ES2632367T3

ES2632367T3 - Composiciones antibacterianas

Info

Publication number: ES2632367T3
Application number: ES08806507.3T
Authority: ES
Inventors: Ying Jia
Original assignee: Ampliphi Biosciences Corp
Current assignee: Ampliphi Biosciences Corp
Priority date: 2007-10-04
Filing date: 2008-10-03
Publication date: 2017-09-12
Anticipated expiration: 2028-10-03
Also published as: US20110182863A1; CA2700646C; JP6053727B2; JP2011501740A; AU2008306626A1; CN101835384A; US20150216179A1; EP2197284B1; JP2015007087A; AU2008306626B2; CA2700646A1; CN101835384B; WO2009044163A3; WO2009044163A2; EP2197284A2

Abstract

Un procedimiento para matar bacterias sobre una superficie que es un equipo médico, ropa de cama, muebles, paredes o suelos en un hospital que comprende aplicar a la superficie una composición desinfectante que comprende un vehículo y dos o más fagos, comprendiendo los fagos el fago K o mutantes del mismo, y el fago P68 o mutantes del mismo, caracterizado porque la concentración de ambos fagos es de al menos 5:1 ufp de fagos:ufc de bacterias para inducir la lisis externa de las bacterias para las que el fago es un patógeno cuando dichas bacterias están presentes sobre la superficie a desinfectar.

Description

DESCRIPCION

Composiciones antibacterianas

5 [0001] Se describen en el presente documento formulaciones que comprenden bacteriofagos ("fagos") y

metodos para tratar infecciones bacterianas, o desinfectar superficies, usando altas concentraciones de bacteriofago y/o formulaciones que contienen fago K y/o P68. La invencion hace uso del fenomeno conocido como "lisis externa".

[0002] Se conocen bien agentes antibacterianos, en forma de antibioticos de base qulmica (es decir, agentes 10 no vlricos), tales como penicilina o tetraciclina. El problema con dichos antibioticos es que la resistencia contra ellos

es cada vez mas comun. Las mutaciones que confieren resistencia a los antibioticos, o los genes que codifican las enzimas con resistencia a los antibioticos, tales como las penicilinasas, son cada vez mas comunes en las bacterias patogenas en todo el mundo. Las bacterias Staphylococcus atreus resistentes a la meticilina (MRSA), por ejemplo, son una forma cada vez mas comun de infeccion, a menudo adquirida durante la cirugla para otras causas en los 15 hospitales. Las infecciones por MRSA son extremadamente diflciles de tratar con antibioticos convencionales.

[0003] Un enfoque alternativo para tratar las infecciones bacterianas es infectar las bacterias con un virus, conocido como bacteriofagos. Dicha "terapia de bacteriofago" se desarrollo por primera vez a principios del siglo XX, pero ha sido poco utilizada en Occidente desde el advenimiento de los antibioticos en la decada de 1940. Se ha

20 realizado un trabajo mas extenso en Europa del Este.

[0004] Los bacteriofagos (tambien conocidos como "fagos") son especlficos de tipos especlficos de celulas bacterianas. No pueden infectar las celulas de organismos mas complejos debido a las principales diferencias en la maquinaria intracelular clave, as! como en los componentes de la superficie celular. La mayorla de bacteriofagos

25 tienen estructuras, tales como fibras de cola, que permiten a los bacteriofagos unirse a moleculas especlficas en la superficie de sus bacterias diana. El ADN vlrico dentro de los bacteriofagos, o ARN en algunos bacteriofagos, se inyecta a continuacion, normalmente a traves de la cola, en la celula huesped, que entonces dirige la produccion del bacteriofago de la progenie.

30 [0005] Se encuentran diferentes tipos de bacteriofagos que infectan diferentes bacterias. Convencionalmente,

pueden aislarse del entorno en el que crece la bacteria particular, por ejemplo de aguas residuales o heces. La presencia de un bacteriofago en una muestra puede determinarse pasando la muestra a traves de un filtro con poros lo suficientemente pequenos para evitar que las bacterias pasen a traves del filtro. El extracto filtrado se mezcla usualmente con medio de crecimiento, se anaden bacterias huesped adecuadas, y despues se esparce sobre, por 35 ejemplo, una placa de agar. La presencia de manchas claras, denominadas placas, en el cesped resultante de bacterias, indica la presencia de uno o mas bacteriofagos, que causan la lisis de las bacterias.

[0006] Los bacteriofagos que solo pueden matar bacterias se conocen como bacteriofagos "obligatoriamente llticos". Existen bacteriofagos obligatoriamente llticos fuera de la celula bacteriana en forma de material de acido

40 nucleico, usualmente ADN, rodeado por un revestimiento proteico. La capa proteica suele tener una o mas moleculas unidas a ella que permiten a los bacteriofagos unirse a moleculas especlficas en la superficie de las bacterias. Al unirse a la bacteria el ADN gana entrada en el huesped bacteriano donde se transcribe y se traduce en diversas protelnas necesarias para la replicacion y el ensamblaje de nuevos bacteriofagos. El aDn tambien se replica y se envasa en nuevos bacteriofagos que se liberan tras la lisis de la celula bacteriana.

45

[0007] Ademas de bacteriofagos obligatoriamente llticos hay bacteriofagos lisogenicos o temperados. Estos bacteriofagos temperados tienen dos ciclos de vida, uno en el que lisan la celula infectada, y el otro en el que entran en el estado de profago. Los bacteriofagos obligatoriamente llticos siempre tienen que infectar desde el exterior, reprogramar la celula huesped y liberar una rafaga de bacteriofago a traves de la ruptura o la lisis de la celula

50 infectada. Los bacteriofagos "temperados" pueden integrar su ADN en el ADN bacteriano huesped, lo que conduce a una asociacion virtualmente permanente como profago dentro de una bacteria especlfica y su progenie. Algunos profagos no se integran flsicamente en el cromosoma, sino que existen como un replicon autonomo. El profago dirige la slntesis de un represor que bloquea la expresion de sus propios genes y tambien los de cualquier bacteriofago temperado estrechamente relacionado. Ocasionalmente, el profago puede escapar a la regulacion por 55 su represor. El ADN del profago puede entonces ser cortado del genoma por recombinacion especlfica del sitio, replicarse, y la progenie puede liberarse de la celula huesped, en la mayorla de los casos por lisis.

[0008] Se han utilizado bacteriofagos obligatoriamente llticos para tratar infecciones bacterianas. Se han aplicado bacteriofagos obligatoriamente llticos aislados a las heridas o se han inyectado por via intravenosa donde

matan bacterias. La ventaja de los bacteriofagos es que se auto-replican, con tan solo un centenar mas o menos de bacteriofagos que pueden matar hasta cien millones de bacterias. Los bacteriofagos simplemente se replican matando bacterias hasta que las han eliminado del individuo o del entorno. El documento WO 01/51066, por ejemplo, describe un procedimiento para tratar un paciente con uno o mas bacteriofagos obligatoriamente llticos. De 5 forma similar, el documento US 4.957.686 describe un procedimiento para tratar caries dentales con bacteriofago.

[0009] Un posible problema con el uso de bacteriofagos ha sido que el propio cuerpo del paciente tendra a

menudo una respuesta inmune contra los bacteriofagos y eliminara los bacteriofagos de la sangre. Los documentos US 5.660.812, Us 5.688.501 y US 5.766.892 muestran metodos de selection de bacteriofagos para mejorar la 10 semivida de bacteriofago dentro de la sangre de un paciente a tratar. El documento US 5.811.093 analiza la seleccion de un gen modificado que codifica una de las protelnas de capside (recubrimiento) (capside E) de manera que los bacteriofagos sobrevivan en el sistema circulatorio de un animal durante mas tiempo. En el caso de esta ultima patente, la modification se identifico como una mutation puntual dentro de un gen.

15 [0010] El documento WO 01/50872 A2 describe un procedimiento para la higienizacion de productos que

utilizan bacteriofagos.

[0011] Soothill (1999) Burns, Vol. 20, N.° 3, 209-211 describe que la infection de injertos de piel dividida en cobayas por Pseudomonas aeruginosa 3719 los destruye, y el bacteriofago BS24, lltico para la cepa 3719, protege

20 los injertos.

[0012] Un problema asociado a los usos de la tecnica anterior para desinfectar o tratar contaminantes o enfermedades bacterianas es que los fagos son a menudo cepas bacterianas especlficas. La presencia, por ejemplo, de un profago dentro de una bacteria puede bloquear la expresion de genes de un fago infeccioso, evitando

25 as! la replication del fago infeccioso e impidiendo la lisis y la muerte de la bacteria. Un profago tambien puede causar la destruction del ADN del fago entrante.

[0013] Esto ha significado previamente que el fago necesita ser emparejado a la bacteria, requiriendo a menudo un analisis genetico complicado de la bacteria, o ha de usarse un numero de fagos diferente en

30 combination. La production de paneles de diferentes fagos, tales como paneles de mutantes vir derivados de bacteriofagos temperados, se describe en el documento WO 03/080823.

[0014] El fenomeno conocido como "lisis externa" se conoce desde finales de la decada de 1930 y principios de la de 1940. Delbruck M. (J. Gen. Physiol., (1940), paginas 643-660) analiza dos conceptos: "lisis interna" y "lisis

35 externa".

[0015] La "lisis interna" es cuando las celulas bacterianas se infectan con el fago, el fago se multiplica dentro de las celulas, y las celulas se lisan, liberando nuevos fagos y matando a las bacterias. Este es el proceso normalmente usado por el fago obligatoriamente lltico. Por otro lado, la "lisis externa" no implica la replicacion de

40 fagos dentro de las celulas bacterianas. Delbruck observo que los fagos se adsorbieron por las celulas bacterianas, pero no se liberaron los fagos de la progenie. Esto dio lugar a la deformation de celulas bacterianas en cuerpos esfericos y la muerte de las bacterias por lisis. Se observo que se requerlan altas concentraciones de fago por encima de un valor umbral para inducir este fenomeno.

45 [0016] Ahora sabemos que esto se debe, al menos en parte, a la digestion de la pared celular bacteriana por

las enzimas presentes en forma soluble o unidas a partlculas de fago (Stent. G.S., Molecular Biology of Bacterial Particles, W.H. Freeman & Co. (1963), paginas 71-87). Se ha llevado a cabo una gran cantidad de trabajo para aislar y caracterizar las enzimas de lisis conocidas como "lisinas". Las lisinas tambien se conocen como murelna hidrolasas.

50

[0017] Ralston D.J., et al. (J. Gen. Physiol. (1957), 41(2): 343-358), por ejemplo, estudiaron la action del fago y la virolisina sobre las bacterias. La virolisina se ha obtenido a partir de lisados de celulas infectadas con fagos. El mismo grupo continuo informando sobre el fenomeno. En 1964 informaron que la lisis externa parecla requerir sensibilization por los fagos, seguida por la digestion de la pared por la lisina (Ralston D., et al., J. Bacteriol. (1964),

55 88: 676-681).

[0018] El uso de lisinas aisladas se ha enfocado por la comunidad cientlfica como que tiene aplicaciones terapeuticas potenciales. Tambien se han investigado otras enzimas y protelnas asociadas a lisis aislada, tales como holinas. Las holinas estan implicadas en la permeabilizacion de las membranas celulares.

[0019] Por ejemplo, Nelson D., et al. (PNAS, (2001), 98: 4107-4112) describen el uso de lisinas purificadas para tratar infecciones bacterianas. El grupo fue capaz de tratar las infecciones estreptococicas en el tracto respiratorio superior usando lisina purificada introducida por via oral. Los documentos WO 01/19391 y US

5 2002/0094319 tambien describen el uso de enzimas obligatoriamente llticas purificadas, tal como lisina.

[0020] Staplylococcus aureus resistente a meticilina (MRSA) puede causar infecciones sistemicas o abscesos y ulceras, especialmente en pacientes enfermos, ancianos o inmunocomprometidos. Es cada vez mas una causa principal, o contribucion, de muerte en los hospitales. MRSA puede residir en la cavidad nasal de los medicos o

10 visitantes sin ningun slntoma evidente de la enfermedad. Sin embargo, las bacterias pueden propagarse de persona a persona, incluyendo a los pacientes. Por consiguiente, matar las bacterias ayuda a prevenir la enfermedad.

[0021] Se proporciona un posible enfoque en el documento WO 03/080823, usando un panel de bacteriofagos. Sin embargo, hay muchas cepas diferentes de MRSA. Por lo tanto, el panel no puede matar a todos

15 los MRSA por la infeccion obligatoriamente lltica de las bacterias. El inventor ha comprendido ahora que proporcionar fagos en concentraciones suficientemente altas para inducir la lisis externa proporciona una forma de matar rapidamente bacterias sin tener que infectar las bacterias para causar lisis interna. Esto amplla el numero de cepas que pueden ser tratadas con fagos, al mismo tiempo que permite la lisis interna en cepas susceptibles de fagos.

20

[0022] Otras bacterias, tales como Clostridium difficile (C difficile), tambien se estan convirtiendo en problematicas en los hospitales y se propagan por contacto con otros pacientes, trabajadores sanitarios o visitantes, o del entorno circundante.

25 [0023] Actualmente, los hospitales utilizan lavados de manos con alcohol para ayudar a prevenir la

transmision de MRSA. Sin embargo, tales lavados alcoholicos a menudo no son adecuados para su uso en el revestimiento sensible de la cavidad nasal o areas rotas de la piel. Por lo tanto, existe la necesidad de producir una composition adecuada para matar bacterias, tales como MRSA o C. difficile.

30 [0024] Los inventores han identificado inesperadamente que la aplicacion de la lisis externa permite que se

produzca una formulation mas sencilla y rentable. La lisis externa proporciona una manera de matar rapidamente las bacterias. Permite la muerte de bacterias resistentes a los antibioticos sin la necesidad de antibioticos o productos qulmicos daninos o irritantes. Ademas, la utilization de fagos enteros tiene la ventaja de que, si el fago es capaz de infectar bacterias, a traves de lisis interna, entonces las formulaciones pueden tener un modo dual de ataque; tanto 35 la muerte por lisis externa como, incluso si la concentration de la formulacion se diluye por los fluidos corporales tal como el moco, por la lisis interna.

[0025] Ademas, se ha encontrado que los fagos utilizados por el inventor, el fago K y el fago P68 juntos tienen actividad contra una amplia gama de cepas bacterianas y tienen beneficios adicionales descritos mas

40 adelante.

[0026] El fago K se ha caracterizado previamente como un fago anti-MRSA. O'Flaherty S.O., et al., (Appl. Environ. Microbiol. (2005), 71(4): 1836-1842) estudiaron el fago K en diferentes cepas resistentes a farmacos de S. aureus. El fago P68 se estudio, por ejemplo, por Takac M. y Blasi U. (Antimicrob. Agents and Chemo, (2005): 293445 2940). Los inventores han encontrado que el espectro de cepas de MRSA que los fagos K y/o P68 infectan se

complementa entre si, haciendo que la combination de las dos cepas sea especialmente adecuada para su uso en combinaciones anti-MRSA.

[0027] El fago K tiene una ventaja adicional. Aunque las paredes de las bacterias Gram negativas estan 50 compuestas principalmente por peptidoglicano, las bacterias Gram positivas contienen, ademas, grandes cantidades

de acido teicoico, un pollmero de fosfato de poliol anionico. Se sabe desde la decada de 1970 que los mutantes de S. aureus que son resistentes al fago K carecen de acido ribitol teicoico. (Shaw D.R.D. et al (1970) J. Biol. Chem. 245 (19) 5101-5106). El fago K se une a las celulas bacterianas a traves del acido teicoico. Se ha encontrado que la falta de acidos teicoicos de pared reduce las interacciones con las celulas endoteliales, siendo necesario el acido 55 teicoico para la union a las celulas nasales (Weidenmaier C et al In. J. Medical Microbiol (2008) 298, 505-513). Por lo tanto, si el acido teicoico esta presente, el fago K debe unirse a la bacteria. Si la bacteria muta para ser resistente al fago K mediante la reduction del acido teicoico en la pared celular, entonces esto deberla reducir la capacidad de la bacteria para unirse a las celulas nasales. Esto deberla ayudar a reducir la virulencia de cualquier bacteria que se mantenga despues del tratamiento con el fago K.

[0028] La experimentacion por parte de los inventores tambien ha encontrado que, por ejemplo, el fago K y sus derivados de cambio en el intervalo de huespedes a altas concentraciones, todavia pueden matar S-aureus, incluso si mutan para ser resistentes a la infeccion obligatoriamente litica.

5

[0029] Un primer aspecto de la invencion proporciona un procedimiento para matar bacterias sobre una superficie que es un equipo medico, ropa de cama, muebles, paredes o suelos en un hospital que comprende aplicar a la superficie una composition desinfectante que comprende un vehiculo y dos o mas fagos, comprendiendo los fagos el fago K o mutantes del mismo, y el fago P68 o mutantes del mismo caracterizado por que la concentration

10 de ambos fagos es de al menos 5:1 ufp de fagos:ufc de bacterias para inducir la lisis externa de las bacterias para las que el fago es un patogeno cuando dichas bacterias estan presentes sobre la superficie a desinfectar.

[0030] La concentracion de fagos necesaria para causar la lisis externa puede determinarse experimentalmente, por ejemplo, incubando celulas bacterianas a su temperatura normal de crecimiento con

15 diferentes concentraciones del fago y observando a que concentraciones de fagos las celulas bacterianas se lisan como se muestra por el cultivo que pierde turbidez.

[0031] El fago en la composicion sera normalmente de una especie particular predeterminada de bacteria. El termino "patogeno", como se usa en el presente documento, pretende significar que el fago es capaz de unirse

20 especificamente a la superficie de una especie de bacteria y, cuando esta a una alta concentracion, es capaz de inducir la lisis externa. El fago no necesita ser capaz de inducir lisis interna. Como se ha indicado anteriormente, la presencia de profagos diferentes dentro de diferentes cepas de la misma especie de bacteria significa que un fago particular puede o no inducir la lisis de la bacteria a traves del mecanismo de lisis interna. Sin embargo, el fago puede todavia unirse a la superficie de la bacteria y todavia puede inducir la lisis a traves del mecanismo de lisis 25 externa.

[0032] Preferentemente, la concentracion del fago es de al menos 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1, al menos 20: 1, 40: 1, 50: 1, al menos 100: 1 unidades formadoras de placa de fagos (ufp):unidades formadoras de colonias (ufc) de bacterias. Las unidades formadoras de placa de fagos se determinan sobre bacterias que son capaces de lisarse por

30 el fago a traves de lisis interna.

[0033] Se apreciara que la eficacia a la que diferentes tipos de fagos son capaces de inducir la lisis externa en diferentes bacterias variara de fago a fago. Las concentraciones requeridas para inducir tal fenomeno pueden determinarse mediante experimentacion rutinaria.

35

[0034] En el presente documento se describe que, potencialmente, podria tratarse cualquier superficie sobre la que se puede aplicar la composicion desinfectante para producir concentraciones suficientemente altas de fago para producir la lisis externa requerida. En un aspecto, la superficie es equipo medico, ropa de cama, muebles, paredes o suelos en un hospital. Como alternativa, la superficie a tratar es preferentemente la piel externa de un

40 mamifero, por ejemplo, la cavidad nasal o la superficie de una herida o corte en la superficie de un mamifero. Preferentemente, el mamifero es un ser humano.

[0035] La composicion desinfectante puede estar en forma de un lavado por pulverization o liquido para la superficie. La composicion puede ser un lavado de manos. Preferentemente, cuando la composicion es una

45 formulation para aplicacion topica, puede adoptar la forma de una locion, crema, unguento, pasta, gel, espuma o cualquier otra forma fisica como un vehiculo generalmente conocido para administration topica. Dichas formulaciones topicas espesadas son particularmente ventajosas porque las formulaciones se adhieren al area de la piel sobre la que se coloca el material, permitiendo asi que se introduzca una alta concentracion localizada de fago en la zona particular a desinfectar.

50

[0036] Por ejemplo, las cremas a base de parafina y lanolina, que son particularmente utiles para la aplicacion de producto a la cavidad nasal, son generalmente conocidas en la tecnica. Sin embargo, pueden usarse otros espesantes, tales como espesantes polimericos.

55 [0037] Las formulaciones tambien pueden comprender uno o mas de los siguientes: agua, conservantes,

tensioactivos activos, emulsionantes, antioxidantes o disolventes.

[0038] Se utilizan dos o mas fagos diferentes. Los revestimientos superficiales de diferentes cepas de, por

ejemplo, la misma especie de bacteria, a veces varian. Por lo tanto, con el fin de aumentar la probabilidad de que

una formulacion particular pueda inducir la lisis externa en la poblacion bacteriana de una especie particular sobre una superficie particular, es preferible utilizar dos o mas fagos diferentes capaces de infectar diferentes cepas de la misma especie de bacterias. Esto tambien aumenta la probabilidad de que la lisis interna tambien se pueda usar como un procedimiento secundario para matar bacterias en una superficie particular.

5

[0039] Se utilizan dos o mas tipos diferentes de fago, cada fago puede ser especlfico para una especie de

bacteria diferente. Esto permite utilizar una formulacion particular como control en situaciones en las que puede estar presente un numero de bacterias diferentes en una superficie particular.

10 [0040] Preferentemente, el fago es un patogeno de una bacteria seleccionada de Staphylococcus,

Helicobacter, Klebsiella, Listeria, Mycobacterium, Escherichia, Meningococcus, Campylobacter, Streptococcus, Enterococcus, Shigella, Pseudornonas, Burkholderia, Clostridium, Legionella, Acetinobacter, o Salmonella.

[0041] Preferentemente, el fago es un patogeno de Staphylococcus aureus, especialmente MRSA o C. 15 difficile.

[0042] De hecho, la combinacion de fago K y fago P68 o mutantes de los mismos, se usa en ambas concentraciones altas como se indica en las reivindicaciones, para inducir la lisis externa para cepas bacterianas que no permiten la multiplicacion del fago. El inventor ha encontrado que el uso del fago K en combinacion con el fago

20 P68 en una formulacion desinfectante permite infectar y matar una amplia gama de cepas de MRSA. Los intervalos de huesped del fago K y del fago P68 se complementan entre si.

[0043] Se describe en el presente documento una composition desinfectante para desinfectar una superficie que comprende un vehlculo, el fago K y/o el fago P68 o mutantes de los mismos.

25

[0044] El fago K o el fago P68 se utilizan en combinacion entre si y opcionalmente con otros fagos.

[0045] La composicion puede comprender tipos adicionales de fago, ademas del fago K y el fago P68.

30 [0046] Los mutantes del fago K o P68 pueden ser mutaciones puntuales, de deletion o de adicion. Pueden

cambiarse 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 bases en comparacion con la secuencia original del fago K o P68. Dichos

mutantes tienen preferentemente un intervalo de huesped alterado.

[0047] El fago K se analiza en detalle en el artlculo por O'Flaherty et al (J. Bacteriol. (2004) 2862-2871). Es

35 un fago polivalente con un genoma de ADN de 127.395 pb. Tlpicamente, el fago K carece sustancialmente de sitios GATC y GGNCC. Tlpicamente comprende una gran region del genoma que tiene homologla con el fago A511 de Listeria. El genoma tambien comprende tlpicamente intrones en funciones esenciales del fago, dos en el gen de la polimerasa y uno en el gen de la lisina.

40 [0048] La secuencia nucleotldica de P68 se muestra en el artlculo por Vybiral D. et al. (FEMS Microbiol. Lett

(2003), 219, 275-283). P68 comprende 18277 ob (Genbank n.° AF513033).

[0049] Preferentemente, la mutation del fago K o el fago P68 es al menos un 90 %, mucho mas preferentemente al menos un 92 %, 94 %, 96 %, 98 % o un 99 % con respecto a la secuencia nativa del fago.

45

[0050] El fago esta presente en concentraciones suficientemente altas para inducir la lisis externa como se ha descrito anteriormente.

[0051] La composicion puede ser para una aplicacion topica, por ejemplo, sobre la piel de un mamlfero, tal 50 como un ser humano. Por ejemplo, la piel puede ser la cavidad nasal o en una mano. Otras superficies pueden ser

como se ha definido anteriormente.

[0052] La forma de la composicion, los componentes de la composicion, y los usos pueden ser como se han definido anteriormente.

55

[0053] Los fagos especlficos para diferentes especies de bacterias, y de hecho diferentes cepas de bacterias, son generalmente conocidos en la tecnica. Se describe una composicion que comprende uno o mas fagos generalmente conocidos que son capaces de infectar MRSA incluyendo el o K y/o el o P68.

[0054] La invencion tambien proporciona una composicion desinfectante que comprende un vehlcuio y dos o mas fagos, comprendiendo ios fagos ei fago K o mutantes dei mismo, y ei fago P68 o mutantes dei mismo, caracterizada por que ia concentracion de ambos fagos es de ai menos 5:1 ufp de fagos:ufc de bacterias para inducir ia iisis externa de ias bacterias para ias que ei fago es un patogeno cuando dichas bacterias estan presentes sobre

5 una superficie a desinfectar para su uso en metodos para eiiminar bacterias sobre una superficie que comprende apiicar ia composicion desinfectante a ia superficie, en ia que ia superficie es ia piei de un mamlfero, tai como un ser humano. En particuiar, ia superficie puede ser ia cavidad nasai de un mamlfero, o ia piei de ias manos de un ser humano. Esto puede usarse como un desinfectante, por ejempio para prevenir ia propagacion de una bacteria particuiar. Tambien puede usarse como una forma de inhibir una infeccion bacteriana en ia superficie de, por 10 ejempio, ia piei.

[0055] Se describen en ei presente documento metodos de tratamiento de una infeccion bacteriana que comprende apiicar a una superficie infectada una composicion descrita en ei presente documento. Se describe en ei presente documento una composicion para su uso para tratar una infeccion bacteriana.

15

[0056] La composicion desinfectante puede apiicarse a un vendaje o aposito para heridas.

[0057] Se describe en ei presente documento un vendaje o aposito para heridas que comprende ai menos un tipo de fago, caracterizado por que ei fago se proporciona a una concentracion suficientemente aita en ei vendaje o

20 aposito de herida para inducir ia iisis externa en bacterias para ias cuaies ei fago es un patogeno cuando se pone en contacto con taies bacterias.

[0058] Se describe en ei presente documento un vendaje o aposito para heridas que comprende ei fago K y/o ei fago P68 o mutaciones de ios mismos. Ei fago K o P68 puede usarse en soiitario o en combinacion.

25

[0059] Ei aposito para heridas puede ser una compresa o un aposito de tipo yeso que se pegue. Ei fago y/o ias concentraciones utiiizadas son preferentemente como se ha definido anteriormente. Ei fago puede apiicarse ai aposito para heridas o vendaje como formuiacion desinfectante o crema topica, antes de apiicaria ai aposito o ei vendaje.

30

[0060] Como aiternativa, ei vendaje o aposito para heridas puede empaparse en un vehlcuio que contiene ei fago y secarse para dejar ei fago impregnado dentro dei aposito o vendaje.

[0061] Ei fago tambien se puede adsorber sobre ia superficie dei vendaje o aposito para heridas usando 35 tecnicas generaimente conocidas en ia tecnica.

[0062] La ventaja de este enfoque es que ei vendaje o aposito de herida permite que ei fago sea puesto en contacto con una herida que puede contener ias bacterias.

40 [0063] Tambien se describen en ei presente documento metodos para inhibir o tratar bacterias mediante ia

apiicacion de un vendaje o aposito para heridas a un paciente.

[0064] Ei bacteriofago K y ei bacteriofago P68, y ei fago derivado de eiios, se usan en ias composiciones descritas en ei presente documento. Estos inducen ia iisis externa en una ampiia gama de cepas de MRSa. Ambos

45 fagos son generaimente conocidos en ia tecnica. Por ejempio, ei fago K puede obtenerse de ATCC (ATCC 19685- B1) y/o P68 dei Feiix d'Hereiie Reference Center for Bacteriai Viruses de ia Universite Lavai (HER49). Tambien se pueden usar otros fagos.

METODOS

50

[0065] Se cuitivaron bacterias de Staphylococcus aureus insensibies a ia infeccion obiigatoriamente Utica por ei fago en cuestion en caido Luria-Bertani como medio de crecimiento hasta una concentracion de aproximadamente 2 x 108 unidades formadoras de coionias (ufc) por mi. Se anadieron diferentes concentraciones de fago a diferentes ailcuotas de bacterias suspendidas en medio y se incubaron a 37 °C durante ia noche.

55

[0066] Se midio ia turbidez dei cuitivo. Una disminucion en ia turbidez indico ia iisis externa de ias ceiuias.

[0067] La concentracion de fago se caicuio como unidades formadoras de piaca (ufp) en ceiuias bacterianas en ias que se sabla que ei fago infectaba e inducla ia iisis interna para formar piacas. Ei caicuio de ufp de fagos y de

celulas bacterianas son tecnicas convencionales.

[0068] Como alternativa, se proporciona una placa de Petri de un medio de crecimiento solido (medio Luria-

Bertani). Las bacterias insensibles a la infeccion obligatoriamente litica por el fago en cuestion se mezclan con agar 5 Kquido de baja densidad y luego se propagan sobre el medio de crecimiento solido. Las alicuotas (~20 pl) de diferentes diluciones de la preparation de fago se manchan luego sobre la superficie de la placa de Petri. La placa de Petri se incuba para permitir que las bacterias crezcan. Las zonas sin crecimiento bacteriano que corresponden a las posiciones en las que cualquiera de las diluciones de fago se mancho indican lisis externa.

10 [0069] La capacidad del fago para inducir la lisis interna puede determinarse mediante una serie de tecnicas.

Tipicamente se proporciona una placa petri de un medio de crecimiento solido (medio Luria-Bertani). Las bacterias se mezclan con el fago y el agar Kquido de baja densidad y luego se esparcen sobre el medio de crecimiento solido. La placa de Petri se incubo para permitir que las bacterias creciesen. Cuando ocurrio lisis interna, se observaron placas en el crecimiento bacteriano.

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RESULTADOS

[0070] La Tabla 1 muestra la capacidad del fago K y del fago P68 para inducir la lisis interna (placas) en una gama de diferentes cepas de Staphylococcus aureus resistente a la meticilina (MRSA). SAI 653 se ha utilizado como

20 estandar. Esta disponible publicamente en la ATCC (ATCC numero 19685) y es Staphylococcus aureus subsp aureus Rosenbach. Las cepas restantes son cepas de MRSA aisladas de pacientes en hospitales en el Reino Unido y en el extranjero.

[0071] La tabla tambien muestra que a concentraciones mayores el fago puede usarse para inducir lisis 25 externa en cepas incluyendo aquellas en las que el fago no formara placas a traves de lisis interna.

[0072] Esto aumenta considerablemente la eficacia de las formulaciones que comprenden fagos aumentando

el numero de diferentes cepas de bacterias en las que puede usarse la formulation que contiene fago para infectar.

30 [0073] Se observo que con el fago K, la concentration minima de fago K necesaria para inducir la lisis

externa en el fago en la que no fue capaz de inducir la formation de placa era 5:1 ufp de placas con respecto a las celulas.

Lisis externa de mutantes de Staphylococcus aureus resistentes a la infeccion por fagos.

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[0074] Los fagos K, K* y K*710 de Staphylococcus aureus (mutantes del intervalo de huespedes espontaneos derivados del precursor original K) y el fago P68 pueden provocar la lisis externa de la gran mayoria de cepas de S. aureus ensayadas. Se realizaron experimentos para investigar si los mutantes de S. aureus que son resistentes a la infeccion obligatoriamente litica (lisis interna) eran todavia sensibles a la lisis externa. Se aislaron cinco mutantes

40 independientes de la cepa SAI669 de S. aureus (un aislado de EMRSA-15) resistentes al fago K*710, al igual que

otros cinco mutantes resistentes al fago P68. Todos los mutantes aislados como resistentes a la infeccion

obligatoriamente lttica por el fago K*710 tambien mostraron resistencia a la infeccion obligatoriamente litica por los fagos K y K*. Los mutantes resistentes a la infeccion obligatoriamente lttica por K/K*/K*710 eran sensibles a la infeccion obligatoriamente lttica por el fago P68 y viceversa, los mutantes resistentes a la infeccion obligatoriamente 45 litica por el fago P68 eran todavia sensibles a la infeccion obligatoriamente lttica por K/K*/K*710. Cada mutante resistente a fago individual se ensayo para determinar la sensibilidad a la lisis externa. Este ensayo se realizo inoculando un cesped de la cepa de S. aureus en 3 ml de agar blando de caldo Luria (0,7 % p/v) sobre una placa de agar de caldo Luria (1,5 % p/v) y luego se salpicaron 20 pl de diluciones seriadas 10 veces de cada fago (concentracion inicial -5 x 109 unidades formadoras de placas/ml) sobre el agar blando, seguido de incubacion a 37 50 °C durante 20 horas. Las zonas de clareo en el cesped bacteriano a altas concentraciones de fago, pero la ausencia de placas individuales a bajas concentraciones de fago, se tomaron para indicar lisis externa.

[0075] El conjunto de los diez mutantes era sensible a la lisis externa por los fagos K, K* y K*710. Sin embargo, los mutantes resistentes a P68 no eran sensibles a la lisis externa por P68. Se aislaron mutantes dobles

55 espontaneos de cada uno de los diez mutantes originales que ahora eran resistentes tanto a K*710 como a P68. Estos mutantes dobles se seleccionaron por su sensibilidad a la lisis externa. Todos los mutantes dobles eran sensibles a la lisis externa por los fagos K, K* y K*710, pero no por el fago P68. A partir de estos resultados se concluye que los mutantes de S. aureus resistentes a la infeccion obligatoriamente litica por el fago K y los mutantes espontaneos del intervalo de huespedes derivados del fago K, permanecen sensibles a la lisis externa.

[0076] Por lo tanto, en el contexto de la terapia con fagos, el uso del fago K y sus derivados mutantes del

intervalo de huespedes a una concentracion suficientemente alta deberfa matar las cepas de S. aureus incluso si mutan a resistencia a una infeccion obligatoriamente lftica.

imagen1

Claims

REIVINDICACIONES

I. Un procedimiento para matar bacterias sobre una superficie que es un equipo medico, ropa de cama, muebles, paredes o suelos en un hospital que comprende aplicar a la superficie una composicion desinfectante que

5 comprende un vehlculo y dos o mas fagos, comprendiendo los fagos el fago K o mutantes del mismo, y el fago P68 o mutantes del mismo, caracterizado porque la concentration de ambos fagos es de al menos 5:1 ufp de fagos:ufc de bacterias para inducir la lisis externa de las bacterias para las que el fago es un patogeno cuando dichas bacterias estan presentes sobre la superficie a desinfectar.

10 2. Una composicion desinfectante que comprende un vehlculo y dos o mas fagos, comprendiendo los

fagos el fago K o mutantes del mismo, y el fago P68 o mutantes del mismo, caracterizada porque la concentracion de ambos fagos es de al menos 5:1 ufp de fagos:ufc de bacterias para inducir la lisis externa de las bacterias para las que el fago es un patogeno cuando dichas bacterias estan presentes sobre una superficie a desinfectar para su uso en un procedimiento para eliminar bacterias sobre una superficie, que comprende aplicar la composicion 15 desinfectante a la superficie, en la que la superficie es la piel de un mamlfero.
3. Una composicion desinfectante para su uso segun la reivindicacion 2, en la que la composicion

desinfectante es una aplicacion topica para aplicacion a la piel del mamlfero.

20 4. Una composicion desinfectante para su uso segun la reivindicacion 3, en la que la piel esta dentro de

la cavidad nasal, o piel de la mano de un humano.
5. Un procedimiento segun la reivindicacion 1, o una composicion desinfectante para su uso segun cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, en el que la composicion desinfectante es un lavado por pulverization o

25 llquido para la superficie.
6. Un procedimiento segun la reivindicacion 5, o una composicion desinfectante para su uso segun cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5 en forma de crema, locion, unguento, pasta, gel, espuma o lavado de manos.

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7. Un procedimiento segun la reivindicacion 5 o 6, o una composicion desinfectante para su uso segun cualquiera de las reivindicaciones 3 a 6, en el que el vehlculo comprende lanolina o parafina.
8. Un procedimiento o composicion desinfectante para su uso segun cualquier reivindicacion anterior, en 35 los que la composicion comprende fagos adicionales que son un patogeno de una bacteria seleccionada de

Staphylococcus, Helicobacter, Klebsiella, Listeria, Mycobacterium, Escherichia, Meningococcus, Campylobacter, Streptococcus, Enterococcus, Shigella, Pseudomonas, Burkholderia, Clostridium, Legionella, Acetinobacter, o Salmonella.

40 9. Un procedimiento o composicion desinfectante para su uso segun la reivindicacion 8, en los que el

fago es un patogeno de Staphylococcus aureus.
10. Un procedimiento o composicion desinfectante para su uso segun cualquiera de las reivindicaciones

anteriores que comprende al menos un mutante del fago K o fago P68, en los que el mutante es al menos un 90 %, 45 92 %, 94 %, 96 %, 98 % o un 99 % identico a la secuencia nativa del fago.

II. Un procedimiento o composicion desinfectante para su uso segun la reivindicacion 10, en los que el mutante es un mutante puntual, de deletion o de adicion en el que se cambian 1-10 bases en comparacion con la secuencia original del fago K o P68.