JP6742658B1 - 元菌液を産生する方法 - Google Patents

Abstract

【課題】粒径が５０ｎｍを越えないコロイド粒子および短鎖脂肪酸を含有する、酸性度がｐＨ３以上４以下の発酵液を製造する方法の提供。【解決手段】多段階の発酵工程の各々に温度管理された複数組の発酵容器１０を含む発酵装置を備え、スターターとなる軟水Ｗと、低温状態で管理される有胞子性クロストリジウム属菌を含むＮＰＭＤに寄託登録された受託番号ＮＩＴＥｐ—０２９４５〜ＮＩＴＥｐ—０２９５１の７種の発酵菌で構成された元菌液ｂと、天然素材の乾燥大豆の第１培地ｍ１と乾燥植物のタイソウ、クコシ、ウコンからなる混合培地の第２培地ｍ２とハチミツ原料の第３培地ｍ３とを別々に発酵し生成した３種の発酵培地と、を用い、多段階の発酵工程によって前記発酵液を製造する方法。【選択図】図１

Description

本発明は、天然素材を発酵させ短鎖脂肪酸を含有する発酵液を製造する方法に関する。本発明により製造される発酵液は、５０ｎｍを越えない粒径のコロイド粒子および、酪酸、プロピオン酸、乳酸の短鎖脂肪酸を含有する、酸性度がｐＨ３以上４以下の発酵液である。前記発酵液のコロイド粒子の含有率が６．５％〜７．５％であり、前記酪酸の質量割合は、前記発酵液１００ｍＬ当り０．５ｇ〜０．６ｇである。

例えば、日常の食材として市販される発酵食品は酢・味噌・醤油・醸造酒など枚挙にいとまないほどに数多い。また機能性食品の発酵液や発酵液が機能性食品の原液として市販されている発酵食品も少なくない。従来、自然水に果実、野菜、大豆等の豆果および栗や胡桃等の堅果を粉砕した原材料を投入し、選択された発酵菌によって液体の発酵抽出物を生成することは、有史以前から様々に工夫がなされてきた加工食品を製造する周知の方法であり、それによる周知の加工食品である。

本発明に係る酪酸、プロピオン酸、乳酸などの短鎖脂肪酸については、例えば非特許文献１によると、腸内細菌による植物繊維の嫌気発酵過程で生成される短鎖脂肪酸が酪酸であり、酪酸の作用を調べたところ、酪酸は制御性Ｔ細胞の発生のみを促進することが確認されており、同文献は「慢性腸炎モデルマウスに酪酸化でんぷん飼料を与えたところ、移入細胞から制御性Ｔ細胞の発生が大腸で促進され腸内炎症の改善が認められた」と報告している。
さらに非特許文献２には、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）には胸腺由来のｔＴｒｅｇと抹消で誘導されるｐＴｒｅｇの２種類が確認され、ｐＴｒｅｇはＴＨ１７リンパ球のマスター転写因子であるＲＯＲγｔと関連しており、ｐＴｒｅｇの誘導にはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ目のクラスターIV、XIVａによって産生される酪酸が関与し、短鎖脂肪酸、特に酪酸が大腸のｐＴｒｅｇの誘導に重要であることが報告されている。
さらに非特許文献３は、「短鎖脂肪酸は宿主のエネルギー源として利用されるほか、体重増加抑制、摂取、糖代謝改善、インシュリン感受性亢進など、宿主のエネルギー恒常性維持に欠かせない役割を果たしていることが近年の研究で明らかになりつつある」と報告し、短鎖脂肪酸の供給源である難消化性多糖類を含む植物繊維の摂取の重要性を指摘しており、同文献には短鎖脂肪酸の特に酪酸による脂肪酸受容体ＧＰＲ４１、ＧＰＲ４３、ＧＰＲ１０９ａおよび０１ｆｒ７８を介した様々な分子メカニズムが詳細に紹介されている。
また非特許文献４は、嫌気性環境下で赤痢菌と酪酸菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ ＭＩＹＡＩＲＩ５８８株）との混合培養を行い少ない菌量でも赤痢菌の発育抑制が観察されたと報告している。近年、特に酪酸または酪酸菌の生体内おける炎症抑制作用が注目されていることを伝えている。
非特許文献５には、大腸内に常在する腸内細菌叢で産生される短鎖脂肪酸の内、酪酸は体調の必須栄養素であり、上皮細胞でエネルギーとして消費されるのみならず、酪酸の代謝障害が潰瘍性大腸炎の一因になるとの報告をし、また短鎖脂肪酸の生理作用として、カルシウム等のミネラル吸収促進、コレステロール合成抑制、さらに酪酸による大腸がん発症抑制など、それらの分析結果を提示している。

従来の発酵液を製造する方法については、例えば、特許文献１にはラクトース溶液に豆果や堅果の天然物を粉砕した原材料を投入し、少なくとも２つの発酵槽と微生物を培養する増殖器を用い、新鮮な微生物と発酵抽出物を均一混合し、それらが混和された免疫活性を有する発酵生成物およびその製法が記載されている。またこうした酸性物質を製造する方法は、特許文献２にナノ濾過を含む多段階の発酵工程が記載されており、特許文献３にはアシタバの葉および大豆粉末に納豆菌を添加し多段階の発酵工程によって生成される発酵液の製法が記載されている。

特許文献４をみると、乳酸菌の生産物質の液が記載されており、それには、当該液は１６種の乳酸菌を用い複数のグループを形成しグループ毎の継代培養の共棲状態を維持し、それにより生成された乳酸菌培養液を濾過し、濾過された乳酸菌培養液が腸内良性菌を活性化する作用のあることが、さらに記載されている。

生体に対するカルシウム代謝の促進については、特許文献５にカゼインを乳酸菌産生プロティナーゼで分解して得られたペプチドまたはペプチド混合物を含有するカルシウム吸収促進活性および抗酸化活性を有する生理活性剤が記載されており、特許文献６には、精製水に大豆を投入し発酵させた葉酸含有大豆発酵高分子物質であってカルシウム吸収促進機能を有する飲料用の健康補助食品が記載されている。

原材料に大豆を用いた発酵食品については、特許文献７から９に大豆を原材料としビフィズス菌や乳酸菌株をスターターとした製法による発酵食品が開示されている。

製造される発酵液の酸性度については、特許文献１０に酸性度がｐＨ４．５未満に調整された豆乳発酵物を製造する方法と酸性度がｐＨ４．５未満で粘度が５．９ｍＰａ以上の豆乳発酵飲料とが記載されており、特許文献１１には野草抽出液に数種の発酵液等を添加して発酵させた酸性度がｐＨ３．７〜３．９程度の酵素含有健康食品および当該健康食品を製造する方法が記載されている。

「制御性Ｔ細胞の発生を制御する腸内細菌代謝産物」早川盛偵 生物型薬学 Ｖｏｌ．５０ Ｎｏ．８ ２０１４ ファルマシア 「アレルギー疾患と腸内細菌叢」下条直樹 実験医学増刊Ｖｏｌ．３７−Ｎｏ．２ ２０１９『腸内細菌叢』編集＝大野博司 羊土社 ２０１９年２月１日発行 「宿主代謝制御と腸内細菌叢」木村郁夫 実験医学増刊Ｖｏｌ．３７−Ｎｏ．２ ２０１９『腸内細菌叢』編集＝大野博司 羊土社 ２０１９年２月１日発行 「酪酸菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ ＭＩＹＡＩＲＩ５８８株）による腸管病原菌抑制作用」黒岩豊秋 小張一峰 岩永正明 感染症学雑誌 第６４巻第３号 平成２年３月２０日 「プレバイオテックスから大腸で酸性される短鎖脂肪酸の生理効果」原博（北海道大学大学院農学研究科） 腸内細菌学雑誌 １６：３５−４２、２００２

特表２０１３−５２４７９１号公報 特開２０１６−００００３９号公報 特開２０１３−１３２２９０号公報 特許４５４０３７６号公報 特開平５−３０４８８９号公報 特表２０１０−５４０６２３号公報 特開２００１−１２０１８０号公報 特開２００５−２１８３９０号公報 特開２０１１−１６７１９０号公報 特開２０１４−１６８４４１号公報 特開２００９−１７８０８４号公報

本発明は、天然素材を発酵させ短鎖脂肪酸を含有する発酵液を製造する方法である。本発明は、より具体的には、粒径が５０ｎｍを越えないコロイド粒子および短鎖脂肪酸を含有する、酸性度がｐＨ３以上４以下の発酵液を製造する方法である。

本発明により製造される発酵液は、粒径が５０ｎｍを越えないコロイド粒子および、酪酸、プロピオン酸、乳酸の短鎖脂肪酸を含有する、酸性度がｐＨ３以上４以下のものである。因みに、前記発酵液のコロイド粒子の含有率が６．５％〜７．５％であり、前記酪酸の質量割合は、前記発酵液１００ｍＬ当り０．５ｇ〜０．６ｇである。

当該発酵液は、機能性食品として、整腸を促進する乳酸菌およびビフィズス菌を倍増する一方で、整腸に有害なクロストリジウム属のウェルシュ菌を半減させ、さらに生体へのカルシウム吸収率を高めカルシウム代謝を促し生体の骨強度および骨代謝に有意に働くことが確認されている。これは非特許文献３で詳細に紹介されている短鎖脂肪酸の内、特に酪酸による脂肪酸受容体ＧＰＲ４１、ＧＰＲ４３、ＧＰＲ１０９ａおよび０１ｆｒ７８を介した様々な分子メカニズムと一致する結果とも考えられる。

本発明は、発明者らの長年の地道な実践研究により完成された、天然素材を発酵させ、５０ｎｍを超えないコロイド粒子および、酪酸、プロピオン酸、乳酸の短鎖脂肪酸を含有する、酸性度がｐＨ３以上４以下の発酵液を製造する方法を提供する。

それはまた、より具体的には、予め共棲させ安定させた低温状態で管理される短鎖脂肪酸を含む有機酸を産生する有胞子性のクロストリジウム属菌を含む元菌（独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター［ＮＰＭＤ］に寄託登録された受託番号ＮＩＴＥｐ―０２９４５〜ＮＩＴＥｐ―０２９５１の７種の発酵菌）が共棲的に作用する多段階の発酵工程によって、５０ｎｍを超えないコロイドおよび、酪酸、プロピオン酸、乳酸の３種の短鎖脂肪酸を含有する、酸性度がｐＨ３以上４以下の発酵液を製造する方法を提供するものである。

本発明の方法は、
多段階の発酵工程の各々に温度管理された複数組の発酵容器を含む発酵装置を備え、
スターターとなる軟水ｗと、
低温状態で管理される有胞子性クロストリジウム属菌を含むＮＰＭＤに寄託登録された受託番号ＮＩＴＥｐ―０２９４５〜ＮＩＴＥｐ―０２９５１の７種の発酵菌で構成された元菌液ｂと、
天然素材の乾燥大豆の第１培地ｐｍ１と、乾燥植物のタイソウ、クコシ、ウコンからなる混合培地の第２培地ｐｍ２と、ハチミツ原料の第３培地ｐｍ３とを別々に発酵し、生成した３種の発酵培地ｍ１、ｍ２、ｍ３と、
を用い、
多段階の発酵工程によって、
５０ｎｍを超えないコロイド粒子および短鎖脂肪酸を含有する酸性度がｐＨ３以上４以下の発酵液１を製造することを特徴とする。

非特許文献および特許文献には、粒径が５０ｎｍを越えないコロイド粒子および、酪酸、プロピオン酸、乳酸の３種の短鎖脂肪酸を含有する、酸性度がｐＨ３以上４以下の発酵液を想起させる記載は発見できない。さらに多段階の発酵工程によって、５０ｎｍを越えないコロイド粒子および、酪酸、プロピオン酸、乳酸の３種の短鎖脂肪酸を含有する、酸性度がｐＨ３以上４以下の発酵液を製造する方法に関する記載も発見することはできない。またこれら非特許文献および特許文献に記載された技術要素について、当業者が如何様に組み合わせても、５０ｎｍを超えないコロイド粒子および、酪酸、プロピオン酸、乳酸の３種の短鎖脂肪酸を含有する、酸性度がｐＨ３以上４以下の発酵液を製造する本発明の方法を、想到し得る記載がないことも明らかである。

５０ｎｍを超えないコロイド粒子および短鎖脂肪酸を含有する、酸性度がｐＨ３以上４以下の発酵液を製造する本発明の一態様である方法を構成する特徴の第１は、多段階の各発酵工程の第１発酵ラインｆ１にある。

第１発酵ラインｆ１は、
図１［１］〜［５］に示される、複数個（４個以上）の陶器製の発酵瓶１０、加熱釜３０を備えた第１培地タンク２０、および、２基の第１発酵タンク１００を備えた第１発酵システムｓ１と、
図１［６］〜［８］に示される、１基の第２発酵タンク２００、および、図４［ｂ］に示される、第２発酵タンク２００に連結される第１発酵タンク１００の抜取装置１１０を備えた第２発酵システムｓ２と
を用い、
図２（２）に示される予備的第１発酵液ｐｎ１と発酵大豆ｆｓとを生成する第１工程ｐ_１１と、
図２［ｂ］〜［ｃ］および図１６のステージ１に示される酸性度がｐＨ５．３±の第１発酵液ｎ１を生成する第２工程ｐ_１２と、
図１［８］および図１６のステージ１に示されるｐＨ５．０±の第２発酵液ｎ２を生成する第３工程ｐ_１３と、
で構成される。

なおｐＨ値の±は、図１６に示される発酵工程の各発酵液の年間ロットの平均値を示す酸性度ｐＨ値の振れ幅が０．３以内であることを表す記号であり、以下同様である。

より具体的には、
全行程が図１［１］〜［８］に示される第１発酵ラインｆ１は、
図２（１）に示される複数個（４個以上）の陶器製の発酵瓶１０の各々にスターターとなる酸性度がｐＨ７．３±の軟水ｗと第１培地ｐｍ１の原料である乾燥大豆ｄｓと、
図２のステップｐｐ_１０に示される発酵瓶１０の軟水ｗに浸漬され水で戻された乾燥大豆ｄｓの発酵を促す元菌液ｂの一部と糖鎖ｓと
を用い、
図１６のステージ１に示される３７℃〜４０℃の発酵状態を保持しながら３日間（６８時間〜７４時間）の発酵によって、
図２（２）に示されるｐＨ４．５±の予備的第１発酵液ｐｎ１と発酵大豆ｆｓとを生成する第１工程ｐ_１１を含む。

図１［３］〜［４］および図２のステップｐｐ_１１〜ｐｐ_１３に示される第１発酵ラインｆ１の第１工程ｐ_１１はさらに、
粉砕手段（図示せず）で発酵大豆ｆｓを磨り潰し大豆ペーストｇｆｓを生成し各発酵瓶１０に対応する図２（３）に示される複数個（４個以上）の容器１１に移し、予備的第１発酵液ｐｎ１と混合し各容器１１から加熱釜３０に移す工程と、
図２［ａ］のステップｐｐ_１４に示される加熱釜３０で大豆ペーストｇｆｓを５５〜６０℃に加熱し冷却用に予め軟水ｗが投入された第１培地タンク２０に移し、ｐＨ４．５±の第１発酵培地ｍ１を生成する第１予備工程と
を含む。

図１［５］に示される第１発酵ラインｆ１の第２工程ｐ_１２は、
図２（４）および［ｂ］に示される第１発酵培地ｍ１を２基の第１発酵タンク１００に均等に移し、各第１発酵タンク１００に軟水ｗと元菌液ｂをさらに投入する工程と、
図２［ｃ］のステップｐｐ_１５に示される第１発酵タンク１００の各々に投入された第１発酵培地ｍ１と軟水ｗと元菌液ｂとを攪拌し、混合し、ｐＨ６．４±の予備的第２発酵液ｐｎ２を生成する第２予備工程と
を含む。
因みに、第２予備工程で生成されるｐＨ６．４±の予備的第２発酵液ｐｎ２は、第１発酵培地ｍ１と軟水ｗと元菌液ｂとが混合された混濁液ｐｎ２であり、５０ｎｍを超えないコロイド粒子および短鎖脂肪酸を含有する酸性度がｐＨ３以上４以下の発酵液を製造するための発酵原液θに相当するものである。混濁液ｐｎ２が発酵原液θとなる理由は、これ以降の多段階の発酵工程において新たに軟水ｗおよび元菌液ｂが添加されることはないためである。

図１［６］に示される第１発酵ラインｆ１の第２工程ｐ_１２はまた、
図２［ｄ］のステップｐｐ_１６に示される各第１発酵タンク１００に生成されたｐＨ６．４の予備的第２発酵液ｐｎ２を、
図１６ステージ１に示される３７℃〜４０℃の発酵状態を保持しながら５０日〜１００日の発酵によって、
ｐＨ５．３±の第１発酵液ｎ１を生成する第３予備工程を含む。

図１［６］に示される第１発酵ラインｆ１の各第１発酵タンク１００には、
図４［ａ］に示され、詳細は後述されるように、
上澄みには発酵ガスによるスポンジ層ｓｐが形成され、下層部には第１発酵培地ｍ１の繊維質を含む第１沈澱層ｄｅｐ１が堆積し、スポンジ層ｓｐと第１沈澱層ｄｅｐ１との間にｐＨ５．３±の第１発酵液ｎ１が形成される。

図１［８］に示されるように第１発酵ラインｆ１は、第３工程ｐ_１３を含むことができる。第３工程ｐ_１３は、図４［ｂ］に示される第２工程ｐ_１２で生成されたｐＨ５．３±の第１発酵液ｎ１のみを、第１発酵タンク１００の抜取装置１１０によって２基の第１発酵タンク１００から抜き取り、発酵培地を使用しない発酵環境が形成された１基の第２発酵タンク２００に移し、攪拌し、混合し、３７℃〜４０℃の発酵状態を保持しながら、図１６ステージ１に示される第１発酵液ｎ１に含まれる元菌液ｂの発酵菌ｂ１による３日〜５日の発酵によって、ｐＨ５．０±の第２発酵液ｎ２を生成する工程である。

５０ｎｍを超えないコロイド粒子および短鎖脂肪酸を含有する酸性度がｐＨ３以上４以下の発酵液を製造する本発明の一態様である方法を構成する特徴の第２は、多段階の各発酵工程の第２発酵ラインｆ２にある。

第２発酵ラインｆ２は、
図１［９］〜［１２］および図７に示されるように、
図１［９］または図７［ａ］に示される第２培地タンク４０と、
図１［１１］または詳細が図８および図９に示される、内部に吊すように設置される袋状培地フィルタ３２０および循環用ポンプ装置３３０が装備された１基の第３発酵タンク３００と、
図１［１２］に示される第３発酵タンク３００に連結される第２発酵タンク２００の抜取装置２１０（図４［ｂ］の抜取装置１１０と同一原理の装置で図示せず）と、
からなる
第３発酵システムｓ３を用い、
ｐＨ４．８±の第２発酵培地ｍ２を生成する第１工程ｐ_２１と、
ｐＨ４．５±の第３発酵液ｎ３を生成する第２工程ｐ_２２と
で構成される。

図１［９］および［１０］に示される第２発酵ラインｆ２のｐＨ４．８±の第２発酵培地ｍ２を生成する第１工程ｐ_２１は、より具体的には、以下のような第１予備工程ｐｐ_２１および第２予備工程ｐｐ_２２を含む。

第１予備工程ｐｐ_２１は、
図１［９］または図７［ａ］に示される第２培地タンク４０に、
スターターとなるｐＨ５．０±の第２発酵液ｎ２またはｐＨ５．３±の第１発酵液ｎ１のいずれかと、
殺菌処理された乾燥植物のタイソウ、クコシ、ウコンからなる混合培地ｐｍ２と
を投入し、
殺菌処理された混合培地ｐｍ２を第２発酵液ｎ２または第１発酵液ｎ１のいずれかの一部に浸漬し、混合し、攪拌し、
図１６ステージ２に示される３７℃〜４０℃の発酵状態を保持しながら２日〜３日の発酵によって、
図１［１０］または図７［ｂ］に示される予備的発酵混合培地ｐｆｍ２と予備的第３発酵液ｐｎ３とを生成する。

第１予備工程ｐｐ_２１において、第２培地タンク４０に混合培地ｐｍ２を投入し第２発酵液ｎ２または第１発酵液ｎ１のいずれかの一部に浸漬し混合するときは、好ましくは、混合培地ｐｍ２のタイソウ、クコシ、ウコンの各々を重量比７対４対１の割合で使用し、例えば、混合培地ｐｍ２を第２発酵液ｎ２または第１発酵液ｎ１のいずれかの３５リットル毎の総量に対し、重量比７対４対１の割合で乾燥タイソウ２００〜２１０ｇ、乾燥クコシ１１０〜１２０ｇ、乾燥ウコン２５〜３０ｇを混合することである。

第２予備工程ｐｐ_２２は、
図１［１０］または図７［ｂ］に示される第２培地タンク４０から予備的発酵混合培地ｐｆｍ２を取り出し、粉砕手段（図示せず）を用いタイソウの種を磨り潰さない程度に粉砕し、ｐＨ４．８±の予備的第３発酵液ｐｎ３と第２発酵培地ｍ２とを生成する。

第２発酵ラインｆ２のｐＨ４．５±の第３発酵液ｎ３を生成する第２工程ｐ_２２は、より具体的には、以下の予備的工程を含む。

第２工程ｐ_２２は、
図１［１１］に示される第１工程ｐ_２１で生成された第２発酵培地ｍ２を袋状培地フィルタ３２０に封入し第３発酵タンク３００内に吊るし、ｐＨ４．８±の予備的第３発酵液ｐｎ３を第３発酵タンク３００に移す工程と、
第３発酵タンク３００に連結された図１［８］に示される第２発酵タンク２００の抜取装置２１０によって、ｐＨ５．０±の第２発酵液ｎ２を第２発酵タンク２００から第３発酵タンク３００にさらに移す工程と、
図９に示される循環用ポンプ装置３３０を作動し第２発酵培地ｍ２が混じり合わないように袋状培地フィルタ３２０を介しｐＨ４．８±の予備的第３発酵液ｐｎ３とｐＨ５．０±の第２発酵液ｎ２とを一体的に循環する工程と、
を含み、
図１６ステージ２に示される最終的に３７℃〜４０℃の発酵状態を保持しながら８日〜９日の発酵によって、ｐＨ４．５±の第３発酵液ｎ３を生成する。

５０ｎｍを超えないコロイド粒子および短鎖脂肪酸を含有する酸性度がｐＨ３以上４以下の発酵液を製造する本発明の一態様である方法を構成する特徴の第３は、多段階の各発酵工程の第３発酵ラインｆ３にある。

第３発酵ラインｆ３は、
図１［１３］〜［１６］および図１２［ａ］〜［［ｇ］に示されるように、
図１［１３］〜［１４］および図１２［ｂ］に示される第３培地タンク５０と、
図１［１５］および図１２［ｄ］に示される１基の第４発酵タンク４００と
図１２［ｅ］に示される第４発酵タンク４００に連結される第３発酵タンク３００の抜取装置３１０と
からなる
第４発酵システムｓ４を用い、
ｐＨ値４．４±の第３発酵培地ｍ３を生成する第１工程ｐ_３１と、
ｐＨ３．７±の第４発酵液ｎ４を生成する第２工程ｐ_３２と
で構成される。

第３発酵ラインｆ３のｐＨ値４．４±の第３発酵培地ｍ３を生成する第１工程ｐ_３１は、より具体的には、以下の予備的工程を含む。

第１工程ｐ_３１は、
図１２［ａ］〜［ｃ］に示される第３培地タンク５０に、
百科蜜およびアカシヤ蜜を好ましくは１対４の比率で構成されるハチミツ原料ｐｍ３を投入し、投入されたハチミツ原料ｐｍ３の４倍の量に相当するスターターとなるｐＨ４．５±の第３発酵液ｎ３の一部をさらに投入する工程と、
第３培地タンク５０に投入されたハチミツ原料ｐｍ３と投入されるハチミツ原料ｐｍ３の４倍の量に相当する第３発酵液ｎ３の一部を、第３発酵タンク３００で生成された第３発酵液ｎ３の３〜５％に相当する量になるように、投入し、攪拌し、予備的発酵培地ｐｆｍ３を生成する工程と、
を含み、
図１６ステージ２に示される最終的に図１２のステップｐｐ_３１の予備的発酵培地ｐｆｍ３を３７℃〜４０℃の発酵状態を保持しながら２日〜３日の発酵によって、
ｐＨ値４．４±の第３発酵培地ｍ３を生成する。

第３発酵ラインｆ３のｐＨ３．７±の第４発酵液ｎ４を生成する第２工程ｐ_３２は、より具体的には、以下の予備的工程を含む。

第２工程ｐ_３２は、
図１２［ｄ］に示される第３発酵培地ｍ３を第４発酵タンク４００に移す工程と、
図１２［ｅ］〜［ｆ］に示されるスターターのｐＨ４．５±の第３発酵液ｎ３を第４発酵タンク４００に連結された第３発酵タンク３００の抜取装置３１０で第３発酵タンク３００から第４発酵タンク４００にさらに移し、攪拌する工程と、
含み、
図１２［ｇ］および図１６ステージ２に示される最終的に３７℃〜４０℃の発酵状態を保持しながら３０日〜６０日の発酵によって、
ｐＨ３．７±の第４発酵液ｎ４を生成する。

５０ｎｍを超えないコロイド粒子および短鎖脂肪酸を含有する酸性度がｐＨ３以上４以下の発酵液を製造する本発明の一態様である方法を構成する特徴の第４は、多段階の各発酵工程の第４発酵ラインｆ４にある。

第４発酵ラインｆ４は、
図１［１７］に示される１基の第５発酵タンク５００と
図１２［ｇ］に示される第５発酵タンク５００に連結される第４発酵タンク４００の抜取装置４１０（図１２［ｅ］の抜取装置３１０と同一原理の装置で図示せず）と
からなる
第５発酵システムｓ５を用い、
図１２［ｇ］に示されるｐＨ３．７±の第４発酵液ｎ４をｐＨ３．６±の第５発酵液ｎ５に生成する工程ｐ_４１
で構成される。

第４発酵ラインｆ４のｐＨ３．６±の第５発酵液ｎ５を生成する工程ｐ_４１は、より具体的には、以下の予備的工程を含む。

工程ｐ_４１は、
図１［１６］〜［１７］に示されるように、
スターターとなるｐＨ３．７±の第４発酵液ｎ４を第５発酵タンク５００に連結された第４発酵タンク４００の抜取装置４１０（図１２の抜取装置３１０と同一原理の装置で図示せず）で第４発酵タンク４００から第５発酵タンク５００に移す工程と、
第５発酵タンク５００に移されたｐＨ３．７±の第４発酵液ｎ４を複数回攪拌し発酵培地を使用しない発酵環境を形成する工程と、
を含み、
図１６ステージ２に示される最終的に３７℃〜４０℃に発酵状態を保持しながら、第４発酵液ｎ４の発酵菌ｂ１による３０日〜６０日の発酵によって、
ｐＨ３．６±の第５発酵液ｎ５を生成する。

５０ｎｍを超えないコロイド粒子および短鎖脂肪酸を含有する酸性度がｐＨ３以上４以下の発酵液を製造する本発明の一態様である方法を構成する特徴の第５は、多段階の各発酵工程の第５発酵ラインｆ５にある。

第５発酵ラインｆ５は、
図１［１８］〜［１９］または図１５［ａ］〜［ｃ］に示されるように、
図１［１９］または図１５［ｃ］に示される１基の第６発酵タンク６００と、図１［１８］または図１５［ｂ］に示される冷却装置６１０と、
図１５［ａ］に示される予備タンク６２０および予備タンク６２０に連結される第５発酵タンク５００の抜取装置５１０と
からなる
第６発酵システムｓ６を用い、
図１［１８］または図１５［ｂ］に示される３５〜４０℃のｐＨ３．６±の第５発酵液ｎ５を液温４〜５℃以下に急冷却する第１工程ｐ_５１と、
急冷却したｐＨ３．６±の第５発酵液ｎ５を常温状態に戻し、図１［１９］または図１５［ｃ］に示される常温状態を保持しながら酸性度がｐＨ３．３±の第６発酵液ｎ６を生成する第２工程ｐ_５２と
で構成される。

第５発酵ラインｆ５の３５〜４０℃のｐＨ３．６±の第５発酵液ｎ５を液温４〜５℃以下に急冷却する第１工程ｐ_５１は、より具体的には、以下の予備的工程を含む。

第１工程ｐ_５１は、
図１５［ａ］に示される第５発酵タンク５００の抜取装置５１０が連結された予備タンク６２０に第５発酵タンク５００から液温が３５〜４０℃でｐＨ３．６±の第５発酵液ｎ５を移す工程と、
図１５［ｂ］に示される予備タンク６２０を冷却装置６１０の冷却水に漬ける工程と
を含み、
最終的に３５〜４０℃の第５発酵液ｎ５を液温４〜５℃以下に急冷却する。

図１５［ｃ］に示されるｐＨ３．６±の第５発酵ラインｆ５の常温状態を保持しながらｐＨ３．３±の第６発酵液ｎ６を生成する第２工程ｐ_５２は、より具体的には、以下の予備的工程を含む。

第２工程ｐ_５２は、
図１５［ｃ］に示される予備タンク６２０を冷却装置６１０から取り出し、急冷却された第５発酵液ｎ５を常温状態に戻してから第６発酵タンク６００に移す工程と、
発酵培地を使用しない発酵環境を形成する工程と、
を含み、
最終的に常温状態を保持しながら第５発酵液ｎ５の発酵菌ｂ１によるｐＨ３．６±の第５発酵液ｎ５の１８０日〜２４０日の発酵によって、
ｐＨ３．３±の第６発酵液ｎ６を生成する。

以上のように、本発明は、概略的には第１発酵ラインｆ１から第５発酵ラインｆ５で構成される、５０ｎｍを超えないコロイド粒子および、酪酸、プロピオン酸、乳酸の３種の短鎖脂肪酸を含有する、酸性度がｐＨ３以上４以下の発酵液を製造する方法である。

スターターとなる軟水ｗの使用量は、図１［５］に示される２基の第１発酵タンク１００の仕込み量すなわち予備的第２発酵液ｐｎ２が１８００Ｌと想定して概算すると、各段階で生成される発酵液の生成量は、概算で以下のようになる。

４個の陶器製の発酵瓶１０を使用する場合、図２（１）〜（２）に示される各発酵瓶１０に６．５ｋｇの乾燥大豆を浸漬する２０Ｌの軟水ｗが使用されるので、４個分の軟水ｗは８０Ｌになる。次に、各発酵瓶１０の発酵大豆ｆｓを僅かの軟水ｗを５Ｌ程度加えながら粉砕しペースト状にし、仕上がった大豆ペーストｇｆｓを図２（３）に示される４個の別容器１１に移し、予備的第１発酵液ｐｎ１と混合するときに１０Ｌ程度の軟水ｗがさらに加えられる。各容器１１から１０Ｌ相当の軟水ｗが加えられた大豆ペーストｇｆｓと予備的第１発酵液ｐｎ１とを加熱釜３０に移し、加熱する。加熱され３５Ｌ相当になった各発酵瓶１０相当の大豆ペーストｇｆｓおよび予備的第１発酵液ｐｎ１（ｇｆｓ+ｐｎ１+ｗ）が第１培地タンク２０に移される。

加熱釜３０で各発酵瓶１０の３５Ｌ相当になった大豆ペーストｇｆｓと予備的第１発酵液ｐｎ１とに対し１０Ｌ相当の軟水ｗを加えながら、攪拌し、加熱する。次に、第１培地タンク２０に用意された冷却用の１００Ｌ相当の軟水ｗで大豆ペーストｇｆｓと予備的第１発酵液ｐｎ１が発酵温度に冷やされる。結果、第１発酵培地ｍ１の生成に要する軟水ｗは、１８０Ｌ（８０Ｌ+２０Ｌ+４０Ｌ+４０Ｌ）になる。第１培地タンクで冷却するときの使用する軟水ｗは１００Ｌであるので、生成される第１発酵培地ｍ１は、２４０Ｌ［３５Ｌ×４＋１００Ｌ］相当になる。

２基の第１発酵タンク１００には、スターターとなる、第１発酵培地ｍ１の２４０Ｌおよび元菌液ｂの２７０Ｌ〜４５０Ｌに、さらに軟水ｗが投入される。

図２［ｃ］に示される２基の第１発酵タンク１００に投入される軟水ｗは、第１発酵タンク１００の仕込み量すなわち予備的第２発酵液ｐｎ２を１８００Ｌと想定すると、１１１０〜１２９０Ｌという使用量になる。したがって、第１発酵液ｎ１の生成に要する軟水ｗの使用量は、１２９０（１１１０+１８０）Ｌ〜１４７０（１２９０+１８０）Ｌである。本発明の５０ｎｍを超えないコロイド粒子および短鎖脂肪酸を含有する酸性度が３以上４以下の発酵液を製造する方法には、他に軟水ｗが使用される工程はない。

図２［ｄ］または図４［ａ］に示される図１６ステージ１の５０日〜１００日の発酵を経た２基の第１発酵タンク１００の各々には、発酵ガスが形成する空気遮断作用を有するスポンジ層ｓｐと、第１発酵培地ｍ１の繊維質を含む第１沈澱層ｄｅｐ１と、これら２層の間に、半透明な第１中間層液が形成される。半透明な第１中間層液は、ｐＨ５．３±の第１発酵液ｎ１である。

第１発酵タンク１００の2基分の仕込み量すなわち予備的第２発酵液ｐｎ２を１８００Ｌと想定すると、スポンジ層ｓｐと第１沈澱層ｄｅｐ１とで３０％以上が吸収されるため、1基分の第１発酵タンク１００に生成されるｐＨ５．３±の第１発酵液ｎ１は、６００〜６５０Ｌ相当である。

したがって、第２発酵タンク２００に連結される第１発酵タンク１００の抜取装置１１０によって、２基の第１発酵タンク１００から抜き取り第２発酵タンク２００に移されるｐＨ５．３±の第１発酵液ｎ１は、１２００〜１３００Ｌ相当になる。ｐＨ５．３±の第１発酵液ｎ１は、本発明によって製造される５０ｎｍを超えないコロイド粒子および短鎖脂肪酸を含有する、酸性度がｐＨ３以上４以下の発酵液１の最初の発酵液である。

第２発酵タンク２００においては、培地を使用しない発酵環境が形成されており、第１発酵液ｎ１に含まれる発酵菌ｂ１によるｐＨ５．３±の第１発酵液ｎ１の発酵によって、ｐＨ５．０±の第２発酵液ｎ２が生成される。第２発酵タンク２００には、ｐＨ５．３±の第１発酵液ｎ１の発酵によって発酵ガスの泡で上澄に形成される第１上面膜層ｓｆ１と下層に堆積される第２沈殿層ｄｅｐ２と、これら２層の間に、半透明の第２中間層液が形成される。

第２中間層液は、ｐＨ５．０±の第２発酵液ｎ２である。第２発酵液ｎ２は発酵中に第１上面膜層ｓｆ１と第２沈殿層ｄｅｐ２に５％程度吸収されるため、生成される第２発酵液ｎ２は１１４０〜１２４０Ｌ程度である。

第１発酵ラインｆ１は、この段階で終了する。それは図１６図ステージ１に相当し、その間の発酵に要する時間は５５日以上で１０８日を超えない程度である。

図１[９]〜［１２］に示される第２発酵ラインｆ２は、１１４０〜１２４０Ｌ程度のｐＨ５．０±の第２発酵液ｎ２がスターターである。第２発酵液ｎ２の一部は、第２培地タンク４０に添加される。残りの第２発酵液ｎ２は第３発酵タンク３００に移される。発明者らの長年の地道な実践経験からすると、生成されるｐＨ４．５±の第３発酵液ｎ３の仕上り量は、第３発酵タンク３００で生成される第３発酵液ｎ３も８％〜１０％程度の目減りがあるため、１０５０〜１１００Ｌ程度である。

図１[１３]〜［１９］に示される第３発酵ラインｆ３から第５発酵ラインｆ５では、第４発酵液ｎ４から第６発酵液ｎ６の発酵中に気化等による目減り量は２％〜３％と僅かであり、最終的に生成されるｐＨ３．３±の第６発酵液ｎ６の５０ｎｍを超えないコロイド発酵液の仕上り量は、１０００〜１０５０Ｌ程度になる。

各段階の発酵によって生成される発酵液の生成量を概算すると以下のようになる。２基の第１発酵タンク１００において、スターターの１２９０〜１４７０Ｌ相当の軟水ｗと、第１発酵培地ｍ１を用い１８００Ｌ相当の仕込み量で生成されるｐＨ５．３±の第１発酵液ｎ１は、次のスターターとして用いられ、ｐＨ５．０±の第２発酵液ｎ２の１１４０〜１２４０Ｌ程度が生成される。さらに第２発酵液ｎ２と第２発酵培地ｍ２とを用いｐＨ４．５±の第３発酵液ｎ３の１０５０〜１１００Ｌ程度が生成される。これに続く発酵によって、１０５０〜１１００Ｌ程度の第３発酵液ｎ３と第３発酵培地ｍ３とを用いｐＨ３．７±の第４発酵液ｎ４が生成されるが、これ以降の発酵は、発酵培地を使用しない発酵環境が形成されており、生成された第４発酵液ｎ４を用いｐＨ３．６±の第５発酵液ｎ５が生成され、最終的には生成された第５発酵液ｎ５を用いｐＨ３．３±の第６発酵液ｎ６の１０００〜１０５０Ｌ程度が生成される。

ｐＨ３以上４以下の５０ｎｍを超えないコロイド発酵液を生成するための第１発酵ラインから第５発酵ラインを含む多段階の発酵工程を表す概略図である。 第1発酵ラインを構成する第１工程、および、第１予備工程と第２予備工程と第３予備工程とからなる第２工程を表す拡大模式図である。 中央部に弁機能を有する蓋が設置された容量がいずれも６０Ｌを超えない陶器製の発酵瓶を表す斜視図および蓋機構の拡大模式図である。 第１発酵タンクの底部に取り付けた抜取装置の開閉弁の開閉によりパスカルの原理と静水圧平行の原理を応用し、生成された第１中間層液の第１発酵液のみを第１発酵タンクから抜き取り、第２発酵タンクに移す状態を表す模式図である。 事前発酵させた大豆を磨り潰した第1発酵培地の検体Ａを用い６日間の発酵によって生成した第１発酵液Ａと、事前発酵させることなく水に浸漬した乾燥大豆を磨り潰した発酵培地の検体Ｂを用い検体Ａと同じように６日間の発酵によって生成した第１発酵液Ｂと、の比較試験の写真Ａおよび写真Ｂである。 短鎖脂肪酸を含む有機酸を生成する有胞子性クロストリジウム属菌を含む発酵菌の７種の一覧表である。一覧表の菌株はブタペスト条約上の国際寄託機関の独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センターに寄託登録された。寄託番号：ＮＩＴＥ ｐ−０２９４５〜ＮＩＴＥ ｐ−０２９５１（受託日：２０１９年５月１６日）。 発酵ガスの通る穴を穿設した落し蓋を配した第２培地タンクの模式図である。 第２発酵培地による第３発酵液を生成する第２発酵ラインで用いる第３発酵タンクの内部に吊すように設置される袋状培地フィルタの模式図、袋状培地フィルタを配備した第３発酵タンクの斜視図および平面図である。 第２発酵培地による第３発酵液を生成する第２発酵ラインで用いる循環用ポンプ装置が装備された第３発酵タンクの模式図である。 第２発酵液を用い事前発酵させた重量比７対４対１のタイソウ、クコシ、ウコンをタイソウの種が残るように磨り潰し粉砕した第２発酵培地の検体Ａを用いて５日間の発酵によって生成された第３発酵液Ａと、事前発酵させることなく第２発酵液に浸漬した重量比７対４対１のタイソウ、クコシ、ウコンをタイソウの種が残るように磨り潰し粉砕した発酵培地の検体Ｂを用いて検体Ａと同じく５日間の発酵によって生成された第３発酵液Ｂと、の比較試験の写真Ａおよび写真Ｂである。 発酵開始から５日間の第３発酵液Ａと第３発酵液Ｂとの酸性度ｐＨ値の推移を表すグラフおよび比較表である。 第３発酵タンクに第２発酵液を移した状態で、第３発酵タンクの内部に設置される袋状培地フィルタに第２培地タンクで生成された第２発酵培地を投入し、循環用ポンプ装置を作動し、循環させながらの発酵によって第３発酵液を生成する第２発酵ラインを表す工程［ａ］と、第３培地タンクに第３発酵液の一部とはちみつ原料を適量投入し、攪拌させながらの発酵によって第３発酵培地を生成する工程［ｂ］および［ｃ］と、第４発酵タンクに第３発酵タンクから移された第３発酵液と第３発酵培地とを投入し、攪拌させながらの発酵によって第４発酵液を生成する第３発酵ラインを表す工程［ｄ］〜［ｇ］とからなる部分拡大図である。 第３発酵液を用い事前発酵させたハチミツ原料の第３発酵培地のを用い４日間の発酵によって生成された第４発酵液Ａと、第３発酵液を用い事前発酵させないハチミツ原料の培地を用い４日間の発酵によって生成した第４発酵液Ｂと、の比較試験の写真Ａおよび写真Ｂである。 発酵開始から４日間の第４発酵液Ａおよび第４発酵液Ｂの酸性度のｐＨ値の推移を表すグラフおよび比較表である。 第５発酵タンクから予備タンクに第５発酵液を移し、冷却装置で急冷却し、季節に応じた常温状態で液温を管理し、冷却された第５発酵液を第６発酵タンクに移し、発酵培地を使用しない発酵環境が形成され、第５発酵液の発酵菌による発酵によって第６発酵液を生成する第５発酵ラインの拡大模式図である。 第１発酵ラインから第５発酵ラインに要する発酵時間と、第１発酵液から第６発酵液および第１発酵培地から第３発酵培地の酸性度のｐＨ値との推移を、ステージ１からステージ３に区分し、発酵度合いの変化を酸性度のｐＨ値で表した図および表である。 検体として第４発酵液の上澄みを検体加熱処理／減菌処理後に第４発酵液が含有するコロイド粒子の大きさを計測するキュムラン解析結果を表すグラフおよび表である。 検体として第６発酵液の上澄みを加熱処理／減菌処理後に第６発酵液が含有するコロイド粒子の大きさを計測するキュムラン解析結果を表すグラフおよび表である。 日本食品分析センターのソモギー変法による発酵液１００ｇ［ｍＬ］に含有する糖質量の分析結果の表である。 日本食品分析センターの高速液体クロマトグラフィーによる第６発酵液１００ｇ［ｍＬ］に含有する短鎖脂肪酸量の分析結果のグラフである。 ＳＤ、オスラットをモデルマウスとして用いた被験物質（第６発酵液）投与による「反転腸菅法によるカルシウム吸収検討試験」の結果に基づくカルシウム増加量とカウシウム吸収率とを表す棒グラフである。 両側卵巣摘出によるエストロゲン欠乏状態の骨粗鬆症モデルマウスを用いた被験物質（第６発酵液）投与による「Ｇｌａ／Ｇｌｕ−Ｏｓｔｅｏｃａｌｃｉｎ比」と「骨重量と骨強度、および、骨密度」データによる影響度試験の結果に基づくグラフおよび骨密度写真である。 株式会社アイテックラボ（試験責任者松浦正樹）がｃｃ５７ＢＬ／６マウス（♂７週齢）の被験物質（第６発酵液）投与群とコントロール群とに０．５ｍＬ／検体を２８日間の連続経口投与後に検体の結腸内容物を採取し、結腸内容物の細菌ＤＮＡを抽出し、腸内細菌叢における効果に関する試験をした試験結果である。 被験物質（第６発酵液）投与群と注射用水投与群マウスの腫瘍組織におけるＫｒｔ６ｂ遺伝子の発現量を表したグラフである。

発明を実施するための態様

以下は、本発明の一実施態様である。本発明の一実施態様は、多段階の発酵工程によって５０ｎｍを超えないコロイド粒子および短鎖脂肪酸を含有する、ｐＨ３以上４以下の発酵液を製造する方法を提供するものである。本発明の方法によって製造される発酵液は、前記発酵液のコロイド粒子の含有率が６．５％〜７．５％で、前記酪酸の質量割合は前記発酵液１００ｍＬ当り０．５ｇ〜０．６ｇであり、それ自体が機能性食品または機能性食品およびその原液になる。

第１発酵ラインｆ１の詳細

多段階の発酵工程は、より具体的には、本発明の方法を表す概念図の図１［１］に示される第１発酵ラインｆ１を構成する第１工程ｐ_１１から始まる。

第１発酵ラインｆ１の第１発酵液ｎ１を生成するための仕込み量すなわち予備的第２発酵液ｐｎ２を１８００Ｌと想定すると、各工程のスターターになる仕込み量および生成される仕上量は、概算で以下のようになる。

図２（１）（２）に示される第１発酵ラインｆ１の第１工程ｐ_１１は、
図３に示される６０Ｌを超えない容量の中央部に発酵ガスを逃がすための弁機能１１を有する蓋１２を備えた４個の陶器製の発酵瓶１０の各々に、
ｐＨ７．３±の軟水ｗの２０Ｌに水で戻した６．５ｋｇ相当の乾燥大豆ｄｓを浸漬し、６．５ｋｇ相当の各乾燥大豆ｄｓの量に見合う量の糖鎖ｓの０．２５ｋｇと、図６に示される元菌液ｂの一部である０．１４Ｌと、を投入する第１前処理工程と、
第１前処理工程で処理された各発酵瓶１０を３日間（６８〜７４時間）の発酵によって、各発酵瓶１０に併せて３５Ｌ相当の第１予備的発酵液ｐｎ１と発酵大豆ｆｓとを生成する、第２前処理工程と、
からなる
第１予備工程ｐｐ_１１を含む。

図２（３）に示される第１発酵ラインｆ１の第１工程ｐ_１１はさらに、第２予備工程ｐｐ_１２を含む。第２予備工程ｐｐ_１２は、第１予備工程ｐｐ_１１を構成する第２前処理工程の発酵大豆ｆｓを各発酵瓶１０から取り出し、図示しない粉砕手段で僅かな軟水ｗを添加しながらペースト状に磨り潰し、磨り潰した発酵大豆ｆｓを発酵瓶１０に対応する４個の容器１１に移し、第２前処理工程の第１予備的発酵液ｐｎ１と混合し、容器１１毎に、併せて３５Ｌ相当の第１予備的発酵液ｐｎ１と大豆ペーストｇｆｓを生成する。

図２（３）に示される第１発酵ラインｆ１の第２工程ｐ_１１は、容器１１毎に生成された３５Ｌ相当の第１予備的発酵液ｐｎ１と大豆ペーストｇｆｓを各容器１１から加熱釜３０に移し、５５〜６０℃まで徐々に加熱し、攪拌し、加熱釜３０に併せて１８０Ｌ［（３５Ｌ+１０Ｌ）×４］相当の第１予備的発酵液ｐｎ１と大豆ペーストｇｆｓを生成する第３予備工程ｐｐ₁３を含む。

第１発酵ラインｆ１の第２工程ｐ_１２は、図２［ａ］〜［ｄ］に示される第４予備工程ｐｐ_１４〜第６予備工程ｐｐ_１６をさらに含む。

第２工程ｐ_１２の第４予備工程ｐｐ_１４は、第１工程ｐ_１１の第３予備工程ｐｐ₁３で加熱釜３０に生成された１８０Ｌ相当の第１予備的発酵液ｐｎ１と大豆ペーストｇｆｓとを、外気に触れさせないように、１００Ｌ相当の冷却用軟水ｗが予め投入された第１培地タンク２０に移し、攪拌し、２８０Ｌ相当のｐＨ４．５±の第１発酵培地ｍ１を生成する。

図２（４）に示される第２工程ｐ_１２の第４予備工程ｐｐ_１４はさらに、２基の第１発酵タンク１００に、外気に触れさせることなく、第１培地タンク２０のｐＨ４．５±の第１発酵培地ｍ１の２８０Ｌ相当と、図６に示される発酵菌ｂ１を予め共棲させ安定させた元菌液ｂの２７０Ｌ〜４５０Ｌ相当と、軟水ｗの１１００〜１３００Ｌ相当とを均等に振り分け、投入する。図２［ｂ］に示されるように、各第１発酵タンク１００では、第１発酵培地ｍ１および元菌液ｂが軟水Ｗと共に攪拌され、併せて１８００Ｌ相当のｐＨ６．４±の予備的第２発酵液ｐｎ２が生成される。

図２［ｃ］および［ｄ］に示される第２工程ｐ_１２の第５予備工程ｐｐ_１５および第６予備工程ｐｐ_１６は、各発酵タンク１００にｐＨ６．４±の予備的第２発酵液ｐｎ２を外気に触れないように密閉し、３７℃〜４０℃の発酵状態を保持しながら５０日〜１００日の発酵によって、図４［ａ］に示されるように、発酵ガスの泡でスポンジ層ｓｐを上澄に形成しながら液中への酸素の溶け込みを防ぎ、元菌液ｂの発酵菌ｂ１による酸性物質の分泌および発酵を促し、第1培地ｍ１の繊維質と発酵菌ｂ１とが堆積したペースト状の第１沈殿層ｄｅｐ１を下層に形成し、スポンジ層ｓｐと第１沈殿層ｄｅｐ１との間に、半透明な第１中間層液を形成する。形成された半透明な第１中間層液は、ｐＨ５．３±の第１発酵液ｎ１である。

各発酵タンク１００には、長期間の発酵によって膨張したスポンジ層ｓｐと、ペースト状の第１沈殿層ｄｅｐ１とが併せて３００Ｌ相当を占めるので、半透明な第１中間層液であるｐＨ５．３±の第１発酵液ｎ１が６００Ｌ相当になる。因みに、３００Ｌ相当の上澄みのスポンジ層ｓｐとペースト状の第１沈殿層ｄｅｐ１とは元菌液ｂの基礎材料になる。

第１発酵ラインｆ１は、第３工程ｐ_１３をさらに含むことができる。第１発酵ラインｆ１の第３工程ｐ_１３は、図４［ｂ］に示されるように、各第１発酵タンク１００で生成された６００Ｌ相当の第１中間層液であるｐＨ５．３±の第１発酵液ｎ１を1基の第２発酵タンク２００に移し替える。

第３工程ｐ_１３は、
1基の第２発酵タンク２００に移し替えられた１２００Ｌ相当のｐＨ５．３±の第１発酵液ｎ１を第１スターターとして、
第１発酵液ｎ１に含まれる元菌液ｂの発酵菌ｂ１による３日〜５日間の発酵によって、
ｐＨ５．０±の第２発酵液ｎ２を生成する。

第２発酵液ｎ２生成の技術的課題

第３工程ｐ_１３の発酵は、培地または発酵培地を使用しない環境の中で、第１発酵液ｎ１を元菌液ｂの発酵菌ｂ１のみで発酵させるという特徴がある。ここで、第１発酵ラインｆ１の第３工程ｐ_１３の技術的課題について触れておくと、２基の第１発酵タンク１００で別々生成された第１中間層液ｎ１は、元菌液ｂの発酵菌ｂ１の共棲による発酵環境を異にするものであり、１基の第２発酵タンク２００に移し替えられ、混合され、一体化されることによって、第１発酵液ｎ１に含まれる元菌液ｂの発酵菌ｂ１の共棲拮抗がさらに刺激されることになる。それは、ｐＨ５．３±の第１発酵液ｎ１がｐＨ５．０±の第２発酵液ｎ２にまで酸性化されることから推定される。

したがって、本発明の多段階の発酵工程は、図１[６]または[８]の２つのルートに示される第１発酵ラインｆ１の第３工程ｐ_１３を経由することなく、第１発酵ラインｆ１の第２工程ｐ_１２から、直接第２発酵ラインｆ２に進むことが可能になる。

発酵ラインｆ１の第２工程ｐ_１２から直接第２発酵ラインｆ２に進む場合には、第２発酵タンク２００の大きさを有する第１発酵タンク（図示せず）の１基が使用されることになる。長年の実践経験から発明者らは、第１発酵ラインｆ１の第３工程ｐ_１３を経ないと発酵菌ｂ１の共棲拮抗が低位に止まる、すなわち発酵菌ｂ１による酸性物質の十分な分泌および発酵が進まないため、１基の第１発酵タンクで１２００Ｌ相当のｐＨ５．３±の第１発酵液ｎ１を安定的に生成することは容易でないという知見を得た。そうした知見を基に、発明者らはｐＨ５．０±の第２発酵液ｎ２になるまで事前にｐＨ５．３±の第１発酵液ｎ１を発酵させる更なる工夫と、それ以上の発酵日数が必要になるという課題に対し、第１発酵ラインｆ１に第３工程ｐ_１３を組み入れるという発想を想起し課題を解決した。

事実、第１発酵ラインｆ１の第３工程ｐ_１３は、３７℃〜４０℃の発酵状態を保持しながらｐＨ５．３±の第１発酵液ｎ１の発酵菌ｂ１のみによる３日〜５日間の発酵によって、発酵ガスの泡で上澄みの第１上面層ｓｆ１を形成し、それにより液中への酸素の溶け込みを防ぎながら発酵菌ｂ１の分泌および発酵をさらに促し、第１培地ｍ１の残渣が堆積したペースト状の第２沈殿層ｄｅｐ２を下層に形成し、第1上面層ｓｆ１と第２沈殿層ｄｅｐ２との間に、１１４０〜１２４０Ｌ相当の半透明な第２中間層液を形成する。半透明な第２中間層液はｐＨ５．０±の第２発酵液ｎ２である。第３工程ｐ_１３を第１発酵ラインｆ１に組み入れるかどうかは、選択の問題である。

第１発酵ラインｆ１の技術的特徴

第１発酵ラインｆ１の技術的特徴は、通常の大豆発酵とは異なり、発酵瓶１０で乾燥大豆ｄｓを発酵させた第１予備的発酵液ｐｎ１と大豆ペーストｇｆｓと軟水ｗと元菌液ｂの一部とで予め第１発酵培地ｍ１を生成し、事前発酵されたｐＨ４．５±の第１発酵培地ｍ１と軟水ｗとを用い、ｐＨ５．３±の第１発酵液ｎ１を生成するようにしたことである。

通常、大豆を用いた発酵生成物は、大豆ｄｓを被発酵物または水などの液体に浸漬した状態で生成する。ところが、本発明者らは、乾燥大豆を用いた第１発酵培地ｍ１を事前発酵する工程を経て、発酵液を生成するという発酵工程によってｐＨ５．３±の第１発酵液ｎ１を生成することに着目し、本発明を完成させた。

図５は、事前発酵された大豆を磨り潰した第1発酵培地の検体Ａを用い６日間の発酵によって生成した第１発酵液Ａと、事前発酵されることなく水に浸漬した乾燥大豆を磨り潰した発酵培地の検体Ｂを用い検体Ａと同じように６日間の発酵によって生成した第１発酵液Ｂと、の比較試験によって生成された第１発酵液Ａの写真Ａおよび第１発酵液Ｂの写真Ｂである。

写真Ａは、４Ｌ相当の第１発酵液ｎ１の生成を想定し予備的に発酵させた大豆６０ｇを磨り潰した大豆ペーストと軟水ｗと０．８Ｌの元菌液ｂとを５５℃まで加熱した後に、３７℃に冷却し、攪拌した検体Ａを６日間の発酵によって生成された第１発酵液Ａである。写真Ａから明らかなように、生成された第１発酵液Ａは、上澄みのスポンジ層ｓｐと、沈殿層ｄｅｐと、その２層の間に、透明度の高い４Ｌ相当の中間層液ｎ１とが綺麗に３層に形成される。

写真Ｂは、写真Ａと対比するために、同量の大豆６０ｇをそのまま水に１８時間の浸漬し、磨り潰し、事前発酵しない大豆ペーストを作成し、そのように作成された大豆ペーストと軟水ｗと０．８Ｌの元菌液ｂと、を５５℃まで加熱した後に、３７℃に冷却し、攪拌した検体Ｂを６日間の発酵によって生成された発酵液Ｂである。写真Ｂから明らかなように、生成された発酵液Ｂは、検体Ａの条件と異なる事前発酵しない大豆ペーストによるものであるので、結果、透明度の低い中澄み液と沈殿層とが形成されるが、発酵菌ｂ１の発酵環境に必要な上澄みのスポンジ層ｓｐが殆ど形成されていない。

図５に示された比較試験の結果は、第１培地の乾燥大豆を事前発酵させておく発酵液Ａと事前発酵しない発酵液Ｂとは、発酵環境に決定的な差が生じることを明らかにした。この比較試験は、より詳細には、元菌液ｂに含まれる発酵菌群ｂ１を使用する発酵環境は、上澄みスポンジ層ｓｐを形成し、空気を遮断することが必須であるという技術的事項を解明したことになる。事実、上澄みスポンジ層ｓｐが生成されない発酵液Ｂは、生臭い臭気が漂い発酵菌ｂ１が外気に触れたために菌数の減少と酸化および腐敗の進行が、発酵作用に勝った結果によるものと推定される。

本発明の方法によるｐＨ５．３±の第１発酵液ｎ１の生成の実現には、上澄みスポンジ層ｓｐを形成する、第１培地を事前発酵する第１発酵培地ｍ１を生成する工程が必須であることは、図５の写真Ａと写真Ｂの試験結果から明らかである。

第２発酵ラインｆ２の詳細

第２発酵ラインｆ２は、
図１[９]および[１０]に示される第２培地タンク４０でｐＨ４．８±の第２発酵培地ｍ２を予め生成する第1工程ｐ_２１と、
図１［１１］に示される第３発酵タンク３００および第３発酵システムｓ３において、第1工程ｐ_２１で生成されたｐＨ４．８±の第２発酵培地ｍ２およびｐＨ５．０±の第２発酵液ｎ２を第２スターターとして、ｐＨ４．５±の第３発酵液ｎ３を生成する第２工程ｐ_２２と、
から構成される。
ここで、スターターとは原材料の意味である。

第２発酵ラインｆ２の第１工程ｐ_２１は、予備的な工程として、拡大図７［ａ］に示される発酵ガスの通る穴を穿設した落し蓋４１を配したシート４２によって封鎖される第２培地タンク４０を準備する。

第１工程ｐ_２１はさらに、第２培地タンク４０に、
図７［ａ］に示される事前に用意された混合培地ｐｍ２と、
１日〜２日程度を経た発酵工程中の第２発酵液ｎ２の一部または第２発酵液ｎ２の一部のいずれかと、
を併せて３５Ｌ相当になるように投入し、攪拌し、
３７℃〜４０℃の発酵状態を保持しながら２日〜３日の発酵によって、
図７［ｂ］に示される予備的発酵混合培地ｐｆｍ２および予備的第３発酵液ｐｎ３を生成し、
図示しない工程によって、
生成された予備的発酵混合培地ｐｆｍ２を粉砕手段でタイソンの種が潰れない程度に磨り潰して第２培地タンク４０に戻し、
磨り潰された予備的発酵混合培地ｐｆｍ２に予備的第３発酵液ｐｎ３を馴染ませながら
ｐＨ４．８±の第２発酵培地ｍ２を生成する。

事前に用意される混合培地ｐｍ２は、殺菌処理されたタイソウ、クコシ、ウコンからなる乾燥植物を、第２発酵液ｎ２の３５Ｌ相当の総量に対し、タイソウ２００〜２１０ｇ、クコシ１１０〜１２０ｇ、ウコン２５〜３０ｇの重量比で混合された混合培地である。因みに、タイソウ、クコシ、ウコンからなる乾燥植物は、天然に存在する薬効を持つ産物で「生薬一覧」にも挙げられる棗の果実がタイソウ、クコの果実のクコシ、および、ショウガ科のウコンである。これらは、発明者らの長年の地道な実践から多くの生薬の中から選択された。

第２発酵ラインｆ２の技術的特徴

長年の試行錯誤の実践から発明者らは、図７［ａ］および［ｂ］に示されるように、第２発酵ラインｆ２の第１工程ｐ_２１において、第２発酵液ｎ２の３５Ｌ相当の総量に対し、タイソウ２００〜２１０ｇ、クコシ１１０〜１２０ｇ、ウコン２５〜３０ｇ（重量比７：４：１）相当で混合された混合培地ｐｍ２を形成し、第２培地タンク４０で事前に混合培地ｐｍ２を発酵させ、予備的発酵混合培地ｐｆｍ２および予備的第３発酵液ｐｎ３を生成し、図示しない工程によって、粉砕手段で予備的発酵混合培地ｐｆｍ２をタイソウの種が潰れない程度に磨り潰して第２培地タンク４０に戻し、磨り潰された予備的発酵混合培地ｐｆｍ２に予備的第３発酵液ｐｎ３を馴染ませながらｐＨ４．８±の第２発酵培地ｍ２を生成する工程を完成させた。

第２発酵ラインｆ２の第１工程ｐ_２１は、第１発酵ラインｆ１に第３工程ｐ_１３が組み込まれている場合には、好ましくは、第２発酵液ｎ２の発酵工程ｐ_１３と一部重複する工程が採用される。

第１工程ｐ_２１を第２発酵液ｎ２の発酵工程ｐ_１３とリニアに並べずに一部重複するように同時平行させた技術的理由の第1は、発酵工程中の発酵菌ｂ１の発酵環境を変えることにある。発酵環境を変えることにより、発酵菌ｂ１の酸性物質の分泌および発酵がさらに促され、第２発酵培地ｍ２はより迅速に生成されるようにした。

技術的理由の第２は、第３発酵タンク３００による第３発酵液ｎ３の発酵工程ｐ_２２の開始を、第２発酵液ｎ２の発酵工程ｐ_１３の終了時に合せるためである。それにより、第２発酵培地ｍ２を生成する第２発酵ラインｆ２の第１工程ｐ_２１は、第１発酵ラインｆ１の第３工程ｐ_１３の第２発酵液ｎ２の発酵工程ｐ_１３の終了を待つことなく、開始することができる。結果的に、第３発酵液ｎ３を生成する第２発酵ラインｆ２の第２工程ｐ_２２は、第１発酵ラインｆ１の第２発酵液ｎ２の発酵工程（第３工程ｐ_１３）の終了に遅れることなく開始されることになる。

第２発酵ラインｆ２の第１工程ｐ_２１において、選択された３種の生薬である乾燥植物ｐｍ２を事前発酵させた第２発酵培地ｍ２を用いる第２発酵ラインｆ２の技術的意義は、図１０に示される第３発酵液ｎ３の発酵液モデルの検体Ａおよび検体Ｂの比較試験の結果および図１１に示される検体Ａおよび検体Ｂの異なる発酵の進行度合の分析結果から明らかになる。

第２発酵ラインｆ２は、第２発酵培地ｍ２を生成する工程ｐ_２１を含む。本工程ｐ_２１は、第２発酵液ｎ２の３５Ｌ相当の総量に対し、タイソウ２００〜２１０ｇ、クコシ１１０〜１２０ｇ、ウコン２５〜３０ｇ（重量比７：４：１）相当で混合された混合培地ｐｍ２を、第２発酵液ｎ２の一部と共に、第２培地タンク４０で事前発酵し、予備的第３発酵液ｐｎ３および予備的発酵混合培地ｐｆｍ２を生成する予備的工程ｐｐ_２１を含み、生成された予備的発酵混合培地ｐｆｍ２を、粉砕手段を用いてタイソンの種が潰れない程度に磨り潰して第２培地タンク４０に戻し、磨り潰された予備的発酵混合培地ｐｆｍ２に対し予備的第３発酵液ｐｎ３を馴染ませ、ｐＨ４．８±の第２発酵培地ｍ２を生成する予備的工程ｐｐ_２２を、さらに含む。

第２発酵ラインｆ２はｐＨ４．５±の第３発酵液ｎ３を生成する工程ｐ_２２をさらに含む。図１［１１］〜［１２］に示される工程ｐ_２２は、工程ｐ_２１で生成された第２発酵培地ｍ２を袋状培地フィルタ３２０に封入した状態で第３発酵タンク３００に吊るし、第３発酵タンク３００には、第２培地タンク４０から予備的第３発酵液ｐｎ３を移し、さらに第２発酵タンク２００からｐＨ５．０±の第２発酵液ｎ２を移す予備的工程ｐｐ_２１を含む。工程ｐ_２２はさらに、袋状培地フィルタ３２０の第２発酵培地ｍ２が混ざり合わないように、予備的第３発酵液ｐｎ３と第２発酵液ｎ２を循環し、３７℃〜４０℃の発酵状態を保持しながら８日〜９日の発酵によって、１０５０Ｌ相当のｐＨ４．５±の第３発酵液ｎ３を生成する予備的工程ｐｐ_２２を含む。

図１０は、第３発酵液ｎ３の発酵液モデルの検体Ａおよび検体Ｂの比較試験の結果を示す写真Ａおよび写真Ｂである。

検体Ａは、１Ｌ相当の第２発酵液ｎ２と、１Ｌに見合うタイソウ５．７１ｇ、クコシ３．１４ｇ、ウコン０．８５ｇ（重量比７：４：１）からなる混合培地ｐｍ２を事前発酵し、事前発酵した第２発酵培地ｍ２を生薬用の代用フィルタに封入し試験容器Ａに吊るし、１Ｌ相当のスターターの第２発酵液ｎ２と予備的第３発酵液ｐｎ３とを試験容器Ａに投入し、攪拌し、３８℃〜４０℃の発酵状態を保持しながら５日間の発酵によって、上澄みの発酵ガス層と混濁した第３発酵液ｎ３の２層からなる発酵液Ａである(図１０の写真Ａ)。

検体Ｂは、１Ｌ相当の第２発酵液ｎ２と、1Ｌに見合うタイソウ５．７１ｇ、
クコシ３．１４ｇ、ウコン０．８５ｇ（重量比７：４：１）からなる混合培地ｐｍ２を混合培地ｐｍ２のまま、事前発酵せずに生薬用の代用フィルタに封入し、試験容器Ｂに吊るし、１Ｌ相当のスターターの第２発酵液ｎ２と予備的第３発酵液ｐｎ３とを試験容器Ｂに投入し、攪拌し、３８℃〜４０℃の発酵状態を保持しながら５日間の発酵によって、上澄みの発酵ガス層が殆ど形成されない第３発酵液ｎ３からなる発酵液Ｂである（図１０の写真Ｂ）。発酵液Ｂは、上澄みの発酵ガス層が殆ど形成されていないという点で発酵液Ａと決定的に異なる。

発酵液Ａと発酵液Ｂとは、発酵菌ｂ１の酸性物質の分泌代謝による発酵度合いの差によるものであって、より具体的には、発酵液Ａは、発酵液Ｂに比べ発酵菌ｂ１の分泌代謝による発酵が進んでいることを示す比較試験の結果である。

図１１は、５日間の発酵液Ａと発酵液Ｂの発酵度合いの差を酸性度の変化で見たものである。発酵液Ａは、常に発酵液Ｂより低い酸性度のｐＨ値を示す。３日目までは、発酵液Ａの酸性度はｐＨ５．１１〜ｐＨ５．０９で推移し、発酵液Ｂの酸性度はｐＨ５．１３〜ｐＨ５．１４で推移し、酸性度は、発酵液Ａ＞酸性度Ｂであるが共に大きな変化はない。しかし、４日〜５日目には、共に酸性度が強くなることが明らかで、発酵液Ａの酸性度はｐＨ４．７６〜ｐＨ４．６８まで、また発酵液Ｂの酸性度はｐＨ４．８７〜ｐＨ４．７８まで酸性化が進み、酸性度は発酵液Ａ＞酸性度Ｂであるが、共に嫌気性発酵菌ｂ１の分泌代謝による発酵度合いが確認される。

図１１はまた、第３発酵液ｎ３を生成するときに事前発酵された第２発酵培地ｍ２を用いることによって発酵菌ｂ１の発酵環境を変え、発酵菌ｂ１の酸性物質の分泌代謝を高め発酵を促すように働かせている結果を示すグラフである。事前発酵された第２発酵培地ｍ２を用い、第３発酵液ｎ３を生成する技術的意義は、ここにある。

第２発酵ラインｆ２の第２工程ｐ_２２の第１予備工程ｐｐ_２１は、
図１［１１］に示される第１工程ｐ_２１で生成されたｐＨ４．８±の第２発酵培地ｍ２を第３発酵タンク３００内に吊るすように複数設置された蒸気殺菌済の袋状培地フィルタ３２０に均等に封入し、
第１工程ｐ_２１で生成された予備的第３発酵液ｐｎ３を第２培地タンク４０から第３発酵タンク３００に移し、
第２発酵タンク２００からｐＨ５．０±の第２発酵液ｎ２を第３発酵タンク３００に連結された第２発酵タンク２００の抜取装置２１０を介し、第３発酵タンク３００に移す。

第２発酵ラインｆ２の第２工程ｐ_２２の第２予備工程ｐｐ_２２は、
図９に示される循環用ポンプ装置３３０を作動し、
第３発酵タンク３００に、
内部に吊るされた袋状培地フィルタ３２０に他と混ざり合わないように封入されたｐＨ４．８±の第２発酵培地ｍ２と、
ｐＨ４．８±の予備的第３発酵液ｐｎ３およびｐＨ５．０±の第２発酵液ｎ２
を第２スターターとして一体的に循環し、
３７℃〜４０℃の発酵状態を保持しながら８日〜９日の発酵によって、
上澄みに第２上面膜層ｓｆ２が形成された混濁液からなるｐＨ４．５±の第３発酵液ｎ３を生成する。

第２発酵培地ｍ２は、肌理の細かい袋状培地フィルタ３２０に封入されているため、第２発酵ラインｆ２の第２工程ｐ_２２においては、第２発酵培地ｍ２の残渣が発酵タンク３００に底部に堆積することはない。また第２発酵液ｎ２から第３発酵液ｎ３に変化するときに、第３発酵液ｎ３の酸性度がｐＨ５以下にまで進むことは確認されている。

第３発酵ラインｆ３の詳細

図１[１３]〜[１６]に示される第３発酵ラインｆ３は、ｐＨ４．４±の第３発酵培地ｍ３が生成される第１工程ｐ_３１とｐＨ３．７±の第４発酵液ｎ４が生成される第２工程ｐ_３２とからなる。

第３発酵ラインｆ３の全体像が図１２に示される。図１２には、第２発酵ラインｆ２で生成された第２発酵液ｎ２を第３発酵タンク３００に移した状態で、第３発酵タンク３００の内部に設置される袋状培地フィルタ３２０に第２培地タンク４０で生成された第２発酵培地ｍ２を投入し、循環用ポンプ装置３３０を作動し、循環させながら８日〜9日間の発酵によって、第３発酵液ｎ３を生成する工程［ａ］が示される。

第３発酵ラインｆ３は、第３培地タンク５０に、第３培地タンク３００の第３発酵液ｎ３の一部とはちみつ原料ｐｍ３とを適量投入し、攪拌し、３７℃〜４０℃の発酵状態を保持しながら２日〜３日間の発酵によって、第３発酵培地ｍ３を生成する工程［ｃ］を含む。

第３発酵ラインｆ３はさらに、第４発酵タンク４００に第３発酵タンク３００から移された第３発酵液ｎ３と第３発酵培地ｍ３とを投入し、攪拌し、３７℃〜４０℃の発酵状態を保持しながら３０日〜６０日の発酵によって、第４発酵液ｎ４を生成する工程［ｄ］〜［ｇ］を含む。

第３発酵ラインｆ３の第１工程ｐ_３１は、より具体的には、図１２［ａ］〜［ｂ］に示される生成された１０５０〜１１００Ｌ相当の第３発酵液ｎ３の３〜５％相当の百科蜜とアカシヤ蜜とを１対４の比率になるように構成したハチミツ原料ｐｍ３と、ハチミツ原料ｐｍ３の４倍に相当する量の第３発酵液ｎ３の一部と、を外気にふれさせないように、第３培地タンク５０に移し、攪拌し、図１２［ｃ］に示される予備的発酵培地ｐｆｍ３を生成するようにした第１予備工程ｐｐ_３１を含む。

第１工程ｐ_３１はさらに、第1予備工程ｐｐ_３１で生成された予備的発酵培地ｐｆｍ３を、３７℃〜４０℃の発酵状態を保持しながら２日〜３日間の発酵によって、ハチミツ原料ｐｍ３によるｐＨ４．４±の第３発酵培地ｍ３を生成するようにした第２予備工程ｐｐ_３２を含む。

第３発酵ラインｆ３の第２工程ｐ_３２は、
図１２［ｄ］〜［ｆ］に示される第４発酵タンク４００にｐＨ４．４±の第３発酵培地ｍ３を投入し、
第４発酵タンク４００に連結された第３発酵タンク３００の抜取装置３１０でｐＨ４．５±の第３発酵液ｎ３を第４発酵タンク４００に移し、
ｐＨ４．４±の第３発酵培地ｍ３と
ｐＨ４．５±の第３発酵液ｎ３と
を第４スターターとして、混合し、攪拌し、
３７℃〜４０℃の発酵状態に保持しながら３０日〜６０日の発酵によって、
上澄みに発酵ガス層の第３上面層ｓｆ３が形成され、下層に沈殿物を含む第３沈殿層ｄｅｐ３が形成され、
形成された第３上面層ｓｆ３と第３沈殿層ｄｅｐ３との間に、１０００〜１０５０Ｌ相当の半透明な第３中間層液を生成する。半透明な第３中間層液は、ｐＨ３．７±の第４発酵液ｎ４である。

第３発酵ラインｆ３の技術的特徴

長年の地道な試行錯誤の実践から発明者らは、第３発酵ラインｆ３を構想し、試行錯誤を繰り返し、発酵菌ｂ１に一定質量の糖分を供給し、発酵菌ｂ１の増殖と分泌代謝能力とを高め、さらなる酸性物質の分泌代謝による発酵を継続させることを実現させた。

発明者らは、試行錯誤の繰り返しの中で、水分活性度（低すぎると菌の水中活動の抑制によって菌増殖が出来なくなる程度）から割り出される発酵菌ｂ１の分泌代謝能力を維持するための糖質量が第３発酵液ｎ３の３〜５％に相当するハチミツ原料ｐｍ３であることを発見し、これを４倍の第３発酵液ｎ３の量で攪拌し、予備的発酵培地ｐｆｍ３を生成し、生成された予備的発酵培地ｐｆｍ３を、３７℃〜４０℃の発酵状態に保持しながら２日〜３日間の発酵によって、第３発酵培地ｍ３を生成した。

発明者らはさらに、生成された第３発酵培地ｍ３を２０倍相当の第３発酵液ｎ３で混合し、攪拌し、３７℃〜４０℃の発酵状態を保持しながら３０日〜６０日の発酵によって、発酵菌ｂ１の酸性物質の分泌代謝による発酵を促し、ｐＨ３．７±の第４発酵液ｎ４を生成することに成功した。これが第３発酵ラインｆ３である。その技術的特徴が図１３および図１４に示される。

図１３は、第４発酵液ｎ４の発酵液モデルの検体Ａおよび検体Ｂの比較試験の結果を示す写真Ａおよび写真Ｂである。

検体Ａは、ハチミツ原料ｐｍ３を事前発酵させた第３発酵培地ｍ３を１Ｌになるように２０倍相当の第３発酵液ｎ３で混合し、攪拌し、３８℃〜４０℃の発酵状態を保持しながら４日間の発酵によって生成した第４発酵液ｎ４の発酵液Ａである。検体Ｂは、ハチミツ原料ｐｍ３（第３培地ｐｍ３）のまま１Ｌになるように２０倍相当の第３発酵液ｎ３で混合し、攪拌し、４日間の発酵によって生成した第４発酵液ｎ４の発酵液Ｂである。

検体Ａは、一方の試験容器にハチミツ原料ｐｍ３を事前発酵させた第３発酵培地ｍ３を投入し、攪拌し、４日間の発酵によって、上澄みに形成する発酵ガス層の第３上面層ｓｆ３と、下層に溜る沈殿物を含む第３沈殿層ｄｅｐ３と、第３上面層ｓｆ３と第３沈殿層ｄｅｐ３との間に、半透明な第３中間層液の３層形成する発酵液Ａである。半透明な第３中間層液は、第４発酵液ｎ４に相当する。

検体Ｂは、他方の試験容器にハチミツ原料ｐｍ３のまま投入し、攪拌し、４日間の発酵によって、生成された発酵液Ｂである。写真Ｂからすると、上澄みに発酵ガス層の第３上面層ｓｆ３を形成されているが、検体Ａに比べると、極薄い層であることが確認される。これは、発酵菌ｂ１の酸性物質の分泌代謝による発酵が検体Ａほど活発でないことの現れである。そのことは、図１４から確認される。

４日間の発酵による発酵液Ａおよび発酵液Ｂの酸性度の変化を見たのが、図１４である。1日目の発酵液Ａおよび発酵液Ｂの酸性度は、共にｐＨ４．６である。酸性度の変化は、2日目に共に上昇し、発酵液ＡはｐＨ４．７で、発酵液Ｂは４．７３である。３日〜４日目に発酵度合いが進み、結果、酸性度は共に下がり、発酵液ＡはｐＨ４．６〜４．５２であるのに対し、発酵液ＢはｐＨ４．６８〜４．６である。２日〜４日目の両者の酸性度は、常に発酵液Ａ＞酸性度Ｂである。

図１４は、それを表す発酵開始から４日間の発酵液Ａおよび発酵液Ｂの酸性度の推移を表すグラフである。両者の違いは、４日間の酸性度のｐＨ値において発酵液Ａが常に発酵液Ｂを下回る程に発酵度合いが高いことの現れである。このことは、発酵液Ａの発酵菌ｂ１がより活発に酸性物質を分泌していることの証しである。すなわち、発明者らは、第４発酵液ｎ４を生成するときに、ハチミツ原料ｐｍ３のままの第３培地ではなく、ハチミツ原料ｐｍ３を事前発酵された第３発酵培地ｍ３を用いることによって、発酵菌ｂ１の発酵環境を変え、酸性物質の分泌代謝を高めるように発酵菌ｂ１を働かせることに成功した。

第４発酵ラインｆ４の詳細

図１[１７]に示される第４発酵ラインｆ４は、
ｐＨ３．７±の第４発酵液ｎ４を第５スターターとして、
３７℃〜４０℃の発酵状態を保持しながら第４発酵液ｎ４に含まれる発酵菌ｂ１のみによる３０日〜６０日の発酵によって、
ｐＨ３．６±の第５発酵液ｎ５を生成する。
これが第４発酵ラインｆ４の工程ｐ_４１であり、発酵工程中に目減りは殆どないので、生成される第５発酵液ｎ５は、１０００〜１０５０Ｌ相当になる。

第４発酵ラインｆ４の工程ｐ_４１は、以下の工程を経た、第５発酵液ｎ５を生成する工程である。

それは、第１発酵培地ｍ１を用いた第１発酵ラインｆ１の第１工程ｐ_１１および第２工程ｐ_１２において、２基の第１発酵タンク１００で生成した第１発酵液ｎ１を１基の第２発酵タンク２００に移し替え、第３工程ｐ_１３において発酵培地を使用しない発酵環境で生成された第２発酵液ｎ２および第２培地タンク４０で生成された第２発酵培地ｍ２を用い、第２発酵ラインｆ２で、第３発酵液ｎ３を生成し、第２発酵ラインｆ２で生成された第３発酵液ｎ３および第３培地タンクで生成された第３発酵培地ｍ３を用い、第３発酵ラインｆ３で、第４発酵液ｎ４を生成し、第４発酵ラインｆ４で発酵培地を使用しない発酵環境で第５発酵液ｎ５が生成される。第４発酵ラインｆ４の工程ｐ_４１の第５スターターは、第４発酵液ｎ４のみであり、新たな培地または発酵培地が使用されることはない。

第４発酵ラインｆ４の技術的特徴

第４発酵液ｎ４の酸性度ｐＨ３．７±と第５発酵液ｎ５の酸性度ｐＨ３．６±との間には、一見酸性度に変化がないように見える。しかし、１６図から明らかなように、実測に基づき各工程の発酵度合いの変化を酸性度のｐＨ値で表した第５発酵液ｎ５の発酵度合いの変化を表す酸性度は、第４発酵液ｎ４の３０日〜６０日をかけた発酵期間中に、徐々に高めている。これは、第４発酵液ｎ４に含まれる発酵菌ｂ１の分泌代謝による発酵が進んでいることを証するものである。

第４発酵ラインｆ４の技術的意図について言及すると、発明者らの長年の地道な試行錯誤の実践過程において、一時期、第３発酵ラインｆ３によって発明者らが目指す発酵液の製造方法は完成したものと見做していた。その時点では、第３発酵ラインｆ３に続く第４発酵ラインｆ４の技術的必要性は、想定されていなかった。ところが、発明者らは、第３発酵ラインｆ３の終了時においてもなお、発酵菌ｂ１の酸性物質の分泌代謝活動は収まらず、そのため、発酵菌ｂ１を加熱殺菌するなどの様々な工夫を施し、第３発酵ラインｆ３の第４発酵液ｎ４を安定的生成するよう何度も試みた。結果、発明者らが得た技術的知見は、有胞子性の発酵菌を含む発酵菌ｂ１は、例え高温・乾燥・栄養の悪化等の過酷な条件下でも芽胞を形成し休眠状態で生き伸び、加熱殺菌などでは処理し難いものであるということであった。

この技術的知見に気付いた発明者らは、むしろ時間はかかるけれども、第３発酵ラインｆ３の終了段階で発酵菌ｂ１の酸性物質の活発な分泌代謝を終了させることが果たして必要かどうかの技術的課題に着目し、第４発酵ラインｆ４以下の発酵工程における発酵菌ｂ１の酸性物質の分泌代謝の技術的価値の発見に至り、本発明を完成させることに成功した。

第５発酵ラインｆ５の詳細

図１[１８]〜[１９]に示される第５発酵ラインｆ５は、
第４発酵ラインｆ４における第５発酵タンク５００で生成された第５発酵液ｎ５を一旦急冷却し、急冷却された第５発酵液ｎ５を常温に戻し常温状態にするようにした第１工程ｐ_５１と、
常温状態で管理した液温状態で、第５発酵液ｎ５に含まれる発酵菌ｂ１の発酵によって、１０００〜１０５０Ｌ相当のｐＨ３．３±の第６発酵液ｎ６を生成する第２工程ｐ_５２と、
を含む。

第６発酵液ｎ６は、第５発酵液ｎ５に含まれる発酵菌ｂ１のみによる発酵によって生成される。それは、第５発酵ラインｆ５の第２工程ｐ_５２で第５発酵液ｎ５が第４発酵液ｎ４に含まれる発酵菌ｂ１のみによる発酵によって生成されたときと同様である。しかし、第６発酵液ｎ６を生成するときの発酵環境は、第５発酵液ｎ５を生成するときの発酵環境と、次の２つの点で決定的に異なる。それが第５発酵ラインｆ５の技術的特徴がある。

第５発酵ラインｆ５の技術的特徴

第５発酵ラインｆ５の技術的特徴の第１は、図１５［ａ］に示されており、それは、第５発酵タンク５００に３７℃〜４０℃の発酵状態で保持された第５発酵液ｎ５の１０００〜１０５０Ｌ相当を、第６発酵システムｓ６の冷却装置６１０に配備された予備タンク６２０に移す工程である。

その技術的意図は、図１５［ｂ］に示されており、それは、第５発酵液ｎ５に含まれる発酵菌ｂ１の酸性物質を分泌する活動が停止する４〜５℃以下に急冷却することにある。これは発酵菌ｂ１の最も分泌代謝のし易い発酵環境から最も分泌代謝のし難い環境へと切換えることを意味する。この状態の発酵菌ｂ１は、休眠状態になり、分泌代謝を停止する。

図１５［ｃ］に示される急冷却によって分泌代謝を停止した発酵菌ｂ１を含む第５発酵液ｎ５は、予備タンク６２０から第６発酵タンク６００に移され、季節に応じた常温状態に戻し、常温状態の発酵経環境で、１８０日〜２４０日の発酵によって発酵菌ｂ１の活動が徐々に促され酸性物質の分泌代謝が活性化される。

第５発酵ラインｆ５の技術的特徴の第２は、発酵菌ｂ１が活動し易い３７℃〜４０℃の発酵状態ではなく、発酵菌ｂ１が活動し難い常温状態、具体的には、５℃以上２８℃以下の季節に応じた発酵環境を作り出し、図１６のステージ３に示される１８０日〜２４０日の長期間（６月〜８月）の発酵によって、発酵菌ｂ１の酸性物質の分泌代謝を促しながら代謝活動を収斂させるようにしたことである。それにより、最終的には分泌代謝を停止した発酵菌ｂ１は休眠状態になり、第６発酵タンク６００にはｐＨ３．３±の第６発酵液ｎ６が生成される。

発明の作用効果

原理的には、本発明により製造されるｐＨ５．３±の第１発酵液ｎ１は、最終生成物のｐＨ３．３±の第６発酵液ｎ６を生成するための最初の発酵液である。第１発酵液ｎ１は、適正な体積比率で、軟水ｗと、大豆ペーストの発酵培地ｍ１と、特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）に寄託登録された受託番号ＮＩＴＥ ｐ−０２９４５〜ＮＩＴＥ ｐ−０２９５１（受託日：２０１９年５月１６日）の有胞子性の発酵菌を含む７種の発酵菌ｂ１からなる元菌液ｂとを混合した混濁液（予備的第２発酵液ｐｎ２）すなわち５０ｎｍを超えないコロイド粒子および短鎖脂肪酸を含有するｐＨ３以上４以下の発酵液を製造するための原液θをスターターとして、図１６のステージ１に示されるように、適正な発酵温度の３７℃〜４０℃の発酵状態に保持しながら５０日〜１００日かけた発酵によって生成される。

第１発酵液ｎ１のスターターとなる混濁液（予備的第２発酵液ｐｎ２）が原液θである理由は、軟水ｗおよび有胞子性の発酵菌ｂ１を含む元菌液ｂを使用するのは、第１発酵液ｎ１を生成するときに限られることに由来する。その由来は、具体的には、第２発酵液ｎ２から第６発酵液ｎ６を生成するときに、新たに軟水ｗおよび元菌液ｂが使用されることはない。第２発酵液ｎ２から第６発酵液ｎ６を生成する工程の全ては、それぞれに形成された適正な発酵環境で、第１発酵液ｎ１に含まれる有胞子性の発酵菌を含む７種の発酵菌ｂ１による酸性物質の分泌代謝を活性化し、各工程でのそれぞれの発酵を進めることによって、各発酵液の酸性度を高める。

５０ｎｍを超えないコロイド粒子および短鎖脂肪酸を含有するｐＨ３以上４以下の発酵液を製造する方法に関する本発明において、有胞子性の発酵菌を含む７種の発酵菌ｂ１からなる元菌液ｂは、必須の構成要件である。元菌液ｂは、図６に示される（ＮＰＭＤ）に寄託登録された受託番号ＮＩＴＥ ｐ−０２９４５〜ＮＩＴＥ ｐ−０２９５１（受託日：２０１９年５月１６日）の有胞子性の発酵菌を含む７種の発酵菌ｂ１で構成される。元菌液ｂが安定的に供給できなければ、本発明は成立しない。

発明者らは、長期にわたる実践過程で試行錯誤を繰り返し、結果、図６に示される酪酸、プロピオン酸、乳酸菌の短鎖脂肪酸を含む有機酸を生成する有胞子性の発酵菌を含む7種の発酵菌ｂ１を見出し、選択し、それらを安定的に産生する元菌液ｂを生成することに成功した。

元菌液ｂの産生は、２基の第１発酵タンク１００に形成される３層のスポンジ層ｓｐと、半透明な中間層液と、第１沈澱層ｄｅｐと、による。より具体的には、元菌液ｂは、第１発酵タンク１００から上澄みのスポンジ層ｓｐと底部に堆積した第１沈澱層ｄｅｐと取り出し、混合し、ペースト状にしたものである。２基の第１発酵タンク１００に形成される３層の何れの層にも元菌液ｂを構成する有胞子性の発酵菌を含む７種の発酵菌ｂ１は、含まれる。

半透明な中間層液を除いた第１発酵タンク１００に形成されるスポンジ層ｓｐおよび第１沈澱層ｄｅｐが元菌液ｂになる根拠は、各第１発酵タンク１００の仕込み量を９００Ｌと想定すると、３分の１の３００Ｌ相当が元菌液ｂの原料になり、それを相当量のペースト状に仕上げた元菌液ｂを次の仕込みの元菌液ｂとして使用すると、第１発酵タンク１００に同品質の３層が形成され、ｐＨ５．３±の第１発酵液ｎ１が生成される。

またペースト状に仕上げた元菌液ｂは冷凍保存することもできる。冷凍保存された元菌液ｂの必要な相当量を３７℃〜４０℃の発酵状態に戻し、次の仕込みのペースト状の元菌液ｂとして使用しても、第１発酵タンク１００には同品質の次の３層が形成され、そこで形成される半透明な中間層液の第１発酵液ｎ１の酸性度は、常にｐＨ５．３±であることから確認することができる。

ペースト状の元菌液ｂは、大型冷凍装置で長期保存することができる一方で５０日〜１００日の発酵直後に発酵温度のまま、次の発酵ラインｆ１に使用することもできる。本発明の短鎖脂肪酸を含有する発酵液を製造する製造方法は、最終製品の第６発酵液ｎ６が生成するまでには、図１６から明らかなように、少なくとも３０３日（１０か月）〜４７７日（１６か月）を要するが、その最終製品の製造を待つことなく、連続製造は、遅くとの第１発酵液ｎ１の生成が終了する１００日前後の間隔で、行うことができる。要するに本発明による製造される最終生成物のｐＨ３．３±の第６発酵液ｎ６は、遅くとも１００日単位で連続製造することができる。

本発明により製造される発酵液

本発明により製造される発酵液は、スターターとなる軟水ｗと、有胞子性の発酵菌を含む７種の発酵菌ｂ１からなる元菌液ｂと、３種類の発酵培地に用いられる乾燥大豆、タイソウ、クコシ、ウコンなど３種の生薬からなる乾燥植物、および、ハチミツ原料からなる天然素材で発酵された発酵液である。

本発明により製造される最終生成物のｐＨ３．３±の第６発酵液ｎ６について、下記の分析を行い、第１発酵液ｎ１から第６発酵液ｎ６に至る発酵における発酵菌ｂ１の分泌代謝による酸性物質の作用を想定し、本発明により製造される発酵液を構成する要素を推定する。
（１）第１発酵液から第６発酵液の酸性度ｐＨ値の分析
（２）第６発酵液ｎ６の粒度分析
（３）第４発酵液ｎ４から第６発酵液ｎ６の糖質濃度分析
（４）第２発酵液ｎ２から第６発酵液ｎ６までの短鎖脂肪酸分析

（１）第１発酵液から第６発酵液の酸性度ｐＨ値の推移

発明者らは、既に記載した各工程で生成される発酵培地および発酵液の酸性度のｐＨ値を監視しながら、日々、本発明で製造される発酵培地および発酵液の製造に携る。図１６は、常に計測し監視している酸性度のロット毎の平均値をグラフに表したものである。各ｐＨ値に±を付しているのは、発酵過程では常に生じる計測する室の温度差、湿度差、更には計測のタイミングの僅かなズレによるｐＨ値の振れ幅（通常は０．３の振れ幅）を表現したものである。

図１６に示されるｐＨ７．３±の軟水ｗから始まった第１発酵ラインｆ１の酸性度の推移は、第１発酵培地ｍ１の酸性度を含め、第１発酵液ｎ１および第２発酵液ｎ２を含め、ステージ１として区分した。その区分の発酵期間は、最短で５５日、最長で１０８日程度である。

注目すべきは、２基の第１発酵タンク１００に、第１培地タンク２０で生成されたｐＨ４．５±の第１発酵培地ｍ１と、元菌液ｂと、軟水ｗとが大量に投入され、攪拌され、生成された混濁液のｐＨ６．４±の予備的第２発酵液ｐｎ２は、本発明により製造される発酵液の起点となる、いわゆる出発点の発酵液になる。これ以後、元菌液ｂおよび軟水ｗが再投入されることはない。そのため、ｐＨ６．４±の予備的第２発酵液ｐｎ２は、本発明により製造される最終生成物のｐＨ３．３±の第６発酵液ｎ６の原液θに相当する。そして、ｐＨ６．４±の予備的第２発酵液ｐｎ２は、適正な発酵温度で５０日〜１００日の発酵によって、ｐＨ５．３±の第１発酵液ｎ１に生成される。

注目すべき他の１つは、ステージ１の最後の区分となる第２発酵タンク２００で第１発酵液ｎ１の発酵菌ｂ１のみによる適正な発酵温度で３日〜５日の発酵によってｐＨ５．０±の第２発酵液ｎ２が生成されることである。さらに同区分内には、第２発酵ラインｆ２を構成する２日〜３日の発酵によってｐＨ４．８±の第２発酵培地ｍ２を生成する工程が重複していることである。

図１６に示されるｐＨ５．０±の第２発酵液ｎ２が始まる第２発酵ラインｆ２からｐＨ３．６±の第５発酵液ｎ５の第４発酵ラインｆ４までの酸性度の推移は、第２発酵ラインｆ２の第２発酵培地ｍ２と第２発酵液ｎ２とをスターターとして生成されたｐＨ４．５±の第３発酵液ｎ３の酸性度を含め、第３発酵ラインｆ３の第３発酵培地ｍ３と第３発酵液ｎ３とをスターターとして生成されたｐＨ３．７±の第４発酵液ｎ４をさらに含め、第４発酵ラインｆ４の第４発酵液ｎ４のみをスターターとして生成されたｐＨ３．６±の第５発酵液ｎ５を含めた、ステージ２として区分した。同区分内の適正な発酵温度での発酵期間は、最短で６８日、最長で１２９日程度である。

注目すべき推移は、次の２つの変化である。第１の変化は、第２発酵培地ｍ２および第３発酵培地ｍ３を用いた第２発酵ラインｆ２および第３発酵ラインｆ３において、発酵菌ｂ１の酸性物質の分泌代謝が活発化し、第３発酵液ｎ３および第４発酵液ｎ４まで酸性度は、ｐＨ５．０±からｐＨ３．７±まで進行したことである。第２の変化は、第４発酵ラインｆ４の第４発酵液ｎ４のみをスターターとして、３７℃〜４０℃の発酵状態を保持したまま３０日〜６０日をかけた発酵によって生成された第５発酵液ｎ５であるが、酸性度は、第４発酵液ｎ４のｐＨ３．７±と比べ、ｐＨ３．６±で殆ど変化していないことである。

発明者らは、第３発酵ラインｆ３の終了時においてもなお、発酵菌ｂ１の酸性物質の分泌代謝活動は収まらないことを利用し、第３発酵ラインｆ３の終了段階で発酵菌ｂ１の酸性物質の活発な分泌代謝を終了させずに、緩やかな発酵でも発酵菌ｂ１の酸性物質の分泌代謝を促す第４発酵ラインｆ４の発酵工程の技術的価値を発見したことによる。それは、芽胞を形成する有胞子性の発酵菌を含む発酵菌ｂ１は、例え高温・乾燥・栄養の悪化等の過酷な条件下でも、芽胞を形成し休眠状態で生き伸びるため加熱殺菌などでは処理し難く、寧ろ時間はかけ、第４発酵液ｎ４の発酵を促進するメリットに発明者らが気付いたためである。

図１６に示されるｐＨ３．６±の第５発酵液ｎ５をスターターとする第５発酵ラインｆ５の酸性度の推移は、ステージ３として区分した。ステージ３は、適正な発酵温度の３７℃〜４０℃の発酵状態で保持された第５発酵液ｎ５を４〜５℃以下に一旦急冷却し、次に発酵菌ｂ１の最も分泌代謝し難い環境から緩やかな分泌代謝になる常温による発酵環境に切換え、季節に応じた常温状態の発酵環境で１８０日から２４０日の発酵によって生成する工程であり、同区分内の発酵期間は、当然長期になり、最短で１８０日（６月）、最長で２４０日（８月）程度である。

第５発酵ラインｆ５は、技術的にはｐＨ３．６±の第５発酵液ｎ５の熟成に近い工程のように見えるが、実際は、発酵菌ｂ１の酸性物質の分泌代謝を促しながら代謝活動を収斂させ、最終的に、発酵菌ｂ１の分泌代謝を停止し、有胞子性の発酵菌ｂ１を休眠状態にしたｐＨ３．３±の第６発酵液ｎ６を生成する工程である。

各発酵期間における酸性度ｐＨ値の変化は、２基の第１発酵タンク１００の本格的な発酵開始の酸性度は原液θである予備的第２発酵液ｐｎ２のｐＨ６．４±であり、第１ステージの終了時の酸性度はｐＨ５．０±まで進み、第１ステージの終了時からは第２発酵液ｎ２に含まれる発酵菌ｂ１の分泌活動によって発酵が進捗し、第２ステージの終了時まで間に適正な発酵温度の３７℃〜４０℃を保持したまま、酸性度は３．６±まで進み、その間に元菌液ｂに含まれる芽胞を形成しない発酵菌、さらには、好気性雑菌が万が一にも混入するかまたは発酵過程に混入した場合でも、高酸性環境であるため、そうした菌類の増殖は抑制され、死滅した菌が各発酵タンクの下層に沈殿層として堆積されることになる。

季節に応じた常温状態の発酵環境で長期発酵期間になる第３ステージは、発酵菌ｂ１に含まれる芽胞を形成する有胞子性の発酵菌の分泌活動を促しながら発酵を進め、最終的に有胞子性の発酵菌を含む発酵菌ｂ１の分泌活動をほぼ終焉に近い状態へと導き、これ以上の発酵は進まず、酸性度はｐＨ３．３±で安定状態に入ることになる。

（２）第６発酵液ｎ６の粒度分析

発明者らは、長年の地道な実践研究によって、本発明により製造される発酵液の哺乳類等の体内吸収率が極優れていることに気付き、当該発酵液の構成について専門機関に分析を依頼し、その分析結果から、当該発酵液がコロイド粒子を６．５％〜７．５％程度含有する生成物であることを確認している。当該専門機関は、岐阜県産業技術センターであり、発明者らは、同センターに対し、本発明により製造される次に２種類の発酵液について、キュムラン解析の粒度分布試験を依頼し、検査結果を得ている。

本発明により製造される２種類の発酵液は、ｐＨ３．７±の第４発酵液ｎ４とｐＨ３．３±の第６発酵液ｎ６である。キュムラン解析によるこれら粒度分布試験の準備は、以下の要領で行われ、第４発酵液ｎ４に対するキュムラン解析の結果は、第１７図である。また第６発酵液ｎ６に対するキュムラン解析の結果は、第１８図である。キュムラン解析とは、発酵液中６．５％〜７．５％程度含有されるコロイド粒子の測定である。

そこで、同センターに提出した試料は、発酵培地ｍ１〜ｍ３を用いた発酵菌ｂ１により発酵されるｐＨ３．７±の第４発酵液ｎ４を加熱殺菌処理した後に冷却し、１日沈殿させた上澄み２００ｍＬを減菌処理し、１００ｍＬ瓶２本に分別した第１試料（Ｃａｌｂｉｏ−５）と、発酵培地を用いない発酵菌ｂ１のみにより発酵されたｐＨ３．６±の第５発酵液ｎ５を常温状態の発酵環境の中で１８０日（６月）〜２４０日（８月）の長期間発酵によって生成されるｐＨ３．３±の第６発酵液ｎ６を加熱殺菌処理した後に冷却し、１日沈殿させた上澄み２００ｍＬを減菌処理し、１００ｍＬ瓶２本に分別した第２試料（Ｃａｌｂｉｏ−７）である。

第１試料（Ｃａｌｂｉｏ−５）は、最後の発酵培地ｍ３（ｐＨ４．４±）と第３発酵液ｎ３（ｐＨ４．５±）をスターターとして、３７℃〜４０℃の発酵状態に保持しながら３０日〜６０日の発酵によって、上澄みに発酵ガス層の第３上面層ｓｆ３が形成され、下層に沈殿物を含む第３沈殿層ｄｅｐ３が形成され、第３上面層ｓｆ３と第３沈殿層ｄｅｐ３との間に形成された半透明な第３中間層液が第１試料となるｐＨ３．７±の第４発酵液ｎ４である。発酵培地を用いる最後の発酵工程で生成される発酵液に相当する。

第２試料（Ｃａｌｂｉｏ−７）は、培地または発酵培地を一切用いることなく、ｐＨ３．６±の第５発酵液ｎ５をスターターとし、適正な発酵温度の３７℃〜４０℃の発酵状態で保持された第５発酵液ｎ５を、４〜５℃以下に一旦急冷却し、発酵菌ｂ１の最も分泌代謝し難い環境から緩やかな分泌代謝になる常温による発酵環境に切換え、発酵菌ｂ１に含まれる芽胞を形成する有胞子性の発酵菌の分泌活動を促しながら発酵を進め、最終的に有胞子性の発酵菌を含む発酵菌ｂ１の分泌活動をほぼ終焉に近い状態へと導き、これ以上の発酵は進まない酸性度はｐＨ３．３±の最終生成物の第６発酵液ｎ６である。これが第２試料となる。

第４発酵液ｎ４の粒度分布は、図１７に示される。図１７は、第１試料の加熱処理／減菌処理後の第４発酵液ｎ４に６．５％〜７．５％程度含まれるコロイド粒子の大きさを計測するキュムラン解析結果を表すグラフおよび表である。解析結果によると、第４発酵液ｎ４は、ミクロン単位のコロイド粒子であることが判明した。具体的には、縦軸の頻度（％）ｙと横軸の対数で表す粒径（μｍ）ｘのグラフでミクロン単位の粒径であることが示される。また詳細数値で示された表からは、具体的な数値を把握することができる。通しナンバーＣＨ５５から頻度が０％を超えＣＨ１０１から頻度が０％になる。
結論は、第1試料に含まれるコロイド粒子の粒径ｘは、
ｘ＝０．３７５μｍ（ｙ＝０．２４％）〜１８．５μｍ（ｙ＝０．１７％）
である。

第６発酵液ｎ６の粒度分布は、図１８に示される。図１８は、第２試料の加熱処理／減菌処理後に第６発酵液ｎ６に６．５％〜７．５％程度含まれるコロイド粒子の大きさを計測するキュムラン解析結果を表すグラフおよび表である。解析結果によると、第６発酵液ｎ６は、ナノ単位のコロイド粒子であることが判明した。具体的には、縦軸の体積分布（％）ｙと横軸の対数で表す粒径（ｎｍ）ｘの上段左図のグラフでナノ単位の粒径で、グラフから平均粒径が２１．４ｎｍであることが示される。また詳細数値で示された表からは、具体的な数値を把握することができる。体積分布頻度が０％以上から０％に至る範囲の数値による。
結論は、第２試料に含まれるコロイド粒子の粒径ｘは、
ｘ＝１．１ｎｍ（ｙ＝５．７％）〜６．６ｎｍ（ｙ＝０．１％）
である。

図１７と図１８の分析データの差異は、ミクロン単位と１０００分の１μｍのナノ単位の違いによるものである。図１８の第２試料は、第１試料のミクロン単位の粒度分布の分析ではなく、体積分布頻度によるナノ単位の粒度分布の分析による。

発明者らは、一時期、第３発酵ラインｆ３によって発明者らが目指す発酵液の製造方法は完成したと認識し、酸性物質を分泌する発酵菌ｂ１の代謝活動を終焉させる処理を試みている。発明者らはまた、発酵菌ｂ１に含まれる有胞子性の発酵菌は過酷な条件下でも芽胞を形成して休眠状態で生き伸びるという処理し難い菌群であることに気付き、その後、発明者らの様々な試行錯誤の実践過程を経て、活発な有胞子性の発酵菌を含む発酵菌ｂ１の代謝活動を利用し、粒度がミクロン単位の第４発酵液ｎ４をスターターとして３０日〜６０日の発酵によってｐＨ３．６±の第５発酵液ｎ５を生成した。

生成された第５発酵液ｎ５を最後のスターターとして常温状態の発酵環境で１８０日（６月）〜２４０日（８月）の長期間発酵によって発酵菌ｂ１の分泌活動を徐々に収斂させ、結果的に、有胞子性の発酵菌を含む発酵菌ｂ１による自然発酵によって酸性度を徐々に高め最終的な酸性度のｐＨ３．３±で安定させることに成功した。しかも望外な成果は、ナノ単位のコロイド粒子を含有する第６発酵液ｎ６を実現したことである。言うまでもなく明らかな事実は、ミクロン単位のコロイド粒子を含有する発酵液とナノ単位のコロイド粒子を含有する発酵液とでは、発酵食品として使用した場合の生体内の吸収率に格段の差が生じることは言うまでない。

第４発酵液ｎ４と第６発酵液ｎ６との性能分析の第２は、それぞれに含まれる糖質量を計測することである。発明者らは、ハチミツ原料ｐｍ３による第３発酵培地ｍ３を生成し、それに２０倍相当の第３発酵液ｎ３を混合し、攪拌し、糖質濃度を３〜５％にした発酵菌ｂ１の分泌活動が最も活性化し易い発酵環境を形成し、３７℃〜４０℃の発酵状態を保持しながら３０日〜６０日の発酵によって、発酵菌ｂ１の酸性物質の分泌代謝をさらに促し、ｐＨ３．７±の第４発酵液ｎ４を生成することに成功した。

（３）第４発酵液ｎ４から第６発酵液ｎ６までの糖質濃度分析

図１９は、１００ｍＬ当りの第４発酵液ｎ４の糖質量ｃ１と第５発酵液ｎ５の糖質量ｃ２と第６発酵液ｎ６の糖質量ｃ３の測定結果である。
具体的には、以下の通りである。
ｃ１＝３．３９ｇ／１００ｍＬ
ｃ２＝２．８８ｇ／１００ｍＬ
ｃ３＝１．１９ｇ／１００ｍＬ

長年にわたる地道な試行錯誤の実践から発明者らは、第３発酵ラインｆ３を構想し、試行錯誤を繰り返し、発酵菌ｂ１にハチミツ原料を発酵させた糖質の発酵培地の一定量を供給し、発酵菌ｂ１の増殖と分泌代謝能力とを共に高め、さらなる酸性物質の分泌代謝による発酵を継続させることを実現させた。

発明者らは、水分活性度から割り出される発酵菌ｂ１の分泌代謝能力を維持するための一定質量の糖は、第３発酵液ｎ３の３〜５％に相当するハチミツ原料ｐｍ３であり、これを４倍の第３発酵液ｎ３の量で攪拌し、予備的発酵培地ｐｆｍ３を生成し、生成された予備的発酵培地ｐｆｍ３を２日〜３日間の発酵によって第３発酵培地ｍ３を生成した。発明者らはさらに、生成された第３発酵培地ｍ３を２０倍相当の第３発酵液ｎ３で混合し、攪拌し、３７℃〜４０℃の発酵状態を保持しながら３０日〜６０日の発酵によって、発酵菌ｂ１の酸性物質の分泌代謝による発酵を促し、ｐＨ３．７±の第４発酵液ｎ４を生成することに成功した。これが第３発酵ラインｆ３である。

発酵させた糖質の発酵培地の一定量を第３発酵液ｎ３に供給し、発酵菌ｂ１の増殖と分泌代謝能力高める技術的特徴は、図１３および図１４に示される。図１３は、第４発酵液ｎ４の発酵液モデルの検体Ａおよび検体Ｂの比較試験の結果を示す写真Ａおよび写真Ｂである。検体Ａは、第３発酵液ｎ３の５％相当のハチミツ原料ｐｍ３を用い事前発酵させた第３発酵培地ｍ３と、１Ｌになるように２０倍相当の第３発酵液ｎ３とを発酵し生成した（第４発酵液ｎ４相当の）発酵液Ａである。検体Ｂは、ハチミツ原料ｐｍ３のままで１Ｌになるように２０倍相当の第３発酵液ｎ３に投入し、発酵し、生成した発酵液Ｂである。

検体Ａは、試験容器に第３上面層ｓｆ３と第３沈殿層ｄｅｐ３との間に、半透明な第３中間層液の３層が形成され、半透明な第３中間層液が第４発酵液ｎ４に相当する。検体Ｂは、写真Ｂからすると、試験容器に上面層ｓｆ３が形成されているが検体Ａに比べると極薄い層であり、これは、発酵菌ｂ１の酸性物質の分泌代謝による発酵が検体Ａほど活発でないことの表れであり、そのことは図１４から確認することができる。

図１４は、発酵液Ａの発酵菌ｂ１がより活発に酸性物質を分泌していることの証しである。発明者らは、第４発酵液ｎ４を生成するときにハチミツ原料ｐｍ３のままの第３培地ではなく、ハチミツ原料ｐｍ３を事前発酵させた第３発酵培地ｍ３を用いることによって発酵菌ｂ１の発酵環境を変え、発酵菌ｂ１を増殖し再び酸性物質の分泌代謝を高めるように働かせる工夫を施した。

そこで生成されたｐＨ３．７±の第４発酵液ｎ４と、ｐＨ３．７±の第４発酵液ｎ４をスターターとして発酵培地を使用しない発酵菌ｂ１のみの３０〜６０日の発酵によって生成されるｐＨ３．６±の第５発酵液ｎ５と、ｐＨ３．６±の第５発酵液ｎ５をスターターとして、常温状態の発酵環境の中で、発酵培地を使用しない発酵菌ｂ１のみの１８０日（６月）〜２４０日（８月）の長期間発酵によって生成されるｐＨ３．３±の第６発酵液ｎ６と、を共に、加熱殺菌処理した後に冷却し、それぞれを１日沈殿させた上澄み２００ｍＬを減菌処理した後に、１００ｍＬ瓶２本に分別し、日本食品分析センターおいて、ソモギー変法による糖質濃度の分析を依頼した。

分析結果は上記した通りである。ｐＨ３．７±の第４発酵液ｎ４は、５％のハチミツ原料ｐｍ３を使用したことから第３発酵液ｎ３に１００ｍＬ当り５ｇの糖質量が投入されたものである。発酵された第４発酵液ｎ４は、最終的に、３．９３ｇの糖質量にまで減少した。それは、発酵菌ｂ１の働きにより消耗した結果であり、第５発酵液ｎ５で２．８８ｇ、第６発酵液ｎ６で１．１９ｇも同様に、発酵菌ｂ１の働きによる消耗した結果である。

こうした結果から第４発酵液ｎ４の糖質濃度は４％に近く、第３発酵ラインｆ３では、発明者らが経験済みの酸性物質を分泌する発酵菌ｂ１の代謝活動は収まらず発酵菌ｂ１を加熱殺菌するなどの様々な処理を困難にする状態にあることが理解される。

また第５発酵液ｎ５の糖質濃度を表す２．８８ｇ／１００ｍＬ、第６発酵液ｎ６の糖質濃度を表す１．１９ｇ／１００ｍＬは、時間をかけることによって加熱殺菌などの強引な処理をせずに発酵菌ｂ１の活発な分泌代謝を促しながら容易に分泌活動を収斂へと導くことができるように、糖質濃度を低下させることができることを示すものである。

第４発酵ラインｆ４の３０日〜６０日の発酵によって第５発酵液ｎ５を生成する工程および第５発酵ラインｆ５の１８０日（６月）〜２４０日（８月）の長期間発酵によって第６発酵液ｎ６を生成する工程は共に、発酵菌ｂ１に含まれる有胞子性の発酵菌の分泌活動を促しながら芽胞を形成させ、最終的に発酵菌ｂ１に休眠状態に近い環境を提供するための工程である。

（４）第２発酵液ｎ２から第６発酵液ｎ６までの短鎖脂肪酸分析

本発明の構成要件である低温状態で管理される有胞子性クロストリジウム属菌を含むＮＰＭＤに寄託登録された受託番号ＮＩＴＥｐ―０２９４５〜ＮＩＴＥｐ―０２９５１の発酵菌で構成された元菌液ｂの７種の発酵菌ｂ１の分泌活動により産生される酸性物質は、図２０に示される酸性物質から想定されるように、生体内の腸内エコロジーを形成する、いわゆる酪酸を含む短鎖脂肪酸である。これを明らかにするのが第２発酵液ｎ２から第６発酵液ｎ６までに含有する短鎖脂肪酸の比較分析である。

第２発酵液ｎ２は、第１発酵ラインｆ１の最終生成物である。第１発酵ラインｆ１は、図４の概念図に示されるように、第２工程ｐ_１２で生成された第１発酵液ｎ１を２基の第１発酵タンク１００から１基の第２発酵タンク２００に移し、発酵培地を使用しない発酵環境を形成し、３７℃〜４０℃の発酵状態を保持しながら、ｐＨ５．３±の第１発酵液ｎ１に含まれる元菌液ｂの発酵菌ｂ１による３日〜５日の発酵によって生成されたｐＨ５．０±の第２発酵液ｎ２である。第３発酵液ｎ３から第６発酵液ｎ６までは、第２発酵ラインｆ２から第５発酵ラインｆ５までの最終生成物である。

各発酵ラインの最終生成物の各発酵液は、低温状態で管理される有胞子性クロストリジウム属菌を含むＮＰＭＤに寄託登録された受託番号ＮＩＴＥｐ―０２９４５〜ＮＩＴＥｐ―０２９５１の発酵菌で構成された元菌液ｂの７種の発酵菌ｂ１の分泌活動により産生される酸性物質によって、どのように変化していくかを観察する。

そこで、第１発酵ラインで５５日〜１０８日かけ生成された（１）ｐＨ５．０±の第２発酵液ｎ２と、第２発酵液ｎ２をスターターとして８日〜９日の発酵によって生成された（２）ｐＨ４．５±の第３発酵液ｎ３と、第３発酵液ｎ３をスターターとして３０日〜６０日の発酵によって生成された（３）ｐＨ３．７±の第４発酵液ｎ４と、第４発酵液ｎ４をスターターとして３０〜６０日の発酵によって生成される（４）ｐＨ３．６±の第５発酵液ｎ５は、いずれも３７℃〜４０℃の発酵状態を保持しながらの発酵による最終生成物である。第５発酵液ｎ５をスターターとして１８０日〜２４０日の発酵によって生成される（５）ｐＨ３．３±の第６発酵液ｎ６は、（１）〜（４）と異なる常温状態の発酵環境の中での発酵による最終生成物である。

上記（１）〜（５）の発酵液を共に加熱殺菌処理した後に冷却し、それぞれを１日沈殿させた上澄み２００ｍＬを減菌処理した後に、１００ｍＬ瓶２本に分別し、日本食品分析センターおいて高速液体クロマトグラフィーによる短鎖脂肪酸分析を要請し、第２発酵液ｎ２から第６発酵液ｎ６までに含有される乳酸、プロピオン酸、酪酸の短鎖脂肪酸の含有量の測定結果を得た。

測定結果は図２０に示される。具体的には、以下の通りである。
短鎖脂肪酸の種類 乳酸 プロピオン酸 酪酸
（単位／１００ｍＬ）
第２発酵液ｎ２ 検出無０ｇ ０．０１ｇ ０．１８ｇ
第３発酵液ｎ３ ０．０８ｇ ０．０１ｇ ０．３０ｇ
第４発酵液ｎ４ ０．２０ｇ ０．０２ｇ ０．５４ｇ
第５発酵液ｎ５ ０．１３ｇ ０．０２ｇ ０．５９ｇ
第６発酵液ｎ６ ０．２１ｇ ０．０２ｇ ０．５８ｇ

第２発酵液ｎ２の１００ｍＬに含有される乳酸は検出されなかった。プロビオンで０．０１ｇ／１００ｍＬ、酪酸で０．１８ｇ／１００ｍＬである。本発明により製造される発酵液は、天然素材を用いて発酵されたものである。天然素材による発酵液で、短鎖脂肪酸の特に酪酸の含有量が、第３発酵液ｎ３で、０．３０ｇ／１００ｍＬ、第４発酵液ｎ４で０．５４ｇ／１００ｍＬ、また培地または発酵培地を用いることなく、第４発酵液ｎ４または第５発酵液ｎ５に含まれる発酵菌ｂ１のみによる第５発酵液ｎ５または第６発酵液ｎ６では、０．６０ｇ／１００ｍＬに達しようという酪酸含有量の評価は、今後の基礎研究を待たざるを得ないが、１０００ｍＬ当り６ｇの酪酸含有量は、少なくとも抗炎症作用、骨強度改善、抗肥満、抗ガン作用等に係る制御性Ｔ細胞の発生に多大な影響を与えるであろうことが十分に予測される数値である。

最終的に第６発酵液ｎ６は、０．２μｍのメッシュのフィルタ濾過を行い蓄積した短鎖脂肪酸を含む発酵代謝物を抽出し食品原材料や食品として使用することなど、自然発酵の物質として様々な用途の可能がある。その可能性の一端を以下に示す。

本発明で製造される発酵液の作用効果

本発明によって製造される発酵液は、５０ｎｍを超えないコロイド粒子および短鎖脂肪酸の酪酸が１０００ｍＬ当り５ｇ以上含有する、酸性度ｐＨ３以上４以下の天然素材の発酵液である。当該発酵液の適量の日常的摂取によって生体に対するカルシウム代謝は活性化され、骨強度および骨代謝の有意性がある。以下に示される、株式会社天然素材探索研究所による「反転腸管試験によるカルシウム吸収検討試験」、および、当該試験を前提とした機能性食品試験のための岐阜大学医学部生理学が骨粗鬆症モデルマウスを用いた詳細な試験などによって、確認されている。

株式会社天然素材探索研究所（代表取締役 青山美子）は、２０１５年１１月に「反転腸管試験によるカルシウム吸収検討試験」に関する報告書を提出している。試験は、供試動物は系統ＳＤのオス（♂）ラットに、予備飼育期間中、固形飼料ＣＲＦ−１（オリエンタル酵母工業）を自由摂取で行い、給水には蒸留水を給水瓶による自由摂取で行った。試験対象物は第６発酵液ｎ６（Ｃａｌｂｉｏ−７）である。

供試動物の試験群の設定は、Ｃｏｎｔｒｏｌ群の５匹（９腸管 ３０、６０、９０分反応 各３腸管）と、発酵液ｎ６（Ｃａｌｂｉｏ−７）の０．１％添加群の５匹（９腸管 ３０、６０、９０分反応 各３腸管）と、発酵液ｎ６（Ｃａｌｂｉｏ−７）の０．５％添加群の５匹（９腸管 ３０、６０、９０分反応 各３腸管）との３セットによる。

試験項目および方法は、（１）予備飼育期間を６日間に設定し、飼料ＣＲＦ−１の自由摂取で本飼育開始までの予備飼育を行い馴化した。次に（２）反転腸管法による吸収試験を行なった。それは、ア）内液および外液の調整で、試薬の調整と外液の調整と内液の調整とからなり、さらに、イ）反転腸管が作成され、ハ）反転腸管の反応時間を３０分、６０分、９０分で設定し、最後に、二）カルシウム測定を行なった。それはさらに、ホ）統計処理によって検定結果を危険率５％以下であることを確認し、有意性有りと判定されたものである。
反転腸管法によるカルシウム吸収試験の実験結果は、図２１に示される。

図２１は、ＳＤオス（♂）ラットをモデルマウスに被験物質Ｃａｌｂｉｏ−７投与の反転腸管法によるカルシウム吸収試験の結果である。それは、上図の「カルシウム吸収量」および下図の「カルシウム増加量」を示す。上図の反転腸管法によるカルシウム吸収作用についての比較検討の結果によると、下図のカルシウム増加量は，各カルシウム給源においてはＣｏｎｔｒｏｌ群に対してＣａｌｂｉｏ−７添加群が有意な高値を示した。上図のカルシウム吸収率は、乳酸カルシウム給源がＣｏｎｔｒｏｌ群に対し高値を示し、クエン酸カルシウム及び炭酸カルシウム給源については０．５％添加群において有意な高値を示した。

本試験結果を要約すると、カルシウム増加量では、全ての反応時間においてＣａｌｂｉｏ−７群の各濃度は、Ｃｏｎｔｒｏｌ群に対して有意な高値を示し反応３０分間の外液から内液への移行が最大であった。一方、カルシウム吸収率においても、全ての反応時間においてＣａｌｂｉｏ−７群の各濃度は、Ｃｏｎｔｒｏｌ群に対して有意な高値を示し反応時間６０分の吸収率が最高値であった。

岐阜大学医学部生理学が骨粗鬆症モデルマウスによる詳細な試験結果に基づく試験報告書は、２０１７年２月に、岐阜大学医学部生理学の安倍力の作成に係り岐阜大学大学院医学系研究科長湊口信也によって確認され押印されたものである。同報告書は、上記した２０１５年１１月の「反転腸管試験によるカルシウム吸収検討試験」の試験報告書を前提に行われた骨粗鬆症モデルマウスに対する被験物質のＣａｌｂｉｏ−７投与の骨強度および骨代謝マーカーへの影響に関するものである。以下に内容の一部を抜粋する。

試験課題は、骨粗鬆症モデルマウスに対する被験物質投与による骨密度および骨代謝マーカーへの影響に関する。試験概要は、両側卵巣摘出(ＯＶＸ)によるエストロゲン欠乏状態の骨粗鬆症モデルマウスを採用し試験物質の８週間連続投与による骨粗鬆症予防効果の検討を行ったものである。

実験方法は、以下の通りである。
実験動物は、１２週齢のラットＣ５７ＢＬ/６(メス♀、ｎ＝２４)である。試験群は、通常ラットＳｈａｍと両側卵巣摘出ラットＯＶＸとを擁する、以下の４グループに１２週齢のラットＣ５７ＢＬ/６(メス♀、ｎ＝２４)を、それぞれ６匹を使用した。
・Ｓｈａｍ ＋水 （ＳＷＷ）、ｎ＝６
・Ｓｈａｍ＋Ｃａｌｂｉｏ−７（０．５ｍＬ/ｄａｙ)（ＳＣＣ）、ｎ＝６
・ＯＶＸ ＋水 (ＯＷＷ)、ｎ＝６
・ＯＶＸ ＋Ｃａｌｂｉｏ−７（０．５ｍＬ/ｄａｙ)（ＯＣＣ）、ｎ＝６
被験物質投与プランは、以下の通り。
Ｃ７: 被験物質のＣａｌｂｉｏ−７（第６発酵液ｎ６）
Ｃ７は、飲水量のデータから１日当たり０．５ｍＬ摂取するように濃度調整されたものである。
試験項目は、骨組織に関し血中の骨形成マーカーＧｌａ−Ｏｓｔｅｏｃａｌｃｉｎと骨吸収マーカーＧｌｕ−Ｏｓｔｅｏｃａｌｃｉｎとの比のデータ、骨重量と骨強度，および、骨密度への影響度試験のデータの採取である。

エストロゲン欠乏状態の骨粗鬆症モデルマウスを用いた試験結果のＧｌａ／Ｇｌｕ−Ｏｓｔｅｏｃａｌｃｉｎの比、骨重量と骨強度、および、骨密度への影響度試験の結果は、図２２に示される。

図２２は、両側卵巣摘出(ＯＶＸ)によるエストロゲン欠乏状態の骨粗鬆症モデルマウスを用いた被験物質投与による「Ｇｌａ／Ｇｌｕ−Ｏｓｔｅｏｃａｌｃｉｎ比」の試験群の比を表し、さらに、「骨重量と骨強度」への影響度、「骨密度」への影響度を表す棒グラフと写真である。因みに「Ｇｌａ／Ｇｌｕ−Ｏｓｔｅｏｃａｌｃｉｎ比」は、血中のＧｌａ−Ｏｓｔｅｏｃａｌｃｉｎは骨形成マーカー、Ｇｌｕ−Ｏｓｔｅｏｃａｌｃｉｎは骨吸収マーカーなので、比が高い場合は骨形成促進か又は骨吸収抑制を示し、比が低い場合は骨形成抑制か又は骨吸収促進を示す。

図２２の「骨重量と骨強度」への影響度を見た左図は、（体重補正した）大腿骨の乾燥骨重量である。右図は同じく、（体重補正した）３点曲げ試験による大腿骨の骨強度である。両側卵巣摘出(ＯＶＸ)により乾燥骨重量は低下した。Ｃａｌｂｉｏ−７摂取では，この値の回復をみることはできなかったが，骨強度試験では，Ｃａｌｂｉｏ−７摂取によって，両側卵巣摘出(ＯＶＸ)による骨強度の低下を有意に防ぐことができた。

図２２の「骨密度」への影響度を見た左図は、骨密度に係り大腿骨内海綿骨の骨量の典型例である。右図は、海綿骨の骨量密度（海綿骨骨梁重量／海綿骨腔体積）である。両側卵巣摘出(ＯＶＸ)により海綿骨骨梁密度の有意な減少がみられた。この値は、Ｃａｌｂｉｏ−７摂取では回復は見られなかった。一方ではＳＣＣ群において有意ではないものの高い数値が示された。

以上は本報告書の抜粋の一部である。実験者からは、まとめとして次のような評価結果（１）〜（３）が示された。

（１）今回の実験では，Ｃａｌｂｉｏ−７の摂取によって，ＯＣＣ群の骨強度が改善された。しかし乾燥骨重量や海綿骨骨梁の定量的評価ではＯＣＣ群とＯＷＷ群で違いがなかったことから，骨組織（骨梁密度）以外の要因が骨強度の回復に影響を与えていると考えられる。また骨形成と骨吸収の状態に関しては，８週目において，ＯＣＣ群の値はＯＷＷ群の値に比べて高い傾向であった。何らかの要因でカルシウム代謝が活性化したと考えられる。

（２）両側卵巣摘出(ＯＶＸ)による女性ホルモンバランスの変動は非常に強力であることから、通常の餌に含まれるカルシウム量ではその消費量を補うに十分ではないと思われる。反転腸管法を用いカルシウム吸収作用について試験した結果，各カルシウム給源において，カルシウム増加量および吸収率で、
Ｃｏｎｔｒｏｌ群に比べ有意に高値を示した。

（３）（１）および（２）から、Ｃａｌｂｉｏ−７摂取によって，両側卵巣摘出(ＯＶＸ)による骨強度の低下を有意に防ぐことが出来たことなどから，特に（２０１５年１１月の「反転腸管試験によるカルシウム吸収検討試験」を参考に）吸収率，増加率が顕著であった乳酸カルシウムを添加した餌を用いて追加検討を行い，両側卵巣摘出(ＯＶＸ)による骨吸収の増加をはじめとする各数値の変動改善の検討を行うことが望ましい。

本発明によって製造される、５０ｎｍを超えないコロイド粒子および短鎖脂肪酸の酪酸が１０００ｍＬ当り５ｇ以上含有する、酸性度ｐＨ３以上４以下の天然素材の発酵液が生体に与える機能について、（１）腸内細菌叢におけるＣａｌｂｉｏ−７摂取による効果に関する試験、および、（２）抗ガン作用に関する試験が、２０１４年５月に岐阜県海津市の株式会社アイテックラボ（試験責任者 松浦正樹、報告書作成者 中村伸）で行われ、試験報告されている。なお，この時の被験物質は、上記試験と同様、Ｃａｌｂｉｏ−７である。

試験（１）は、Ｃ５７ＢＬ/６マウス（オス♂７週齢）をＣｏｎｔｒｏｌ群とＣａｌｂｉｏ−７投与群に分け（ｎ＝１０）、Ｃｏｎｔｒｏｌ群には注射用水、Ｃａｌｂｉｏ−７投与群にはＣａｌｂｉｏ−７をそれぞれ０．５ｍＬ/ｂｏｄｙで２８日間連続経口投与した。

本試験（１）においては、投与期間終了後に結腸内容物を採取し、解析または凍結保存した。さらに細菌核酸抽出専用キットを用いて結腸内容物より細菌ＤＮＡを抽出した。得られたＤＮＡの濃度を測定し、その純度を確認した。ＤＮＡ抽出時は、同一グループ内の３個体ないし４個体のサンプルを等量ずつプールして抽出した。さらに乳酸菌、ビフィズス菌、クロストリジウム菌の特異的プライマー、および、ユニバーサルプライマーを用い、細菌ＤＮＡの定量化を行い相対的な細菌ＤＮＡのコピー数を算出すると共に、Ｃｏｎｔｒｏｌ群に対する比率を算出した。

試験（１）の方法による腸内細菌叢におけるＣａｌｂｉｏ−７摂取による効果に関する試験結果は、図２３に示される。図２３は、本発明によって製造された発酵液（Ｃａｌｂｉｏ−７）をマウスに投与し、腸内細菌叢における効果に関する試験結果である。

図２３の上図は、腸内細菌叢の乳酸菌およびビフィズス菌を少なくとも含む腸内良性菌の「善玉菌」が倍増したことを表す。また図２３の下図は、腸内細菌叢のクロストリジウム・ウェルシュ菌を少なくとも含む腸内悪性菌の「悪玉菌」が半減したことを表す。

試験（２）は、腫瘍組織における遺伝子発現解析によるリアルタイムＰＣＲ法による遺伝子発現解析の結果、具体的には、ＤＮＡマイクロアレイ（ＩＴＬ−１３―ＭＯ―０４９）で発現変動が見られた遺伝子のうちＫｒｔ６ｂ（Ｋｅｔａｔｉｎ６ｂ）について特異的プライマーを設計し、その遺伝子発現をリアルタイムＰＣＲ法で定量解析した結果である。

本試験（２）においては、Ｃａｌｂｉｏ−７投与マウスの腫瘍組織、使用した腫瘍組織は上皮細胞系のガンのＬｅｗｉｓ Ｌｕｎｇ ｃａｒｃｉｎｏｍａ細胞であり、これに腫瘍増因子としてとらえられるＫｒｔ６ｂの遺伝子発現について、注射用水投与群と比較分析を行った。結果は、ケラチンのようなケラチノサイト（角化細胞）遺伝子群の発現が見られた。要するに、図２４に示されたように、Ｋｒｔ６ｂは肺ガンの中でも扁平上皮性ガン鑑別のためのマーカーになっており、このＫｒｔ６ｂ遺伝子の発現の抑制が見られたのである。

試験結果の総括

本発明によって製造される、５０ｎｍを超えないコロイド粒子が６．５％〜７．５％程度含有し短鎖脂肪酸の酪酸が１０００ｍＬ当り５ｇ以上含有する、酸性度ｐＨ３以上４以下の天然素材の発酵液が生体に与える機能について、それ自体が機能性食品またはその原液になる。総括の第１は、図２１に示された反転腸管法によるカルシウム吸収試験結果の「増加量と吸収量」のデータ、および、図２２に示されたエストロゲン欠乏状態の骨粗鬆症モデルマウスを用いた試験結果の「Ｇｌａ／Ｇｌｕ−Ｏｓｔｅｏｃａｌｃｉｎ比」、「骨重量と骨強度の影響度」、および、「骨密度の影響度」のデータから明らかなように、生体に対してカルシウム代謝を活性化し、骨強度および骨代謝に有意に作用することである。

総括の第２は、図２３に示された「乳酸菌」と「ビフィズス菌」の増加および「クロストリジウム・ウェルシュ菌」の減少を表すデータから明らかなように、腸内細菌叢において腸内良性菌の「善玉菌」といわれる乳酸菌及びビフィズス菌を少なくとも倍増させ、腸内悪性菌の「悪玉菌」といわれるクロストリジウム・ウェルシュ菌を少なくとも半減させるように作用することである。さらに図２４に示されたように、Ｃａｌｂｉｏ−７投与マウスの腫瘍組織（Ｌｅｗｉｓ Ｌｕｎｇ ｃａｒｃｉｎｏｍａ―ｓｙｎｇｒａｆｔ ｍｏｄｅｌ）におけるＫｒｔ６ｂ遺伝子発現抑制が確認された。

補助的資料

ＮＰＭＤに寄託登録された７種の発酵菌
（受託日：２０１９年５月１６日）

ハイアマウント株式会社の製造に係る発酵生成物に使用される発酵菌の単離培養と菌名確定ための１６ｓｒＤＮＡ（１６ｓｒＲＮＡ遺伝子）の部分塩基配列解析（約１５００ｂｐ）方法による結果、以下の細菌は、人、動物には害無で乾燥または凍結乾燥の復元が可能であることが確認されたものである。

NITE ｐ-02945
微生物の種類：細菌 細胞形状：桿菌 特徴：芽胞形成陰性（非芽胞性）
分類学上の位置 Aneurinibacillus sp.（アヌリニバチルス属）
培養条件：標準寒天培地 培養温度：３０℃ 培養期間：４８時間
培養方法：好気性

NITE ｐ-02946
微生物の種類：細菌 細胞形状：桿菌 特徴：芽胞形成陰性（非芽胞性）
分類学上の位置 Brevibacillus sp.（ブレビバチルス属）
培養条件：標準寒天培地 培養温度：３０℃ 培養期間：４８時間
培養方法：好気性

NITE ｐ-02947
微生物の種類：細菌 細胞形状：桿菌 特徴：芽胞形成陰性（非芽胞性）
分類学上の位置 Pseudoclavibacter sp.（シュードクラビバクタ―属）
培養条件：標準寒天培地 培養温度：３０℃ 培養期間：７２時間
培養方法：好気性

NITE ｐ-02948
微生物の種類：細菌 細胞形状：桿菌 特徴：芽胞形成陽性（芽胞性）
分類学上の位置 Paenibacillus sp.（パニエバシラス属）
培養条件：標準寒天培地 培養温度：３０℃ 培養期間：７２時間
培養方法：好気性

NITE ｐ-02949
微生物の種類：細菌 細胞形状：桿菌 特徴：芽胞形成陽性（芽胞性）
分類学上の位置 Clostridium sp.（クロストリジウム属）
培養条件：GAM Broth"Nissui"寒天 培養温度：３０℃ 培養期間：４８時間 培養方法：嫌気性

NITE ｐ-02950
微生物の種類：細菌 細胞形状：桿菌 特徴：芽胞形成陽性（芽胞性）
分類学上の位置 Clostridium sp.（クロストリジウム属）
培養条件 GAM Broth"Nissui"寒天 培養温度：３０℃ 培養期間：４８時間 培養方法：嫌気性

NITE ｐ-02951
微生物の種類：細菌 細胞形状：桿菌 特徴：芽胞形成陽性（芽胞性）
分類学上の位置 Clostridium sp.（クロストリジウム属）
培養条件 GAM Broth"Nissui"寒天 培養温度：３０℃ 培養期間：４８時間 培養方法：嫌気性

１ ５０ｎｍを超えないコロイド粒子および短鎖脂肪酸を含有する、酸性度が
３以上４以下の発酵液
ｎ１〜ｎ６ 第１発酵液〜第６発酵液
ｐｎ１〜ｐｎ３ 予備的第１発酵液〜予備的第３発酵液
ｗ 軟水

ｍ 発酵培地
ｍ１〜ｍ３ 第１発酵培地〜第３発酵培地
ｄｓ 乾燥大豆
ｆｓ 発酵大豆
ｇｆｓ 大豆ペースト
ｐｍ２ 混合培地
ｐｆｍ２ 予備的発酵混合培地
ｐｍ３ はちみつ原料
ｐｆｍ３ 予備的発酵培地

ｂ 元菌液
ｂ１ 元菌液に含まれる発酵菌（ＮＰＭＤに寄託登録された受託番号ＮＩＴＥｐ―０２９４５〜ＮＩＴＥｐ―０２９５１）発酵菌

ｓｐ スポンジ層
ｓｆ１〜ｓｆ４ 第１上面層〜第４上面層
ｄｅｐ１〜ｄｅｐ４ 第１沈殿層〜第４沈殿層

ｆ 発酵段階
ｆ１〜ｆ５ 第１発酵ライン〜第５発酵ライン
ｐ_１１〜ｐ_１３ ｆ１の第１工程〜第３工程
ｐ_２１／ｐ_２２ ｆ２の第１工程／第２工程
ｐ_３１／ｐ_３２ ｆ３の第１工程／第２工程
ｐ_４１ ｆ４の工程
ｐ_５１ ｆ５の工程

１０ 発酵瓶（陶器製）
２０ ｆ１の第１培地タンク
３０ ｆ１の加熱釜
４０ ｆ２の第２培地タンク
５０ ｆ３の第３培地タンク
１００ ｆ１の１０００リットル相当容量の第１発酵タンク（２基）
１０１ 第１発酵タンクのパスカル原理と静水圧平行を利用した開閉弁
１１０ 第１発酵タンクの開閉弁を有する抜取装置
２００ ｆ１の２０００リットル相当容量の第２発酵タンク
２０１ 第２発酵タンクのパスカル原理と静水圧平行を利用した開閉弁
２１０ 第２発酵タンクの開閉弁を有する抜取装置
３００ ｆ２の２０００リットル相当容量の第３発酵タンク
３０１ 第３発酵タンクのパスカル原理と静水圧平行を利用した開閉弁
３１０ 第３発酵タンクの開閉弁を有する抜取装置
３２０ ｆ２の袋状培地フィルタ
３３０ ｆ２の循環用ポンプ装置
４００ ｆ３の２０００リットル相当容量の第４発酵タンク
４０１ 第４発酵タンクのパスカル原理と静水圧平行を利用した開閉弁
４１０ 第４発酵タンクの開閉弁を有する抜取装置
５００ ｆ４の２０００リットル相当容量の第５発酵タンク
５０１ 第５発酵タンクのパスカル原理と静水圧平行を利用した開閉弁
５１０ 第５発酵タンクの開閉弁を有する抜取装置
６００ ｆ５の２０００リットル相当容量の第６発酵タンク
６１０ ｆ５の冷却装置
６２０ ｆ５の予備タンク

Claims (5)

1. 独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）に寄託登録された３種の好気性の非芽胞性細菌のアヌリニバチルス属（受託番号ＮＩＴＥｐ−０２９４５）、ブレバチルス属（受託番号ＮＩＴＥｐ−０２９４６）およびシュードクラビバクター属（受託番号ＮＩＴＥｐ−０２９４７）と、１種の好気性の芽胞性細菌のパニエバシラス属（受託番号ＮＩＴＥｐ−０２９４８）と、３種の嫌気性の芽胞性菌のクロストリジウム属（受託番号ＮＩＴＥｐ−０２９４９、受託番号ＮＩＴＥｐ−０２９５０、受託番号ＮＩＴＥｐ−０２９５１）と、を少なくとも含む菌群が共棲し且つ酸化発酵を促し、５０ｎｍを越えない粒径のコロイド粒子および、酪酸、プロピオン酸、乳酸の短鎖脂肪酸を含有する酸性度がｐＨ３以上４以下の発酵液を製造するのに用いる、ｐＨ５．０〜５．６の元菌液を安定的に産生する方法であって、
   ｐＨ７．０〜７．６の軟水と、
   乾燥大豆から生成されたｐＨ４．２〜４．８の第１発酵培地と、
   ｐＨ５．０〜５．６の前記菌群を含む前記元菌液と、
   を１１００〜１３００対２８０対２７０〜４５０の体積比率で第１発酵タンクに投入し、混合し、ｐＨ６．１〜６．７の混濁液を生成する工程αと、
   前記ｐＨ６．１〜６．７の混濁液の３７℃〜４０℃の発酵温度で５０日〜１００日の発酵によって、前記第１発酵タンク内に、
   発酵ガスを含む上澄みスポンジ層と
   下層に第１沈殿層と
   前記スポンジ層および前記第１沈殿層の間に半透明のｐＨ５．０〜５．６の発酵液と
   の３層を形成する工程βと、
   前記第１発酵タンクから前記半透明のｐＨ５．０〜５．６の発酵液のみを抜き取り第２発酵タンクに移す工程γと、
   前記半透明の発酵液が抜き取られた前記第１発酵タンクの前記スポンジ層と前記第１沈殿層とを混合しペースト状に生成し、ｐＨ５．０〜５．６の元菌液にする工程δ
   からなる方法。
   
2. 乾燥大豆からｐＨ４．２〜４．８の前記第１発酵培地を生成する方法は、
   培地タンクに
   １ｋｇの乾燥大豆当たり、ｐＨ７．０〜７．６の３Ｌ相当の軟水と
   糖鎖と
   前記ｐＨ５．０〜５．６の元菌液と
   を添加し、
   ３７℃〜４０℃の発酵温度で６８〜７４時間の発酵によって
   予備的発酵液と発酵大豆を生成する第１の予備工程εと、
   前記発酵大豆を前記培地タンクから取り出しペースト状に磨り潰し大豆ペーストに仕上げ、該大豆ペーストを前記予備的発酵液と混合し、５．４Ｌ相当の前記予備的発酵液と前記大豆ペーストを生成する第２の予備工程ηと、
   前記５．４Ｌ相当の予備的発酵液と大豆ペーストを加熱釜に移し、５５〜６０℃まで加熱し、攪拌し、予め１５Ｌ相当の冷却水が投入された前記培地タンクに戻し、５．４Ｌ相当のｐＨ４．２〜４．８の前記第１発酵培地を生成する第３の予備工程λと、
   からなる請求項１に記載の方法。
   
3. 前記工程δで産生される元菌液の量は、前記工程αで生成される前記混濁液の量の３分の１相当であることを特徴とする請求項１または２のいずれかに記載の方法。
   
4. 前記ペースト状に仕上げた元菌液は、大型冷凍装置で長期保存するかまたは５０日〜１００日の発酵直後に発酵温度のまま次の発酵工程αに使用するかのいずれかにすることを特徴とする請求項１から３のいずれかに記載の方法。
5. 冷凍保存された元菌液は３７℃〜４０℃の発酵状態に戻しペースト状の元菌液として使用するようにしたことを特徴とする請求項４に記載の方法。