JP6736512B2 - Powder containing modified lysozyme and method for producing the same - Google Patents
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Description
本発明は、長期間保存後も抗ノロウィルス活性を維持しうるリゾチーム変性物含有粉末、及びその製造方法に関する。 TECHNICAL FIELD The present invention relates to a lysozyme modified product-containing powder capable of maintaining anti-Norovirus activity even after long-term storage, and a method for producing the same.
ノロウィルスはヒトに対する感染力が高く、食中毒やウィルス性急性胃腸炎（感染症）を引き起こすことが知られている。現在、ノロウィルスには有効なワクチンがなく、一旦発症すると治療は輸液等の対症療法に限られてしまい、高齢者等では重症化する場合もある。 Norovirus is highly infectious to humans and is known to cause food poisoning and viral acute gastroenteritis (infection). Currently, norovirus does not have an effective vaccine, and once it develops, treatment is limited to symptomatic treatment such as infusion, and in some cases, it may become severe in the elderly and the like.
ノロウィルスの感染経路は主に経口感染である。そのため、食中毒や感染症の発生の予防及び発生後の拡大防止のためには、環境に存在するノロウィルスを不活化することが極めて重要である。 The infection route of Norovirus is mainly oral infection. Therefore, it is extremely important to inactivate the norovirus existing in the environment in order to prevent the occurrence of food poisoning and infectious diseases and the spread thereof after the occurrence.
従来、アルコール製剤をはじめとすると多くの消毒薬は、ノロウィルスの不活化には無効とされ、不活化のためには、８５℃１分以上の加熱や次亜塩素酸ナトリウムによる処理が推奨されている。しかしながら、次亜塩素酸ナトリウムは、金属に対する腐食作用、皮膚に対する刺激作用、衣類等に対する漂白作用があるので実際上の使用は制限される。そのため、次亜塩素酸ナトリウムに代わるノロウィルス不活化剤の開発が望まれている。 Conventionally, many antiseptics such as alcoholic preparations are ineffective for inactivating norovirus, and for inactivation, heating at 85°C for 1 minute or more or treatment with sodium hypochlorite is recommended. ing. However, sodium hypochlorite has a corrosive effect on metals, an irritating effect on the skin, and a bleaching effect on clothes and the like, so that its practical use is limited. Therefore, development of a norovirus inactivating agent that replaces sodium hypochlorite is desired.
一方、近年、抗菌剤分野において、リゾチーム又はその変性物を有効成分とした種々の製剤が報告されている。リゾチームは動植物界に広く分布し、哺乳動物の涙、唾液、尿、乳、鳥類の卵中の卵白、魚類の体表粘液、微生物、バクテリオファージＴ４等から取得可能である。なかでも卵白由来のリゾチーム又はその変性物は大量製造が可能であることから、抗菌剤の開発において特に利用されている。 On the other hand, in recent years, various preparations containing lysozyme or a modified product thereof as an active ingredient have been reported in the field of antibacterial agents. Lysozyme is widely distributed in the animal and plant kingdoms and can be obtained from mammalian tears, saliva, urine, milk, egg white in avian eggs, body mucus of fish, microorganisms, bacteriophage T4 and the like. Among them, egg white-derived lysozyme or a modified product thereof can be mass-produced, and thus is particularly used in the development of antibacterial agents.
例えば、特許文献１には、リゾチーム変性物を有効成分として用いることにより、優れたノロウィルス不活化剤を調製しうることが本出願人により報告されている。特に、特許文献１には、リゾチームの変性に際しては、ｐＨを少なくとも５．５以上にすることが好ましいことが報告されている。しかしながら、ノロウィルスが広範囲に渡り流行していることを踏まえると、優れた不活性化効果を有する抗ノロウィルス製剤の開発が依然として望まれているといえる。 For example, Patent Document 1 reports by the present applicant that an excellent norovirus inactivating agent can be prepared by using a lysozyme modified product as an active ingredient. In particular, Patent Document 1 reports that at the time of denaturing lysozyme, it is preferable that the pH is at least 5.5 or higher. However, in view of the widespread spread of norovirus, it can be said that the development of an anti-norovirus preparation having an excellent inactivating effect is still desired.
このような技術状況下、本発明者らは、リゾチーム変性物を有効成分とする種々の製剤を製造し、その抗ノロウィルス活性の経時的変化を観察した。その結果、リゾチーム変性物を長期間に渡り保存すると、その抗ノロウィルス活性が著しく低下する場合があることが明らかとなった。 Under such a technical situation, the present inventors produced various preparations containing a lysozyme modified product as an active ingredient, and observed the change with time of its anti-norovirus activity. As a result, it became clear that when the lysozyme modified product was stored for a long period of time, its anti-norovirus activity might be significantly reduced.
従って、本発明の課題は、長期間保存後もリゾチーム変性物の抗ノロウィルス活性を維持しうる製剤、及びその製造方法を提供することにある。 Therefore, an object of the present invention is to provide a preparation capable of maintaining the anti-norovirus activity of a lysozyme modified product even after long-term storage, and a method for producing the same.
本発明者は、今般、リゾチーム変性物及び／又はその塩を含む溶液のｐＨを調節してリゾチーム変性物含有粉末とすることにより、長期間保存後も抗ノロウィルス活性を効果的に維持しうることを見出し、本発明を完成するに至った。 The present inventor can adjust the pH of a solution containing a lysozyme modified product and/or a salt thereof to obtain a lysozyme modified product-containing powder to effectively maintain the anti-norovirus activity even after long-term storage. This has led to the completion of the present invention.
すなわち、本発明によれば、以下の（１）〜（１１）が提供される。
（１）４０℃、７５％ＲＨの条件下で４週間保存されたときの下記に規定される抗ノロウィルス活性が２．０以上であり、
前記保存前後における抗ノロウィルス活性の低下値が３．０以下であり、
かつ
固形分換算で２質量％となるように脱イオン水に溶解させてなる溶液のｐＨが５.０未満である、リゾチーム変性物含有粉末。
抗ノロウィルス活性：ノロウィルス液と、リゾチーム変性物を固形分換算で２質量％含有する前記リゾチーム変性物含有粉末水溶液とを等量混合して得られたノロウィルス混合液を２５℃で１分間放置した時の、放置前の感染価の対数から放置後の感染価の対数を引いた値。
（２）（１）に記載のリゾチーム変性物含有粉末において、
前記溶液のｐＨが１．７以上５．０未満である、リゾチーム変性物含有粉末。
（３）（１）又は（２）に記載のリゾチーム変性物含有粉末において、
前記リゾチーム変性物の含有量が固形分換算で３０質量％以上１００質量％以下である、リゾチーム変性物含有粉末。
（４）（１）〜（３）のいずれかに記載のリゾチーム変性物含有粉末において、
前記保存開始前の抗ノロウィルス活性が２．０以上である、リゾチーム変性物含有粉末。
（５）（１）〜（４）のいずれかに記載のリゾチーム変性物含有粉末において、
下記に規定される前記保存開始前のリゾチーム変性物含有粉末の蛍光強度が４，０００以上である、リゾチーム変性物含有粉末。
蛍光強度：前記保存開始前のリゾチーム変性物含有粉末を、リゾチーム変性物の濃度が固形分換算で０．０５質量％になり且つリン酸塩の濃度が０．２Ｍとなるようにリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で希釈し、得られる希釈液５ｍＬに８ｍＭの１，８−アニリノナフタレンスルホン酸のメタノール溶液２５μＬを添加し、得られる液を３０分間２５℃で反応させた後、該反応液について励起波長３９０ｎｍ（励起バンド幅１０ｎｍ）及び蛍光波長４７０ｎｍ（蛍光バンド幅１０ｎｍ）の条件にて測定された蛍光強度
（６）（１）〜（５）のいずれかに記載のリゾチーム変性物含有粉末において、
前記リゾチーム変性物が加熱変性物である、リゾチーム変性物含有粉末。
（７）（１）〜（６）のいずれかに記載のリゾチーム変性物含有粉末において、
糖類をさらに含む、リゾチーム変性物含有粉末。
（８）（１）〜（７）のいずれかに記載のリゾチーム変性物含有粉末を含有する、医薬製剤。
（９）リゾチーム及び／又はその塩をｐＨ５．０以上で変性処理することにより得られるリゾチーム変性物及び／又はその塩を準備する工程、
該リゾチーム変性物及び／又はその塩を含む溶液のｐＨが５．０未満となるように調節する工程、及び
該ｐＨを調節された溶液を乾燥する工程
を含む、リゾチーム変性物のリゾチーム変性物含有粉末の製造方法。
（１０）（９）に記載にリゾチーム変性物含有粉末の製造方法において、
前記リゾチーム変性物及び／又はその塩を含む溶液のｐＨが１．７以上５．０未満となるように調節する、リゾチーム変性物含有粉末の製造方法。
That is, according to the present invention, the following (1) to (11) are provided.
(1) The anti-norovirus activity defined below is 2.0 or more when stored for 4 weeks at 40° C. and 75% RH,
The reduction value of the anti-norovirus activity before and after the storage is 3.0 or less,
Also, a lysozyme-modified product-containing powder, wherein the pH of the solution prepared by dissolving in deionized water so as to be 2% by mass in terms of solid content is less than 5.0.
Anti-norovirus activity: A norovirus mixed solution obtained by mixing equal amounts of a norovirus solution and an aqueous solution of a lysozyme modified product-containing powder containing 2% by mass of the lysozyme modified product in terms of solid content at 25° C. for 1 minute The value obtained by subtracting the logarithm of infectious titer after leaving from the logarithm of infectious titer before leaving.
(2) In the lysozyme modified product-containing powder according to (1),
A lysozyme-modified product-containing powder, wherein the pH of the solution is 1.7 or more and less than 5.0.
(3) In the lysozyme modified product-containing powder according to (1) or (2),
The lysozyme modified product-containing powder, wherein the content of the lysozyme modified product is 30% by mass or more and 100% by mass or less in terms of solid content.
(4) The lysozyme modified product-containing powder according to any one of (1) to (3),
A lysozyme-modified product-containing powder, which has an anti-norovirus activity of 2.0 or more before the start of storage.
(5) The lysozyme modified product-containing powder according to any one of (1) to (4),
The lysozyme modified product-containing powder as defined below, wherein the fluorescence intensity of the lysozyme modified product-containing powder before the start of storage is 4,000 or more.
Fluorescence intensity: The lysozyme-modified product-containing powder before the start of the storage was adjusted to a phosphate buffer solution so that the concentration of the lysozyme-modified product would be 0.05% by mass in terms of solid content and the concentration of phosphate would be 0.2M. After diluting with (pH 7.0), 25 mL of a methanol solution of 8 mM 1,8-anilinonaphthalenesulfonic acid was added to 5 mL of the resulting diluted solution, and the resulting solution was reacted at 25°C for 30 minutes, and then the reaction was performed. Containing the lysozyme modified product according to any one of (6), (1) to (5), which was measured for the liquid under the conditions of an excitation wavelength of 390 nm (excitation band width 10 nm) and a fluorescence wavelength of 470 nm (fluorescence band width 10 nm). In powder,
A lysozyme-modified product-containing powder, wherein the lysozyme-modified product is a heat-modified product.
(7) The lysozyme modified product-containing powder according to any one of (1) to (6),
A powder containing a lysozyme modified product, which further contains a saccharide.
(8) A pharmaceutical preparation comprising the lysozyme modified product-containing powder according to any one of (1) to (7).
(9) a step of preparing a lysozyme modified product and/or a salt thereof obtained by denaturing lysozyme and/or a salt thereof at pH 5.0 or higher,
Containing a lysozyme-modified product of a lysozyme-modified product, which comprises a step of adjusting the pH of a solution containing the lysozyme-modified product and/or a salt thereof to less than 5.0, and a step of drying the pH-adjusted solution. Powder manufacturing method.
(10) In the method for producing a lysozyme-modified product-containing powder as described in (9),
A method for producing a powder containing a lysozyme modified product, which comprises adjusting the pH of a solution containing the lysozyme modified product and/or a salt thereof to be 1.7 or more and less than 5.0.
本発明によれば、上述のようにリゾチーム変性物を酸性条件下で粉末化することにより、リゾチーム変性物の有する優れた抗ノロウィルス活性を長期間維持することができる。また、本発明は、従前より広く利用されているリゾチームを原料とすることから、ノロウィルスの不活性化を安全に実施する上で有利である。また、本発明は、リゾチーム変性物を安全かつ安定に保存しうることから、ノロウィルスの不活性化剤の製造及び使用において有利に利用することができる。 According to the present invention, by pulverizing the modified lysozyme under acidic conditions as described above, the excellent anti-norovirus activity of the modified lysozyme can be maintained for a long period of time. Further, since the present invention uses lysozyme, which has been widely used, as a raw material, it is advantageous in safely inactivating the norovirus. Moreover, since the modified lysozyme can be stored safely and stably, the present invention can be advantageously used in the production and use of a Norovirus inactivating agent.
以下、本発明を詳細に説明する。なお、本発明において、格別に断らない限り、「部」は「質量部」を意味し、「％」は「質量％」を意味する。また、本明において、格別に断らない限り、「室温」とは、２０〜２５℃を意味する。 Hereinafter, the present invention will be described in detail. In the present invention, "part" means "part by mass" and "%" means "% by mass" unless otherwise specified. In addition, in the present invention, “room temperature” means 20 to 25° C., unless otherwise specified.
＜発明の特徴＞
本発明のリゾチーム変性物含有粉末は、リゾチーム変性物及び／又はその塩を構成成分としており、固形分換算で２質量％となるように脱イオン水に溶解させてなる溶液のｐＨが５．０未満となることを特徴としている。また、本発明の好ましい態様によれば、上記リゾチーム変性物含有粉末は、リゾチーム及び／又はその塩をｐＨ５．０以上の溶液中で変性処理することにより得られるリゾチーム変性物及び／又はその塩を準備し、該リゾチーム変性物及び／又はその塩を含みかつｐＨ５．０未満に調節された溶液を乾燥させることにより得られるものである。かかるリゾチーム変性物含有粉末が、４０℃、７５％ＲＨの条件下で４週間保存しても、抗ノロウィルス活性２．０以上を維持しうることは当業者にとって意外な事実である。
<Characteristics of the invention>
The lysozyme modified product-containing powder of the present invention contains a lysozyme modified product and/or a salt thereof as a constituent component, and the pH of the solution obtained by dissolving the lysozyme modified product and/or a salt thereof in deionized water so as to be 2% by mass in terms of solid content is 5.0. It is characterized by being less than. Further, according to a preferred embodiment of the present invention, the lysozyme modified product-containing powder contains a lysozyme modified product and/or a salt thereof obtained by modifying a lysozyme and/or a salt thereof in a solution having a pH of 5.0 or more. It is obtained by preparing and drying a solution containing the lysozyme modified product and/or its salt and adjusted to pH less than 5.0. It is a surprising fact for those skilled in the art that such a lysozyme-modified product-containing powder can maintain the anti-norovirus activity of 2.0 or more even when stored for 4 weeks under the conditions of 40° C. and 75% RH.
本発明のリゾチーム変性物含有粉末の上記４０℃、７５％ＲＨの条件下で４週間保存後の抗ノロウィルス活性は、ノロウィルス液と、リゾチーム変性物を固形分換算で２質量％含有する上記リゾチーム変性物含有粉末水溶液とを等量混合して得られたノロウィルス混合液を２５℃で１分間放置した時の、放置前の感染価の対数から放置後の感染価の対数を引いた値とされる。本発明の抗ノロウィルス活性は、後述する実施例の記載に従い測定することができる。ここで、ノロウィルス液の濃度は、感染価１０５〜１０８ＰＦＵ／ｍＬであり、好ましくは感染価１０６ＰＦＵ／ｍＬである。 The anti-norovirus activity of the lysozyme modified product-containing powder of the present invention after storage for 4 weeks under the conditions of 40° C. and 75% RH is 2% by mass of the norovirus solution and the lysozyme modified product in terms of solid content. A value obtained by subtracting the logarithm of infectious titer after standing from the logarithm of infectious titer before standing when a Norovirus mixed solution obtained by mixing equal amounts of powdered aqueous solution containing lysozyme modified product was left at 25°C for 1 minute. It is said that The anti-norovirus activity of the present invention can be measured according to the description in Examples below. Here, the concentration of the Norovirus solution is an infectious titer of 10 5 to 10 8 PFU/mL, and preferably an infectious titer of 10 6 PFU/mL.
本発明のリゾチーム変性物含有粉末における上記抗ノロウィルス活性の下限は、上述の通り、２．０であり、好ましくは２．５であり、より好ましくは３．０であり、さらに好ましくは３．５であり、さらに一層好ましくは４．０である。また、本発明のリゾチーム変性物含有粉末の抗ノロウィルス活性の上限は、特に限定されないが、例えば、７．０であり、好ましくは６．０である。また、抗ノロウィルス活性の好適な範囲は、上述した上限および下限の組合せから選択することができ、２．０以上７．０以下、２．０以上６．０以下等が挙げられる。上述のような高レベルのノロウィルス活性を有するリゾチーム変性物含有粉末は、ノロウィルスの消毒ないし滅菌において有利に利用することができる。 As described above, the lower limit of the anti-norovirus activity of the powder containing the modified lysozyme of the present invention is 2.0, preferably 2.5, more preferably 3.0, and further preferably 3. 5 and even more preferably 4.0. The upper limit of the anti-norovirus activity of the lysozyme modified product-containing powder of the present invention is not particularly limited, but is, for example, 7.0, and preferably 6.0. Further, a suitable range of the anti-norovirus activity can be selected from a combination of the above-mentioned upper limit and lower limit, and examples thereof include 2.0 or more and 7.0 or less, 2.0 or more and 6.0 or less. The lysozyme-modified product-containing powder having a high level of norovirus activity as described above can be advantageously used in disinfection or sterilization of norovirus.
また、本発明のリゾチーム変性物含有粉末によれば、長期の保存期間にわたり抗ノロウィルス活性を高レベルで維持することが可能である。本発明のリゾチーム変性物含有粉末について４０℃、７５％ＲＨの条件下で４週間の保存試験を行う場合、保存前後における抗ノロウィルス活性の低下値は３．０以下に維持することができる。ここで、「保存前後における抗ノロウィルス活性の低下値」とは、「上記保存試験の開始の時点のリゾチーム変性物含有粉末の抗ウィルス活性から、保存試験の終了時のリゾチーム変性物含有粉末の抗ウィルス活性を差し引いた値」を意味する。かかる保存前後における抗ノロウィルス活性の低下値の好ましい上限は、好ましくは２．５であり、より好ましくは２．０であり、さらに好ましくは１．５とされる。また、本発明の上記保存前後における抗ノロウィルス活性の低下値の下限は、好ましくは−２．５であり、より好ましくは−２．０であり、さらに好ましくは−１．５、さらに好ましくは０とされる。 Further, according to the lysozyme-modified product-containing powder of the present invention, it is possible to maintain the anti-norovirus activity at a high level over a long storage period. When the lysozyme-modified product-containing powder of the present invention is stored for 4 weeks under the conditions of 40° C. and 75% RH, the reduction value of the anti-norovirus activity before and after storage can be maintained at 3.0 or less. Here, the "reduced value of anti-norovirus activity before and after storage" means "from the antiviral activity of the lysozyme modified product-containing powder at the start of the storage test, the lysozyme modified product-containing powder at the end of the storage test. "Value obtained by subtracting antiviral activity". The preferable upper limit of the reduction value of the anti-norovirus activity before and after such storage is preferably 2.5, more preferably 2.0, and further preferably 1.5. Further, the lower limit of the anti-norovirus activity lowering value before and after the storage of the present invention is preferably -2.5, more preferably -2.0, further preferably -1.5, further preferably It is set to 0.
本発明のリゾチーム変性物含有粉末によれば、上記のような抗ノロウィルス活性を、長期間にわたり高レベルで維持することができる。したがって、上記保存試験の開始時期は、特に限定されないが、例えば、リゾチーム変性物含有粉末の製造から好ましくは２０年間以内、さらに好ましくは１５年間以内、さらに好ましくは１０年間以内、さらに好ましくは５年間以内、さらに好ましくは１年間以内、さらに好ましくは半年以内、さらに一層好ましくは製造直後とされる。 According to the lysozyme modified product-containing powder of the present invention, the anti-norovirus activity as described above can be maintained at a high level for a long period of time. Therefore, the start time of the storage test is not particularly limited, but for example, preferably 20 years or less, more preferably 15 years or less, further preferably 10 years or less, and further preferably 5 years from the production of the lysozyme modified product-containing powder. Within 1 year, more preferably within 1 year, even more preferably within 6 months, and even more preferably immediately after production.
また、本発明のリゾチーム変性物含有粉末の上記保存開始前の蛍光強度は、抗ノロウィルス活性の指標とすることができる。本発明のリゾチーム変性物含有粉末の蛍光強度は、後述する原料となるリゾチーム変性物及び／又はその塩と同様、好ましくは４，０００以上であり、より好ましくは５，０００以上である。 In addition, the fluorescence intensity of the lysozyme-modified product-containing powder of the present invention before the start of storage can be used as an index of anti-norovirus activity. The fluorescence intensity of the lysozyme-modified product-containing powder of the present invention is preferably 4,000 or more, and more preferably 5,000 or more, as in the case of the lysozyme-modified product and/or its salt as a raw material described later.
上記のリゾチーム変性物含有粉末の蛍光強度の値は、以下に説明する手法により測定される。すなわち、リゾチーム変性物含有粉末を、リゾチーム変性物の濃度が固形分換算で０．０５質量％になり且つリン酸塩の濃度が０．２Ｍとなるようにリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で希釈して希釈液を得、該希釈液５ｍＬに８ｍＭの１，８−アニリノナフタレンスルホン酸のメタノール溶液２５μＬを添加し、得られる液を３０分間２５℃で反応させ、該反応液の蛍光強度について、励起波長３９０ｎｍ（励起バンド幅１０ｎｍ）及び蛍光波長４７０ｎｍ（蛍光バンド幅１０ｎｍ）の条件にて測定する。かかる方法により測定された蛍光強度の値が、リゾチーム変性物含有粉末の蛍光強度とされる。なお、リゾチーム変性物の濃度が固形分換算で０．０５質量％であり、リン酸塩の濃度が０．２Ｍとなるようにリン酸緩衝液で希釈するとは、具体的には、例えばリゾチーム変性物を固形分換算で１質量％含有する水溶液の蛍光強度を測定する場合、前記水溶液５ｇと０．２５Ｍのリン酸緩衝液８０ｍＬを１００ｍＬのメスフラスコに入れた後、精製水で１００ｍＬにメスアップすることで調節されることをいう。なお、本発明の蛍光強度の測定方法のさらなる詳細は、後述する実施例の記載の従い、Canadian Institute of Food Science and Technology 1985 Vol.18 No.4 p.290-295の記載の方法に準じるものとする。 The fluorescence intensity value of the lysozyme modified product-containing powder is measured by the method described below. That is, the lysozyme modified product-containing powder was treated with a phosphate buffer (pH 7.0) so that the concentration of the lysozyme modified product would be 0.05% by mass in terms of solid content and the concentration of phosphate would be 0.2M. The diluted solution is obtained by diluting, and 5 mL of the diluted solution is added with 25 μL of a methanol solution of 8 mM 1,8-anilinonaphthalenesulfonic acid, and the resulting solution is reacted at 25° C. for 30 minutes to give a fluorescence intensity of the reaction solution. Is measured under the conditions of an excitation wavelength of 390 nm (excitation band width 10 nm) and a fluorescence wavelength of 470 nm (fluorescence band width 10 nm). The value of the fluorescence intensity measured by such a method is used as the fluorescence intensity of the lysozyme-modified product-containing powder. The concentration of the modified lysozyme is 0.05% by mass in terms of solid content, and the dilution with a phosphate buffer solution so that the concentration of the phosphate is 0.2 M is specifically, for example, modified lysozyme. When measuring the fluorescence intensity of an aqueous solution containing 1% by mass of solid matter in terms of solid content, after putting 5 g of the aqueous solution and 80 mL of 0.25 M phosphate buffer in a 100 mL volumetric flask, make up to 100 mL with purified water. It means being adjusted by doing. Incidentally, further details of the method for measuring the fluorescence intensity of the present invention, as described in the examples below, according to the method of the Canadian Institute of Food Science and Technology 1985 Vol.18 No.4 p.290-295. And
＜リゾチーム変性物及び／又はその塩＞
本発明のリゾチーム変性物含有粉末は、リゾチーム変性物及び／又はその塩を原料として製造されるものである。本発明において、「リゾチーム」とは、Ｎ−アセチルグルコサミンとＮ−アセチルムラミン酸とのβ−１，４結合を加水分解する性質を有するタンパク質をいう。そして、本発明において、「リゾチーム変性物」とは、リゾチームのタンパク質としての立体構造が変化したものをいう。
<Modified lysozyme and/or salt thereof>
The lysozyme modified product-containing powder of the present invention is produced using a lysozyme modified product and/or its salt as a raw material. In the present invention, “lysozyme” refers to a protein having the property of hydrolyzing the β-1,4 bond between N-acetylglucosamine and N-acetylmuramic acid. In the present invention, the "lysozyme modified product" refers to a product in which the three-dimensional structure of lysozyme as a protein is changed.
リゾチームは、卵、動物の組織、体液、植物等生物界に広く存在し、基質特異性と構造から大きく以下の５種のファミリーに分類される。
１．リゾチーム（細菌型）
２．リゾチーム（ニワトリ型）
３．リゾチーム（グース型）
４．リゾチーム（ファージ型；Ｖタイプ）
５．リゾチーム（ＣＨ型）
Lysozyme is widely present in the living world such as eggs, animal tissues, body fluids and plants, and is largely classified into the following five families based on the substrate specificity and structure.
1. Lysozyme (bacterial type)
2. Lysozyme (chicken type)
3. Lysozyme (goose type)
4. Lysozyme (phage type; V type)
5. Lysozyme (CH type)
本発明において、リゾチーム変性物及び／又はその塩の原料として、上記５種のリゾチームファミリーのいずれも使用することができる。これらのリゾチームのなかでも、原料であるリゾチームとして、卵白リゾチーム、ヒトリゾチーム等のリゾチーム（ニワトリ型）が好ましい。そして、ノロウィルスの不活化作用がより優れており、低コストでありかつ入手容易であることを勘案すれば、リゾチーム変性物及び／又はその塩は、卵白リゾチームに由来するものであることがより好ましい。 In the present invention, any of the above five lysozyme families can be used as a raw material for the lysozyme modified product and/or its salt. Among these lysozymes, lysozyme (chicken type) such as egg white lysozyme and human lysozyme is preferable as the raw material lysozyme. And, considering that the inactivating effect of norovirus is more excellent, the cost is low and the availability is easy, the lysozyme modified product and/or the salt thereof is more preferably derived from egg white lysozyme. preferable.
また、リゾチーム変性物の塩としては、食品添加物又は薬学的に許容可能である塩が挙げられ、より具体的には、塩酸、炭酸、リン酸、ホウ酸、へキサメタリン酸、硝酸、硫酸等の無機酸の塩、クエン酸、酒石酸、コハク酸、リンゴ酸、酢酸、グルタミン酸、グリセロリン酸、グルコン酸等の有機酸の塩が挙げられる。リゾチームの塩のなかでも、無機酸の塩が好ましく、広く使用されかつ安全性が確立している観点から、塩酸塩がより好ましい。なおここで、本発明の化合物及び／又は塩は、大気中に放置したり又は再結晶をすることにより、水分を吸収し、吸着水が付いたり、水和物となったりする場合があり、本発明には、そのような各種の水和物、溶媒和物及び結晶多形の化合物も包含する。 Examples of the salt of the lysozyme modified product include food additives or pharmaceutically acceptable salts, and more specifically, hydrochloric acid, carbonic acid, phosphoric acid, boric acid, hexamethaphosphoric acid, nitric acid, sulfuric acid, etc. Examples thereof include salts of inorganic acids, and salts of organic acids such as citric acid, tartaric acid, succinic acid, malic acid, acetic acid, glutamic acid, glycerophosphoric acid, and gluconic acid. Among the salts of lysozyme, the salts of inorganic acids are preferable, and the hydrochloride is more preferable from the viewpoint of being widely used and having established safety. Here, the compound and/or salt of the present invention may be left in the air or recrystallized to absorb water, adsorb water, or become a hydrate. The present invention also includes such various hydrates, solvates and polymorphic compounds.
本発明のリゾチーム変性物含有粉末において、リゾチーム変性物及び／又はその塩を複数種類含有する場合、リゾチーム変性物及び／又はその塩の濃度（固形分換算）は、リゾチーム変性物及び／又はその塩の合計量の濃度（固形分換算）を意味する。またここで、固形分換算とは、乾燥固形分換算を意味する。リゾチーム変性物含有粉末中のリゾチーム変性物及び／又はその塩の含有割合は、リゾチーム変性物含有粉末の製造におけるリゾチーム変性物及び／又はその塩の仕込み量と、リゾチーム変性物含有粉末の生成量と基づき算出することができる。 When the lysozyme modified product-containing powder of the present invention contains a plurality of lysozyme modified products and/or salts thereof, the concentration of the lysozyme modified product and/or its salt (solid content conversion) is lysozyme modified product and/or its salt. Means the concentration of the total amount (in terms of solid content). The term "solid content conversion" as used herein means dry solid content conversion. The content ratio of the lysozyme modified product and/or its salt in the lysozyme modified product-containing powder is the charged amount of the lysozyme modified product and/or its salt in the production of the lysozyme modified product-containing powder, and the production amount of the lysozyme modified product-containing powder. It can be calculated based on.
（リゾチーム変性物及び／又はその塩の抗ノロウィルス活性）
本発明のリゾチーム変性物及び／又はその塩の抗ノロウィルス活性は、上述の保存前のリゾチーム変性物含有粉末の抗ノロウィルス活性と好ましくは同様である。また、リゾチーム変性物及び／又はその塩の抗ノロウィルス活性の値は、リゾチーム変性物含有粉末の抗ノロウィルス活性と同様の手法により測定される。
(Anti-norovirus activity of modified lysozyme and/or salt thereof)
The anti-norovirus activity of the modified lysozyme and/or salt thereof of the present invention is preferably the same as the anti-norovirus activity of the above-mentioned powder containing the modified lysozyme before storage. The anti-norovirus activity value of the lysozyme modified product and/or its salt is measured by the same method as the anti-norovirus activity of the lysozyme modified product-containing powder.
（リゾチーム変性物及び／又はその塩の蛍光強度）
本発明のリゾチーム変性物及び／又はその塩の蛍光強度は、リゾチーム変性物及び／又はその塩の表面疎水性の指標とすることができる。すなわち、本発明のゾチーム変性物及び／又はその塩の蛍光強度が高いほど、リゾチーム変性物及び／又はその塩の表面疎水性が高いといえる。リゾチーム変性物及び／又はその塩の表面疎水性が高いほど、抗ノロウィルス活性が高い傾向がある。また、蛍光強度を測定することにより、リゾチーム変性物及び／又はその塩が十分に加熱変性されていることを確認できる。
(Fluorescence intensity of modified lysozyme and/or salt thereof)
The fluorescence intensity of the lysozyme modified product and/or its salt of the present invention can be used as an index of the surface hydrophobicity of the lysozyme modified product and/or its salt. That is, it can be said that the higher the fluorescence intensity of the zozyme modified product and/or its salt of the present invention, the higher the surface hydrophobicity of the lysozyme modified product and/or its salt. The higher the surface hydrophobicity of the lysozyme modified product and/or its salt, the higher the anti-norovirus activity tends to be. Further, by measuring the fluorescence intensity, it can be confirmed that the lysozyme modified product and/or its salt is sufficiently denatured by heating.
リゾチーム変性物及び／又はその塩の蛍光強度は、好ましくは保存開始前のリゾチーム変性物含有粉末と同様とされる。 The fluorescence intensity of the lysozyme modified product and/or its salt is preferably the same as that of the powder containing the lysozyme modified product before the start of storage.
（リゾチーム変性物の種類）
本発明において、リゾチーム変性物含有粉末の製造の際に用いられるリゾチームの変性処理は、本発明の効果を妨げない限り特に限定されない。従って、本発明のリゾチーム変性物としては、加熱処理物、酸処理物、アルカリ処理物、酵素処理物、有機溶剤処理物、界面活性剤処理物、酸化処理物、還元処理物、高圧力処理物、変性剤処理物、これらの組合せ等が挙げられる。なお、リゾチーム変性物には、リゾチーム及び／又はその塩を分解処理したリゾチーム由来ペプチドも含まれる。
(Types of modified lysozyme)
In the present invention, the modification treatment of lysozyme used in the production of the powder containing a lysozyme modified product is not particularly limited as long as the effects of the present invention are not impaired. Therefore, as the lysozyme modified product of the present invention, a heat-treated product, an acid-treated product, an alkali-treated product, an enzyme-treated product, an organic solvent-treated product, a surfactant-treated product, an oxidation-treated product, a reduction-treated product, a high-pressure treated product. , Denaturant-treated products, combinations thereof, and the like. The lysozyme-modified product also includes a lysozyme-derived peptide obtained by decomposing lysozyme and/or its salt.
リゾチーム変性物の中でも、ノロウィルスの不活化効果の点から、加熱変性したもの（以下、単に「加熱変性物」ともいう。）が好ましい。加熱変性物は、非加熱のリゾチーム及び／又はその塩に比して短時間でノロウィルスを不活化させることができ、本発明において特に有利に利用することができる。 Among the lysozyme-modified products, those that have been heat-denatured (hereinafter, also simply referred to as “heat-denatured product”) are preferable from the viewpoint of the effect of inactivating norovirus. The heat-denatured product can inactivate norovirus in a shorter time than non-heated lysozyme and/or its salt, and can be particularly advantageously used in the present invention.
また、本発明のリゾチーム変性物は、上述する通り、抗ウィルス活性を付与する観点からは、ｐＨ５．０以上での変性処理より得られた変性物であることが好ましい。リゾチームのｐＨ５．０以上での変性処理物を、再度ｐＨ５．０未満に調節して粉末化することは、長期間抗ノロウィルス活性を保持する上で特に有利である。 As described above, the lysozyme modified product of the present invention is preferably a modified product obtained by a modification treatment at pH 5.0 or higher from the viewpoint of imparting antiviral activity. It is particularly advantageous to adjust the pH of the lysozyme-denatured product at pH 5.0 or higher to less than 5.0 again and to pulverize it to maintain the anti-norovirus activity for a long period of time.
＜リゾチーム変性物含有粉末＞
（リゾチーム変性物及び／又はその塩の含有量）
本発明のリゾチーム含有粉末におけるリゾチーム変性物及び／又はその塩の含有量は、所望の抗ノロウィルス活性等を勘案して当業者が適宜設定してよく、後述する製造方法におけるｐＨ調節後のリゾチーム変性物及び／又はその塩のみから構成されていてもよいが、固形分換算で３０質量％以上１００質量％以下であることが好ましく、３０〜９０質量％以下であることがより好ましく、３３質量％以上８０質量％であることがさらに好ましく、３５質量％以上７０質量％以下であることがさらに好ましい。リゾチーム変性物及び／又はその塩の含有量が前記範囲内であることにより、抗ノロウィルス活性を維持した粉末が得られやすい。
<Powder containing modified lysozyme>
(Content of modified lysozyme and/or salt thereof)
The content of the lysozyme modified product and/or its salt in the lysozyme-containing powder of the present invention may be appropriately set by those skilled in the art in consideration of the desired anti-norovirus activity and the like, and lysozyme after pH adjustment in the production method described below. Although it may be composed only of a modified product and/or its salt, it is preferably 30% by mass or more and 100% by mass or less, more preferably 30 to 90% by mass, and 33% by mass in terms of solid content. % Or more and 80% by mass or less is more preferable, and 35% by mass or more and 70% by mass or less is further preferable. When the content of the lysozyme modified product and/or the salt thereof is within the above range, it is easy to obtain a powder that maintains the anti-norovirus activity.
（リゾチーム変性物含有粉末の水分含有量）
また、本発明のリゾチーム変性物含有粉末は、抗ノロウィルス活性の維持し易さの向上の観点からは水分含有量は低いことが好ましい。リゾチーム変性物含有粉末における水分含有量は通常、１０質量％以下であることが好ましく、８質量％以下であることがより好ましく、６質量％以下であることがさらに好ましい。また、リゾチーム変性物含有粉末における水分含有量の好適な範囲は、０．１質量％以上１０質量％以下、０．２質量％以上８質量％以下、又は０．３質量％以上６質量％以下である。リゾチーム変性物含有粉末の水分含量は、当業者に公知の方法であるKarl-Fischer法を用いて測定した値とする。
(Water content of powder containing modified lysozyme)
In addition, the lysozyme-modified product-containing powder of the present invention preferably has a low water content from the viewpoint of improving the ease of maintaining the anti-norovirus activity. The water content of the lysozyme-modified product-containing powder is usually preferably 10% by mass or less, more preferably 8% by mass or less, and further preferably 6% by mass or less. Further, the preferred range of the water content in the lysozyme modified product-containing powder is 0.1% by mass or more and 10% by mass or less, 0.2% by mass or more and 8% by mass or less, or 0.3% by mass or more and 6% by mass or less. Is. The water content of the lysozyme modified product-containing powder is a value measured by the Karl-Fischer method, which is a method known to those skilled in the art.
（糖類）
また、本発明のリゾチーム変性物含有粉末は、後述する製造方法のいずれかの工程において、抗ノロウィルス活性の維持し易さの向上の観点から、糖類を添加して製造してもよい。したがって、好ましい態様によれば、本発明のリゾチーム変性物含有粉末は、糖類を含んでいてもよい。糖類は、本発明の効果を妨げない限り特に限定されず、酸又は酵素加水分解等の公知手法により各種穀物由来のデンプンから製造してもよく、市販品であってもよい。本発明のデキストリンの例としては、加水分解の度合いや構造により種々の分解物が挙げられ、糖類の好適な例としては、トレハロースまたはデキストリン（アミロデキストリン、エリトロデキストリン、アクロデキストリン、マルトデキストリン、シクロデキストリン等）が挙げられる。
(Sugar)
In addition, the lysozyme modified product-containing powder of the present invention may be produced by adding a saccharide in any step of the production method described below from the viewpoint of improving the ease of maintaining the anti-norovirus activity. Therefore, according to a preferred embodiment, the lysozyme modified product-containing powder of the present invention may contain a saccharide. The saccharide is not particularly limited as long as it does not impair the effects of the present invention, and may be produced from starch derived from various grains by a known method such as acid or enzymatic hydrolysis, or may be a commercially available product. Examples of the dextrin of the present invention include various decomposition products depending on the degree of hydrolysis and structure, and preferable examples of the saccharide include trehalose or dextrin (amylodextrin, erythrodextrin, acrodextrin, maltodextrin, cyclo Dextrin etc.).
また、本発明の糖類がデキストリンである場合、抗ノロウィルス活性の維持し易さの観点から、デキストリンは、ＤＥ２０以下であることが好ましく、ＤＥ１０以下であることがより好ましい。また、本発明のデキストリンのＤＥのより好適な範囲としては、２以上２０以下、４以上２０以下、２以上１０以下又は４以上１０以下である。ここで、デキストリンのＤＥとは、Ｄｅｘｔｒｏｓｅ Ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔの略称で、デキストリンの加水分解の程度を意味し、次の式で表される。
ＤＥ＝直接還元糖（グルコース換算）／固形分×１００
デキストリンのＤＥはウィルシュテッター・シューデル法により求めた値とする。
When the saccharide of the present invention is dextrin, the dextrin is preferably DE20 or less and more preferably DE10 or less from the viewpoint of easy maintenance of the anti-norovirus activity. The DE of the dextrin of the present invention is more preferably in the range of 2 or more and 20 or less, 4 or more and 20 or less, 2 or more and 10 or less, or 4 or more and 10 or less. Here, the DE of dextrin is an abbreviation for Dextrose Equivalent, which means the degree of hydrolysis of dextrin and is represented by the following formula.
DE=direct reducing sugar (glucose equivalent)/solid content×100
The DE of the dextrin is the value obtained by the Wilstetter-Schudel method.
また、別の態様によれば、本発明のデキストリンは、抗ノロウィルス活性の維持し易さ観点から、シクロデキストリンであることが好ましく、α―シクロデキストリン、β−シクロデキストリン又はγ−シクロデキストリンであることがより好ましい。 Further, according to another aspect, the dextrin of the present invention is preferably a cyclodextrin from the viewpoint of easy maintenance of anti-norovirus activity, and is α-cyclodextrin, β-cyclodextrin or γ-cyclodextrin. More preferably.
（糖類の含有量）
本発明のリゾチーム含有粉末における糖類の含有量の好適な下限としては、固形分換算で、５質量％、１５質量％、２０質量％、２５質量％、３０質量％又は３５質量％である。また、糖類の含有量の好適な上限としては、７０質量％、６０質量％、５５質量％、５０質量％、４５質量％又は３５質量％である。また、糖類の含有量の好適な範囲は、上述した上限および下限の組合せから選択することができ、５質量％以上７０質量％以下、１５質量％以上６０質量以下等が挙げられる。糖類の含有量を上記好適な範囲内とすることは、抗ノロウィルス活性を長期間維持する上で有利である。
(Sugar content)
A suitable lower limit of the saccharide content in the lysozyme-containing powder of the present invention is 5% by mass, 15% by mass, 20% by mass, 25% by mass, 30% by mass or 35% by mass in terms of solid content. The preferable upper limit of the saccharide content is 70% by mass, 60% by mass, 55% by mass, 50% by mass, 45% by mass or 35% by mass. Moreover, the suitable range of the content of the saccharides can be selected from the combination of the upper limit and the lower limit described above, and examples thereof include 5% by mass or more and 70% by mass or less, and 15% by mass or more and 60% by mass or less. Setting the saccharide content within the above-mentioned preferred range is advantageous in maintaining the anti-norovirus activity for a long period of time.
（配合比）
また、本発明のリゾチーム変性物含有粉末において、リゾチーム変性物及び／又はその塩と、糖類との質量比（リゾチーム変性物及び／又はその塩：糖類）は、本発明の効果を妨げない限り特に限定されないが、抗ノロウィルス活性を維持し易い観点から、好ましくは１：０．１〜１：３であり、より好ましくは１：０．３〜１：２．５であり、さらに好ましくは１：０．４〜１：２である。
(Compounding ratio)
Further, in the lysozyme modified product-containing powder of the present invention, the mass ratio of the lysozyme modified product and/or its salt and the saccharide (lysozyme modified product and/or its salt:sugar) is not particularly limited unless the effect of the present invention is hindered. Although not limited, from the viewpoint of easily maintaining the anti-norovirus activity, it is preferably 1:0.1 to 1:3, more preferably 1:0.3 to 1:2.5, and further preferably 1 : 0.4 to 1:2.
＜リゾチーム変性物含有粉末の製造方法＞
本発明のリゾチーム変性物含有粉末は、リゾチーム及び／又はその塩を含む溶液をｐＨ５．０以上で変性させ、リゾチーム変性物及び／又はその塩を得る工程、該リゾチーム変性物及び／又はその塩を含む溶液のｐＨが５．０未満となるように調節する工程、及び該ｐＨを調節された溶液を乾燥する工程を経て製造することが好ましい。
<Method for producing powder containing modified lysozyme>
The lysozyme modified product-containing powder of the present invention comprises a step of denaturing a solution containing lysozyme and/or a salt thereof at a pH of 5.0 or higher to obtain a lysozyme modified product and/or a salt thereof, and a lysozyme modified product and/or a salt thereof. It is preferable that the production is performed through a step of adjusting the pH of the containing solution to be less than 5.0 and a step of drying the pH-adjusted solution.
（リゾチーム変性物及び／又はその塩の準備工程）
本発明の製造方法では、まず、リゾチーム変性物及び／又はその塩を準備する。リゾチーム変性物及び／又はその塩は、市販品を用いてもよいが、リゾチーム及び／又はその塩に公知の変性方法を施すことにより取得することが好ましい。かかる変性方法としては、加熱処理、酸処理、アルカリ処理、酵素処理、有機溶剤処理、界面活性剤処理、酸化処理、還元処理、高圧力処理等を挙げることができるが、好ましくは加熱処理である。
(Preparation step of modified lysozyme and/or salt thereof)
In the production method of the present invention, first, a lysozyme modified product and/or its salt is prepared. The lysozyme modified product and/or its salt may be a commercially available product, but it is preferably obtained by subjecting lysozyme and/or its salt to a known modification method. Examples of the modification method include heat treatment, acid treatment, alkali treatment, enzyme treatment, organic solvent treatment, surfactant treatment, oxidation treatment, reduction treatment and high pressure treatment, but heat treatment is preferable. ..
加熱処理は、リゾチーム及び／又はその塩の変性が適度に行われていれば加熱条件を特に限定するものではないが、リゾチーム及び／又はその塩を５０℃以上１３０℃以下、好ましくは６０℃以上、より好ましくは７０℃以上で加熱することが好ましい。 The heat treatment is not particularly limited to heating conditions as long as lysozyme and/or its salt is appropriately modified, but lysozyme and/or its salt may be heated to 50°C or higher and 130°C or lower, preferably 60°C or higher. It is more preferable to heat at 70° C. or higher.
熱変性の方法としては、リゾチーム及び／又はその塩を溶媒に溶解させて加熱するとよく、加熱時間は、リゾチーム加熱温度に応じて決定することができ、１分以上７２０分以下であってもよい。なお、前記溶媒は、リゾチーム及び／又はその塩を溶解することができる溶媒であれば限定されないが、例えば、水や、水を含む有機溶媒であってもよい。 As the method of heat denaturation, lysozyme and/or its salt may be dissolved in a solvent and heated, and the heating time may be determined according to the lysozyme heating temperature, and may be 1 minute or more and 720 minutes or less. .. The solvent is not limited as long as it can dissolve lysozyme and/or its salt, but may be, for example, water or an organic solvent containing water.
また、リゾチームの上記変性工程において、前記リゾチーム溶液のｐＨは５．０以上であり、好ましくは５．５以上である。また、リゾチーム溶液のｐＨは６．５以下であることがより好ましい。後述する３段階の加熱変性方法においても、第１の加熱工程、第２の加熱工程および第３の加熱工程において、リゾチーム溶液のｐＨ は、上述の通り、５．０以上にして加熱変性は行われる。 In the denaturation step of lysozyme, the pH of the lysozyme solution is 5.0 or higher, preferably 5.5 or higher. Further, the pH of the lysozyme solution is more preferably 6.5 or less. Also in the three-step heat denaturation method described below, in the first heating step, the second heating step, and the third heating step, the pH of the lysozyme solution is set to 5.0 or more as described above, and heat denaturation is not performed. Be seen.
また、必要に応じて、上述のような酸（例えば、塩酸、酢酸等の、無機酸又は有機酸）、アルカリ（例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等の無機塩基）又は緩衝液（例えば、酢酸緩衝液）を使用して、リゾチーム溶液を上記範囲のｐＨ に調整してもよい。例えば、リゾチームがリゾチームの塩（例えば塩化リゾチーム）である場合、酸、アルカリ又は緩衝液を使用して、水溶液のｐＨを上記範囲のｐＨに調整したうえで、加熱変性を行うことが好ましい。 Further, if necessary, an acid (for example, inorganic acid or organic acid such as hydrochloric acid or acetic acid), an alkali (for example, inorganic base such as sodium hydroxide or potassium hydroxide) or a buffer solution (for example, The lysozyme solution may be adjusted to a pH within the above range using an acetate buffer). For example, when lysozyme is a salt of lysozyme (for example, lysozyme chloride), it is preferable to carry out heat denaturation after adjusting the pH of the aqueous solution to a pH within the above range using an acid, an alkali or a buffer solution.
（３段階加熱変性法）
好ましい態様によれば、上記加熱変性物を得る工程は、波長６６０ｎｍ の光の透過率が７０％ 超（好ましくは８０％ 以上、より好ましくは９０％ 以上、通常１００％以下）であり、ｐＨ が５．０以上７．０以下であり、かつ、リゾチーム及び／又はその塩の濃度が固形分換算で０．５質量％以上７質量％以下であるリゾチームの水溶液を、該水溶液の波長６６０ｎｍの光の透過率が７０％ になるまで加熱する第１の加熱工程（ 以下、単に「第１ の加熱工程」ともいう。） と、前記第１ の加熱工程の後に、該水溶液の波長６６０ｎ ｍ の光の透過率が７０％ 未満の極小値まで加熱した後、７０％ になるまで該水溶液を加熱する第２の加熱工程（ 以下、単に「第２ の加熱工程」ともいう。） と、前記第２の加熱工程の後に、前記水溶液の波長６６０ｎｍの光の透過率が７０％ を超える状態で該水溶液をさらに加熱する第３の加熱工程（ 以下、単に「第３の加熱工程」ともいう。） と、を含む。上記第１の加熱工程、第２の加熱工程及び第３の加熱工程により、リゾチーム変性物を得ることができる。以下、その詳細について説明する。
(3-step heat denaturation method)
According to a preferred embodiment, in the step of obtaining the heat-modified product, the transmittance of light having a wavelength of 660 nm is more than 70% (preferably 80% or more, more preferably 90% or more, usually 100% or less), and the pH is An aqueous solution of lysozyme having a concentration of 5.0 to 7.0 and a concentration of lysozyme and/or a salt thereof of 0.5% by mass to 7% by mass in terms of solid content is converted into light having a wavelength of 660 nm. Of the aqueous solution having a wavelength of 660 nm after the first heating step (hereinafter, also simply referred to as “first heating step”) of heating until the transmittance of the aqueous solution becomes 70%. Second heating step of heating the aqueous solution to a minimum value of less than 70% and then heating the aqueous solution to 70% (hereinafter, also simply referred to as "second heating step"); After the heating step of (3), a third heating step (hereinafter, also simply referred to as “third heating step”) of further heating the aqueous solution in a state where the transmittance of the light having a wavelength of 660 nm exceeds 70%. ,including. A lysozyme modified product can be obtained by the first heating step, the second heating step, and the third heating step. The details will be described below.
[第１の加熱工程]
第１の加熱工程によって、波長６６０ｎｍの光の透過率が７０％超である水溶液における該光の透過率が低下して７０％になることは、該水溶液の透過率が低下することを意味し、例えば、目視にて該水溶液の白濁を確認することができる。
[First heating step]
The decrease in the light transmittance of the aqueous solution having a light transmittance of 660 nm of more than 70% to 70% by the first heating step means that the transmittance of the aqueous solution is decreased. For example, the cloudiness of the aqueous solution can be visually confirmed.
すなわち、第１の加熱工程では、前記水溶液中のリゾチームの立体構造及び／ 又はリゾチームの表面の表面疎水性が上昇し、疎水性部分が引き合い凝集して、前記水溶液中のリゾチームの溶解性が低下する結果、該水溶液の波長６６０ｎｍの光の透過率が７０％超から７０％に低下すると推測される。 That is, in the first heating step, the three-dimensional structure of lysozyme in the aqueous solution and/or the surface hydrophobicity of the surface of lysozyme are increased, the hydrophobic moieties are attracted and aggregated, and the solubility of lysozyme in the aqueous solution is decreased. As a result, it is estimated that the transmittance of light having a wavelength of 660 nm of the aqueous solution is decreased from more than 70% to 70%.
リゾチームの立体構造を確実に変化させることができ、かつ、リゾチームの凝集を防止して、ノロウィルスの不活化作用を高めることができる点で、第１ の加熱工程において、水溶液中のリゾチームの濃度は１ 質量％ 以上であることが好ましく、一方、５質量％以下であることが好ましい。 In the first heating step, the concentration of lysozyme in the aqueous solution was increased in the first heating step, because the three-dimensional structure of lysozyme can be reliably changed, and the aggregation of lysozyme can be prevented to enhance the inactivating effect of norovirus. Is preferably 1% by mass or more, while it is preferably 5% by mass or less.
リゾチーム及び／ 又はその塩の水溶液を構成する溶媒は水であるが、リゾチーム及び／又はその塩の水への溶解性に影響しない範囲で水と混和する有機溶媒を使用してもよい。リゾチーム及び／ 又はその塩の水溶液を構成する溶媒における水の割合は通常８０質量％以上１００質量％ 以下である。また、リゾチーム及び／ 又はその塩の水溶液を構成する溶媒が、水と混和する有機溶媒を含む場合、リゾチーム及び／ 又はその塩の水溶液を構成する溶媒における該有機溶媒の割合は通常１質量％ 以上２０質量％ 以下である。 The solvent forming the aqueous solution of lysozyme and/or its salt is water, but an organic solvent miscible with water may be used as long as the solubility of lysozyme and/or its salt in water is not affected. The proportion of water in the solvent constituting the aqueous solution of lysozyme and/or its salt is usually 80% by mass or more and 100% by mass or less. When the solvent constituting the aqueous solution of lysozyme and/or its salt contains an organic solvent miscible with water, the proportion of the organic solvent in the solvent constituting the aqueous solution of lysozyme and/or its salt is usually 1% by mass or more. It is 20 mass% or less.
前記有機溶媒としては、水と混和する有機溶媒であればよく、例えば、メタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、エチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリン等のアルコール系溶媒、アセトン、メチルエチルケトン等のケトン系溶媒、アセトニトリル、テトラヒドロフラン、１ 、４−ジオキサン等が挙げられ、これらを単独でまたは２ 種以上を組み合わせて使用することができる。 The organic solvent may be an organic solvent miscible with water, for example, alcohol solvents such as methanol, ethanol, 1-propanol, 2-propanol, ethylene glycol, propylene glycol, glycerin, acetone, ketones such as methyl ethyl ketone. Examples include system solvents, acetonitrile, tetrahydrofuran, 1,4-dioxane, and the like, which can be used alone or in combination of two or more kinds.
[第２の加熱工程]
第２の加熱工程において、第１の加熱工程で得られた水溶液の波長６６０ｎ ｍ の光の透過率が７０％から７０％未満（好ましくは６０％未満、より好ましくは５０％未満、通常０％以上）の極小値まで加熱した後、７０％になるまで加熱することにより、第１の加熱工程で得られた水溶液の光の透過率がさらに低下し（その結果、目視にて水溶液の白濁及び／ 又は沈殿を確認することができる。）、その後、該透過率が増加に転じて、該白濁及び／又は沈殿が次第に消失すること（その結果、目視で次第に透明になっていくことを確認することができる。）を確認することができる。
[Second heating step]
In the second heating step, the transmittance of the aqueous solution obtained in the first heating step for light having a wavelength of 660 nm is 70% to less than 70% (preferably less than 60%, more preferably less than 50%, usually 0%). After heating to the minimum value of (above) and then heating to 70%, the light transmittance of the aqueous solution obtained in the first heating step is further reduced (as a result, the aqueous solution becomes cloudy and opaque). / Or precipitation can be confirmed.) After that, the transmittance starts to increase, and the cloudiness and/or precipitation gradually disappears (as a result, it is confirmed visually that it gradually becomes transparent). Can be confirmed.)
すなわち、第２の加熱工程では、前記水溶液中のリゾチームの立体構造がさらに変化し、リゾチームの表面疎水性がさらに高まるにつれて、リゾチームの水溶性が一旦低下した後に高まる結果、水溶液の波長６６０ｎｍの光の透過率が７０％になると推測される。 That is, in the second heating step, as the three-dimensional structure of lysozyme in the aqueous solution is further changed and the surface hydrophobicity of lysozyme is further increased, the water solubility of lysozyme is temporarily decreased and then increased. Is estimated to be 70%.
第２の加熱工程においてリゾチームの表面疎水性がさらに高まるにつれて、リゾチームの水溶性が一旦低下した後で高まるメカニズムは明らかでないが、第２の加熱工程によって、第１の加熱工程において凝集したリゾチーム同士が結合して線状の凝集体に変化し、この凝集体が前記水溶液に溶解するため、前記水溶液中のリゾチームの溶解性が上昇するためであると推測される。 As the surface hydrophobicity of lysozyme further increases in the second heating step, the mechanism by which the water solubility of lysozyme once decreases and then increases is not clear. However, by the second heating step, the lysozyme aggregated in the first heating step is It is presumed that this is due to the fact that they bind to each other and change into linear aggregates, and these aggregates dissolve in the aqueous solution, so that the solubility of lysozyme in the aqueous solution increases.
第２の加熱工程は第１の加熱工程の後に引き続いて行うことができる。すなわち、第２の加熱工程は第１の加熱工程と連続的に行うことができる。 The second heating step can be performed subsequently to the first heating step. That is, the second heating step can be continuously performed with the first heating step.
[第３の加熱工程]
第３の加熱工程では、前記水溶液中のリゾチームの立体構造がさらに変化し、リゾチームの水溶性を維持した状態で、リゾチームの表面疎水性がさらに高められる結果、水溶液の波長６６０ｎｍの光の透過率が７０％を超える値を維持することができると推測される。
[Third heating step]
In the third heating step, the three-dimensional structure of lysozyme in the aqueous solution is further changed, and the surface hydrophobicity of lysozyme is further increased while maintaining the water solubility of lysozyme. As a result, the light transmittance of the aqueous solution at a wavelength of 660 nm is increased. Is estimated to be able to remain above 70%.
より具体的には、第３の加熱工程においては、該水溶液中に白濁及び／又は沈殿が生じない（該水溶液の透過率（透明性）が維持されている）ことが好ましい。 More specifically, in the third heating step, it is preferable that cloudiness and/or precipitation does not occur in the aqueous solution (the transmittance (transparency) of the aqueous solution is maintained).
前記水溶液中のリゾチームの立体構造をより確実に変化させることができる点で、第３の加熱工程は、該水溶液の波長６６０ｎｍの光の透過率が７５％以上になるまで加熱することがより好ましく、８０％以上になるまで加熱することがより好ましい（通常１００％以下である）。 In the point that the three-dimensional structure of lysozyme in the aqueous solution can be more surely changed, it is more preferable that the third heating step is performed until the transmittance of light having a wavelength of 660 nm of the aqueous solution becomes 75% or more. More preferably, it is heated to 80% or more (usually 100% or less).
さらに、第３の加熱工程は、第３の加熱工程で得られた水溶液を０．４５μｍのメンブレンフィルターでろ過したものとエタノールとを質量比で１：１の割合で混合したときに波長６６０ｎｍの光の透過率が８５％以上になるまで加熱することが好ましく、９０％以上になるまで加熱することがより好ましい（通常１００％以下である）。 Further, in the third heating step, when the aqueous solution obtained in the third heating step is filtered through a 0.45 μm membrane filter and ethanol is mixed at a mass ratio of 1:1, a wavelength of 660 nm is obtained. The heating is preferably performed until the light transmittance becomes 85% or more, and more preferably 90% or more (usually 100% or less).
第３の加熱工程で得られた水溶液を０．４５μｍのメンブレンフィルターでろ過したものとエタノールとを質量比で１：１の割合で混合したときに波長６６０ｎｍの光の透過率が８５％以上になることは、上記定義で規定される蛍光強度が４，０００以上であるリゾチーム変性物が得られた指標とすることができる。 When the aqueous solution obtained in the third heating step was filtered through a 0.45 μm membrane filter and ethanol was mixed at a mass ratio of 1:1, the transmittance of light having a wavelength of 660 nm was 85% or more. This can be used as an index for obtaining a lysozyme-modified product having a fluorescence intensity defined by the above definition of 4,000 or more.
第３の加熱工程は第２の加熱工程の後に引き続いて行うことができる。すなわち、第３の加熱工程は第１の加熱工程及び第２の加熱工程と連続的に行うことができる。 The third heating step can be carried out subsequently to the second heating step. That is, the third heating step can be continuously performed with the first heating step and the second heating step.
第３の加熱工程において、前記透過率が７０％を超える状態で加熱された（透明化した）水溶液は、室温（例えば２５℃）に戻しても該透過率を維持することができる（透明性を維持することができる）。その原因としては、該水溶液中に含まれるリゾチーム等の形態（立体構造）が室温でも維持されているためであると推測される。 In the third heating step, the aqueous solution heated (made transparent) with the transmittance exceeding 70% can maintain the transmittance even when returned to room temperature (for example, 25° C.) (transparency). Can be maintained). It is presumed that the cause is that the form (stereostructure) of lysozyme and the like contained in the aqueous solution is maintained even at room temperature.
リゾチーム変性物の製造において、高い収率を達成することができ、かつ、該水溶液を第１の加熱工程、第２の加熱工程及び第３の加熱工程でそれぞれ規定される透過率に調整できる点で、第１の加熱工程、第２の加熱工程及び第３の加熱工程における該水溶液の中心品温を７０℃ 以上となるように加熱することが好ましく、加熱時間が短いため製造時間を短縮できる点で、８０℃ 以上がより好ましく、９０℃ 以上がさらに好ましい（１３０℃ 以下であってもよく、約１００℃以下であってもよい）。なお、第１の加熱工程、第２の加熱工程及び第３の加熱工程における加熱時間は、加熱温度及び処理量に応じて各工程で規定する透過率を満たすように適宜決定することができる。 In the production of a lysozyme-modified product, a high yield can be achieved, and the aqueous solution can be adjusted to have a transmittance specified in each of the first heating step, the second heating step and the third heating step. Then, it is preferable to heat the aqueous solution in the first heating step, the second heating step, and the third heating step so that the core temperature of the aqueous solution is 70° C. or higher. Since the heating time is short, the manufacturing time can be shortened. In this respect, 80° C. or higher is more preferable, and 90° C. or higher is further preferable (130° C. or lower, or about 100° C. or lower). The heating time in the first heating step, the second heating step, and the third heating step can be appropriately determined so as to satisfy the transmittance specified in each step depending on the heating temperature and the treatment amount.
第１の加熱工程、第２の加熱工程及び第３の加熱工程を同じ加熱温度で連続して行う場合、第１の加熱工程における加熱時間及び第２の加熱工程における及び第３の加熱工程における加熱時間は、合計で中心品温が７０℃ 以上７５℃ 以下の場合は１２５分間以上７２０分間以下、中心品温が７５℃ 超８０℃ 以下の場合は８０分間以上４３５分間以下、中心品温が８０℃ 超８５℃ 以下の場合は７０分間以上３０５分間以下、中心品温が８５℃超９０℃以下の場合は５０分間以上２４０分間以下、中心品温が９０℃超９５℃ 以下の場合は４０分間以上１８５分間以下、中心品温が９５℃超１００℃ 以下の場合は２ ５分間以上１２０分間以下、中心品温が１００℃超の場合は１０分間以上１２０分間以下であることが好ましい。 When the first heating step, the second heating step, and the third heating step are continuously performed at the same heating temperature, the heating time in the first heating step and the second heating step and the third heating step The total heating time is 125 minutes or more and 720 minutes or less when the core product temperature is 70°C or more and 75°C or less, and 80 minutes or more and 435 minutes or less when the core product temperature is more than 75°C and 80°C or less. 70 minutes or more and 305 minutes or less when the temperature is more than 80°C and 85°C or less, 50 minutes or more and 240 minutes or less when the core product temperature is more than 85°C and 90°C, or 40 minutes when the core product temperature is more than 90°C and 95°C or less It is preferable that the time is not less than 1 minute and not more than 185 minutes, the core temperature is not less than 95° C. and not more than 100° C., the time is not less than 25 minutes and not more than 120 minutes, and the center temperature is not less than 100° C., it is not less than 10 minutes and not more than 120 minutes.
（ｐＨ調節工程）
次に、本発明の製造方法では、リゾチーム変性物及び／又はその塩を含む溶液のｐＨが５．０未満となるように調節する。ｐＨの調節は、ｐＨ測定計で測定しながら、リゾチーム変性物及び／又はその塩を含む溶液に、上述のような酸を添加することにより実施することができる。
(PH adjusting step)
Next, in the production method of the present invention, the pH of the solution containing the lysozyme modified product and/or its salt is adjusted to be less than 5.0. The pH can be adjusted by adding the above-mentioned acid to the solution containing the lysozyme modified product and/or its salt while measuring with a pH meter.
リゾチーム変性物及び／又はその塩を含む溶液のｐＨは、リゾチーム変性物含有粉末の最終的なｐＨを勘案して調節することが好ましい。従って、リゾチーム変性物及び／又はその塩を含む溶液のｐＨは、５．０未満であり、好ましくは１．７以上５．０未満であり、より好ましくは１．７以上４．０以下であり、さらに好ましくは２．０以上４．０以下である。 The pH of the solution containing the lysozyme modified product and/or its salt is preferably adjusted in consideration of the final pH of the lysozyme modified product-containing powder. Therefore, the pH of the solution containing the lysozyme modified product and/or its salt is less than 5.0, preferably 1.7 or more and less than 5.0, and more preferably 1.7 or more and 4.0 or less. , And more preferably 2.0 or more and 4.0 or less.
また、リゾチーム変性物及び／又はその塩を含む溶液におけるリゾチーム変性物及び／又はその塩の濃度は、２質量％程度が好ましいが、リゾチーム変性物含有粉末の最終的なｐＨが所望の範囲となる限りは特に限定されず、１〜１０質量％程度、好ましくは２〜４質量％とすることができる。 The concentration of the lysozyme modified product and/or its salt in the solution containing the lysozyme modified product and/or its salt is preferably about 2% by mass, but the final pH of the powder containing the lysozyme modified product is within the desired range. There is no particular limitation as long as it is 1 to 10% by mass, preferably 2 to 4% by mass.
また、リゾチーム変性物及び／又はその塩を含む溶液における酸の配合量は、リゾチーム変性物含有粉末の最終的なｐＨを勘案して、溶液のｐＨ測定計で測定することにより、当業者により適宜決定される。 Further, the amount of the acid in the solution containing the lysozyme modified product and/or its salt is appropriately determined by a person skilled in the art by measuring the pH of the solution in consideration of the final pH of the lysozyme modified product-containing powder. It is determined.
リゾチーム変性物及び／又はその塩を含んでなる溶液を調製し、ｐＨを調節する際の温度は、特に限定されないが、例えば、室温（２５℃）で行うことができる。 The temperature for preparing a solution containing a lysozyme modified product and/or a salt thereof and adjusting the pH is not particularly limited, but may be room temperature (25° C.), for example.
（乾燥工程）
そして、本発明によれば、上記ｐＨ調節された溶液を乾燥することにより、リゾチーム変性物含有粉末を得ることができる。本発明の乾燥方法は、本発明の効果を妨げない限り特に限定されず、常法に則り、噴霧乾燥、凍結乾燥等の手法を用いて行うことができるが、噴霧乾燥により調製することが好ましい。
(Drying process)
Then, according to the present invention, the lysozyme-modified product-containing powder can be obtained by drying the pH-adjusted solution. The drying method of the present invention is not particularly limited as long as it does not impair the effects of the present invention, and can be carried out according to a conventional method using a method such as spray drying or freeze drying, but it is preferably prepared by spray drying. ..
（その他）
本発明のリゾチーム変成物含有粉体の製造方法においては、上記いずれかの工程において、糖類を添加してもよい。糖類の添加時期は、特に限定されないが、乾燥工程前が好ましい。
(Other)
In the method for producing a lysozyme modified product-containing powder of the present invention, a saccharide may be added in any of the above steps. The time of addition of the sugar is not particularly limited, but it is preferably before the drying step.
なお、本発明の製造方法では、上記の各工程の前後において、精製工程、粒度調節工程、成型工程等を公知手法により実施してもよく、本発明にはかかる態様も包含される。 In the production method of the present invention, the purification step, the particle size adjusting step, the molding step and the like may be performed by known methods before and after each of the above steps, and the present invention also includes such an aspect.
＜剤型／用途＞
本発明のリゾチーム変性物含有粉末は、本発明の効果を妨げない限り、所望により食品添加物又は薬学上許容可能な添加成分等とともに、固体状、半固形状、粉末状等の組成物の形態とすることができる。かかる添加成分としては、特に限定されないが、遊離の上記酸、トコフェロール酢酸エステル等の酸化防止剤、カルボキシビニルポリマー、ヒドロキシエチルセルロース等の増粘剤、グリセリン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル等の界面活性剤等が挙げられる。
<Formulation/Use>
The lysozyme-modified product-containing powder of the present invention is in the form of a composition such as a solid, semi-solid, or powder, together with a food additive or a pharmaceutically acceptable additive component, if desired, as long as the effect of the present invention is not impaired. Can be Such addition components are not particularly limited, but include the above free acids, antioxidants such as tocopherol acetate, carboxyvinyl polymers, thickeners such as hydroxyethyl cellulose, glycerin fatty acid ester, surfactants such as sucrose fatty acid ester. Etc.
また、本発明のリゾチーム変性物含有粉末は、必要に応じて種々の剤型をとることができ、好適な例としては、錠剤、粉末剤、カプセル等の固形剤としてもよく、用事調製して液剤としてもよい。リゾチーム変性物含有粉末を水やアルコール媒体等の液体と混合して液剤として使用することは、リゾチーム変性物含有粉末の飛散防止の観点から好ましい。液剤とする場合、その粘度は使用方法に応じて適宜定めることができる。例えば、噴霧可能な粘度の液剤とし、トリガースプレーヤー、スクイズ容器、エアゾル容器等のスプレー容器に充填することにより、手指、食品、調理器具、住居環境、嘔吐物、排泄物等へ噴霧することにより、ノロウィルスの不活化を手軽に行うことができ、ノロウィルス不活化剤を含む液剤に、不活化の対象物（例えば、手指、食品、医療機器、医療器具、調理器具、住居環境）を浸すことにより、ノロウィルスの不活化を手軽に行うこともできる。また、リゾチーム変性物含有粉末を含む液剤を湿潤させたシートとして使用することができる。さらに、ローション、クリーム等とすることにより皮膚外用剤として使用することができ、これにより、ノロウィルスが手指に付着してもその場で不活化し、ノロウィルスが経口感染することを防止することができる。 Further, the lysozyme-modified product-containing powder of the present invention can take various dosage forms as necessary, and suitable examples thereof may be tablets, powders, solid preparations such as capsules and the like, which can be prepared as needed. It may be used as a liquid agent. It is preferable to mix the lysozyme modified product-containing powder with a liquid such as water or an alcohol medium and use it as a liquid agent from the viewpoint of preventing scattering of the lysozyme modified product-containing powder. When the solution is used, its viscosity can be appropriately determined according to the method of use. For example, by spraying a liquid such as a sprayer, a trigger sprayer, a squeeze container, an aerosol container, etc., by spraying on fingers, food, cooking utensils, living environment, vomiting, excrement, etc. , Can easily inactivate the norovirus, and soak the object to be inactivated (eg, fingers, food, medical equipment, medical equipment, cookware, living environment) in a liquid agent containing the norovirus inactivating agent. This makes it possible to easily inactivate the norovirus. Further, it can be used as a sheet moistened with a liquid agent containing a powder containing a lysozyme modified product. Furthermore, it can be used as a skin external preparation by forming a lotion, a cream, etc., and thereby, even if the Norovirus adheres to the fingers, it is inactivated on the spot, and it is possible to prevent oral infection of the Norovirus. You can
また、本発明のリゾチーム変性物含有粉末を固形剤とする場合、例えば、予め経口摂取しておくことにより、ノロウィルスが口に入ったとしても、それを不活化して感染を防止することができ、また、ノロウィルスによる感染症が発症した場合にも体内のノロウィルスを不活化する治療剤として使用することができる。以上の通り、本発明のリゾチーム変性物含有粉末は医薬として利用することができる。従って、本発明の別の態様によれば、リゾチーム変性物含有粉末を含んでなる医薬製剤が提供される。また、好ましい態様によれば、上記医薬製剤は、ノロウィルスによる感染症の治療剤であり、さらに好ましくは、ノロウィルスに起因する胃腸炎の治療剤である。なおここで、「治療」には、確立された病態を治療することだけでなく、将来確立される可能性のある病態を予防することをも含む。 Further, when the lysozyme modified product-containing powder of the present invention is used as a solid agent, for example, by ingesting it in advance, even if the Norovirus enters the mouth, it can be inactivated to prevent infection. In addition, it can be used as a therapeutic agent for inactivating norovirus in the body when an infection caused by norovirus occurs. As described above, the lysozyme modified product-containing powder of the present invention can be used as a medicine. Therefore, according to another aspect of the present invention, there is provided a pharmaceutical preparation comprising a powder containing a lysozyme modified product. According to a preferred embodiment, the pharmaceutical preparation is a therapeutic agent for infectious diseases caused by norovirus, and more preferably a therapeutic agent for gastroenteritis caused by norovirus. The term "treatment" as used herein includes not only treating an established pathological condition but also preventing a pathological condition that may be established in the future.
また、本発明の別の態様によれば、医薬製剤として使用するための、上記リゾチーム変性物含有粉末が提供される。また、本発明のさらに別の態様によれば、医薬製剤の製造における、上記リゾチーム変性物含有粉末が提供される。また、上記いずれかの態様において、上記医薬製剤は、好ましくはノロウィルスによる感染症の治療剤であり、より好ましくはノロウィルスに起因する胃腸炎の治療剤である。 Further, according to another aspect of the present invention, there is provided the above-mentioned lysozyme-modified product-containing powder for use as a pharmaceutical preparation. Further, according to still another aspect of the present invention, there is provided the above-mentioned powder containing a lysozyme modified product in the production of a pharmaceutical preparation. Further, in any of the above embodiments, the pharmaceutical preparation is preferably a therapeutic agent for infectious diseases caused by norovirus, more preferably a therapeutic agent for gastroenteritis caused by norovirus.
（ノロウィルスの不活化方法）
本発明によれば、リゾチーム変性物含有粉末を用いて、ノロウィルスが存在する適用対象又は環境において、ノロウィルスを効果的に不活性化することが可能となる。従って、本発明の一つの態様によれば、ノロウィルスの不活化方法であって、それを必要する生体又は区画に、有効量のリゾチーム変性物含有粉末を適用することを含む方法が提供される。また、本発明のノロウィルスの不活化方法は、好ましくはノロウィルスによる感染症の治療方法とされる。
(How to inactivate norovirus)
According to the present invention, it is possible to effectively inactivate norovirus in an application target or environment in which norovirus is present, by using a powder containing a lysozyme modified product. Therefore, according to one aspect of the present invention, there is provided a method for inactivating a norovirus, which comprises applying an effective amount of a powder containing modified lysozyme to a living body or a compartment in need thereof. .. The method for inactivating norovirus of the present invention is preferably a method for treating infectious diseases caused by norovirus.
適用対象が生体の場合、生体は、好ましくは哺乳動物、例えば、げっ歯類、イヌ、ネコ、ウシ、霊長類等とされ、好ましくはヒトとされ、特に好ましくはノロウィルスによる感染症の患者とされる。 When the application target is a living body, the living body is preferably a mammal, for example, a rodent, a dog, a cat, a cow, a primate, etc., preferably a human, and particularly preferably a patient with an infection caused by norovirus. To be done.
また、上記適用対象が区画の場合は、ノロウィルスが存在しうる限り特に限定されず、住居、食品工場、公共施設、工場、病院等の種々の環境の一区画が挙げられる。 In addition, when the application target is a compartment, it is not particularly limited as long as a norovirus can exist, and examples include compartments of various environments such as houses, food factories, public facilities, factories, and hospitals.
リゾチーム変性物含有粉末の適用方法は、本発明の効果を妨げない限り特に限定されず、適用対象に応じて適宜選択することができる。適用対象が生体である場合、適用方法としては、例えば、経口投与、坐薬投与、噴霧、塗布、点滴、静脈注射等の投与方法が挙げられる。また、適用対象が区画である場合には、適用方法としては、噴霧、塗布等の方法が挙げられる。 The method for applying the lysozyme modified product-containing powder is not particularly limited as long as it does not impair the effects of the present invention, and can be appropriately selected depending on the application target. When the application target is a living body, examples of the application method include oral administration, suppository administration, spraying, application, infusion, intravenous injection and the like. When the application target is a section, examples of the application method include spraying and coating.
また、リゾチーム変性物含有粉末の有効量は、適用対象の種類、性質、状態や、適用場所、適用方法等に応じて当業者により適宜決定することができる。適用対象、適用場所、適用方法等に応じて当業者が適宜決定することができる。 Further, the effective amount of the lysozyme modified product-containing powder can be appropriately determined by those skilled in the art according to the type, property, state of application target, application site, application method and the like. Those skilled in the art can appropriately make a decision according to the application target, application place, application method, and the like.
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されない。 Hereinafter, the present invention will be specifically described with reference to examples, but the present invention is not limited to these examples.
例１：リゾチーム変性物含有粉末の調製
サンプル１
（リゾチーム変性物の調製）
卵白（鶏卵卵白）リゾチーム（キユーピー株式会社製）を蒸留水に溶解し、ｐＨ測定器（卓上型ｐＨメーター Ｆ-７２、株式会社堀場製作所製）で測定しながら酸を加え、ｐＨ６．０に調整した濃度４質量％の溶液を得、該溶液を９０℃で１時間加熱処理し、空冷することによりリゾチーム変性物含有溶液を調製した。
前記加熱処理においては、上述した第１の加熱工程、第２の加熱工程及び第３の加熱工程として記載された、反応液の透過率の変化が確認された。なお、本実施例では、第１の加熱工程、第２の加熱工程および第３の加熱工程を連続して行っており、前記加熱時間は第１、第２および第３の加熱工程における加熱時間の合計である。
Example 1: Preparation of powder containing modified lysozyme
Sample 1
(Preparation of modified lysozyme)
Dissolve egg white (chicken egg white) lysozyme (Kewpie Co., Ltd.) in distilled water and add acid while measuring with a pH meter (tabletop pH meter F-72, Horiba, Ltd.) to adjust to pH 6.0. A solution having a concentration of 4% by mass was obtained, and the solution was heated at 90° C. for 1 hour and air-cooled to prepare a lysozyme modified product-containing solution.
In the heat treatment, changes in the transmittance of the reaction liquid described as the above-described first heating step, second heating step, and third heating step were confirmed. In this example, the first heating step, the second heating step and the third heating step are continuously performed, and the heating time is the heating time in the first, second and third heating steps. Is the sum of
（リゾチーム変性物含有粉末の調製）
次に、得られたリゾチーム変性物含有溶液にｐＨ測定器で測定しながら塩酸を添加し、ｐＨを２．０に調節した。次に、得られた溶液を噴霧乾燥法（熱風温度１５０℃、排風温度８０℃）で粉末化し、リゾチーム変性物含有粉末を得た。
(Preparation of powder containing modified lysozyme)
Next, hydrochloric acid was added to the obtained lysozyme modified product-containing solution while measuring with a pH meter to adjust the pH to 2.0. Next, the obtained solution was pulverized by a spray drying method (hot air temperature 150° C., exhaust air temperature 80° C.) to obtain a lysozyme modified product-containing powder.
サンプル２
リゾチーム変性物含有溶液のｐＨを３．０に調節する以外、サンプル１と同様の手法により、サンプル２のリゾチーム変性物含有粉末を得た。
Sample 2
A lysozyme modified product-containing powder of Sample 2 was obtained in the same manner as in Sample 1 except that the pH of the lysozyme modified product-containing solution was adjusted to 3.0.
サンプル３
リゾチーム変性物含有溶液のｐＨを調整しない以外、サンプル１と同様の手法により、サンプル３のリゾチーム変性物含有粉末を得た。すなわち、サンプル３の粉末化処理時におけるリゾチーム変性物含有溶液のｐＨは６．０であった。
Sample 3
A lysozyme modified product-containing powder of Sample 3 was obtained in the same manner as in Sample 1 except that the pH of the lysozyme modified product-containing solution was not adjusted. That is, the pH of the lysozyme-modified product-containing solution during the powdering treatment of Sample 3 was 6.0.
サンプル４
リゾチーム変性物の調製時のｐＨを４．０とする以外、サンプル１と同様にして、サンプル４のリゾチーム変性物含有粉末を得た。
Sample 4
A lysozyme modified product-containing powder of Sample 4 was obtained in the same manner as Sample 1 except that the pH at the time of preparing the lysozyme modified product was 4.0.
例２：リゾチーム変性物含有粉末の抗ノロウィルス活性保存試験
（保存試験）
各サンプルの抗ノロウィルス活性の経時変化を以下に記載の保存試験によって評価した。具体的には、まず、製造直後にサンプル１〜４の抗ノロウィルス活性を測定した。さらに、恒温恒湿容器内で４０℃、７５％ＲＨの条件下で４週間保存した後、サンプル１〜３の抗ノロウィルス活性を再度測定した。抗ノロウィルス活性の測定は、以下の手法に従い実施した。
Example 2: Storage test for anti-norovirus activity of powder containing modified lysozyme (storage test)
The time course of the anti-norovirus activity of each sample was evaluated by the storage test described below. Specifically, first, immediately after production, the anti-norovirus activity of Samples 1 to 4 was measured. Furthermore, after storing in a thermo-hygrostat at 40° C. and 75% RH for 4 weeks, the anti-norovirus activity of Samples 1 to 3 was measured again. The anti-norovirus activity was measured according to the following method.
（抗ノロウィルス活性測定）
（１）６ウェルプレートに、マウスマクロファージ株化細胞（ＲＡＷ２６４．７細胞）をコンフルエントの６０〜８０％まで培養した。
（２）マウスマクロファージ株化細胞（ＲＡＷ２６４．７細胞）をコンフルエントまで培養し、コンフルエントになった細胞にノロウィルス液１ｍＬを接種し、２日間、３７℃、５％ＣＯ２条件下で培養した。この場合、ノロウィルス液として、Ｍｕｒｉｎｅ ｎｏｒｏｖｉｒｕｓ ｓｔｒａｉｎ １（ＭＮＶ−１）（Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ Ｆｏｏｄ Ｒｅｓｉｄｕｅｓ ｏｎ Ｎｏｒｏｖｉｒｕｓ Ｓｕｒｖｉｖａｌ ｏｎ Ｓｔａｉｎｌｅｓｓ Ｓｔｅｅｌ Ｓｕｒｆａｃｅｓ）を使用した。
(Measurement of anti-norovirus activity)
(1) Mouse macrophage cell lines (RAW264.7 cells) were cultured in a 6-well plate to 60 to 80% of confluence.
(2) Mouse macrophage cell line (RAW264.7 cells) was cultured to confluency, 1 mL of the Norovirus solution was inoculated to the confluent cells, and the cells were cultured for 2 days at 37° C. under 5% CO 2 conditions. In this case, as a Norovirus solution, Murine norovirus strain 1 (MNV-1) (Effect of Food Residents on Norovirus Survival on Stainless Steel Surfaces) was used.
培養後、細胞が剥がれているのを目視で確認し、凍結融解を４回繰り返して細胞を破壊し、細胞中のウィルスを放出させた。その後、５０ｍＬ遠沈管に分注し、遠心分離（８，０００ｇ、２０分）を行い、感染価（ＰＦＵ／ｍＬ）が１０６〜１０７ＰＦＵ／ｍＬ程度のノロウィルス液を得た。このノロウィルス液は、−８０℃で保存し、解凍して使用した。 After the culture, it was visually confirmed that the cells were detached, and freeze-thawing was repeated 4 times to destroy the cells and release the virus in the cells. Then, the mixture was dispensed into a 50 mL centrifuge tube and centrifuged (8,000 g, 20 minutes) to obtain a Norovirus solution having an infectious titer (PFU/mL) of about 106 to 107 PFU/mL. This Norovirus solution was stored at −80° C. and thawed before use.
（３）次に、各サンプルを水に溶解し、リゾチーム変性物を固形分換算で２．０質量％含有する水溶液を調製した。この水溶液に、（２）で得たノロウィルス液を等質量加え、これを評価用サンプル液（ノロウイルス混合液）とした。 (3) Next, each sample was dissolved in water to prepare an aqueous solution containing a lysozyme modified product in an amount of 2.0 mass% in terms of solid content. An equal mass of the Norovirus solution obtained in (2) was added to this aqueous solution, and this was used as an evaluation sample solution (Norovirus mixed solution).
各評価用サンプル液を、２５℃で所定の反応時間（０分又は１分）で放置し、ノロウィルスを反応させた。
反応後、各評価用サンプル液を１０ｘ倍希釈し、希釈サンプル液とした。ここで、ｘは整数であり、後述する（８）において目視でプラーク数をカウントできる数とする。即ち、（８）で、プラーク数が１０〜１００程度となるように希釈倍率を調節した。
Each sample solution for evaluation was left at 25° C. for a predetermined reaction time (0 minutes or 1 minute) to react with norovirus.
After the reaction, each evaluation sample was 10 x fold diluted and the diluted sample liquid. Here, x is an integer, and is a number by which the number of plaques can be visually counted in (8) described later. That is, in (8), the dilution ratio was adjusted so that the number of plaques was about 10 to 100.
（４）（１）のプレートにおいて培養液を全量撤去し、所定時間放置後希釈した希釈サンプルを５００μＬ／ｗｅｌｌで２ウェルずつ接種した。 (4) The entire amount of the culture solution was removed from the plate of (1), and after leaving it for a predetermined time, the diluted sample was inoculated with 500 μL/well every 2 wells.
（５）マウスマクロファージ株化細胞（ＲＡＷ２６４．７細胞）が乾かないように振とうしながら、室温で１時間インキュベートし、ノロウィルスをマウスマクロファージ株化細胞に感染させた。 (5) The mouse macrophage cell line (RAW264.7 cell) was incubated at room temperature for 1 hour with shaking to prevent it from drying, and the mouse macrophage cell line was infected with Norovirus.
（６）プレート上の５００μＬ／ｗｅｌｌの接種液を全量除去し、１．５％ Ｓｅａ Ｐｌａｑｕｅ Ａｇａｒｏｓｅ−ＤＭＥＭ（３７℃）を２ｍｌ／ｗｅｌｌで重層し、それが固まった後、３７℃、５％ＣＯ２条件下で２日間培養した。 (6) All the inoculum of 500 μL/well on the plate was removed, and 1.5% Sea Plaque Agarose-DMEM (37° C.) was overlaid with 2 ml/well, and after it solidified, 37° C., 5% CO 2 The cells were cultured under the conditions for 2 days.
（７）２日間培養後のプレートに染色液である０．０３％ニュートラルレッド溶液を２ｍＬ／ｗｅｌｌで重層し、３７℃、５％ＣＯ２条件下で１時間インキュベートした。 (7) A 0.03% neutral red solution as a staining solution was overlaid on the plate after culturing for 2 days at 2 mL/well, and incubated at 37° C. under 5% CO 2 condition for 1 hour.
（８）（７）のインキュベート後に０．０３％ニュートラルレッド溶液の全量を撤去し、目視でプラーク数をカウントした。得られたプラーク数と希釈倍率から感染価（ＰＦＵ／ｍＬ）を算出した。 (8) After the incubation in (7), the total amount of the 0.03% neutral red solution was removed, and the number of plaques was visually counted. The infectious titer (PFU/mL) was calculated from the number of obtained plaques and the dilution ratio.
（９）また、以下の式から、保存試験前後の各サンプルの抗ノロウィルス活性を算出した。
抗ノロウィルス活性＝Ｌｏｇ１０(１分間放置前のノロウィルス混合液の感染価)−Ｌｏｇ１０(１分間放置後のノロウィルス混合液の感染価)
(9) Further, the anti-norovirus activity of each sample before and after the storage test was calculated from the following formula.
Anti-norovirus activity=Log10 (infectious titer of Norovirus mixed solution before left for 1 minute)-Log10 (infectious titer of Norovirus mixed solution after left for 1 minute)
（抗ノロウィルス活性測定の結果）
保存試験前のサンプル１〜３はすべて抗ノロウィルス活性を３．０以上有していた。一方で、サンプル４の保存試験前の抗ノロウィルス活性は１．５であった。
以上より、加熱変性時のｐＨが５．０未満である場合には、抗ノロウィルス活性を有する粉末は得られないことが理解できる。
また、保存試験後のサンプル１〜３の結果は、表２に示される通りであった。表２から、中性付近で加熱後にｐＨを５．０未満にしたうえで粉末化することにより、保存後も抗ノロウィルス活性が得られることが理解できる。
(Results of anti-norovirus activity measurement)
Samples 1 to 3 before the storage test all had an anti-norovirus activity of 3.0 or more. On the other hand, the anti-norovirus activity of Sample 4 before the storage test was 1.5.
From the above, it can be understood that a powder having an anti-norovirus activity cannot be obtained when the pH upon heat denaturation is less than 5.0.
The results of Samples 1 to 3 after the storage test were as shown in Table 2. From Table 2, it can be understood that the anti-norovirus activity can be obtained even after storage by heating the mixture at around neutrality and adjusting the pH to less than 5.0 and pulverizing.
例３：リゾチーム変性物含有粉末の蛍光強度／水分含有量測定
保存試験前のサンプル１〜４の蛍光強度を、Canadian Institute of Food Science and Technology 1985 Vol.18 No.4 p.290-295に記載された方法に従い測定した。具体的には、サンプルを、リゾチーム変性物の固形分換算で０．０５質量％になり且つリン酸塩の濃度が０．２Ｍとなるようにリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で希釈した。ここで、リン酸緩衝液は、リン酸二水素ナトリウム及びリン酸水素二ナトリウムで調製したものを使用した。次に、得られた希釈液５ｍＬに８ｍＭの１，８−アニリノナフタレンスルホン酸のメタノール溶液２５μＬを添加し、３０分間２５℃で反応させた。次に、得られた反応液の蛍光強度について、日本分光株式会社製、型名ＦＰ−８５００蛍光分光光度計を用いて、励起波長３９０ｎｍ（励起バンド幅１０ｎｍ）、蛍光波長４７０ｎｍ（蛍光バンド幅１０ｎｍ）、レスポンス０．５ｓｅｃ、感度Ｌｏｗ（約２７０±１０Ｖ）（電源周波数（５０／６０Ｈｚ））、ペリスタシッパＳＨＰ−８２０型使用の条件で測定した。なお、試験サンプルの蛍光強度は、上記０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）の蛍光強度をブランク値とし、ブランク値を差し引いた値とした。
Example 3: Measurement of fluorescence intensity/water content of powder containing lysozyme modified product The fluorescence intensity of Samples 1 to 4 before the storage test is described in Canadian Institute of Food Science and Technology 1985 Vol.18 No.4 p.290-295. It measured according to the method. Specifically, the sample was diluted with a phosphate buffer (pH 7.0) such that the lysozyme-modified product had a solid content of 0.05% by mass and a phosphate concentration of 0.2 M. Here, as the phosphate buffer, one prepared with sodium dihydrogen phosphate and disodium hydrogen phosphate was used. Next, 25 μL of a methanol solution of 8 mM 1,8-anilinonaphthalenesulfonic acid was added to 5 mL of the obtained diluted solution, and the mixture was reacted at 25° C. for 30 minutes. Next, regarding the fluorescence intensity of the obtained reaction solution, an excitation wavelength of 390 nm (excitation band width of 10 nm) and a fluorescence wavelength of 470 nm (fluorescence band width of 10 nm) were used using a model name FP-8500 fluorescence spectrophotometer manufactured by JASCO Corporation. ), response 0.5 sec, sensitivity Low (about 270±10 V) (power supply frequency (50/60 Hz)), and the conditions of using Perista Shipper SHP-820 type. The fluorescence intensity of the test sample was a value obtained by subtracting the blank value from the fluorescence intensity of the 0.2 M phosphate buffer solution (pH 7.0) as a blank value.
結果は、表２に示される通りであった。
また、サンプル１〜４の水分含量をKarl-Fischer法に基づいて測定したところ、いずれも５質量％であった。 Moreover, when the water content of each of Samples 1 to 4 was measured based on the Karl-Fischer method, all were 5% by mass.
Claims (10)
前記保存前後における抗ノロウィルス活性の低下値が３．０以下であり、
かつ
固形分換算で２質量％となるように脱イオン水に溶解させてなる溶液のｐＨが５.０未満である、リゾチーム変性物含有粉末。
抗ノロウィルス活性：ノロウィルス液と、リゾチーム変性物を固形分換算で２質量％含有する前記リゾチーム変性物含有粉末水溶液とを等量混合して得られたノロウィルス混合液を２５℃で１分間放置した時の、放置前の感染価の対数から放置後の感染価の対数を引いた値。 The anti-norovirus activity defined below is 2.0 or more when stored for 4 weeks at 40° C. and 75% RH,
The reduction value of the anti-norovirus activity before and after the storage is 3.0 or less,
A lysozyme-modified product-containing powder, wherein the pH of the solution prepared by dissolving in deionized water so as to be 2% by mass in terms of solid content is less than 5.0.
Anti-norovirus activity: A norovirus mixed solution obtained by mixing equal amounts of a norovirus solution and an aqueous solution of the lysozyme modified product-containing powder containing 2% by mass of the lysozyme modified product in terms of solid content at 25° C. for 1 minute The value obtained by subtracting the logarithm of infectious titer after leaving from the logarithm of infectious titer before leaving.
前記溶液のｐＨが１．７以上５.０未満である、リゾチーム変性物含有粉末。 The lysozyme modified product-containing powder according to claim 1,
A lysozyme-modified product-containing powder, wherein the pH of the solution is 1.7 or more and less than 5.0.
前記リゾチーム変性物の含有量が固形分換算で３０質量％以上１００質量％以下である、リゾチーム変性物含有粉末。 The lysozyme modified product-containing powder according to claim 1 or 2,
The lysozyme modified product-containing powder, wherein the content of the lysozyme modified product is 30% by mass or more and 100% by mass or less in terms of solid content.
前記保存開始前の抗ノロウィルス活性が２．０以上である、リゾチーム変性物含有粉末。 In the lysozyme modified product-containing powder according to any one of claims 1 to 3,
A lysozyme-modified product-containing powder, which has an anti-norovirus activity of 2.0 or more before the start of storage.
下記に規定される前記保存開始前のリゾチーム変性物含有粉末の蛍光強度が４，０００以上である、リゾチーム変性物含有粉末。
蛍光強度：前記保存開始前のリゾチーム変性物含有粉末を、リゾチーム変性物の濃度が固形分換算で０．０５質量％になり且つリン酸塩の濃度が０．２Ｍとなるようにリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で希釈し、得られる希釈液５ｍＬに８ｍＭの１，８−アニリノナフタレンスルホン酸のメタノール溶液２５μＬを添加し、得られる液を３０分間２５℃で反応させた後、該反応液について励起波長３９０ｎｍ（励起バンド幅１０ｎｍ）及び蛍光波長４７０ｎｍ（蛍光バンド幅１０ｎｍ）の条件にて測定された蛍光強度 The lysozyme modified product-containing powder according to any one of claims 1 to 4,
The lysozyme modified product-containing powder as defined below, wherein the fluorescence intensity of the lysozyme modified product-containing powder before the start of storage is 4,000 or more.
Fluorescence intensity: The lysozyme-modified product-containing powder before the start of the storage is adjusted to a phosphate buffer solution such that the concentration of the lysozyme-modified product becomes 0.05% by mass in terms of solid content and the concentration of phosphate becomes 0.2M. After diluting with (pH 7.0), 25 μL of 8 mM methanol solution of 1,8-anilinonaphthalenesulfonic acid was added to 5 mL of the obtained diluted solution, and the obtained solution was reacted at 25° C. for 30 minutes, and then the reaction was performed. Fluorescence intensity measured for the liquid under the conditions of excitation wavelength 390 nm (excitation band width 10 nm) and fluorescence wavelength 470 nm (fluorescence band width 10 nm)
前記リゾチーム変性物が加熱変性物である、リゾチーム変性物含有粉末。 The lysozyme modified product-containing powder according to any one of claims 1 to 5,
A lysozyme-modified product-containing powder, wherein the lysozyme-modified product is a heat-modified product.
糖類をさらに含む、リゾチーム変性物含有粉末。 The lysozyme modified product-containing powder according to any one of claims 1 to 6,
A powder containing a lysozyme modified product, which further contains a saccharide.
該リゾチーム変性物及び／又はその塩を含む溶液のｐＨが５．０未満となるように調節する工程、及び
該ｐＨを調節された溶液を乾燥する工程
を含む、リゾチーム変性物のリゾチーム変性物含有粉末の製造方法。 A step of preparing a lysozyme modified product and/or its salt obtained by denaturing lysozyme and/or its salt at pH 5.0 or higher,
A lysozyme-modified product containing a lysozyme-modified product, which comprises a step of adjusting the pH of a solution containing the lysozyme-modified product and/or a salt thereof to be less than 5.0, and a step of drying the pH-adjusted solution. Powder manufacturing method.
前記リゾチーム変性物及び／又はその塩を含む溶液のｐＨが１．７以上５．０未満となるように調節する、リゾチーム変性物含有粉末の製造方法。 The method for producing a lysozyme modified product-containing powder according to claim 9,
A method for producing a lysozyme-modified product-containing powder, wherein the pH of a solution containing the lysozyme-modified product and/or its salt is adjusted to be 1.7 or more and less than 5.0.
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