JP6728503B2 - 血液脳関門を通過することができる化合物を有効成分として含有する脳腫瘍の予防または治療用薬学的組成物 - Google Patents

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Description

本発明は、血液脳関門を通過することができる化合物を有効成分として含有する脳腫瘍の予防または治療用薬学的組成物に関するものである。
タンパク質キナーゼは、アデノシン三リン酸（ATP）の末端リン酸基をタンパク質の特定の残基であるチロシン、セリンまたはスレオニンに転移させる反応を触媒する酵素であり、細胞媒介体および環境の変化に対する細胞の活性や成長および分化を調節する信号に関与する。
不適切に高いタンパク質キナーゼ活性は、異常な細胞の作用から起因する多数の疾患と直接的または間接的に関連がある。例えば、突然変異、過剰発現または不適切な酵素活性に関連するキナーゼの適切な調節メカニズムの失敗や、サイトカイン、キナーゼの上流または下流のシグナル伝達に関与する因子の過剰生成または欠乏によって疾病が引き起こされ得る。したがって、キナーゼ活性の選択的な阻害は、疾病の治療用新薬開発の有益な標的になり得る。
LRRK2（leucin-rich repeat kinase-2）タンパク質は、ロイシンリッチリピートキナーゼ集団（leucin-rich repeat kinase family）に属するタンパク質であり、種間の類似性が高い2527個のアミノ酸配列で構成されている。LRRK2タンパク質は、単一のタンパク質の中にGTP加水分解酵素（GTPase）とセリン-スレオニンキナーゼ（Serine-threonine kinase）活性の両方を有する特徴がある。発現したLRRK2タンパク質は、脳を含む様々な器官や組織で観察されており、細胞レベルでは、細胞質または細胞膜およびミトコンドリア外膜に存在する。
また、LRRK2タンパク質は、機能に重要な5つのドメイン（domain）を有しており、自己リン酸化作用（Autophosphorylation）による自己活性調節作用とタンパク質の相互作用および酵素作用を介して細胞の機能を調節することが予想される。特に、シャペロン機序（chaperone machinery）、細胞骨格配列（cytoskelecton arrangement）、タンパク質翻訳機序（protein translational machinery）、シナプス小胞の細胞内流入（synaptic vesicle endocytosis）、マイトジェン-活性化タンパク質キナーゼシグナル伝達過程（mitogen-activated protein kinases signaling cascades）およびユビキチン/オートファージタンパク質分解過程（ubiquitin/autophage protein degradation pathways）などがLRRK2タンパク質によって調節されることが分かった。
LRRK2タンパク質は、アルツハイマー病に関連した軽度認知損傷の転嫁、L-ドーパ（Dopa）誘導された運動異常症、およびニューロン前駆分化と関連したCNS障害とに関することが報告された。また、LRRK2タンパク質のG2019S突然変異は、急性骨髄性白血病（AML）だけでなく、腎臓癌、乳癌、肺癌、前立腺癌などの非-皮膚癌の発生を増加させることが報告された。詳細には、LRRK2タンパク質のG2019S突然変異は、LRRK2キナーゼドメインの触媒活性を増加させる。さらに、LRRK2タンパク質は、筋萎縮性側索硬化症、関節リウマチおよび強直性脊椎炎とも関連していることが報告されている（国際公開特許WO 2011/038572）。
一方、脳腫瘍の治療方法としては、外科的手術、放射線治療、抗癌薬物療法（化学療法）、ホルモン療法などがある。その中で、主に外科的手術と放射線治療に依存してきたが、特に放射線治療は、神経毒性と認知症などの副作用を伴う問題がある。したがって、このような問題点を解消するために、抗癌薬物療法（化学療法）が注目されているが、脳腫瘍の治療のための薬物療法は、「血液脳関門（Blood-brain barrier、BBB）」という特殊な保護体系に詰まって脳まで伝達されない薬物が多数であり、抗癌剤に対する癌の抵抗性などにより制限的である。
一方、本発明者らは、LRRK2タンパク質の阻害剤として使用される化合物が、血液脳関門（BBB）を効率的に通過して脳腫瘍の予防および治療に有用に使用することができることをin vivo実験を通じて初めて究明し、本発明を完成した。
国際公開特許WO 2011/038572
本発明の目的は、血液脳関門を効率的に通過して脳腫瘍の予防または治療に有用に使用できる薬学的組成物を提供することである。
前記目的を達成するために、
本発明は、LRRK2タンパク質の阻害剤を有効成分として含有する脳腫瘍の予防または治療用薬学的組成物を提供する。
また、本発明は、薬剤学的に治療可能な量のLRRK2タンパク質阻害剤を有効成分として含有する第1成分、および薬剤学的に治療可能な量のアバスチンを有効成分として含有する第2成分を含む脳腫瘍の予防または治療用薬学的キットを提供する。
また、本発明は、LRRK2タンパク質の阻害剤を個体に投与する工程を含む脳腫瘍を治療する方法を提供する。
また、本発明は、LRRK2タンパク質の阻害剤を個体に投与する工程、およびアバスチンを個体に投与する工程を含む脳腫瘍を治療する方法を提供する。
さらに、本発明は、脳腫瘍の治療のための薬学的組成物の製造に使用するためのLRRK2タンパク質阻害剤の用途を提供する。
本発明に係る脳腫瘍の予防または治療用薬学的組成物は、LRRK2タンパク質の阻害剤を有効成分として含有し、一般的な薬物が通過し難い血液脳関門を容易に通過して、腫瘍形成を顕著に抑制する効果がある。
脳腫瘍患者から得られた癌組織でLRRK2タンパク質が発現することをウエスタンブロットで確認した結果を示す図である。 LRRK2タンパク質に対するリン酸化と脳腫瘍の悪性度との相関関係を確認した結果を示す図である。 脳腫瘍細胞で発現したLRRK2タンパク質をコードする核酸配列を分析した結果を示す図である。 LRRK2タンパク質を発現するレンチウイルスベクターの構造を示す模式図である。 LRRK2タンパク質を発現するレンチウイルスベクターで感染した細胞でLRRK2タンパク質の過発現を確認した図である。 LRRK2タンパク質を発現するレンチウイルスベクターで感染した細胞で腫瘍細胞の自己複製能を確認した図である。 実施例10、11、12、20、および21の化合物を脳腫瘍患者由来細胞株であるNCC01細胞に処理した場合に確認されるウエスタンブロット評価結果を示す図である。 実施例11、12、20、21、および22の化合物を脳腫瘍患者由来細胞株であるNCC01細胞に処理した場合に確認されるウエスタンブロット評価結果を示す図である。 実施例10、11、12、20、および21の化合物を脳腫瘍患者由来細胞株であるNCC01細胞に処理した場合に確認されるウエスタンブロット評価結果を示すグラフである。 脳腫瘍患者由来細胞株であるNCC01細胞に実施例10の化合物を、様々な濃度で処理した場合に確認されるウエスタンブロット評価結果を示す図である。 脳腫瘍患者由来細胞株であるNCC01細胞に実施例10の化合物を、様々な濃度で処理した場合に確認されるウエスタンブロット評価結果を示す図である。 脳腫瘍患者由来細胞株であるNCC01細胞に実施例12の化合物を、様々な濃度で処理した場合に確認されるウエスタンブロット評価結果を示す図である。 脳腫瘍患者由来細胞株であるNCC01細胞に実施例12の化合物を、様々な濃度で処理した場合に確認されるウエスタンブロット評価結果を示す図である。 脳腫瘍患者由来細胞株であるNCC01細胞に実施例12の化合物を、100nMの濃度で処理し、時間が経過するにつれて確認されるウエスタンブロット評価結果を示す図である。 脳腫瘍患者由来細胞株であるNCC01細胞に実施例12の化合物を、100nMの濃度で処理し、時間が経過するにつれて確認されるウエスタンブロット評価結果を示す図である。 NCC01細胞に実施例12の化合物を、50nM〜2,000nMの濃度範囲で処理して、1日が経過した後に確認されるウエスタンブロット評価結果を示す図である。 NCC01細胞に実施例12の化合物を、50nM〜2,000nMの濃度範囲で処理して、1日が経過した後に確認されるウエスタンブロット評価結果を示す図である。 NCC01細胞に実施例12の化合物を、50nM〜2,000nMの濃度範囲で処理して、1日が経過した後に確認されるウエスタンブロット評価結果を示す図である。 実施例12の化合物がミトコンドリアの活性を阻害することにより、脳腫瘍細胞の死滅を誘導することを確認した図である。 実施例12の化合物が脳腫瘍幹細胞に存在するミトコンドリアの活性を抑制することを確認した図である。 実施例12の化合物がTRAP1タンパク質の発現を抑制することにより、ミトコンドリアの活性を抑制することを確認した図である。 低酸素条件に露出したNCC01細胞株から形成された球の成長がLRRK2遺伝子に対するshRNAによって抑制されることを確認した図である 低酸素条件に露出したNCC01細胞株でLRRK2タンパク質の発現をウエスタンブロットで確認した結果を示す図である。 低酸素条件に露出した528NS細胞株から形成された球の成長がLRRK2遺伝子のshRNAによって抑制されることを確認した図である 低酸素条件に露出した528NS細胞株でLRRK2タンパク質の発現をウエスタンブロットで確認した結果を示す図である。 NCC01細胞に実施例11、12および21の化合物を、それぞれ100nMの濃度で処理し、1日が経過した後に確認されるcell cycle FACS評価結果を示す図である。 NCC01細胞に実施例11、12および21の化合物を、それぞれ100nMの濃度で処理し、1日が経過した後に確認されるcell cycle FACS評価結果を示す図である。 脳腫瘍が誘導されたマウスモデルに対して実施例12の化合物を経口投与したときの生存日の変化を観察した結果を示す図である。 脳腫瘍が誘導されたマウスモデルに対して実施例12の化合物を経口投与したときの腫瘍の大きさの変化を測定した結果を示す図である。 実施例12の化合物をアバスチンと併用処理したとき、脳腫瘍の治療効果が増加することを確認した図である。 脳腫瘍患者由来細胞株であるNCC01細胞に比較例の化合物を処理した場合に、確認されるウエスタンブロット評価結果を示す図である。 実施例10、11、12、20、および21の化合物を脳腫瘍患者由来細胞株である448T細胞に処理した場合に確認されるウエスタンブロット評価結果を示す図である。 脳腫瘍患者由来細胞株である448T細胞に、実施例12の化合物を、様々な濃度で処理した場合に確認されるウエスタンブロット評価結果を示す図である。 脳腫瘍が誘導されたマウスモデルに対して実施例12、20および21の化合物を経口投与したときの生存日の変化を観察した結果を示す図である。 脳腫瘍患者由来細胞株である448T細胞に比較例化合物と実施例1、11および12の化合物を処理した場合に確認されるウエスタンブロット評価結果を示す図である。
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明は、LRRK2（Leucine Rich Repeat Kinase 2）タンパク質の阻害剤を有効成分として含有する脳腫瘍の予防または治療用薬学的組成物を提供する。
1つの例として、前記LRRK2タンパク質阻害剤は、下記化学式1で表される化合物、その光学異性体、またはその薬学的に許容可能な塩であり得る。
[化学式1]
前記化学式1において、
R1は、-H、-OH、ハロゲン、ニトロ、ニトリル、C1-10の直鎖または分岐アルキル、C1-10の直鎖または分岐アルコキシ、C1-5の直鎖または分岐アルキルアミノ、または、ジC1-5の直鎖または分岐アルキルアミノであり、
R2は、-H、-OH、ハロゲン、ニトロ、ニトリル、または、非置換または1つ以上のハロゲンが置換されたC1-10の直鎖または分岐アルキルであるか、R3と連結してNを1つ以上含む非置換、置換または融合した5〜8角環ヘテロシクロアルキル、またはNを1つ以上含む非置換または置換された5〜6角環ヘテロアリールを形成し、
ここで、前記置換された5〜8角環ヘテロシクロアルキル、および置換された5〜6角環ヘテロアリールは、独立して、-OH、=O、ハロゲンおよびC1-5の直鎖または側鎖アルキルからなる群から選択される1種以上の置換基が置換された5〜8角環ヘテロシクロアルキル、および5〜6角環ヘテロアリールであり、
ここで、前記融合された5〜8角環ヘテロシクロアルキルは、非置換されたC6-10のアリールが融合した5〜8角環ヘテロシクロアルキルであり、
R3は、-H、-OH、ハロゲン、ニトロ、ニトリル、C1-10の直鎖または分岐アルキル、C1-10の直鎖または分岐アルコキシ、C1-5の直鎖または分岐アルキルアミノ、ジC1-5の直鎖または分岐アルキルアミノ、C1-5の直鎖または分岐アルキルスルホニルC6-10アリールアミノ、またはC1-5の直鎖または分岐アルキルスルホニルアミノC6-10アリールアミノであるか、R2と一緒に連結してNを1つ以上含む非置換、置換または融合した5〜8角環ヘテロシクロアルキルを形成し、
ここで、前記置換された5〜8角環ヘテロシクロアルキルは、独立して、-OH、=O、ハロゲンおよびC1-5の直鎖または側鎖アルキルからなる群から選択される1種以上の置換基が置換された5〜8角環ヘテロシクロアルキルであり、
ここで、前記融合された5〜8角環ヘテロシクロアルキルは、非置換されたC6-10のアリールが融合した5〜8角環ヘテロシクロアルキルであり、
Yは、
または
であり、
前記R4、R5とR6は、独立して、-H、-OH、ハロゲン、ニトロ、ニトリル、C1-10の直鎖または分岐アルキル、C1-10の直鎖または分岐アルコキシ、NおよびOからなる群から選択される1種以上のヘテロ原子を含む非置換または置換された5〜8角環ヘテロシクロアルキル、NおよびOからなる群から選択される1種以上のヘテロ原子を含む非置換または置換された5〜8角環ヘテロシクロアルキルカルボニルであり、
ここで、前記置換された5〜8角環ヘテロシクロアルキルは、ジC1-5の直鎖または分岐アルキルアミノまたは1つ以上のNを含み、複数のC1-5の直鎖または分岐アルキルが置換された6角環ヘテロシクロアルキルが置換された5〜8角環ヘテロシクロアルキルであり、
前記R7、R8およびR9は、独立して、-H、-OH、ハロゲン、ニトロ、ニトリル、非置換または1つ以上のヒドロキシが置換されたC1-10の直鎖または分岐アルキル、またはNおよびOからなる群から選択された1種以上のヘテロ原子を含む非置換または置換された5〜8角環ヘテロシクロアルキルであり、
ここで、前記置換された5〜8角環ヘテロシクロアルキルは、-OH、=O、ハロゲン、およびOを1つ含む4〜5角環非置換されたヘテロシクロアルキルからなる群から選択される1種以上の置換基が置換された5〜8角環ヘテロシクロアルキルである。
好ましくは、
R1は、-H、または-NH(CH3)であり、
R2は、-H、ハロゲン、または-CF3であるか、R3と共に連結し、
を形成し、
R3は、-H、-NH(CH3)、-NH(CH2CH3)、
、または
であるか、R2と共に連結して
または
を形成し、Yは、
または、
であり、
前記R4、R5およびR6は、独立して、-H、メトキシ、ハロゲン、
、
、
または、
であり、
前記R7、R8およびR9は、独立して、-H、メチル、ハロゲン、
または、
である。
さらに好ましくは、前記化学式1で表される化合物は、下記の化合物群から選択されるいずれか1つであり得る。
（1）5-クロロ-N4-（2-（イソプロピルスルホニル）フェニル）-N2-（2-メトキシ-4-（4-（4-メチルピペラジン-1-イル）ピペリジン-1-イル）フェニル）ピリミジン-2,4-ジアミン;
（2）N-（2-（2-（3-クロロ-4-メトキシフェニルアミノ）-5-フルオロピリミジン-4-アミノ）フェニル）メタンスルホンアミド;
（6）（4-（ジメチルアミノ）ピペリジン-1-イル）（3-メトキシ-4-（4-（メチルアミノ）-5-（トリフルオロメチル）ピリミジン-2-イルアミノ）フェニル）メタノン;
（8）N4-エチル-N2-（1-（3-フルオロ-1-（オキセタン-3-イル）ピペリジン-4-イル）-3-メチル-1H-ピラゾール-4-イル）-5-（トリフルオロメチル）ピリミジン-2,4-ジアミン;
（10）2-[（2-メトキシ-4-[[4-（4-メチルピペラジン-1-イル）ピペリジン-1-イル]カルボニル]フェニル）アミノ]-5,11-ジメチル-5,11-ジヒドロ-6H-ピリミド[4,5-b] [1,4]ベンゾジアゼピン-6-オン;
（11）（4-（4-（エチルアミノ）-5-（トリフルオロメチル）ピリミジン-2-イルアミノ）-2-フルオロ-5-メトキシフェニル）（モルホリノ）メタノン;
（12）（3-メトキシ-4-（4-（メチルアミノ）-5-（トリフルオロメチル）ピリミジン-2-イルアミノ）フェニル）（モルホリノ）メタノン;
（14）1-（5-クロロ-4-（4-（メチルアミノ）-5-（トリフルオロメチル）ピリミジン-2-イルアミノ）-1H-ピラゾール-1-イル）-2-メチルプロパン-2-オール、および
（16）N2-（5-クロロ-1-（（3S、4R）-3-フルオロ-1-（オキセタン-3-イル）ピペリジン-4-イル）-1H-ピラゾール-4-イル）-N4-メチル-5-（トリフルオロメチル）ピリミジン-2,4-ジアミン。
他の一例として、前記LRRK2タンパク質阻害剤は、下記化学式2で表される化合物、その光学異性体、またはその薬学的に許容可能な塩であり得る。
[化学式2]
前記化学式2において、
L1とL2は、独立して、-O-、-CH2-、-NH-、または-S-であり、
A1は、非置換または置換されたC3-10のシクロアルキルであり、ここで、前記置換されたC3-10のシクロアルキルは、-OH、ハロゲン、ニトリル、ニトロ、C1-5の直鎖または分岐アルキルおよびC1-5の直鎖または分岐アルコキシからなる群から選択される1種以上の置換基が置換されたC3-10のシクロアルキルであり、
A2は、N、OおよびSからなる群から選択される1種以上のヘテロ原子を含む非置換または置換された5〜6角環ヘテロアリールであり、ここで、前記置換された5〜6角環ヘテロアリールは、-OH、ハロゲン、ニトリル、ニトロ、C1-5の直鎖または分岐アルキルおよびC1-5の直鎖または分岐アルコキシからなる群から選択される1種以上の置換基が置換された5〜6角環ヘテロアリールであり、
A3、A4、およびA5は、独立して、-H、C1-5の直鎖または分岐アルキルまたはC1-5の直鎖または分岐アルコキシである。
好ましくは、L1およびL2は、独立して、-CH2-、-NH-、または-S-であり、
A1は、
または
であり、A2は、
であり、
A3、A4およびA5は、独立して、-Hまたはメチルである。
さらに好ましくは、前記化学式2で表される化合物は、下記の化合物群から選択されるいずれか1つであり得る。
（7）（S）-3-（シクロプロピルチオ）-7-メチル-1-（1H-ピラゾール-3-イル）-6,7-ジヒドロチエノ[3,4-c]ピリジン-4（5H）-オン、および
（9）3-（シクロペンチルチオ）-6,6-ジメチル-1-（1H-ピラゾール-3-イル）-6,7-ジヒドロベンゾ[c]チオフェン-4（5H）-オン。
別の一例として、前記LRRK2タンパク質阻害剤は、下記化学式3で表される化合物、その光学異性体、またはその薬学的に許容可能な塩であり得る。
[化学式3]
前記化学式3において、
L3は、不在、-NH-、または-O-であり、
L4は、N、またはCであり、
E1は、-H、-OH、ハロゲン、ニトリル、ニトロ、C1-5の直鎖または分岐アルキル、またはC1-5の直鎖または分岐アルコキシであり、
E2は、前記L4がNである場合は不在であり、前記L4がCの場合、
であり、
前記E5は、C1-5の直鎖または分岐アルキルであり、
E3は、-H、-OH、ハロゲン、ニトリル、ニトロ、C1-5の直鎖または分岐アルキル、C1-5の直鎖または分岐アルコキシ、非置換または置換されたC6-10のシクロアルキル、またはNおよびOからなる群から選択される1種以上のヘテロ原子を含む非置換または置換された5〜8角環ヘテロシクロアルキルであり、
ここで、前記置換されたC6-10のシクロアルキルと置換された5〜8角環ヘテロシクロアルキルは、独立して、-OH、ハロゲン、C1-3の直鎖または分岐アルキル、およびC1-3の直鎖または分岐アルコキシからなる群から選択される1種以上の置換基が置換されたC6-10のシクロアルキルおよび5〜8角環ヘテロシクロアルキルであり、
E4は、Nを1つ以上含む非置換または置換された6〜8角環ヘテロシクロアルキルカルボニルC1-5の直鎖または分岐アルキル、Nを1つ以上含む非置換または置換された6〜8角環ヘテロアリールであり、
ここで、前記置換された6〜8角環ヘテロシクロアルキル、および置換された6〜8角環ヘテロアリールは、独立して、C6-10のアリール、NおよびOからなる群から選択される1種以上のヘテロ原子を含む非置換または置換された6角環ヘテロシクロアルキルが置換された6〜8角環ヘテロシクロアルキルであり、
ここで、前記置換された6角環ヘテロシクロアルキルは、-OH、ハロゲン、または非置換または1つ以上のハロゲンが置換されたC1-5の直鎖または分岐アルキルが置換された6角環ヘテロシクロアルキルである。
好ましくは、L3は、不在、-NH-、または-O-であり、
L4は、N、またはCであり、
E1は、-H、またはメチルであり、
E2は、前記L4がNである場合は不在であり、前記L4がCの場合、
であり、
E3は-H、
、
または
であり、
E4は、
、
、
、
または
である。
さらに好ましくは、前記化学式3で表される化合物は、下記の化合物群から選択されるいずれか1つであり得る。
（3）（R）-3-（4-（シクロヘキシルアミノ）-1H-ピラゾール[4,3-c]ピリジン-3-イル）-1-（3-フェニルピペリジン-1-イル）プロパン-1-オン;
（5）4-（4-（6-メチル-4-（テトラヒドロ-2H-ピラン-4-イルオキシ）-1H-ピラゾール[4,3-c]ピリジン-3-イル）ピリジン-2-イル）モルホリン;
（18）3-（6-（4-（2-フルオロエチル）ピペラジン-1-イル）ピリミジン-4-イル）-5-（1-メチルシクロプロポキシ）-1H-インダゾール、および
（20）（2S、6R）-2,6-ジメチル-4-（6-（5-（1-メチルシクロプロポキシ）-1H-インダゾール-3-イル）ピリミジン-4-イル）モルホリン。
別の一例として、前記LRRK2タンパク質阻害剤は、下記化学式4で表される化合物、その光学異性体、またはその薬学的に許容可能な塩であり得る。
[化学式4]
（前記化学式4において、
αは、-CH =、または-N =であり、
G1は、-H、-OH、ハロゲン、ニトロ、ニトリル、C1-5の直鎖または分岐アルキル、C1-5の直鎖または分岐アルコキシ、またはNを1つ以上含む非置換または置換された5〜8角環ヘテロアリールアミノであり、
ここで、前記置換された5〜8角環ヘテロアリールは、-OH、ハロゲンまたはC1-3の直鎖または分岐アルキルが置換された5〜8角環ヘテロアリールであり、
G2は、-H、-OH、ハロゲン、ニトロ、ニトリル、C1-5の直鎖または分岐アルキル、C1-5の直鎖または分岐アルコキシ、非置換または置換されたC6-10のアリール、またはNおよびOのからなる群から選択される1種以上のヘテロ原子を含む非置換または置換された5〜8角環ヘテロシクロアルキルであり、
ここで、前記置換されたC6-10のアリールと置換された5〜8角環ヘテロシクロアルキルは、独立して、C1-5の直鎖または分岐アルキル、C1-5の直鎖または分岐アルコキシ、およびNおよびOを含む6角環の非置換されたヘテロシクロアルキルC1-3の直鎖または側鎖アルキルからなる群から選択される1種以上の置換基が置換されたC6-10のアリールおよび5〜8角環ヘテロシクロアルキルであり、
G3は、-H、-OH、ハロゲン、ニトロ、ニトリル、C1-5の直鎖または分岐アルキル、C1-5の直鎖または分岐アルコキシ、非置換または1つ以上のニトリルが置換されたC6-10のアリール、またはN、OおよびSからなる群から選択される1種以上のヘテロ原子を含む非置換または置換された5〜10角環ヘテロアリールであり、
ここで、前記置換された5〜10角環ヘテロアリールは、ハロゲン、C1-5の直鎖または分岐アルキルおよびニトリルからなる群から選択される1種以上の置換基が置換された5〜10角環ヘテロアリールである。
好ましくは、G1は、-H、または
であり、
G2は、
または
であり、
G3は、ニトリル、
、
または
である。
さらに好ましくは、前記化学式4で表される化合物は、下記の化合物群から選択されるいずれか1つであり得る。
（19）6-（1-メチル-1H-ピラゾール-3-イルアミノ）-4-（3-メチル-4-（モルホリノメチル）フェニル）-1H-ピロロ[2,3-b]ピリジン-3-カルボニトリル;
（21）3-（4-モルフォリノ-1H-ピロロ[2,3-b]ピリジン-3-イル）ベンゾニトリル、および
（22）1-メチル-4-（4-モルホリノ-7H-ピロロ[2,3-d]ピリミジン-5-イル）-1H-ピロール-2-カルボニトリル。
別の一例として、前記LRRK2タンパク質阻害剤は、下記化学式5で表される化合物、その光学異性体、またはその薬学的に許容可能な塩であり得る。
[化学式5]
前記化学式5において、
M1は、非置換または1つ以上のハロゲンが置換されたC6-10のアリールであり、
M2は、N、OおよびSからなる群から選択される1種以上のヘテロ原子を含む非置換された6〜8角環ヘテロアリールであり、および
M3は、N、OおよびSからなる群から選択される1種以上のヘテロ原子を含む非置換された6〜8角環ヘテロシクロアルキルである。
好ましくは、前記化学式5で表される化合物は、下記の化合物であり得る。
（4）2-（4-フルオロベンジルオキシ）-5-（1-（2-モルホリノエチル）-1H-ピラゾール-4-イル）-N-（ピリジン-3-イル）ベンズアミド。
別の一例として、前記LRRK2タンパク質阻害剤は、下記化学式6で表される化合物、その光学異性体、またはその薬学的に許容可能な塩であり得る。
[化学式6]
前記化学式6において、
Q1は、-H、アミノ、C1-5の直鎖または分岐アルキル、またはC1-5の直鎖または分岐アルコキシであり、
Q2は、-H、非置換されたC6-10のシクロアルキルであり、
Q3は、-H、C1-5の直鎖または分岐アルキル、またはC1-5の直鎖または分岐アルコキシであり、および
Q4は、Nを1つ以上含み、1つのメチルが置換された5角環ヘテロアリールである。
好ましくは、前記化学式6で表される化合物は、下記の化合物であり得る。
（13）（R）-4-（1-シクロプロピルエチルアミノ）-7-（1-メチル-1H-ピラゾール-4-イル）シンノリン-3-カルボクスアミド。
別の一例として、前記LRRK2タンパク質阻害剤は、下記化学式7で表される化合物、その光学異性体、またはその薬学的に許容可能な塩であり得る。
[化学式7]
前記化学式7において、
T1は、-H、C1-5の直鎖または分岐アルキル、または非置換されたC3-8のシクロアルキルカルボニルである。
好ましくは、前記化学式7で表される化合物は、下記の化合物であり得る。
（15）シクロプロピル[10,11,14,15-テトラヒドロ-1,16-エテノ-4,8-（メテノ）ピラゾール[3,4-j][1,4,7,9]オキサトリアザシクロヘキサデシン-12（13H）-イル]メタノン。
別の一例として、前記LRRK2タンパク質阻害剤は、下記化学式8で表される化合物、その光学異性体、またはその薬学的に許容可能な塩であり得る。
[化学式8]
前記化学式8において、
Z1は、-H、アミノ、C1-5の直鎖または分岐アルキル、またはC1-5の直鎖または分岐アルコキシであり、
Z2は、Nを1つ以上含み、1つのC1-5の直鎖または分岐アルキルが置換された5〜8角環ヘテロアリールであり、および
Z3は、-H、またはC1-5の直鎖または分岐アルキル、またはC1-5の直鎖または分岐アルコキシである。
好ましくは、前記化学式8で表される化合物は、下記の化合物であり得る。
（17）（4-（6-アミノ-5-（1-イソプロピル-1H-1,2,3-トリアゾール-4-イル）ピリジン-3-イル）-2-メトキシフェニル）（モルホリノ）メタノン。
本発明に係る薬学的組成物は、脳腫瘍、詳細にはLRRK2タンパク質が発現されたり、活性化した脳腫瘍を治療するために使用することができる。前記LRRK2タンパク質の活性をLRRK2タンパク質がリン酸化することによって表し得る。
本発明に係るLRRK2タンパク質阻害剤は、薬学的に許容可能な塩の形態で使用することができ、ここで、塩としては、薬学的に許容可能な遊離酸（free acid）によって形成された酸付加塩が有用である。
酸付加塩は、塩酸、硝酸、リン酸、硫酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、亜硝酸、亜リン酸などのような無機酸類、脂肪族モノおよびジカルボン酸、フェニル-置換されたアルカノエート、ヒドロキシアルカノエートおよびアルカンジオエート、芳香族酸類、脂肪族および芳香族スルホン酸類などの無毒性有機酸、酢酸、安息香酸、クエン酸、乳酸、マレイン酸、グルコン酸、メタンスルホン酸、4-トルエンスルホン酸、酒石酸、フマル酸などの有機酸から得ることができる。このような薬学的に無毒な塩の種類には、硫酸塩、ピロ硫酸塩、バイサルフェート、サルファイト、バイサルファイト、ニトラート、ホスフェート、モノハイドロゲンホスフェート、ジハイドロゲンホスフェート、メタホスフェート、ピロホスフェートクロライド、ブロマイド、アイオダイド、フルオライド、アセテート、プロピオネート、デカノアート、カプリル酸塩、アクリル酸塩、ホルマート、イソブチレート、カプレート、ヘプタノエート、プロピオネート、シュウ酸塩、マロネート、ソクシネート、スベラート、セバケート、フマレート、マリエート、ブチン-1,4-ジオエート、ヘキサン-1,6-ジオエート、ベンゾエート、クロロベンゾエート、メチルベンゾエート、ジニトロベンゾエート、ヒドロキシベンゾエート、メトキシエトキシベンゾエート、フタル酸エステル、テレフタル酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、トルエンスルホン酸塩、クロロベンスルホネート、キシレンスルホネート、フェニルアセテート、フェニルプロピオネート、フェニルブチレート、シトレート、乳酸塩、β-ヒドロキシブチレート、グリコレート、マレート、タトレート、メタンスルホネート、プロパンスルホネート、ナフタレン-1-スルホネート、ナフタレン-2-スルホネート、マンデル酸塩などを含むことができる。
本発明に係る酸付加塩は、通常の方法で製造することができ、例えば、LRRK2タンパク質阻害剤の誘導体をメタノール、エタノール、アセトン、塩化メチレン、アセトニトリルなどの有機溶媒に溶解し、有機酸または無機酸を加えて生成された沈殿物をろ過、乾燥させて製造するか、溶媒と過剰の酸を減圧蒸留した後、乾燥させて、有機溶媒下で結晶化させて製造することができる。
また、本発明のLRRK2タンパク質阻害剤は、塩基を使用して薬学的に許容可能な金属塩として作ることができる。詳細には、アルカリ金属またはアルカリ土類金属塩は、例えば、化合物を過量のアルカリ金属水酸化物またはアルカリ土類金属水酸化物溶液中に溶解し、非溶解化合物の塩をろ過し、ろ液を蒸発、乾燥させて得ることができる。ここで、金属塩としては、ナトリウム、カリウムまたはカルシウム塩を製造することが製薬上適合する。また、これに対応する塩は、アルカリ金属またはアルカリ土類金属塩を適当な銀塩（例えば、硝酸銀）と反応させて得ることができる。
本発明に係る薬学的組成物で、前記のLRRK2タンパク質阻害剤、その光学異性体、またはその薬学的に許容可能な塩は、臨床投与時に経口または非経口のさまざまな剤形で投与することができるが、製剤化する場合には、通常使用する充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩解剤、界面活性剤などの希釈剤または賦形剤を使用して製造することができる。
経口投与用剤形としては、例えば、錠剤、丸剤、軽/軟質カプセル剤、液剤、懸濁剤、乳化剤、シロップ剤、顆粒剤、エリクシール剤、トローチ剤などがあり、これらの剤形は、有効成分に加えて、希釈剤（例えば、ラクトース、デキストロース、スクロース、マンニトール、ソルビトール、セルロースおよび/またはグリシン）、滑沢剤（例えば、シリカ、タルク、ステアリン酸およびそのマグネシウムまたはカルシウム塩および/またはポリエチレングリコール）を含有することができる。錠剤は、マグネシウムアルミニウムシリケート、澱粉ペースト、ゼラチン、メチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロースおよびポリビニルピロリジンなどの結合剤を含有することができ、場合によっては澱粉、寒天、アルギン酸またはそのナトリウム塩などのような崩解剤または沸騰混合物、吸収剤、着色剤、香味剤、および甘味料を含有することができる。
さらに、本発明は、薬剤学的に治療可能な量のLRRK2タンパク質阻害剤を有効成分として含有する第1成分、および薬剤学的に治療可能な量のアバスチンを有効成分として含有する第2成分を含む脳腫瘍の予防または治療用薬学的キットを提供する。
本発明の薬学的キットは、脳腫瘍の予防または治療のために、第1成分および第2成分を順次または同時に投与することができる。前記第1成分および第2成分を順次に投与する場合には、第1成分の投与30分〜180分、60分〜120分、80分〜100分前後で第2成分を投与することができる。本発明の一実施例によれば、第1成分の投与90分後に第2成分を投与することができる。
前記薬学的キットに含まれた第1成分および第2成分を併用投与すると、脳腫瘍の抗癌活性を増大させることができる。前記投与は、哺乳動物、具体的にヒトに投与されものであり得る。
また、本発明は、LRRK2タンパク質の阻害剤を個体に投与する工程を含む脳腫瘍を治療する方法を提供する。
前記LRRK2タンパク質は、上述したような特徴を有することができ、詳細な説明は省略する。前記個体は、哺乳動物、具体的にヒトであり得る。
本発明に係るLRRK2タンパク質阻害剤、その光学異性体、またはその薬学的に許容可能な塩を有効成分とする薬学的組成物は、非経口投与することができ、非経口投与は、皮下注射、静脈内注射、筋肉内注射または胸部内注射を介して投与することができる。
ここで、非経口投与用剤形に製剤化するために、前記LRRK2タンパク質阻害剤、その光学異性体、またはその薬学的に許容可能な塩を安定剤または緩衝剤と一緒に水に混合して溶液または懸濁液に製造し、これをアンプルまたはバイアルの単位投与型に製造することができる。前記組成物は、滅菌して防腐剤、安定化剤、水和剤または乳化促進剤、浸透圧調節用の塩および緩衝剤などの補助剤、その他の治療的に有用な物質を追加で含有することができ、通常の方法である混合、顆粒化またはコーティング方法によって製剤化することができる。
また、本発明のLRRK2タンパク質阻害剤、その光学異性体、またはその薬学的に許容可能な塩を有効成分とする薬学的組成物の人体に対する投与量は、患者の年齢、体重、性別、投与形態、健康状態、および疾患の程度によって異なり得、体重が70Kgの成人患者を基準にすると、一般的に0.1〜1000mg/日であり、好ましくは1〜500mg/日であり、また、医師または薬剤師の判断に基づいて一定時間間隔で1日1回から数回に分割して投与することもできる。
また、本発明は、LRRK2タンパク質の阻害剤を個体に投与する工程、およびアバスチンを個体に投与する工程を含む脳腫瘍を治療する方法を提供する。
前記LRRK2タンパク質は、上述したような特徴を有することができ、詳細な説明は省略する。
本発明の脳腫瘍を治療する方法は、脳腫瘍の治療のために、LRRK2タンパク質阻害剤とアバスチンを順次または同時に投与することができる。前記LRRK2タンパク質阻害剤とアバスチンを順次に投与する場合には、LRRK2タンパク質阻害剤の投与30分〜180分、60分〜120分、80分〜100分前後にアバスチンを投与することができる。本発明の一実施例によれば、LRRK2タンパク質阻害剤の投与90分後にアバスチンを投与することができる。
前記LRRK2タンパク質阻害剤およびアバスチンを併用投与すると、脳腫瘍の抗癌活性を増大させることができる。前記投与は、哺乳動物、具体的にヒトに投与するものであり得る。
さらに、本発明は、脳腫瘍の治療用薬学的組成物の製造に使用するためのLRRK2タンパク質阻害剤の用途を提供する。
本発明は、LRRK2タンパク質阻害剤が、一般的な薬物が通過し難い血液脳関門を容易に通過して、腫瘍形成を顕著に抑制することができる効果があることを最初に究明し、これに関連する実験結果は、後述する実験例を介して詳細に説明する。
以下、本発明を後述する実施例と実験例を通じて詳細に説明する。
ただし、後述する実施例と実験例は、本発明を、一部例示するものであるだけで、本発明がこれに限定されるものではない。
＜実施例1＞ 5-クロロ-N4-（2-（イソプロピルスルホニル）フェニル）-N2-（2-メトキシ-4-（4-（4-メチルピペラジン-1-イル）ピペリジン-1-イル）フェニル）ピリミジン-2,4-ジアミンの製造
表題化合物をWO2004080980、WO2005016894、WO2009102446、WO2012019132またはWO2015077602特許文献を参照して、準備した。
＜実施例2＞ N-（2-（2-（3-クロロ-4-メトキシフェニルアミノ）-5-フルオロピリミジン-4-アミノ）フェニル）メタンスルホンアミドの製造
表題化合物をWO 2009127642特許文献を参照して、準備した。
＜実施例3＞ （R）-3-（4-（シクロヘキシルアミノ）-1H-ピラゾール[4,3-c]ピリジン-3-イル）-1-（3-フェニルピペリジン-1-イル）プロパン-1-オンの製造
表題化合物をWO 2010106333特許文献を参照して、準備した。
＜実施例4＞ 2-（4-フルオロベンジルオキシ）-5-（1-（2-モルホリノエチル）-1H-ピラゾール-4-イル）-N-（ピリジン-3-イル）ベンゾアミドの製造
表題化合物をWO 2011038572特許文献を参照して、準備した。
＜実施例5＞ 4-（4-（6-メチル-4-（テトラヒドロ-2H-ピラン-4-イルオキシ）-1H-ピラゾール[4,3-c]ピリジン-3-イル）ピリジン-2-イル）モルホリンの製造
表題化合物をWO 2011141756特許文献を参照して、準備した。
＜実施例6＞ （4-（ジメチルアミノ）ピペリジン-1-イル）（3-メトキシ-4-（4-（メチルアミノ）-5-（トリフルオロメチル）ピリミジン-2-イルアミノ）フェニル）メタノンの製造
表題化合物をWO 2011151360特許文献を参照して、準備した。
＜実施例7＞ （S）-3-（シクロプロピルチオ）-7-メチル-1-（1H-ピラゾール-3-イル）-6,7-ジヒドロチエノ[3,4-c]ピリジン-4（5H）-オンの製造
表題化合物をWO 2012058193特許文献を参照して、準備した。
＜実施例8＞ N4-エチル-N2-（1-（3-フルオロ-1-（オキセタン-3-イル）ピペリジン-4-イル）-3-メチル-1H-ピラゾール-4-イル）-5-（トリフルオロメチル）ピリミジン-2,4-ジアミンの製造
表題化合物をWO 2012062783特許文献を参照して、準備した。
＜実施例9＞ 3-（シクロペンチルチオ）-6,6-ジメチル-1-（1H-ピラゾール-3-イル）-6,7-ジヒドロベンゾ[c]チオフェン-4（5H）-オンの製造
表題化合物をWO 2012118679特許文献を参照して、準備した。
＜実施例10＞ 2-[（2-メトキシ-4-[[4-（4-メチルピペラジン-1-イル）ピペリジン-1-イル]カルボニル]フェニル）アミノ]-5,11-ジメチル-5,11-ジヒドロ-6H-ピリミド[4,5-b] [1,4]ベンゾジアゼピン-6-オンの製造
表題化合物をWO 2010080712またはWO 2015176010特許文献を参照して、準備した。
＜実施例11＞ （4-（4-（エチルアミノ）-5-（トリフルオロメチル）ピリミジン-2-イルアミノ）-2-フルオロ-5-メトキシフェニル）（モルホリノ）メタノンの製造
表題化合物をWO 2011151360特許文献を参照して、準備した。
＜実施例12＞ （3-メトキシ-4-（4-（メチルアミノ）-5-（トリフルオロメチル）ピリミジン-2-イルアミノ）フェニル）（モルホリノ）メタノン製造
12-1.：（3-メトキシ-4-（4-（メチルアミノ）-5-（トリフルオロメチル）ピリミジン-2-イルアミノ）フェニル）（モルホリノ）メタノン製造-1
表題化合物をWO 2011151360特許文献を参照して、準備した。
12-2.：（3-メトキシ-4-（4-（メチルアミノ）-5-（トリフルオロメチル）ピリミジン-2-イルアミノ）フェニル）（モルホリノ）メタノン製造-2
工程1.：2,4-ジクロロ-5-ヨードピリミジン（1.0当量）をTHFに溶解した後、0℃でメチルアミン（3.5wt％in EtOH、1.1当量）を添加した。前記混合物を0℃で2時間攪拌した後、溶媒を除去し、それ以上精製過程なしに次の工程で使用した（収率：100％）。
工程2.：二口丸底フラスコ（Two-necked round-bottom flask）を窒素気体で満たした後、CuI（5.0当量）およびKF（5.0当量）を入れた。前記混合物を、150℃に温度を加熱した後、減圧状態で2時間攪拌した。反応後、温度を常温に下げ、窒素下でDMF/NMP（1：1）に溶解したトリメチル（トリフルオロメチル）シラン（5.0当量）をシリンジ（syringe）を用いて添加した。30分間反応させた後、DMF/NMP（1：1）に溶解した2-クロロ-5-ヨード-N-メチルピリミジン-4-アミン（1.0当量）をシリンジを用いて添加し、50℃で18時間反応させた。反応後、前記反応物に水を添加して沈殿物を形成させ、形成された沈殿物を濾過して除去した。得られた濾液からEtOAcを用いて有機物を抽出した（x3）。集めた有機層は、ブライン（brine）で洗浄し、Na2SO4で残りの水を除去した。水が除去された混合物をMPCL（EtOAc：Hex）を用いて精製することにより、黄色固体の目的化合物を得た（収率：70％）。
工程3.：2-クロロ-N-メチル-5-（トリフルオロメチル）ピリミジン-4-アミン（1.0当量）と（4-アミノ-3-メトキシフェニル）（モルホリノ）メタノン（1.0当量）をジオキサン（dioxane）に溶解し、室温でp-トルエンスルホン酸（p-toluensulfonic acid）（1.0当量）を添加した。これを100℃で16時間攪拌した後、常温に冷やした後、溶媒を除去し、氷水を添加した。有機物はEtOAcを用いて抽出した（x3）。集めた有機層は、ブラインで洗浄し、Na2SO4で残りの水を除去した。水が除去された混合物をMPCL（EtOAc：Hex）を用いて精製することにより、白色固体の目的化合物を得た（収率：70％）。
＜実施例13＞ （R）-4-（1-シクロプロピルエチルアミノ）-7-（1-メチル-1H-ピラゾール-4-イル）シンノリン-3-カルボクスアミドの製造
表題化合物をWO 2012162254特許文献を参照して、準備した。
＜実施例14＞ 1-（5-クロロ-4-（4-（メチルアミノ）-5-（トリフルオロメチル）ピリミジン-2-イルアミノ）-1H-ピラゾール-1-イル）-2-メチルプロパン-2-オールの製造
表題化合物をWO 2012062783特許文献を参照して、準備した。
＜実施例15＞ シクロプロピル[10,11,14,15-テトラヒドロ-1,16-エテノ-4,8-（メテノ）ピラゾール[3,4-j] [1,4,7、9]オキサトリアザシクロヘキサデシン-12（13H）-イル]メタノンの製造
表題化合物をWO 2013046029特許文献を参照して、準備した。
＜実施例16＞ N2-（5-クロロ-1-（（3S、4R）-3-フルオロ-1-（オキセタン-3-イル）ピペリジン-4-イル）-1H-ピラゾール-4-イル）-N4-メチル-5-（トリフルオロメチル）ピリミジン-2,4-ジアミンの製造
表題化合物をJournal of Medicinal Chemistry（2014），57（3），921-936文献を参照して準備した。
＜実施例17＞ （4-（6-アミノ-5-（1-イソプロピル-1H-1,2,3-トリアゾール-4-イル）ピリジン-3-イル）-2-メトキシフェニル）（モルホリノ）メタノン製造
表題化合物をWO 2014106612文献を参照して、準備した。
＜実施例18＞ 3-（6-（4-（2-フルオロエチル）ピペラジン-1-イル）ピリミジン-4-イル）-5-（1-メチルシクロプロポキシ）-1H-インダゾールの製造
表題化合物をWO 2014137723文献を参照して、準備した。
＜実施例19＞ 6-（1-メチル-1H-ピラゾール-3-イルアミノ）-4-（3-メチル-4-（モルホリノメチル）フェニル）-1H-ピロロ[2,3- b]ピリジン-3-カルボニトリルの製造
表題化合物をWO 2014170248文献を参照して、準備した。
＜実施例20＞（2S、6R）-2,6-ジメチル-4-（6-（5-（1-メチルシクロプロポキシ）-1H-インダゾール-3-イル）ピリミジン-4-イル）モルホリンの製造
表題化合物をWO 2014137723文献を参照して、準備した。
＜実施例21＞ 3-（4-モルホリノ-1H-ピロロ[2,3-b]ピリジン-3-イル）ベンゾニトリルの製造
表題化合物をWO 2015092592文献を参照して、準備した。
＜実施例22＞ 1-メチル-4-（4-モルホリノ-7H-ピロロ[2,3-d]ピリミジン-5-イル）-1H-ピロール-2-カルボニトリルの製造
表題化合物をUSA 20140005183 A1文献を参照して、準備した。
下記表1に、実施例1〜22で準備した化合物の構造を示した。
＜比較例＞ 2-メチル-2- [3-メチル-4-[[4-（メチルアミノ）-5-（トリフルオロメチル）ピリミジン-2-イル]アミノ]ピラゾール-1-イル]プロパンニトリル
表題化合物をWO 2012062783文献を参照して、準備した。
＜実験例1＞ 脳腫瘍の癌幹細胞でLRRK2タンパク質の発現を確認
脳腫瘍の治療用標的タンパク質としてLRRK2タンパク質の可能性を確認するために、19人の脳腫瘍患者から得た癌組織を利用して、ウエスタンブロットを実行して、LRRK2タンパク質の発現を確認した。
詳細には、脳腫瘍患者から癌組織を収得した後、ウエスタンブロットを実行して、LRRK2タンパク質の発現を確認し、その結果を図1に示した。
図1に示すように、脳腫瘍患者から得られた癌組織でLRRK2タンパク質が発現されることを確認し、これは脳腫瘍の悪性度が高いほど、発現量が増加した。したがって、前記からLRRK2タンパク質が脳腫瘍治療の標的として使用することができることを知ることができた。
＜実験例2＞ LRRK2タンパク質に対するリン酸化による脳腫瘍患者の予後の変化を確認
LRRK2タンパク質は、リン酸化がすることによってその活性を示す。そこで、脳腫瘍細胞でLRRK2タンパク質に対するリン酸化に起因する脳腫瘍の予後の変化を確認した。
詳細には、200人余りの脳腫瘍3期および4期患者から組織サンプルを得て、得られた組織サンプルでリン酸化したLRRK2タンパク質の発現を免疫染色を通じて確認した。
その結果、図2に示すように、LRRK2タンパク質に対するリン酸化は、脳腫瘍の悪性度が増加するにつれて、つまり3期から4期に脳腫瘍が進むにつれて増加した。したがって、前記から悪性度の高い脳腫瘍の治療のためにリン酸化したLRRK2タンパク質を標的タンパク質として使用することができることを知ることができた。
＜実験例3＞ LRRK2タンパク質の突然変異体と脳腫瘍との相関関係を確認
従来の研究によれば、LRRK2タンパク質に発生した突然変異によって、様々な癌が発生し得、LRRK2タンパク質と関連することが知られているパーキンソン病もまた、LRRK2タンパク質の突然変異によって発生することが報告された。そこで、前記の実験例では脳腫瘍細胞で過発現したことが確認されたLRRK2タンパク質がその突然変異であるかどうかを確認した。詳細には、5人の患者から得た脳腫瘍細胞を用いて配列分析を行い、その際に、下記表2に記載されたようなプライマーを使用した。
その結果、図3に示すように、脳腫瘍細胞で発現したLRRK2タンパク質をコードする核酸配列は、従来知られている単一塩基多型（SNP）を除いては、パーキンソン病で主に確認されるような特異的な突然変異がなかった。したがって、前記から、パーキンソン病や他の種類の癌とは異なり、脳腫瘍の場合、通常のLRRK2タンパク質が過発現することによって、癌が発生することを確認できた。
＜実験例4＞ LRRK2タンパク質の過発現による腫瘍形成能を確認
実験例3で確認されたように、脳腫瘍がLRRK2タンパク質の過発現によって発生するかどうかを確認するために、LRRK2タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むレンチウイルスベクター（pLenti CMV GFP DEST（736-1）,Addgene ＃19732）を作製したあと、これを528NS,464T（サムスンソウル病院、大韓民国）およびex-vivo細胞株にそれぞれ感染させ、腫瘍の形成を確認した。このとき、LRRK2タンパク質を発現しないレンチウイルスベクターを、対照群として感染させた。
その結果、図4に示すように、対照群に比べてLRRK2タンパク質を発現するレンチウイルスに感染した528NS,464Tまたはex-vivo細胞株でGSC（glioma stem cell）球の大きさが増加した。このことから、LRRK2タンパク質の過発現で腫瘍が形成されることが分かった。
＜実験例5＞ 化合物のLRRK2タンパク質に対するリン酸化阻害活性の評価（in vitro）-（1）
in vitroでの薬効評価のために脳腫瘍患者由来細胞株であるNCC01細胞を用いてウエスタンブロット実験を行った。
より詳細には、7.5x105〜1.0x106個のNCC01細胞に実施例10、11、12、20、21、および22で製造した化合物を、100または1,000nMの濃度でそれぞれ処理し、1日が経過した後、サンプルを収集してウエスタンブロットを介してLRRK2タンパク質に対するリン酸化阻害活性を評価した。実施例化合物を処理していない群を無処理群（Vehicle）とした。その結果を図5および6に示した。
図5および6に示すように、本発明に係る実施例10、11、12、20、21、および22の化合物は、無処理群（Vehicle）に比べて脳腫瘍患者由来細胞株であるNCC01細胞でLRRK2タンパク質に対するリン酸化を大幅に抑制した。
従って、本発明に係る化合物が脳腫瘍患者由来細胞株で発現するLRRK2タンパク質に対するリン酸化を抑制することを確認した。
＜実験例6＞ 化合物の濃度によるLRRK2タンパク質に対するリン酸化阻害活性の評価（in vitro）-（1）
先の＜実験例1＞のLRRK2タンパク質に対するリン酸化阻害活性の評価と同様に実験を行って、本発明に係る実施例の化合物が詳細にはどのような濃度範囲で効能が優れているのかを確認するために実験を行った。
より詳細には、7.5x105〜1.0x106個のNCC01細胞に実施例10および12で製造した化合物を0.5、1、5、10、50、および100nMの濃度で処理し、1日が経過した後、サンプルを収集してウエスタンブロットを介してLRRK2タンパク質に対するリン酸化阻害活性を評価した。実施例化合物を処理していない群を無処理群（Vehicle）とした。その結果を図7〜10に示した。
図7〜10に示すように、実施例10の化合物は、100nMでの濃度でもリン酸化されたLRRK2タンパク質が検出されたが、実施例12の化合物は、50および100nMの濃度でLRRK2タンパク質に対するリン酸化をほとんど抑制した。
このことから、本発明に係る化合物は、nM単位の低濃度でもLRRK2タンパク質に対するリン酸化を顕著に抑制することを確認した。
＜実験例7＞ 化合物の処理時間によるLRRK2タンパク質に対するリン酸化阻害活性の評価（in vitro）
先の＜実験例1＞のLRRK2タンパク質に対するリン酸化阻害活性の評価と同様に実験を行って、本発明に係る実施例の化合物を処理した後、時間の経過によって活性がどのように変化するかを確認するために実験を行った。
より詳細には、7.5x105〜1.0x106個のNCC01細胞に実施例12で製造した化合物を、100nMの濃度で処理し、1日、4日、8日が経過した後にサンプルを収集し、ウエスタンブロットを介してLRRK2タンパク質に対するリン酸化阻害活性を評価した。実施例化合物を処理していない群を無処理群（Vehicle）とした。その結果を図11および12に示す。
図11および12に示すように、実施例12の化合物を脳腫瘍患者由来細胞株であるNCC01細胞に処理して、1日が経過した後からLRRK2タンパク質に対するリン酸化レベルが急激に減少し、これは時間が経過した後も持続した。
このことから、本発明に係る実施例の化合物が長期間継続的にLRRK2タンパク質に対するリン酸化を抑制することを確認した。
＜実験例8＞ LRRK2タンパク質に対するリン酸化の抑制による細胞内シグナル伝達経路の変化の評価（in vitro）
癌幹細胞の成長のための細胞内シグナル伝達経路で本発明に係る実施例の化合物の影響を確認するために実験を行った。
より詳細には、1.0x106個のNCC01細胞に実施例12で製造した化合物を50、100、500、1000、および2000nMの濃度で処理し、1日が経過した後にサンプルを収集し、ウエスタンブロットを介して細胞内シグナル伝達経路に関与する癌の幹細胞マーカーであるNESTINタンパク質の発現を確認した。実施例化合物を処理していない群を無処理群（Vehicle）とした。その結果を図13〜15に示した。
図13〜15に示すように、実施例12の化合物によってNCC01細胞でLRRK2タンパク質に対するリン酸化が抑制され、これは処理された化合物の濃度に依存的に減少した。
このことから、本発明に係る実施例12の化合物が脳腫瘍患者由来の細胞でLRRK2タンパク質によるシグナル伝達を阻害し、これにより、腫瘍幹細胞の成長に関与するNESTINタンパク質の発現を減少させ、細胞の成長を抑制することを確認した。
＜実験例9＞ LRRK2タンパク質の活性抑制を通じたミトコンドリアの機能変化を確認
LRRK2タンパク質は、ミトコンドリアの外膜に位置し、ミトコンドリアの切片化および膜電位（membrane potential）の調節に関与することが報告されている。したがって、前記実施例で製造したLRRK2タンパク質を阻害する化合物が、ミトコンドリアの機能にどのような影響を与えるかを確認する実験を行った。
詳細には、NCC01細胞株に1μMの実施例12の化合物を処理して、1日が経過した後、活性化したミトコンドリアを染色するTMRE（tetramethylrhodamine ethylester）染色薬を添加してミトコンドリアの機能変化を確認した。ここで、実施例化合物を処理していない群を無処理群（control）とした。染色された結果を顕微鏡で撮影して図16に示した。
図16に示すように、対照群の細胞は、細胞内に存在するミトコンドリアの活性が維持されてTMRE染色薬の発色が明確になった。しかし、実施例12の化合物を処理した細胞は、TMRE染色薬の発色程度が減少したのみならず、細胞内に存在する核の切片化が起こることを確認した。このことから、本発明に係る実施例12の化合物がミトコンドリアの活性を阻害することにより、脳腫瘍細胞の死滅に影響を与えることが分かった。
＜実験例10＞ 脳腫瘍幹細胞でLRRK2タンパク質に対するリン酸化阻害活性の評価
腫瘍の転移に関連することが知られている腫瘍幹細胞でLRRK2のタンパク質のリン酸化を抑制することにより、幹細胞の細胞死滅を誘導するかどうかを確認するための実験を行った。
詳細には、脳腫瘍幹細胞株であるNCC01細胞株に実施例12で製造された化合物を0.1または1μMの濃度で添加し、1日が経過した後、＜実験例9＞に記載したように、ミトコンドリアを染色してその機能変化を確認した。ここで、実施例化合物を処理していない群を無処理群（Vehicle）とした。染色された結果を顕微鏡で撮影して図17に示した。
図17に示すように、対照群に比べて、実施例12の化合物を処理した群では、脳腫瘍幹細胞に存在するミトコンドリアの活性が抑制された。したがって、前記から、本発明に係る化合物は、ミトコンドリアの活性を抑制することにより、脳腫瘍幹細胞の死滅を誘導することにより、腫瘍の転移を抑制することができることを確認した。
＜実験例11＞ 脳腫瘍幹細胞でLRRK2タンパク質阻害剤によるTRAP1発現抑制活性の評価
＜実験例10＞ で確認された本発明に係るLKKR2タンパク質の阻害剤の脳腫瘍幹細胞でミトコンドリアの活性を抑制することが、ミトコンドリアの機能調節に関与することが知られているTRAP1（TNF receptor associated protein 1）タンパク質の発現の変化に関与しているかどうかを確認する実験を行った。
詳細には、脳腫瘍幹細胞株であるNCC01細胞株に実施例12で製造された化合物を、100または1,000nMの濃度で添加し、1日が経過した後、ウエスタンブロットの方法を介してTRAP1タンパク質の発現の変化を確認した。ここで、実施例化合物を処理していない群を無処理群（Vehicle）とした。
その結果、図18に示すように、実施例12の化合物によってTRAP1タンパク質の発現が抑制された。このことから、本発明に係る化合物がTRAP1タンパク質の発現を抑制することにより、ミトコンドリアの活性を抑制することが分かった。
＜実験例12＞ 低酸素状態でのLRRK2タンパク質発現の変化を確認
従来の研究を通じてGSCの機能で低酸素条件が重要であることが分かった。したがって、低酸素状態でのLRRK2タンパク質の発現の変化およびその発現を抑制したときのGSC球の大きさを確認した。
詳細には、NCC01および528NS細胞株を低酸素条件に露出させた後、そこにLRRK2遺伝子に対する2種類のshRNAを処理した後、球の大きさの変化を確認した。ここで、対照群としてはルシフェラーゼのshRNA（shNT）を使用した。
その結果、図19に示すように、低酸素条件に露出したNCC01（aおよびb）および528NS（cおよびd）細胞株の球の大きさは、対照群に比べて増加したが、これはLRRK2遺伝子のshRNAであるLRRK2 shRNA-1およびLRRK2 shRNA-2によって抑制された。このことから、低酸素条件下で生成されたGSCがLRRK2タンパク質の発現抑制により成長が抑制されることが分かった。
＜実験例13＞ LRRK2タンパク質に対するリン酸化の抑制を通じた細胞死滅誘導活性の評価（in vitro）
LRRK2タンパク質に対するリン酸化を阻害することにより、脳腫瘍細胞の細胞死滅を誘導するかどうかを評価するためにFACS（Fluorescence-activated cell sorting）を用いて実験を行った。
より詳細には、7.5x105〜1.0x106個のNCC01細胞に実施例11、12および21で製造した化合物を、100nMの濃度でそれぞれ処理し、1日が経過した後にサンプルを収集し、FACSを実行することにより、細胞死滅誘導活性を評価した。実施例化合物を処理していない群を無処理群（Control）とした。その結果を図20および21に示す。
図20および21に示すように、実施例11、12および21の化合物がNCC01細胞の細胞死を誘導した。特に、実施例12の化合物が実施例11および21の化合物に比べて約3倍高い細胞死滅率を示した。このことから、本発明に係る実施例12の化合物は、他の実施例の化合物に比べて、細胞死滅の誘導効果が顕著に優れていることが分かった。
＜実験例14＞ 動物モデルでの化合物の脳腫瘍細胞に対する成長阻害活性の評価-（1）
本発明に係る実施例の化合物が、動物モデルで脳腫瘍細胞に対する成長抑制活性を示すかどうかを確認するために実験を行った。
より詳細には、Balb/c-nudeマウスモデルに脳腫瘍患者由来細胞株であるNCC01を1.0x104個になるように脳内に注入し、3日が経過した後、実施例12で製造した化合物を10mg/kgまたは60mg/kgで経口投与した。化合物を投与した後、生存期間によるマウスの生存率とMRIを用いて前記マウスに生成された腫瘍の大きさを測定した。実施例の化合物を処理していない群を無処理群（Vehicle）とした。その結果を図22および23に示す。
図22に示すように、無処理群のグループでは、マウスの平均生存期間が54日であるのに対し、実施例12の化合物を10mg/kgで経口投与したグループは、平均生存が71日になり、実施例12の化合物を60mg/kgで経口投与したグループは、すべての個体が100日まで生存した（Vehicle vs 10mg/kg：p=0.032、Vehicle vs 60mg/kg：p〈0.001）。
また、図23に示すように、化合物を処理していない無処理群では、NCC01細胞を注入した位置に腫瘍が形成されたが、実施例12の化合物を10mg/kgまたは60mg/kg経口投与した群では、腫瘍の形成が観察されなかった。
このことから、本発明に係る実施例の化合物は、脳腫瘍細胞から由来した腫瘍の形成を動物モデルで顕著に抑制することが分かった。
＜実験例15＞ 化合物およびアバスチンの併用処理による脳腫瘍の治療効果の評価
本発明に係る実施例の化合物を脳腫瘍の治療薬として処方されているアバスチンと併用処理したとき、動物モデルでその効果を確認するために実験を行った。
より詳細には、5週齢のBalb/c-nudeマウスを利用して、同所性マウスモデル（orthotopic mouse model）を製造した。ここで、脳腫瘍細胞株であるU87MG細胞（ATCC、米国）を定位方法の装置（stereotaxic device）を利用して、ブレグマ（bregma）を基準に左2.2mm、後ろ0.5mmおよび深さ3.5mmで注入した。細胞を注入し、3日後、マウスを5匹ずつ3つの群（対照群（Vehicle）、アバスチン群、または実施例12の化合物とアバスチン投与群）に分けて、薬物を投与した。実施例12の化合物は、30mg/kgの投与量を経口投与し、アバスチンは10mg/kgの投与量を腹腔内に注射した。以後、前記のマウスが全体の体重の20%以上が減少したり、異常行動を示すなどの腫瘍形成所見を示せば生存期間を測定した。その結果、統計プログラムを利用して示した生存グラフを図24に示した。
その結果、図24に示すように、実施例12の化合物をアバスチンと併用処理する場合には、アバスチンによる脳腫瘍の治療効果がさらに顕著に増加することが分かった。
＜実験例16＞ 比較例化合物のLRRK2タンパク質に対するリン酸化阻害活性の評価（in vitro）
LRRK2タンパク質阻害剤として公知の化合物である比較例化合物のin vitroでの薬効評価のために脳腫瘍患者由来細胞株であるNCC01細胞を用いてウエスタンブロット実験を行った。
より詳細には、7.5x105〜1.0x106個の細胞に比較例で製造した化合物を0.1または1.0μMの濃度でそれぞれ処理し、1日が経過した後にサンプルを収集し、ウエスタンブロットを介してLRRK2タンパク質に対するリン酸化阻害活性を評価した。実施例化合物を処理していない群を無処理群（Vehicle）とした。その結果を図25に示した。
図25に示すように、本発明に係る比較例化合物は、LRRK2タンパク質を阻害することが知られているが、LRRK2タンパク質に対するリン酸化は抑制しないことを確認した。
＜実験例17＞ 化合物のLRRK2タンパク質に対するリン酸化阻害活性の評価（in vitro）-（2）
in vitroでの薬効評価のために脳腫瘍患者由来細胞株である448Tを利用して、ウエスタンブロット実験を行った。実験はNCC01細胞の代わりに448T細胞（サムスンソウル病院、大韓民国）を使用して、実施例10、11、12、20および21で製造した化合物を処理したことを除いては、実験例5と同様の条件および方法で行った。
その結果、図26に示すように、本発明に係る実施例10、11、12、20および21の化合物は、無処理群（Vehicle）に比べて脳腫瘍患者由来細胞株である448T細胞でLRRK2タンパク質に対するリン酸化を顕著に抑制した。
従って、本発明に係る化合物が脳腫瘍患者由来細胞株で発現されるLRRK2タンパク質に対するリン酸化を抑制することを再確認した。
＜実験例18＞ 化合物の濃度によるLRRK2タンパク質に対するリン酸化阻害活性の評価（in vitro）-（2）
本発明に係る実施例の化合物が448T細胞に対して詳細にはどのような濃度範囲で効能が優れているのかを確認するために実験を行った。実験はNCC01細胞の代わりに448T細胞を使用して、実施例12で製造した化合物を50、100、500、1000、2000nMの濃度で処理したことを除いては、実験例6と同じ条件および方法で行った。
その結果、図27に示すように、実施例12の化合物は、50nMの濃度でLRRK2タンパク質に対するリン酸化をほとんど抑制させた。
このことから、本発明に係る化合物は、nM単位の低濃度でもLRRK2タンパク質に対するリン酸化を顕著に抑制することを再確認した。
＜実験例19＞ 動物モデルでの化合物の脳腫瘍細胞の成長阻害活性の評価-（2）
本発明に係る実施例の化合物が、動物モデルで脳腫瘍細胞の成長抑制活性を示すことを確認するために実験を行った。実験はNCC01細胞の代わりに448T細胞を使用して、実施例12、20および21で製造した化合物を60mg/kgで経口投与したことを除いては、実験例14と同じ条件および方法で行った。
その結果、28に示すように、化合物を処理していない無処理群では、448T細胞を注入した位置に腫瘍が形成されたが、実施例12、20および21で製造した化合物を経口投与した群では、腫瘍の形成が観察されなかった。
このことから、本発明に係る実施例の化合物は、脳腫瘍細胞から由来した腫瘍の形成を動物モデルで顕著に抑制することを再確認した。
＜実験例20＞ 実施例および比較例の化合物のLRRK2タンパク質に対するリン酸化阻害活性の評価（in vitro）
LRRK2タンパク質阻害剤として公知の化合物である比較例化合物のin vitroでの薬効を評価するために実験を行った。実験はNCC01細胞の代わりに448T細胞を使用して、実施例1、11および12で製造した化合物を処理したことを除いては、実験例16と同じ条件および方法で行った。
その結果、図29に示すように、比較例化合物は、LRRK2タンパク質を阻害することが知られているが、本発明に係る実施例1、11、および12の化合物とは異なり、LRRK2タンパク質に対するリン酸化は抑制しないことを確認した。
＜製剤例1＞ 薬学的製剤の製造
1-1.散剤の製造
本発明のLRRK2タンパク質阻害剤500mg
乳糖100mg
タルク10mg
前記の成分を混合して気密包に充填して散剤を製造する。
1-2.錠剤の製造
本発明のLRRK2タンパク質阻害剤500mg
トウモロコシのでんぷん100mg
乳糖100mg
ステアリン酸マグネシウム2mg
前記の成分を混合した後、通常の錠剤の製造方法によって打錠して錠剤を製造する。
1-3.カプセル剤の製造
本発明のLRRK2タンパク質阻害剤500mg
トウモロコシのでんぷん100mg
乳糖100mg
ステアリン酸マグネシウム2mg
通常のカプセル剤の製造方法によって、前記の成分を混合して、ゼラチンカプセルに充填してカプセル剤を製造する。
1-4.注射剤の製造
本発明のLRRK2タンパク質阻害剤500mg
注射滅菌蒸留水 適量
pH調整剤 適量
通常の注射剤の製造方法によって、1アンプルあたり（2ml）前記の成分含量で製造する。
1-5.液剤の製造
本発明のLRRK2タンパク質阻害剤100mg
異性化糖10g
マンニトール5g
精製水 適量
通常の液剤の製造方法によって精製水にそれぞれの成分を加えて溶解させ、レモンの香りを適量加えた後、前記の成分を混合した後、精製水を加えて全体100mlに調節した後、茶色の瓶に充填し、滅菌して液剤を製造する。

Claims (3)

  1. 以下の化合物群：
    (1) 5-クロロ-N4-（2-（イソプロピルスルホニル）フェニル）-N2-（2-メトキシ-4-（4-（4-メチルピペラジン-1-イル）ピペリジン-1-イル）フェニル）ピリミジン-2,4-ジアミン;
    (10) 2-[（2-メトキシ-4-[[4-（4-メチルピペラジン-1-イル）ピペリジン-1-イル]カルボニル]フェニル）アミノ]-5,11-ジメチル-5,11-ジヒドロ-6H-ピリミド[4,5-b] [1,4]ベンゾジアゼピン-6-オン;
    （11） （4-（4-（エチルアミノ）-5-（トリフルオロメチル）ピリミジン-2-イルアミノ）-2-フルオロ-5-メトキシフェニル）（モルホリノ）メタノン;および
    （12） （3-メトキシ-4-（4-（メチルアミノ）-5-（トリフルオロメチル）ピリミジン-2-イルアミノ）フェニル）（モルホリノ）メタノン
    から選択されるいずれか１つの化合物、またはこの薬学的に許容可能な塩を有効成分として含む、４期の脳腫瘍の予防または治療用薬学的組成物。
  2. 薬剤学的に治療可能な量の以下の化合物群：
    (1) 5-クロロ-N4-（2-（イソプロピルスルホニル）フェニル）-N2-（2-メトキシ-4-（4-（4-メチルピペラジン-1-イル）ピペリジン-1-イル）フェニル）ピリミジン-2,4-ジアミン;
    (10) 2-[（2-メトキシ-4-[[4-（4-メチルピペラジン-1-イル）ピペリジン-1-イル]カルボニル]フェニル）アミノ]-5,11-ジメチル-5,11-ジヒドロ-6H-ピリミド[4,5-b] [1,4]ベンゾジアゼピン-6-オン;
    （11） （4-（4-（エチルアミノ）-5-（トリフルオロメチル）ピリミジン-2-イルアミノ）-2-フルオロ-5-メトキシフェニル）（モルホリノ）メタノン;および
    （12） （3-メトキシ-4-（4-（メチルアミノ）-5-（トリフルオロメチル）ピリミジン-2-イルアミノ）フェニル）（モルホリノ）メタノン
    から選択されるいずれか１つの化合物、またはこの薬学的に許容可能な塩を有効成分として含有する第1成分、および、薬剤学的に治療可能な量のアバスチンを有効成分として含有する第2成分を含む、４期の脳腫瘍の予防または治療用薬学的キット。
  3. 前記第1成分および第2成分が順次または同時投与されることを特徴とする、請求項２に記載の脳腫瘍の予防または治療用薬学的キット。
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