JP6736476B2 - 局所性および全身性細菌感染症の治療 - Google Patents

局所性および全身性細菌感染症の治療 Download PDF

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Description

本発明は、哺乳類、特にヒトにおける細菌感染症の治療のための組成物および方法に関する。特に、本発明は局所性細菌感染症および全身性細菌感染症の治療に関する。
近年において、従来の抗生物質に対する耐性が増大を続けており、そして化学殺生物剤の適用が環境を根拠にますます受け入れ難くなっているので、細菌感染症の制御についての代替法に関心が向けられている。
１つの有望なアプローチは、ヒト、動物、植物および魚に対して有害ではないが、ウイルスには致死的な天然に存在する遍在ウイルスであるバクテリオファージの適用を含む。バクテリオファージは特異的であり、そしてサルモネラ属およびリステリア属のような病原体に対して、現在上市のいくつかの衛生製品を用いて特定の細菌のタイプにのみ感染する。
バクテリオファージは、時折１つの宿主種（例えば、大腸菌属およびクルブシエラ属）より多くの単一の宿主種の株の範囲に対して特異的作用を有する。これは、バクテリオファージを一般的な抗生物質として有用にさせるものではないが、標的な干渉(intervention)に有用にさせる。抗生物質はより広範な特異性を有し、それ故、非標的な干渉および緊急的な使用に有用であるが、使用で出現する耐性株に悩まされる。
座瘡および膿痂疹のような局所性感染症は、効率が悪いと考えられている既存製品に代わるものとして、バクテリオファージで治療可能であり得；バクテリオファージＫを含むいくつかの病院用ハンドウォッシュが提案されてきたが、広く追及されてきておらず；多くの座瘡治療が知られているが、ほとんどは皮膚に損傷を与えることが知られているサリチル酸および過酸化ベンゾイルのような活性薬剤を含有する。
US 2007-014770は、抗座瘡細菌を溶解し得るバクテリオファージ、およびこのようなバクテリオファージを含む薬学組成物を開示する。US 2003-180319は、必要に応じて薬学的に受容可能なキャリアと組み合わせた、バクテリオファージのパネル(panel)を含む薬学組成物を開示する。バクテリオファージは、石鹸、ハンドクリームまたはフェイスクリーム、シェービングクリームおよびシェービングフォーム、デンタルフロス、歯磨き粉、歯磨きペーストなどのような消耗品に取り込まれるのに適切であるとして開示されている。EP 0414304は、オイル、乳化剤、水、およびアクネ菌（Propionibacterium acnes）（座瘡を引き起こすものとして知られている）を溶解可能なバクテリオファージを含む、クリームまたはローションの形態の殺菌性組成物を開示する。EP 1504088は、バクテリオファージ含有組成物を用いる細菌感染症の局所治療を開示し、当該治療は座瘡および感染創の治療を含む。特に、EP 1504088は、脱脂綿芽を用いるが他の製剤を用いない、鼻孔へのファージ溶液の局所適用を記載する。類似組成物を用いる他の主張される治療には以下が挙げられる：臭気を発生する皮膚細菌を標的することによる体臭の低減；ならびに、ストレプトコッカス・ミュータンス（Streptococcus mutans）、バクテロイデス・ジンジバリス（Bacteriodes gingivalis）および／またはハエモピルス・アクチノミセテムコミタンス（Haemophilus actinomycetemcomitans）を標的することによる虫歯および歯肉病の治療。
例えば、Sulakvelidzeら、Antimicrobial Agents and Chemotherapy, ２００１年３月, pp 649-659によってミニレビューされている「バクテリオファージ治療」において明らかにされているバクテリオファージ療法に伴う１つの一般的問題は、このような調製物の効能の論証が欠乏していることである。実のところ、上述の従来技術において、製剤化は行われておらず、原理の証明もなされていない。
BruttinおよびBrussow(Antimicrob Agent Chemother. ２００５年７月; 49(7), pp2874-2878)は、下痢のファージ療法の安全性試験について報告し、経口ファージの適用は、総糞便E.coli数における減少を引き起こさず、すなわち、下痢を治癒しなかったと結論付けた。
Sulakvelidzeらにより確認された他の問題には、人体からファージを急速に一掃すると、起こり得る効果、患者における抗ファージ抗体の生産、身体におけるファージの乏しい安定性、ファージの狭い宿主範囲、およびファージ調製物の不充分な純度が低減または無効されるというリスクがある。
Kucharewicz-KrukowskaおよびSlopek(Arch Immunol Ther Exp (Warsaw) 1987; 35(5) pp553-561)は、遊離バクテリオファージの投与の後に抗体を産生し、中和抗体および血球凝集抗体の両方を検出したことを実証した。SkurnikおよびStrauch(International Journal of Medical Microbiology 296 (2006) pp5-14)による別のレビューでは、バクテリオファージに対する細菌病原体のインビボでの感受性はまだ充分によく解明されていないことが示されている。最近、Capparelliら(Antimicrobial Agents and Chemotherapy, ２００７年８月, pp2765-2773)は、黄色ブドウ球菌（S. aureus）に対するファージ療法が、１０９ＰＦＵのファージ用量を用い、それ故マウスでの治療の達成のために異例の高さかつ面食らう程の多量のファージを必要としたことを記載した。
WO03/093462(University of Strathclyde)およびWO2012/175749(Fixed Phage)は、細菌感染の治療のために、バクテリオファージが共有結合した粒子を開示する。WO03/093462は、食中毒の治療のために１０μｍビーズ上に共有結合にて固定化したバクテリオファージを含む調製物を摂取することを開示する。それは、他のサイズのビーズを使用することを開示していない。WO2012/175749は、感染した深い創傷と植物の細菌感染との治療のために、粒子上に固定化されたバクテリオファージを含む調製物の適用を開示する。
WO2012/175749およびWO2012/175749はいずれも、ヒトまたは動物被検体の皮膚または外表面への共有結合固定化バクテリオファージ保有粒子を含む調製物の適用を開示していない。
WO2007/072049(Blaze Venture Technologies)は、放電で粒子を活性化させることにより直径１０μｍの粒子にバクテリオファージを共有結合で結合することにより、バクテリオファージを安定化させる方法を開示する。
US2002/001590(Kelly)は、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）を溶解し得るバクテリオファージ、およびこのようなバクテリオファージを含む薬学的組成物を開示する。
本発明の目的は、局所性細菌感染症の治療において活性な組成物を提供することである。別の目的は、細菌感染症の治療における全身的に活性な組成物を提供することである。特定の実施形態では、当該目的は、ヒトのこのような感染症の治療を含む。
したがって、本発明は、細菌感染症の局所治療に使用するための、キャリア粒子に共有結合したバクテリオファージを提供する。
キャリア粒子に共有結合したバクテリオファージと、薬学的に許容し得るキャリアまたは賦形剤とを含む局所製剤はまた、このような感染症を治療する方法であるような、細菌感染症の治療のために提供される。
本発明はさらに、細菌感染症の全身治療に使用するための、７ミクロンまたはそれ未満の平均直径を有するキャリア粒子に共有結合したバクテリオファージ、および細菌感染の治療のために哺乳類に全身投与するための組成物であって、キャリア粒子に共有結合したバクテリオファージを含む組成物を提供する。本発明の組成物はまた、抗生物質を含有し得ていてもよく、ここで、バクテリオファージは、その抗生物質が有効な細菌に溶解性を示す。
すべての実施形態において、本発明は、新規な抗菌療法、方法および使用を提供する。
図１は、保管中の本発明のファージ含有製剤中のファージの生存を示す。 図２は、精製バクテリオファージで処理した高用量のマイクロスフェアの体重増加に対する効果を示す。 図３は、１００μｌの１×１０８ｃｆｕ／ｍｌ Ｅ１５の皮下（ｓ．ｃ．）投与および５μｍのバクテリオファージ処理マイクロスフェアの尾静脈内（ｉ．ｖ．）注射を行った２匹の動物の温度経時変化を示す。 図４は、１００μｌの１×１０８ｃｆｕ／ｍｌ Ｅ１５（ＨＭ中懸濁）の投与後の２４時間の細菌の数を示す。 図５は、１００μｌの１×１０８ｃｆｕ／ｍｌ Ｅ１５の皮下（ｓ．ｃ．）投与および５μｍのバクテリオファージ処理マイクロスフェアの尾静脈内（ｉ．ｖ．）注射後の、１匹の動物（９６７６）における細菌およびバクテリオファージの経時変化を示す。 図６は、全血液中の細菌の経時変化を示す。試験動物（白四角、陰影三角）に５０μｌの５×１０７ｃｆｕ／ｍｌ Ｅ１５（５％ブタ胃ムチン中懸濁）を腹腔内（ｉ．ｐ．）接種し、そしてバクテリオファージ処理マイクロスフェアの二次注射を静脈内で行った。コントロール動物（陰影菱形）には、５０μｌの５×１０７ｃｆｕ／ｍｌ Ｅ１５（５％ブタ胃ムチン中懸濁）の腹腔内（ｉ．ｐ．）接種のみを行った。 図７は、５０μｌの５×１０７ｃｆｕ／ｍｌ Ｅ１５（５％ブタ胃ムチン中懸濁）を腹腔内（ｉ．ｐ．）接種し、そしてバクテリオファージ処理マイクロスフェアの二次注射を静脈内（ｉ．ｖ．）に行った試験動物におけるｃｆｕ／全血液後の経時変化を示す。 図８は、黄色ブドウ球菌８５８８に対するアンピシリンの効果を示す。 図９は、黄色ブドウ球菌８５８８に対するファージＫの効果を示す。 図１０は、黄色ブドウ球菌８５８８のファージＫ殺菌に対する阻害アンピシリン濃度の効果を示す。 図１１は、粒子上ファージの投与に対するインビボ応答の試験の結果を示す。 図１２は、遊離バクテリオファージＫに対する通常血清および熱不活性化血清の効果を示す。 図１３は、固定化バクテリオファージＫにおける通常血清および熱不活性化血清の効果を示す。 図１４は、２週間後のラットから取り出した縫合糸を示す。 図１５は、本発明のマイクロスフェア投与から１４日後のラット肝臓の顕微鏡写真を示す。 図１６は、ヒト皮膚におけるファージ含有クリームの臨床結果を示す。
このため、本発明は、細菌感染の局所治療に使用するための、キャリア粒子に共有結合したバクテリオファージを提供する。以下の実施例において、１つのこのようなバクテリオファージ製剤は、コントロール製剤と比較して、顕著に増強された安定性と、経時的に保持された活性とを示した。
本発明の組成物を用いる局所療法のための身体の好適な領域は、皮膚、歯、眼、鼻および耳を包含する。
キャリア粒子は、典型的には概ね球状である。平均直径を、２０ミクロンまで、１５ミクロンまで、１０ミクロンまで、０．１ミクロンから、０．５ミクロンから、またはこれらの任意の組み合わせ（例えば、０．１ミクロンから２０ミクロンまたは０．５ミクロンから１０ミクロン）で有していてもよい。粒子は一般に、概ね球形または回転楕円体であり得；それらは、特に身体の繊細な部分の使用のために、好ましくは滑らかである。いくつかの実施形態では、バクテリオファージは、皮膚の細菌感染症の治療の使用のためのものである。
２０ミクロンまでの粒子サイズが、より滑らかな感覚の製剤（例えば、以下により詳細に記載したクリームを参照）を与え、それ故、１〜２０ミクロン、１０〜１５ミクロン、１０ミクロンまで、および１〜１０ミクロンの範囲のサイズがすべて適切である。約３ミクロンのサイズが製剤に特にクリーミーな感覚を与える。
粒子サイズは、当該分野における標準として認識される方法および装置を用いて適切に測定される。分散液における粒子のサイズ測定(sizing)は、様々な技術（レーザー回折、動的光拡散（ＤＬＳ）、ディスク遠心および光学顕微鏡観察を包含する）を用いて行われ得る。これらの技術のすべてはそれらの利点および限界を有する。レーザー回折は、測定領域に対してサンプルの充分に制御された提示に依存し、そして狭い範囲の粒子濃度を有するサンプルに限定される。希釈がしばしば必要とされ、そしてこれは粒子サイズ、特に高い溶解性を有する化合物に影響し得る。サイズ測定装置の例は、レーザー回折法を用いるMalvern Instruments (UK)によってなされる。
本発明のさらに好適な実施形態では、複数の粒子に共有結合したバクテリオファージが提供される。これらは、好ましくは比較的均質な形態で、複数の粒子のうちの大部分、好ましくは実質的にはすべてが、上記範囲の直径を有し、共有結合したファージを有する粒子のより好ましくは８０％またはそれより多く、９０％またはそれより多く、あるいは９５％またはそれより多くが上記範囲内（上記または本明細書中の他の部分に記載したような任意の範囲である）の直径を有する。
バクテリオファージが共有結合によって固定化される本発明の使用のための粒子は、一般には、治療される動物に対して実質的に不活性である。いくつかの例では、ナイロン粒子（ビーズ）が使用された。他の不活性な、好ましくは非毒性の生体適合性材料を用いてもよい。さらに、粒子は生分解性材料から製造され得る。適切な材料には、ポリメチルメタクリレート、ポリエチレン、エチレン／アクリレートコポリマー、ナイロン−１２、ポリウレタン、シリコーン樹脂、シリカおよびナイロン１０１０が挙げられる。ＷＯ２００３／０９３４６２は、粒子が製造され得るさらなる材料を記載している。
粒子基材へのバクテリオファージの固定化または付着は、多くの方法で行われ得る。好ましくは、バクテリオファージは、バクテリオファージコートタンパク質と、キャリア基材との間に形成される共有結合を介して固定化される。
さらに、バクテリオファージは、好ましくは、バクテリオファージの付加および結合の前に、基材粒子を活性化することによって頭部基またはヌクレオカプシドを介して基材に固定化される。
用語「活性化された／活性化する／活性化」は、例えば、電気的に（例えば、コロナ放電によって）、または種々の化学基（界面化学をウイルスを結合し得る状態にする、例えば、バクテリオファージの頭部基またはカプシド基）と当該基材を反応させることにより、基材を活性化することを意味すると理解される。
当該基材の活性化は、例えば、酸、好ましくはＨＣｌを用いる予備的な加水分解に続く水および酸を中和するためのアルカリの洗浄工程によって達成され得る。好ましくは、当該アルカリは炭酸水素ナトリウムである。頭部基を介するバクテリオファージの結合が有効である。複合バクテリオファージの場合、例えば、頭部基を介する結合は尾部基（これは細菌を特異的に認識するために必要である）を宿主細菌細胞への感染、すなわち結合および透過に対して自由な状態とする。複数の種々の株特異的バクテリオファージがいつも基材に固定化され得る。
ウイルスコートタンパク質と基材との間の共有結合（例えば、ペプチド上のアミノ基を介する、例えば、ペプチド結合）の形成の結果として、ファージが基材にカップリングされる。このプロセスを助ける「カップリング剤」は異なっており、かつ使用される基材に依存する。例えば、ナイロン基材、あるいはアミノまたはカルボキシ表面基を有する他のポリマーへのカップリングについて、カップリング剤のカルボジイミドまたはグルタルアルデヒドが使用され得る。
ファージ感染性を保持する、バクテリオファージの粒子への共有結合のための方法のさらなる詳細および好ましい方法は、ＷＯ２００３／０９３４６２およびＷＯ２００７／０７２０４９により詳細に記載されている。
本発明は、外的に適用される（例えば、患者の皮膚、歯、眼、鼻および耳への）局所治療の準備のために使用される。特に、本発明は、座瘡の治療のために使用され得る。公知の調製物を用いる１つの問題は、皮膚に有害な化学品の存在である。本発明の特定の実施形態では、バクテリオファージは、サリチル酸を含むことなく、かつ過酸化ベンゾイルを含むことなく処方される。
本発明はまた、（１）膿痂疹（例えば、黄色ブドウ球菌および／または化膿レンサ球菌（S. pyogenes）により引き起こされる）；（２）毛包炎、フルンケル症、またはカルブンケル症（例えば、黄色ブドウ球菌または緑膿菌により引き起こされる）；（３）膿瘡（例えば、黄色ブドウ球菌または化膿レンサ球菌により引き起こされる）；あるいは（４）丹毒または蜂巣炎（例えば、Ａ群β溶血性ストレプトコッカス（streptococcus）（丹毒）、黄色ブドウ球菌（蜂巣炎）または化膿レンサ球菌により引き起こされる）；の治療のために使用され得る。
本発明はまた、デオドラント製剤またはデオドラント特性をさらに有する発汗抑制製剤におけるような、体臭の原因となり得る細菌の治療のために使用され得る。
複数のタイプのバクテリオファージが同時に使用されることが好ましい。これは、より多くの標的細菌に対する活性を与え、そして耐性の発現を低減する。このため、本発明の実施形態は、記載されるような使用のための、キャリア粒子に共有結合した、３またはそれより多くの細菌株に対して活性なバクテリオファージ、キャリア粒子に共有結合した、５またはそれより多くの細菌株に対して活性なバクテリオファージの多くを含む。好ましくは、バクテリオファージは、同じ細菌種の異なる株に対してすべて活性である。例えば、バクテリオファージは、黄色ブドウ球菌の異なる株に溶解性であるか、またはアクネ菌の異なる株に溶解性である。
本発明は、細菌感染症の治療のために、本明細書中に定義されるようなキャリア粒子に共有結合したバクテリオファージと、薬学的に許容し得るキャリアまたは賦形剤とを含む、局所製剤を対応して提供する。
局所製剤は、好ましくは水中に懸濁した粒子上バクテリオファージのみでなく、好ましくは、水以外（必要に応じて水を加えて）の薬学的に許容され得るキャリアを含む。この製剤は、ゲル、クリームまたはローションの形態であり得、適切には、ゲル形成剤、クリーム形成剤、ワックス、オイル、界面活性剤およびバインダーの１つまたはそれより多く、あるいはすべてを含む。特に皮膚の局所使用のために、これらの成分の１つまたはそれより多くの使用は、皮膚の保持時間の増加を助けかつ調製物の効果を増加させ得る。
ゲルまたはクリームとしての製剤が特に好適である。本発明の特定の実施形態では、以下により詳細に記載するように、クリームが、無水ラノリン、白色軟質パラフィンＢＰおよび軽質流動パラフィンＰｈＥｕｒを含有する水性クリーム中に、ナイロン粒子に共有結合したバクテリオファージを含んで調製される。一般に、皮膚（特にヒト皮膚）への局所適用に適切なすべてのクリームおよびゲルは、本発明によるバクテリオファージの製剤のための基剤として適切である。
一般にクリームまたはローションの製造は、組成物を混合かつ乳化するために加熱を必要とする。熱の付与は、このような標準的な組成物における混入細菌量の低減に有用な方法である。天然のバクテリオファージは温度上昇に対して感受性であり、そして加熱で不活性となり、それ故、このような調製物の製造の間に包含するのは不適切である。しかし、驚くべきことに、固形支持体に共有結合したバクテリオファージは、天然のバクテリオファージよりも顕著に大きな熱安定性を有する。結果として、共有結合により固定化されたバクテリオファージは、熱処理（例えば、熱滅菌）調製物に包含され得る。これは、特に有効である。滅菌の化学的または放射線ベースの方法は核酸を損傷し、それ故バクテリオファージ含有組成物の処理に適さないからである。バクテリオファージの遺伝子材料は、バクテリオファージが感受性であるために無傷のままでいなければならない。
本発明の特定の実施形態は、２０ミクロンまでの平均直径を有するキャリア粒子に共有結合したアクネ菌に溶解性のバクテリオファージを含む、クリームまたはゲルを提供する。バクテリオファージは、キャリア粒子に共有結合したアクネ菌の少なくとも３つまたは少なくとも５つあるいはそれより多くの異なる株に溶解性であり得る。これらは、座瘡または体臭（細菌によって引き起こされる）の治療に特に適している。
本発明のさらに特定の実施形態は、２０ミクロンまでの平均直径を有するキャリア粒子に共有結合した黄色ブドウ球菌に溶解性のバクテリオファージを含む、クリームまたはゲルを提供する。バクテリオファージは、キャリア粒子に共有結合した黄色ブドウ球菌の少なくとも３つまたは少なくとも５つあるいはそれより多くの異なる株に溶解性であり得る。これらは、黄色ブドウ球菌により引き起こされる皮膚感染症の治療に特に適している。
使用において、粒子（例えば、ビーズ）上に固定化されたファージは、遊離ファージよりもより安定であることが見出される。加えて、ビーズは、皮膚に対して結合し、局在化を改善し、そして洗浄またはブラッシング、あるいは製剤の乾燥後の脱落がなさそうであり、重ねて治療の効果を向上させることが見出される。
本発明によってまたさらに提供されるのは、局所性細菌感染症を治療する方法であり、この方法は、上記のようなキャリア粒子に共有結合したバクテリオファージまたはその製剤を投与する工程を包含する。
本発明によってさらに提供されるのは、細菌感染症の全身治療に使用するための、７ミクロンまたはそれ未満の平均直径を有するキャリア粒子に共有結合したバクテリオファージである。
以下に詳細に記載された本発明の特定の実施形態において、このような粒子に固定化されたバクテリオファージは、全身性黄色ブドウ球菌感染症を治療するために使用された。結果は、共有結合されたバクテリオファージを有するこれらの全身投与された粒子は安全でありかつ当該感染症の治療に有効であったことを示した。
このため、このような粒子上バクテリオファージは、キャリア粒子が患者の血管内（特にヒト患者内）の循環を可能にする選択されたサイズまたはそれを下回るサイズである点で全身的に使用するために適合される。同様に、キャリア粒子は、患者の体内（特にヒト患者内）の循環の間、粒子の食作用をさけるための選択されたサイズまたはそれを上回るサイズにふさわしいものである。キャリア粒子は概ね球状であり得、そして別々に６ミクロンまたはそれ未満、５ミクロンまたはそれ未満、あるいは０．１ミクロンまたはそれより多く、０．５ミクロンまたはそれより多く、１ミクロンまたはそれより多く、もしくは０．１ミクロン〜６ミクロン、あるいは１ミクロン〜５ミクロンの平均直径を有し得る。
本明細書に記載した局所的な使用および製剤に関して、複数のタイプのバクテリオファージが同時に使用されることが好ましい。これにより、より多くの標的細菌に対する活性が与えられ、耐性の発現が低減される。このため、全身治療の発明の実施形態は、キャリア粒子に共有結合した、細菌の３つまたはそれより多くの株に対して活性なバクテリオファージ、あるいはキャリア粒子に共有結合した、細菌の５つまたはそれより多くの株に対して活性なバクテリオファージの多くを含む。好ましくは、バクテリオファージは、同じ細菌種の異なる株に対してすべて活性である（例えば、バクテリオファージは、ブドウ球菌、あるいは黄色ブドウ球菌または他の全身性感染細菌の異なる株に溶解性である）。
他の実施形態では、本発明のバクテリオファージは、抗生物質を用いる併用療法に使用される。このため、本発明は、全身性細菌感染の治療に使用するための、７ミクロンまたはそれ未満の平均直径を有するキャリア粒子に共有結合した細菌に溶解性のバクテリオファージを、同じ細菌に対して有効な抗生物質との組み合わせで提供する。したがって、実施例にてより詳細に以下に示した本発明の特定の実施形態において、治療上有効な用量での抗生物質と、キャリア粒子に共有結合したバクテリオファージとの両方を含む組成物が、身体中の血液および器官における全身的な細菌の殺菌に有効であった。この組み合わせにより、各々の成分間の有害な相互作用がないことが確認された。
この組み合わせは、好ましくは哺乳類、特にヒトへの全身投与のためである。適切な製剤は、以下の実施例にて使用されるように、静脈内注射または非経口注射のための製剤である。
この組み合わせ治療において、キャリア粒子は適切には概ね球状であり、そして適切には上記のような、サイズとなされており、したがって例えば、６ミクロンまたはそれ未満、あるいは０．１ミクロンから６ミクロン、あるいは５ミクロンまたはそれ未満、あるいは１ミクロンから５ミクロンの平均直径を有する。組み合わせは、キャリア粒子に共有結合した、細菌の３つまたはそれより多く、あるいは５つまたはそれより多くの株に対して活性な複数のバクテリオファージを使用し得る。バクテリオファージは、ブドウ球菌、特に黄色ブドウ球菌に溶解性であり得る。
この組み合わせ治療において、抗生物質は、その最小阻止濃度（ＭＩＣ）にて、またはこれを上回って適切に投与される。使用において、存在するバクテリオファージは抗生物質に対して耐性を有する細菌に溶解性であり、そして殺菌し、治療の効力を向上させる。本発明の特定の実施形態において、以下により詳細に記載するように、抗生物質は、抗生物質耐性を発現することが知られている細菌に投与され、それ故、抗生物質がＭＩＣを下回って投与され、すべての細菌に対して有効ではないように予測された。抗生物質はファージと組み合わせて投与され、完全な細菌の殺菌を生じ、したがって、耐性細菌に対して組み合わせの効果が示された。
それ故、本発明の組み合わせの実施形態の組成物は、粒子上バクテリオファージを含み、そしてさらに抗生物質を含む（ここで、バクテリオファージはその抗生物質が有効である細菌に溶解性である）。
細菌感染症の全身治療のための組み合わせ治療の方法は、７ミクロンまたはそれ未満の平均直径を有するキャリア粒子に共有結合したバクテリオファージと組み合わせて、抗生物質を投与する工程を含む。この方法の任意かつ好適な特徴は、全身バクテリオファージ療法に関して本明細書中で他に記載されている通りである。
本発明は、一般にバクテリオファージを用いる使用に適切であり、バクテリオファージ株に対する制限がないが、好ましくは溶解性バクテリオファージを用いる使用に適切である。
本発明の製剤は、標的細菌に対して治療上有効な用量のバクテリオファージを含む。バクテリオファージ含量は、典型的には、１０２〜１０１０ＰＦＵであり、このため、液体／ゲルタイプの組成物については１０２〜１０１０ＰＦＵ／ｍｌであり、適切には１０３ＰＦＵ／ｍｌまたはそれより多くであり、さらに別々で適切には１０９ＰＦＵ／ｍｌまでまたは１０８ＰＦＵ／ｍｌまでである。
本明細書中に開示された局所治療のための好適な製剤は、標準基剤と、活性成分としてビーズ上に固定化されたバクテリオファージとを含む。局所用途のこのような調製物は、先に公開された文書（ＵＳ２００３−１８０３１９およびＥＰ０４１４３０４を含む）に記載のものと一致し、それらは上記に対して参照される。
局所使用のための特定の製剤または組成物において、用量は低レベルであり得る。用量は、必要に応じて１０２〜１０６ＰＦＵ／ｍｌである。使用において、ファージのこのレベルは、皮膚への適用において、皮膚１ｍｍ２当たり少なくとも約１ファージ、適切には皮膚１ｍｍ２当たり５ファージまで、１０ファージまで、または１００ファージまでを達成し得る。典型的には、局所感染が存在する場合、製剤の直接的な適用は比較的低用量が有効であることを意味し；固定化されたファージと感染した領域との並列は、ファージと感染する細菌との間の接触の可能性を増大させる。さらに、局所使用のために、組成物のファージの充填は、１ビーズ当たり１つのファージ（したがって、例えば、５ミクロンビーズ当たり１ファージ）、あるいは１ビーズ当たり１〜５ファージ、１〜１０ファージまたは１〜１００ファージを送達するように設計され得る。したがって、組成物は、１０２〜１０６粒子／ｍｌ、１０２〜１０５粒子／ｍｌ、または１０２〜１０４粒子／ｍｌを含むように設計され得る。使用において、ファージのこのビーズレベルは、皮膚への適用において、皮膚１ｍｍ２当たり少なくとも約１粒子、適切には皮膚１ｍｍ２当たり１〜１０粒子または１〜１００粒子を達成し得る。
本発明のバクテリオファージの全身投与のための好適な経路は、薬学的に受容可能なキャリアに懸濁させた、活性成分としての粒子（例えば、マイクロビーズ）に共有結合したバクテリオファージの薬学的調製物の、注射による、特に静脈内送達による。
注射による全身投与は、多くの刊行物（ＵＳ ２００２／００１５９０、Sulakvelidzeら（上記参照）、Kucharewicz-KrukowskaおよびSlopek（上記参照）、ならびにSkurnikおよびStrauch（上記参照）を含む）に記載されている。したがって、本発明の組成物、方法および使用のための本明細書中に開示された全身治療の方法は、当業者に周知の全身治療の方法と一致する。
全身使用には、より高い用量が一般に必要とされる。このような製剤の適切な用量は、例えば、ヒトへの使用には、１０５〜１０１０ＰＦＵまたは１０７〜１０１０ＰＦＵまたは１０７〜１０９ＰＦＵの範囲内であり得る。これらの使用のための粒子調製物は、１ビーズ当たり１つのファージ（よって、例えば５ミクロンビーズ当たり１ファージ）あるいは１ビーズ当たり１〜５個、１〜１０個または１〜１００個のファージを送達するように設計され得る。
本発明のためのバクテリオファージは、そのバクテリオファージが入手可能であり、かつその宿主または標的細菌が培養されかつ培養中に感染され得る限り、一般に制限されないバクテリオファージを包含する。バクテリオファージは、ｓｓＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ｓｓＤＮＡまたはｄｓＤＮＡバクテリオファージであり得、遺伝物質の配置は環状または線形のいずれでもよく、細菌の細胞に感染する。適切なバクテリオファージとしては、マイオウイルス科（Myoviridae）、サイフォウイルス科（Siphoviridae）、ポドウイルス科（Podoviridae）、リポスリクスウイルス科（Lipothrixviridea）、ルディウイルス科（Rudiviridae）、アンプラウイルス科（Ampullaviridae）、バチロウイルス科（Bacilloviridae）、バイカウダウイルス科（Bicaudaviridae）、クラバウイルス科（Clavaviridae）、コルチコウイルス科（Corticoviridae）、シストウイルス科（Cystoviridae）、フセロウイルス科（Fusseloviridae）、グロブロウイルス科（Globuloviridae）、グッタウイルス科（Guttavirus）、イノウイルス科（Inoviridae）、レビウイルス科（Leviviridae）、ミクロウイルス科（Microviridae）、プラズマウイルス科（Plasmaviridae）およびテクティウイルス科（Tectiviridae）が挙げられる。
所望のファージをいかにして単離するかの例は文献で普及しており、単なる例示として、Gill JJおよびHyman P、「Phage choice, isolation, and preparation for phage therapy」, Curr Pharm Biotechnol., 2010年１月;11(1): pp2-14、ならびに前出の「Bacteriophage Therapy」、Sulakvelidzeらによる総説, Antimicrobial Agents and Chemotherapy,２００１年３月, pp649-659が挙げられる。
本発明の利点は、その１つまたはそれより多くの実施形態に起因するが、活性の増加（特に中期から長期の保存後の）を含み、これは製品保存期間の増大を生じる。同様に、本発明の利点は、本発明の製品に含まれる共有結合固定化バクテリオファージの熱に対する耐性の増加である。このような耐熱性バクテリオファージの使用は、製造および滅菌プロセスを簡素化し、よって、このような調製物の配合をより効率的にする。皮膚治療は、危険な化学物質（例えば、サリチル酸および過酸化ベンゾイル）を回避し得る。粒子サイズは必要に応じて小さく、滑らかな感覚の局所治療を提供し得る。全身治療のために、短期間でのみならず、注入から多数日後にも全身的に効力が達成されることは、体内に保持される粒子上で、インビボで有効貯蔵された活性を含む、活性の長期保持を実証する。粒子上ファージのクリアランスが遊離ファージと比較して減少することは、治療の有効性をさらに延長する。細菌の標的抗生物質耐性株に対するバクテリオファージの特異性を抗生物質のより広範な特異性と組み合わせることは、特定の耐性機構に対する選択を提供することにより、個々の使用の場合および細菌の環境分布の両方において、抗生物質耐性の既知の問題を克服し得る。
遊離ファージに対する抗体応答は、先行技術から公知である。さらに、遊離バクテリオファージの反復用量を用いることは、中和抗体の産生の見込みを増大し、有効な侵襲性の療法としてのバクテリオファージの使用に有害となることが当該分野で理解される。本発明によれば、共有結合固定化バクテリオファージの使用が、抗体応答がないかまたはその刺激が非常に低いという驚くべき利点を有する。これは、具体例で実証される。さらに、固定化調製物が遊離ファージと比較して長期間安定であることは、一投与当たりの用量と投与数もしくは頻度との両方の減少を可能にし、治療に対する免疫応答（もしあれば）のさらなる減少に至る。固定化バクテリオファージは、例えば、ファージが付着したビーズまたはマイクロスフェアの表面に抗原物質がほとんどないかまたは全くないことに起因する抗体応答を生じ得ない。この観察および生じた利点は予想外であり驚くべきことである。よって、例えば、１０７〜１０１０ＰＦＵのヒト用量（これをマウスの先行技術で用いられる遊離ファージの１０９ＰＦＵと対比する）使用しても、反復用量後でさえ免疫応答を生じ得ない。
以下の実施例に記載する本発明の特定の実施形態では、粒子上に固定化されたファージが、例えば肝臓内の保持により、体内に活性形態で長期間保持されることも見出されている。活性（すなわち感染性）ファージを保有する粒子は、全身注射から１４日後に動物の肝臓中で検出可能であった。これは、肝臓を経由した血液循環が細菌をこれらの捕捉された活性ファージと接触させるので、全身治療の長期にわたる効果を提供する。したがって、抗細菌活性は、予想外の驚くほどに長い間持続する。
ファージは、補体により別に中和され得る。また、本発明の別の特定の試験では、我々は、驚くべきことに、固定化ファージが補体によって中和されない（対して、遊離ファージでは中和される）ことを示した。これは、本発明の使用および療法のさらなる別の利点である。
本発明を、添付の図面を参照して、特定の実施形態において説明する。
実施例１−座瘡治療のためのバクテリオファージ製剤
アクネ菌（ＦＰ ｐａ１）をナイロンビーズ（平均直径１０ミクロン）上に固定化し、以下に記載のように製剤Ａ、Ｂ、およびＣに混合した。次いで、各製剤を室温でバクテリオファージの生存について試験した。
製剤Ａ−水性クリーム
無水ラノリン １．０％ｗ／ｗ
白色軟質パラフィンＢＰ １４．５％ｗ／ｗ
軽質流動パラフィンＰｈＥｕｒ １２．６％ｗ／ｗ
水 ［１００％まで］
製剤Ｂ−洗顔料（商標「クレアラシル」で市販）
製品内容：水、グルコン酸ナトリウム、プロピレングリコール、オクチルドデカノール、ステアレス−２、シクロペンタシロキサン、ステアレス−２１、サリチル酸、セチルアルコール、ベヘニルアルコール、シクロヘキサシロキサン、ポルアクリルアミド、Ｃ１３−１４イソパラフィン、キサンタンガム、フェノキシエタノール、ケイ酸マグネシウムアルミニウム、ラウレス−７、メンソール、メチルパラベン、ブチルパラベン、エチルパラベン、イソブチルパラベン、プロピルパラベン、ＣＩ７７８９１。
製剤Ｃ−ゲル（商標「Ｄｒ Ｓｐｏｔ」で市販）
製品内容：２％サリチル酸、ウィッチヘーゼル、乳酸。
サリチル酸に対する耐性
製剤Ａに０．５、１．０、１．５および２％ｗ／ｗでサリチル酸を補充し、製剤Ａ１、Ａ２、Ａ３およびＡ４とラベル付けした。これらの製剤中のファージの感染力を、製剤Ａ（サリチル酸を含有しない）中のファージの感染力と比較した。保管から２週間後、コントロールの製剤Ａと比較して、Ａ１〜Ａ４のいずれにおいても感染力の損失は観察されなかった。このことは、ファージ生存に関して、２％でさえもサリチル酸の有害作用がなかったことを示す。
保管中のファージ含有製剤の生存
製剤Ａ、ＢおよびＣの各々に、ナイロン１２粒子上に共有結合にて固定化されたアクネ菌バクテリオファージを補充し、ファージの感染力を、同じ基剤製剤中の同価の遊離（すなわち固定化していない）ファージと比較した。６週間にわたる結果を図１に示す。
このように、ファージ生存は、製剤Ａ、ＢおよびＣの各々中のナイロン粒子上の固定化によって、全ての場合において少なくとも一桁分、３つのうち２つにおいては数桁分、顕著に増大された。
実施例２−局所使用のための製剤（黄色ブドウ球菌）
基剤クリーム調製物：
１２０ｇの乳化軟膏ＢＰ（Emulsifying Ointment BP）を６０℃に加熱し、２７０ｍｌの水（これもまた同じ温度に加熱した）と混合した。この混合物をそれが冷却しつつ注意深く撹拌し、滑らかな白色のクリーム製剤を作製した。このクリームを室温に冷却し、５等分した。
バクテリオファージ粒子作製：
平均直径３ミクロンのナイロン１２粒子をコロナ放電（７５ｋＶ場）により処理し、１×１０９ｐｆｕ／ｍｌのバクテリオファージ懸濁液に迅速に添加した。粒子を３回洗浄し、結合していないバクテリオファージを除去した。この方法を用いて、保管したファージストックから黄色ブドウ球菌に特異的な５つの異なるバクテリオファージ株の各々の１つを用いて、５つの個別の２ｍｌ調製物を作製した。
製剤：
これらの５つの別々のクリーム基剤部分の各々に、別々のバクテリオファージ粒子調製物を、懸濁液が基剤中に十分に取り込まれるまで混合および撹拌によって添加した。次いで、この５つの別々の基剤を合わせ、十分混合し、５つの異なる固定化ファージタイプを含有する１つのクリーム基剤を形成した。
実施例３−局所使用のための製剤（アクネ菌）
以下のように、製剤を調製した。
−油相：ステアリン酸４％、ステアリルアルコール５％、ラノリン７％、ミリスチン酸イソプロピル８％。
−水相：メチルセルロース１％（精製水中）
これらの２つの相を重量基準で別々に調製し、７０℃に加熱した。次いで、クリームが凝固して冷却するまで粉砕によって水相を油相と混合した。
平均直径１０ミクロンのナイロン６，６粒子を７０ｋＶのコロナ放電に通すことにより処理し、１×１０９ｐｆｕ／ｍｌの最終濃度のアクネ菌に対する５つの異なるバクテリオファージを含有する混合バクテリオファージ調製物に迅速に添加した。粒子を３回洗浄して非結合バクテリオファージを除去し、クリーム基剤に添加し、１×１０５ｐｆｕ／ｍｌの最終バクテリオファージ濃度を得た。
実施例４−全身性感染症の治療
５ミクロン直径マイクロスフェアを、精製した結合バクテリオファージＫの添加と共に化学的方法またはコロナ放電法のいずれかにより調製した。ＰＢＳに懸濁した５μｍマイクロスフェアの静脈内（ｉ．ｖ．）注射を、７日目に２０ｍｇ／ｋｇ体重の用量でラット群に与えた。体重増加プロフィールには変化はなかった。このことは、短期間では動物に対するマイクロスフェアまたは固定化バクテリオファージの顕著な有害作用がなかったことを示した（図２に示す）。
感染前、温度応答因子を２匹のラットに移植した。体温を感染期前、感染期中、および感染期後に３０分間隔で記録した。動物を世話し、７日間にわたって体重測定した。その間に動物は、採血を行う拘束プロセスに馴化した。実験は、麻酔動物において投与の選択として皮下（ｓ．ｃ．）経路を用いて１００μｌ １×１０８ｃｆｕ／ｍｌのＥＭＲＳＡ １５（５％ブタ胃ムチン中に懸濁）の用量を用いた。注射を０９：３０時間（第一の採取時点）で行った。５μｍバクテリオファージ処理マイクロスフェアの尾静脈内（ｉ．ｖ．）注射を、尾端を取り出した後に実施した。マイクロスフェア上バクテリオファージの数をプラークアッセイから算出し、１．１×１０３ｐｆｕ／ｍｌの値を得、１００μｌの接種物は１０２ｐｆｕ／ｍｌを含んでいた。
回復を継続して監視し、２７時間の間は１時間毎に、次いで続く３日間は６時間毎に採血を行った。感染後１４日目に動物を屠殺し、最終の採血を心穿刺により行い、器官を摘出し、付随してプレートおよびブロス上に血液スワブを採り、感染程度を決定した。マイクロスフェアが導入されるにつれて、器官および血液をバクテリオファージの存在についても分析した。
結果
動物は、１００μｌの１×１０８ｃｆｕ／ｍｌ Ｅ１５の皮下（ｓ．ｃ．）投与および５μｍバクテリオファージ処理マイクロスフェアの尾静脈内（ｉ．ｖ．）注射の後、十分回復した。動物は疲労の臨床兆候を示さず、健康の良好な全身状態を継続した。
接種直後に温度の急激な上昇が起こった。このことは、感染を伴う動物における発熱応答を示している。図３を参照のこと。温度は、接種後の２４時間の間、約３８．５℃に維持された。この段階におけるバクテリオファージ結合マイクロスフェアは、細菌の皮下（ｓ．ｃ．）注射のみと比較した場合、温度に対する直接の効果をなんら有しない。
血液試料に対して細菌計数を実施した。図４を参照のこと。
両方の動物において同様のパターンが見られた。グラフは、経時的に細菌数が増大したことを示しており、動物身体内のコロニー形成および細菌流入を示唆する。温度および細菌数の間で相関が見られた。温度の増大は、血液中の細菌の増加と共に生じた。
また、追加の万能培養試験管にＬブロスを満たし、血液中に存在する細菌を増殖させた。結果は細菌計数を補強したものであり、各時点について陽性の結果を得た。接種の１週間後に屠殺した後の器官には細菌が見られなかった。このことは、感染が全身性ではなくなったことを示す。
採血結果は、細菌数上昇と温度上昇との間の関係を実証した。しかし、この上昇温度の期間は、採血手順自体により影響を受けたことが示された。屠殺した時点、採取の１週間後に血液中で細菌は見られなかった、これは、初期全身感染が排除されたことを示唆した。
器官中の細菌数はまた陰性の結果を示した。このことは、モデル全身感染の排除を確認している。図５を参照のこと。これは、バクテリオファージを導入しなかった場合に屠殺した際に相当量の細菌が見られたモデルとは、対照的であった。
倒立顕微鏡を用いた寒天重層上に生成されたプラークの分析は、ナイロンビーズの存在を示さなかった。したがって、単離したバクテリオファージは遊離したものであり、最初の固定化用量ではなかったと結論付けられた。
我々は、処理動物とコントロール動物との間の細菌計数を比較した。図６を参照のこと。
我々は、１１日にわたって細菌数を測定した。図７を参照のこと。試験動物（Ｃ４〜Ｃ１０）は、最初の２日間において細菌数の最初の上昇を示した。しかし、これらの形状（figures）は迅速に下降し、続く数日以内に激減した。この傾向は全ての動物において同様であった。これと異なり、コントロール動物では連続した割合の細菌増殖が見られた。
我々は、種々の器官においてバクテリオファージ数を測定した。表１を参照のこと。結果は、バクテリオファージのものよりも全ての器官において細菌数が顕著に低かったことを示した。高い数の遊離バクテリオファージが動物体内の細菌感染から生じたに違いない。全器官中のそれらの存在は、マイクロスフェアまたは遊離バクテリオファージが体中を行き渡ることができることを実証した。
本発明のこの実施例の実験では、文献で報告された実験に用いられた「遊離」バクテリオファージ（１０９バクテリオファージがしばしば用いられる）と比較して、相対的に低い用量の固定化バクテリオファージを用いた（１００）。バクテリオファージ数の上昇が細菌のほとんどが排除されるレベルになる前、細菌数が増大するように、約１０６の細菌によりモデル感染を誘導した。こういうわけで、接種から１２〜２４時間後まで細菌数が増加し続けた。動態は複雑である。細菌は指数関数的に増大するが、免疫系による食作用を受け、またバクテリオファージにより感染されて破壊される。「遊離」バクテリオファージもまた（先行技術のように）免疫系により除去され、本発明のようなマイクロビーズ上固定化バクテリオファージはここに示す通り、循環系から脾臓および肝臓に移動し、そこで活性なままである（本明細書中の他のデータおよび結果を参照のこと）。
結果は、以下を示した：
・ナイロンマイクロスフェア（５μｍ直径）は、動物に対して自明な有害作用を生じなかった。
・この用量における固定化バクテリオファージは、測定可能な有害作用を生じなかった。
・固定化バクテリオファージはインビボで細菌に感染した。
・低用量の固定化バクテリオファージは、モデルにおける細菌感染を排除した。
・遊離バクテリオファージは固定化バクテリオファージでの初期感染から生じ、そして初期感染を生じない固定化バクテリオファージは活性なままであった。
・コロナ処理および化学処理の両方のマイクロビーズとも、等しく活性であった。
実施例５−バクテリオファージおよび抗生物質を含む製剤
我々は、（１）アンピシリン、（２）バクテリオファージＫが共有結合で表面に結合したナイロン１２粒子および（３）両方が共投与される製剤を、黄色ブドウ球菌８５８８に対する有効性について試験した。
図８は、バクテリオファージＫがＭＩＣ濃度に近いアンピシリンの存在により影響を受けなかったことを示す。
データは、アンピシリンが黄色ブドウ球菌の８５８８株を殺菌し得たことを示した。この細菌株に対するアンピシリンのＭＩＣは０．０２ｍｇ／ｍｌ（２０μｇ／ｍｌ）であると判明した。これは、この株が耐性株（「ＭＲＳＡ」）（ＭＩＣブレークポイント０．１２５μｇ／ｍｌ）であることを示した。ＭＩＣを上回る処理の吸光度読み取り値は、ミューラーヒントン培地単独の陰性コントロールに類似しており、細菌増殖がないことを示した。
図９は、ファージＫがあらゆる濃度で細菌８５８８を殺菌したことを示す。ファージＫ処理ウェルの吸光度読み取り値は、陰性コントロールのミューラーヒントン培地単独に類似していた。
図１０中のデータは、０．０１ｍｇ／ｍｌ（ＭＩＣ以下）のアンピシリンと黄色ブドウ球菌８５８８のバクテリオファージ溶菌との間に相互作用がないことを示した。アンピシリン値（ａｍｐ）は、図８に示すものに類似した実験由来である。０．０１ｍｇ／ｍｌアンピシリン（ＭＩＣ以下）では、アンピシリンは、細菌増殖に対して幾分かの効果を有するが、耐性細菌が生存するので全体的に有効というわけではない。ファージの添加は全体的な殺菌を生じ、これは、ファージが、抗生物質のＭＩＣ以下の用量で生存した耐性細菌を殺菌することを示している。これは、出現した（そして抗生物質での処理のみの場合に生存し得た）耐性細菌株が、組み合わせ治療によって殺菌され得ることを示した。したがって、このモデルにおいて抗生物質および固定化ファージの共投与が細菌の殺菌に有効であった。
実施例６−粒子上ファージの投与に対するインビボ応答
Ｐ３８８．Ｄ１細胞（マウスリンパマクロファージ細胞）を（ｉ）５ミクロンナイロンビーズ、（ｉｉ）１００マイクロリットルの遊離ファージ、（ｉｉｉ）ファージが共有結合した５ミクロンビーズ、および（ｉｖ）コントロールで刺激した。定期的に試料を採取し、そしてＥＬＩＳＡを用いてＩＬ−１αレベルを測定した。図１１を参照のこと。
刺激３時間後にＩＬ−１αのわずかな増加が見られたが、刺激２４時間にはなんの効果もなかった。これらの結果は、共有結合にて固定化されたファージはこのモデルにおいて免疫応答を誘導しなかったことを示した。
実施例７−血清中の固定化バクテリオファージの生存
以前の研究（Donlan R.M. (2006) Controlling clinically relevant biofilms using bacteriophage Biofilm Perspectives No. 2006:02. www.BiofilmsOnline.com、ならびにSokoloff A., Bock I., Zhang G., Sebestyen M.,およびWolff J. (2000) The interaction of peptides with the innate immune system studied with the use of T7 phage peptide display. Molecular Therapy 2, 131-139）は、ファージが、血清と接触後３７℃でインキュベートした３分後に不活性化されたことを示した。
縫合糸に共有結合したバクテリオファージが同じ効果を示したかどうかを解明するように、実験を設計した。
遊離ファージおよび縫合糸上ファージを血清（「通常」および熱不活性化された）と合わせ、３７℃でインキュベートし、ＰＦＵ活性の保持について一定の間隔で試験した（以下の結果を参照のこと）。
結果
図１２および１３に言及すると、血清の存在下１０分後、遊離ファージのファージ価はその後急速に減少したことが分かった。熱処理血清（補体が不活性化された）では、損失は生じなかった。別に、固定化ファージは（通常）血清に対して耐性であった−このファージ価は、実験の全体を通じて安定なままであった。これは、非処理血清の抗バクテリオファージ活性が免疫ベースであることを示した。
実施例８
固定化ファージに対するＩｇＭおよびＩｇＧ抗体の産生の分析
我々は、５ミクロンナイロン粒子上に共有結合にて固定化したファージの投与に対するラットの抗体応答を調べた。心穿刺により血液試料を採取し、これらの試料からの血清をＥＬＩＳＡ試験に供し、抗体応答が検出され得たかどうかを決定した。
ＥＬＩＳＡによるＩｇＧおよびＩｇＭの測定
酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）を用いて、実験ラットにおいて、血清がバクテリオファージ９５６３に対する抗体のレベルを含んだかどうかを決定した。
実験を以下の方法によって行った：屠殺したラットから血液を採集し、１３，０００ｒｐｍにて１０分間遠心分離し、得られた血清を採集し−２０℃にて保存した。新鮮な二倍強度コーティング緩衝液（１００μｌ）を、精製バクテリオファージ（１００μｌ）を有する９６ウェルマイクロタイタープレート（Greiner Bio-One, Germany）の各ウェルに、それらをマイクロプレートに固定化するために添加した。ＰＢＳ（１００μｌ）をコントロールウェルに添加し、プレートを４℃で一晩、または３７℃で２時間放置した。残存した液をチップで排出し、プレートを３回ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ（Fisher Scientific, Leicestershire, UK）で十分に洗浄した。プレートを、ウェル内に液が残存しなくなるまでペーパータオル上に反復してタップした。ＰＢＳ−ＢＳＡ（１０ｍｇ／ｍｌ）（２００μｌ）を３７℃で０．５時間、各ウェルに添加し、非特異的結合部位をブロックした。残存した液をチップで排出し、プレートを３回ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで十分に洗浄し、その後１００μｌの血清を添加し、湿潤環境を作るために濡れたティッシュペーパーを入れた密封した箱内で、室温で２時間インキュベートした。インキュベーション後、残存した液をチップで排出し、プレートを３回ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで十分に洗浄した。
洗浄後、ＨＲＰ−マウス抗ラットＩｇＭまたはＩｇＧ（Invitrogen, Paisley, UK）のいずれかの第二抗体の１０００分の１希釈液１００μｌを添加し、プレートを室温で１時間、または３７℃で３０〜４０分インキュベートした。残存した液をチップで排出し、プレートを３回ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで洗浄した。酢酸クエン酸緩衝液（５．２．１．）中テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）（１５０μｌ）（Sigma, Aldrich, UK）を各ウェルに添加し、反応混合物が青色になるまで暗所内でプレートを室温で３０〜４０分間インキュベートした。反応を４ＭのＨ２ＳＯ４（５０μｌ）を添加することにより停止させ、その色を黄色に変化させた。吸光度をプレートリーダー（Labsystems iEMS Reader MF, Finland）を用いて４５０ｎｍで読み取った。結果をコントロール血液試料（ラットにファージを追加投与しなかった）に対して比較した。
結果
以下の表は、ＩｇＭおよびＩｇＧについて別々に結果を示す。両場合において、抗体産生において統計学的有意差はなかった。したがって、固定化ファージの刺激は、試験したラットにおいて抗ファージ抗体の産生を生じなかった。
結果は、固定化バクテリオファージが、免疫原性が低かった、すなわち、ＩｇＧまたはＩｇＭの免疫応答がなかったことを示した。ナイロンビーズに共有結合したファージを用いて、本発明者らによって繰り返し引き続き行った実験は全て、ラットモデルにおける固定化ファージに対する検出可能な抗体応答がないことを一貫して示した。
実施例９−インビボ曝露後のファージ活性
ファージＫが共有結合にて固定化された縫合糸を調製し、使用した（ＷＯ２０１２／１７５７４９の実施例６と同様に）。１４日目に、縫合糸を取り出し、洗浄し、それらの活性を調べた。
結果
図１４に示すように、２週間後に取り出した縫合糸はファージ活性を保持した（従来のプラーク形成アッセイにより測定）。固定化ファージは、抗体により不活性化されていなかった。
実施例１０−固定化ファージのインビボ保持
実施例４と同様に処理したラット由来の肝臓試料を、５ミクロンマイクロスフェアの投与の１４日後に分析した。
結果
図１５に示すように、全身投与１４日後の肝臓において、マイクロスフェア（引き続き、活性ファージを保有することを確認した）が検出可能であった（矢印を参照のこと）。
実施例１１−ヒト皮膚におけるアクネ菌の治療
ヒト皮膚における感染症の治療に対する粒子上固定化バクテリオファージの有効性を評価するために、小研究を行って、バクテリオファージを含有するクリームが皮膚における細菌量を減少させるかどうかについて測定した。
有志のヒト皮膚をアルコールで拭き取り、そして１×１０４ｃｆｕ／ｍｌのアクネ菌（ＡＴＣＣ６９１９）を接種した。これを空気乾燥し、次いで以下で処理した：
１．Ｅ４５クリーム、
２．１×１０５ｐｆｕ／ｇのバクテリオファージを有するＥ４５クリーム、または
３．約１０ミクロンの直径のナイロン１２ビーズ上に固定化された１×１０５ｐｆｕ／ｇのバクテリオファージを有するＥ４５クリーム。
異なる時点で、拭き取りをして、皮膚上の細菌量をモニタリングした。
結果を図１６に示す。示されるように、本研究において、クリーム基剤中の固定化バクテリオファージは、遊離ファージよりも有効であり、さらに他のコントロール（クリーム単独）よりも有効であった。
実施例１２−皮膚感染症のためのモデルとしてのブタ皮膚
本発明によるヒト皮膚感染症とその治療のためのモデルとしてブタ皮膚を使用するために、以下のプロトコルを開発した。
バクテリオファージの固定化
予め単離したバクテリオファージを、座瘡治療製品に取り込まれ得るナイロンビーズ上に固定化する；１０ミクロンのナイロンビーズ、化粧品グレードを使用（出願人による先の公開研究（例えば、ＷＯ２００７／０７２０４９）に以前記載されているように）。
システムプロトコル
ナイロンビーズは、座瘡治療品およびクリーム内に取り込まれるナノ粒子にバクテリオファージを固定化するためのモデルシステムとして作用する。
各々の処理された材料を、細菌増殖の阻害について試験する。効果を、固定化されていないバクテリオファージに曝した材料および材料単独と比較する。実験は複数の試験を含み、そして阻害効果がもはや観察されなくなるまで試験を継続する。
完了時、細菌増殖の制御について固定化バクテリオファージの効能および固定化バクテリオファージの保存期間を材料毎に測定する。
固定化バクテリオファージを用いる皮膚感染症の治療
以下のようにブタ皮膚を調製し、かつ接種する。
新しいブタ皮膚を無菌下で取り扱う。皮膚を７０％アルコールで拭き取って、夾雑細菌を除去する。
一旦乾燥し、皮膚に１×１０４ｃｆｕ／ｃｍ２の濃度まで意図した細菌株を夾雑させる。滅菌綿棒を用いて細菌溶液を皮膚に塗り付け、１５分間層流フード内で空気乾燥する。所望のバクテリオファージ処理を行う（バクテリオファージが上記のように固定化されたビーズを使用し、次いで皮膚を３７℃にて１６時間インキュベートする）。
ブタ皮膚を、選択培地上で夾雑細菌についてアッセイする。細菌の計数を、処理が成功したかどうかを決定するために、接種後に行う。
実施例１３−モデルブタ皮膚における座瘡治療の有効性
上記ブタ皮膚モデルを使用して、座瘡治療について固定化バクテリオファージの投与の有効性を示した。
ブタ皮膚を接種するために使用した宿主細菌は黄色ブドウ球菌８５８８であり、そしてこの細菌に感染させるために使用したバクテリオファージはファージＫであった。
ファージＫを直径１０ミクロンのナイロンビーズ上に固定化した；１×１０７ｐｆｕ／ｍｌのバクテリオファージを１ｇの１０ミクロンビーズ上に固定化した。
ブタ皮膚に上記のように黄色ブドウ球菌を接種した。また上記のように、ブタ皮膚（４ｃｍ×４ｃｍ）をＥ４５基剤クリーム（１ｍｌ）および約１×１０４ｐｆｕのビーズで処理した。
この試験の結果を表４に示す。この結果は、皮膚試験試料における細菌数が固定化バクテリオファージを含有するクリームの適用によって首尾良く減少したことを示す。
したがって、本発明は局所性および全身性細菌感染症の治療のための組成物および方法を提供する。

Claims (19)

  1. 以下の局所治療に使用するための、キャリア粒子に共有結合したバクテリオファージを含む製品：
    （１）座瘡；
    （２）膿痂疹（例えば、黄色ブドウ球菌および／または化膿レンサ球菌により引き起こされる）；
    （３）毛包炎、フルンケル症、またはカルブンケル症（例えば、黄色ブドウ球菌または緑膿菌により引き起こされる）；
    （４）膿瘡（例えば、黄色ブドウ球菌または化膿レンサ球菌により引き起こされる）； （５）丹毒または蜂巣炎（例えば、Ａ群β溶血性ストレプトコッカス（丹毒）、黄色ブドウ球菌（蜂巣炎）または化膿レンサ球菌により引き起こされる）；あるいは
    （６）体臭。
  2. 前記キャリア粒子が略球状であり、そして２０ミクロンまでの平均直径を有する、請求項１に記載の使用のためのバクテリオファージを含む製品。
  3. 前記キャリア粒子が略球状であり、そして０．１ミクロンから１５ミクロンの平均直径を有する、請求項１に記載の使用のためのバクテリオファージを含む製品。
  4. 前記キャリア粒子が略球状であり、そして０．５ミクロンから１０ミクロンの平均直径を有する、請求項１に記載の使用のためのバクテリオファージを含む製品。
  5. サリチル酸を含まず、かつ過酸化ベンゾイルを含まない、請求項１に記載の座瘡の治療に使用のためのバクテリオファージを含む製品。
  6. 請求項１から５のいずれかに記載の使用のための、キャリア粒子に共有結合した、細菌の３つまたはそれより多くの株に対して活性な複数のバクテリオファージを含む製品。
  7. 以下の治療のための、キャリア粒子に共有結合したバクテリオファージと薬学的に受容可能なキャリアまたは賦形剤とを含む、局所製剤：
    （１）座瘡；
    （２）膿痂疹（例えば、黄色ブドウ球菌および／または化膿レンサ球菌により引き起こされる）；
    （３）毛包炎、フルンケル症、またはカルブンケル症（例えば、黄色ブドウ球菌または緑膿菌により引き起こされる）；
    （４）膿瘡（例えば、黄色ブドウ球菌または化膿レンサ球菌により引き起こされる）； （５）丹毒または蜂巣炎（例えば、Ａ群β溶血性ストレプトコッカス（丹毒）、黄色ブドウ球菌（蜂巣炎）または化膿レンサ球菌により引き起こされる）；あるいは
    （６）体臭。
  8. ゲル、クリームまたはローションの形態である、請求項７に記載の局所製剤。
  9. ゲル形成剤、
    クリーム形成剤、
    ワックス、
    オイル、
    界面活性剤、および
    結合剤、
    の１つまたはそれより多く、あるいはすべてを含む、請求項８に記載の局所製剤。
  10. ２０ミクロンまでの平均直径を有する粒子を含む、請求項７から９のいずれかに記載の局所製剤。
  11. ０．１ミクロンから１５ミクロンまでの平均直径を有する粒子を含む、請求項７から９のいずれかに記載の局所製剤。
  12. ０．５ミクロンから１０ミクロンまでの平均直径を有する粒子を含む、請求項７から９のいずれかに記載の局所製剤。
  13. ２０ミクロンまでの平均直径を有するキャリア粒子に共有結合したアクネ菌に対して溶解性のバクテリオファージを含む、請求項７から１２のいずれかに記載のクリームまたはゲル。
  14. 前記キャリア粒子に共有結合したアクネ菌の少なくとも３つの異なる株に対して溶解性のバクテリオファージを含む、請求項１３に記載のクリームまたはゲル。
  15. 前記キャリア粒子に共有結合したアクネ菌の少なくとも５つの異なる株に対して溶解性のバクテリオファージを含む、請求項１３に記載のクリームまたはゲル。
  16. ２０ミクロンまでの平均直径を有するキャリア粒子に共有結合した黄色ブドウ球菌に対して溶解性のバクテリオファージを含む、請求項７から１２のいずれかに記載のクリームまたはゲル。
  17. 前記キャリア粒子に共有結合した黄色ブドウ球菌の少なくとも３つの異なる株に対して溶解性のバクテリオファージを含む、請求項１６に記載のクリームまたはゲル。
  18. 前記キャリア粒子に共有結合した黄色ブドウ球菌の少なくとも５つの異なる株に対して溶解性のバクテリオファージを含む、請求項１６に記載のクリームまたはゲル。
  19. 以下の治療用医薬の製造のための、請求項１から１８のいずれかに記載の製品または製剤の使用：
    （１）座瘡；
    （２）膿痂疹（例えば、黄色ブドウ球菌および／または化膿レンサ球菌により引き起こされる）；
    （３）毛包炎、フルンケル症、またはカルブンケル症（例えば、黄色ブドウ球菌または緑膿菌により引き起こされる）；
    （４）膿瘡（例えば、黄色ブドウ球菌または化膿レンサ球菌により引き起こされる）； （５）丹毒または蜂巣炎（例えば、Ａ群β溶血性ストレプトコッカス（丹毒）、黄色ブドウ球菌（蜂巣炎）または化膿レンサ球菌により引き起こされる）；あるいは
    （６）体臭。
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