JP6725495B2 - マイクロ流体デバイスのアウトプットを分析する装置及び方法 - Google Patents

Description

本ＰＣＴ出願は、２０１４年８月１４日に出願の米国仮特許出願第６２／０３７２７３号の優先権を主張するものであり、その開示はあらゆる目的のために参照により全て本願に援用される。

本発明はマイクロフルイディクス（マイクロ流体工学）分野、特にはマイクロ流体デバイスのアウトプット、例えば液滴を分析するデバイス及びプロセスに関する。

ミクロスケールのエマルジョンを多数の独立した化学反応を行うための独立した区画として用いる液滴ベースのアッセイは近年、幅広い生物医学的用途向けのプラットフォームとして人気を博している。流体を単離するのにミリメートルサイズのウェルプレートを用いる従来の実験室的アプローチとは異なり、マイクロメートルスケールの液滴はピコリットル（１０^-12Ｌ）の流体しか含有せず、体積を１０⁶倍縮小することができる。さらに、従来のウェルプレートで利用可能な数百の区画とは異なり、マイクロフルイディクスでは液滴を１分あたり１０⁶個の高速で作り出すことができ、従来の技法と比較すると区画数は１０⁴倍を超えて増加する。超並列極小体積アッセイによりもたらされる感度の飛躍的な上昇は、タンパク質及び核酸の両方の１つの分子の検出、時間の関数としての分子濃度のモニタリング、指向進化のためのハイスループットスクリーニングの実行及び単一細胞のアッセイに利用されてきた。

液滴を作り出し処理するマイクロフルイディクス技術を小型化し、コンパクトでモノリシックなチップに集積させることはできるものの、液滴ベースのアッセイの読み出しの小型化はより困難であった。（１）結合事象に基づいて蛍光を明滅させることができる分子ビーコンは、過剰な試薬を洗い流す余分なステップを不要にし、（２）異なる色の蛍光色素により１つの液滴中の複数の標的を検出することができ、（３）広く利用されている蛍光ベースの試薬はアッセイの展開を容易にすることから、蛍光ベースの検出を用い得る。これまでの研究は、蛍光検出を液滴マイクロフルイディクス技術と統合し、細胞の蛍光検出を小型化しようとするものであった。静的な液滴の顕微鏡写真を１回の撮影で１０⁶個もの解像能でもって撮影できる広視野顕微鏡技法が開発されてきた。他の研究者グループは流入物検出システムを開発し、このシステムではリアルタイム選別、ダウンストリームプロセッシング及び、１秒あたり１０⁴個もの液滴という、静的技法で可能なものよりはるかに多い数の液滴を測定できるという利点を有する。しかしながら、これらの技法は複雑な光学素子を必要とし、また２本以上のチャネルのモニタリングが容易ではない。

本発明の態様は、マイクロ流体デバイスのアウトプットを分析するデバイス及びプロセスに関する。

一態様において、本発明は、液滴を分析するためのマイクロ流体デバイスを提供する。このマイクロ流体デバイスは、基板とこの基板上に形成されたマイクロ流体チャネルとを含む。マイクロ流体チャネルは複数の流路を含み、複数の流路のそれぞれは、その流路を通過する液滴の信号を変調するように構成されたマスクパターンを有するため、複数の流路を通過する液滴が複数の信号を生成する。マイクロ流体デバイスは、これら複数の信号を検出するように構成された検出器も含む。

別の態様において、本発明は、液滴を分析するためのマイクロ流体デバイスを提供する。このマイクロ流体デバイスは、基板とこの基板上に形成されたマイクロ流体チャネルとを含む。マイクロ流体チャネルは複数の流路を含み、複数の流路のそれぞれはマスクパターンを有する。各マスクパターンは流路を通過する液滴の蛍光信号を変調するように構成されているため、複数の流路を通過する液滴が複数の蛍光信号を生成する。マイクロ流体デバイスは、複数の蛍光信号を同時に検出するように構成された検出器も含む。

さらに別の態様において、本発明は、基板上に形成された、複数の流路を含むマイクロ流体チャネルを有するマイクロ流体デバイスで複数の液滴を分析する方法を提供する。この方法は、複数の液滴に複数の流路を通過させるステップと、これら複数の流路上に形成された複数のマスクパターンを使用するステップと、複数の液滴からの複数の信号を変調するステップと、複数の信号を検出するステップとを含む。

上記の全般的な説明及び以下の詳細な説明は共に本発明の例であって本発明を限定するものではないことを理解されたい。

以下の詳細な説明を添付の図面と併せて読むことで本発明を最もよく理解することができる。同様の要素は同じ参照番号を有する。同様の要素が複数存在する場合は、それら複数の同様の要素に１つの参照番号を割り当て、小文字の名称でもって特定の要素を指す。要素に集合的に言及する又は１つ以上の不特定の要素に言及する場合は、小文字の名称を記載しない場合がある。慣例にのっとり、別段の定めがない限り、図面に描かれた様々な特徴は縮尺通りではないことを強調する。むしろ、明確にするために、様々な特徴の大きさを拡大又は縮小する場合がある。図面に含まれるのは以下の図である。

本発明の態様によるマイクロ流体デバイスの概略図である。 本発明の態様によるマイクロ流体デバイスの概略断面図である。 本発明の態様による１０５ビット長のマスクパターンから得られた振幅変調信号を示すグラフである。 本発明の態様によるマイクロ流体デバイスの写真である。 本発明の態様による信号測定の概略フロー図である。 本発明の態様による二次元速度相関である。 本発明の態様による生信号データ及び対応する直交相関ベクトルに関連するグラフである。 本発明の態様によるマイクロ流体デバイスの概略断面図である。 本発明の態様によるデバイスの一部の光学顕微鏡写真である。 本発明の態様によるマイクロ流体デバイスの概略図である。 本発明の態様による蛍光顕微鏡写真である。 本発明の態様によるマイクロ流体デバイスの概略図である。 本発明の態様による信号検出器のチップ回路図である。 本発明の態様による生信号データ及び対応する直交相関ベクトルに関連するグラフである。 本発明の態様による複数の液滴についての生信号データ及び対応する直交相関ベクトルに関連するグラフである。 本発明の態様による複数の液滴を分析する方法の選択されたステップを示すフロー図である。 本発明の態様によるマスクパターニングした流路を通過する２つの液滴を示すグラフである。 本発明の態様によるマスクパターニングした流路を通過する液滴を示すヒートマップである。 本発明の態様によるマスクパターニングした流路を通過する液滴を示すヒートマップである。 本発明の態様によるマイクロ流体デバイスの測定能の感度及び特異度を示す受信者操作特性曲線である。 本発明の態様によるマイクロ流体デバイスの感度及び特異度に信号対雑音比が及ぼす影響を示す受信者操作特性曲線である。 本発明の態様によるマイクロ流体デバイスの感度及び特異度にマスクパターンのビット数が及ぼす影響を示す受信者操作特性曲線である。 本発明の態様によるマイクロ流体デバイスの感度及び特異度に流路数が及ぼす影響を示す受信者操作特性曲線である。 本発明の態様によるマイクロ流体デバイスの感度及び特異度に流路数及び液滴数が及ぼす影響を示す受信者操作特性曲線である。 本発明の態様による信号測定の概略フロー図である。 本発明の態様による２つの異なる波長で光を発するマイクロ流体デバイスの概略断面図である。 本発明の態様による励起及び発光スペクトルについての二段階復調の概略フロー図である。 本発明の態様による２つの異なる信号を生成するように構成された２種の染料の励起及び発光スペクトルの図である。 図９ｂの二段階復調の結果に関する概略図である。

本発明の態様は、マイクロ流体デバイスのアウトプットを分析するためのデバイス及びプロセスを対象としている。

発明者らは、マイクロ流体デバイスのアウトプットのバルク分析は有用であると認識している。また、発明者らは、マイクロ流体デバイスのチャネルごとに異なるマイクロパターニングされたマスクを使用してアウトプット、例えば液滴からの信号をコード化することで、高価でかさばる光学検出器を必要とすることなく弱い信号を回復させることができると認識している。さらに、発明者らは、マスクを使用することで複数のチャネルを同時にモニタし、追加の高価な検出ハードウェア（例えば、レンズ、レーザー）及び複雑な流体制御ハードウェアを必要とすることなくますます複雑化する実験が可能になると認識している。特に、本発明のマイクロ流体デバイスは、１つの検出器を使用して複数のチャネルにおいて液滴を測定でき、同時に行うことさえでき、またレンズ又は手の込んだ流体流量制御を必要としない。したがって、マイクロ流体デバイスの実施形態は、携行のポイント・オブ・ケア使用に適している。

本明細書において、「液滴」とは概して、本発明のデバイス及びプロセスを用いて分析する対象である１種以上の被分析物用のビヒクル及び／又は送達系のことである。マイクロ流体デバイスの場合、適切な被分析物には、以下に限定するものではないが、エマルジョン（例えば、油中水滴型、水中油滴型、水中油中水滴型）、ベシクル、マイクロバブル、ビーズ（例えば、磁性ポリマービーズ）、細胞、病原体、ＤＮＡ、ＲＮＡ、核酸、汚染物質及び同種のものが含まれる。

本明細書において、「信号」とは、外部から検出可能な液滴の任意の特徴のことである。本発明のマイクロ流体デバイスで検出しうる信号例には、電子、磁気、誘電、超音波、蛍光信号が含まれる。

図１ａは、本発明の態様による、液滴を分析するためのマイクロ流体デバイス１００の概略図である。本発明のマイクロ流体デバイスでは、液滴発生器１１０により発生させ得る単分散エマルジョン等の液滴を分析することができる。一実施形態において、液滴発生器１１０は、マイクロ流体デバイス１００の構成要素である。

マイクロ流体デバイス１００の一部は基板上に形成しうる。基板材料例には、ガラス、シリカ、マイラー、ポリシロキサン又はポリジメチルシロキサン（「ＰＤＭＳ」）、ポリアクリルアミド、ポリアクリレート、ポリメタクリレート若しくはこれらの混合物を含めた（ただしこれらに限定するものではない）炭素系ポリマーが含まれる。

マイクロ流体デバイス１００は液滴が流れる複数の流路を含み、これらの流路は集合的にマイクロ流体チャネルと称する場合がある。マイクロ流体チャネルは複数の流体流路１１５を含む。複数の流体流路１１５は液滴発生器１１０と流体連通し且つ液滴発生器１１０から液滴を受け取る。実施形態例において、複数の流体流路１１５のそれぞれを、液滴発生器１１０で生じる液滴が流れる。

複数の流路１１５のそれぞれはそれぞれのマスクパターン（集合的にマスク１２０）を備え、マスクパターンは、流路を通過する液滴により生成される信号を変調するように構成される。１つのマスク１２０として図示しているが、当業者ならば、本明細書の記載内容から、各マスクパターンを独立したマスクとして設け得ること又は２つ以上のマスクパターンを組み合わせて１つのマスクにしうることがわかる。一実施形態において、マスク１２０は、複数の流路の各流路の１つ以上の面上に在るマイクロパターン（例えば、「バーコード」）である。図１ｂを参照するが、各マスクパターンは１つ以上の信号放出部及び１つ以上の信号減衰部を備える。例えば、分析する信号が蛍光である場合、信号放出部は、信号（ここでは光）がマスクを通過できる透明部１２４になり得て、信号減衰部は信号がマスクを透過することを防止する不透明部１２２になり得る。信号放出部及び信号減衰部は、完全に透明〜完全に不透明の間の様々な透明状態を含み得る。ここで、マスクは、リソグラフィによりパターニングされた、ガラス上の金属になり得て、複数の流路１１５の屋根としての役割も果たしうる。当業者ならば、マスク１２０は他の面上に（すなわち、複数の流路１１５の側部又は底部）形成しうることがわかる。マスク１２０は複数の流路１１５の内面上、あるいは複数の流路の上方にある面（例えば複数の流路の上方にある光学フィルタ等）上にも形成しうる。

他の信号、例えば電子、磁気、誘電及び超音波信号の１種以上を対象とする場合、マスク１２０は透明性の状態が異なるもの以外になり得る。すなわち、信号放出部は対象の信号の全て又は一部によるマスクの通過を許容し、信号減衰部はそのような透過を防止する。例えば、磁気信号の場合、マスク１２０は、マスクパターンをコード化するために流路の様々な位置に配置された磁場センサを含み得る。あるいは、センサを磁場から保護するＮｉＦｅ等の高感受性材料を複数の流路１１５上にパターニングすることで同じ結果が得られる。対象とする信号が超音波の場合、マスクパターンは、反射係数が大きい材料を使用して形成しうる。

図１ａに戻るが、分析する信号が蛍光である場合、マイクロ流体デバイス１００は照明器、例えば光源１２５も含み得る。図示した光源１２５は側方照明系であり、液滴内の蛍光染料を励起させる役割を果たす。光源１２５は、液滴内の蛍光色素の励起波長λ_exに合わせた光を発する発光ダイオード（ＬＥＤ）になり得る。光源１２５は、２種以上の蛍光色素の励起波長に合わせた２つ以上の光波長で光を発するように構成しうる。

あるいは、２つ以上の光源を利用することで２つ以上の光波長を有する光を発しうる。照明器は、放出された２つ以上の光波長の位相を互いにずらして変調するように構成しうる。

光源１２５は、照明と無照明とを切り換える及び／又は２つ以上の光波長間で切り換えるように構成しうる。望ましくは、この切り換えは個々の画素下での各液滴の時間中、何度も起き、例えば、１つの画素下での時間中、液滴は１００回、２００回、３００回等の切り換えを経る場合がある。一実施形態において、２つ以上の光波長間での切り換えは周波数３００ｋＨｚで起きるため、各液滴は、各液滴が１つの個々の画素下を通過する間に３００回の励起切り換えを経る。照明と無照明とを切り換える及び／又は２つ以上の光波長間で切り換えるように構成された照明器を用いることでマイクロ流体デバイス１００は絶対信号ではなく相対蛍光信号を各液滴について測定し得て、較正を必要とすることのない向上した被分析物分析が容易となる。

反共振結合を用いることで光をマイクロチップ内に閉じ込め、流体チャネルを均一に強く照明しうる。複数の流路１１５を通過する１種以上の蛍光染料を含有する液滴は光源１２５からの励起光を吸収し、蛍光を発する。液滴が流路１１５を下る間に、その放出された光はマスク１２０により振幅変調される。

マイクロ流体デバイス１００は検出器１３０も含み、検出器１３０は、複数の流路のそれぞれで放出された変調信号を検出する。検出器１３０は、複数の流路１１５のそれぞれで放出された変調信号を同時に検出するように構成しうる。一実施形態においては、図１ｂに図示するように、流路で等方的に放出された蛍光はマスク１２０の各マスクパターンを通って検出器１３０、例えばシリコン光検出器へと入る。図示の実施形態においては、マスク１２０と検出器１３０との間にロングパス光学フィルタ１３２があり、このフィルタが散乱した励起光からのバックグラウンド信号を減弱させる。一実施形態においては、光源１２５が２つ以上の光波長で光を発する場合、２つ以上の光学フィルタが利用されるように追加の光学フィルタを用い得て、各フィルタは２つ以上の光波長のそれぞれの波長に対応し、またマスクパターンと光検出器との間に配置される。２つ以上のフィルタは、２つ以上の蛍光信号を復調するように構成しうる。２つ以上のフィルタはロングパスフィルタとしても構成し得て、また各液滴が各フィルタ下を連続的に通過するように空間的に離間しうる。検出器１３０はマスク１２０の真上に座しうる。

液滴がマスクパターン下を通過する時、その放出された光は信号減衰部１２２によりブロックされた状態から信号放出部１２４により伝播される状態へと遷移し、これにより２値の振幅変調された信号Ｖ_d（ｔ）が得られる。一実施形態において、ｎ複数本の流路１１５のそれぞれについてのマスクパターンｍ_nは一連の１と０で定義し得て、１は透明に対応し、０は不透明に対応する。マスク１２０を液滴に近接させて置くことで、マスクパターンの各ビットは液滴から放出される光の立体角の取りうる最大値を確実に規定し、１と０との違いがはっきりする。

マスクパターンは８０〜１２５ビットに及び得る。一実施形態において、マスクパターンは１００ビットを超える。１つのシステム（ＳＮＲ＝−６ｄＢ、ｃ＝４つのチャネル）においては、パフォーマンスを大きく低下させることなくマスク長さをＬ＝１００ビットまで減少させ得ることが判明した（ＡＵＣ＝０．９９９）。そのようなシステムにおいては、Ｌ＝５０ビットを下回ると、感度及び特異度がかなり低下することがある。

マスク１２０内のマスクパターンは望ましくは、エネルギーＥ（ｍ_a＊ｍ_a）が最小となるように最小で互いに相関しうる。これにより液滴は同じチャネルの異なる流路の検出領域に同時に存在することができ、また互いに区別することができる。好ましくは、マスクパターンは複数の流路１１５のそれぞれで異なる。一実施形態において、マスクパターンは互いに最小で相互相関しうるため、エネルギーＥ（ｍ_a＊ｍ_b）はａ≠ｂで最小となる。これにより異なるチャネルからの信号は最大限に分離することができる。

最大周期列（ＭＬＳ）として知られる擬似乱数ベクトルをフィードバックレジスタを用いて生成することができる。長さＬ＝２^M−１のシーケンスの場合、シフトレジスタの要素は次数Ｍの原始多項式ｈ（ｘ）により定義される。このシフトレジスタを繰り返すことで、最小で自己相関していると証明できる一連の１及び０を生成することができる。複数のチャネルを形成するため、二次元ＭＬＳはＭａｃＷｉｌｌｉａｍｓ ａｎｄ Ｓｌｏａｎｅ著のＰｓｅｕｄｏ−ｒａｎｄｏｍ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ａｎｄ ａｒｒａｙｓに記載されるように一次元のＭＬＳを畳み込んで二次元アレイとすることで生成しうる。

ＩＥＥＥ６４：１７１５−１７２９（１９７６）の手順
マスクパターニングは、検出器１３０で得られた一次元信号を一組のベクトルに展開することを可能にし、各ベクトルは複数の流路１１５の１つを表す。図１ｃは、１０５ビット長のマスクパターンの例と通過する液滴からの対応する振幅変調信号Ｖ_dをグラフで表したものである。この時間コード化には２つの役目がある。（１）相関型の信号回復を用いて弱い信号（ＳＮＲ＜＜１）を回復できるため、レンズ、レーザー又は高感度の検出器を含まない単純なハードウェア実装が可能になる。（２）検出器を１つだけ使用して複数のチャネルを独立してモニタでき、ハードウェアを複雑にすることなく１つのチップ上で追加のアッセイを行うことができる。

各ビット長は均一である。一実施形態において、ビット長は８０μｍであり、１０５ビット長のマスクパターンの場合、長さが８．４ｍｍの検出領域となる。当業者ならば、ビット長がビット毎に異なる場合もあることがわかる。

図１ｄは、本発明の態様による液滴を分析するためのマイクロ流体デバイス１００の写真である。この実施形態において、システムは携帯電話程度の大きさである（１０ｘ５ｘ２ｃｍ³）

光検出器からの信号Ｖ_d（ｔ）の処理は、蛍光液滴が検出領域を通過したか否かの予備的な判断、また通過したならば、複数の流路１１５のどれを通過したかを判断することを含み得る。これを目的として、マイクロ流体デバイス１００は、複数の蛍光信号のそれぞれをマスクパターンと相関させるように構成された回路も含み得る。信号はベクトルセットΨｎに投影し得て、それぞれ通過する液滴からの信号Ｖｄ（ｔ）とマスクｍ_nのそれぞれとの相対相関を表す。図２ａに示すように、光検出器で測定された信号Ｖｄ（ｔ）はベクトルΨｎ（τ）＝Ｖｄ（ｔ）＊ｍ_n（ｘ／ｖ）＝∫Ｖｄ（ｔ）ｍ_n（ｘ／ｖ＋τ）ｄｔ（−∞〜∞）に投影され、それぞれ液滴が個々のチャネルｎを通過し、速度ｖで移動した確度を表す。

１０ｎＭのローダミンを含んだ液滴が検出領域を通過する際に光検出器から出てくる生データの例を図２ｃにおいてＶ_dとして示す。信号が相関器のバンクを通過した後（図２ａ）、ベクトルセットΨ１、Ψ２、Ψ３及びΨ４が生成され、各ベクトルは複数の流路１１５の特定のチャネルに対応する。液滴はΨ２において大きなピークを引き起こし、これは液滴がそのチャネルを通過したことを示唆している。発明者らはこれらのベクトルのそれぞれに適用されるゲーティング閾値Ψｔを定義し（緑色の破線で示す）、その閾値を超えると蛍光液滴が検出されたとみなす。

上記のピーク検出は、液滴の速度についての情報でもって強化しうる。しかしながら、発明者らは、液滴及び流量の制御は不要であることを発見した。特に、速度が分散した液滴に適合可能なアルゴリズムを用い得る。二次元相関ｍ_n（ｘ／Ｖ）＊Ｖｄ（ｔ）を計算し得て、Ｖは様々な速度の一次元マトリックスである［ｖ最小：ｖ最大］。この二次元相関はＭＡＴＬＡＢを用いて計算しうる。図２ｂは、速度ｖ及び時間ｔの二次元マトリックスとしての出力を示し、そこから二次元空間におけるピーク位置（ｖｐ、ｔｐ）を正確に見つけることができる。この技法では、液滴の速度は検出領域において時間中（約５０ミリ秒）一定であると仮定しており、これを実験的に検証した。この特定の実施形態においては、３つの異なる速度の３つの液滴を観察しうる。

検出は、光源１２５を照明と無照明とを切り換える及び／又は２つ以上の光波長の間で切り換えることでさらに改善しうる。励起光の変調により、信号の周波数は光検出器１３０の低周波数ノイズから離れるようにシフトし、低ＳＮＲ液滴を検出する能力が改善される。２つの励起源及び２つの吸収フィルタからの液滴の応答をコード化することで、各液滴を４つの考えられ得る組み合わせで独立して測定する。一実施形態においては、３つのパラメータを測定することで液滴の存在を検出しうる（例えば、２つの蛍光チャネル及び明視野散乱（ＳＳＣ））。

図５を参照するが、複数の液滴を、基板上に形成された、複数の流路を含むマイクロ流体チャネルを有するマイクロ流体デバイスで分析するプロセスの選択されたステップを示すフロー図である。本明細書に記載の方法に関し、本明細書の記載から、望ましい結果を依然として得つつも１つ以上のステップを省略しうる及び／又は方法の記載のシーケンス以外（同時を含む）で実行しうるとわかることに留意されたい。

ステップ５１０において、複数の液滴に複数の流路（例えば、複数の流路１１５、図１ａ）を通過させる。複数の液滴は例えば液滴発生器１１０により発生させ得る。

ステップ５２０において、複数の液滴からの複数の信号を、複数の流路上に形成された複数のマスクパターン（例えば、マスク１２０、図１ａ）を使用して変調する。各マスクパターンは１つ以上の信号放出部及び１つ以上の信号減衰部を有しうる。検出する信号が蛍光又は光である場合、１つ以上の信号放出部は透明部になり得て、１つ以上の信号減衰部は不透明部になり得る。さらに、１つ以上の信号放出部は様々な透明性の状態のパターンを形成しうる。複数のマスクの透明部及び不透明部は好ましくは少なくとも約１００ビットを有するバイナリパターンに対応しうる。一実施形態において、複数の流路のそれぞれは複数のマスクからの対応するマスクを有する。

ステップ５３０において、複数の信号を検出する。複数の信号は、検出器１３０、例えば光検出器を使用して検出しうる。検出器はマスク１２０に対して直接的に配置されえて、あるいはフィルタ１３２を検出器（例えば、光検出器１３０）とマスク１２０との間に配置されうる。

ある実施形態においては、信号が蛍光信号であり検出器が光検出器である場合、複数の流路をステップ５３０の前に照明する。例えば照明と無照明との切り替え及び／又は２つ以上の光波長の間での切り替えによる複数の流路の照明の切り換えにより、蛍光信号の検出を円滑に進めうる。一実施形態において、複数の流路の照明の切り換えは、照明器、例えば光源１２５を繰り返しオン／オフにすることを含む。別の実施形態において、複数の流路の照明の切り換えは、それぞれが１つ以上の光波長を有する２つ以上の光間での切り替えを含む。各光は、残りの光を形作る１つ以上の波長とは異なる１つ以上の光波長を有するように構成しうる。例えば、複数の流路を照明するステップは照明器を含みえて、この照明器はそれぞれがある光波長を有する２つ以上の光を発生するように構成し得て、照明器は、複数の流路の照明ステップ中、２つ以上の光間で切り替わる。

液滴は、２つ以上の複数の蛍光信号を生成するために２種以上の蛍光染料を含み得る。各複数の蛍光信号は異なる光波長に対応しうる及び／又は異なる発光スペクトルを有しうる。

検出器で検出した複数の信号を追加で、複数のマスクのうちの対応するマスクと相関させ得る。

以下の実施例は、本発明の全体的な特性を実証するためのものである。さらに、これらの実施例では、安定した単分散マイクロバブルを発生させること並びに本発明の原理にしたがったマイクロ流体デバイス及び関連するプロセスを用いることで改善された結果が得られることを示す。

図３ａに示すように、デバイスを、成形ＰＤＭＳ流体チャネルを形成するためのソフトリソグラフィとマスクを形成するためのガラス上でのＮｉの標準的な平面リソグラフィとの組み合わせ用いて作製した。Ｓｉ光検出器はチップの真上に座し、フィルタを使用して散乱した励起光をブロックする。成形ＰＤＭＳ層を、標準的な単層ＳＵ−８リソグラフィ（ＳＵ−８ ２０２５、ＭｉｃｒｏＣｈｅｍ）を用いて厚さ８０μｍのフィーチャで形成した。マスクをガラス上のＮｉに、標準的な平面光リソグラフィを用いてパターニングした。まず、Ｎｉをガラススライドに熱蒸着させた（Ｋｕｒｔ Ｌｅｓｋｅｒ ＰＶＤ ７５、Ｗｏｌｆ Ｎａｎｏｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ Ｆａｃｉｌｉｔｙ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ）。続いて、マスクパターンを、Ｎｉのウェットエッチング（塩化鉄（ＩＩＩ））を用いてリソグラフィにより画成した（Ｓｈｉｐｌｅｙ １８１３）。ＮｉにパターニングしたガラススライドをＰＤＭＳスタンプ接合を用いて成形ＰＤＭＳ層に恒久的に接合した。図３ｂは、デバイスの一部の光学顕微鏡写真である。スケールバーは１６０μｍである。

図３ｃに示すように、液滴をＴ字部を用いて発生させた。液滴にはローダミンを含ませた。スケールバーは６０μｍである。４つのＴ字部を１つのデバイスに、オイルの入口は一ヶ所で、ハイブリッドソフトリソグラフィ／レーザー加工により統合した。チップを（１）ミクロスケールの液滴メーカ及び流体チャネルをＰＤＭＳの層に形成するためのソフトリソグラフィと（２）オイルを個々の液滴メーカに均一に送るためのより深く（ｄ＝２００μｍ）レーザー彫刻されたチャネルを有するＰＤＭＳの第２層にビアを形成するための直接レーザー微細加工との組み合わせを用いて作製した。Ｔ字部の開口部は幅１００μｍ、深さ５０μｍであった。ミネラルオイルを連続相として使用した（５％Ｖ／ＶのＳｐａｎ ８０及び１％Ｖ／ＶのＴｗｅｅｎ（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ））。水相の流量は０．１ｍＬ／時間であり、油相の流量は１ｍＬ／時間であり、シリンジポンプ（Ｂｒａｉｎｔｒｅｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して制御した。図３ｄに示すように、液滴の平均サイズは６０μｍでありＣＶは約５％であった。４つの水性インプット用のオンチップ貯留部を使用し、タイゴン（Ｔｙｇｏｎ）チューブを使用して２つのチップを接続すると、１つのシリンジポンプでデバイスを動かすことができた。２つの別々のチップモジュールを接続するのにチューブを使用したのは、プロトタイピングし易くするためであった。コンパチブルな作製ストラテジーで作製した液滴発生器及び検出モジュールも同じチップに集積させた。

図３ｆに示すように、光検出器からの出力電流をカスタム電子機器を使用して、増幅し、デジタル化し、処理した。光検出器センサは、λ＝６００ｎｍで２００ｍＡ／Ｗの応答性を有した。光検出器をＧ＝０．７５ｘ１０６Ｖ／Ａトランスインピーダンス増幅器（帯域ＤＣ−２０ｋＨｚ、Ｔｈｏｒ ＰＤ１００Ａ）に接続した。トランスインピーダンス増幅器の出力を、ゲイン２０、ハイパス周波数ｆＨ＝１Ｈｚ及びローパス周波数２０ｋＨｚ（Ｉｔｈａｃｏ）の前置増幅器（ＰＡ）にＡＣ結合した。ＰＡの出力をアナログ／デジタル変換器（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、ＮＩ ＵＳＢ−６００９）に接続し、この変換器は信号を４０ｋＳ／秒でデジタル化し、分析のために信号をコンピュータ又はスマートフォンへＵＳＢ上で送った。全ての分析をパーソナルコンピュータ（ＭＡＴＬＡＢ）上で行ったが、携行で実行する場合は、この処理をデジタル信号処理（ＤＳＰ）チップを使用して又はクラウドコンピューティングを用いて行いうる。

図３ｅは、どのように反共振結合を用いて側方照明により光をチップに届けるかを示す概略図である。

チップ内の光学素子は、フットプリントが小さい携帯用デバイスにパッケージングできる市販の製品を使用して可能な限り小さく且つ安価なものにとどめた（図１ｄ）。励起光を、ヒートシンク（Ｗａｋｅｆｉｅｌｄ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ、１９７５７−Ｍ−ＡＢ）を備えたカスタムレーザー加工（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｌａｓｅｒ）のアクリルボックスにパッケージ化した超高輝度ＬＥＤ（λ_ex＝５３０ｎｍ）（Ｌｕｍｉｎｕｓ、ＣＢＴ−９０−Ｇ−Ｃ１１−ＪＫ２０１）により得た。ボックスは、スロットコネクタと同様にチップを差し込め、光が反共振結合が最大となる斜角でチップに結合するように設計される。プリント回路基板に搭載したシリコン光検出器（トランスインピーダンス増幅器を集積）を使用した（Ｔｈｏｒ Ｌａｂｓ、ＰＤＡ １００ａ）。λ＝６００ｎｍロングパスフィルタ（＃６９−８６８ Ｅｄｍｕｎｄ ｏｐｔｉｃｓ）をチップと検出器との間に配置することで、励起波長の散乱光の影響を減少させた（反射率９５％）。

デバイス用のマスクパターンの長さは１０５ビットであった。列は、各チャネルの自己相関及びチャネル間の相互相関を最小限にするために可能な限り長く形成した。その長さは、光検出器のサイズにより制限される。シリコン光検出器（Ｔｈｏｒ Ｌａｂｓ、ＰＤＡ１００Ａ）は１０ｘ１０ｍｍ²であり、またレンズは使用しなかったため、これが検出領域のサイズを決定する。マスクの各画素のサイズは液滴のサイズにより決定された。各液滴から等方的に放出された光の大部分を確実にマスクパターンでブロックするために、マスクの画素サイズを液滴のサイズと合わせた。６０μｍの液滴及び８０μｍの画素を用いた。したがって、チャネルあたりの総ビット数は１０ｍｍ／８０μｍ＝１２５に制約された。

自己及び相互相関を最小にするために発明者らの規格に合わせたそれぞれ１０５ビット長のマスクセットを作成するために、ＭａｃＷｉｌｌｉａｍｓ及びＳｌｏａｎｅの著書に記載のプロセスを用いて、擬似ランダム最大周期列（ＭＬＳ）から擬似ランダムマトリックスアレイを作成した。擬似ランダムマトリックスのディメンションは、ＭＬＳシーケンスの特定の許容可能な因数分解である。この場合、ディメンションは１０５ｘ３９＝４０９５＝２１２−１（Ｍ＝１２）であった。これらのシーケンスを、ＭＡＴＬＡＢを使用してランダムに生成したマスクの列と比較した。ＭＬＳから作成したマスクは著しく小さい自己相関及び相互相関を有すると判明した（Ｐ＜１０^-4、両側ｔ検定）。マスクを作成する別のストラテジーも編み出し、そのストラテジーではランダムマスクの大きなライブラリを構築し、次に低自己相関を有するマスクのサブセットを選択した。そのサブセットから、次に低相互相関を有するペアのサブセットを選択し、そのペアから低相互相関を有する４つのセットを選択した。２つの手順により同様の結果が得られたが、ＭＬＳ技法では計算時間はたったの数秒であり、選択技法では数時間かかり、４つを超えるチャネルでは問題外なほど遅くなった。両方ともＭＡＴＬＡＢで行った。

ノイズフロア下の蛍光液滴の測定
発明者らの相関型検出スキームでは、極めて弱い信号（ＳＮＲ＜＜１）をノイズフロア下から回復できる。このプラットフォームは信号をノイズから効率的に分離できるが、これは信号がマスクパターンと相関し、ノイズは相関していないからである。弱い信号を回復できることは望ましい。レンズを使用せずに済み、小型化によく適しているからである。弱い信号を回復できることを実証するために、蛍光が弱い液滴をＳＮＲ約０．２５で測定し、これらは生データでは解像できなかった。図４ａに示すように、信号対雑音比を、通過する液滴からの信号における予測エネルギーを同じ時間間隔でのノイズの平均エネルギーで割ることで計算する。しかしながら、このデータを正しいマスクｍ₂と相関させた後、その相関ベクトルΨにおけるピークは相関データにおいてノイズフロアを大きく上回り（ＳＮＲ＞１０）、簡単に検出された。

検出領域における複数の液滴の同時測定
本発明のプラットフォームの高感度は部分的には検出領域の面積が広い（１０ｘ１０ｍｍ²）ことに由来し、この広い検出領域で蛍光液滴の通過時に蛍光液滴から多数の光子を回収する。しかしながら、広い検出領域を有することは、検出領域が慣用のサイトメトリと同様に１回に１つの液滴に制限され、デバイスのスループットが著しく制限されるという代償を伴う。そのため、マスクを、検出領域内で複数の液滴を同時に解像できるように設計した。低自己相関及び低相互相関のマスクパターンを選択することで、発明者らの相互相関型検出ストラテジーでは、同じチャネルに沿って、又は異なるチャネルにおいて異なる位置で同時に液滴を解像できた。

その能力を実証するために、検出領域を通過した３つの液滴を同時に、全て同じチャネルで測定した。図４ｂに示すように、生データにおいて、３つの信号はオーバーラップし、解像不可能であった。しかしながら、このデータを正しいマスクと相関させた後、相関ベクトルΨにおける３つのピークは十分に分離され、個別に解像できた。

マルチチャネル検出
本プラットフォームの利点は、液滴を複数のチャネルで同時に検出できることである。この能力の特性を明らかにするために、液滴を特定のチャネルに送り、デバイスの出力を予測される結果と比較した。この機能を図６ａにおいて実証し、この図は検出領域を通過する２つの液滴を示し、液滴のうちの一方はチャネル１を通過し、もう一方はチャネル２を通過する。このデータを正しいマスクと相関させた後、チャネル２のはっきりとしたピークは第１の液滴に対応し、チャネル１のはっきりとしたピークは第２の液滴に対応し、液滴の正確なチャネルを速やかに同定することができた。

デバイス感度及び特異度の定量化
感度と特異度とのトレードオフの特性を明らかにするために、本発明のデバイスを様々な閾値Ψ_tを用いて試験し、受信者操作特性曲線（ＲＯＣ）を生成した。感度＝ＴＰ／Ｐであり、ＴＰは検出器が通過する液滴を成功裡に検出し、正しくそのチャネルを同定したインスタンスの数であり、Ｐは液滴の総数である。特異度＝検出器のＴＮ／Ｎであり、ＴＮ／Ｎ−ＦＰは真陰性であり、総偽陽性ＦＰ（検出器が液滴を誤って検出するインスタンス）及び陰性Ｎ＝Ｐ^*（ｃ−１）（液滴の総数Ｐ及びチャネルの総数ｃにより定義される）により定義される。

まず液滴を４つのチャネルの１つに一度に通過させ、検出の感度及び特異度を定量化した。図６ｂは実験結果をヒートマップでまとめたものである。デバイスは予測通りに動作した。液滴は通過したチャネルで、ヒートマップの対角線に沿って検出され、対角線を外れた間違ったチャネルでは検出されなかった。黒い点は液滴が通過したチャネルを示す。各試験について、発明者らは約４００個の液滴をＳＮＲ約１で通過させた。選択した閾値Ψ_tに関し、感度は１．０であり、特異度は０．９９４であった。

複数のチャネルで液滴を同時に検出するチップの能力を実証するために、次に、液滴に考えられ得る６つのチャネルセットのそれぞれを通過させた（チャネル１＆チャネル２、チャネル１＆チャネル３等）。図６ｃは、実験結果をヒートマップにまとめたものである。液滴は正しいチャネルセットで検出され、間違ったチャネルでは検出されなかった。各試験において、約８００個の液滴をＳＮＲ約１で通過させた。選択した閾値Ψ_tについて、平均感度は１．０であり、特異度は０．９９３であった。

感度と特異度とのトレードオフの特性を、上記の結果をまとめたＲＯＣ曲線を生成することで明らかにした。おおよそのＳＮＲが約１である液滴の場合、図６ｄは曲線下の面積ＡＵＣ＝０．９９９５を示し、これは１つの光検出器だけを使用して液滴の並行流をロバストにモニタできることを実証している。

設計パラメータの選択がパフォーマンスに及ぼす影響のキャラクタリゼーション
システムの設計の特性を明らかにし、またシステムの設計を支援するために、モデルを用いて様々なパラメータをシミュレートした。モデルはＭＡＴＬＡＢで実行した。簡単に説明すると、液滴がチャネルを通過する時間のある１点Ｔ_p及び液滴が通過する特定のチャネルｎを乱数発生器を使用して確率的に生成する。通過する液滴からの信号Ｖ_d（ｔ）＝ｍ（ｎ，ｘ／ｖ−ｔ_p）＋Ｖ_d（ｔ）をマスクパターンを用いて生成した（液滴速度ｖでスケーリングし、時点ｔｐでの出力信号Ｖ_d（ｔ）にする）。Ｎ個の液滴を繰り返し置いた。ガウス雑音を信号に適切な信号対雑音比ＳＮＲまで加えた。モデルを実験データとの直接比較により検証した。このモデルを用いて、検出ストラテジーの限界を求めた。これが将来の応用及び開発の土台となる。

液滴検出の感度及び特異度がどのように光検出器の信号対雑音比（ＳＮＲ）の関数であるのかを調査した。この研究で用いた装置の場合（Ｌ＝１００ビット、ｃ＝４つのチャネル）、図７ａに示すように、液滴を−１０ｄＢ（０．１）もの低いＳＮＲで高い感度及び精度（ＡＵＣ＝０．９９９１）で検出できた。ＳＮＲが−１３ｄＢ（０．０５）を下回ると、感度及び特異度は急速に低下し始めた。信号がノイズの５％でしかない場合に液滴を解像する能力が、弱い蛍光の液滴を、単純なレンズ不使用の光検出器で解像することを可能にする。

次に、マスクのビット数Ｌがパフォーマンスに及ぼす影響を測定した。プロトタイプにマッチしたシステム（ＳＮＲ＝−６ｄＢ、ｃ＝４つのチャネル）の場合、パフォーマンスを大きく低下させることなくマスクの長さをＬ＝１００ビットまで減少させることができると判明した（ＡＵＣ＝０．９９９）。Ｌ＝５０ビットを下回ると、感度及び特異度が急速に低下した。ビット長に伴うパフォーマンスの向上は２つの要因に起因しうる。（１）ビット数が増大するにつれて、液滴はより多く効果的に測定され、これが平均約√Ｌの信号による有効ＳＮＲの上昇につながる。（２）ビット数が増大するにつれて、チャネル間の相互相関ｍａ＊ｍｂ≠ａは対応して低下し、液滴がチャネルｂ≠ａを通過する場合、Ψ_aのバックグラウンド信号が減少する。

チャネル数の増加に関わる制限のキャラクタリゼーション
そして、モデルシステムを用いて、プロタイプで実証したｃ＝４より多いチャネルを追加する実現可能性を実証した。第１の実験においては、総液滴量を一定してＲ＝Ｒ₀で維持したため、検出領域における液滴の平均数は約１であった。図７ｃに示すように、プロタイプにマッチさせたデバイス（Ｌ＝１００ビット、ＳＮＲ＝−６ｄＢ）の場合、チャネルの数がｃ＝４から１６に増大する間、感度及び特異度は一定であり続けることが判明した。この結果は幾つかの要因に帰することができ、以下を含む。（１）ｃが４から１６に増大する間のチャネル間での相関ｍ_a＊ｍ_b≠aにおける増大はわずかである。（２）Ｌ＝１００ビットから作成できる相関していないマスクの数はｃ．３１ ２よりずっと大きいからである。チャネルの数が増大するにつれて、液滴１つあたりの相関ベクトルΨ_aは増加する。ピーク検出アルゴリズムは、ピーク高さを残りのベクトルΨ_b≠aにおける局所分散と比較することでピークを同定する。チャネルの数ｃが増大すると、アベレージングが増え、偽陽性及び陰性が減少する。

図７ｄに示すように、チップの多重送信能力が液滴密度により若干制限される場合があり、検出領域内の液滴の平均数が約２を超えて増加するとパフォーマンスは低下する。チャネル内の液滴の位置はポアソン統計にしたがったため、検出領域内の液滴の平均数が２を超えると、所与のインスタンスで検出領域において５個を超える液滴が発見される可能性が徐々に高まり、個々の事象を解像する検出器の能力に影響がでた。この現象を試験するために、総液滴量を一定してＲ＝Ｒ０で維持するのではなく、チャネルあたりの液滴量を一定してＲ∝ｃで維持した。液滴量は、チャネルが４つの場合、検出領域においては平均して１度に１つの液滴があるように選択され、チャネルの追加に比例して液滴量は増加した。デバイスのパフォーマンスは、チャネルの追加に比例して低下した。

複数の蛍光染料及び複数の光波長の利用
各液滴中の複数種の蛍光染料を検出するのに蛍光信号の励起波長及び発光波長の両方を変調することで、液滴中の被分析物の検出を改善しうる。図９ａにおいては、２種の蛍光染料（フルオレセイン及びローダミンＢ）はそれぞれ緑色に関係した光波長５３０ｎｍ及び青色に関係した光波長４６０ｎｍに対応する励起波長を有する。望ましくは、蛍光染料を励起させるのに使用する２つの光波長を互いに位相をずらして変調する。

フルオレセイン及びローダミンＢ染料からの波線で示した励起スペクトル及び実線で示した発光スペクトルの例を図９ｃに示す。

２つの異なるロングパス光学フィルタを利用して、液滴からの発光スペクトルを解像する。２つのフィルタは、各液滴がフィルタ下を連続的に通過するように空間的に離間されている。この例において、２つのフィルタのそれぞれは１つの波長、例えば緑の光の波長又は青い光の波長に対応するように構成されるため、一方のフィルタは青い光の波長による励起をブロックし、もう一方のフィルタは緑の光の波長による励起をブロックする。２つのマスクパターンをフィルタと同じ場所に配置することで各フィルタからの応答を復調しうる。

光検出器からの信号を復調することで、２種の染料から受け取った２つの信号を独立して測定する。図９ｂに二段階復調法を示すが、この方法では励起信号及び発光信号の復調が連続的に起きる。この例においては、復調により、図９ｄに示すように、２つの励起源及び２つの吸収フィルタからの応答に関係した４つの考えられ得る組み合わせが得られる。

本発明を本明細書において具体的な実施形態に言及しながら例示、説明してきたが、本発明は記載した詳細に限定されない。むしろ、請求項の均等の範囲内で本発明から逸脱することなく様々な改変を細部に加え得る。

Claims (28)

1. 基板と、
   前記基板上に形成された、複数の流路を含むマイクロ流体チャネルであって、前記複数の流路のそれぞれが、前記流路を通過する各液滴の信号を変調するように構成されたマスクパターンを有し、前記複数の流路を通過する複数の液滴が複数の信号を生成するマイクロ流体チャネルと、
   前記複数の信号を検出するように構成された検出器と、
   を具備し、
   前記複数の流路のそれぞれの前記マスクパターンが、少なくとも１００ビットを有するバイナリパターンに対応する、１つ以上の信号放出部と１つ以上の信号減衰部とを有するマイクロ流体デバイス。
2. 前記マスクパターンが前記複数の流路のそれぞれで異なる請求項１に記載のマイクロ流体デバイス。
3. 前記１つ以上の信号放出部が透明部であり、前記１つ以上の信号減衰部が不透明部である請求項２に記載のマイクロ流体デバイス。
4. 前記透明部及び前記不透明部が１００〜１２５ビットのバイナリパターンに対応する請求項３に記載のマイクロ流体デバイス。
5. 前記マスクパターンが、前記検出器によって前記信号の少なくとも一部を検出できるように構成された１つ以上の信号放出部を有する請求項１に記載のマイクロ流体デバイス。
6. 前記１つ以上の信号放出部が少なくとも２つの透明性の状態を含む請求項５に記載のマイクロ流体デバイス。
7. 前記信号が、蛍光、磁気、誘電及び超音波から成る群から選択される請求項１に記載のマイクロ流体デバイス。
8. 前記信号が蛍光信号であり、前記検出器が光検出器である請求項３に記載のマイクロ流体デバイス。
9. 前記複数の流路を照明するように構成された照明器をさらに具備する請求項８に記載のマイクロ流体デバイス。
10. 前記照明器が、前記複数の流路の照明と無照明とを切り換えるように構成される請求項９に記載のマイクロ流体デバイス。
11. 前記照明器が、２つ以上の光波長を用いて前記複数の流路を照明するように構成される請求項９に記載のマイクロ流体デバイス。
12. 前記照明器が、前記２つ以上の光波長を互いに位相をずらして変調するように構成される請求項１１に記載のマイクロ流体デバイス。
13. 前記マスクパターンと前記光検出器との間に配置される光学フィルタをさらに具備する請求項１１に記載のマイクロ流体デバイス。
14. 少なくとも１つの追加の光学フィルタが、前記マスクパターンと前記光検出器との間に配置され、前記光学フィルタ及び前記少なくとも１つの追加の光学フィルタが、それぞれ前記２つ以上の光波長の１つの波長に対応する請求項１３に記載のマイクロ流体デバイス。
15. 前記液滴が、乳化物、ビーズ、細胞、病原体、ＤＮＡ、ＲＮＡ、核酸、汚染物質及びこれらの組み合わせから成る群からの１種以上の被分析物を含有する請求項１に記載のマイクロ流体デバイス。
16. 基板と、
    前記基板上に形成された、複数の流路を含むマイクロ流体チャネルであって、前記複数の流路のそれぞれがマスクパターンを有し、前記マスクパターンが前記流路を通過する液滴の蛍光信号を変調するように構成され、前記複数の流路を通過する複数の液滴が複数の蛍光信号を生成するマイクロ流体チャネルと、
    前記複数の蛍光信号を検出するように構成された検出器と、
    を具備し、
    前記複数の流路のそれぞれの前記マスクパターンが、少なくとも１００ビットを有するバイナリパターンに対応する、１つ以上の信号放出部と１つ以上の信号減衰部とを有する液滴を分析するためのマイクロ流体デバイス。
17. 前記検出器が光検出器である請求項１６に記載のマイクロ流体デバイス。
18. 前記マスクパターンが前記複数の流路のそれぞれで異なる請求項１７に記載のマイクロ流体デバイス。
19. 前記複数の蛍光信号のそれぞれをマスクパターンと相関させるように構成された回路をさらに具備する請求項１８に記載のマイクロ流体デバイス。
20. 前記液滴が２つ以上の蛍光信号を生成し、各蛍光信号が異なる光波長に対応する請求項１６に記載のマイクロ流体デバイス。
21. 前記２つ以上の蛍光信号を復調するように構成された２つ以上のフィルタをさらに具備する請求項２０に記載のマイクロ流体デバイス。
22. 基板上に形成された、複数の流路を含むマイクロ流体チャネルを有するマイクロ流体デバイスで複数の液滴を分析する方法であって、
    前記複数の流路のそれぞれが、少なくとも１００ビットを有するバイナリパターンに対応する、１つ以上の信号放出部と１つ以上の信号減衰部とを備えたマスクパターンを有し、複数の液滴を前記複数の流路に通過させることと、
    前記マスクパターンを使用して前記複数の液滴からの複数の信号を変調することと、
    前記複数の信号を検出することと、
    を含む方法。
23. 前記マスクパターンが前記複数の流路のそれぞれで異なる請求項２２に記載の方法。
24. 前記複数の信号のそれぞれを対応する前記マスクパターンと相関させることをさらに含む請求項２３に記載の方法。
25. 前記１つ以上の信号放出部が透明部であり、前記１つ以上の信号減衰部が不透明部である請求項２２に記載の方法。
26. 前記透明部及び前記不透明部が１００〜１２５ビットのバイナリパターンに対応する請求項２５に記載の方法。
27. 前記１つ以上の信号放出部が様々な透明性の状態のパターンを形成する請求項２２に記載の方法。
28. 前記複数の信号が、蛍光、磁気、誘電及び超音波の１種以上である請求項２２に記載の方法。