KR102449743B1 - 마이크로유체 디바이스들의 출력을 분석하기 위한 장치 및 방법 - Google Patents
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Abstract
액적들을 분석하기 위한 마이크로유체 디바이스들이 개시된다. 설명된 마이크로유체 디바이스는 기판 및 기판 상에 형성된 마이크로유체 채널을 포함한다. 마이크로유체 채널은 통로들을 포함하며, 여기서 각각의 통로는, 통로들을 통과하는 액적들이 신호들을 생성하도록, 그 통로를 통과하는 액적의 신호를 변조하도록 구성된 마스크 패턴을 갖는다. 마이크로유체 디바이스는 또한 신호들을 검출하도록 구성된 검출기를 포함한다. 기판 상에 형성된 마이크로유체 채널을 갖는 마이크로유체 디바이스로 액적들을 분석하는 방법이 개시된다. 설명된 방법은, 통로들을 통해 액적을 통과시키는 단계; 통로들 상에 형성된 마스크 패턴들을 사용하여 액적들로부터 신호들을 변조하는 단계; 및 신호들을 검출하는 단계를 포함한다.
Description
관련 출원들에 대한 교차-참조
본 개시는 2014년 8월 14일 출원된 미국 가특허 출원 번호 제62/037,273호를 우선권으로 주장하며, 그의 개시는 모든 목적을 위해 그 전체가 인용에 의해 본원에 포함된다.
본 발명은 마이크로유체들(microfluidics)의 분야에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 액적들(droplets)과 같은 마이크로유체 디바이스들의 출력을 분석하기 위한 디바이스들 및 프로세스들에 관한 것이다.
마이크로-스케일 에멀전들(micro-scale emulsions)이 다수의 독립적인 화학 반응들을 일으키기 위한 격리된 구획들로서 사용되는 액적-기반 분석(assay)들이 최근 몇 년간 광범위한 생물의학 애플리케이션들에 대한 플랫폼으로 인기를 얻고 있다. 유체들을 격리하기 위해 밀리미터 크기의 웰 플레이트들(well plates)을 사용하는 종래의 실험실 접근법과 비교하면, 마이크로미터-스케일 액적들은 피콜리터(10-12L)의 유체만을 포함하여 볼륨 면에서 106x 감소를 제공한다. 또한, 종래의 웰 플레이트 상에서 사용 가능한 수백 개의 구획들과 비교하면, 마이크로유체들은 액적들이 분당 106 만큼 높은 레이트로 생성되도록 허용하여, 종래의 기술들에 비해 구획들의 수 면에서 104배 초과의 증가를 제공한다. 대규모 병렬화 초소형 볼륨 에세이들에서 유래한 감도의 엄청난 증가는, 단백질과 핵산 모두의 단일 분자를 검출하고 시간의 함수로서 분자 농도들을 모니터링하고 유도 진화(directed evolution)에 대해 높은-쓰루풋 스크린들(high-throughput screens)을 수행하고, 단일 세포를 에세이하는데 이용되었다.
액적들을 생성하고 프로세싱하기 위한 마이크로유체들이 소형화되고 간결한 모노리식(monolithic) 칩 상에 통합될 수 있지만, 액적-기반 에세이들의 판독은 소형화하기 더욱 어렵게 되었다. 형광-기반 감지가 사용될 수 있는데, 그 이유는, 1) 바인딩(binding) 이벤트들에 기초하여 형광을 턴 온 또는 오프할 수 있는 분자 비콘들(molecular beacons)은 과도한 시약을 씻어내는 추가 단계들을 방지하고; 2) 상이한 컬러의 형광단(fluorophore)들은 단일 액적에서 다수의 타겟들의 검출을 허용하고; 그리고 3) 광범위하게 이용 가능한 형광-기반 시약들은 에세이 개발을 용이하게 하기 때문이다. 형광 검출을 액적 마이크로유체들과 통합하고 세포들의 형광 검출을 소형화하기 위한 이전의 연구가 행해졌다. 단일-샷(single-shot)에서 106만큼 많은 분해하는 능력과 더불어, 정적 액적들의 현미경사진을 찍을 수 있는 광역 현미경(wide-field microscopy) 기술들이 개발되었다. 다른 그룹들은, 실시간 정렬, 다운-스트림 프로세싱 및 초당 104 액적들만큼 많이 측정하는 정적 기술들로 가능한 것보다 훨씬 더 많은 수의 액적들을 측정하는 능력의 이점을 갖는 인-플로우 검출 시스템(in-flow detection system)이 개발되었다. 그러나 이 기술들은 복잡한 광학을 필요로 하며 2개 이상의 채널을 모니터링하기가 쉽지 않다.
본 발명의 양상들은 마이크로유체 디바이스들의 출력을 분석하기 위한 디바이스들 및 프로세스들에 관한 것이다.
일 양상에 따라, 본 발명은 액적들을 분석하기 위한 마이크로유체 디바이스를 제공한다. 마이크로유체 디바이스는 기판 및 기판 상에 형성된 마이크로유체 채널을 포함한다. 마이크로유체 채널은 복수의 통로들을 포함하고, 복수의 통로들 각각은, 복수의 통로들을 통과하는 액적들이 복수의 신호들을 생성하도록, 통로를 통과하는 액적의 신호를 변조하도록 구성된 마스크 패턴을 갖는다. 마이크로유체 디바이스는 또한 복수의 신호들을 검출하도록 구성된 검출기를 포함한다.
다른 양상에 따라, 본 발명은 액적들을 분석하기 위한 마이크로유체 디바이스를 제공한다. 마이크로유체 디바이스는 기판 및 기판 상에 형성된 마이크로유체 채널을 포함한다. 마이크로유체 채널은 복수의 통로들을 포함하고, 복수의 통로들 각각은 마스크 패턴을 갖는다. 각각의 마스크 패턴은, 복수의 통로들을 통과하는 액적들이 복수의 형광 신호들을 생성하도록, 통로를 통과하는 액적의 형광 신호를 변조하도록 구성된다. 마이크로유체 디바이스는 또한 복수의 형광 신호들을 동시에 검출하도록 구성된 검출기를 포함한다.
또 다른 양상에 따라, 본 발명은 기판 상에 형성된 마이크로유체 채널을 갖는 마이크로유체 디바이스로 복수의 액적들을 분석하는 방법을 제공하며, 마이크로유체 채널은 복수의 통로들을 포함한다. 이 방법은, 복수의 통로들을 통해 복수의 액적들을 통과시키는 단계; 복수의 통로들 상에 형성된 복수의 마스크 패턴들을 사용하는 단계; 복수의 액적들로부터의 복수의 신호들을 변조하는 단계; 및 복수의 신호들을 검출하는 단계를 포함한다.
위의 일반적인 설명 및 다음의 상세한 설명 모두는 예시적인 것이며 본 발명을 제한하는 것은 아니란 것이 이해될 것이다.
본 발명은, 유사한 엘리먼트들이 동일한 참조번호들을 갖는 첨부 도면들과 관련하여 판독될 때, 이하의 상세한 설명으로부터 가장 잘 이해될 것이다. 복수의 유사한 엘리먼트들이 존재하는 경우, 단일 참조 번호는 특정 엘리먼트들을 참조하는 소문자 지정을 통해 복수의 유사한 엘리먼트들에 할당될 수 있다. 엘리먼트들을 집합적으로 또는 엘리먼트들의 비-특정의 하나 또는 그 초과를 참조할 때 소문자 지정이 삭제될 수 있다. 통상적인 관행에 따라, 달리 표시되지 않는 한, 도면들의 다양한 특징들은 실척대로 그려지지 않는다는 것이 강조된다. 반대로, 다양한 특징들의 치수들은 명확성을 위해 확장되거나 감소될 수 있다. 도면에는 다음 도면들이 포함된다.
도 1a는 본 발명의 양상들에 따른 마이크로유체 디바이스의 개략적 예시이다.
도 1b는 본 발명의 양상들에 따른 마이크로유체 디바이스의 단면의 개략적 예시이다.
도 1c는 본 발명의 양상들에 따라 105 비트 길이(long) 마스크 패턴으로부터 발생된 진폭 변조된 신호를 도시하는 그래프이다.
도 1d는 본 발명의 양상들에 따른 마이크로유체 디바이스의 사진이다.
도 2a는 본 발명의 양상들에 따른 신호 측정의 개략적인 흐름도이다.
도 2b는 본 발명의 양상들에 따른 2차원 속도 상관이다.
도 2c는 본 발명의 양상들에 따른 미가공 신호 데이터 및 대응하는 직교 상관 벡터들에 관한 그래프들의 세트이다.
도 3a는 본 발명의 양상들에 따른 마이크로유체 디바이스의 단면의 개략적 예시이다.
도 3b는 본 발명의 양상들에 따른 디바이스의 부분의 광학 현미경 사진이다.
도 3c는 본 발명의 양상들에 따른 개략적인 마이크로유체 디바이스이다.
도 3d는 본 발명의 양상들에 따른 형광 현미경 사진이다.
도 3e는 본 발명의 양상들에 따른 개략적인 마이크로유체 디바이스이다.
도 3f는 본 발명의 양상들에 따른 신호 검출기의 개략적인 칩이다.
도 4a는 본 발명의 양상들에 따른 미가공 신호 데이터 및 대응하는 직교 상관 벡터들에 관한 그래프들의 세트이다.
도 4b는 본 발명의 양상들에 따라 다수의 액적들에 대한 미가공 신호 데이터 및 대응하는 직교 상관 벡터들에 관한 그래프들의 세트이다.
도 5는 본 발명의 양상들에 따라 복수의 액적들을 분석하는 방법의 선택된 단계들을 도시하는 흐름도이다.
도 6a는 본 발명의 양상들에 따라 마스크 패터닝된 통로들을 통한 2개의 액적들의 통과를 도시하는 그래프들의 세트이다.
도 6b는 본 발명의 양상들에 따라 마스크 패터닝된 통로들을 통한 액적들의 통과를 도시하는 히트 맵(heat map)이다.
도 6c는 본 발명의 양상들에 따라 마스크 패터닝된 통로들을 통한 액적들의 통과를 도시하는 히트 맵이다.
도 6d는 본 발명의 양상들에 따라 마이크로유체 디바이스의 측정 능력의 감도 및 특이성을 도시하는 수신기 동작 특성 곡선이다.
도 7a는 본 발명의 양상들에 따른 마이크로유체 디바이스의 감도 및 특이성에 관한 신호 대 잡음비의 영향을 도시하는 수신기 동작 특성 곡선이다.
도 7b는 본 발명의 양상들에 따른 마이크로유체 디바이스의 감도 및 특이성에 관한 마스크 패턴의 비트들의 수의 영향을 도시하는 수신기 동작 특성 곡선이다.
도 7c는 본 발명의 양상들에 따른 마이크로유체 디바이스의 감도 및 특이성에 관한 통로들의 수의 영향을 도시하는 수신기 동작 특성 곡선이다.
도 7d는 본 발명의 양상들에 따른 마이크로유체 디바이스의 감도 및 특이성에 관한 액적들의 수 및 통로들의 수의 영향을 도시하는 수신기 동작 특성 곡선이다.
도 8은 본 발명의 양상들에 따른 신호 측정의 개략적인 흐름도이다.
도 9a는 본 발명의 양상들에 따라 2개의 상이한 파장들의 광을 제공하는 마이크로유체 디바이스의 단면의 개략적 예시이다.
도 9b는 본 발명의 양상들에 따른 여기(excitation) 및 방출 스펙트럼에 대한 2-단계 복조의 개략적인 흐름도이다.
도 9c는 본 발명의 양상들에 따라 2개의 상이한 신호들을 제공하도록 구성된 2개의 염료의 여기 및 방출 스펙트럼의 예시이다.
도 9d는 도 9b의 2-단계 복조의 결과들에 대한 개략적 예시이다.
도 1a는 본 발명의 양상들에 따른 마이크로유체 디바이스의 개략적 예시이다.
도 1b는 본 발명의 양상들에 따른 마이크로유체 디바이스의 단면의 개략적 예시이다.
도 1c는 본 발명의 양상들에 따라 105 비트 길이(long) 마스크 패턴으로부터 발생된 진폭 변조된 신호를 도시하는 그래프이다.
도 1d는 본 발명의 양상들에 따른 마이크로유체 디바이스의 사진이다.
도 2a는 본 발명의 양상들에 따른 신호 측정의 개략적인 흐름도이다.
도 2b는 본 발명의 양상들에 따른 2차원 속도 상관이다.
도 2c는 본 발명의 양상들에 따른 미가공 신호 데이터 및 대응하는 직교 상관 벡터들에 관한 그래프들의 세트이다.
도 3a는 본 발명의 양상들에 따른 마이크로유체 디바이스의 단면의 개략적 예시이다.
도 3b는 본 발명의 양상들에 따른 디바이스의 부분의 광학 현미경 사진이다.
도 3c는 본 발명의 양상들에 따른 개략적인 마이크로유체 디바이스이다.
도 3d는 본 발명의 양상들에 따른 형광 현미경 사진이다.
도 3e는 본 발명의 양상들에 따른 개략적인 마이크로유체 디바이스이다.
도 3f는 본 발명의 양상들에 따른 신호 검출기의 개략적인 칩이다.
도 4a는 본 발명의 양상들에 따른 미가공 신호 데이터 및 대응하는 직교 상관 벡터들에 관한 그래프들의 세트이다.
도 4b는 본 발명의 양상들에 따라 다수의 액적들에 대한 미가공 신호 데이터 및 대응하는 직교 상관 벡터들에 관한 그래프들의 세트이다.
도 5는 본 발명의 양상들에 따라 복수의 액적들을 분석하는 방법의 선택된 단계들을 도시하는 흐름도이다.
도 6a는 본 발명의 양상들에 따라 마스크 패터닝된 통로들을 통한 2개의 액적들의 통과를 도시하는 그래프들의 세트이다.
도 6b는 본 발명의 양상들에 따라 마스크 패터닝된 통로들을 통한 액적들의 통과를 도시하는 히트 맵(heat map)이다.
도 6c는 본 발명의 양상들에 따라 마스크 패터닝된 통로들을 통한 액적들의 통과를 도시하는 히트 맵이다.
도 6d는 본 발명의 양상들에 따라 마이크로유체 디바이스의 측정 능력의 감도 및 특이성을 도시하는 수신기 동작 특성 곡선이다.
도 7a는 본 발명의 양상들에 따른 마이크로유체 디바이스의 감도 및 특이성에 관한 신호 대 잡음비의 영향을 도시하는 수신기 동작 특성 곡선이다.
도 7b는 본 발명의 양상들에 따른 마이크로유체 디바이스의 감도 및 특이성에 관한 마스크 패턴의 비트들의 수의 영향을 도시하는 수신기 동작 특성 곡선이다.
도 7c는 본 발명의 양상들에 따른 마이크로유체 디바이스의 감도 및 특이성에 관한 통로들의 수의 영향을 도시하는 수신기 동작 특성 곡선이다.
도 7d는 본 발명의 양상들에 따른 마이크로유체 디바이스의 감도 및 특이성에 관한 액적들의 수 및 통로들의 수의 영향을 도시하는 수신기 동작 특성 곡선이다.
도 8은 본 발명의 양상들에 따른 신호 측정의 개략적인 흐름도이다.
도 9a는 본 발명의 양상들에 따라 2개의 상이한 파장들의 광을 제공하는 마이크로유체 디바이스의 단면의 개략적 예시이다.
도 9b는 본 발명의 양상들에 따른 여기(excitation) 및 방출 스펙트럼에 대한 2-단계 복조의 개략적인 흐름도이다.
도 9c는 본 발명의 양상들에 따라 2개의 상이한 신호들을 제공하도록 구성된 2개의 염료의 여기 및 방출 스펙트럼의 예시이다.
도 9d는 도 9b의 2-단계 복조의 결과들에 대한 개략적 예시이다.
본 발명의 양상들은 마이크로유체 디바이스들의 출력을 분석하기 위한 디바이스들 및 프로세스들에 관한 것이다.
본 발명자들은 마이크로유체 디바이스의 출력의 거시 분석(bulk analysis)을 제공하는 것이 유용할 것이라는 것을 인지하였다. 본 발명자들은 또한, 마이크로유체 디바이스의 각각의 채널에 대해 별개의 마이크로-패터닝된 마스크들을 사용한 출력 예를 들어, 액적들로부터의 신호의 인코딩이, 비싸고 부피가 큰 광학 검출기들에 대한 필요성 없이, 약한 신호들의 복원을 가능케 한다는 것을 인지하였다. 본 발명자들은 추가로, 마스크들의 사용은 다수의 채널들이 동시에 모니터링되도록 허용하여서, 예를 들어, 렌즈들, 레이저들 및 복합 유체 제어 하드웨어와 같은 추가적인 그리고 비싼 검출 하드웨어에 대한 필요성 없이 점점 더 복잡한 실험들을 허용한다는 것을 인지하였다. 특히, 본 발명의 마이크로유체 디바이스는 단일 검출기를 사용하여 다수의 채널들에서 액적들을 심지어 동시에 측정할 수 있으며, 렌즈들 또는 정교한 유체 유동 제어를 필요로 하지 않는다. 따라서, 마이크로유체 디바이스들의 실시예들은 휴대용의 포인트-오브-케어(point-of-care) 사용에 적합하다.
본원에 사용된 "액적(droplet)"은 일반적으로, 본 발명의 디바이스들 및 프로세스들을 사용하여 분석되는 하나 이상의 분석물에 대한 비히클(vehicle) 및/또는 전달 시스템을 지칭한다. 마이크로유체 디바이스들의 맥락 내에서, 적합한 분석물들은 에멀전(예를 들어, 유-중-수(water-in-oil), 수-중-유(oil-in-water), 수-중-유-중-수(water-in-oil-in-water)), 소포들, 마이크로버블들, 비드들(예를 들어, 자성 중합체 비드들), 세포들, 병원체들, DNA, RNA, 핵산들, 오염물들 등을 포함(그러나 이것으로 제한되지 않음)한다.
본원에 사용된 "신호"는 액적의 임의의 외부적으로 검출 가능한 특성을 지칭한다. 본 발명의 마이크로유체 디바이스에 의해 검출될 수 있는 예시적인 신호들은 전자, 자기, 유전성, 초음파, 형광 신호들을 포함한다.
도 1a는 본 발명의 양상들에 따라 액적들을 분석하기 위한 마이크로유체 디바이스(100)의 개략적 예시를 도시한다. 본 발명의 마이크로유체 디바이스는 액적 생성기(110)에 의해 생성될 수 있는 단분산 에멀전들과 같은 액적들의 분석을 허용한다. 일 실시예에서, 액적 생성기(110)는 마이크로유체 디바이스(100)의 컴포넌트이다.
마이크로유체 디바이스(100)의 일부들은 기판 상에 형성될 수 있다. 예시적인 기판 재료들은, 유리, 실리카, 마일라(mylar), 폴리실록산들, 또는 폴리디메틸실록산("PDMS"), 폴리아크릴아미드, 폴리아크릴레이트, 폴리메타크릴레이트 또는 이들의 혼합물을 포함(그러나 이것으로 제한되지 않음)하는 탄소계 중합체들을 포함한다.
마이크로유체 디바이스(100)는 집합적으로 마이크로유체 채널로서 지칭될 수 있는, 액적들이 유동할 수 있는 다수의 통로들을 포함한다. 마이크로유체 채널은 복수의 유체 통로들(115)을 포함한다. 복수의 유체 통로들(115)은 액적 생성기(110)와 유체 연통하고, 액적 생성기(110)로부터 액적들을 수용한다. 예시적인 실시예에서, 복수의 유체 통로들(115) 각각은 액적 생성기(110)에서 발생한 액적들의 스트림을 포함한다.
복수의 통로들(115) 각각은 통로를 통과하는 액적에 의해 생성된 신호를 변조하도록 구성된 각각의 마스크 패턴(집합적으로 마스크(120))을 포함한다. 단일 마스크(120)로 예시되었지만, 당업자는, 각각의 마스크 패턴이 독립적인 마스크로서 구현될 수 있거나 2개 이상의 마스크 패턴들이 하나의 마스크로 결합될 수 있다는 것을 본원의 설명으로부터 인지할 것이다. 일 실시예에서, 마스크(120)는 복수의 통로들의 각각의 통로의 하나 이상의 표면들 상에 상주하는 마이크로-패턴(예를 들어, "바코드")이다. 도 1b를 참조하면, 각각의 마스크 패턴은 하나 이상의 신호 방출 부분들 및 하나 이상의 신호 감쇠(dampening) 부분들로 구성된다. 예를 들어, 분석될 신호가 형광인 경우, 신호 방출 부분들은 신호(여기서는 광)가 마스크를 통과하도록 허용하는 투명 부분들(124)일 수 있고 신호 감쇠 부분들은 마스크를 통한 신호의 투과를 방해하는 불투명 부분들(122)일 수 있다. 신호 방출 부분들 및 신호 감쇠 부분들은 완전 투명과 완전 불투명 사이의 다양한 투명 상태들을 포함할 수 있다. 여기서, 마스크는 복수의 통로들(115)의 지붕으로도 역할을 할 수 있는, 유리 상의 리소그래피적으로 패터닝된 금속일 수 있다. 당업자는, 마스크(120)가 다른 표면들(즉, 복수의 통로들(115)의 측 또는 베이스) 상에 형성될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 마스크(120)는 또한 복수의 통로들(115)의 내부 표면 상에 또는 (예를 들어, 복수의 통로들 위의 광학 필터와 같이) 복수의 통로들 위의 표면 상에 형성될 수 있다.
전자, 자기, 유전성 및 초음파 신호들 중 하나 또는 그 초과와 같은 다른 신호들이 관심 대상인 경우, 마스크(120)는 다양한 투명 상태들 이외의 다른 것으로 구성될 수 있다. 즉, 신호 방출 부분은 관심 신호의 전부 또는 일부가 마스크를 통과하도록 허용해야 하는 반면에, 신호 감쇠 부분은 그러한 투과를 방지해야 한다. 예를 들어, 자기 신호들에 관하여, 마스크(120)는 마스크 패턴을 인코딩하기 위해 다양한 포지션들에서 통로들 상에 포지셔닝된 자기장 센서들을 포함할 수 있다. 대안적으로, 자기장으로부터 센서를 차폐하도록 작용하는, NiFe와 같은 높은 자화율 재료(susceptibility material)가 동일한 결과를 달성하기 위해 복수의 통로들(115) 상에 패터닝될 수 있다. 관심 신호가 초음파인 경우, 마스크 패턴은 큰 반사 계수를 갖는 재료를 사용하여 생성될 수 있다.
도 1a을 다시 참조하여, 형광이 분석될 신호인 경우, 마이크로유체 디바이스(100)는 조명기(illuminator), 예를 들어, 광 소스(125)를 또한 포함할 수 있다. 도시된 바와 같은 광 소스(125)는 액적들 내의 형광 염료를 여기시키도록 작용하는 사이드-조명 시스템이다. 광 소스(125)는, 액적들 내의 형광단의 여기 파장(λex)에 동조된 광을 방출하는 발광 다이오드(LED)일 수 있다. 광 소스(125)는 2개 이상의 형광단들의 여기 파장들에 동조된 2개 이상의 광 파장들의 광을 방출하도록 구성될 수 있다. 대안적으로, 2개 이상의 광 소스들은 2개 이상의 광 파장들을 갖는 광을 방출하는데 이용될 수 있다. 조명기는 방출된 2개 이상의 광 파장들이 서로 이위상(out of phase)으로 변조되도록 구성될 수 있다.
광 소스(125)는 조명하는 것과 조명하는 않는 것 사이에서 교번하도록 및/또는 2개 이상의 광 파장들 사이에서 교번하도록 구성될 수 있다. 바람직하게는, 교번은 개별 픽셀 하에서 각각의 액적의 지속기간 마다 여러 번 발생하는데, 예를 들어, 단일 픽셀 하의 지속기간 마다, 액적이 100회 교번, 200회 교번, 300회 교번 등을 겪을 수 있다. 일 실시예에서, 2개 이상의 광 파장들 사이의 교번은 300㎑의 주파수에서 발생하여서, 각각의 액적은, 각각의 액적이 단일의 개별 픽셀 아래를 지나갈 때 여기(excitation)의 300회의 교번을 겪게 된다. 조명하는 것과 조명하는 않는 것 사이에서 교번하도록 및/또는 2개 이상의 광 파장들 사이에서 교번하도록 구성된 조명기를 이용하는 것은 마이크로유체 디바이스(100)가, 각각의 액적에 대한 절대 신호와는 대조적으로, 상대적 형광 신호를 측정하는 것을 가능케 할 수 있고, 그리하여 분석물의 개선된 교정 없는 분석을 용이하게 한다.
반-공진 커플링(anti-resonant coupling)은 마이크로칩 내에서 광을 보유하고 유체 채널을 균일하고 강하게 조명하는데 사용될 수 있다. 복수의 통로들(115)을 통과하는 하나 이상의 형광 염료를 함유하는 액적은 형광 및 광 소스(125)로부터의 여기 광을 흡수할 것이다. 액적이 통로(115)를 지나감에 따라, 그의 방출된 광은 마스크(120)에 의해 진폭 변조된다.
마이크로유체 디바이스(100)는 또한 복수의 통로들(115) 각각으로부터 방출 된 변조된 신호를 검출하는 검출기(130)를 포함한다. 검출기(130)는 복수의 통로들(115) 각각으로부터 방출되는 변조된 신호들을 동시에 검출하도록 구성될 수 있다. 일 실시예에서, 도 1b에서 도시된 바와 같이, 통로로부터 등방성으로 방출된 형광 광은 마스크(120)의 각각의 마스크 패턴을 통과하고 검출기(130), 예를 들어, 실리콘 광 검출기로 전달된다. 예시된 실시예에서, 마스크(120)와 검출기(130) 사이에는, 산란된 여기 광으로부터 백그라운드 신호를 감소시키는 롱 패스 광학 필터(long pass optical filter)(132)가 있다. 일 실시예에서, 광 소스(125)가 2개 이상의 광 파장들의 광을 생성하는 경우, 추가의 광학 필터가 이용되어서, 각각이 2개 이상의 광 파장들의 단일 파장에 대응하고 마스크 패턴과 광 검출기 사이에 포지셔닝되는 2개 이상의 광학 필터들이 활용될 수 있다. 2개 이상의 필터들은 2개 이상의 형광 신호들을 복조하도록 구성될 수 있다. 2개 이상의 필터들은 또한 롱 패스 필터들로서 구성될 수 있으며 각각의 액적이 각각의 필터 아래를 순차적으로 지나가도록 공간적으로 분리된다. 검출기(130)는 마스크(120)의 바로 위에 안착될 수 있다.
액적이 마스크 패턴 아래를 지남에 따라, 그의 방출된 광은 신호 감쇠 부분들(122)에 의해 차단되는 것으로부터 신호 방출 부분(124)에 의해 투과되는 것으로 트랜지션하며, 이는 이진의 진폭 변조된 신호 Vd(t)를 발생시킨다. 일 실시예에서, n개의 복수의 통로들(115) 각각에 대한 마스크 패턴(mn)은 일련의 1들 및 0들로서 정의될 수 있으며, 1은 투명에 대응하고 0은 불투명에 대응한다. 액적들에 아주 근접하게 마스크(120)를 포지셔닝하는 것은, 마스크 패턴의 각각의 비트가 액적들로부터 방출되는 광의 최대의 가능한 입체각(solid angle)에 대(subtend)하는 것을 보장하고, 이에 따라 1들과 0들 간의 콘트라스트를 보장된다.
마스크 패턴들은 80 내지 125 비트의 범위에 이를 수 있다. 일 실시예에서, 마스크 패턴은 100 비트보다 크다. 하나의 시스템(SNR=-6 dB, c=4 채널)에서, 마스크 길이는 성능 면에서 현저한 감소 없이, L=100 비트들(AUC=0.999) 만큼 낮게 감소될 수 있다는 것이 밝혀졌다. 이러한 시스템에서 L=50 비트 아래에서, 감도 및 특이성이 상당히 저하될 수 있다.
마스크(120) 내의 마스크 패턴들은 바람직하게는, 에너지(
)가 최소가 되도록 서로 최소한으로 상관될 수 있다. 이는 액적들이 동일한 채널의 상이한 통로의 검출 영역에 동시에 존재하고 서로 구별되도록 허용한다. 바람직하게는, 마스크 패턴은 복수의 통로들(115) 각각에 대해 상이하다. 일 실시예에서, 마스크 패턴들은, 에너지(
)가 
에 대해 최소가 되도록 서로 최소한으로 교차-상관(cross-correlate)될 수 있다. 이는, 상이한 채널들로부터의 신호들이 최대로 분리되도록 허용한다.
최대 길이 시퀀스들(MLS)로 알려진 의사랜덤 벡터들은 피드백 레지스터를 사용하여 생성될 수 있다. 길이 L=2M-1의 시퀀스에 대해, 시프트 레지스터의 엘리먼트들은 각도(M)의 원시 다항식(h(x))에 의해 정의된다. 이 시프트 레지스터를 반복함으로써, 최소로 자동상관되는 것으로 입증될 수 있는 일련의 1들 및 0들이 생성될 수 있다. 다수의 채널들을 생성하기 위해, 2-차원 MLS는 1-차원 MLS를, MacWilliams 및 Sloane에 의한 Pseudo-random sequences 및 array(IEEE 64의 프로시딩들 : 1715-1729(1976))에서 설명된 바와 같은 2차원 어레이들로 폴딩(folding)함으로써 생성될 수 있다.
마스크 패터닝은 검출기(130)에 의해 획득된 1-차원 신호가, 각각이 복수의 통로들(115) 중 하나를 나타내는 벡터들의 세트로 압축해제되도록 허용한다. 도 1c는 105 비트 길이 마스크 패턴의 예 및 통과하는 액적으로부터의 대응하는 진폭 변조된 신호(Vd)를 그래프로 예시한다. 이 시간 인코딩은 2개의 기능을 수행하는데, 1) 그것은, 상관-기반 신호 복원을 사용하여 약한 신호(SNR << 1)의 복원을 허용하고 이에 따라, 렌즈들, 레이저들 또는 고감도 검출기들을 포함하지 않는 단순한 하드웨어 구현을 가능케 하고; 그리고 2) 그것은, 단일 검출기만을 사용한 다수의 채널들의 독립적인 모니터링을 허용하여, 하드웨어의 복잡성을 증가시켜야 할 필요 없이 단일 칩 상에 추가 에세이들이 구현되는 것을 가능케 한다.
각각의 비트의 길이는 균일할 수 있다. 일 실시예에서, 비트 길이는 80㎛ 길이이며, 이는 105 비트 길이 마스크 패턴에 대해 8.4mm 길이 검출 영역을 발생시킨다. 당업자는 비트 길이가 또한 비트 마다 변동될 수 있다는 것을 이해할 것이다.
도 1d는 본 발명의 양상들에 따라 액적들을 분석하기 위한 마이크로유체 디바이스(100)의 사진이다. 이 실시예에서, 시스템은 대략 셀 전화의 크기(10 x 5 x 2 cm3)이다.
광 검출기로부터의 신호(Vd(t))를 프로세싱하는 것은, 형광 액적이 검출 영역을 통과했는지 여부 그리고 만약 그렇다면, 그것이 복수의 통로들(115) 중 어느 것을 통과했는지를 결정하는지에 관한 예비 결정을 포함할 수 있다. 이를 위해, 마이크로유체 디바이스(100)는 또한 복수의 형광 신호들 각각을 마스크 패턴과 상관시키도록 구성된 회로를 포함할 수 있다. 신호는, 각각이 통과 액적로부터의 신호(Vd(t))와 마스크들(mn) 각각의 상대적 상관을 나타내는 벡터들(Ψn)의 세트로 투영될 수 있다. 도 2a에서 도시된 바와 같이, 광 검출기에 의해 측정된 신호(Vd(t))는 각각이 개별 채널(n)을 통과하고 속도(v)로 이동하는 액적의 가능성을 나타내는, -∞에서 ∞까지 벡터들 
로 투영된다.
검출 영역을 통과하며, 10nM 로다민이 로딩되는, 액적으로서 광 검출기로부터 비롯되는 미가공 데이터의 예는 도 2c에서 Vd로서 도시된다. 신호가 상관기들의 뱅크(도 2a)를 통과한 후에, 벡터들의 세트(Ψ1, Ψ2, Ψ3 및 Ψ4)가 생성되며, 각각의 벡터는 복수의 통로들(115)의 특정 채널에 대응한다. 액적은 Ψ2에서 큰 피크를 유발하며, 이는 액적이 그 채널을 통과했다는 것을 암시한다. 본 발명자들은 이들 벡터들(녹색 점선으로 도시됨) 각각에 적용되는 게이팅 임계 값 Ψt를 정의하며, 이보다 높으면 본 발명자들은 형광 액적이 검출된 것으로 간주한다.
위에서 설명된 피크 검출은 액적의 속도에 대한 지식으로 강화될 수 있다. 그러나 본 발명자들은 액적 및 유동 제어가 반드시 필요한 것은 아니라는 것을 발견했다. 특히, 분산된 속도들을 갖는 액적들에 대해 적응 가능한 알고리즘이 사용될 수 있다. 2차원 상관(
)이 계산될 수 있으며, 여기서 V는 속도들의 범위 [vmin : vmax]를 갖는 1-d 행렬이다. 이 2-차원 상관은 MATLAB을 사용하여 계산될 수 있다. 도 2b는 피크 포지션들(vp, tp)이 2-d 공간에서 정확하게 발견될 수 있는 속도 v 및 시간 t의 2-차원 행렬로서의 출력을 도시한다. 이 기술의 가정은, 액적 속도가 검출 영역에서 시간의 지속기간(약 50ms) 동안 일정하다는 것이고, 이는 우리가 실험적으로 검증했다. 이 특정 실시예에서, 3개의 별개의 속도에서 3개의 액적들이 관찰될 수 있다.
검출은, 조명하는 것과 조명하는 않는 것 사이에서 광 소스(125)를 교번시키고 그리고/또는 2개 이상의 광 파장들 사이에서 교번시킴으로써 추가로 개선될 수 있다. 여기 광을 변조함으로써, 신호는 광 검출기(130)의 저주파수 노이즈로부터 떨어진 주파수로 시프트될 수 있고, 그리하여 낮은 SNR 액적들을 검출하는 능력을 개선한다. 2개의 여기 소스 및 2개의 방출 필터들로부터의 액적의 응답을 인코딩함으로써, 각각의 액적은 4개의 가능한 조합들로 독립적으로 측정된다. 일 실시예에서, 3개의 파라미터들은 액적들, 예를 들어, 2개의 형광 채널들 및 광 필드 산란(SSC)의 존재를 검출하기 위해 측정될 수 있다.
도 5를 참조하면, 기판 상에 형성된 마이크로유체 채널(복수의 통로들을 포함함)을 갖는 마이크로유체 디바이스로 복수의 액적들을 분석하는 프로세스의 선택된 단계들을 나타내는 흐름도가 제공된다. 본원에서 설명되는 방법들에 관해서, 본원에서의 설명으로부터, 원하는 결과들을 여전히 달성하면서, 하나 이상의 단계들이 생략될 수 있고 그리고/또는 방법의 설명된 시퀀스대로 수행되지 않을 수 있다(동시에 포함함)는 것이 이해될 것이라는 것이 주의되어야 한다.
단계(510)에서, 복수의 액적들이 복수의 통로들(예를 들어, 복수의 통로들(115);도 1a)을 통과한다. 복수의 액적들은 예를 들어, 액적 생성기(110)에 의해 생성될 수 있다.
단계(520)에서, 복수의 액적들로부터의 복수의 신호들이 복수의 통로들(예를 들어, 마스크(120);도 1a) 상에 형성된 복수의 마스크 패턴들을 사용하여 변조된다. 각각의 마스크 패턴은 하나 이상의 신호 방출 부분들 및 하나 이상의 신호 감쇠 부분들을 가질 수 있다. 검출될 신호가 형광 또는 광인 경우, 하나 이상의 신호 방출 부분들은 투명 부분들일 수 있고 하나 이상의 신호 감쇠 부분들은 불투명 부분들일 수 있다. 또한, 하나 이상의 신호 방출 부분들은 다양한 투명 상태들의 패턴을 형성할 수 있다. 복수의 마스크들의 투명 부분들 및 불투명 부분들은 바람직하게는, 적어도 약 100 비트를 갖는 이진 패턴에 대응할 수 있다. 일 실시예에서, 복수의 통로들 각각은 복수의 마스크들로부터의 대응하는 마스크를 갖는다.
단계(530)에서, 복수의 신호들이 검출된다. 복수의 신호들은 검출기(130) 예를 들어, 광 검출기를 사용하여 검출될 수 있다. 검출기는 마스크(120)에 대해 직접 포지셔닝될 수 있거나, 또는 필터(132)가 검출기(예를 들어, 광 검출기(130))와 마스크(120) 사이에 포지셔닝될 수 있다.
일 실시예에서, 신호가 형광 신호이고 검출기가 광 검출기인 경우, 복수의 통로들은 단계(530) 이전에 조명된다. 예를 들어, 조명기를, 조명하는 것과 조명하는 않는 것 사이에서 교번시키고 그리고/또는 2개 이상의 광 파장들 사이에서 교번시킴으로써 복수의 통로들의 조명을 교번시키는 것은 형광 신호(들)의 검출을 용이하게 할 수 있다. 일 실시예에서, 복수의 통로들의 조명을 교번시키는 것은 조명기, 예를 들어, 광 소스(125)를 반복적으로 턴 온 또는 오프하는 것을 포함한다. 다른 실시예에서, 복수의 통로들의 조명을 교번시키는 것은, 각각이 하나 이상의 광 파장들을 갖는 2개 이상의 광들 사이에서 교번시키는 것을 포함한다. 각각의 광은, 다른 광들을 포함하는 하나 이상의 광 파장들과 상이한 하나 이상의 광 파장들을 갖도록 구성될 수 있다. 예를 들어, 복수의 통로들을 조명하는 단계는 조명기를 포함할 수 있으며, 이 조명기는 2개 이상의 광들을 생성하도록 구성되며, 각각의 광은 광 파장을 가지며, 복수의 통로들을 조명하는 단계 동안 2개 이상의 광들 사이에서 교번한다.
액적들은 2개 이상의 복수의 형광 신호들을 생성하도록 2개 이상의 형광 염료들을 포함할 수 있다. 복수의 형광 신호 각각은 상이한 광 파장에 대응할 수 있고 그리고/또는 상이한 방출 스펙트럼을 가질 수 있다.
검출기에 의해 검출된 복수의 신호들은 추가로 복수의 마스크들 중 대응하는 마스크와 상관될 수 있다.
예들
이하의 실시예들은 본 발명의 전반적인 성질을 설명하기 위해 포함된다. 예들은 추가로, 안정된 단분산 마이크로버블들을 생성하고 본 발명의 원리들에 따른 마이크로유체 디바이스 및 관련된 방법을 사용함으로써 취득되는 개선된 결과들을 예시한다.
도 3a에 의해 도시된 바와 같이, 디바이스는 성형된(molded) PDMS 유체 채널들을 제조하기 위한 소프트 리소그래피 및 마스크들을 생성하기 위한 유리 상의 Ni의 표준 평면 리소그래피의 조합을 사용하여 제조되었다. Si 광 검출기는 칩 바로 위에 배치되고, 필터는 산란된 여기 광을 차단하는데 사용된다. 성형된 PDMS 층은 80μm 두께 피처들을 갖는 표준 단일-층 SU-8 리소그래피(SU-8 2025, MicroChem)를 사용하여 제조되었다. 마스크는 표준 평면 포토리소그래피를 사용하여 유리 상에서 Ni로 패터닝되었다. 우선, Ni는 유리 슬라이드들(Kurt Lesker PVD 75, Wolf Nanofabrication Facility, University of Pennsylvania) 상에서 열증발(thermal evaporate)되었다. 그 후, 마스크 패턴은 Ni(염화철(III))의 습식 에칭을 사용하여 리소그래피적으로 정의되었다(Shipley 1813). Ni 패터닝된 유리 슬라이드는 PDMS-스탬핑된 결합을 사용하여 성형된 PDMS 층에 영구적으로 결합되었다. 도 3b는 디바이스의 부분의 광학 현미경 사진을 도시한다. 스케일 바(scale bar)는 160μm이다.
도 3c에 의해 도시된 바와 같이, 액적들이 T-접합들을 사용하여 생성되었다. 액적들은 로다민으로 로딩되었다. 스케일 바는 60μm이다. 하이브리드 소프트 리소그래피/레이저 가공을 사용하여 단지 하나의 오일(oil) 입력만으로 4개의 T-접합들이 단일 디바이스에 통합되었다. 이 칩은, 1) PDMS의 층에 마이크로-스케일의 액적 제조기들 및 유체 채널들을 제조하기 위한 소프트 리소그래피 및 2) 개별 액적 제조기들에 오일을 균등하게 전달하기 위해 더 깊은(d=200 μm) 레이저-조각 채널들을 갖는 PDMS의 제 2 층에 비아들을 제조하기 위한 직접 레이저 마이크로머시닝의 결합을 이용하여 제조되었다. T 접합의 어퍼처는 100 μm 폭과 50 μm 깊이이다. 미네랄 오일은 5% V/V 스팬 80 및 1 % V/V 트윈(Fisher Scientific)으로, 연속적 페이즈(continuous phase)로서 사용되었다. 유량들은 수성 페이즈에 대해 0.1 mL/hr 및 오일 페이즈에 대해 1mL/hr이고 주사기 펌프(Braintree Scientific)를 사용하여 제어되었다. 도 3d에 의해 도시된 바와 같이, 평균 액적 크기는 60 μm이고 CV는 ~ 5 %이다. 4개의 수성 입력들에 대한 온-칩 저장소들을 사용하고 타이간(tygon) 튜빙을 사용하여 2개의 칩들을 함께 연결하면, 단일 주사기 펌프가 디바이스를 구동할 수 있다. 편리한 프로토타이핑(prototyping)을 위해 2개의 개별의 칩 모듈들을 연결하는 튜빙이 사용되었다. 호환 가능한 제조 전략들을 사용하여 제조된 액적 생성기 및 검출 모듈은 또한 동일한 칩 상에 통합되었다.
도 3f에 의해 도시된 바와 같이, 광 검출기로부터의 출력 전류는 맞춤식 전자장치(custom electronics)를 사용하여 증폭되고, 디지털화되고, 프로세싱된다. 광 검출기 센서는 λ=600 nm에서 200 mA/W의 응답율을 가졌다. 광 검출기는 DC-20 kHz 대역폭을 갖는 G=0.75 x 106 V/A 트랜스임피던스 증폭기(Thor PD100A)에 연결되었다. 트랜스임피던스 증폭기의 출력은 20의 이득 및 fH=1Hz의 고역(high-pass) 주파수 및 20 kHz의 저역 주파수를 갖는 전치-증폭기(PA)(Ithaco)에 AC 커플링되었다. PA의 출력은, 분석을 위해 USB를 통해 컴퓨터 또는 스마트 폰으로 신호를 전송하기 전에 신호를 40 kS/s로 디지털화하는 아날로그-디지털 변환기(National Instruments, NI USB-6009)에 연결되었다. 모든 분석은 개인용 컴퓨터(MATLAB) 상에서 수행되었지만, 휴대용 구현을 위해, 이 프로세싱은 디지털 신호 프로세싱(DSP) 칩을 사용하거나 클라우드 컴퓨팅을 사용하여 수행될 수 있다.
도 3e는 사이드 조명을 통해 칩에 광을 전달하기 위해 반공진 커플링(antiresonant coupling)이 어떻게 사용되었는지를 보여주는 개략도를 도시한다.
칩의 광학은 소형-풋프린트 휴대용 디바이스(도 1d)에 패키징될 수 있는 상용 제품들을 사용하여 가능한 한 작고 저렴하게 유지되었다. 여기 광은 히트 싱크(Wakefield Thermal Solutions, 19757-M-AB)를 갖는 주문식 레이저 가공된(Universal Laser) 아크릴 박스에 패키징된 울트라-브라이트 LED(λex=530 nm) (Luminus, CBT-90- G- C11- JK201)에 의해 제공되었다. 박스는 슬롯 커넥터와 유사하게 칩이 그 안에 끼워질 수 있도록 설계되었으며, 광은 최대 반-공진 커플링을 위해 사각(oblique angle)으로 칩에 커플링될 것이다. 트랜스임피던스 증폭이 통합되어 있는, 인쇄 회로 보드에 장착된 실리콘 광 검출기가 사용되었다(Thor Labs, PDA 100a). 여기 파장에서 산란된 광의 영향을 줄이기(95 % 반사율) 위해 칩과 검출기 사이에 λ=600nm 길이 통과 필터(# 69-868 Edmund optics)가 배치되었다.
디바이스에 대한 마스크 패턴들의 길이는 105 비트였다. 시퀀스는 각각의 채널의 자동상관 및 채널들 간의 교차-상관을 최소화하기 위해 가능한 한 길게 만들어졌다. 그 길이는 광 검출기의 크기에 의해 제한되었다. 실리콘 광 검출기(Thor Labs, PDA100A)는 10 x 10mm2였고, 어떠한 렌즈들도 사용되지 않았기 때문에, 이는 검출 영역의 크기를 세팅한다. 마스크에서 각각의 픽셀의 크기는 액적들의 크기에 의해 결정되었다. 각각의 액적으로부터 등방성으로 방출된 광의 상당한 부분이 마스크 패턴에 의해 차단되는 것을 보장하기 위해, 마스크의 픽셀 크기가 액적들의 픽셀 크기와 일치되었다. 60 μm 액적들 및 80 μm 픽셀들이 사용되었다. 채널 당 총 비트 수는 이에 따라 10 mm/80 μm=125로 제한되었다.
최소 자동 및 교차-상관에 대한 본원의 규격과 일치하는, 마스크들(각각이 105 비트 길이임)의 세트를 생성하기 위해, MacWilliams 및 Sloane의 프로세스는 의사랜덤 최대 길이 시퀀스들(MLS)로부터 의사 랜덤 행렬 어레이를 생성하는데 사용되었다. 의사 랜덤 행렬의 치수들은 MLS 시퀀스의 특정한 허용되는 인수분해이다. 이 경우, 치수들은 105 x 39=4095=212-1(M=12)이다. 이러한 시퀀스들은 MATLAB을 사용하여 마스크들의 랜덤으로 생성된 시퀀스들과 비교되었다. MLS 생성 마스크는 훨씬 더 작은 자동상관 및 교차-상관을 갖는다는 것이 발견되었다(P <10-4, 2-테일드 t 테스트(two-tailed t test)). 랜덤 마스크들의 대형 라이브러리가 생성되고 그 후 낮은 자동상관을 갖는 마스크들의 서브세트가 선택되는, 마스크들을 생성하기 위한 대안적인 전략이 또한 개발되었다. 그 서브세트로부터, 낮은 교차-상관을 갖는 쌍들의 서브세트가 선택되고, 그 쌍들로부터, 낮은 교차-상관을 갖는 4개의 세트들이 선택된다. 2개의 절차들이 비슷한 결과들을 산출했지만, MLS 기술은 단지 몇 초의 계산 시간이 걸린 반면에, 선택 기술은 몇 시간이 걸렸으며 4개 초과의 채널들에 대해서는 용인될 수 없게 느리게 되었다. 양자 모두의 구현들은 MATLAB에서 수행되었다.
노이즈
플로어 아래의 형광
액적
측정
본 발명자의 상관-기반 검출 방식은 극도로 약한 신호(SNR << 1)가 노이즈 플로어(noise floor) 아래로부터 복원되도록 허용한다. 이 플랫폼은 신호가 마스크의 패턴과 상관되는 반면에 노이즈는 그렇지 않기 때문에, 노이즈로부터 신호를 효율적으로 분리할 수 있다. 약한 신호들을 복원하는 능력은, 그것이 렌즈-프리 이용(lens-free use)을 허용하여 소형화에 매우 적합하기 때문에 바람직하다. 이 능력을 보여주기 위해, 약한 형광 액적들은 SNR ~ 0.25로 측정되었으며, 이는 미가공 데이터에서 분해될 수 없다. 도 4a에 도시된 바와 같이, 신호 대 잡음 비는 통과 액적으로부터의 신호의 예상된 에너지를, 동일한 시간 간격에 걸친 노이즈의 평균 에너지로 나눔으로써 계산된다. 그러나 이 데이터를 올바른 마스크(m2)와 상관시킨 후, 그의 상관 벡터 Ψ의 피크는 상관 데이터의 노이즈 플로어보다 훨씬 높았으며(SNR> 10) 쉽게 검출되었다.
검출 영역에서 다수의
액적들의
동시성 측정
본 발명의 플랫폼의 높은 감도는, 형광 액적들이 통과할 때 이들로부터 많은 광자들을 수집하는 검출 영역의 넓은 면적(10 x 10 mm2)으로부터 부분적으로 비롯된다. 그러나 큰 검출 영역을 갖는 것에 대한 트래이드-오프는, 검출 영역이 종래의 세포계측법(cytometry)에서처럼 한 번에 한 액적으로 제한되므로, 그것은 디바이스의 쓰루풋을 심각하게 제한한다는 것이다. 이를 위해, 마스크들은 검출 영역 내의 다수의 액적들을 동시에 분해할 수 있도록 설계되었다. 본원의 교차-상관-기반 검출 전략이 상이한 채널들에서의 또는 동일한 채널을 따라 상이한 포지션들에서의 액적들을 동시에 분석할 수 있도록 서로 낮은 자동상관 및 낮은 교차-상관을 갖는 마스크 패턴들이 선택되었다.
이 능력을 보여주기 위해, 검출 영역을 통과한 3개의 액적들이 모두 동일한 채널에서 동시에 측정되었다. 도 4b에 도시된 바와 같이, 미가공 데이터에서, 3개의 신호들은 중첩하고 분해가 불가능하다. 그러나 이 데이터를 올바른 마스크와 상관시킨 후에, 상관 벡터 Ψ의 3개의 피크들은 잘 분리되어 개별적으로 분해될 수 있다.
다중채널 검출
본 발명의 플랫폼의 이점은 다수의 채널들에서 동시에 액적들을 검출하는 능력이다. 이 능력을 특성화하기 위해, 액적들이 특정 채널을 통해 전송되고 디바이스의 출력은 예상된 결과와 비교되었다. 이 기능성은 도 6a에서 보여지며, 이 도 6a는 검출 영역을 통과하는 2개의 액적들을 도시하며, 액적들 중 하나는 채널 1을 통과하고 다른 하나는 채널 2를 통과한다. 이 데이터를 올바른 마스크들과 상관시킨 후에, 채널 2의 명확한 피크가 제1 액적에 대응하고 채널 1의 명확한 피크가 제 2 액적에 대응하여, 액적들의 올바른 채널을 쉽게 식별되도록 허용한다.
디바이스
감도 및 특이성의 정량화
감도와 특이성 사이의 트레이드오프를 특성화하기 위해, 본 발명의 디바이스는 임계 값들(Ψt)의 범위를 사용하여 테스트되었고 수신기 작동자 특성 곡선(receiver operator characteristic curve)(ROC)을 생성하였다. 감도=TP/P이며, 여기서 TP는 검출기가 통과 액적을 성공적으로 검출하고 그의 채널을 올바르게 식별한 인스턴스들의 수이며, P는 액적들의 총 수이다. 특이성=검출기의 TN/N이며, 여기서 TN=N-FP는 트루 네거티브들(true negatives)이고, 검출기가 액적을 오검출할 때 인스턴스들인 총 거짓 포지티브들(FP), 및 액적들의 총 수 P, 채널들의 총 수 c에 의해 정의되는 네거티브들의 총 수 N=P *(c-1)에 의해 정의된다.
액적들은 먼저 한 번에 4 채널들 중 하나를 통과하고 검출의 감도 및 특이성을 정량화하였다. 도 6b는 히트 맵에서 실험들의 결과들을 요약한다. 디바이스는 예상대로 수행되었고; 액적들은 히트 맵의 대각선을 따라 액적들이 통과 채널에서 검출되었고 비대각선(off diagonal)의 올바르지 않은 채널에서 검출되지 않는다. 검은 점들은 액적이 지나간 채널들을 도시한다. 테스트들 각각에 대해, SNR ~ 1을 갖는 ~ 400 액적들이 통과되었다. 선택된 임계 값(Ψt)에 대해, 감도는 1.0이었고 특이성은 0.994였다.
다수의 채널들에서 액적들을 동시에 검출할 수 있는 칩의 능력을 보여주기 위해, 액적들은 다음으로, 6개의 가능한 채널들의 세트들(ch1 & ch2, ch1 & ch3 등)을 통과하였다. 도 6c는 히트 맵에서 실험들의 결과들을 요약한다. 액적들은 올바른 채널 세트들에서 검출되었고, 올바르지 않은 채널에서는 검출되지 않았다. 테스트들 각각에 대해, SNR ~ 1을 갖는 ~ 800 액적들이 통과되었다. 선택된 임계 값(Ψt)에 대해, 평균 감도는 1.0이었고 특이성은 0.993였다.
감도와 특이성 사이의 트레이드오프는 위에서 설명된 결과들을 요약하는 ROC 곡선들을 생성함으로써 특성화되었다. 대략 SNR ~ 1을 갖는 액적들에 대해, 도 6d는 AUC=0.9995인 곡선 아래의 영역 도시하며, 이는 단일 광 검출기만을 사용하여 액적들의 평행한 스트림들을 견고하게 모니터하는 능력을 보여준다.
성능에 대한 설계 파라미터
선택들 영향의 특성화
시스템의 설계를 특성화하고 보조하기 위해, 모델은 다양한 파라미터들을 시뮬레이트하기 위해 사용되었다. 모델은 MATLAB을 사용하여 수행되었다. 간단히, 액적이 채널을 통과하는 시간의 지점(tp)과 액적이 통과한 특정 채널(n)은 랜덤 번호 생성기들을 사용하여 확률적으로 생성된다. 통과 액적으로부터의 신호는 액적 속도(v)에 의해 스케일링되고 시간 지점(tp)에서 출력 신호(Vd(t))에 배치된 마스크 패턴을 이용하여 생성된다(
). N개의 액적들이 반복적으로 배치된다. 가우시안 노이즈는 적절한 신호 대 잡음 비(SNR)에 대한 신호에 추가된다. 모델은 실험 데이터와의 직접 비교에 의해 검증되었다. 이 모델을 사용하여, 검출 전략들의 한계들이 결정되며, 이는 향후 애플리케이션들 및 개발을 위한 토대로 설정된다.
액적 검출의 감도 및 특이성이 광 검출기의 신호 대 잡음 비(SNR)에 관하여 어떤 함수관계에 있는지가 조사되었다. 이 연구에서 사용된 셋업(L=100 비트, c=4 채널)에 대해, 도 7a에 도시된 바와 같이, 그 액적들은 -10dB(0.1)만큼 낮은 SNR과 더불어 높은 감도 및 정확도(AUC=0.9991)로 검출될 수 있다는 것이 밝혀졌다. -13dB(0.05)의 SNR 미만에서, 감도와 특이성이 급속히 떨어지기 시작했다. 신호가 단지 노이즈의 5%일 때 액적들을 분해하는 능력은, 약한 형광 액적들이 단순한 렌즈 프리 광 검출기를 사용하여 분해되는 것을 가능케 한다.
다음으로, 성능에 관한 마스크(L)의 비트들의 수의 영향이 측정되었다. 프로토타입(SNR=-6 dB, c=4 채널)에 매칭된 시스템에 대해, 마스크는 성능면에서 현저한 감소 없이, L=100 비트들(AUC=0.999) 만큼 낮은 길이로 감소될 수 있다는 것이 밝혀졌다. L=50 비트들 아래에서, 감도 및 특이성이 급격히 떨어졌다. 비트 길이에 따른 성능의 증가는 다음과 같은 2개의 요인에 기인할 수 있는데 : 1) 비트 수가 증가함에 따라, 더 많은 인스턴스들의 액적이 효과적으로 측정되며, 이는 신호 평균화(
)에 의한 유효 SNR의 증가로 이어지고, 그리고 2) 비트들의 수가 증가됨에 따라, 채널들 간의 교차-상관(
)이 상응하게 감소되며, 이는 액적들이 채널을 통과할 때(b ≠ a) Ψa에서 백그라운드 신호를 감소시킨다.
채널들의 수를 증가시키기 위한 제한들의 특성화
마지막으로, 모델 시스템은 프로토타입에서 보여진 c=4보다 많은 채널들을 추가하는 실현성(feasibility)을 보여주기 위해 사용되었다. 우리의 제1 실험에서, 총 액적 레이트가 일정하게(R=R0) 유지되어서, 검출 영역에서 액적들의 평균 수는 ~ 1가 되었다. 도 7c에 도시된 바와 같이, 프로토타입(L=100 비트들, SNR=-6dB)에 매칭된 디바이스에 대해, 채널들의 수가 c=4에서 16으로 증가함에 따라, 감도 및 특이성은 일정하게 유지된다는 것이 밝혀졌다. 이 결과는 다음을 포함하는 몇개의 요인들에 기인한 것일 수 있는데, 1) c가 4에서 16으로 증가함에 따라 채널들간 상관(
)의 증가가 크지 않지 않고 그리고 2) L=100 비트들로부터 생성될 수 있는 비상관 마스크들의 수는 c.312보다 훨씬 더 크기 때문이다. 채널들의 수가 증가함에 따라, 액적마다 더 많은 상관 벡터들(Ψa)이 있다. 피크-발견 알고리즘은 피크 높이를, 다른 벡터들(Ψb≠a)의 로컬 분산(local variance)과 비교함으로써 피크들을 식별한다. 채널들의 수(c)가 증가함에 따라, 평균화가 증가되며, 이는 거짓 포지티브들 및 네거티브들을 감소시킨다.
도 7d에 도시된 바와 같이, 칩의 멀티플렉싱 능력은 액적 밀도에 의해 다소 제한될 수 있으며, 검출 영역의 액적들의 평균 수가 ~ 2 이상 증가될 때 성능이 떨어진다. 채널에서 액적들의 포지션이 포아송 통계(Poisson statistics)를 따르기 때문에, 검출 영역에서 액적들의 평균 수가 2보다 커짐에 따라, 5개 초과의 액적들이 임의의 주어진 인스턴스로 검출 영역에서 발견될 가능성이 높아지며, 이 지점에서는, 개별 이벤트들을 분해하는 검출기의 능력이 영향을 받는다. 이 현상을 테스트하기 위해, 총 액적 레이트를 일정하게(R=R0) 유지하기보다는, 채널 당 액적 레이트가 일정하게 R ∝ c로 유지되었다. 액적 레이트는, 4개의 채널에 대해, 한 번에 평균 1 개의 액적이 검출 영역에 존재하도록 선택되고, 레이트는 채널들이 추가됨에 따라 비례하여 증가한다. 디바이스의 성능은 채널을 추가할 때마다 비례하여 떨어졌다.
다수의 형광 염료들 및 다수의 광 파장들의 활용
각각의 액적 내에서 다수의 형광 염료들을 검출하기 위해 형광 신호의 여기 파장 및 방출 파장을 모두 변조함으로써, 액적들 내의 분석물의 검출이 개선될 수 있다. 도 9a에서, 2개의 형광 염료들인 플루오레세인(fluorescein) 및 로다민(rhodamine) B는 각각, 녹색과 연관된 530 nm의 광 파장 및 청색과 연관된 460 nm의 광 파장에 대응하는 여기 파장들을 갖는다. 바람직하게는, 형광 염료들을 여기시키는데 사용되는 2개의 광 파장들은 서로 이위상으로 변조된다.
플루오레세인 및 로다민 B 염료들로부터 발생한, 점선으로 도시된 여기 스펙트럼 및 실선으로 도시된 방출 스펙트럼의 예가 도 9c에 예시된다.
2개의 상이한 롱-패스 광학 필터들은 액적들에 의해 생성된 방출 스펙트럼을 분해하기 위해 사용된다. 2개의 필터들은 각각의 액적이 필터들 아래를 순차적으로 통과하도록 공간적으로 분리될 것이다. 이 예에서, 2개의 필터들 각각은 단일 파장, 예를 들어, 녹색 광 파장 또는 청색 광 파장에 대응하도록 구성되어서, 하나의 필터가 청색 광 파장으로부터 발생한 여기를 차단하고 다른 필터가 녹색 광 파장으로부터 발생한 여기를 차단하게 된다. 2개의 마스크 패턴들은 도달 필터(reach filter)로부터의 응답을 복조하기 위해 필터와 함께 배치될 수 있다.
광 검출기로부터의 신호들은 2개의 염료들로부터 수신된 2개의 신호들을 독립적으로 측정하도록 복조된다. 도 9b는 여기 및 방출의 복조가 순차적으로 발생하는 2-단계 복조 방법을 예시한다. 이 예에서, 복조는 도 9d에서 예시된 바와 같이 2개의 여기 소스들 및 2개의 방출 필터들로부터의 응답들과 연관된 4개의 가능한 조합들을 발생시킨다.
본 발명은 특정 실시예들을 참조하여 본원에서 도시되고 설명되지만, 본 발명은 도시된 세부사항들로 제한되도록 의도되지 않는다. 오히려, 청구범위의 등가물들의 범위 및 영역 내에서 그리고 본 발명을 벗어나지 않고 다양한 변형들이 이루어질 수 있다.
Claims (29)
- 액적들을 분석하기 위한 마이크로유체 디바이스(microfluidic device)로서,
기판;
상기 기판 상에 형성된 마이크로유체 채널 ― 상기 마이크로유체 채널은 복수의 통로들을 포함하고, 상기 복수의 통로들 각각은, 상기 복수의 통로들을 통과하는 액적들이 복수의 신호들을 생성하도록 상기 통로를 통과하는 각각의 액적의 신호를 변조하게 구성된 마스크 패턴을 가지며, 상기 마스크 패턴은 상기 복수의 통로들의 각각에 대해 상이함 ―; 및
상기 복수의 신호들을 검출하도록 구성된 검출기를 포함하는,
마이크로유체 디바이스. - 제1항에 있어서,
상기 복수의 통로들 각각의 마스크 패턴은 하나 이상의 신호 방출 부분들 및 하나 이상의 신호 감쇠 부분들을 포함하는,
마이크로유체 디바이스. - 제2항에 있어서,
상기 하나 이상의 신호 방출 부분들은 투명 부분들이고 상기 하나 이상의 신호 감쇠 부분들은 불투명 부분들인,
마이크로유체 디바이스. - 제3항에 있어서,
상기 투명 부분들 및 상기 불투명 부분들은 100 비트보다 큰 이진 패턴에 대응하는,
마이크로유체 디바이스. - 제1항에 있어서,
상기 마스크 패턴은, 상기 신호의 적어도 일부가 상기 검출기에 의해 검출되도록 허용하게 구성된 하나 이상의 신호 방출 부분들을 포함하는,
마이크로유체 디바이스. - 제5항에 있어서,
상기 하나 이상의 신호 방출 부분들은 적어도 2개의 투명 상태들을 포함하는,
마이크로유체 디바이스. - 제1항에 있어서,
상기 신호는 형광, 자기, 유전성 및 초음파로 구성된 그룹으로부터 선택되는,
마이크로유체 디바이스. - 제3항에 있어서,
상기 신호는 형광 신호이고 상기 검출기는 광 검출기인,
마이크로유체 디바이스. - 제8항에 있어서,
상기 복수의 통로들을 조명하도록 구성된 조명기를 더 포함하는,
마이크로유체 디바이스. - 제9항에 있어서,
상기 조명기는 상기 복수의 통로들을 조명하는 것과 조명하지 않는 것 사이에서 교번하도록 구성되는,
마이크로유체 디바이스. - 제9항에 있어서,
상기 조명기는 2개 이상의 광 파장들을 사용하여 상기 복수의 통로들을 조명하도록 구성되는,
마이크로유체 디바이스. - 제11항에 있어서,
상기 조명기는 서로 이위상(out of phase)으로 상기 2개 이상의 광 파장들을 변조하도록 구성되는,
마이크로유체 디바이스. - 제11항에 있어서,
상기 마스크 패턴과 상기 광 검출기 사이에 포지셔닝된 광학 필터를 더 포함하는,
마이크로유체 디바이스. - 제13항에 있어서,
적어도 하나의 추가 광학 필터가 상기 마스크 패턴과 상기 광 검출기 사이에 포지셔닝되고, 상기 광학 필터 및 상기 적어도 하나의 추가 광학 필터는 각각 상기 2개 이상의 광 파장들의 단일 파장에 대응하는,
마이크로유체 디바이스. - 제1항에 있어서,
상기 액적은 유제들(emulsifications), 비드들, 세포들, 병원균들, DNA, RNA, 핵산들, 오염물들 및 이들의 조합들로 구성된 그룹으로부터의 하나 이상의 분석물들을 함유하는,
마이크로유체 디바이스. - 액적들을 분석하기 위한 마이크로유체 디바이스로서,
기판;
상기 기판 상에 형성된 마이크로유체 채널 ― 상기 마이크로유체 채널은 복수의 통로들을 포함하고, 상기 복수의 통로들 각각은, 상기 복수의 통로들을 통과하는 액적들이 복수의 형광 신호들을 생성하도록 상기 통로를 통과하는 액적의 형광 신호를 변조하도록 구성된 마스크 패턴을 가지며, 상기 마스크 패턴은 상기 복수의 통로들의 각각에 대해 상이함 ―; 및
상기 복수의 형광 신호들을 검출하도록 구성된 검출기를 포함하는,
마이크로유체 디바이스. - 제16항에 있어서,
상기 검출기는 광 검출기인,
마이크로유체 디바이스. - 삭제
- 제16항에 있어서,
상기 복수의 형광 신호들 각각을 마스크 패턴과 상관시키도록 구성된 회로를 더 포함하는,
마이크로유체 디바이스. - 제16항에 있어서,
상기 액적은 2개 이상의 형광 신호들을 생성하며, 각각의 형광 신호는 상이한 광 파장에 대응하는,
마이크로유체 디바이스. - 제20항에 있어서,
상기 2개 이상의 형광 신호들을 복조하도록 구성된 2개 이상의 필터들을 더 포함하는,
마이크로유체 디바이스. - 기판 상에 형성된 마이크로유체 채널을 갖는 마이크로유체 디바이스로 복수의 액적들을 분석하는 방법으로서,
상기 마이크로유체 채널은 복수의 통로들을 포함하고, 상기 방법은,
상기 복수의 통로들을 통해 복수의 액적들을 통과시키는 단계;
상기 복수의 통로들 상에 형성된 복수의 마스크 패턴들을 사용하는 단계 ― 상기 복수의 통로들의 각각은 상기 복수의 마스크 패턴들로부터의 대응하는 마스크 패턴을 가지며, 상기 마스크 패턴은 상기 복수의 통로들의 각각에 대해 상이함 ―;
상기 복수의 액적들로부터의 복수의 신호들을 변조하는 단계; 및
상기 복수의 신호들을 검출하는 단계를 포함하는,
복수의 액적들을 분석하는 방법. - 삭제
- 제22항에 있어서,
상기 복수의 신호들 각각을, 상기 대응하는 마스크 패턴에 상관시키는 단계를 더 포함하는,
복수의 액적들을 분석하는 방법. - 제22항에 있어서,
상기 복수의 마스크 패턴들 각각은 하나 이상의 신호 방출 부분들 및 하나 이상의 신호 감쇠 부분들을 포함하는,
복수의 액적들을 분석하는 방법. - 제25항에 있어서,
상기 하나 이상의 신호 방출 부분들은 투명 부분들이고 상기 하나 이상의 신호 감쇠 부분들은 불투명 부분들인,
복수의 액적들을 분석하는 방법. - 제26항에 있어서,
상기 투명 부분들 및 상기 불투명 부분들은 적어도 100 비트를 갖는 이진 패턴에 대응하는,
복수의 액적들을 분석하는 방법. - 제25항에 있어서,
상기 하나 이상의 신호 방출 부분들은 다양한 투명 상태들의 패턴을 형성하는,
복수의 액적들을 분석하는 방법. - 제22항에 있어서,
상기 복수의 신호들은 형광, 자기, 유전성 및 초음파 중 하나 또는 그 초과인,
복수의 액적들을 분석하는 방법.
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