成物は、食品、ペット用おやつ、および／または、ペット用チューであるのが好ましい。

対照組成物は、該当する猫に対して推奨されるビタイミンおよびミネラルの全てを提供する完全なバランスのとれた食品であり、試験組成物と同等の栄養を有するが、猫の口腔内の基質および／または歯周病を低減、防止、および／または処置することにおけるいかなる活性成分も有しない、または、何らかの有益な効果を有することを主張していない、任意の市販のキャットフード製品であり得る。

試験組成物は、猫の口腔内の基質および／または歯周病を低減、防止、および／または処置することにおける活性成分を有する、および／または、有益な効果を有すると考えられる任意のキャットフード製品であり得る。

本発明の重要な態様は、人間の採点者に生じ得る、評価のいかなる主観性をも取り除くことである。「ＱＬＦ」または類似のソフトウェアプラットフォームの使用は、歯垢および／または歯石レベルが客観的に評価され、真の定性的および／または定量的結果が取得されることを確実にする。

第４の態様の全ての態様は、必要な変更を加えて、本発明の第５の態様にも適用される。

本発明の方法は、蛍光を検出できる画像撮影装置を用いる。そのような装置は、当該技術分野においてよく知られている。

蛍光の検出は、蛍光を検出する任意の装置を用いて行うことができる。蛍光は、被検体の歯の表面および／またはエナメル質内から発せられる。

蛍光の検出は、光を検出する任意の手段および／または装置によって達成され得る。蛍光は、目視によってまたは適切なフィルタを通して見ることができる。蛍光の検出およびその強度の測定は、適切な検出器およびエミッションフィルタを用いて行うことができる。これは、適切な暗い環境に設置されたＣＣＤ検出器の前に配置された適切なフィルタと、適切なソフトウェアとを備えたデジタルカメラまたは類似の装置であり得る。光を検出する手段および／または装置は、目視用であってもよく、または蛍光の検出を可能にするフィルタを有する特殊な写真手段を有してもよい。

画像撮影装置は、蛍光を検出できるものである。蛍光は、８００ｎｍ未満、好ましくは４５０ｎｍ未満の波長において検出され得る。蛍光放射は４０５ｎｍの波長であるのが最も好ましい。画像撮影装置は、３００〜８００ｎｍ、４００〜５００ｎｍ、３５０〜７００ｎｍ、または４０５〜４５０ｎｍの波長範囲の蛍光を検出できる。

画像撮影装置（例えばデジタルカメラ等）は、試験の開始時（０日目）に、被検体の１以上の歯の最初の画像を撮影でき、後続の画像は、試験中の所定のときに撮影される。

０日目に撮影された画像と、例えば３日目、７日目、１４日目、および／または２１日目に撮影された後続の画像とは、互いに比較され、および／または、試験群の被検体と対照群の被検体との間で比較される。試験中の歯垢形成領域、歯垢形成の低減領域、歯石の形成領域、および／または歯石形成の低減領域はハイライトされ、画像解析ソフトウェアを用いて定性的に採点または定量化され得る。

蛍光の検出は、定性的または定量的に測定され得る。高度に訓練された熟練した人間の採点者を用いる現在の臨床採点方法は、蛍光、またはペットの動物の歯の歯垢を検出するために用いられる染料の色の変化を定性的および／または（０〜４の点数を与えて）半定性的に決定する。本発明の方法は、試験中の各インターバルにおける歯垢形成の量、および／または歯垢形成の低減の量を比較するために、試験の開始時および試験中の各インターバルにおいて、基質の被覆率を、各被検体の各歯における面積および深さに関して定量化する。

本発明は、定量的光励起蛍光法技術（「ＱＬＦ」）を用い得る。

本発明の方法における基質の解析は、猫ｓの口腔内の基質および／または歯周病を低減、防止、および／または処置することにおける試験組成物の有効性を決定することを補助できる。

伴侶動物の歯の表面に形成された歯垢の蛍光を検出するために、「ＱＬＦ」が用いられ得る。「ＱＬＦ」は比較的新しい方法であり、現在、人間の歯垢の定量化については妥当性が確認されている。「ＱＬＦ」は、青色光および自然光を用いて、着色剤を用いてまたは用いずに歯垢および歯石の視覚化、およびそれに続く定量化を可能にする。「ＱＬＦ」は、青色光の下における細菌種の自家蛍光に依拠している。画像は、デジタルカメラを用いてリアルタイムで撮影され、歯垢および歯石の被覆率を定量化するために画像解析ソフトウェアを用いて解析される。或いは、より多くの歯垢が見えるようにするために、歯垢は、（当業者に知られている）標準的な染め出し液を用いて染め出され得る。この技術は、ユーザが、ミネラルの損失、歯垢／歯石の深さ、歯垢／歯石のサイズ、着色のサイズおよび重症度等のパラメータを高い精度および再現性で定量化するのを可能にする。ソフトウェアによる解析は、病変部面積（ｍｍ^２）、歯垢の／歯石の深さ（蛍光の割合（ΔＦ（単位は％））、および病変部の体積（ΔＱ（単位はｍｍ^２））を決定できる。

「ＱＬＦ」は、歯垢／歯石レベルを評価するための方法において用いられるのに適した技術であり、従って、本発明の猫における製品の有効性を試験する方法において用いられるのに適している。

本発明は、試験される動物の口の１以上の歯、口の上顎または下顎の１以上の歯、口の顎の右下側、右上側、顎の左下側、もしくは左上側の１以上の歯、またはそれらの組合せ（例えば、口の半分（上顎／下顎、顎の右側／左側）または口の４分の１の解析）の画像を用いた、動物の口の歯垢および／または歯石の堆積の正確な評価を可能にする。具体的には、本発明は、単に、口の上顎の１以上の歯の歯垢および／もしくは歯石の量を検出し、試験対象の動物の口全体の歯垢および／もしくは歯石の量を正確に相関することにより、並びに／または、口の上顎の１以上の歯の歯垢および／もしくは歯石の量を検出して、対照群と試験群との差を検出することにより、試験対象の動物の口内の歯垢および／または歯石の量を決定できるという長所を有する。本方法は、犬については１８本より少ない歯、および猫については１４本より少ない歯を評価して、口全体の評価を決定できる。本方法は、犬の１８本より少ない、１７本、１６本、１５本、１４本、１３本、１２本、１１本、１０本、９本、８本、７本、６本、５本、４本、３本、２本の歯、または１本の歯を評価して、口全体の評価を決定できる。本方法は、猫の１４本より少ない、１３本、１２本、１１本、１０本、９本、８本、７本、６本、５本、４本、３本、２本の歯、または１本の歯を評価して、口全体の評価を決定できる。

これは、本発明が、意識のある状態のペットの動物において行うことができるだけでなく、より短い時間枠（２８日間ではなく、３日間、７日間、１４日間、２１日間）で試験結果を提供でき、また、口の上顎または下顎の１以上の歯、口の顎の右下側、右上側、顎の左下側、左上側、またはそれらの組合せの１以上の歯の蛍光を測定することによって、被検体である動物の口全体の歯垢および／または歯石の量を決定できるという、従来公知の方法に対する長所を提供する。本発明は、ペット産業に対して、より速く且つより信頼性の高い方法論を決定する。

次に、以下の実施例および図面を参照して本発明を更に説明する。実施例および図面は単に説明の目的で提供されるものであり、本発明を限定するものとは解釈されない。

従った試験設計（２１日間の継続期間）を表す図を示す 犬の口全体（上顎および下顎）、および口の中の歯をラベル付けするためにそれぞれ用いられた付番方式を表す図を示す 犬毎、日毎の口の平均歯垢被覆率（％）の結果を示す 図３−１の続き ２例の犬についての各繰り返しについての経時的な歯毎の歯垢被覆率（％）の個々の歯の結果を示す 図４−１の続き 図４−２の続き 歯毎、犬毎、および撮影者毎の歯垢被覆率（％）のエビデンスとしての、染め出しを行っていない個々の歯１０３〜１０８についての結果の再現性を示す 歯毎、犬毎、および撮影者毎の歯垢被覆率（％）のエビデンスとしての、染め出しを行っていない個々の歯２０３〜２０８についての結果の再現性を示す 日毎、犬毎、および撮影者毎の染め出しを行っていない歯に対する「ＱＬＦ」によって決定された歯垢被覆率（％）（口全体の平均：Ｉ３、Ｃ、Ｐ３、Ｐ４）を示す 犬毎、日毎、および繰り返し毎の染め出しを行っていない歯に対する「ＱＬＦ」によって決定された歯垢被覆率（％）（上顎のＰ１、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ４を含む口全体の平均）の変動のプロット 図８−１の続き 意識のある状態の口腔ケアチューを与えられた犬（円）とチューを与えられなかった犬（三角形）とを比較した、１週目、２週目、３週目、および４週目における口全体（上顎のＩ３、Ｃ、Ｐ３、およびＰ４）の平均歯垢率（％）を示す（平均は９５％信頼区間での実線の形状として示されている） 染め出しを行った４本の歯のサンプルに対する、「Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ」（登録商標）において歯垢を採点する５人の人間の採点者によって識別された歯垢、および「ＱＬＦ」ソフトウェアによって識別された歯垢の視覚的表現 上顎の第３切歯、上顎の犬歯、並びに第３および第４小臼歯［１０３、１０４、１０７、１０８、１０９］（染め出しを行った歯）に対する、「Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ」において歯垢を採点した５人の人間の採点者（三角形および正方形）によって識別された平均歯垢被覆率（％）、および「ＱＬＦ」ソフトウェア（円）によって識別された平均歯垢被覆率（％）の変動のチャート 下顎の犬歯、並びに第３および第４小臼歯［４０４、４０７、４０８、および４０９］（染め出しを行った歯）に対する、「Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ」において歯垢を採点した５人の人間の採点者（三角形および正方形）によって識別された平均歯垢被覆率（％）、および「ＱＬＦ」ソフトウェア（円）によって識別された平均歯垢被覆率（％）の変動のチャート ２方向クロスオーバー試験（清潔な口のモデル）における、口腔ケアチューを与えられた場合の、チューを与えられなかった場合と比較した、歯垢の蓄積の１５％の低減を検出するための累乗曲線を示す 口腔ケアチューを与えられた場合とチューを与えられなかった場合とを比較した、意識のある状態の犬の上顎のみ（Ｉ３、Ｃ、Ｐ３、Ｐ４）（円）、並びに、意識の無い状態の犬の上顎（Ｉ３、Ｃ、Ｐ３、Ｐ４、Ｍ１）および下顎（Ｃ、Ｐ３、Ｐ４、Ｍ１）（三角形）の平均歯垢被覆率のチャートを示す（平均は９５％信頼区間での実線の形状として示されている） ベースライン調整を行っていない、口腔ケアチューを与えた場合および与えなかった場合の、歯の種類毎の日数に対する平均歯垢被覆率（％）を示す（ＬＳＤ＝最小有意差、バーは有意差（５％水準）に必要な平均値間の差の中央値を表す） ベースライン（０日目）調整を行った、口腔ケアチューを与えた場合および与えなかった場合の、歯の種類毎の日数に対する平均歯垢被覆率（％）を示す（ＬＳＤ＝最小有意差、バーは有意差（５％水準）に必要な平均値間の差の中央値を表す） 口腔ケアチューを毎日与えられた犬（正方形）およびチューを与えられなかった犬（円）の、犬毎の、日数に対する平均歯垢被覆率（％）（９５％信頼区間）を示す 口の歯垢被覆率を定量化するための３通りの異なる方法を用いた、チューを与えられなかった犬および標準的なチューを与えられた犬の、犬毎の、歯垢被覆率（％）のベースラインからの差の平均（９５％信頼区間）を示す （猫についての繰り返し性データ）各繰り返しの写真についての、猫毎の歯の平均歯垢被覆率（％）を示す （猫についての再現性データ）各撮影者についての、猫毎の歯の平均歯垢被覆率（％）を示す （猫についてのデンタルダイエットの有効性）食餌毎および猫毎の歯の平均歯垢被覆率（％）を示す（９５％信頼区間） 食餌毎の各歯についての平均歯垢被覆率（％）を示す（９５％信頼区間）（星印は、歯内の食餌間の有意差（ｐ＜０．０５）を示す） 歯の様々なサブセットについての分散成分および食餌の差のその後の結果を示す 動物の歯の付番方式、および犬のＶＯＨＣによって推奨されている歯のリストを示す 動物の歯の付番方式、および猫のＶＯＨＣによって推奨されている歯のリストを示す 本発明の実施例において評価され、図面に示されている歯を示す 本発明の実施例において評価され、図面に示されている歯を示す 本発明の実施例において評価され、図面に示されている歯を示す

以下の実施例は、動物の歯垢のレベルを定量化するための定量的光励起蛍光法（「ＱＬＦ」）の使用の妥当性を、その繰り返し性、再現性、および精度を評価し、それを確立されている臨床採点システムと比較することによって確認するために用いられた方法を示す。試験は、（i）撮影者内の繰り返し性、（ii）撮影者間の再現性、および（iii）現行の採点方法との比較を決定するために犬を用いて行い、また、意識のある状態の犬を用いた７日間の試験をエビデンスで裏付け、更に、この方法論を猫に用いた。

実施例１：撮影者内の繰り返し性
この実施例の目的は、「ＱＬＦ」を用いて犬の歯の歯垢被覆率を測定する際の、撮影者内の繰り返し性を判定することである。

２．５歳〜６．９歳の１１匹のミニチュアシュナウザー犬のパネルサイズが選択された。全ての犬は、最近の（過去１か月以内の）歯石除去および歯磨きを受けており、目に見える歯石はほとんどまたは全く無かった。犬は、試験開始前の約１週間にわたって毎日歯のブラッシングを受け、試験の１日目のベースライン測定前に最後の歯のブラッシングを受けた。犬は、試験の３週間（２１日間）の継続期間にわたって、次の歯のブラッシングは受けなかった。試験中の全ての犬は意識のある状態であった。

３週間（２１日間）の試験フェーズは、歯垢の高レベルの堆積を可能にするのに十分に長くなるよう決定された。試験中、犬にはウェットタイプおよびドライタイプの混合の食餌を与え、試験群には毎日チューを与えた（チューを与えられた群ｖｓチューを与えられなかった群）。

１日目、３日目、７日目、１４日目、および２１日目に、単一の撮影者により、染め出しを行っていない歯の画像を「ＱＬＦ」で撮影した。３日目、７日目、１４日目、および２１日目には３回の繰り返し（午前中に２回、午後に１回）の画像を撮影し、１日目には２回撮影した（図１を参照）。これらの全ての日に画像を撮影することで、或る範囲の異なる歯垢被覆率が与えられた（これは、この範囲にわたる撮影者内の変動を評価するのに重要である）。

歯番号１０３〜１０８、並びに２０３〜２０８をキャプチャした上顎の４枚の画像を撮影することにより、測定を取得した。図２を参照されたい。

図２は、犬の口全体（上顎および下顎）、並びに口の中の歯を採点するために用いられたそれぞれの付番方式を表す図を示す。ＶＯＨＣ臨床採点方法は、上顎の０３、０４、０７、０８、０９、並びに下顎の０４、０７、０８、０９の歯を採点することを必要とすることが知られている。（示されているように）歯番号１０１〜１０８および２０１〜２０８にわたって歯垢被覆率の量が測定された。

撮影の際のカメラの位置に対するマッスルメモリーの影響を低減するために、試験は、検査者が全ての犬を続けて撮影し、次に、繰り返しのセットのために、最初の犬に戻って、再び全ての犬を撮影するよう設計された。昼食後、３回目のセットの画像が撮影された。これは、３枚の画像間の時間が、画像１と画像２との間は１時間、画像２と画像３との間は約１と１／２時間であったことを意味する。

１セットの画像は、口の周囲の５通りの視野を含んだ。即ち、上顎の第１小臼歯（Ｐ１、即ち１０５、２０５）、第２小臼歯（Ｐ２、即ち１０６、２０６）、第３小臼歯（Ｐ３、即ち１０７、２０７）、および第４小臼歯（Ｐ４、即ち１０８、２０８）を視覚化するために、犬の口の左側および右側において２枚ずつの画像が撮影され、上顎および下顎の第１切歯（Ｉ１、即ち１０１、２０１、３０１、４０１）、第２切歯（Ｉ２、即ち１０２、２０２、３０２、４０２）、第３切歯（Ｉ３、即ち１０３、２０３、３０３，４０３）、および犬歯の一部（Ｃ、即ち１０４、２０４、３０４、４０４）を視覚化するために、正面から１枚の画像が撮影された。図２を参照されたい。

統計
歯垢被覆率（％）の分散成分を推定するために、線形混合効果モデル（ＲＥＭＬ）を用いた。最初に、犬内にネストされた歯内にネストされた時間内にネストされた繰り返しをフィッティングされた変量効果として用いた全ての歯を含むモデル、次に、犬内にネストされた時間内にネストされた繰り返しを用いた各歯の種類についてのモデル。次に、繰り返し性の主要因である変動率（％）、および、変動係数率（％）（モデルの全体平均に対する繰り返し性の標準偏差）を算出した。

結果
１１匹のミニチュアシュナウザーから取得された、１５８４個の染め出しを行っていない上顎の歯（Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ４）の画像、および１９８枚の正面からの画像（単一の画像はＩ１、Ｉ２、Ｉ３、および犬歯の一部をキャプチャしている）を、「ＱＬＦ」画像解析ソフトウェアを用いて解析し、歯垢被覆率を定量化した（図３および図４）。

図３は、チューを与えられた１１匹の犬（Ａ〜Ｋ）の、チューを与えられなかった場合と比較した、平均歯垢被覆率（％）を示す。３セットの画像（１〜３）は、０日目、３日目、７日目、１４日目、および２１日目に取得された。コンピュータ処理された歯１０５、１０６、１０７、１０８、２０５、２０６、２０７、および２０８についての画像、並びに前歯（１０１、１０２、１０３、部分的な１０４、２０１、２０２、２０３、および部分的な２０４）についての画像から、個々におよび集合的に、歯垢被覆率（％）の測定を取得した。この調査は、意識のある状態の犬から歯の画像を取得できること、および、３〜２１日間の時間枠で歯垢の蓄積の量を測定できることを実証するものである。また、チューを与えられた犬は、概して、チューを与えられなかった犬よりも歯垢のレベルが低かったことがわかる。

分散成分解析を用いて、複数の日、複数の歯、複数の犬にわたる撮影者内の繰り返し性を定量化した。上顎の小臼歯についての繰り返し性の変動係数（１００×平均歯垢被覆率に対する標準偏差）は７．５％であった。

複数の日および複数の犬にわたる、各歯についての繰り返し性変動成分も算出した（表２および図４を参照）。

図４は、２匹の犬についての、３回の繰り返しの画像セット（１〜３）についての、上顎の小臼歯（１０５〜１０８および２０５〜２０８）の各々、並びに前歯（上顎および下顎の切歯および部分的な犬歯の平均）についての、経時的な（０日目、３日目、７日目、１４日目、２１日目）歯垢被覆率（％）の例を示す。「ＱＬＦ」は、個々の歯における経時的な歯垢被覆率の解析を可能にし、これは、特定の歯をターゲットにした商品のための大きな利益を有する。

「ＱＬＦ」法は、歯２０６（５．２％）および前歯（２７．９％）を除く、評価された歯の大半で、データ中の全変動の１．４％未満である、良好な繰り返し性を示した。歯の平均に対する分散成分を求めると、２０６（３０％）および前歯（７９％）を除く、解析された歯の大半について、変動係数率（％ＣＶ）が６％〜１６％の範囲であったことが示された。これらの歯は、歯２０６および前歯について、最も低い平均歯垢被覆率（％）である７．７％および０．６８％をそれぞれ有し、これは、相対的な変動の増加に寄与しているものであり得る。しかし、この試験で評価された、主張の妥当性確認試験のためにＶＯＨＣによって要求されている歯は、Ｐ３およびＰ４のみであり、「ＱＬＦ」は、これらの歯に対して９％未満の％ＣＶを有する最も高い繰り返し性を示したので、これらの歯の高い％ＣＶは、この技術を、製品の有効性の主張を裏付けるために用いる場合には、重要でない。比較として、Hennet, et al., 2006からの情報に基づき修正ローガン−ボイス法（Modified L&B）の繰り返し性を推定すると、＞２９％である。

この試験の目的の１つは、この技術をどのように用いるかを評価することであった。次の試験では、前歯は撮影せず、全てのＶＯＨＣ推奨の歯が撮影される（見える場合）ことを確実にするために、側方からより多くの画像を撮影した。

要約すると、この調査は、意識のある状態の犬の上顎の歯の画像を取得できることを示した。「ＱＬＦ」は繰り返し性があり、３〜２１日間の時間枠で歯垢の量の変化を測定できる。個々の歯についての歯垢被覆率のレベルを決定でき、これは、特定の歯をターゲットにした製品のために有益である。

実施例２−ユーザ間の再現性
この実施例の目的は、「ＱＬＦ」を用いて意識のある状態の犬の歯垢被覆率を測定する際の、５人の撮影者間における再現性を評価することであった。

５人の撮影者は、同じドライタイプの食餌を与えられた意識のある状態のミニチュアシュナウザー（Ｎ＝１２）の歯の画像を撮影した。犬は、試験開始前に、１日おきに歯のブラッシングを受けた。異なるレベルの歯垢および歯石を評価するために、画像の撮影の前に、歯のブラッシングを１日間、１０日間、および２１日間止めた。各撮影者は、２時間以内の期間に、歯１０３〜１０８および２０３〜２０８の画像を撮影した（図５）。

犬内にネストされた撮影者を変量効果とした線形混合モデル（ＲＥＭＬ）を用いて、歯垢被覆率（％）の分散成分を推定した。次に、撮影者が主要因である変動率、および％ＣＶ（モデルの全体の平均に対する再現性標準偏差）を算出した。

４８０（各撮影者毎に９６）の染め出しを行っていない上顎の歯（Ｉ３、Ｃ、Ｐ３、およびＰ４）についての歯垢被覆率（％）を決定した。選択された歯は、ＶＯＨＣ標準製品検査プロトコルによって定められている修正ローガン−ボイス法を用いて採点された歯に基づくものであった。図５および図６は、１２匹の犬（Ａ〜Ｌ）および５人の撮影者（１〜５）についての、個々の歯の歯垢被覆率（％）を示す（図５は１０３〜１０８の歯を示し、図６は２０３〜２０８の歯を示す）。平均的な歯についての変動係数（平均歯垢被覆率（％）に対する偏差）は１０．９％ＣＶであった。このデータは、「ＱＬＦ」を、個々の歯における歯垢の量を再現可能に測定するために用いることができることを示している。

口の平均の歯垢被覆率（％）は１．２％〜４１．２％の範囲であり（図７）、口の平均についての撮影者間の再現性の変動係数は３．２１％であった。

図７は、犬毎および検査者毎の、染め出しを行っていない歯に対する「ＱＬＦ」によって決定された歯垢被覆率（％）（口全体の平均：Ｉ３、Ｃ、Ｐ３、Ｐ４）である。この図は、１２匹の犬（Ａ〜Ｌ）の画像を撮影した５人の撮影者（１〜５）から得た平均歯垢被覆率の再現性を示す。異なる撮影者間の平均被覆率に対する変動（％ＣＶ）は３．２％であった。８．８％ＣＶを有する標準的な修正ローガン−ボイス法（Hennet et al., 2006に基づく）と比較して。

要約すると、「ＱＬＦ」は再現可能性を有し、意識のある状態の犬の上顎の個々の歯における歯垢被覆率（％）を測定できる。歯のブラッシングの停止後１日目、１０日目、および２１日目の歯垢の量を定量化できる。

図８は、犬毎（Ａ〜Ｋ）、日毎（０、３、７、１４、２１）、および繰り返し毎（１〜３）の、染め出しを行っていない歯に対する「ＱＬＦ」によって決定された歯垢被覆率（％）の変動のプロット（口全体の平均：上顎のＰ１、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ４）である。

意識のある状態の犬の、歯のブラッシングの停止後３日目、７日目、１４日目、および２１日目の、上顎の小臼歯の各歯における歯垢被覆率を測定できる。

実施例３：歯垢の蓄積の長期的評価−歯垢被覆率を測定可能な時間枠の決定
この実施例の目的は、歯垢被覆率のレベルを経時的に測定可能であるか否か、および、処置効果間の有意差をどの段階で確認できるかを決定することであった。

この試験は、意識のある状態の犬において、通常の２８日間の試験フェーズより短い時間枠で、製品の有効性を測定できることを実証するものである。

この試験は、「ＱＬＦ」が、意識のある状態の犬において、製品試験フェーズ中の１週目、２週目、３週目、および４週目において、製品の差を測定できるか否かを評価するために設計された。２フェーズクロスオーバー調査における各２８日間の試験フェーズの継続期間にわたって、１０匹の犬を、週に１回、意識のある状態で撮影した。意識のある状態の犬の下顎の歯に接近することは困難であるので、上顎のＩ３、Ｃ、Ｐ３、およびＰ４の画像のみを撮影した。

統計
「ＱＬＦ」によって測定された歯垢被覆率（％）を、経時的な分散の増加を可能にするために週に特有の変動によって重みづけした線形混合効果モデルを用いて解析した。犬は、犬に対する繰り返し測定の主要因である変量効果として含まれ、チューのタイプ、週、およびそれらの交互作用は固定効果として含まれた。５％の制御されたファミリーワイズエラー率を用いて、各週におけるチューのタイプ間の対照を行った。（ｎｌｍｅライブラリおよびｍｕｌｔｃｏｍｐライブラリを用いたＲ ｖ３．０２）。

結果
１週目、２週目、３週目、および４週目において、チューを与えられた群とチューを与えられなかった群との間に、口全体の平均歯垢被覆率（ＶＯＨＣ推奨の歯Ｉ３、Ｃ、Ｐ３、Ｐ４）の有意差が見出された（図９および表３を参照）。

１週間後、チューを与えられた群をチューを与えられなかった群と比較すると、歯垢被覆率の７４％の低減が観察された（９５％信頼区間の上限および下限はそれぞれ５４．３％および９３．６％）（表３を参照）。

図９は、口腔ケアチューを与えられた犬（円）の、チューを与えられなかった犬（三角形）と比較した、１週目、２週目、３週目、および４週目における口全体の平均歯垢率（％）（上顎のＩ３、Ｃ、Ｐ３、およびＰ４）である。実線の形状は平均を示し、バーは９５％信頼区間を示す。

結論として、この調査は、意識のある状態の犬の上顎の歯の「ＱＬＦ」画像を取得できること、および、口腔ケアチューを与えられた犬とチューを与えられなかった犬との間の歯垢の蓄積の低減率（％）の有意差を、７日間という短い時間枠で決定できることを示した。

実施例４−「ＱＬＦ」ソフトウェアの精度の評価
「ＱＬＦ」ソフトウェアの歯垢を正しく識別する能力を、５人の人間の採点者が「ＱＬＦ」で取得された画像上の歯垢を手作業で採点することによって決定された歯垢被覆率のレベルと比較することによって決定した。

「ＱＬＦ」ソフトウェアの結果を、或る範囲の歯垢被覆率を有する５０の歯の写真を用いた５人の訓練された人間の歯垢採点者の結果と比較した。図１０を参照されたい。図１０は、染め出しを行った４つの歯のサンプルに対する、５人の人間の採点者が「Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ」において歯垢を採点することによって識別された歯垢、および「ＱＬＦ」ソフトウェアによって識別された歯垢の視覚的表現である。

５人の人間の採点者によって評価された９匹の犬の口全体の点数を、犬内にネストされた採点者を変量効果としてフィッティングした線形混合モデルによって解析した。次に、この分散の推定を、（５人の人間の採点者から見出された平均歯垢被覆率を有する）１０００人の採点者のシミュレーションに情報を与えるために用いた。人間の採点者の結果の分布の範囲内にある「ＱＬＦ」ソフトウェアの結果の確率を、「ＱＬＦ」ソフトウェアの点数の平均未満の平均を有するシミュレーションされた採点者の割合（％）によって算出した。５％の試験水準を用いた。

歯垢の識別において、５人の採点者と「ＱＬＦ」ソフトウェアとの間には、歯垢被覆率の０．６％〜１００％（最小、最大）の全範囲にわたって高レベルの一致が見られた。「ＱＬＦ」ソフトウェアより低い平均歯垢被覆率（％）を有したシミュレーションされた人間の採点者は１０％であり（ｐ＝０．１）、５人の採点者の分散のシミュレーションは、「ＱＬＦ」ソフトウェアが人間の採点者に対して有意差がなかったことを示した。図１１を参照されたい。図１１は、上顎の第３切歯、上顎および下顎の犬歯、並びに第３および第４小臼歯（染め出しを行った歯）に対して、「Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ」において歯垢を採点した５人の人間の採点者（三角形および正方形）によって識別された歯垢被覆率（％）、および「ＱＬＦ」ソフトウェア（円）によって識別された歯垢被覆率（％）の変動のチャートである。図１１ａは、解析された上顎の歯（１０３、１０４、１０７、１０８、１０９）の結果を示し、図１１ｂは、解析された下顎の歯（４０４、４０７、４０８、４０９）の結果を示す。解析された歯は、標準的な臨床採点調査において用いられる下顎および上顎のＶＯＨＣ推奨の歯である。

実施例５−「ＱＬＦ」と修正ローガン−ボイス法との比較
この調査は、「ＱＬＦ」を、確立されている歯垢採点方法である修正ローガン−ボイス法（Hennet et al.,2006）と比較したものである。

修正ローガン−ボイス法は、染め出しを行った歯垢を用い、歯を歯肉部分と歯冠部分とに分け、その部分における歯垢被覆率（％）に応じて０〜４の点数を割り当てると共に、歯垢の厚さに応じて１〜３の点数を割り当てる。被覆率および厚さの点数を乗算することによって、歯の各部分（歯肉部分および歯冠部分）についての全体的な歯垢の点数を算出した。次に、歯肉および歯冠の点数を加算して、歯の合計点を与えた。全ての歯の点数の平均が、口の点数を与えた。この評価には、上顎のＩ３、Ｃ、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ４、および第１大臼歯（Ｍ１、即ち１０９，２０９）、並びに下顎のＣ、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ４、およびＭ１（３０９，４０９）の歯が含まれた。

犬には市販の成犬用のドライタイプの食餌を与え続け、先に説明したように製品の有効性調査を行った。染め出し液を用いて犬の歯の歯垢を視覚化し、修正ローガン−ボイス法（Hennett et al.,2006）および「ＱＬＦ」を用いて歯垢の量を決定した。犬を繰り返し測定の主要因である変量効果とし、製品を固定効果とした線形混合効果モデルによって、データを解析した。５％の試験水準で製品を比較した。

口腔ケアチューを与えられた犬の、チューを与えられなかった犬と比較した歯垢の蓄積の低減率（％）において、「ＱＬＦ」と修正ローガン−ボイス法との間の良好な一致が実証された（表４）。製品の有効性は、修正ローガン−ボイス法では、口腔ケアチューを与えられた犬を、チューを与えられなかった犬と比較した際の歯垢の堆積の２２％の低減として測定され、「ＱＬＦ」では１９％の低減として測定され、これらの方法は類似の結果を与えた。「ＱＬＦ」によって測定された歯垢の蓄積の低減は、ローガン−ボイス法の結果の９５％信頼区間内であり、「ＱＬＦ」で確認された低減についての信頼区間の幅は、ローガン−ボイス法の信頼区間の幅の５２％であり、「ＱＬＦ」ではより変動が低いことを示した。

事後検出力分析は、少なくとも９０％の検出力で、「ＱＬＦ」を用いて歯垢の蓄積の１５％の低減を測定するために必要な犬の数は、修正ローガン−ボイス法を用いる場合と比較して、より少ないこと示した。

図１２は、２方向クロスオーバー試験（２６匹の犬、清潔な口のモデル）における、口腔ケアチューを与えられた群の、チューを与えられなかった群と比較した歯垢の蓄積の１５％の低減を検出するための累乗曲線を示す。実線は「ＱＬＦ」（染め出しを行った歯）を示し、破線は修正ローガン−ボイス法を示し、点線は「ＱＬＦ」（染め出しを行っていない歯）を示す。１５％の低減を測定するには、ローガン−ボイス法では１９匹の犬が必要であるのに対して、「ＱＬＦ」では７匹の犬が必要である（９０％の検出力）。

「ＱＬＦ」は、修正ローガン−ボイス法よりも主観性が低い。また、「ＱＬＦ」はより迅速であり、撮影者に必要な訓練はより少なくてよく、将来的に用いるための永久的なデータベースを設けるために画像を格納できる。それに加えて、デンタルケア製品の有効性試験において、同じサイズ効果を測定するのに必要な動物の数がより少ない。

要約すると、「ＱＬＦ」によって測定された歯垢の蓄積の低減率（％）は、修正ローガン−ボイス法を用いて決定された歯垢の蓄積の低減率の範囲内であった。それに加えて、デンタルケア製品の有効性試験において、同じサイズ効果を測定するのに必要な動物の数がより少ない。使用する動物の数がより少ないこと、および、意識のある状態の犬において調査を行うことができることは、科学研究における人間による動物の使用を支える指針のうちの２つ、即ち、用いる動物の数を最小限にすること、および、動物の幸福を向上させるために、実験を行う方法を洗練させることをサポートする。

実施例６−意識のある状態の犬ｖｓ意識の無い状態の犬
意識のある状態の犬において、（２８日間の標準的な試験ではなく）短い時間枠で歯垢を測定する方法は、新たなまたは改良された口腔ケア製品を試験するために非常に望ましい。

犬を、
−染め出し液を用いる／用いない
−小臼歯を見るためのプラスチックの口角鉤
−上顎のみ
を含む、意識のある状態での「ＱＬＦ」撮影のために訓練した。

また、クロスオーバー調査の各試験フェーズの最後に、麻酔をかける前に、意識のある状態の犬の染め出しを行っていない歯の「ＱＬＦ」画像も撮影した。

意識のある状態の犬（上顎の歯の平均）および麻酔された犬（ＶＯＨＣ推奨の全ての歯の平均）の、染め出しを行っていない歯の「ＱＬＦ」によって測定された歯垢被覆率（％）を、犬を、犬に対して繰り返される測定の主要因である変量効果とし、測定のタイプ、製品、およびそれらの交互作用を固定効果とした線形混合モデルを用いて解析した。チューのタイプ間の対照を、５％水準で測定間で比較した。これは、チューを与えられなかった場合と比較した、口腔ケアチューを与えられた場合の（ｘ軸）、意識のある状態の犬の上顎のみ（Ｉ３、Ｃ、Ｐ３、Ｐ４）（円）、並びに、意識の無い犬の上顎（Ｉ３、Ｃ、Ｐ３、Ｐ４、Ｍ１）および下顎（Ｃ、Ｐ３、Ｐ４、Ｍ１）（三角形）の、平均歯垢被覆率（ｙ軸）のチャートを示す図１３に示されている。バーは９５％信頼区間を示す。

口腔ケアチューを与えられた群とチューを与えられなかった群との間には、意識のある状態で撮影された犬（Ｐ＜０．００１）と意識の無い状態で撮影された同じ１０匹の犬（Ｐ＜０．００１）との両方について有意差があった。

チューを与えられなかった群および口腔ケアチューを与えられた群のそれぞれについての、意識のある状態で撮影された犬の（染め出しを行っていない）平均歯垢被覆率は２７．７％（２２．２％、３３．２％）および７．６％（２．１％、１３．１％）であり、これは歯垢の蓄積の７２．６％（５４．０％、９１．２％）の低減である。同じ１０匹の犬を麻酔にかけられた状態で撮影した場合の（染め出しを行っていない）平均歯垢被覆率は、チューを与えられなかった群については３０．５％（２５．０％、３６．１％）であり、口腔ケアチューを与えられた群については９．５％（４．０％、１５．０％）であり、これは、歯垢の蓄積の６９．０％（５２．１％、８５．８％）の低減である。これは以下の表５に示されている。

口腔ケアチューを与えられた犬とチューを与えられなかった犬との間の歯垢の蓄積の低減率（％）に関して、意識のある状態の犬と意識の無い犬との間に有意差は見出されなかった（Ｐ＝０．９８４）。

要約すると、製品の性能の差は、意識のある状態の犬においても麻酔された犬においても見極めることができる。それに加えて、口腔ケアチューを与えられた犬の、チューを与えられなかった犬と比較した場合の歯垢の蓄積の低減率（％）には、口全体（ＶＯＨＣ推奨の歯）ではなく、上顎の歯（Ｉ３、Ｃ、Ｐ３、Ｐ４）のみを評価した場合でも、有意差は無かった。

実施例７−繰り返し性調査
この調査の目的は、口腔ケアチューを与えられた犬とチューを与えられなかった犬との間の経時的な平均歯垢被覆率の差を評価することであった。

この調査の設計は、実施例１について説明した通りである。

染め出しを行っていない、歯の種類毎：
０日目、３日目、７日目、１４日目、および２１日目に収集された染め出しを行っていないデータに対する混合モデル解析を行った。変量効果は、犬内にネストされた歯内にネストされた日としてフィッティングされた。歯、日、チュー、およびそれらの交互作用は、固定効果としてフィッティングされた。

歯、日、およびチュー間の交互作用は有意であり（ｐ＜０．００１）、従って、これらの日にわたる歯垢の被覆率の変化は歯の種類と共に変化し、これは口腔ケアチューの追加によっても異なった（図１４Ａ）。

試験の０日目には、歯の種類間で平均歯垢被覆率に０％から高々２３％までの範囲があり、この範囲は、口腔ケアチューを与えられた犬については僅かに大きい。

（各時間プロファイルについて０日目からの、および、各時点における各歯の種類についての口腔ケアチューを与えた場合と与えなかった場合との間において）各時点における歯の種類間の比較数についての多重性調整が行われる場合には、口腔ケアチューを与えられた場合の時間に伴う有意な変化は見出されない。口腔ケアチューを与えられなかった場合には、歯１０７、１０８、２０７、および２０８について、０日目からの有意な増加がある。

図１４Ａは、口腔ケアチューを与えた場合および与えなかった場合の、日毎および歯番号毎の平均歯垢被覆率（％）である（ＬＳＤ＝最小有意差、バーは有意差（５％水準）に必要な平均値間の差の中央値を表す）。

結果に対する０日目の変動の影響を調べるために、０日目の繰り返しの平均を混合モデル解析における共変量として用い、犬内にネストされた歯内にネストされた日を変量効果とし、チュー、歯、日、およびそれらの交互作用を固定効果とした。

歯、日、およびチュー間の交互作用は有意であり（ｐ＝０．００２）、従って、これらの日にわたる歯垢の被覆率の変化は歯の種類と共に変化し、これは口腔ケアチューの追加によっても異なる。

図１４Ｂは、０日目について調整された、日毎および歯の種類毎の、口腔ケアチューを与えた場合および与えなかった場合の平均歯垢被覆率（％）である（ＬＳＤ＝最小有意差、バーは有意差（５％水準）に必要な平均値間の差の中央値を表す）。

結論として、意識のある状態の犬の個々の歯の画像を用いて、たとえ清潔な口のモデルを用いない場合でも、歯垢レベルの量の経時的な変化を測定することができる。個々の歯を用いて、対照群と比較した口腔ケア製品の差を見極めることができる。

染め出しを行っていない、（前歯を除く）歯の種類にわたる平均、即ち口の平均：
前歯のデータを除く、０日目、３日目、７日目、１４日目、および２１日目に収集された染め出しを行っていないデータに対する混合モデル解析を行った。変量効果は、犬内にネストされた歯内にネストされた日としてフィッティングされた。日、チュー、およびそれらの交互作用は、固定効果としてフィッティングされた。

日およびチュー間の交互作用は有意であり（ｐ＜０．００１）、従って、チューが与えられた場合には、これらの日にわたる歯垢の被覆率の変化は異なる（図１５を参照）。図１５は、口腔ケアチューを毎日与えられた犬（正方形）およびチューを与えられなかった犬（円）毎の、日数に対する平均歯垢被覆率（％）（９５％信頼区間）を示す。

０．００４の試験水準を用いて（＝０．０５／１２、１２〜１６回の比較が、各チュー条件内における０日目から各時点までの差と、チュー条件間における０日目から各時点までの差の比較とを含む）、以下が見出された。
−チューを与えられた群において、１４日目、および２１日目に、０日目からの有意な増加があり（ｐ＝０．００１）、差は６．０％より大きかった（未調整レベルでは７日目にも有意差があった（ｐ＝０．０１４））。
−チューを与えられなかった群において、７日目、１４日目、および２１日目に、０日目からの有意な増加があり（ｐ＜０．００１）、差は６．５％から高々１８．４％までの範囲であった（未調整レベルでは３日目にも有意差があった（ｐ＝０．０３））。
−チュー条件間において、チューを与えられなかった群は、チューを与えられた群と比較して、３日目、７日目、１４日目、および２１日目における０日目からの差がより高くなり、２１日目には有意に高かった（ｐ＜０．００１）（未調整レベルでは１４日目にも有意差があった（ｐ＝０．００５））。

従って、この交互作用は、チューを与えられなかった群における平均歯垢率（％）のより速い増加に起因する。以下の表は、チューを与えられた群およびチューを与えられなかった群の経時的な差についての、調整された９５％信頼区間でのこれらの結果を示す。

結論として、３日間という早い時期から、歯垢蓄積率（％）の有意な増加を測定できる。犬が口腔ケアチューを与えられた場合の、チューを与えられなかった場合と比較した、歯垢の蓄積速度の差を検出できる。

実施例８：「ＱＬＦ」方法論を用いた、意識のある状態での７日間の試験
この調査の目的は、試験の各７日間のフェーズにわたる歯垢の堆積を定量化するために、意識のある状態の犬に対して定量的光励起蛍光法を用いることであった。

清潔な口のモデルを用いた１３匹のミニチュアシュナウザー犬、即ち、犬の歯をベースラインの歯垢または歯石が存在しない状態に設定するために、犬は試験の開始時に１回の歯石除去および歯磨きを受けた。

ランダム化クロスオーバー設計において、犬は７日間にわたって、チューを与えられないか、または、毎日口腔ケアチューを与えられた。即ち、各犬が両方の「処置」を受けた。

歯垢の「ＱＬＦ」撮影を行い、「ＱＬＦ」画像キャプチャソフトウェアを用いて画像を解析した。

青色光の下で蛍光を発しない薄い未発達の歯垢を視覚化するために、染め出し液を追加して、意識のある状態の犬に対してＱＬＦレベルを行った。従って、この方法はＱＬＦと面積測定法とのハイブリッドである。カラーフィルタを追加することで、染め出しを行った歯垢の自動的な算出が可能になる。

各７日間のフェーズの最初および最後にＱＬＦを行い、始点となるベースライン歯垢測定値を与えた。各フェーズの開始時に、歯のブラッシングを用いて、歯をベースラインの歯垢にリセットした。試験が短期間であることから歯石の形成は限られたものとなり、意識の無い状態での歯石除去および歯磨きは必要ないので、各フェーズ間の全身麻酔は必要なかった。

この方法は、歯垢の発生／除去の指標としての上顎の８本の歯（１０３、２０３、１０４、２０４、１０７、２０７、１０８、および２０８）の視覚化を可能にする。

統計
解析ソフトウェアを用いて、歯垢のレベルの画像解析を行った。各歯について、データは、歯の全領域の画素に対する蛍光を発した／着色された画素数の形態をとり、指標となる８本の歯（１０３、２０３、１０４、２０４、１０７、２０７、１０８、および２０８）の各々についての各時点における歯垢被覆率（％）を与える。データセットは以下の３通りに解析された。
（１）個々の歯の被覆率（％）
各歯について、ベースラインにおける被覆率（％）を、フェーズの最後における被覆率（％）から減算した。この測定（ベースラインについて補正された被覆率（％））は線形混合モデルにおける応答として用いられ、処置を固定効果とし、犬および犬内の歯をランダム構造とした。残りの部分の目視による検査は、いかなる変換の必要性も示さなかった。尤度比試験を用いて、歯の変量効果の必要性を評価した結果、この項は除去された。
（２）複数の歯にわたる平均被覆率（％）
各歯について、ベースラインにおける被覆率（％）を、フェーズの最後における被覆率（％）から減算した。各犬について、これらの値の平均を算出した。この測定値（ベースラインについて補正された被覆率（％））は線形混合モデルにおける応答として用いられ、処置を固定効果とし、犬を変量効果とした。残りの部分の目視による検査は、いかなる変換の必要性も示さなかった。
（３）口の被覆率（％）
各犬について、全ての歯にわたる蛍光を発した画素を合計し、それを、全ての歯にわたる全画素の合計で除算し、次に、１００を乗算することにより、各測定時における口全体についての被覆率（％）を算出した。ベースラインにおける口全体の被覆率（％）を、フェーズの最後における口全体の被覆率（％）から減算した。この測定（ベースラインについて補正された口全体の被覆率（％））は線形混合モデルにおける応答として用いられ、処置を固定効果とし、犬を変量効果とした。残りの部分の目視による検査は、いかなる変換の必要性も示さなかった。

３つのモデルの全てについて、各処置から９５％信頼区間での推定を抽出し、処置間の比較を行った。

３通りの解析の全ては、処置間の有意差を示した（図１６を参照）。図１６は、３通りの結果の全てを同じグラフ上に示している。図１６は、３通りの結果の全てを、平均について９５％信頼区間で同じグラフ上に示している。これは、７日間の処置フェーズで、（このケースでは、毎日のデンタルチューによる処置を用いて生じた）歯垢被覆率の有意差を示すことができることを実証するものである。３通りの異なる解析方法の全てを用いて差が観察され、このことは、データを、単一の歯の差から口全体の歯垢の点数の平均までのレベルで効果的に調べることができることを示すものである。

最初の２つの方法は、数学的に予想された通り同一の推定を与えるが、複数の歯にわたる平均はよりばらつきが大きいように見える。３つ目の方法は最もばらつきが大きく、被覆率（％）について僅かに異なる推定を与えている。１つ目および２つ目の方法は、歯をサイズによって重みづけしていないので、これは予想された結果である。

この調査は、意識のある伴侶動物から得た個々の歯における歯垢の蓄積は、有意な結果を提供できるので、特定の指標となる歯を測定した際に、歯垢除去における有意差を決定できることを示す。意識のある状態の動物の使用は、（調査フェーズ間における全身麻酔が必要なく、全身麻酔間に、推奨される４週間の間隔を空けるが必要ないので）より短い調査フェーズを可能にする。このデータの検出力分析は、歯垢被覆率における同じ差を識別するのに必要な動物の数が、現在容認されているゴールドスタンダードの測定法である修正ローガン−ボイス法による意識の無い状態での採点よりも少ないことを示す。

結論として、意識のある状態の犬に対して「ＱＬＦ」を用いることは、全身麻酔間の４週間の回復時間の必要性をなくすことにより、より短い調査処置フェーズを可能にした。この調査は、７日間の処置フェーズ後に、上顎の指標となる歯のみを用いて、口腔ケア処置によって生じた歯垢除去における有意差を示すことができることを示した。

実施例９−意識の無い状態の猫に対する「ＱＬＦ」の妥当性確認
この調査の目的は、変動を定量化し、デンタルダイエット（デンタルケア用の食餌）の有効性を実証するために猫の歯垢を測定するための「ＱＬＦ」法の使用、および、意識の無い状態の猫に対する「ＱＬＦ」の使用の妥当性を確認することであった。

清潔な口のモデルを用いた（即ち、猫の歯をベースラインの歯垢または歯石が存在しない状態に設定するために、猫は各調査フェーズの開始時に１回の歯石除去および歯磨きを受けた）２４匹の猫のＶＯＨＣ推奨の歯（上＝１０４、２０４、１０７、２０７、１０８、２０８、および、下＝３０４、４０４、３０７、４０７、３０８、４０８、３０９、４０９）のＱＬＦ画像を撮影した。ランダム化クロスオーバー設計において（即ち、各猫が両方の「処置」を受ける）、猫は、２８日間にわたって、標準的な成猫用のドライタイプの食餌またはドライタイプのデンタルダイエットを毎日与えられた。「ＱＬＦ」に加えて、ローガン−ボイス（Ｌ＆Ｂ）法による歯垢の採点も同時に行われた。

この調査は２つのフェーズで構成されており、フェーズ１は繰り返し性、フェーズ２は再現性である。各フェーズについて、（ｉ）評価対象の各歯における歯垢率、（ｉｉ）各歯における平均歯垢率（％）、および（ｉｉｉ）重みづきの口（１００×口内の合計面積にわたる口内の歯垢の合計の除算）の測定を行った。

１人の評価者が、各２８日間のフェーズ試験の最後に、染め出し液を用い全身麻酔をかけられた猫に対して「ＱＬＦ」を用い、ハードウェアおよび画像キャプチャソフトウェアを用いて歯垢の蓄積を定量化した。上顎および下顎のＶＯＨＣの採点対象の１４本の歯の全て（即ち、１０４、２０４、１０７、２０７、１０８、２０８、３０４、４０４、３０７、４０７、３０８、４０８、３０９、および４０９）が、歯垢の発生／除去の指標として撮影された。画像は「ＱＬＦ」解析ソフトウェアを用いて解析された。

異なる採点者間における結果の再現性を決定するために、上述の有効性調査の第２フェーズの最後に、３人の撮影者が、１２匹の猫の歯における染め出しを行った歯垢を「ＱＬＦ」を用いて撮影した。上顎および下顎のＶＯＨＣの採点対象の１４本の歯の全て（即ち、１０４、２０４、１０７、２０７、１０８、２０８、３０４、４０４、３０７、４０７、３０８、４０８、３０９、および４０９）が、歯垢の発生／除去の指標として撮影された。画像は「ＱＬＦ」解析ソフトウェアを用いて解析された。

統計
デンタルダイエットの有効性の実証
線形混合効果モデル（ＬＭＭ）によって有効性データを解析した。歯の平均、重みづきの口、およびＬ＆Ｂデータは、猫内にネストされたチューを変量効果として用い、チューを固定効果として用いた。それに加えて、各歯についての歯垢被覆率（％）の生データを用いて、猫内にネストされた歯内にネストされたチューを変量効果として用い、歯毎のチューおよびそれらの交互作用を固定効果として用いた。９５％ファミリーワイズ信頼区間での平均および平均値間の差を推定した。

繰り返し性および再現性
繰り返し性および再現性を定量化するために、各測定について、ＬＭＭを用いて分散成分解析を行った。まず、ＶＯＨＣ推奨の各歯について、猫内にネストされた繰り返しを変量効果として含むことにより、分散成分を定量化した。同じモデルを用いて、歯の平均および重みづきの口のデータを解析した。それに加えて、猫内にネストされた歯内にネストされた繰り返しを変量効果として含むことにより、各歯における歯垢率（％）を解析した（即ち、解析前に平均する代わりに、全てのデータが用いられた）。分散成分を抽出し、それぞれのデータ全体の平均に対する繰り返し性／再現性に起因する全分散の割合（％）を変動係数率（％）と共に定量化した。

結果
各繰り返しの写真についての猫毎の歯の平均歯垢被覆率（％）の繰り返し性が図１７に示されている。平均繰り返し性％ＣＶは２．２％であった。

３人の撮影者の各々についての、猫毎の歯の平均歯垢被覆率（％）の再現性が図１８に示されている。平均再現性％ＣＶは２．３％であった。

図１９に９５％信頼区間で示されているように、歯の平均歯垢被覆率（％）のＬＭＭ解析のデンタルダイエットの有効性の結果は、デンタルダイエットを与えられた場合に、歯垢被覆率の約１４．２６％（ｐ＜０．００１）の有意な低減を示した。

食餌の交互作用毎に歯を調べるＬＭＭは、食餌の効果が歯毎に有意に変化することを示した（ｐ＜０．０００１）。この交互作用は図２０に示されている。

意識のある状態の猫において、以下の歯のサブセットを撮影した際のＱＬＦを調査するために、更なる解析を行った。
１. １０４、２０４、１０７、２０７、１０８、２０８、３０４、４０４、３０７、４０７、３０８、４０８、３０９、４０９
２. １０４および２０４のみ
３. １０７および２０７のみ
４. １０８および２０８のみ
５. １０４、２０４、１０７、２０７
６. １０７、２０７、１０８、２０８
７. １０４、２０４、１０７、２０７、１０８、２０８
次に、７通りのサブセットを、猫内にネストされた歯内にネストされた食餌を変量効果とし、食餌を固定効果としたＬＭＭによって解析した。図２１は、歯の様々なサブセットについての、分散成分および食餌の差のその後の結果を示す。「１０４、２０４、１０７、２０７」の組合せ以外の全てのサブセットは、食餌間における有意差が見出された。個々の歯１０８／２０８のみの使用で十分であることがわかる。

要約すると、この試験は、「ＱＬＦ」を用いて、特定のデンタルダイエットを与えられた場合の猫の歯垢被覆率の有意な変化を、口全体の評価だけでなく個々の歯（例えば、ＶＯＨＣ推奨の歯よりも少ない数の歯、特に上顎の歯）を用いて、再現可能に定量化できることを実証した。

結論
このデータは、「ＱＬＦ」の妥当性を確認された再現性および精度を表しており、「ＱＬＦ」が犬および猫の歯垢のレベルを測定するのに適した技術であることを示す。

また、このデータは、「ＱＬＦ」を意識のある状態の犬に用いることができること、および、この方法論が、口全体の評価を取得するために口の全ての歯の各々のデータを取得するのではなく、または、ＶＯＨＣ推奨の歯のリスト全体を取得するのではなく、口の中の個々の歯（１以上の歯）および口の一方の顎（即ち、口の半分）にある１以上の歯（特に、上顎の歯）において取得されたデータを用いることによって、動物の口全体の評価を決定するための有意差を与えることも示す。

このデータは、２８日間より少ない日数で試験を行うことができることのエビデンスを提供する。

このデータは、試験期間および試験される動物の数を減らすことを可能にする、精度が向上した、新たな迅速な製品試験方法論のエビデンスを提供する。このデータは、２８日間の試験と比較して、より短い時間枠（例えば、７日間）で試験を行うことができることを示す。

このデータは、歯垢または歯石を低減することにおける口腔ケア製品の有効性を測定する試験が、より短い時間枠で有意な結果を示したことを示しており、少なくとも２８日間でなく、少なくとも７日間で試験を行うことができることのエビデンスを示している。

更に、本発明の実施例は、歯の歯垢および／または歯石の測定の精度を、より短い時間枠（２８日間と比較して７日間）で達成できるのみならず、口全体ではなく口の半分を測定することによって達成できることを示している。これは、被検体の上顎のみを測定し、次に、その結果を口全体の歯垢被覆率の測定に相関させることによって示された。このデータは、３日間、７日間、１４日間、および２１日間の試験の長さの有意な結果を示すと共に、そのような試験を、口全体の測定に相関される個々の歯（上顎）、並びに口全体の測定に相関される口半分（即ち、口全体ではなく上顎）の測定を用いて行うための有意な結果を示す。

この試験の長所は、特に、犬が意識のある状態であったという事実である。この結果は、意識のある状態の犬と意識の無い状態の犬との間で、結果に有意差が無かったことを示した。

このデータは、「ＱＬＦ」が、意識のある状態の犬に対して用いるための、正確で、再現性があり、信頼性が高い方法であることを示す。「ＱＬＦ」は、例えばローガン−ボイス法等の確立されている臨床採点方法に匹敵する結果を提供できる。採点に必要な訓練は遥かに少なく、ソフトウェアを用いて容易に定量化可能であり、従って、より主観性が低い。試験毎に必要な動物の数がより少なく、解析する必要がある歯の数がより少なく、従って、製品の有効性に対する結果を取得するための期間がより短く、より迅速な、動物にとってよりストレスが低い試験を提供する。
以下、本発明の好ましい実施形態を記載する。
（実施形態１）
被検体の口腔内の基質を検出して定量化する方法であって、
（i）蛍光を検出できる画像撮影装置を用いて、意識のある状態の被検体の１以上の歯の１以上の画像を取得する工程と、
（ii）前記画像を解析する工程と、
（iii）各前記被検体の各前記歯における前記基質の被覆率を定量化する工程と
を有し、
前記試験群の被検体が伴侶動物であることを特徴とする方法。
（実施形態２）
前記１以上の歯が前記被検体の上顎内に位置する、実施形態１記載の方法。
（実施形態３）
前記基質が、齲蝕病変部、歯垢、細菌、歯石、着色、および／または、それらの任意の組合せから選択される、実施形態１または２記載の方法。
（実施形態４）
前記伴侶動物が犬または猫である、実施形態１〜３のいずれかに記載の方法。
（実施形態５）
前記画像撮影装置が前記蛍光を検出する、実施形態１〜４のいずれかに記載の方法。
（実施形態６）
伴侶動物である被検体の口腔内の基質を低減、防止、および／または処置することにおける試験組成物の有効性を決定するための試験において、前記被検体の口腔内の基質を検出して定量化する方法であって、
（i）蛍光を検出できる画像撮影装置を用いて、前記試験の開始時（０日目）における意識のある状態の試験群の被検体および意識のある状態の対照群の被検体の１以上の歯の１以上の画像を取得する工程と、
（ii）前記０日目における各前記被検体の各前記歯における前記基質の被覆率を定量化するために前記画像を解析する工程と、
（iii）前記試験の継続期間にわたって、前記試験群の被検体に試験組成物を投与すると共に、前記対照群の被検体に対照組成物を投与する工程と、
（iv）前記試験中に所定の間隔で、前記試験群の被検体および前記対照群の被検体の各々の前記工程（i）と同じ１以上の歯の１以上の画像を取得する工程と、
（v）各前記被検体の各前記歯における前記基質の被覆率およびサイズを決定して定量化して、前記試験の開始時および／または前記試験の各段階における前記画像と比較するために、前記画像を解析する工程と、
（vi）前記試験群の被検体と前記対照群の被検体との前記１以上の歯の前記基質の被覆率を比較する工程と、
（vii）前記被検体の口腔内の基質および／または歯周病を低減、防止、および／または処置することにおける前記試験組成物の有効性を決定する工程と
を含むことを特徴とする方法。
（実施形態７）
前記被検体と前記対照群の被検体とが同じ被検体である、実施形態６記載の方法。
（実施形態８）
前記１以上の歯が前記被検体の上顎内に位置する、実施形態６または７に記載の方法。
（実施形態９）
前記基質が、齲蝕病変部、歯垢、細菌、歯石、着色、および／または、それらの任意の組合せから選択される、実施形態６〜８のいずれかに記載の方法。
（実施形態１０）
前記伴侶動物が犬または猫である、実施形態６、７、８、または９記載の方法。
（実施形態１１）
前記画像撮影装置が前記蛍光を検出する、実施形態６〜１０のいずれかに記載の方法。
（実施形態１２）
前記試験組成物が、ペットフード、ペット用おやつ、および／または、ペット用チューから選択される、実施形態６〜１１のいずれかに記載の方法。
（実施形態１３）
前記解析が定量的光励起蛍光法によって行われる、実施形態６〜１２のいずれかに記載の方法。
（実施形態１４）
前記試験期間が７日間である、実施形態６〜１３のいずれかに記載の方法。
（実施形態１５）
前記試験期間が３日間である、実施形態６〜１３のいずれかに記載の方法。
（実施形態１６）
前記伴侶動物が、前記１以上の画像を取得する前記工程がおこなれている間は静止しているよう訓練されている、実施形態１〜１５のいずれかに記載の方法。
（実施形態１７）
試験中に、試験組成物の有効性を決定するために１以上の歯における歯垢の存在または量を決定するための、伴侶動物である被検体における蛍光の使用。
（実施形態１８）
猫の口腔内の基質を検出して定量化する方法であって、
（i）蛍光を検出できる画像撮影装置を用いて、猫の１以上の歯の１以上の画像を取得する工程と、
（ii）前記画像を解析する工程と、
（iii）前記猫の各前記歯における前記基質の被覆率を定量化する工程と
を含むことを特徴とする方法。
（実施形態１９）
前記１以上の歯が前記猫の上顎内に位置する、実施形態１８記載の方法。
（実施形態２０）
前記画像撮影装置が前記蛍光を検出する、実施形態１８または１９記載の方法。
（実施形態２１）
猫の口腔内の基質を低減、防止、および／または処置することにおける試験組成物の有効性を決定するための試験において、前記猫の口腔内の基質を検出して定量化する方法であって、
（viii）蛍光を検出できる画像撮影装置を用いて、前記試験の開始時（０日目）における試験群の猫および対照群の猫の１以上の歯の１以上の画像を取得する工程と、
（ix）前記０日目における各前記猫の各前記歯における前記基質の被覆率を定量化するために前記画像を解析する工程と、
（x）前記試験の継続期間にわたって、前記試験群の猫に試験組成物を投与すると共に、前記対照群の猫に対照組成物を投与する工程と、
（xi）前記試験中に所定の間隔で、前記試験群の猫および前記対照群の猫の各々の前記工程（i）と同じ１以上の歯の１以上の画像を取得する工程と、
（xii）各前記猫の各前記歯における前記基質の被覆率およびサイズを決定して定量化して、前記試験の開始時および／または前記試験の各段階における前記画像と比較するために、前記画像を解析する工程と、
（xiii）前記試験群の猫と前記対照群の猫との前記１以上の歯の前記基質の被覆率を比較する工程と、
（xiv）前記猫の口腔内の基質および／または歯周病を低減、防止、および／または処置することにおける前記試験組成物の有効性を決定する工程と
を含むことを特徴とする方法。
（実施形態２２）
前記１以上の歯が前記猫の上顎内に位置する、実施形態２１記載の方法。
（実施形態２３）
前記画像撮影装置が前記蛍光を検出する、実施形態２１〜２２のいずれかに記載の方法。
（実施形態２４）
前記解析が定量的光励起蛍光法によって行われる、実施形態２１〜２３のいずれかに記載の方法。
（実施形態２５）
前記試験期間が７日間である、実施形態２１〜２４のいずれかに記載の方法。
（実施形態２６）
前記試験期間が３日間である、実施形態２１〜２４のいずれかに記載の方法。

Claims (16)

1. 伴侶動物である被検体の口腔内の基質を低減、防止、および／または処置することにおける試験組成物の有効性を決定するための試験において、前記被検体の口腔内の基質を検出して定量化する方法であって、
   （i）蛍光を検出できる画像撮影装置を用いて、前記試験の開始時（０日目）における麻酔を受けていない状態の試験群の被検体および麻酔を受けていない状態の対照群の被検体の１以上の歯の１以上の画像を取得する工程と、
   （ii）前記０日目における各前記被検体の各前記歯における前記基質の被覆率を定量化するために前記画像を解析する工程と、
   （iii）前記試験の継続期間にわたって、前記試験群の被検体に試験組成物を投与すると共に、前記対照群の被検体に対照組成物を投与する工程と、
   （iv）前記試験中に所定の間隔で、前記試験群の被検体および前記対照群の被検体の各々の前記工程（i）と同じ１以上の歯の１以上の画像を取得する工程と、
   （v）各前記被検体の各前記歯における前記基質の被覆率およびサイズを決定して定量化して、前記試験の開始時および／または前記試験の各段階における前記画像と比較するために、前記画像を解析する工程と、
   （vi）前記試験群の被検体と前記対照群の被検体との前記１以上の歯の前記基質の被覆率を比較する工程と、
   （vii）前記被検体の口腔内の基質および／または歯周病を低減、防止、および／または処置することにおける前記試験組成物の有効性を決定する工程と
   を含み、
   前記被検体は、犬または猫であり、
   前記１以上の歯の本数は、前記被検体が犬の場合１８本より少なく、猫の場合１４本より少ないことを特徴とする方法。
2. 前記被検体と前記対照群の被検体とが同じ被検体である、請求項１記載の方法。
3. 前記１以上の歯が前記被検体の上顎内に位置する、請求項１または２に記載の方法。
4. 前記基質が、齲蝕病変部、歯垢、細菌、歯石、着色、および／または、それらの任意の組合せから選択される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
5. 前記伴侶動物が犬または猫である、請求項１、２、３または４記載の方法。
6. 前記画像撮影装置が前記蛍光を検出する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
7. 前記試験組成物が、ペットフード、ペット用おやつ、および／または、ペット用チューから選択される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
8. 前記解析が定量的光励起蛍光法によって行われる、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
9. 前記試験期間が７日間である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
10. 前記試験期間が３日間である、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
11. 猫の口腔内の基質を低減、防止、および／または処置することにおける試験組成物の有効性を決定するための試験において、前記猫の口腔内の基質を検出して定量化する方法であって、
    （viii）蛍光を検出できる画像撮影装置を用いて、前記試験の開始時（０日目）における試験群の猫および対照群の猫の１以上の歯の１以上の画像を取得する工程と、
    （ix）前記０日目における各前記猫の各前記歯における前記基質の被覆率を定量化するために前記画像を解析する工程と、
    （x）前記試験の継続期間にわたって、前記試験群の猫に試験組成物を投与すると共に、前記対照群の猫に対照組成物を投与する工程と、
    （xi）前記試験中に所定の間隔で、前記試験群の猫および前記対照群の猫の各々の前記工程（i）と同じ１以上の歯の１以上の画像を取得する工程と、
    （xii）各前記猫の各前記歯における前記基質の被覆率およびサイズを決定して定量化して、前記試験の開始時および／または前記試験の各段階における前記画像と比較するために、前記画像を解析する工程と、
    （xiii）前記試験群の猫と前記対照群の猫との前記１以上の歯の前記基質の被覆率を比較する工程と、
    （xiv）前記猫の口腔内の基質および／または歯周病を低減、防止、および／または処置することにおける前記試験組成物の有効性を決定する工程と
    を含み、
    前記１以上の歯の本数は１４本より少ないことを特徴とする方法。
12. 前記１以上の歯が前記猫の上顎内に位置する、請求項１１記載の方法。
13. 前記画像撮影装置が前記蛍光を検出する、請求項１１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
14. 前記解析が定量的光励起蛍光法によって行われる、請求項１１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
15. 前記試験期間が７日間である、請求項１１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
16. 前記試験期間が３日間である、請求項１１〜１４のいずれか１項に記載の方法。