CN107110780A - 用于分析微流体装置的输出的设备和方法 - Google Patents

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Abstract

公开了用于分析微滴的微流体装置。所描述的微流体装置包括基片和形成在基片上的微流体通道。微流体通道包括通路，其中，每个通路具有被配置成对通过该通路的微滴的信号进行调制的掩模图案，使得通过通路的微滴产生信号。微流体装置还包括被配置成检测所述信号的检测器。公开了用微流体装置来分析微滴的方法，所述微流体装置具有形成在基片上的微流体通道。所描述的方法包括：使微滴通过通路；使用形成在通路上的掩模图案；对来自微滴的信号进行调制；以及检测所述信号。

Description

用于分析微流体装置的输出的设备和方法
相关申请的交叉引用
本PCT申请要求于2014年8月14日提交的美国临时专利申请第62/037,273号的优先权，出于所有目的，该美国临时专利申请的公开内容通过引用全部合并到本文中。
技术领域
本发明涉及微流体领域，并且更特别地涉及用于分析微流体装置的输出如微滴的设备和处理。
背景技术
使用微尺度的乳剂作为隔离的区室来运行多个独立的化学反应的基于微滴的测定法作为广泛的生物医学应用的平台在最近几年得到了普及。相比于使用毫米大小的孔板来隔离流体的常规实验室方法，微米尺度的微滴仅包含(10-12L)皮升的流体，提供了在体积上的106倍的缩小。进一步，相比于常规孔板上可用的数百个区室，微流体允许以高达每分钟106的速率来创建微滴，从而提供在区室的数目上大于常规技术的104倍。来自大规模并行超小体积测定法的灵敏度巨大提高已被利用来检测蛋白质和核酸的单分子，以：监测作为时间的函数的分子浓度；执行用于定向进化的高通量筛选；并且测定单细胞。
当用于产生和处理微滴的微流体装置可以被小型化和集成到紧凑的单片芯片上时，已经更难以小型化对基于微滴的测定法的读出。可以使用基于荧光的感测，这是因为：1)分子信标，其可以基于绑定事件来开启或关闭荧光，避免额外的步骤来洗去过量的试剂；2)不同颜色的荧光团允许检测单个微滴中的多个目标；并且3)广泛可用的基于荧光的试剂使得测定的发展较为容易。以前的工作已经将荧光检测与微滴微流体技术进行集成并且使细胞的荧光检测小型化。已开发有宽视野显微镜技术，其可以拍摄静态微滴的显微照片，其中，在单张中具有多达106的析象能力。其他团体已开发了在流中检测系统，其具有实时排序下游处理的优点，并且具有与静态技术相比可能的测量远远更大数目的微滴的能力，测量多达每秒104个的微滴的能力。然而，这些技术需要复杂的光学器件并且不容易进行修改以监测多于一个的通道。
发明内容
本发明的各方面涉及用于分析微流体装置的输出的设备和方法。
根据一个方面，本发明提供了一种用于分析微滴的微流体装置。微流体装置包括基片和形成在基片上的微流体通道。微流体通道包括多个通路，所述多个通路中的每一个具有被配置成对通过该通路的微滴的信号进行调制的掩模图案，使得通过所述多个通路的微滴产生多个信号。微流体装置还包括被配置成检测所述多个信号的检测器。
根据另一方面，本发明提供了一种用于分析微滴的微流体装置。微流体装置包括基片和形成在基片上的微流体通道。微流体通道包括多个通路，所述多个通路中的每一个具有掩模图案。每个掩模图案被配置成对通过该通路的微滴的荧光信号进行调制，使得通过所述多个通路的微滴产生多个荧光信号。微流体装置还包括被配置成同时检测所述多个荧光信号的检测器。
根据又一方面，本发明提供了一种用微流体装置来分析多个微滴的方法，所述微流体装置具有形成在基片上的微流体通道，所述微流体通道包括多个通路。该方法包括以下步骤：使多个微滴通过所述多个通路；使用形成在所述多个通路上的多个掩模图案；对来自所述多个微滴中的多个信号进行调制；以及检测所述多个信号。
应该理解的是，前述的总体描述和以下的详细描述对于本发明而言都是示例性的，而不是限制性的。
附图说明
当结合附图来阅读时，本发明将会从下面的详细描述中被最好地理解，在附图中，相同的元件具有相同的附图标记。当存在多个类似的元件时，单个附图标记可以被分配给所述多个类似的元件，其中，小字符标志指代具体的元素。当总体指代元素或者指代元素中的非特定的一个或更多个时，小字符标志可以被丢弃。进行如下强调：根据常见做法，附图中的各种特征未按比例绘制，除非有另外指明。相反，为清楚起见，各种特征的尺寸可以扩大或缩小。附图中所包括的图如下：
图1a是根据本发明的各方面的微流体装置的示意图；
图1b是根据本发明的各方面的微流体装置的横截面示意图；
图1c是描绘根据本发明的各方面的从105比特长的掩模图案得到的幅度调制信号的曲线图；
图1d是根据本发明的各方面的微流体装置的照片；
图2a是根据本发明的各方面的信号测量的流程示意图；
图2b是根据本发明的各方面的二维速率相关；
图2c是根据本发明的各方面的涉及原始信号数据和相应的正交相关向量的一组曲线图；
图3a是根据本发明的各方面的微流体装置的横截面示意图；
图3b是根据本发明的各方面的装置的一部分的光学显微照片；
图3c是根据本发明的各方面的微流体装置的示意图；
图3d是根据本发明的各方面的荧光显微照片；
图3e是根据本发明的各方面的微流体装置的示意图；
图3f是根据本发明的各方面的信号检测器的芯片示意图；
图4a是根据本发明的各方面的涉及原始信号数据和相应的正交相关向量的一组曲线图；
图4b是根据本发明的各方面的涉及多个微滴的原始信号数据和相应的正交相关向量的一组曲线图；
图5是描绘根据本发明的各方面的分析多个微滴的方法的选择步骤流程图；
图6a是描绘根据本发明的各方面的通过掩模图案通路的两个微滴的通过的一组曲线图；
图6b是描绘根据本发明的各方面的通过掩模图案通路的微滴的通过的热图；
图6c是描绘根据本发明的各方面的通过掩模图案通路的微滴的通过的热图；
图6d是描绘根据本发明的各方面的微流体装置的测量能力的灵敏度和特异性的接收器工作特性曲线；
图7a是描绘信噪比对根据本发明的各方面的微流体装置的灵敏度和特异性的影响的接收器工作特性曲线；
图7b是描绘掩模图案的位的数目对根据本发明的各方面的微流体装置的灵敏度和特异性的影响的接收器工作特性曲线；
图7c是描绘通路的数目对根据本发明的各方面的微流体装置的灵敏度和特异性的影响的接收器工作特性曲线；
图7d是描绘通路的数目和微滴的数目对根据本发明的各方面的微流体装置的灵敏度和特异性的影响的接收器工作特性曲线；
图8是根据本发明的各方面的信号测量的流程示意图；
图9a是根据本发明的各方面的提供两个不同波长的光的微流体装置的横截面示意图；
图9b是根据本发明的各方面的针对激发光谱和发射光谱的两步解调的流程示意图；
图9c是根据本发明的各方面的被配置成提供两种不同信号的两种染料的激发光谱和发射光谱的图示；以及
图9d是图9b的两步解调的结果的示意图。
具体实施方式
本发明的各方面涉及用于分析微流体装置的输出的设备和方法。
本发明人已经认识到，提供对微流体装置的输出的全分析将会是有用的。本发明人还已经认识到，针对微流体装置的每个通道使用不同的微图案化掩模来对来自输出例如微滴的信号进行编码，使得能够恢复弱信号而无需昂贵和笨重的光检测器。本发明人已经还认识到使用掩模允许同时监测多个通道，从而允许日益增加的复杂实验，而无需另外的和昂贵的检测硬件例如透镜、激光器和复杂的流体控制硬件。特别地，本发明的微流体装置可以使用单个检测器来测量多个通道中的微滴，甚至同时测量多个通道中的微滴，并且不需要透镜或复杂的流体流动控制。由此，微流体装置的实施方式适用于便携式医用方面。
在本文中使用时，“微滴”总体上指用于要使用本发明的设备和方法来分析的一个或更多个分析物的赋形剂和/或递送系统。在微流体装置的上下文中，合适的分析物包括但不限于乳剂(例如油包水、水包油、水包油包水)、囊泡、微气泡、珠粒(例如磁性聚合物珠)、细胞、病原体、DNA、RNA、核酸、污染物等。
在本文中使用时，“信号”是指微滴的任何外部可检测的特征。可以由本发明的微流体装置检测的示例性信号包括电信号、磁信号、介电信号、超声波信号、荧光信号。
图1a示出了根据本发明的各方面的用于分析微滴的微流体装置100的示意图。本发明的微流体装置允许对微滴——例如可以由微滴产生器110产生的单分散乳剂——的分析。在一种实施方式中，微滴产生器110是微流体装置100的部件。
可以在基片上形成微流体装置100的一部分。示例性基片材料包括玻璃、二氧化硅、聚酯薄膜、聚硅氧烷或碳基聚合物，包括但不限于聚二甲基硅氧烷(“PDMS”)、聚丙烯酰胺、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯或它们的混合物。
微流体装置100包括微滴可以在其中流过的多个通路，这些通路可以统称为微流体通道。微流体通道包括多个流体通路115。所述多个流体通路115与微滴产生器110流体连通并且从微滴产生器110接收微滴。在一种示例性实施方式中，所述多个流体通路115中的每一个包括源于微滴产生器110的微滴流。
所述多个通路115中的每一个包括相应的掩模图案(统称为掩模120)，所述掩模图案被配置成对通过该通路的微滴产生的信号进行调制。虽然示出为单个掩模120，但是本领域技术人员将会从本文中的描述中认识到每个掩模图案可以被实现为独立的掩模，或者两个或更多个掩模图案可以被合并成一个掩模。在一种实施方式中，掩模120是驻留在所述多个通路中的每一个中的一个或更多个表面上的微图案(例如“条形码”)。转向图1b，每个掩模图案包括一个或更多个信号发射部分和一个或更多个信号抑制部分。例如，在待分析的信号是荧光的情况下，信号发射部分可以是允许信号(此处，光)通过掩模的透明部分124，并且信号抑制部分可以是防止信号通过掩模的不透明部分122。信号发射部分和信号抑制部分可以包括在完全透明与完全不透明之间的各种透明状态。此处，掩模可以是在玻璃上的光刻图案化金属，其还可以用作所述多个通路115的顶板(roof)。本领域技术人员将理解，掩模120可以形成在其它表面(即所述多个通路115的侧面或底面)上。掩模120还可以形成在所述多个通路115的内表面上，或者形成在所述多个通路之上的表面上(例如所述多个通路之上的滤光器上)。
在关注其他信号——例如电信号、磁信号、介电信号和超声波信号中的一种或更多种——的情况下，掩模120可以包括除了变化的透明状态之外的状态。也就是说，信号发射部分应当允许所关注的信号的全部或一部分通过掩模，而信号抑制部分应当防止这样的通过。例如，对于磁信号，掩模120可以包括定位在通路的不同位置处的磁场传感器，以对掩模图案进行编码。可替代地，可以将用于将传感器相对于磁场进行遮蔽的高敏感性材料例如NiFe图案化到所述多个通路115上，以实现相同的结果。在所关注的信号是超声波的情况下，可以使用具有大的反射系数的材料来产生掩模图案。
回到图1a，在荧光是待分析的信号的情况下，微流体装置100还可以包括照射器例如光源125。如所描绘的，光源125是侧面照射系统，其用于激发微滴内的荧光染料。光源125可以是发光二极管(LED)，其发射被调谐到微滴内的荧光团的激发波长λex的光。光源125可以被配置成发射在调谐到两个或更多个荧光团的激发波长的两个或更多的光波长处的光。可替代地，可以使用两个或更多个光源来发射具有两个或更多个光波长的光。照射器可以被配置成将所发射的两个或更多个光波长调制成彼此不同相。
光源125可以被配置成在照射与不照射之间交替，和/或在两个或更多个光波长之间交替。理想的是，这种交替在每个体像素下微滴持续期间发生许多次，例如每单个像素下的持续时间，微滴可以经历100次交替、200次交替、300次交替，等等。在一种实施方式中，所述两个或更多个光波长之间的这种交替以300kHz的频率发生，使得：当每个微滴在单个个体像素下通过时，每个微滴经历300次激发交替。采用被配置成在照射与不照射之间交替和/或在两个或更多个光波长之间交替的照射器可以使得微流体装置100能够对于每个微滴测量相对荧光信号，而不是绝对信号，从而有利于对分析物的改善的免校准分析。
可以使用反谐振耦合来包含微芯片内的光并且一致地和强烈地照射流体通道。通过多个通路115的含有一种或多种荧光染料的微滴将吸收来自光源125的激发光并发出荧光。当微滴沿通路115向下移动时，它发出的光被掩模120进行幅度调制。
微流体装置100还包括检测器130，检测器130检测从所述多个通路115中的每一个发出的经调制信号。检测器130可以被配置成同时检测从所述多个通路115中的每一个发出的经调制信号。在一种实施方式中，如图1b所示，来自通路的各向同性地发射的荧光通过掩模120的相应的掩模图案，并进入检测器130例如硅光检测器中。在示出的实施方式中，在掩模120与检测器130之间是长通滤光器132，长通滤光器132减少了来自散射的激发光的背景信号。在一种实施方式中，在光源125产生两种或更多种光波长的光的情况下，可以采用附加的滤光器使得使用两种或更多种滤光器，每个滤光器对应于所述两种或更多种光波长中的单种波长，并且定位在掩模图案与光检测器之间。所述两种或更多种滤光器可以被配置成对所述两个或更多个荧光信号进行解调。所述两种或更多种滤光器还可以被配置成长通滤光器并且在空间上分离，以使得每个微滴在每个滤光器下顺序通过。检测器130可以搁置在掩模120的正上方。
当微滴在掩模图案下方通过时，它发射的光从被信号抑制部分122阻挡变为通过信号发出部分124透过，这产生二元幅度调制信号Vd(t)。在一种实施方式中，对于多个通路115——n个通路115——中的每一个，可以将掩模图案mn定义为一系列的1和0，其中，1对应于透明，而0对应于不透明。将掩模120定位成靠近微滴确保掩模图案中的每比特对着从微滴射出的光的最大可能立体角，因此，确保1和0之间的对比。
掩模图案的范围可以为80至125比特。在一种实施方式中，掩模图案大于100比特。在一个系统(SNR＝-6dB，c＝4通道)中，已经发现，掩模长度可以在性能上没有显著降低的情况下减小到最低为L＝100比特(AUC＝0.999)。在这样的系统中，低于L＝50比特，灵敏度和特异性可能会略微退化。
理想地，掩模120内的掩模图案可以最低限度地彼此相关，使得能量E(ma＊ma)为最小。这允许微滴共存于同一通道的不同通路中的检测区域中并且区分于彼此。优选地，掩模图案对于所述多个通路115中的每一个而言是不同的。在一种实施方式中，掩模图案可以最低限度地彼此交叉相关，使得能量E(ma＊mb)对于a≠b为最小。这允许来自不同通道的信号最大限度地分离。
可以使用反馈寄存器来生成被称为最大长度序列(MLS)的伪随机向量。对于长度L＝2M-1的序列，移位寄存器的元素由度M的本原多项式h(x)限定。通过迭代该移位寄存器，可以生成被证明是最小限度地自相关的一系列的1和0。为了创建多个通道，可以通过将一维MLS折叠成如由MacWilliams和Sloane描述的二维MLS、伪随机序列和阵列来生成二维MLS。Proceeding of the IEEE 64:1715-1729(1976)。
掩模图案允许将由检测器130获得的一维信号解压缩成一组向量，每个向量代表所述多个通路115中的一个。图1C图示了105比特的长掩模图案的一个示例和来自通过的微滴的相应的幅度调制信号Vd。此时编码有两个功能：1)它允许使用基于相关的信号恢复来恢复弱信号(SNR<<1)，并且因此使得能够进行简单的硬件实现，其不包括透镜、激光器或高灵敏度的检测器；2)它允许仅使用单个检测器来独立监测多个通道，从而使得能够在单个芯片上实现附加的测定，而不会增加硬件的复杂性。
每比特的长度可以是均匀的。在一种实施方式中，比特长度为80μm长，导致对于105比特长的掩模图案具有8.4mm长的检测区域。本领域技术人员将理解，比特长度将还会随比特不同而不同。
图1d是根据本发明的各方面的用于分析微滴的微流体装置100的照片。在该实施方式中，系统大致是移动电话的尺寸(10×5×2cm3)。
处理来自光检测器的信号Vd(t)可以包括初步确定荧光微滴是否已经通过检测区域，如果是，则确定荧光微滴通过多个通路115中的哪些通路。为此，微流体装置100还可以包括被配置成使多个荧光信号中的每一个与掩模图案相关的电路。该信号可以被投影至一组向量ψn上，每个向量表示来自通过的微滴的信号Vd(t)与掩模mn中的每一个的相对相关。如图2a所描绘的，由光检测器测量到的信号Vd(t)被投影至向量ψn(τ)＝Vd(t)＊mn(x/v)＝∫Vd(t)mn(x/v+τ)dt从-∞到∞，每个向量表示微滴已经通过单个通道n并且以速率v行进的可能性。
随着加载有10nM罗丹明(rhodamine)的微滴通过检测区域，来自光检测器的原始数据的示例在图2c中被示为Vd。在信号通过相关器组(图2a)之后，产生了一组向量ψ1、ψ2、ψ3和ψ4，其中，每个向量对应于多个通路115中的特定通道。微滴引起ψ2中大的峰值，这表明微滴通过该通道。限定了应用于这些向量(示为绿色虚线)中的每一个的门控阈值ψt，高于该阈值认为检测到荧光微滴。
可以利用微滴速率的知识来增强上述峰值检测。然而，发明人已经发现，微滴和流量控制不是必需的。特别地，可以使用适于具有分散速率的微滴的算法。可以计算二维相关mn(x/V)＊Vd(t)，其中，V是具有一系列速率[vmin:vmax]的一维矩阵。可以使用MATLAB来计算该二维相关。图2b将输出描绘为速率v和时间t中的二维矩阵，据此，可以在二维空间中准确地找到峰值位置(vp,tp)。该技术的假设是，在检测区域中微滴速率在持续时间(～50ms)内恒定，这用实验来验证。在该特定实施方式中，可以观察到三个不同速率的三个微滴。
可以通过使光源125在照射与不照射之间交替和/或在两个或更多个光波长之间交替来进一步改进检测。通过调制激发光，可以将信号在频率上偏移出光检测器130的低频噪声，从而提高检测低SNR微滴的能力。通过对来自两个激发源和两个发射滤光器的微滴的响应进行编码，利用四种可能的组来独立地测量每个微滴。在一种实施方式中，可以测量三个参数以检测微滴的存在，例如两个荧光通道和亮场散射(SSC)。
转向图5，提供了描绘用微流体装置来分析多个微滴的方法的选择步骤的流程图，微流体装置具有形成在基片上的微流体通道，微流体通道包括多个通路。应当注意，关于本文所述的方法，根据本文的描述将理解，一个或更多个步骤可以被省略和/或不按所描述的方法的顺序(包括同时地)被执行，然而仍然实现期望结果。
在步骤510中，多个微滴通过多个通路(例如图1a中的多个通路115)。多个微滴可以由例如微滴产生器110产生。
在步骤520中，使用形成在多个通路上的多个掩模图案(例如图1a的掩模120)来调制来自多个微滴的多个信号。每个掩模图案可以具有一个或更多个信号发射部分和一个或更多个信号抑制部分。在待检测的信号是荧光或光的情况下，一个或更多个信号发射部分可以是透明部分，并且一个或更多个信号阻尼部分可以是不透明部分。此外，一个或更多个信号发射部分可以形成各种透明状态的图案。多个掩模的透明部分和不透明部分可以优先对应于具有至少约100位的二元图案。在一种实施方式中，多个通路中的每一个具有来自多个掩模的相应掩模。
在步骤530中，检测多个信号。可以使用检测器130例如光检测器来检测多个信号。检测器可以定位成正好与掩模120相对，或者滤光器132可以定位在检测器(例如光检测器130)与掩模120之间。
在实施方式中，在信号是荧光信号并且检测器是光检测器的情况下，在步骤530之前照亮多个通路。例如通过使照射器在照射与不照射之间交替和/或在两个或更多个光波长之间交替来交替照射多个通路，可以促进对荧光信号的检测。在一种实施方式中，交替照射多个通路包括重复地打开和关闭照射器例如光源125。在另一实施方式中，交替照射多个通路包括在两个或更多个光之间交替，每个光具有一个或更多个光波长。每种光可以被配置成具有与包括其它光的一个或更多个光波长不同的一个或更多个光波长。例如，照射多个通路的步骤可以包括照射器，该照射器被配置成产生两个或更多个光，每种光具有光波长并且在照射多个通路的步骤期间在两个或更多种光之间交替。
微滴可以包括两种或更多种荧光染料以产生两个或更多个荧光信号。多个荧光信号中的每一个可以对应于不同光波长和/或可以具有不同的发射光谱。
由检测器检测到的多个信号可以另外与多个掩模中的相应掩模相关。
示例
包括以下示例以说明本发明的总体性质。所述示例还说明通过产生稳定的单分散微泡以及通过采用根据本发明的原理的微流体装置和相关过程获得的改进结果。
如图3a所示，使用软光刻制造模制的PDMS流体通道和对玻璃上的Ni的标准平面光刻法生成掩模的组合来制造装置。Si光检测器紧密地位于芯片的上面，滤光器用于阻挡散射的激发光。使用具有80μm厚特征的标准单层SU-8光刻(SU-8 2025，MicroChem)来制造模制的PDMS层。使用标准平面光刻法将掩模图案化在玻璃上的Ni中。首先，将Ni热蒸发到玻璃载片(Kurt Lesker PVD 75，Wolf Nanofabrication Facility，宾夕法尼亚大学)上。随后，使用Ni(氯化铁(III))的湿法蚀刻来光刻限定(Shipley 1813)掩模图案。使用PDMS冲压粘合将Ni图案化的玻璃载片永久粘合到模制的PDMS层上。图3b描绘了装置的一部分的光学显微照片。比例尺为160μm。
如图3c所描绘的，使用T形接头产生微滴。微滴加载有罗丹明。比例尺为60μm。使用混合的软光刻/激光加工，将四个T形接头集成到单个装置上，仅具有单个油输入端。使用以下的组合来制造芯片：1)使用软光刻在PDMS层中制造微尺度微滴制造器和流体通道；以及2)使用直接激光微加工对具有更深的(d＝200μm)激光雕刻通道的PDMS的第二层制造通孔，以向各个微滴制造器均匀地递送油。T形接头的孔径为100μm宽和50μm深。矿物油用作具有5％V/V司盘(Span)80和1％V/V吐温(Tween)(Fisher Scientific)的连续相。水相的流速为0.1mL/hr，油相的流速为1mL/hr，并且使用注射泵(Braintree Scientific)来控制。如图3d所示，平均微滴尺寸为60μm，CV为～5％。使用片上储液器用于四个水的输入端，并且使用聚乙烯管将两个芯片连接在一起，单个注射泵能够驱动装置。完成使用管道连接两个独立的芯片模块以方便原型制作。使用兼容制造策略制造的微滴产生器和检测模块也集成在同一芯片上。
如图3f所描绘的，使用定制电子设备来放大、数字化以及处理来自光检测器的输出电流。光检测器传感器在λ＝600nm处具有的响应度为200mA/W。光检测器连接至具有DC-20kHz带宽(Thor PD100A)的G＝0.75×106V/A跨阻抗放大器。跨阻抗放大器的输出端被AC耦接至增益为20、高通频率为fH＝1Hz和低通频率为20kHz(Ithaco)的前置放大器(PA)。PA的输出端连接至对数字转换器(National Instruments，NI USB-6009)的模拟，其在将信号通过USB发送至计算机或智能电话以用于分析之前以40kS/s对信号进行数字化。所有分析在个人计算机(MATLAB)上完成，但是对于便携式实现，可以使用数字信号处理(DSP)芯片或使用云计算来完成该处理。
图3e描绘了示出如何使用抗谐振耦合将光经由侧面照射递送到芯片中的示意图。
使用可以封装到小尺寸便携式设备(图1d)中的商业产品将芯片中的光学器件保持为尽可能小且便宜。激发光由封装在具有散热器(Wakefield Thermal Solutions,19757-M-AB)的定制激光加工(Universal Laser)丙烯酸盒中的超亮LED(λex＝530nm)(Luminus，CBT-90-G-C11-JK201)提供。盒被设计成使得芯片可以以类似于槽式连接器的方式滑入其中，并且光将以倾斜角度耦合到芯片以用于最大抗谐振耦合。使用安装在具有集成跨阻放大的印刷电路板上的Silicone光检测器(Thor Labs，PDA 100a)。在芯片与检测器之间放置λ＝600nm长通滤光器(#69-868Edmund光学器件)以减少激发波长的散射光的影响(95％反射率)。
该装置的掩模图案的长度为105比特。使该序列尽可能长以使每个通道的自相关和通道之间的互相关最小化。序列长度受光检测器的尺寸的限制。Silicone光检测器(ThorLabs，PDA100A)为10×10mm2，并且由于没有使用透镜，这设置了检测区域的尺寸。掩模中的每个像素的尺寸由微滴的尺寸确定。为了确保从每个微滴各向同性射出的光的大部分被掩模图案阻挡，掩模的像素尺寸与微滴的像素尺寸匹配。使用60μm微滴和80μm像素。因此，每个通道的总比特数被限制为10mm/80μm＝125。
为了生成每个掩模为105比特长的一组掩模，所述一组掩模与对于最小自相关和互相关的规范匹配，采用MacWilliams和Sloane中的处理以从伪随机最大长度序列(MLS)创建伪随机矩阵阵列。伪随机矩阵的维度是MLS序列的某些允许的分解。在这种情况下，维度为105×39＝4095＝212-1(M＝12)。使用MATLAB将这些序列与随机生成的掩模序列进行比较。发现MLS生成的掩模具有显著更小的自相关和互相关(P<10-4，双侧t校验)。还开发了用于生成掩模的替代策略，其中，生成大的随机掩模库，然后选择具有低自相关的掩模的子集。然后，从该子集中选择具有低互相关的子集对，并且从那些对中选择具有低互相关的四个组。这两个过程产生了类似的结果，但是MLS技术仅花费了数秒的计算时间，而选择技术花费了几个小时，并且对于大于四个通道不可阻挡地变得慢。两种实现都在MATLAB中执行。
测量低于本底噪声的荧光微滴
发明人的基于相关性的检测方案允许极弱信号(SNR<<1)从低于本底噪声恢复。该平台可以有效地将信号与噪声分离，这是因为信号与掩模的图案相关，而噪声不相关。恢复弱信号的能力是期望的，这是因为所述检测方案允许无透镜使用，从而使得其非常适合于小型化。为了证明这种能力，测量具有SNR～0.25的弱荧光微滴，所述弱荧光微滴在原始数据中不能被分辨。如图4a所示，通过在同一时间间隔上将来自通过的微滴的信号中的预期能量除以噪声的平均能量来计算信噪比。然而，在将该数据与正确的掩模m2相关之后，其相关向量ψ中的峰值远高于相关数据中的本底噪声(SNR>10)并且容易被检测。
同时测量检测区域中的多个微滴
本发明平台的高灵敏度部分地来自于检测区域的大面积(10×10mm2)，检测区域在荧光微滴通过时收集来自荧光微滴的许多光子。然而，具有大的检测区域的权衡是，如在常规细胞计数法中一样，检测区域一次限于一个微滴，其严重限制了装置的总处理能力。为此，将掩模设计成能够同时分辨检测区域内的多个微滴。选择具有低自相关和彼此低互相关的掩模图案，以使得基于互相关的检测策略可以同时分辨沿着同一通道或不同通道中的不同位置的微滴。
为了证明该能力，同时测量通过检测区域的三个微滴，所述三个微滴全部在同一通道中。如图4b所示，在原始数据中，三个信号重叠并且不可能分辨。然而，在将该数据与正确掩模相关之后，相关向量ψ中的三个峰值变得很好分离并且可以被单独分辨。
多通道检测
本发明平台的益处是同时检测多个通道中的微滴的能力。为了表征该能力，微滴被发送通过特定通道，并且将装置的输出与预期结果进行比较。该功能在图6a中示出，图6a示出了通过检测区域的两个微滴，其中，一个微滴在通道1中通过，另一个微滴在通道2中通过。在将该数据与正确的掩模相关之后，通道2中的清晰峰值对应于第一微滴并且通道1中的清晰峰值对应于第二微滴，从而允许容易识别微滴的正确通道。
装置灵敏度和特异性的定量
为了表征灵敏度与特异性之间的权衡，使用一系列阈值ψt来测试本发明的装置，并且生成受试者工作特性曲线(ROC)。灵敏度＝TP/P，其中，TP是检测器成功检测到通过的微滴并且准确识别到其通道的实例的数目，并且P是微滴的总数目。特异性＝检测器的TN/N，其中，TN＝N-FP是真阴性并且由总的假阳性FP——即检测器错误检测微滴的实例——和阴性的总数目N＝P*(c-1)来限定，N由微滴的总数目P和通道的总数目c来限定。
微滴首先一次通过四个通道之一，并且量化灵敏度和特异性的检测。图6b总结了热图中的实验结果。装置按预期执行；沿着热图的对角线在微滴通过的通道中检测到微滴，而不是在偏离对角线的不正确的通道中。黑点示出微滴通过的通道。对于每次测试，使具有SNR～1的～400个微滴通过。对于选择的阈值ψt，灵敏度为1.0，并且特异性为0.994。
为了证明芯片同时检测多个通道中的微滴的能力，微滴接下来通过通道的六个可能的组(ch1和ch2、ch1和ch3等)中的每一个。图6c总结了热图中的实验结果。在正确的通道组中检测到微滴，而不是在不正确的通道中。对于每次测试，使具有SNR～1的～800个微滴通过。对于选择的阈值ψt，平均灵敏度为1.0，并且特异性为0.993。
灵敏度与特异性之间的权衡通过产生总结上述结果的ROC曲线来表征。对于具有近似SNR～1的微滴，图6d描绘了曲线下方的区域，AUC＝0.9995，从而证明了仅使用单个光检测器鲁棒地监测微滴的平行流的能力。
表征设计参数选择对性能的影响
为了表征和辅助系统的设计，使用模型来模拟一系列参数。该模型使用MATLAB实现。简而言之，使用随机数发生器随机地产生微滴通过通道的时间点tp和微滴通过的特定通道n。使用掩模图案生成来自通过的微滴的信号Vd(t)＝m(n，x/v-tp)+Vd(t)，所述信号由微滴速率v缩放并且在时间点tp被放置在输出信号Vd(t)中。重复地放置N个微滴。高斯噪声被添加至信号达适当的信噪比SNR。通过与实验数据直接比较来验证该模型。使用该模型，确定了检测策略的极限，这为未来的应用和发展奠定了基础。
研究了微滴检测的灵敏度和特异性如何是光检测器的信噪比(SNR)的函数。对于本研究中使用的设置(L＝100比特，c＝4个信道)，发现如图7a所描绘的，可以在SNR低至-10dB(0.1)的情况下以高灵敏度和精确度(AUC＝0.9991)检测到微滴。SNR低于-13dB(0.05)，灵敏度和特异性开始迅速下降。当信号仅为噪声的5％时分辨微滴的能力使得能够使用简单的无透镜光检测器来分辨弱荧光微滴。
接下来，测量掩模L中的比特数对性能的影响。对于与原型匹配的系统(SNR＝-6dB，c＝4个信道)，发现掩模可以减小至低至L＝100比特(AUC＝0.999)的长度，而没有显著地减小性能。低于L＝50比特，灵敏度和特异性迅速下降。随着比特长度的性能的增加可以归因于两个因素：1)随着比特数增加，微滴被有效地测量更多的实例，从而导致通过信号求平均～√L来增加有效SNR；以及2)随着比特数增加，通道之间的互相关ma＊mb≠a相应地减小，当微滴通过通道b≠a时，这减小了ψa中的背景信号。
表征增加通道数目的限制
最后，模型系统用于证明增加比原型中证明的c＝4更多的通道的可行性。在第一实验中，总微滴速率保持恒定R＝R0以使得检测区域中的微滴的平均数目为～1。如图7c所示，对于与原型匹配的装置(L＝100比特，SNR＝-6dB)，发现随着通道数目从c＝4增加至16，灵敏度和特异性保持恒定。该结果可以归因于若干因素，包括：1)随着c从4增加至16，通道之间的相关ma＊mb≠a的增加不显著；以及2)由于可以从L＝100比特生成的不相关掩模的数目比c.312大得多。随着通道数目的增加，每微滴有更多的相关向量ψa。峰值查找算法通过比较峰值高度与其他向量ψb≠a中的局部方差来识别峰值。随着通道数目c增加，求平均增加，这减小了假阳性和假阴性。
如图7d所示，芯片的多路复用能力可能在某种程度上受微滴密度限制，其中，当检测区域中的平均微滴数目增加超过～2时，芯片性能下降。因为微滴在通道中的位置遵循泊松统计，随着检测区域中的微滴的平均数目变得大于2，变得越来越可能的是：在任何给定情况下可能在检测区域中发现>5个微滴，此时检测器分辨单个事件的能力受到影响。为了测试该现象，而不是保持总微滴速率恒定R＝R0，每通道的微滴速率保持恒定R∝c。选择微滴速率以使得对于4个通道，在检测区域中平均一次存在一个微滴，并且速率随着通道的增加而成比例地增加。装置的性能随着每次增加通道而成比例地下降。
利用多种荧光染料和多种光波长
通过调制荧光信号的激发波长和发射波长二者以检测每个微滴内的多种荧光染料，可以改进对微滴中的分析物的检测。在图9a中，两种荧光染料、荧光素和罗丹明B分别具有对应于与绿色相关联的530nm的光波长以及与蓝色相关联的460nm的光波长的激发波长。期望地，用于激发荧光染料的两种光波长被调制为彼此不同相。
由荧光素和罗丹明B染料产生的激发光谱(由虚线示出)和发射光谱(由实线示出)的示例示于图9c中。
采用两种不同的长通滤光器来分辨由微滴产生的发射光谱。两个滤光器将在空间上分开以使得每个微滴在滤光器下面顺序地通过。在该示例中，两个滤光器中的每一个被配置成对应于单个波长，例如绿光波长或蓝光波长，以使得一个滤光器阻挡由蓝光波长产生的激发，并且另一滤光器阻挡由绿光波长产生的激发。两个掩模图案可以与滤光器共同定位以解调来自每个滤光器的响应。
来自光检测器的信号被解调以独立地测量从两种染料接收到的两个信号。图9b示出了两步解调方法，通过所述方法激发解调和发射解调顺序地发生。在该示例中，如图9d所示，解调产生与来自两个激发源和两个发射滤光器的响应相关联的四种可能组合。
尽管本文中参照具体实施方式示出和描述了本发明，但是本发明不意在限制于所示的细节。确切地，在权利要求的范围和权利要求的等同物的范围内并且在不偏离本发明的情况下可以在细节上做出各种修改。

Claims (29)

1.一种用于分析微滴的微流体装置，包括：
基片；
形成在所述基片上的微流体通道，所述微流体通道包括多个通路，所述多个通路中的每一个具有被配置成对通过该通路的相应微滴的信号进行调制的掩模图案，使得通过所述多个通路的微滴产生多个信号；以及
检测器，其被配置成检测所述多个信号。
2.根据权利要求1所述的微流体装置，其中，所述多个通路中的每一个的掩模图案包括一个或更多个信号发射部分和一个或更多个信号抑制部分。
3.根据权利要求2所述的微流体装置，其中，所述一个或更多个信号发射部分是透明部分，并且所述一个或更多个信号抑制部分是不透明部分。
4.根据权利要求3所述的微流体装置，其中，所述透明部分和所述不透明部分对应于大于100比特的二元图案。
5.根据权利要求1所述的微流体装置，其中，所述掩模图案包括：一个或更多个信号发射部分，其被配置成允许所述信号的至少一部分被所述检测器检测。
6.根据权利要求5所述的微流体装置，其中，所述一个或更多个信号发射部分包括至少两种透明状态。
7.根据权利要求1所述的微流体装置，其中，所述信号选自由荧光信号、磁信号、介电信号和超声波信号组成的组。
8.根据权利要求3所述的微流体装置，其中，所述信号是荧光信号，并且所述检测器是光检测器。
9.根据权利要求8所述的微流体装置，还包括：照射器，其被配置成照射所述多个通路。
10.根据权利要求9所述的微流体装置，其中，所述照射器被配置成在照射所述多个通路与不照射所述多个通路之间交替。
11.根据权利要求9所述的微流体装置，其中，所述照射器被配置成使用两个或更多个光波长来照射所述多个通路。
12.根据权利要求11所述的微流体装置，其中，所述照射器被配置成将所述两个或更多个光波长调制成彼此不同相。
13.根据权利要求11所述的微流体装置，还包括：滤光器，其定位在所述掩模图案与所述光检测器之间。
14.根据权利要求13所述的微流体装置，其中，在所述掩模图案与所述光检测器之间定位有至少一个附加的滤光器，所述滤光器和所述至少一个附加的滤光器各个对应于所述两个或更多个光波长中的单个波长。
15.根据权利要求1所述的微流体装置，其中，所述微滴包含一个或更多个分析物，所述分析物来自由乳化物、珠粒、细胞、病原体、DNA、RNA、核酸、污染物以及它们的组合组成的组。
16.一种用于分析微滴的微流体装置，包括：
基片；
形成在所述基片上的微流体通道，所述微流体通道包括多个通路，所述多个通路中的每一个具有被配置成对通过该通路的微滴的荧光信号进行调制的掩模图案，使得通过所述多个通路的微滴产生多个荧光信号；以及
检测器，其被配置成检测所述多个荧光信号。
17.根据权利要求16所述的微流体装置，其中，所述检测器是光检测器。
18.根据权利要求17所述的微流体装置，其中，所述掩模图案针对所述多个通路中的每一个而言是不同的。
19.根据权利要求18所述的微流体装置，还包括：电路，其被配置成使所述多个荧光信号中的每一个与掩模图案相关。
20.根据权利要求16所述的微流体装置，其中，所述微滴产生两个或更多个荧光信号，每个荧光信号对应于不同的光波长。
21.根据权利要求20所述的微流体装置，还包括：两个或更多个滤光器，其被配置成对所述两个或更多个荧光信号进行解调。
22.一种用微流体装置来分析多个微滴的方法，所述微流体装置具有形成在基片上的微流体通道，所述微流体通道包括多个通路，所述方法包括：
使多个微滴通过所述多个通路；
使用形成在所述多个通路上的多个掩模图案；
对来自所述多个微滴的多个信号进行调制；以及
检测所述多个信号。
23.根据权利要求22所述的方法，其中，所述多个通路中的每一个具有来自所述多个掩模图案的相应掩模图案。
24.根据权利要求23所述的方法，还包括使所述多个信号中的每一个与所述相应掩模图案相关的步骤。
25.根据权利要求22所述的方法，其中，所述多个掩模图案中的每一个包括一个或更多个信号发射部分和一个或更多个信号抑制部分。
26.根据权利要求25所述的方法，其中，所述一个或更多个信号发射部分是透明部分，并且所述一个或更多个信号抑制部分是不透明部分。
27.根据权利要求26所述的方法，其中，所述透明部分和所述不透明部分对应于具有至少约100比特的二元图案。
28.根据权利要求25所述的方法，其中，所述一个或更多个信号发射部分形成具有各种透明状态的图案。
29.根据权利要求22所述的方法，其中，所述多个信号是荧光信号、磁信号、介电信号和超声波信号中的一种或更多种。
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