CN107106041A - 在宠物动物中定量斑块的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于检测和定量伴侣动物中斑块水平和/或病变的方法，以及这些信息在口腔保健产品试验期间的用途。所公开的方法使得可以在较短时间内对伴侣动物进行试验，而不需要对待测试的口腔保健产品进行长时间和昂贵的试验。所述的方法是在有意识的宠物动物身上进行的。

Description

在宠物动物中定量斑块的方法
技术领域
本发明涉及用于检测和定量伴侣动物中斑块水平和/或病变的方法，以及这些信息在口腔保健产品试验期间的用途。所公开的方法使得可以在较短时间内对伴侣动物进行试验，而不需要对待实施的口腔保健产品进行长时间和昂贵的试验。所述的方法是在有意识的宠物动物身上进行的。
背景技术
维持或改善宠物动物口腔健康的必要性非常重要。口腔健康差可导致牙周病，对宠物动物的健康有严重的影响。
众所周知，宠物动物，特别是犬和猫，在它们的整个生命过程中患有牙周病。所有牙周病病例的发病原因均为斑块(plaque)。斑块是细菌生物膜的积聚。如果斑块未被去除，它会硬化并形成牙垢(结石)，或者它会引起牙龈炎、牙龈萎缩，最终导致牙齿脱落和其它牙周疾病。减少或控制宠物动物中的细菌积聚(斑块)通常是通过机械手段，例如简单地刷牙，或向宠物动物提供咀嚼物或宠物零食，其将斑块从牙齿上刮下来。然而，通过机械手段去除斑块依赖于宠物动物花费足够的时间来咀嚼宠物零食或咀嚼物和/或关于定期给宠物动物刷牙的主人依从性，这些对于主人而言经常难以控制。
一旦动物的牙齿上的斑块变硬成为牙垢(结石)，则斑块可以进一步积累，从而降低了使用机械手段对除去斑块的影响并因此导致宠物动物的牙周病。这样的牙垢(结石)只能通过将动物置于麻醉剂下，由兽医从牙齿中除去，这带有某些风险。
通常，在宠物动物口腔护理产品测试中，试验旨在评估测试组合物去除和/或控制斑块的功效，并且牙齿在试验期间不被刷洗。这些试验可能需要长达28天才能确定测试组合物的功效。其原因是斑块积聚和结石形成的效果只能在第28天清楚地观察到，同样地，测试组合物的功效(即减少斑块和结石积聚的有效性)在更长的时间段内是更准确。
此外，宠物动物通常需要进行全身麻醉，以使技术人员在试验期间确定牙齿上的斑块和/或结石的水平，或至少在开始试验之前进行剔除牙垢和抛光牙齿。
兽医口腔健康理事会(Veterinary Oral Health Council，VOHC)提供建议的猫和犬的牙齿清单，当进行产品功效试验时，可以对其进行评估以获得全面口腔评估。VOHC牙齿清单如下：
犬：上颌-I3，C，P3，P4，M1。下颌-C，P3，P4，M1(18颗牙齿)。
猫：上颌-C，P3，P4。下颌-C，P3，P4，M1(14颗牙齿)。
检测宠物动物中的斑块和/或病变的标准临床方法是麻醉宠物动物，并给予对宠物动物牙齿染色的染料，以显示斑块和/或病变的存在。人类评分员(已经在评估斑块/结石积聚的技能方面受过训练)然后主观地对染色覆盖范围和染料的亮度进行评分，以确定每颗牙齿上斑块的水平和厚度，并确定宠物动物斑块的整个口腔评估。这类方法是基于建立的洛根(Logan)和博伊斯(Boyce)方法。称为牙龈轮廓斑块指数(Gingival Contour PlaqueIndex，GCPI)(由希尔思(Hills)开发)的更近期的临床方法可以在有意识的犬身上进行，其中人类评分员使用牙龈轮廓探针来主观地测量跨牙龈边缘的斑块的长度，使用测量探针以指示每颗VOHC牙齿上的斑块长度，然后可以确定每只动物的全口评估。
标准临床方法需要适合于动物的多种全身麻醉剂，标准临床方法和GCPI方法均存在由人为主观性导致的变化。这降低了它们的准确度，这意味着如果该方法更准确和可再现，则需要比现在的情况更多的数量的动物来测量效果。另外，描述的和已知的标准临床方法，通过评估所要求的VOHC牙齿中的平均斑块和/或结石，然后获得全口评估，利用方法学来检测个体中的斑块和/或结石。
因此，实施的费用高昂，世界范围内可以进行这些类型的试验的地区有限。
因此，需要使口腔护理产品功效试验更准确、主观性更低，并且更容易重复评估的每个步骤，且不需要麻醉宠物动物，但仍然能够确定和评价宠物动物中的斑块水平，以达到预防和/或治疗口腔疾病所需的高标准。还需要使用较少训练有素的人类进行评分方法，并需要减少要经受试验的动物总数。
发明内容
在本发明的第一方面，提供了一种检测和定量个体口腔基质(oral substrate)的方法，包括以下步骤：
(i)使用能够检测荧光的取像装置获得有意识的测试个体的一颗或多颗牙齿的一个或多个图像；
(ii)分析图像；以及
(iii)定量每个个体的每颗牙齿上的基质覆盖范围，
其中测试个体是伴侣动物。
通过本发明的方法检测和定量的口腔基质可以是龋齿病变、牙菌斑、细菌、结石、染色和/或它们的任意组合。优选地，检测到的口腔基质是在牙齿上形成的斑块的早期阶段。
参与本发明方法的个体可以是伴侣动物。伴侣动物可以是犬、猫、马或任何其它患有或容易患有牙周病的伴侣动物。优选地，伴侣动物是犬或猫。
在步骤(i)之前可以训练动物，以便在拍摄一个或多个图像的时间段期间使它保持静止/静态。通过训练动物在获得一个或多个图像所需的时间长度上保持静止，可以获得更准确的图像集。这显然可以更准确地评估斑块积聚的水平。
本发明方法的个体是有意识的(即没有经受麻醉剂)。
该方法可以涉及在动物的一半口腔中拍摄牙齿的一个或多个图像，例如，动物口腔的上半部或下半部。一半口腔可以是左半部或右半部。优选地，一颗或多颗牙齿仅位于测试动物和对照动物的上半部，即上颌中。该方法可以涉及针对犬评估少于18颗牙齿，并且针对猫评估少于14颗牙齿。
基质覆盖范围可以根据一颗或多颗牙齿中的每一颗的发出荧光的面积大小和/或由荧光强度确定的基质深度来确定。
可以使用定性光诱导荧光技术(Qualitative Light-induced Fluorescencetechnology，QLFTM)进行分析。
在本发明的第二方面，提供了一种在试验中检测和定量个体中的口腔基质的方法，以确定测试组合物在减少、预防和/或治疗个体的口腔基质中的功效，其中个体为伴侣动物，所述方法包括以下步骤：
(i)使用能够检测荧光的取像装置，在试验开始(第0天)时获得有意识的测试个体和有意识的对照个体的一颗或多颗牙齿的一个或多个图像；
(ii)分析图像以定量在第0天时每个个体的每颗牙齿上的基质覆盖范围；
(iii)在测试期间内对测试个体给予测试组合物和对对照个体给予对照组合物；
(iv)在试验期间以预定的间隔获得每个测试个体和对照个体的步骤(i)的相同的一颗或多颗牙齿的一个或多个图像；
(v)分析图像以确定和定量每个个体的每颗牙齿上的基质覆盖范围和尺寸，并与试验开始时和试验的每个阶段的图像进行比较；
(vi)比较测试个体和对照个体的一颗或多颗牙齿的基质覆盖范围；以及
(vii)确定测试组合物在减少、预防和/或治疗个体的口腔基质和/或牙周病中的功效。
测试个体和对照个体可以是同一个体；例如在交叉试验设计中。
该方法可以涉及在动物的一半口腔中拍摄牙齿的一个或多个图像，例如，动物口腔的上半部或下半部。一半口腔可以是左半部或右半部。优选地，一颗或多颗牙齿仅位于测试动物和对照动物的上半部，即上颌中。该方法可以涉及针对犬评估少于18颗牙齿，并且针对猫评估少于14颗牙齿。
用于本发明方法的一种或多种组合物可以是消耗和/或给予于伴侣动物的任何宠物产品。宠物产品包括食品，如干燥产品、半微湿产品、潮湿食品饮食、液体，以及宠物食品点心(例如点心棒、宠物咀嚼物、松脆零食、谷物棒、点心、饼干和甜食产品)和补充剂。食品补充剂可以是粉末、酱料、浇头(topping)、饼干、粗磨物、袋状物或片剂，其可以与另外的食品共同给予或不与其共同给予、可以与食品混合、洒在食物上或分开供应或加入到液体如水或牛奶中饮用。
优选地，一种或多种组合物可以是食品、宠物零食和/或宠物咀嚼物。
对照组合物可以是任何市售宠物食品，其是完全且平衡的食物，其为所讨论的犬提供所有建议的维生素和矿物质，例如，如下述文献所述：国家研究委员会(NationalResearch Council)，1985，犬的营养需求(Nutritional Requirements for Dogs)，国家科学院出版社(National Academy Press)，华盛顿特区(ISBN：0-309-03496-5)或美国饲料管理官员协会(Association of American Feed Control Officials)，1996年官方出版物(Official Publication1996)，并且与测试组合物具有等同的营养，但没有任何活性成分，或声称在减少、预防和/或治疗伴侣动物中的口腔基质和/或牙周病方面不具有任何有益效果。
测试组合物可以是任何宠物食品，其具有活性成分和/或被认为具有减少、预防和/或治疗伴侣动物中的口腔基质和/或牙周病的有益效果。
通常，宠物产品试验需要长达28天确定测试组合物的功效。其原因是在更长时间例如从第28天或以后的试验中可以更准确地观察到斑块积聚和结石形成对参与试验的宠物动物的影响，从而允许在参与试验的宠物动物中形成斑块以及结石。本发明的方法的优点在于可以在明显更短的时间内(从少至3天)进行试验，从而防止在参与的宠物动物中形成结石。这显然有助于宠物动物个体的健康，因为斑块可以更容易地从牙齿中去除并保持在试验期间给予对照食品的动物的口腔健康。
本发明的一个重要方面是消除可能由于人类评分员而发生的任何评估的主观性。使用QLFTM或类似的软件平台确保客观评估斑块和/或结石的水平，并获得真实的定性和/或定量结果。
另一个重要的方面是训练动物，以便正在获得一个或多个图像时使它们保持静止。过去，麻醉剂已被用于使动物无意识以获得有关斑块积聚的信息。然而，正如所讨论的，使用麻醉剂对伴侣动物有几个风险。有意识的未经训练的动物很可能会四处移动，使得很难获得一颗或多颗牙齿的一个或多个图像。在本发明中，可以在获得图像之前训练动物。训练也具有有益的效果，动物不会因为摄影而感到惊讶或困惑，因此动物的压力水平较低，有助于它们的健康。
第一方面的所有方面都适用于本发明的第二方面，加以必要的变化。
已熟知的是一些口腔细菌(其形成伴侣动物口腔中斑块和结石的时间基础)自发荧光。
荧光是具有比吸收的辐射更长波长和更低能量的光的发射。可以通过各种手段检测荧光。特别地，使用各种光源作为激发源，导致较低能量的光的发射，通常但不一定是可见光。然后在给定波长处检测光。
本发明的方法使用能够检测荧光的取像装置。这样的装置是本领域公知的。
可以使用检测荧光的任何装置进行荧光检测。荧光从个体牙齿的表面和/或牙釉质内发射。
可以通过检测光的任何手段和/或设备来实现荧光的检测。荧光可以可视地被观察到，也可以通过适当的滤镜被观察到。可以检测荧光，并使用合适的检测器和发射滤镜测量其强度。这可以是在安装在适当的黑暗环境中的CCD检测器和适当的软件之前配备有适当的一个或多个滤镜的数码相机或类似装置。检测光的手段和/或设备可以是通过视觉的或用包括允许检测荧光的滤镜的专门的照相装置。
取像装置(image taking device)能够检测荧光。可以在小于800nm，优选小于450nm的波长下检测荧光。最优选地，荧光辐射是在405nm的波长。取像装置能够在300nm至800nm、400nm至500nm、350nm至700nm或405nm至450nm的波长范围内检测荧光。
诸如数码相机的取像装置能够在试验开始时(第0天)拍摄个体的一颗或多颗牙齿的第一图像，并且在试验期间在预定时间拍摄后续的图像。
将在第0天拍摄的图像以及例如在第3天、第7天、第14天和/或第21天拍摄的后续图像彼此进行比较和/或在测试和对照个体之间进行比较。突出在试验期间斑块形成和/或斑块形成的减少和/或结石形成和/或结石形成的减少的面积，并且可以使用图像分析软件进行定性评分或定量。
可以以定性或定量的方式测量荧光的检测。利用训练有素的人类评分员的目前的临床评分方法确定用于在宠物动物的牙齿上定性和/或半定性地检测斑块的染剂的荧光或颜色变化(给出0-4分)。本发明的方法根据试验开始时和试验期间的每个间隔时在每个个体的每颗牙齿上的面积和深度方面定量基质覆盖范围，以便比较在试验期间每个间隔的斑块形成的量和/或斑块形成的减少。
本发明可以使用定量光诱导荧光技术(QLFTM)。
本发明方法中基质的分析能够有助于确定测试组合物在减少、预防和/或治疗个体的口腔基质和/或牙周病中的功效。
QLFTM可用于检测形成在伴侣动物牙齿表面上的斑块的荧光。QLFTM是一种相对新的方法，目前正批准用于人类斑块的定量。它使用蓝光和自然光，以允许可视化和用或不用染色剂进行的斑块和结石的后续定量。QLFTM依赖于蓝光下细菌物种的自发荧光。使用数码相机实时拍摄图像，并通过图像分析软件进行分析，以定量斑块和结石覆盖范围。或者，可以使用标准显示液(对于本领域技术人员已知)来显示斑块，以显示更多的斑块。该技术允许用户以高精度和重复性来定量如矿物质损失、斑块/结石深度、斑块/结石尺寸、染色尺寸和严重性的参数。软件分析能够确定病变面积(mm2)、斑块/结石深度(荧光百分比(ΔF以％为单位))和病变体积(ΔQ，以mm2为单位)。
QLFTM是一种适用于评估斑块/结石水平的方法的技术，从而适用于本发明的在犬中测试产品功效的方法。QLFTM允许快速测试，无需向宠物动物给予全身麻醉剂。
本发明还涉及(作为第三方面)在有意识的犬中使用荧光以确定在一颗或多颗牙齿上的斑块和/或结石的存在或量从而确定测试组合物在试验期间的功效的用途。
第一方面和第二方面的所有特征均与第三方面相关，加以必要的变化。
通常，在本发明之前，试验期间长达28天以确定测试组合物对个体的结石的影响。通常，对于用于确定针对斑块的功效的试验，本发明已经确定试验期可以少至3天、5天或7天。
本发明的方法在至多14天的试验期内进行。在一些实施方案中，试验期为至少7天。在一些实施方案中，试验期为3至7天。
本发明的方法能够精确地测量有意识的宠物动物中斑块形成的进展。
该方法能够在比本领域已知的现有方法更短的时间内(例如3天、4天、7天、14天或21天)进行精确的斑块和/或结石检测。
本发明能够提供快速、准确地确定在一颗或多颗牙齿上是否存在牙斑和/或结石，而不用使个体麻醉。
本发明的第四方面是一种通过使用QLFTM来检测和定量猫的口腔基质的方法。猫可以有意识或无意识。
在本发明的第四方面，提供了一种检测和定量猫的口腔基质的方法，包括以下步骤：
(i)使用能够检测荧光的取像装置获得猫的一颗或多颗牙齿的一个或多个图像；
(ii)分析图像；以及
(iii)定量猫的每颗牙齿上的基质覆盖范围。
检测和定量的口腔基质可以是龋齿病变、牙菌斑、细菌、结石、染色和/或它们的任意组合。优选地，检测到的口腔基质是在牙齿上形成的斑块的早期阶段。
该方法可以涉及在猫的一半口腔中拍摄牙齿的一个或多个图像，例如，猫口腔的上半部或下半部。一半口腔可以是左半部或右半部。优选地，一颗或多颗牙齿仅位于测试猫和对照猫的上半部，即上颌中。该方法可以涉及评估猫口腔中的少于14颗牙齿。
基质覆盖范围可以根据一颗或多颗牙齿中的每一颗的发出荧光的面积大小和/或由荧光强度确定的基质深度来确定。
可以使用定性光诱导荧光技术(QLFTM)进行分析。
在本发明的第五方面，提供了一种在试验中检测和定量猫的口腔基质的方法，以确定测试组合物在减少、预防和/或治疗猫的口腔基质中的功效，所述方法包括以下步骤：
(i)使用能够检测荧光的取像装置获得在试验开始时(第0天)作为测试个体的猫和对照猫的一颗或多颗牙齿的一个或多个图像；
(ii)分析图像以定量第0天时每个个体的每颗牙齿上的基质覆盖范围；
(iii)在测试期间内对测试个体给予测试组合物和对对照个体给予对照组合物；
(iv)在试验期间以预定的间隔获得每只测试猫和对照猫的步骤(i)的相同的一颗或多颗牙齿的一个或多个图像；
(v)分析图像以确定和定量每个个体的每颗牙齿上的基质覆盖范围和尺寸，并与试验开始时和试验的每个阶段的图像进行比较；
(vi)比较测试猫和对照猫的一颗或多颗牙齿的基质覆盖范围；以及
(vii)确定测试组合物在减少、预防和/或治疗猫的口腔基质和/或牙周病中的功效。
测试猫和对照猫可以是同一只猫；例如在交叉试验设计中。
猫可以有意识或无意识。
该方法可以涉及在猫的一半口腔中拍摄牙齿的一个或多个图像，例如，猫口腔的上半部或下半部。一半口腔可以是左半部或右半部。优选地，一颗或多颗牙齿仅位于测试猫和对照猫的上半部，即上颌中。该方法可以涉及评估猫口腔中的少于14颗牙齿。
用于本发明方法的一种或多种组合物可以是消耗和/或给予于猫的任何宠物产品。宠物产品包括食品，如干燥产品、半微湿产品、潮湿食品饮食、液体，以及宠物食品点心(例如点心棒、宠物咀嚼物、松脆零食、谷物棒、点心、饼干和甜食产品)和补充剂。食品补充剂可以是粉末、酱料、浇头、饼干、粗磨物、袋状物或片剂，其可以与另外的食品共同给予或不与其共同给予，可以与食品混合，洒在食物上或分开供应或加入到液体如水或牛奶中饮用。
优选地，一种或多种组合物可以是食品、宠物零食和/或宠物咀嚼物。
对照组合物可以是任何市售的猫食品，其是完全且平衡的食物，其为所讨论的猫提供所有建议的维生素和矿物质，并且与测试组合物具有等同的营养，但没有任何活性成分，或声称在减少、预防和/或治疗猫的口腔基质和/或牙周病方面不具有任何有益效果。
测试组合物可以是任何猫食品，其具有活性成分和/或被认为具有减少、预防和/或治疗猫的口腔基质和/或牙周病的有益效果。
本发明的一个重要方面是消除可能由于人类评分员而发生的任何评估的主观性。使用QLFTM或类似的软件平台确保客观评估斑块和/或结石的水平，并获得真实的定性和/或定量结果。
第四方面的所有方面适用于本发明的第五方面，加以必要的变化。
本发明的方法使用能够检测荧光的取像装置。这样的装置是本领域公知的。
可以使用检测荧光的任何装置进行荧光检测。荧光从个体牙齿的表面和/或牙釉质内发射。
可以通过检测光的任何手段和/或设备来实现荧光的检测。荧光可以可视地观察到，也可以通过适当的滤镜。可以检测荧光，并使用合适的检测器和发射滤镜测量其强度。这可以是在安装在适当的黑暗环境中的CCD检测器和适当的软件之前配备有适当的一个或多个滤镜的数码相机或类似装置。检测光的手段和/或设备可以是通过视觉的或用包括允许检测荧光的滤镜的专门的照相装置。
取像装置能够检测荧光。可以在小于800nm，优选小于450nm的波长下检测荧光。最优选地，荧光辐射是在405nm的波长。取像装置能够在300nm至800nm、400nm至500nm、350nm至700nm或405nm至450nm的波长范围内检测荧光。
诸如数码相机的取像装置能够在试验开始时(第0天)拍摄个体的一颗或多颗牙齿的第一图像，并且在试验期间在预定时间拍摄后续的图像。
将在第0天拍摄的图像以及例如在第3天、第7天、第14天和/或第21天拍摄的后续图像彼此进行比较和/或在测试和对照个体之间进行比较。突出在试验期间斑块形成和/或斑块形成的减少和/或结石形成和/或结石形成的减少的面积，并且可以使用图像分析软件进行定性评分或定量。
可以以定性或定量的方式测量荧光的检测。利用训练有素的人类评分员的目前的临床评分方法确定用于在宠物动物的牙齿上定性和/或半定性地检测斑块的染剂的荧光或颜色变化(给出0-4分)。本发明的方法根据试验开始时和试验期间的每个间隔时在每个个体的每颗牙齿上的面积和深度方面定量基质覆盖范围，以便比较在试验期间每个间隔的斑块形成的量和/或斑块形成的减少。
本发明可以使用定量光诱导荧光技术(QLFTM)。
本发明方法中基质的分析能够有助于确定测试组合物在减少、预防和/或治疗猫的口腔基质和/或牙周病中的功效。
QLFTM可用于检测形成在伴侣动物牙齿表面上的斑块的荧光。QLFTM是一种相对新的方法，目前正批准用于人类斑块的定量。它使用蓝光和自然光，以允许可视化和用或不用染色剂进行的斑块和结石的后续定量。QLFTM依赖于蓝光下细菌物种的自发荧光。使用数码相机实时拍摄图像，并通过图像分析软件进行分析，以定量斑块和结石覆盖范围。或者，可以使用标准显示液(对于本领域技术人员已知)来显示斑块，以显示更多的斑块。该技术允许用户以高精度和重复性来定量如矿物质损失、斑块/结石深度、斑块/结石尺寸、染色尺寸和严重性的参数。软件分析能够确定病变面积(mm2)、斑块/结石深度(荧光百分比(ΔF以％为单位))和病变体积(ΔQ，以mm2为单位)。
QLFTM是一种适用于评估斑块/结石水平的方法的技术，从而适用于本发明的在猫中测试产品功效的方法。
本发明可以使用来自进行测试的动物的口腔的一颗或多颗牙齿、来自口腔的上颌或下颌的一颗或多颗牙齿、来自颌的右下侧或右上侧和/或来自颌的左下侧或左上侧的一颗或多颗牙齿或它们的组合(例如，半口(上/下颌，颌的右/左侧)或四分之一口腔分析)的图像。特别地，本发明的优点是能够确定测试动物口腔中斑块和/结石的量，其是通过简单地检测口腔上颌的一颗或多颗牙齿中的斑块和/或结石的量，并准确地关联至被测动物的整个口腔中的斑块和/或结石的量，和/或检测在口腔上颌的一颗或多颗牙齿中的斑块和/结石的量来检测对照组和测试组之间的差异。该方法能够评估针对犬的少于18颗牙齿和针对猫的小于14颗牙齿来确定全口评估。该方法可以评估犬的少于18、17、16、15、14、13、12，11、10、9、8、7、6、5、4、3、2颗牙齿或单个牙齿，以确定全口评估。该方法可以评估猫的小于14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2颗牙齿或单个牙齿来确定全口评估。
这提供了相对于现有已知方法的优点，不仅在于本发明能够在有意识的宠物动物中进行，它能够以更短的时间范围(3天、7天、14天、21天而不是28天)提供试验结果，并且还能够通过测量口腔的上颌或下颌的一颗或多颗牙齿、来自口腔的颌的右下侧或右上侧或来自口腔的颌的左下侧或左上侧的一颗或多颗牙齿或它们的组合的荧光来确定动物个体的整个口腔中的斑块和/或结石的量。本发明确定了对宠物产业更快更可靠的方法学。
现在将通过参考以下实施例和附图进一步描述本发明，这些实施例和附图仅为了说明的目的而提供，而不应解释为限制本发明。
附图说明
图1：示出进行的试验设计的示意图(持续时间为21天)。
图2：示出犬的全口(上下颌)和用于标记口中牙齿的各自的数值系统的示意图。
图3：示出每只犬每日斑块覆盖范围百分比的平均口腔结果。
图4：示出两只示例犬的每个重复的每颗牙齿斑块覆盖范围百分比随时间变化的单个牙齿结果。
图5：示出通过牙齿、犬和摄影师证明了斑块覆盖范围百分比的103到108的未显露的单个牙齿结果的再现性。
图6：示出通过牙齿、犬和摄影师证明了斑块覆盖范围百分比的203到208的未显露的单个牙齿结果的再现性。
图7示出通过犬和摄影师的每天通过QLFTM在未显露的牙齿上测定的斑块覆盖范围百分比(全口平均值：I3、C、P3、P4)。
图8：根据犬、天数和重复的通过QLFTM在未显露的牙齿上测定的斑块覆盖范围百分比(全口平均值，包括上颌P1、P2、P3、P4)的变异性(variability)的图。
图9：显示了与无咀嚼物(三角形)相比，在喂食口腔护理咀嚼物(圆圈)的有意识的犬中，在1周、2周、3周和4周时的全口平均斑块百分比(上颌I3、C、P3和P4)。平均值表示为实心形状，具有95％置信区间。
图10：由四个样本显露的牙齿上，在图像处理(Photoshop)中标记斑块的五位人类评分员识别的斑块和由QLFTM软件识别的斑块的视觉表示。
图11：在上颌第三门齿、上颌和下颌犬齿以及第3和第4前臼齿(显露的牙齿)[103、104、107、108和404、407、408和409]上，由在图像处理(Photoshop)中标记斑块的五位人类评分员识别的(三角形和正方形)和QLFTM软件(圆圈)识别的平均斑块覆盖范围百分比的变异性的图。
图12：示出在双向交叉试验(清洁口腔模型)中，与无咀嚼物相比，当喂食口腔护理咀嚼物时，检测到斑块积累减少15％的功效曲线。
图13：表示当喂食口腔护理咀嚼物对比无咀嚼物时，有意识的犬(圆圈)的仅上颌(I3、C、P3、P4)和无意识的犬(三角形)的上颌(I3、C、P3、P4、M1)和下颌(C、P3、P4、M1)的平均斑块覆盖范围。平均值表示为实心形状，具有95％置信区间。
图14：分别示出具有和不具有口腔护理咀嚼物的牙齿类型的对于天数的平均斑块覆盖范围％(LSD＝最小显著性差异，柱代表在5％显著差异所需的平均值之间的中值差异)，其中，图14A没有基线调整，图14B有基线(第0天)调整。
图15示出每日喂食口腔护理咀嚼物(正方形)的犬和接受无咀嚼物(圆圈)的犬的对于天数的平均斑块覆盖范围％，具有95％置信区间。
图16：示出使用定量口腔斑块覆盖范围的三种不同方法，不喂食咀嚼物的犬和喂食标准咀嚼物的犬的从基线起的斑块覆盖范围％的平均差异，具有95％置信区间。
图17：(猫重复性数据)示出每张重复照片的根据猫的平均牙齿斑块覆盖范围百分比。
图18：(猫再现性数据)示出每位摄影师的根据猫的平均牙齿斑块覆盖范围百分比。
图19：(猫牙科饮食功效)示出根据饮食和猫的平均牙齿斑块覆盖范围百分比，具有95％置信区间。
图20：示出根据饮食的每颗牙齿的平均斑块覆盖范围百分比，具有95％置信区间。星号表示牙齿内饮食之间的显著差异，p＜0.05。
图21示出各子组牙齿的方差分量和饮食差异的后续结果。
图22：列出了动物中牙齿的编号系统(图21A)，以及犬和猫中建议的牙齿的兽医口腔健康理事会(VOHC)列表(图21B)。
图23：列出了在本发明的实施例中评估的和如图所示的牙齿。
具体实施方式
以下实施例显示用于验证定量光诱导荧光(QLFTM)用于定量动物斑块水平的用途的方法，其通过评估其重复性、再现性和准确性并将其与已建立的临床评分系统进行比较来进行。使用犬进行试验以确定(i)摄影师自身的重复性，(ii)摄影师之间的再现性，以及(iii)与当前评分方法的比较，以及用有意识的犬证明7天试验并在猫中使用该方法学。
实施例1：摄影师自身的重复性
该实施例的目的是确定使用QLFTM测量犬牙齿斑块覆盖范围时摄影师自身的重复性。
选择年龄在2.5至6.9岁之间的11只迷你雪纳瑞犬(miniature schnauzer dog)的小组大小(panel size)。所有的犬都接受了近期的剔除牙垢和抛光(在最近一个月内)，有很少或没有可见的结石。在试验开始之前，每天给犬刷牙持续约一周，并且在其基线测量之前的试验的第一天中最后为其刷牙。三周(21天)的试验期间，犬后续没有接受刷牙。试验期间所有的犬都有意识。
3周(21天)的试验阶段被确定为足够长以允许积累高水平的斑块。在试验期间，为犬喂食混合的湿润和干燥的饮食，并且每天给予测试组咀嚼物(咀嚼物对比(vs.)无咀嚼物)。
在第1天、第3天、第7天、第14天和第21天由单一摄影师通过QLFTM拍摄未显露的牙齿的图像。在第3天、第7天、第14天和第21天，拍摄三个重复的图像，早上两个，下午一个，并且在第1天拍摄两个重复的图像(参见图1)。在所有这些天拍摄的图像给出了一系列不同的斑块覆盖范围，这对于评估整个范围内的摄影师自身的变异性(variability)非常重要。
通过拍摄捕获牙齿号码(tooth numbers)103-108和203-208的上颌的四幅图像来获得测量结果。参见图2。
图2：显示犬的整个口腔(上下颌)和用于对口中牙齿进行评分的相应数值系统的示意图。已知VOHC临床评分方法需要从上颌的03、04、07、08、09和下颌的04、07、08、09对牙齿进行评分。在牙齿号码101至108和201至208间测量斑块覆盖范围的量(如图所示)。
为了减少肌肉记忆对成像的相机的定位的影响，将试验设计为使得检验员连续对所有的犬进行成像，然后回到第一只犬，并对它们所有再次进行成像，作为重复组。午饭后，然后拍摄第三组图像。这意味着3幅图像之间的时间在图像1和2之间为约1小时，在图像2和3之间为约1 1/2小时。
一组图像包括口腔周围的五个视图；拍摄犬口腔左侧和右侧的两个图像，以可视化上颌第一前臼齿(P1；105、205)，第二前臼齿(P2；106、206)，第三前臼齿(P3；107、207)和第四前臼齿(P4；108、208)和一幅从前面拍摄的图像以可视化上颌和下颌的第一门齿(I1；101、201、301、401)、第二门齿(I2；102、202、302、402)、第三门齿(I3；103、203、303、403)和部分犬齿(C；104、204、304、404)。参见图2。
图像的牙齿组 由拍摄的图像评定的牙齿号码
上颌第一前臼齿(P1) 105、205
第二前臼齿(P2) 106、206
第三前臼齿(P3) 107、207
第四前臼齿(P4) 108、208
上颌和第一门齿(I1) 101、201、301、401
第二门齿(I2) 102、202、302、402
第三门齿(I3) 103、203、303、403
部分犬齿(C) 104、204、304、404
统计
线性混合效应模型(REML)用于估计斑块覆盖范围百分比的方差分量。首先是包括所有牙齿的模型，使用嵌套在犬内的牙齿内的嵌套在时间内的重复作为拟合随机效应，然后再次对于每种牙齿类型，使用嵌套在犬内的嵌套在时间内的重复。然后计算可计算重复性的变异性百分比和变异性百分比系数(相对于模型的总体平均值的重复性标准偏差)。
结果
使用QLFTM图像分析软件分析来自十一只迷你雪纳瑞的1584个未显露上颌牙齿(P1、P2、P3、P4)和198个前视图(单图像捕获I1、I2、I3和部分犬齿)的图像，以定量斑块覆盖范围(图3和图4)。
图3：示出与无咀嚼物相比，接受咀嚼物的11只犬(A-K)的平均斑块覆盖范围百分比。在第0天、第3天、第7天、第14天和第21天采集了三组图像(1-3)。分别且共同地从牙齿105、106、107、108、205、206、207和208以及前齿(101、102、103，部分的104、201、202、203和部分的204)的计算机图像获得斑块覆盖范围百分比的测量结果。这项研究表明，可以在有意识的犬中获得牙齿图像，并且可以在3-21天的时间范围内测量斑块积累的量。还可以看出，接受咀嚼物的犬通常比未接受咀嚼物的犬具有较低的斑块水平。
使用方差分量分析来定量天数、牙齿和犬之间的摄影师自身的重复性。上颌前臼齿的重复性变异系数(100*相对于平均斑块覆盖范围的标准偏差)为7.5％。
还计算了每颗牙齿的天数和犬间的重复性变异分量(见表2和图4)。
图4：示出对于两只犬和三个重复图像组(1-3)的每个上颌前臼齿(105至108和205至208)和前齿(上颌和下颌门齿和部分犬齿的平均值)随时间的变化(第0天、第3天、第7天、第14天、第21天)的斑块覆盖范围百分比的示例。QLFTM能够随着时间的推移分析单个牙齿中的斑块覆盖范围，这对于针对特定牙齿的产品是非常有益的。
QLFTM方法显示出良好的重复性，除了牙齿206(5.2％)和前齿(27.9％)外，评估的大多数牙齿占数据中总变异性的＜1.4％。对于分析的大多数牙齿，获得相对于牙齿平均值的方差分量显示变异系数百分比(CV％)在6％至16％的范围内，除了206(30％)和前齿(79％)。这些牙齿具有最低的平均斑块覆盖范围百分比，齿206和前齿(front teeth)分别为7.7％和0.68％，这可能有助于增加相对变异性。然而，如果使用这种技术来支持产品功效性要求，则这些牙齿上的高CV％几乎没有影响，因为P3和P4是本试验中评价的唯一牙齿，这是VOHC要求验证试验所要求的，QLFTM显示这些牙齿的重复性最高，CV％<9％。相比之下，根据Hennet等人2006的信息，改进的L&B重复性估计为>29％。
表2：八个单独牙齿和前齿的变异性和CV％
齿 方差分量 SD 变异性％ 平均值 CV％
105 2.02 1.42 0.87 9.643 14.74
106 1.85 1.36 1.36 9.597 14.16
107 2.91 1.71 0.83 25.77 6.62
108 3.18 1.78 0.69 28.73 6.20
205 2.60 1.61 1.13 10.29 15.68
206 5.04 2.24 6.19 7.386 30.39
207 3.53 1.88 0.94 20.83 9.02
208 6.24 2.50 1.54 20.47 12.20
前齿 0.29 0.54 28.47 0.6535 81.98
这项试验的目的之一是评估如何使用这种技术。在随后的试验中，前齿未成像，从侧面拍摄更多的图像，以确保拍摄所有VOHC牙齿(可见的)。
综上所述，该研究表明可以在有意识的犬中获得上颌牙齿的图像。QLFTM是可重复的，斑块数量的变化可以在3天到21天的时间范围内测量。针对单个牙齿可确定斑块覆盖范围水平，这有利于针对特定牙齿的产品。
实施例2-用户间再现性
这个实施例的目的是评估五位摄影师在使用QLFTM测量有意识的犬的斑块覆盖范围时的再现性。
五位摄影师在用相同的干燥饮食喂食的有意识的迷你雪纳瑞(N＝12)中拍摄牙齿图像。犬在开始试验前每隔一天刷牙。在拍摄图像评估不同水平的斑块和结石之前的1天、10天和21天，停止牙刷。每位摄影者在2小时内拍摄齿103-108和203-208的图像(图5)。
线性混合模型(REML)用于估计斑块覆盖范围百分比的方差分量，嵌套在犬中的摄影师作为随机效应。然后计算对摄影师可计算的变异性百分比和CV％(相对于模型的总体平均值的再现性标准偏差)。
确定480个未显露的上颌牙齿(I3、C、P3和P4)的斑块覆盖范围百分比，每个摄影师96个。选择的牙齿是根据VOHC标准产品测试方案定义的使用改进的洛根&博伊斯(Logan&Boyce)方法评分的牙齿。图5和图6：示出对于12只犬(A-L)和5名摄影师(1-5)的单个牙齿的斑块覆盖范围百分比(图5示出牙齿103至108，图6示出牙齿203至208)。平均牙齿变异系数(相对于平均斑块覆盖范围的平均值％)为10.9％CV。该数据表明，QLFTM可用于重复测量单个牙齿上的斑块数量。
口腔平均值范围为从1.2％到41.2％的斑块覆盖范围(图7)，口腔平均的摄影师间再现性变异系数为3.21％。
图7：由犬和检查员在未显露的牙齿上由QLFTM确定的斑块覆盖范围百分比(全口平均值：I3、C、P3、P4)。该图示出来自拍摄12只犬(A-L)的5名摄影师(1-5)的平均斑块覆盖范围的再现性。相对于不同摄影师之间的平均覆盖范围百分比(CV％)的变化为3.2％。与标准的改良洛根&博伊斯(基于Hennet等人2006)相比，具有8.8％的CV。
综上所述，QLFTM是可重现的，斑块覆盖范围百分比可以在有意识的犬的上颌的单个牙齿中测量。停止牙刷后1天、10天和21天可以定量斑块数量。
图8：犬(A-K)的未显露的牙齿在以下天数(0、3、7、14、21)和重复(1-3)上由QLFTM测定的斑块覆盖范围百分比(全口平均：上颌P1、P2、P3、P4)的变异性绘图。
在有意识的犬停止牙刷后3天、7天、14天和21天，可以在每个上颌前臼齿上测量斑块覆盖范围百分比。
实施例3：斑块积累的纵向评估-确定可以测量斑块覆盖范围的时间表
这个实施例的目的是确定是否可以随时间测量斑块覆盖范围的水平，以及在什么阶段可以看到治疗效果之间的显著差异。
试验表明，在有意识的犬中可以在比正常的28天测试阶段更短的时间内测量产品功效。
该试验设计为评估QLFTM是否可以在产品测试阶段在第1周、第2周、第3周和第4周在有意识的犬中测量产品差异。在两相交叉研究中的每个28天测试阶段的持续时间内，每周对10只犬有意识地进行成像。由于难以进入有意识的犬下颌牙齿，因此仅拍摄上颌I3、C、P3和P4的图像。
统计
使用线性混合效应模型，对通过QLFTM测量的斑块覆盖范围百分比进行分析，按周特异性变异加权，以允许随时间增加的方差。犬作为随机效应以说明犬和咀嚼物类型的重复测量结果，周及其相互作用被包括作为固定效应。使用5％的总体控制错误率(familywise controlled error rate)，在每周咀嚼类型之间进行对比。(R v3.02使用库nlme和multcomp)。
结果
在全口平均斑块覆盖范围(VOHC牙齿I3、C、P3、P4)的第1周、第2周、第3周和第4周(见图9和表3)，在咀嚼物和无咀嚼物之间发现显著差异。
一周后，当比较咀嚼物与无咀嚼物时，观察到斑块覆盖范围降低74％(95％上限和下限置信区间分别为54.3％和93.6％)(参见表3)。
表3：与无咀嚼相比，犬接受口腔护理咀嚼时的斑块减少百分比和显著性。
图9。与无咀嚼物(三角形)相比，喂食口腔护理咀嚼物的犬(圆圈)在1周、2周、3周和4周时的全口平均斑块百分比(上颌I3、C、P3和P4)。实心形状说明了平均值并且条形图描绘了95％置信区间。
综上所述，这项研究表明，QLFTM图像可以在有意识的犬的上颌牙齿上获得，并且可以在短至七天的时间范围内确定喂食口腔护理咀嚼物的犬和没有接受咀嚼物的犬之间的斑块积累的减少百分比的显著差异。
实施例4-评估QLFTM软件的准确性。
通过与由QLFTM获得的图像上的由五位人类评分员手动标记的斑块确定的斑块覆盖范围水平进行比较，来确定QLFTM软件正确识别斑块的能力。
将QLFTM软件结果与来自五位经过训练的人类斑块评分员的结果进行比较，使用具有一系列斑块覆盖范围的50颗牙齿的照片。参见图10。图10：在四个样品显露的牙齿上在Photoshop中由五位人类评分员识别的斑块和由QLFTM软件识别的斑块的视觉表示。
对通过五位人类评分员评估的九只犬的全口得分，通过嵌套在犬中的评分员拟合为随机效应的线性混合模型进行分析。然后使用方差估计来通知模拟1000名评分员(使用来自5名人类评分员发现的平均斑块覆盖范围)。QLFTM软件结果落入人类评分员结果分布的概率是通过平均值小于平均QLFTM软件得分的模拟评分员的百分比来计算的。使用5％的测试水平。
在0.6％至100％(最小值，最大值)的整个斑块覆盖范围之间，五位评分员和QLFTM软件之间可见的斑块识别具有高水平的一致性。五位评分员的方差模拟显示，QLFTM软件与人类评分员没有显著差异，10％的模拟人类评分员的平均斑块覆盖范围百分比低于QLFTM软件(p＝0.1)。参见图11。图11：在Photoshop(三角形和正方形)和QLFTM软件(圆圈)上由标记斑块的五位人类评分员识别的上颌第三门齿、上颌和下颌犬齿以及第三和第四前臼齿(显露的牙齿)的斑块覆盖范围百分比的变异性示图。图11a示出了在上颌(103、104、107、109)中分析的牙齿的结果，图11b示出了在下颌(404、407、408、409)中分析的牙齿的结果。分析的牙齿是在标准临床评分研究中使用的下颌和上颌VOHC牙齿。
实施例5-QLFTM与改进的洛根和博伊斯的比较。
本研究将QLFTM与已建立的斑块评分方法改进的洛根和博伊斯方法进行比较(Hennet等人2006)。
改进的洛根&博伊斯方法使用显露的斑块并将牙齿分解成牙龈和冠状半部，然后根据那半部上的斑块覆盖范围百分比在0和4之间分配得分，并根据斑块的厚度在1至3之间打分。通过乘以覆盖范围和厚度得分计算每颗牙齿半部(牙龈和冠状部)的总斑块得分。然后加入牙龈和冠状部得分以得到总牙齿评分。所有牙齿评分的平均值提供了口腔得分。评估中包括以下牙齿：上颌I3、C、P2、P3、P4和第1臼齿(M1；109、209)，以及下颌C、P2、P3、P4和M1(309、409)。
犬以市售成年干燥饮食维持生命，并且如前所述进行产品功效研究。通过使用公开的方案和使用改进的洛根和博伊斯(Logan&Boyce)(Hennet等人2006)和QLFTM确定的斑块的量来可视化犬牙齿上的斑块。数据通过线性混合效应模型进行分析，犬作为随机效应，以说明反复测量，产品作为固定效应。产品在5％的测试水平进行比较。
在喂食口腔护理咀嚼物与不喂食咀嚼物的犬之间的斑块积累的减少百分比中证明了QLFTM和改进的洛根和博伊斯方法之间的良好一致性(表4)。当比较喂食口腔护理咀嚼物和不喂食咀嚼物的犬时，该方法在产品功效上产生了类似的结果，通过改进的洛根和博伊斯的斑块积聚减少22％，通过QLFTM测量的减少19％。通过QLFTM测量的斑块积累的减少在洛根和博伊斯结果的95％置信区间内，QLFTM所观察到的减少的置信区间的宽度是洛根和博伊斯的52％，表明了QLFTM的较小的变异性。
表4：通过QLFTM和改进的洛根和博伊斯方法测量的产品功效的比较。
回顾性功效分析显示，与使用具有至少90％功效的改良洛根&博伊斯方法学相比，使用QLFTM测量斑块积累减少15％将需要较少的犬。
图12示出了功效曲线，其在双向交叉试验(26只犬，清洁口腔模型)中，喂食口腔护理咀嚼物与不喂食咀嚼物相比时，检测到斑块积累减少15％。实线描绘QLFTM(显露的牙齿(disclosed teeth))，虚线描绘改进的洛根&博伊斯方法，点划线描绘QLFTM(未显露的牙齿(undisclosed teeth))。要测量减少15％将需要七只QLFTM犬，而洛根&博伊斯方法学(90％功效)则需要19只。
QLFTM不如改进的洛根&博伊斯方法主观。它还更快速；摄影师需要的训练较少，并且可以存储图像以提供用于将来使用的永久数据库。此外，在牙科产品功效试验中，需要较少的动物来测量相同大小的效果。
总之，通过QLFTM测量的斑块积累的减少百分比在使用改进的洛根&博伊斯方法确定的斑块积累的减少百分比的范围内。此外，在牙科产品功效试验中，需要较少的动物来测量相同大小的效果。使用较少的动物和有意识的犬进行研究的能力支持在科学研究中支持动物人道主义使用的两项指导原则；即将使用的动物数量减少到最低限度，并进行实验方法改进以改善动物福利。
实施例6–有意识与无意识的犬
在短时间范围内测量有意识的犬中的斑块的方法对于测试新的或改进的口腔护理产品是非常需要的(与28天标准测试试验相反)。
为有意识的QLFTM成像而训练犬，包括：
-进行/不进行显露的方案
-塑料面颊牵引器，以查看前臼齿
-仅上颌。
在交叉研究的每个测试阶段结束时，在被置于麻醉之前，还有意识地为犬拍摄未显露的牙齿的QLFTM图像。
通过使用线性混合模型分析来自有意识犬(上颌牙齿的平均值)和麻醉犬(所有VOHC牙齿的平均值)的未显露牙齿的QLFTM测量的斑块覆盖范围百分比，犬作为随机效应以说明对犬和测量类型的重复测量，产品及其相互作用作为固定效应。咀嚼物类型之间的对比在5％水平的测量之间进行比较。如图13所示，其代表当喂食口腔护理咀嚼物对比物咀嚼(x轴)时，有意识的犬(圆圈)的仅上颌(I3、C、P3、P4)和无意识的犬(三角形)的上颌(I3、C、P3、P4、M1)和下颌(C、P3、P4、M1)的平均斑块覆盖范围(y轴)。柱描绘了95％置信区间。
对于两只犬有意识地成像(P<0.001)和相同的十只犬无意识成像(P<0.001)，口腔护理咀嚼物和无咀嚼物之间存在显著差异。
对于无咀嚼物和口腔护理咀嚼物，有意识成像(未显露)的犬的平均斑块覆盖范围分别为27.6％(22.2％，33.2％)和7.6％(2.1％，13.1％)，斑块积累减少为72.6％(54.0％，91.2％)。当麻醉(未显露)对相同的十只犬成像时，物咀嚼物时平均斑块覆盖范围为30.5％(25.0％，36.1％)，当喂食口腔护理咀嚼物时为9.5％(4.0％，15.0％)，斑块积累减少69.0％(52.1％，85.8％)。这在下表5中示出。
表5：显示统计结果
在有意识和无意识的犬之间，在喂食口腔护理咀嚼物的犬和不喂食咀嚼物的犬之间斑块积累的减少百分比中没有发现显著差异(P＝0.984)。
综上所述，产品性能可以在有意识的犬和麻醉的犬中区分开来。另外，当仅评价上颌牙(I3、C、P3、P4)而不是全口(VOHC牙齿)时，对犬喂食口腔护理咀嚼物与没有咀嚼物时相比，斑块积累的减少百分比没有显著差异。
实施例7-重复性研究
该研究的目的是评价在接受口腔护理咀嚼物和未接受咀嚼物的犬之间的平均斑块覆盖范围随时间的差异。
研究设计如实施例1所述。
牙齿类型上未显露的：
对在第0天、第3天、第7天、第14天和第21天收集的未显露的数据进行了混合模型分析。随机效应拟合为嵌套在犬中的齿中嵌套的天数。牙齿、天数、咀嚼物及其相互作用拟合为固定效应。
牙齿、天数和咀嚼物之间的相互作用是显著的(p<0.001)，因此随时间的斑块覆盖范围的变化随牙齿类型而变化，并且加入口腔护理咀嚼物时这也不同(图14A)。
在试验的第0天，牙齿类型之间的平均斑块覆盖范围为0％到23％，对于有口腔护理咀嚼物的犬，该范围略大。
如果对于每个时间点(从每个时间曲线的第0天以及在每个时间点的每种牙齿类型的有口腔护理咀嚼物和物口腔护理咀嚼物)的齿类型之间的比较数进行多重调整，则在有口腔护理咀嚼物时没有发现随时间的显著变化。当无口腔护理咀嚼物时，牙齿107、108、207和208在第0天有显著增加。
图14A：有和无口腔护理咀嚼物时各自的天数和牙齿数的平均斑块覆盖范围％(LSD＝最小显著差异，条代表在5％显著差异所需的平均值之间的中值差异)。
为了研究第0天变异性对结果的影响，在混合模型分析中将第0天的平均重复用作协变量，嵌套在犬内的齿中嵌套的天数作为随机效应，咀嚼物、牙齿、天数及其相互作用作为固定效应。
牙齿、天数和咀嚼物之间的相互作用是显著的(p＝0.002)，因此斑块覆盖范围随天数的变化随牙齿类型而变化，加入口腔护理咀嚼物时这也是不同的。
图14B：对于第0天按天数和牙齿类型调整的斑块覆盖范围平均百分比，分别为有口腔护理咀嚼物和无口腔护理咀嚼物(LSD＝最小显著差异，柱代表在5％显著差异所需的平均值之间的中值差异)。
综上所述，有意识的犬的单个牙齿的图像可用于测量斑块数量水平随时间的变化，即使不使用清洁口腔模型时也是如此。单个牙齿可用于在口腔护理产品与对照组之间区分。
在牙齿类型(无前齿)上平均的未显露的，即口腔平均值：
对第0天、第3天、第7天、第14天和第21天收集的未显露的数据进行了混合模型分析，不包括前齿数据。随机效应拟合为嵌套在犬中齿中嵌套的天数。天数、咀嚼物及其相互作用拟合为固定效应。
天数和咀嚼物之间的相互作用是显著的(p<0.001)，因此如果存在咀嚼物时，斑块覆盖范围随天数的变化是不同的(参见图15)。图15示出每日喂食口腔护理咀嚼物的犬(方形)和不喂食咀嚼物的犬(圆圈)对天数的平均斑块覆盖范围％，具有95％置信区间。
使用0.004的测试水平(＝0.05/12-12-16比较，包括每个咀嚼物内从第0天到每个时间点的差异，加上咀嚼物之间从第0天到每个时间点的差异的比较)，可知
-在有咀嚼物中，从第0天到第14天和第21天有显著增加，p＝0.001，其中差异均大于6.0％(第7天在未调整水平上显著不同，p＝0.014)
-在无咀嚼期中，从第0天到第7天、第14天和第21天有显著增加，p<0.001，其中差异范围从6.5％至18.4％(第3天在未调整水平上显著不同，p＝0.03)
-咀嚼物之间，与咀嚼物相比，无咀嚼物的从第0天到第3天、第7天、第14天和第21天的差异较高，在第21天显著较高，p<0.001(第14天在未调整水平上显著不同，p＝0.005)
因此，相互作用是由于无咀嚼物组平均斑块％的增加更快。下表说明了有咀嚼物和无咀嚼物时随时间的差异的这些结果，其具有调整的95％置信区间。
表6具有95％置信区间和p值的平均斑块覆盖范围％的比较[是＝咀嚼物，否＝无咀嚼物]。
综上所述，斑块积累百分比的显著增加可以早到在三天来测量。当给犬喂食口腔护理咀嚼物时，与无咀嚼物相比，可以检测斑块积聚速率的差异。
实施例8：使用QLFTM方法学进行有意识的7天试验
这项研究的目的是使用定量光诱导荧光对有意识的犬在每7天的试验阶段进行斑块积聚的定量。
使用清洁口腔模型的十三只迷你雪纳瑞犬，即在试验开始时，它们接受了单一的剔除牙垢和抛光，以将其牙齿设定为基线，即无斑块或结石。
在随机交叉设计中，犬每天不喂食咀嚼物或喂食口腔护理咀嚼物持续七天，即每只犬接受两种“处理”。
进行QLFTM斑块成像，使用QLFTM图像采集软件分析图像。
在有意识的犬上进行QLF水平，并增加显示液来可视化在蓝光下不发荧光的较薄的不成熟的斑块。因此，该方法是QLF和测面法的混合。添加滤色器可以自动计算显露的斑块。
在每七天阶段的开始和结束时进行QLF，以给出基线斑块测量结果。在每个阶段开始时，利用刷牙以将牙齿重设为基线斑块。在每个阶段之间不需要全身麻醉，因为试验的短暂性意味着有限的结石形成，因此不需要无意识的剔除牙垢和抛光。
该方法使得上颌上的8个牙齿(103、203、104、204、107、207、108和208)可视化，作为斑块发展/去除的指示。
统计
使用分析软件进行斑块水平的图像分析。对于每颗牙齿，数据采用在总牙面积像素上的荧光/染色像素的计数的形式，以给出每个时间点8个指示牙齿(103、203、104、204、107、207、108和208)中的每一颗的斑块覆盖范围百分比。数据集以三种方式分析：
(1)单个牙齿的覆盖范围％。对于每颗牙齿，从阶段结束时的覆盖范围％减去基线的覆盖范围％。在线性混合模型中，将该测量结果即基线修正的覆盖范围％用作响应，其中，治疗作为固定效应，犬和犬内的牙齿作为随机结构。残差的目视检查表明不需要进行任何变形。使用似然比检验来评估牙齿随机效应的必然性，这导致了该项的去除。
(2)牙齿间的平均覆盖范围％。对于每颗牙齿，从阶段结束时的覆盖范围％减去基线的覆盖范围％。对于每只犬，计算这些值的平均值。在线性混合模型中，将基线修正的平均覆盖范围％用作响应，其中，治疗作为固定效应，犬作为随机效应。残差(residuals)的目视检查表明不需要进行任何变形。
(3)口腔覆盖范围％。对于每只犬，通过将所有牙齿上的荧光像素相加并除以所有牙齿之间的总像素数之和，然后乘以100，在每个测量时间计算全口的覆盖范围％。从阶段结束时的全口覆盖范围％中减去基线处的全口覆盖范围％。在线性混合模型中，将该测量结果即基线修正的全口覆盖范围％用作响应，其中以治疗为固定效应，犬作为随机效应。残差的目视检查表明不需要进行任何变形。
对于所有三种模型，对每次治疗，提取了95％置信区间的估计值，并进行了治疗比较。
所有这三项分析显示治疗之间有显著差异(参见图16)。图16示出同一图上的所有三个结果。图16示出用于平均值的95％置信区间的同一图上的所有三个结果。这表明在7天的治疗阶段中，在这种情况下是使用日常牙科咀嚼物治疗诱导，可以显示斑块覆盖范围的显著差异。使用所有三种不同的分析方法观察到差异，表明可以在单颗牙齿差异水平通过全口平均斑块得分有效询问数据。
前两种方法提供了与数学预期相同的估计值，但是牙齿间的平均值显得更加可变。第三种方法是最易变的，并给出了覆盖范围％略有不同的估计值。这是预期的，因为第一方法和第二种方法不会通过其尺寸来加权牙齿。
这项研究表明，来自有意识的伴侣动物的个体牙齿上的斑块积累可以提供显著的结果，并且在测量特定指示牙齿时可以在斑块去除中确定如此显著的差异。使用有意识的动物可以缩短研究阶段(因为不需要在研究阶段之间全身麻醉，所以不需要全身麻醉之间建议的4周的间隙)。该数据的功效分析表明，需要较少的动物识别出与当前接受的改进的洛根博伊斯无意识评分的黄金标准测量相同的斑块覆盖范围差异。
综上所述，通过消除在全身麻醉之间需要4周恢复时间，在有意识的犬上使用QLFTM允许获得较短的研究治疗阶段。研究表明，在7天的治疗阶段之后，仅使用上颌上的指示牙齿，可以显示出通过口腔护理治疗诱导的斑块积累的显著差异。
实施例9-在无意识的猫上验证QLFTM
这项研究的目的是定量变异性并验证使用QLFTM方法学来测量猫的斑块，以及在无意识的猫上使用QLFTM来证明牙科饮食的疗效。
使用清洁口腔模型，在24只猫中拍摄了VOHC牙齿(上颌＝104、204、107、207、108、208，下颌＝304、404、307、407、308、408、309、409)的QLF图像，即所述清洁口腔模型即在每个研究阶段开始时，它们接受了单一的剔除牙垢和抛光，以将其牙齿设于无斑块或结石的基线。猫在随机交叉设计中每天喂食标准成年干燥饮食或牙科干燥饮食持续28天，即每只猫接受两种“处理”。除了QLFTM，洛根&博伊斯(L&B)斑块得分也同时进行。
该研究由两个阶段组成：阶段1-重复性，和阶段2-再现性。对于每个阶段，取以下测量结果：(i)评估的每颗牙齿上的斑块百分比，(ii)每颗牙齿上斑块百分比的平均值，(iii)加权全口-100*将口中总斑块除以口总面积。
单个评估员使用硬件和图像采集软件用显示液在每28天试验阶段结束时使用QLFTM对全身麻醉下的猫定量斑块累积。对上下颌上所有14颗VOHC评分牙齿成像，作为斑块发展/去除的指示。即104、204、107、207、108、208、304、404、307、407、308、408、309和409。使用QLFTM分析软件分析图像。
在上述功效研究的第二阶段结束时，使用QLFTM由3名摄影师对12只猫的牙齿上显露的斑块进行成像，以确定不同评分员之间的结果的再现性。所有14颗VOHC评分牙齿在上下颌上成像，作为斑块发展/去除的指示，即103、203、104、204、107、207、108、208、304、404、307、407、308、408、309和409。使用QLFTM分析软件分析图像。
统计
证明牙科饮食功效
通过线性混合效应模型(linear mixed effect models，LMM)分析功效数据。猫的平均牙齿，加权全口和L&B数据使用嵌套在猫中的咀嚼物作为随机效应，和咀嚼物作为固定效应。此外，使用每颗牙齿的原始斑块覆盖范围％数据，嵌套在猫中的齿中嵌套的咀嚼物用作随机效应，通过牙齿及其相互作用的咀嚼物作为固定效应。在95％总体置信区间内估计平均值和平均值之间的差异。
重复性和再现性
为了定量重复性和再现性，使用LMM对每个测量结果进行方差分量分析。最初，通过包括嵌套在猫中的重复作为随机效应，对每个VOHC牙齿定量方差分量。使用相同的模型分析平均牙齿和加权全口数据。此外，通过包括嵌套在猫中的齿中嵌套的重复作为随机效应，分析每颗牙齿上的斑块％(即，使用的所有数据而不是在分析之前的平均值)。获得方差分量，并将与重复性/再现性相关的总方差的百分比与相对于相应数据的总体平均值的变异系数的百分比进行定量。
结果
每个重复照片的猫平均牙齿斑块覆盖范围％的重复性示于图17中。平均重复性CV％为2.2％
三位摄影师中的每一位的猫平均牙齿斑块覆盖范围％的再现性示于图18。平均再现性CV％为2.3％
平均牙齿斑块覆盖范围％的LMM分析的牙科饮食功效结果显示，当喂食牙科饮食时，斑块覆盖范围显著降低约14.26％(p<0.001)，如图19所示，具有95％置信区间。
通过饮食相互作用研究牙齿的LMM显示，饮食对牙齿的影响显著改变，p<0.0001。这种相互作用如图20所示。
当拍摄以下子组牙齿时，进行进一步的分析以研究有意识的猫的QLF：
1.104、204、107、207、108、208、304、404、307、407、308、408、309、409
2.仅104和204
3.仅107和207
4.仅108和208
5.104、204、107、207
6.107、207、108、208
7.104、204、107、207、108、208
然后通过LMM分析7个子组，以嵌套在猫中的齿中嵌套的饮食作为随机效应，饮食作为固定效应。图21示出各子组牙齿的方差分量和饮食差异的后续结果。所有子组，除了“104、204、107、207”的组合，均在饮食之间发现了显著差异。可以看出，仅使用单独的牙齿108/208就足够了。
综上所述，试验证明使用QLFTM可以在用个别牙齿(例如少于VPOHC牙齿，特别是上颌牙齿)以及全口评估时重现地定量喂食特定牙科饮食时的猫中斑块覆盖范围的显著变化。
结论：
数据表示了QLFTM的验证再现性和准确性，并表明它是用于测量犬和猫中斑块水平的合适的技术。
数据还显示，QLFTM可用于有意识的犬，该方法学通过使用在口中的个别牙齿(一颗或多颗牙齿)和口腔的一个颌(即半口)中的一颗或多颗牙齿特别是上颌牙齿获得的数据提供显著差异来确定动物的全口评估，而不是获得口中每颗牙齿的数据来获得全口评估，或者也不是获得建议的VOHC牙齿的整个列表。
数据提供证据表明，试验可以在少于28天的时间内进行。
该数据提供了增加准确度的新的快速产品测试方法的证据，该方法允许较短的试验时间和较少的测试动物数量。数据显示，可以用更短的时间范围进行试验，例如7天相对28天试验。
数据显示，测量口腔产品在减少斑块或牙垢的功效的试验在较短的时间范围内显示出显著的结果，这表明可以在至少7天而不是至少28天内进行试验。
此外，本发明的实施例表明，不仅在较短的时间范围(7天对28天)，而且在测量半口与全口方面，可以在牙齿中实现斑块和/或牙垢的测量精度。这仅通过测量个体的上颌并且将结果与全口斑块覆盖范围百分比测量值相关联来显示。数据显示了3天、7天、14天和21天的试验长度的显著结果，以及使用个别牙齿(上颌)与全口测量结果相关联，以及全口测量结果与半口测量结果(即上颌对全口)相关联进行这种试验的显著结果。
试验的特别的优点是犬是有意识的。结果表明，有意识和无意识犬之间的结果没有显著差异。
数据显示，QLFTM在用于有意识的犬时是准确、可重复和可靠的方法。其能够提供与已建立的临床评分方法如洛根&博伊斯方法相当的结果。评分需要较少的训练，并且可以使用软件容易地定量，因此主观性低。每次试验需要较少动物，需要分析的牙齿较少，因此提供更短更快的试验以获得关于产品功效的结果，并且对动物的压力较小。

Claims (26)

1.一种检测和定量个体中的口腔基质的方法，所述方法包括以下步骤：
(i)使用能够检测荧光的取像装置获得有意识的测试个体的一颗或多颗牙齿的一个或多个图像；
(ii)分析所述图像；以及
(iii)定量每个个体的每颗牙齿上的基质覆盖范围，
其中所述测试个体是伴侣动物。
2.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述一颗或多颗牙齿位于所述个体的上颌中。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述基质选自龋齿病变、牙菌斑、细菌、结石、染色和/或它们的任意组合。
4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述伴侣动物是犬或猫。
5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述取像装置检测所述荧光。
6.一种在试验中检测和定量个体中的口腔基质以确定测试组合物在减少、预防和/或治疗个体的口腔基质中的功效的方法，其中所述个体是伴侣动物，所述方法包括以下步骤：
(i)使用能够检测荧光的取像装置，在试验开始(第0天)获得有意识的测试个体和有意识的对照个体的一颗或多颗牙齿的一个或多个图像；
(ii)分析图像以定量在第0天每个个体的每颗牙齿上的基质覆盖范围；
(iii)在试验期间内对所述测试个体给予测试组合物并且对所述对照个体给予对照组合物；
(iv)在试验期间以预定的间隔获得每个测试个体和对照个体的步骤(i)的相同的一颗或多颗牙齿的一个或多个图像；
(v)分析所述图像以确定和定量每个个体的每颗牙齿上的基质覆盖范围和尺寸，并与试验开始时和或试验的每个阶段的图像进行比较；
(vi)比较所述测试个体与所述对照个体的一颗或多颗牙齿的基质覆盖范围；以及
(vii)确定所述测试组合物在减少、预防和/或治疗个体的口腔基质和/或牙周病中的功效。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述测试个体和所述对照个体是相同的个体。
8.根据权利要求6或7中任一项所述的方法，其中所述一颗或多颗牙齿位于所述个体的上颌中。
9.根据权利要求6至8所述的方法，其中所述基质选自龋齿病变、牙菌斑、细菌、结石、染色和/或它们的任意组合。
10.根据权利要求6、权利要求7或权利要求8或权利要求9所述的方法，其中所述伴侣动物是犬或猫。
11.根据权利要求6至10中任一项所述的方法，其中所述取像装置检测所述荧光。
12.根据权利要求6至11中任一项所述的方法，其中所述测试组合物选自宠物食品、宠物零食和/或宠物咀嚼物。
13.根据权利要求6至12中任一项所述的方法，其中所述分析通过定量光诱导荧光进行。
14.根据权利要求6至13中任一项所述的方法，其中试验期为7天。
15.根据权利要求6至13中任一项所述的方法，其中试验期为3天。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的方法，其中所述伴侣动物已受训练以在获得所述一个或多个图像的持续时间内保持静止。
17.一种荧光的用途，所述荧光在个体中用以确定在一颗或多颗牙齿上的斑块的存在或量，从而确定测试组合物在试验期间的功效，其中所述个体是伴侣动物。
18.一种检测和定量猫中的口腔基质的方法，所述方法包括以下步骤：
(i)使用能够检测荧光的取像装置获得猫的一颗或多颗牙齿的一个或多个图像；
(ii)分析所述图像；以及
(iii)定量猫中的每颗牙齿上的基质覆盖范围。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述一颗或多颗牙齿位于所述个体的上颌中。
20.根据权利要求18或19所述的方法，其中所述取像装置检测所述荧光。
21.一种在试验中检测和定量猫中的口腔基质以确定测试组合物在减少、预防和/或治疗猫的口腔基质中的功效的方法，所述方法包括以下步骤：
(viii)使用能够检测荧光的取像装置在试验开始(第0天)获得测试猫和对照猫的一颗或多颗牙齿的一个或多个图像；
(ix)分析所述图像以定量第0天时每个个体的每颗牙齿上的基质覆盖范围；
(x)在测试期间内对测试猫给予测试组合物和对对照猫给予对照组合物；
(xi)在试验期间以预定的间隔获得每个测试猫和对照猫的步骤(i)的相同的一颗或多颗牙齿的一个或多个图像；
(xii)分析所述图像以确定和定量每只猫的每颗牙齿上的基质覆盖范围和尺寸，并与试验开始时和或在试验的每个阶段的图像进行比较；
(xiii)比较测试猫与对照猫的所述一颗或多颗牙齿的基质覆盖范围；以及
(xiv)确定所述测试组合物在减少、预防和/或治疗猫中的口腔基质和/或牙周病中的功效。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述一颗或多颗牙齿位于所述个体的上颌中。
23.根据权利要求21至22中任一项所述的方法，其中所述取像装置检测所述荧光。
24.根据权利要求21至23中任一项所述的方法，其中所述分析通过定量光诱导荧光进行。
25.根据权利要求21至24中任一项所述的方法，其中试验期为7天。
26.根据权利要求21至24中任一项所述的方法，其中试验期为3天。
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