JP6650649B2 - 遺伝子改変非ヒトモデル動物 - Google Patents
遺伝子改変非ヒトモデル動物 Download PDFInfo
- Publication number
- JP6650649B2 JP6650649B2 JP2019514326A JP2019514326A JP6650649B2 JP 6650649 B2 JP6650649 B2 JP 6650649B2 JP 2019514326 A JP2019514326 A JP 2019514326A JP 2019514326 A JP2019514326 A JP 2019514326A JP 6650649 B2 JP6650649 B2 JP 6650649B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- gene
- txn1
- modified
- thioredoxin
- rats
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 title claims description 60
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 title claims description 47
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 77
- 108060008226 thioredoxin Proteins 0.000 claims description 67
- 229940094937 thioredoxin Drugs 0.000 claims description 47
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 36
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 23
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 23
- 206010015037 epilepsy Diseases 0.000 claims description 21
- XJLXINKUBYWONI-NNYOXOHSSA-N NADP zwitterion Chemical compound NC(=O)C1=CC=C[N+]([C@H]2[C@@H]([C@H](O)[C@@H](COP([O-])(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]3[C@H]([C@@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](O3)N3C4=NC=NC(N)=C4N=C3)O)O2)O)=C1 XJLXINKUBYWONI-NNYOXOHSSA-N 0.000 claims description 20
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 claims description 19
- 208000017169 kidney disease Diseases 0.000 claims description 17
- 229930027945 nicotinamide-adenine dinucleotide Natural products 0.000 claims description 17
- 208000024172 Cardiovascular disease Diseases 0.000 claims description 13
- 208000007502 anemia Diseases 0.000 claims description 13
- 208000006545 Chronic Obstructive Pulmonary Disease Diseases 0.000 claims description 12
- 206010020772 Hypertension Diseases 0.000 claims description 12
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 12
- 208000017170 Lipid metabolism disease Diseases 0.000 claims description 11
- 208000001132 Osteoporosis Diseases 0.000 claims description 11
- 230000032683 aging Effects 0.000 claims description 11
- 208000002251 Dissecting Aneurysm Diseases 0.000 claims description 8
- 206010002895 aortic dissection Diseases 0.000 claims description 8
- 208000026278 immune system disease Diseases 0.000 claims description 8
- 230000009467 reduction Effects 0.000 claims description 8
- 238000010171 animal model Methods 0.000 claims description 7
- 208000032928 Dyslipidaemia Diseases 0.000 claims description 5
- 102000002933 Thioredoxin Human genes 0.000 claims 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 108
- 101150061874 TXN gene Proteins 0.000 description 91
- 102100036407 Thioredoxin Human genes 0.000 description 58
- 125000005842 heteroatom Chemical group 0.000 description 35
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 35
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 23
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 18
- 238000000034 method Methods 0.000 description 18
- 206010010904 Convulsion Diseases 0.000 description 16
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 16
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 13
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 12
- 208000020832 chronic kidney disease Diseases 0.000 description 12
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 11
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 11
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 10
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 10
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 10
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 10
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 9
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 9
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 9
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 9
- 208000016012 Phenotypic abnormality Diseases 0.000 description 8
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 8
- 102220489643 Thioredoxin_C35S_mutation Human genes 0.000 description 8
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 8
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 8
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 8
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 8
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 8
- 230000002485 urinary effect Effects 0.000 description 8
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 7
- 230000036542 oxidative stress Effects 0.000 description 7
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 6
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 6
- 206010003694 Atrophy Diseases 0.000 description 6
- 108091033409 CRISPR Proteins 0.000 description 6
- 230000037444 atrophy Effects 0.000 description 6
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 6
- 230000006870 function Effects 0.000 description 6
- 210000002216 heart Anatomy 0.000 description 6
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 5
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 5
- 210000002459 blastocyst Anatomy 0.000 description 5
- 230000008859 change Effects 0.000 description 5
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 5
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 5
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 5
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 5
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 5
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 4
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 4
- 201000004384 Alopecia Diseases 0.000 description 4
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 206010033122 Ovarian atrophy Diseases 0.000 description 4
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 206010058907 Spinal deformity Diseases 0.000 description 4
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 4
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 description 4
- 238000002591 computed tomography Methods 0.000 description 4
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 4
- 230000010339 dilation Effects 0.000 description 4
- 150000004662 dithiols Chemical class 0.000 description 4
- 208000028208 end stage renal disease Diseases 0.000 description 4
- 201000000523 end stage renal failure Diseases 0.000 description 4
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 4
- 238000010362 genome editing Methods 0.000 description 4
- 208000024963 hair loss Diseases 0.000 description 4
- 230000003676 hair loss Effects 0.000 description 4
- 230000036541 health Effects 0.000 description 4
- 208000019622 heart disease Diseases 0.000 description 4
- 210000001596 intra-abdominal fat Anatomy 0.000 description 4
- 230000013011 mating Effects 0.000 description 4
- 231100001043 ovarian atrophy Toxicity 0.000 description 4
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 4
- 238000010354 CRISPR gene editing Methods 0.000 description 3
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 3
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 3
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 3
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 3
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- FUSGACRLAFQQRL-UHFFFAOYSA-N N-Ethyl-N-nitrosourea Chemical compound CCN(N=O)C(N)=O FUSGACRLAFQQRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 3
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 3
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 3
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 3
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 3
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 3
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 3
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 3
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 3
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 3
- 235000013402 health food Nutrition 0.000 description 3
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 3
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 3
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 3
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 3
- 230000008085 renal dysfunction Effects 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 238000010187 selection method Methods 0.000 description 3
- 230000002992 thymic effect Effects 0.000 description 3
- 210000004291 uterus Anatomy 0.000 description 3
- 230000004580 weight loss Effects 0.000 description 3
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 2
- 241000700198 Cavia Species 0.000 description 2
- 206010051290 Central nervous system lesion Diseases 0.000 description 2
- 206010016654 Fibrosis Diseases 0.000 description 2
- 206010064571 Gene mutation Diseases 0.000 description 2
- 102000001554 Hemoglobins Human genes 0.000 description 2
- 108010054147 Hemoglobins Proteins 0.000 description 2
- 101001045846 Homo sapiens Histone-lysine N-methyltransferase 2A Proteins 0.000 description 2
- 101100537088 Homo sapiens TXN gene Proteins 0.000 description 2
- 101000852559 Homo sapiens Thioredoxin Proteins 0.000 description 2
- 101100540128 Homo sapiens VAC14 gene Proteins 0.000 description 2
- 208000035150 Hypercholesterolemia Diseases 0.000 description 2
- 206010021750 Infantile Spasms Diseases 0.000 description 2
- 208000035899 Infantile spasms syndrome Diseases 0.000 description 2
- 208000019693 Lung disease Diseases 0.000 description 2
- 101000835317 Mus musculus Thioredoxin Proteins 0.000 description 2
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 description 2
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 238000010459 TALEN Methods 0.000 description 2
- 101710168651 Thioredoxin 1 Proteins 0.000 description 2
- 108010043645 Transcription Activator-Like Effector Nucleases Proteins 0.000 description 2
- 201000006791 West syndrome Diseases 0.000 description 2
- 108010017070 Zinc Finger Nucleases Proteins 0.000 description 2
- PNNCWTXUWKENPE-UHFFFAOYSA-N [N].NC(N)=O Chemical compound [N].NC(N)=O PNNCWTXUWKENPE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000001015 abdomen Anatomy 0.000 description 2
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 2
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 2
- 229940041181 antineoplastic drug Drugs 0.000 description 2
- 230000003078 antioxidant effect Effects 0.000 description 2
- 238000003149 assay kit Methods 0.000 description 2
- 238000004820 blood count Methods 0.000 description 2
- 238000009530 blood pressure measurement Methods 0.000 description 2
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 2
- 230000002308 calcification Effects 0.000 description 2
- 230000005754 cellular signaling Effects 0.000 description 2
- 239000002962 chemical mutagen Substances 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 2
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 2
- 125000002228 disulfide group Chemical group 0.000 description 2
- 208000028329 epileptic seizure Diseases 0.000 description 2
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 2
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 2
- 230000004761 fibrosis Effects 0.000 description 2
- 230000002431 foraging effect Effects 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 231100000853 glomerular lesion Toxicity 0.000 description 2
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 2
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 2
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000001788 irregular Effects 0.000 description 2
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 2
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 2
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 2
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 2
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 2
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 2
- 230000002107 myocardial effect Effects 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 210000003101 oviduct Anatomy 0.000 description 2
- DHRLEVQXOMLTIM-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid;trioxomolybdenum Chemical group O=[Mo](=O)=O.O=[Mo](=O)=O.O=[Mo](=O)=O.O=[Mo](=O)=O.O=[Mo](=O)=O.O=[Mo](=O)=O.O=[Mo](=O)=O.O=[Mo](=O)=O.O=[Mo](=O)=O.O=[Mo](=O)=O.O=[Mo](=O)=O.O=[Mo](=O)=O.OP(O)(O)=O DHRLEVQXOMLTIM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 238000006479 redox reaction Methods 0.000 description 2
- 238000012552 review Methods 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 2
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 208000014644 Brain disease Diseases 0.000 description 1
- 238000011746 C57BL/6J (JAX™ mouse strain) Methods 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 201000001913 Childhood absence epilepsy Diseases 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 208000024658 Epilepsy syndrome Diseases 0.000 description 1
- 208000002877 Epileptic Syndromes Diseases 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 108020005004 Guide RNA Proteins 0.000 description 1
- 108010091358 Hypoxanthine Phosphoribosyltransferase Proteins 0.000 description 1
- XQFRJNBWHJMXHO-RRKCRQDMSA-N IDUR Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(I)=C1 XQFRJNBWHJMXHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- 206010023421 Kidney fibrosis Diseases 0.000 description 1
- 201000006792 Lennox-Gastaut syndrome Diseases 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 108010021466 Mutant Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000008300 Mutant Proteins Human genes 0.000 description 1
- 208000036572 Myoclonic epilepsy Diseases 0.000 description 1
- 208000037004 Myoclonic-astatic epilepsy Diseases 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 238000010222 PCR analysis Methods 0.000 description 1
- 206010061334 Partial seizures Diseases 0.000 description 1
- 206010038540 Renal tubular necrosis Diseases 0.000 description 1
- 206010063837 Reperfusion injury Diseases 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 208000034189 Sclerosis Diseases 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- 208000005392 Spasm Diseases 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 208000037063 Thinness Diseases 0.000 description 1
- 108020004440 Thymidine kinase Proteins 0.000 description 1
- 206010043994 Tonic convulsion Diseases 0.000 description 1
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 1
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 208000003554 absence epilepsy Diseases 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000001367 artery Anatomy 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 238000010876 biochemical test Methods 0.000 description 1
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 description 1
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 1
- 210000003123 bronchiole Anatomy 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000002612 cardiopulmonary effect Effects 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 1
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000011748 cell maturation Effects 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 1
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 238000007877 drug screening Methods 0.000 description 1
- 230000004064 dysfunction Effects 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001037 epileptic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000010195 expression analysis Methods 0.000 description 1
- 210000003754 fetus Anatomy 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 238000010230 functional analysis Methods 0.000 description 1
- 230000008717 functional decline Effects 0.000 description 1
- 238000012252 genetic analysis Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000035876 healing Effects 0.000 description 1
- 238000007490 hematoxylin and eosin (H&E) staining Methods 0.000 description 1
- 238000007489 histopathology method Methods 0.000 description 1
- 230000013632 homeostatic process Effects 0.000 description 1
- 201000005991 hyperphosphatemia Diseases 0.000 description 1
- 206010020871 hypertrophic cardiomyopathy Diseases 0.000 description 1
- 210000003016 hypothalamus Anatomy 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 210000003552 inferior colliculi Anatomy 0.000 description 1
- 210000004969 inflammatory cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000004068 intracellular signaling Effects 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 208000012947 ischemia reperfusion injury Diseases 0.000 description 1
- 230000009191 jumping Effects 0.000 description 1
- 230000003907 kidney function Effects 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 238000001638 lipofection Methods 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 241001515942 marmosets Species 0.000 description 1
- 210000003584 mesangial cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 208000016313 myoclonic-astastic epilepsy Diseases 0.000 description 1
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 230000000414 obstructive effect Effects 0.000 description 1
- 210000004681 ovum Anatomy 0.000 description 1
- 239000007800 oxidant agent Substances 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 238000010827 pathological analysis Methods 0.000 description 1
- KHIWWQKSHDUIBK-UHFFFAOYSA-N periodic acid Chemical compound OI(=O)(=O)=O KHIWWQKSHDUIBK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000737 periodic effect Effects 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 210000005211 primary lymphoid organ Anatomy 0.000 description 1
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 238000011552 rat model Methods 0.000 description 1
- 230000006697 redox regulation Effects 0.000 description 1
- 201000002793 renal fibrosis Diseases 0.000 description 1
- 210000005084 renal tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 230000037432 silent mutation Effects 0.000 description 1
- 210000002027 skeletal muscle Anatomy 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 230000009192 sprinting Effects 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 230000002123 temporal effect Effects 0.000 description 1
- 210000001103 thalamus Anatomy 0.000 description 1
- 229940126585 therapeutic drug Drugs 0.000 description 1
- 238000009210 therapy by ultrasound Methods 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
- A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
- A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0012—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7)
- C12N9/0036—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on NADH or NADPH (1.6)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2217/00—Genetically modified animals
- A01K2217/03—Animals modified by random mutagenesis, e.g. using ENU, chemicals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2217/00—Genetically modified animals
- A01K2217/07—Animals genetically altered by homologous recombination
- A01K2217/072—Animals genetically altered by homologous recombination maintaining or altering function, i.e. knock in
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2227/00—Animals characterised by species
- A01K2227/10—Mammal
- A01K2227/105—Murine
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2267/00—Animals characterised by purpose
- A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
- A01K2267/035—Animal model for multifactorial diseases
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
- C12N2015/8527—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic for producing animal models, e.g. for tests or diseases
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
- Animal Husbandry (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
本発明は、酸化ストレスが深く関わる疾患研究動物として、特に、老化、腎臓病、心血管疾患、高血圧、大動脈解離、慢性閉塞性肺疾患、年齢依存性てんかん、脂質代謝異常、貧血、骨粗鬆症、免疫異常などのモデル動物として有用な非ヒトモデル動物に関し、特にチオレドキシンをコードする遺伝子が改変された非ヒトモデル動物に関するものである。
背景技術
背景技術
生体には抗酸化酵素や抗酸化物質による抗酸化力が備わっており、生体の酸化還元状態を制御することによって多彩な酸化ストレスに適応しホメオスタシスを維持するシステム（レドックス制御：redox regulation）がある。しかし、生体の内因性あるいは外因性の原因により生じる酸化ストレスをこの制御機構が十分処理することができなくなるか、もしくは、制御機構が何らかの原因で破綻してしまうと、生体に様々な障害が現れてくる。過度の酸化ストレスはDNAや蛋白質、脂質等に障害を与え、細胞の機能障害や細胞死を引き起こすため、がんや老化等における重要な原因の１つと考えられている。
チオレドキシンはヒト、ラット、マウスともに105個のアミノ酸からなる分子量約12kDa蛋白質で、その活性部位に２個のシステイン残基を持つ。そのシステイン残基間でのジチオール／ジスルフィド交換反応により基質の酸化還元反応に寄与する。ジチオールを持つ還元型チオレドキシンは基質蛋白質のジスルフィド結合を還元し、自らは酸化型となる。
チオレドキシンは、酸化ストレスを引き起こす原因である紫外線、放射線、酸化剤、ウイルス感染、虚血再灌流障害、抗がん剤投与など、様々な要因によって誘導され、種々の遺伝子発現を調節する転写因子や細胞内のシグナル伝達分子の活性を制御している（J. Annual Review of Immunology. 15, 351-369 (1997)、Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure 30, 421-455 (2001)）。チオレドキシンは、酸化ストレス誘導性の疾患に対しては防御的に作用し、種々の化学物質や抗がん剤に抵抗性を示し、チオレドキシンの発現は長寿命傾向に関与している（J Gerontol A Biol Sci Med Sci.,66A: 1286-1299 (2011)、The Journal of Clinical Investigation 112(9), 1395-1406 (2003)、Nephrol Dial Transplant; 22: 1547-1557 (2007)）。従来技術としてチオレドキシン欠損マウスが作製されているが、この欠損遺伝子ホモ接合体マウスは胎児期に死亡してしまい、ヘテロ接合体は正常である（非特許文献１）。また、ドミナントネガティブ効果を持つチオレドキシン遺伝子を心臓に発現させ、肥大型心筋症モデルとなるトランスジェニック動物が存在する（非特許文献２）。
Developmental Biology 178, 179-185 (1996)
J Clin Invest. 112, 1395-1406 (2003)
解決しようとする問題点は、チオレドキシンの機能低下により引き起こされる様々な疾患の非ヒト動物モデルが存在しないことである。本発明は、老化、腎臓病、心血管疾患、高血圧、大動脈解離、慢性閉塞性肺疾患、年齢依存性てんかん、脂質代謝異常、貧血、骨粗鬆症、免疫異常などのモデルとして適用可能な、非ヒト動物モデルを提供することを課題とする。
本発明は、チオレドキシンの機能低下により発症する老化、腎臓病、心血管疾患、高血圧、大動脈解離、慢性閉塞性肺疾患、年齢依存性てんかん、脂質代謝異常、貧血、骨粗鬆症、免疫異常などの疾患モデルとして適用可能な、非ヒト動物モデルを提供する。本発明者らは、上記課題を解決するために、ゲノム上にランダムに点突然変異を誘発する化学変異原エチルニトロソウレアを雄ラットに投与し、雌ラットと交配して作製した仔ラット群より表現型異常を示すラットを選別し、遺伝子の異常を確認したところ、原因遺伝子はTxn1遺伝子の変異であることを初めて確認した。さらに研究を重ねた結果、Txn1遺伝子の変異を有する非ヒト動物であって、ホモ接合体であっても出生可能であり、老化、腎臓病、心血管疾患、高血圧、慢性閉塞性肺疾患、年齢依存性てんかん、脂質代謝異常、貧血、骨粗鬆症、免疫異常などの疾患モデルとして適用しうる非ヒト動物モデルの作製に成功し、本発明を完成した。
すなわち本発明は、以下よりなる。
１．チオレドキシンをコードする遺伝子が改変された非ヒトモデル動物。
２．チオレドキシンをコードする改変された遺伝子が、基質タンパク質のジスルフィド結合を還元するために消費される単位時間あたりのNADPH（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸）量を減少させ、その減少割合が10％から90％の範囲にあることを特徴とする、前項１に記載の非ヒトモデル動物。
３．老化、腎臓病、心血管疾患、高血圧、大動脈解離、慢性閉塞性肺疾患、年齢依存性てんかん、脂質代謝異常、貧血、骨粗鬆症および免疫異常からなる群から選択されるいずれかの疾患にモデルとして適応される、前項１または２に記載の非ヒトモデル動物。
４．前項１〜３のいずれか1に記載の疾患モデルを用いることを特徴とする薬剤のスクリーニング方法。
１．チオレドキシンをコードする遺伝子が改変された非ヒトモデル動物。
２．チオレドキシンをコードする改変された遺伝子が、基質タンパク質のジスルフィド結合を還元するために消費される単位時間あたりのNADPH（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸）量を減少させ、その減少割合が10％から90％の範囲にあることを特徴とする、前項１に記載の非ヒトモデル動物。
３．老化、腎臓病、心血管疾患、高血圧、大動脈解離、慢性閉塞性肺疾患、年齢依存性てんかん、脂質代謝異常、貧血、骨粗鬆症および免疫異常からなる群から選択されるいずれかの疾患にモデルとして適応される、前項１または２に記載の非ヒトモデル動物。
４．前項１〜３のいずれか1に記載の疾患モデルを用いることを特徴とする薬剤のスクリーニング方法。
本発明のチオレドキシンをコードする遺伝子が改変された非ヒトモデル動物は、老化、腎臓病、心血管疾患、高血圧、大動脈解離、慢性閉塞性肺疾患、年齢依存性てんかん、脂質代謝異常、貧血、骨粗鬆症、免疫異常などの疾患を示し、これらの疾患の病態解明や治療薬のスクリーニング法として用いるモデル動物として使用可能である。
本発明の非ヒトモデル動物は、チオレドキシンをコードする遺伝子が改変され、チオレドキシンの機能が低下することが原因で発症する疾患の非ヒトモデル動物である。本発明における非ヒトモデル動物としては、ヒトを除く哺乳動物が挙げられ、例えば、サル、マーモセット、ウシ、ブタ、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウスなどが挙げられる。特に、ラット、マウス、モルモットなどのげっ歯類の取扱いが容易であるため好ましく、中でもラットが好ましい。
本発明の非ヒトモデル動物は、チオレドキシンをコードする遺伝子が改変されてなる非ヒトモデル動物である。チオレドキシンはヒト、ラット、マウスともに105個のアミノ酸からなる分子量約12kDaの蛋白質で、その活性部位に２個のシステイン残基を有する。そのシステイン残基間でジチオール／ジスルフィド交換反応により基質の酸化還元反応に寄与する。ジチオールを有する還元型チオレドキシンは基質蛋白質のジスルフィド結合を還元し、自らは酸化型となる。チオレドキシンをコードする遺伝子は、TXN、TRX、TRX1、TRDX、Txn1、Txn、Trx1またはADFと呼ばれるいずれかの遺伝子である。例えば、ヒト由来の遺伝子はTXN、TRX、TRX1またはTRDXと呼ばれ、ラット由来遺伝子はTxn1またはTxnと呼ばれ、マウス由来遺伝子はTxn1、Txn、Trx1またはADFと呼ばれる。チオレドキシンをコードする遺伝子として、例えばラット由来遺伝子Txn1はGenBank Accession No. NM_053800 （配列番号１）に示される塩基配列で特定される遺伝子が挙げられ、Txn1蛋白質は配列番号２に示すアミノ酸配列で特定される。
（配列番号１）
ATGGTGAAGCTGATCGAGAGCAAGGAAGCTTTTCAGGAGGCCCTGGCCGCTGCGGGAGACAAGCTTGTGGTAGTGGACTTCTCTGCCACGTGGTGTGGACCTTGCAAAATGATCAAGCCCTTCTTTCATTCCCTCTGTGACAAGTATTCCAATGTGGTGTTCCTTGAAGTAGACGTGGATGACTGCCAGGATGTTGCTGCAGACTGTGAAGTCAAATGCATGCCGACCTTCCAGTTCTATAAAAAGGGTCAAAAGGTTGGGGAGTTCTCTGGTGCTAACAAGGAAAAGCTCGAAGCCACTATTACGGAGTTTGCCTAA
（配列番号２）
MVKLIESKEAFQEALAAAGDKLVVVDFSATWCGPCKMIKPFFHSLCDKYSNVVFLEVDVDDCQDVAADCEVKCMPTFQFYKKGQKVGEFSGANKEKLEATITEFA
ATGGTGAAGCTGATCGAGAGCAAGGAAGCTTTTCAGGAGGCCCTGGCCGCTGCGGGAGACAAGCTTGTGGTAGTGGACTTCTCTGCCACGTGGTGTGGACCTTGCAAAATGATCAAGCCCTTCTTTCATTCCCTCTGTGACAAGTATTCCAATGTGGTGTTCCTTGAAGTAGACGTGGATGACTGCCAGGATGTTGCTGCAGACTGTGAAGTCAAATGCATGCCGACCTTCCAGTTCTATAAAAAGGGTCAAAAGGTTGGGGAGTTCTCTGGTGCTAACAAGGAAAAGCTCGAAGCCACTATTACGGAGTTTGCCTAA
（配列番号２）
MVKLIESKEAFQEALAAAGDKLVVVDFSATWCGPCKMIKPFFHSLCDKYSNVVFLEVDVDDCQDVAADCEVKCMPTFQFYKKGQKVGEFSGANKEKLEATITEFA
本発明のチオレドキシンをコードする遺伝子が改変された非ヒト動物モデルは、ホモ接合体モデルまたはヘテロ接合体モデルの各々において、例えば、老化、腎臓病、心血管疾患、高血圧、大動脈解離、慢性閉塞性肺疾患、年齢依存性てんかん、脂質代謝異常、貧血、骨粗鬆症、免疫異常などの疾患を示す。以下、当該改変された遺伝子を、単に「改変型チオレドキシン遺伝子」ともいう。本発明における改変型チオレドキシン遺伝子は、チオレドキシンが作用する基質蛋白の還元機能を10％〜90％、好ましくは10％〜70％、より好ましくは26.9％〜53.9％に低下させればよい。C35Sのチオレドキシンが2.55％〜7.45％に消費量が低下していたことから、本発明における改変型チオレドキシン遺伝子の機能低下範囲は、C35Sの減少範囲を除外する値である。改変型チオレドキシン遺伝子は第54番目のアミノ酸がFからLに置換されたチオレドキシンを発現しうる塩基配列であってもよい。そのような塩基配列としては、第54番目のコドンTTCがCTCへ改変されているチオレドキシンをコードする塩基配列の他、遺伝子コドンの縮重のため、改変型チオレドキシンと同じアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするいずれかの塩基配列であってもよい。
本発明の遺伝子改変非ヒトモデル動物は、当該動物のゲノム上のチオレドキシンをコードする塩基配列（改変型チオレドキシン遺伝子）により改変型チオレドキシンを発現しうる動物であればよい。そのような動物は、改変型チオレドキシン遺伝子をゲノム上に配置させることで達成しうる。例えば、遺伝子工学技術を用いて人為的に個体の遺伝情報を変化させることで作製することができる。遺伝子改変非ヒトモデル動物は、例えば外部から特定の遺伝子を導入したトランスジェニック動物、特定の遺伝子を置換させたノックイン動物が挙げられる。また、モデルとなる動物の染色体に遺伝子の導入、欠失、置換さらにはエフェクターとの組み合わせによるゲノム編集（Genome Editing）により作製することができる。
トランスジェニック非ヒト動物は、一般的には、トランス遺伝子とよばれる外来性の遺伝子を宿主のゲノムに人為的に組み込み、これが世代をこえて受け継がれる非ヒト動物をいう。宿主が保有する蛋白質とは異なる変異型蛋白質を発現させる目的等により、作製されることが多い。トランスジェニック非ヒトの作製方法は、自体公知の方法、例えばマイクロインジェクション法を採用することができる。ドナー動物から採取した受精卵前核へ本発明の改変型チオレドキシン遺伝子を導入し、当該受精卵をレシピエント動物の卵管内に移植し、自然分娩させてトランスジェニック非ヒト動物を産生することができる。本発明のトランスジェニック非ヒト動物は、未受精卵、受精卵、精子およびその始原生殖細胞を含む前駆細胞などに対して、好ましくは、非ヒト動物の発生における胚発生の段階（さらに好ましくは、受精卵の卵割前の単細胞または卵割段階でかつ一般に8細胞期以前）において、リン酸カルシウム法、電気パルス法、リポフェクション法、凝集法、マイクロインジェクション法、パーティクルガン法、DEAE-デキストラン法などにより本発明の改変型チオレドキシン遺伝子を導入することにより作製することができる。また、該遺伝子導入方法により、体細胞、生体の臓器、組織細胞などに本発明の改変型チオレドキシン遺伝子を導入し、細胞培養、組織培養などを作製し、これらの細胞を上述の生殖細胞系前駆体細胞と自体公知の細胞配合法により融合させることによりトランスジェニック非ヒト動物を作製することもできる。
遺伝子が導入された受精卵は、次に仮親の卵管に移植されて胎児となり、出生後3-4週齢で体の一部（マウスやラットの場合には、例えば、尾部先端）からDNAを抽出し、サザン解析やPCR法により導入遺伝子の存在を確認することができる。導入遺伝子の存在が確認された個体を初代とすれば、導入遺伝子はその子（F1）に伝達される。さらに、このF1個体を野生型動物または他のF1動物と交配させることにより、2倍体染色体の片方（ヘテロ接合）または両方（ホモ接合）に導入遺伝子を有する個体（F2）を作製することができる。
他の態様によれば、第54番目のアミノ酸がFからLに置換されたチオレドキシンを発現する本発明の非ヒト動物は、上記本発明の改変型チオレドキシン遺伝子をES細胞（embryonic stem cell）に導入することによって作製することもできる。例えば、正常ラット胚盤胞に由来するHPRT陰性（ヒポキサンチングアニン・フォスフォリボシルトランスフェラーゼ遺伝子を欠いている）ES細胞に、上記本発明の改変型チオレドキシン遺伝子を導入することにより作製可能である。本発明の改変型チオレドキシン遺伝子がラット内在性遺伝子上にインテグレートされたES細胞をHATセレクション法により選別する。次いで、選別したES細胞を、別の正常非ヒト動物から取得した受精卵（胚盤胞）にマイクロインジェクションする。該胚盤胞を仮親としての別の正常非ヒト動物の子宮に移植する。そうして該仮親非ヒト動物から、キメラトランスジェニック非ヒト動物が生まれる。該キメラトランスジェニック非ヒト動物を正常非ヒト動物と交配させることによりヘテロトランスジェニック非ヒト動物を得ることができる。該ヘテロトランスジェニック非ヒト動物同士を交配することにより、ホモトランスジェニック非ヒト動物が得られる。これらのトランスジェニック非ヒト動物は、本発明のチオレドキシンをコードする遺伝子が改変したモデル動物ということができる。
他の態様によれば、第54番目のアミノ酸がFからLに置換されたチオレドキシンを発現するノックイン非ヒト動物は、上記本発明の改変型チオレドキシン遺伝子をES細胞に導入することによって作製することができる。例えば、ラット等の正常非ヒト動物のES細胞に、本発明の改変型チオレドキシン遺伝子を導入することにより作製可能である。本発明の改変型チオレドキシン遺伝子が非ヒト動物の内在性遺伝子上に置換されたES細胞を、G418を用いたポジティブセレクション法とヘルペスチミジンキナーゼ遺伝子を用いたネガティブセレクション法により選別する。次いで、選別したES細胞を、別の正常非ヒト動物から取得した受精卵（胚盤胞）にマイクロインジェクションする。該胚盤胞を仮親としての別の正常非ヒト動物の子宮に移植する。そうして該仮親非ヒト動物から、キメラノックイン非ヒト動物が生まれる。該キメラノックイン非ヒト動物を正常非ヒト動物と交配させることによりヘテロノックインラットを得ることができる。該ヘテロノックインラット同士を交配することにより、ホモノックイン非ヒト動物が得られる。これらのノックイン非ヒト動物は、本発明のチオレドキシンをコードする遺伝子が改変した非ヒトモデル動物ということができる。
さらに別の態様では、本発明の非ヒトモデル動物は、ゲノム編集の手法を用いて作製することもできる。ゲノム編集の方法は、自体公知の方法または今後開発されるあらゆる手法を適用することができる。例えば、CRISPR/CasシステムやTranscription Activator-Like Effector Nucleases（TALEN）、Zinc Finger Nuclease（ZFN）等の技術により、モデルとなる動物について遺伝子特異的な破壊や目的遺伝子のノックイン等を行い、本発明の非ヒトモデル動物を作製することができる。
以下、本発明の理解を深めるために、実施例および実験例により本発明の内容を具体的に説明する。
（実施例１）Txn1遺伝子改変ラットの作製
本実施例では、表現型異常を示すラットの解析を行い、当該解析結果に基づくTxn1遺伝子改変ラットの作製について説明する。
本実施例では、表現型異常を示すラットの解析を行い、当該解析結果に基づくTxn1遺伝子改変ラットの作製について説明する。
１）表現型異常を示すラットの確認
ゲノム上にランダムに点突然変異を誘発する化学変異原エチルニトロソウレア（N-ethyl-N-nitorosourea；ENU）（40mg/kg）を雄ラットF344/NSlcに2回（9, 10週齢時）腹腔内投与し、雌ラットF344/NSlcと交配することで、仔ラット群を作製した。仔ラット群の中から表現型異常を示すラットを選別し、表現異常に関わる遺伝子を検索した。遺伝子の解析として、野生型との交配により戻し交雑群を作製し、全染色体上のDNA多型マーカーを用いて病型との連鎖解析を行った。これにより表現型異常に関わる関連座位を絞り込み、次世代シークエンサーを用いたゲノムシークエンス解析により、原因遺伝子はTxn1遺伝子の変異であることを同定した。図１は、自動キャピラリーシークエンサー（ABI3100）を用いたシークエンス解析により、当該ラットのチオレドキシンTxn1遺伝子変異を解析した結果を示す。当該表現型異常を示すラットはTxn1遺伝子の第54番目のコドンTTCがCTCへ変化しており、その結果第54番目のアミノ酸がFからLに置換していることが確認された（F54L）。
ゲノム上にランダムに点突然変異を誘発する化学変異原エチルニトロソウレア（N-ethyl-N-nitorosourea；ENU）（40mg/kg）を雄ラットF344/NSlcに2回（9, 10週齢時）腹腔内投与し、雌ラットF344/NSlcと交配することで、仔ラット群を作製した。仔ラット群の中から表現型異常を示すラットを選別し、表現異常に関わる遺伝子を検索した。遺伝子の解析として、野生型との交配により戻し交雑群を作製し、全染色体上のDNA多型マーカーを用いて病型との連鎖解析を行った。これにより表現型異常に関わる関連座位を絞り込み、次世代シークエンサーを用いたゲノムシークエンス解析により、原因遺伝子はTxn1遺伝子の変異であることを同定した。図１は、自動キャピラリーシークエンサー（ABI3100）を用いたシークエンス解析により、当該ラットのチオレドキシンTxn1遺伝子変異を解析した結果を示す。当該表現型異常を示すラットはTxn1遺伝子の第54番目のコドンTTCがCTCへ変化しており、その結果第54番目のアミノ酸がFからLに置換していることが確認された（F54L）。
当該ラットのチオレドキシン変異箇所（第54番目のF）付近のアミノ酸について、他の動物種とアライメント解析を行った。第54番目のアミノ酸であるFは、動物種を超えて保存されていた（図２）。このことは、この第54番目のFはチオレドキシン蛋白質の機能において重要なアミノ酸であること、FからLへの変異は表現型異常に重要な役割を担っている可能性を示唆している。
２）Txn1遺伝子改変ラットの作製
上記１）において確認されたTxn1遺伝子の第54番目のコドンTTCがCTCへ変化したラットについて、10世代以上同系統の野生型（Wild Type：WT）と戻し交配を行い、遺伝的バックグラウンドをWTに一致させ、Txn1遺伝子改変ラット（ヘテロ接合体：Hetero）を作製した。当該ヘテロ接合体のTxn1遺伝子改変ラット同士を交配することにより、ホモ接合体のTxn1遺伝子改変ラットとヘテロ接合体のTxn1遺伝子改変ラットおよび野生型ラット（WT）を得た。以下の実験では、この同胞のWTをコントロールとして使用した。以降において、ホモ接合体の変異ラットを「Homo」といい、ヘテロ接合体の変異ラットを「Hetero」ということとする。また、野生型ラット（WT）は「WT」という。以下の実験例においても同様である。
上記１）において確認されたTxn1遺伝子の第54番目のコドンTTCがCTCへ変化したラットについて、10世代以上同系統の野生型（Wild Type：WT）と戻し交配を行い、遺伝的バックグラウンドをWTに一致させ、Txn1遺伝子改変ラット（ヘテロ接合体：Hetero）を作製した。当該ヘテロ接合体のTxn1遺伝子改変ラット同士を交配することにより、ホモ接合体のTxn1遺伝子改変ラットとヘテロ接合体のTxn1遺伝子改変ラットおよび野生型ラット（WT）を得た。以下の実験では、この同胞のWTをコントロールとして使用した。以降において、ホモ接合体の変異ラットを「Homo」といい、ヘテロ接合体の変異ラットを「Hetero」ということとする。また、野生型ラット（WT）は「WT」という。以下の実験例においても同様である。
（実験例１）Txn1遺伝子改変ラットにおけるTxn1蛋白質の発現解析
実施例１で作製したTxn1遺伝子改変ラットについて、Txn1蛋白質の発現を確認した。生後１ヶ月、４ヶ月のWT、Hetero、Homo、および、生後12ヶ月のWT、Heteroから腎臓、心臓、肝臓、脳の組織を摘出後、液体窒素で凍結し、超低温冷凍庫に保管した。各組織よりLysis Bufferにて蛋白質を抽出後、超音波処理を行った。冷却遠心機にて沈殿物を除去し、蛋白質濃度を測定後、抗Txn1抗体、および、インターナルコントロールである抗GAPDH抗体を用いたウエスタンブロットを行なった。WTに比し、Hetero、Homoラットの各組織におけるTxn1蛋白質は発現量に大きな差がないことが明らかになった。このことより、変異型Txn1蛋白質も分解されることなく安定に発現していると考えられた。
実施例１で作製したTxn1遺伝子改変ラットについて、Txn1蛋白質の発現を確認した。生後１ヶ月、４ヶ月のWT、Hetero、Homo、および、生後12ヶ月のWT、Heteroから腎臓、心臓、肝臓、脳の組織を摘出後、液体窒素で凍結し、超低温冷凍庫に保管した。各組織よりLysis Bufferにて蛋白質を抽出後、超音波処理を行った。冷却遠心機にて沈殿物を除去し、蛋白質濃度を測定後、抗Txn1抗体、および、インターナルコントロールである抗GAPDH抗体を用いたウエスタンブロットを行なった。WTに比し、Hetero、Homoラットの各組織におけるTxn1蛋白質は発現量に大きな差がないことが明らかになった。このことより、変異型Txn1蛋白質も分解されることなく安定に発現していると考えられた。
（実験例２）Txn1遺伝子組換え蛋白質を用いたTxn1活性測定
本実験例では、実施例１で作製したHomoラット、および、WTラットのTxn1遺伝子cDNAを用いてTxn1組換え蛋白質を作成し、Txn1活性の測定を行なった。WT、および、Homoラットの組織からRNAを抽出後、RT-PCRにて正常型(WT)、および、変異型(F54L)のcDNAを作成し、FLAG-tagを持つpCMV-Tag2Bベクターに挿入した。また、Txn1の活性中心である35番目のシステインをセリンに変異させた変異型C35Sを作成しpCMV-Tag2Bベクターに導入した。作成したプラスミドは全てシークエンス解析により配列を確認した。各ベクター（WT、F54L、C35S、 Empty vector)をヒト正常培養細胞HEK293に導入し遺伝子発現させた後、抗FLAG 抗体 ビーズ(Sigma；ANTI-FLAG M2 Agarose Affinity Gel、A2220）を用いて、FLAG融合型チオレドキシン蛋白を精製した。蛋白濃度を定量し、抗Txn1抗体(Cell Signaling Technology, #2298)、抗FLAG抗体(Sigma, F3165)を用いたウエスタンブロットにて各蛋白量を比較確認した後、 Thioredoxin Activity Assay Kit (Redoxica, TR-7011K)と微量分光光度計(DeNovix社、 DS-11+)を用いてTxn1の活性測定を行なった。
本実験例では、実施例１で作製したHomoラット、および、WTラットのTxn1遺伝子cDNAを用いてTxn1組換え蛋白質を作成し、Txn1活性の測定を行なった。WT、および、Homoラットの組織からRNAを抽出後、RT-PCRにて正常型(WT)、および、変異型(F54L)のcDNAを作成し、FLAG-tagを持つpCMV-Tag2Bベクターに挿入した。また、Txn1の活性中心である35番目のシステインをセリンに変異させた変異型C35Sを作成しpCMV-Tag2Bベクターに導入した。作成したプラスミドは全てシークエンス解析により配列を確認した。各ベクター（WT、F54L、C35S、 Empty vector)をヒト正常培養細胞HEK293に導入し遺伝子発現させた後、抗FLAG 抗体 ビーズ(Sigma；ANTI-FLAG M2 Agarose Affinity Gel、A2220）を用いて、FLAG融合型チオレドキシン蛋白を精製した。蛋白濃度を定量し、抗Txn1抗体(Cell Signaling Technology, #2298)、抗FLAG抗体(Sigma, F3165)を用いたウエスタンブロットにて各蛋白量を比較確認した後、 Thioredoxin Activity Assay Kit (Redoxica, TR-7011K)と微量分光光度計(DeNovix社、 DS-11+)を用いてTxn1の活性測定を行なった。
図4Aに抗Txn1抗体、抗FLAG抗体を用いたウエスタンブロットの結果を示している。図4Bは、Txn1が基質タンパク質のジスルフィド結合を還元するために消費されるNADPHの減少を示す図である。図4Cは、Txn1蛋白の単位時間あたりのNADPHの消費量を示した図である。変異型F54Lは正常型WTに比べて、26.9％〜53.9％に単位時間あたりのNADPHの消費量が低下(350pgで53.9%へ低下、2400pgで26.9%へ低下）していることが明らかになった。変異型C35Sは2.55％〜7.45％に低下していた。図4Dは、F54L変異型の抽出蛋白を正常型WTと混合してもF54Lに活性阻害がなく、F54L変異型がドミナントネガティブ効果を持たないことを示している。
（実験例３）Txn1遺伝子改変ラットにおけるTxn1活性測定
本実験例では、実施例１で作製したHomo、Hetero、および、野生型WTラットの組織より蛋白質を抽出し、Txn1の活性測定を行なった。 生後４ヶ月のHomo、Hetero、WTの組織を摘出後、液体窒素で凍結し、超低温冷凍庫に保管した。Lysis Bufferを用いて腎臓組織から蛋白を抽出し超音波処理を行った後、冷却遠心機にて沈殿物を除去し蛋白濃度を定量した。抗Txn1抗体(Cell Signaling Technology, #2298)を用いたウエスタンブロットにて蛋白量を確認した後、Thioredoxin Activity Assay Kit (Redoxica, TR-7011K)と微量分光光度計(DeNovix社、 DS-11+)を用いてTxn1の活性測定を行なった。
本実験例では、実施例１で作製したHomo、Hetero、および、野生型WTラットの組織より蛋白質を抽出し、Txn1の活性測定を行なった。 生後４ヶ月のHomo、Hetero、WTの組織を摘出後、液体窒素で凍結し、超低温冷凍庫に保管した。Lysis Bufferを用いて腎臓組織から蛋白を抽出し超音波処理を行った後、冷却遠心機にて沈殿物を除去し蛋白濃度を定量した。抗Txn1抗体(Cell Signaling Technology, #2298)を用いたウエスタンブロットにて蛋白量を確認した後、Thioredoxin Activity Assay Kit (Redoxica, TR-7011K)と微量分光光度計(DeNovix社、 DS-11+)を用いてTxn1の活性測定を行なった。
図5Aは抗Txn1抗体を用いたウエスタンブロットの結果を示している。WT、Hetero、Homoラットの組織抽出蛋白の濃度がほぼ同一であることがわかる。図5Bは、Txn1が基質タンパク質のジスルフィド結合を還元するために消費されるNADPHの減少を示す図である。図5Cは抽出蛋白50μg、および、100μgを用いて測定したTxn1の単位時間あたりのNADPHの消費量を示す図である。HeteroおよびHomoラットのTxn1の単位時間あたりのNADPHの消費量はWTラットより低いことを示している。WTに比しHomoで30.6％〜32.2％に活性低下 (50μg で32.2%へ低下、100μg で30.6%へ低下)が認められる。図5DはWT抽出蛋白50μg(WT)、Homo抽出蛋白50μg(Homo)、および、WT抽出蛋白50μgとHomo抽出蛋白50μgの混合溶液(WT+Homo)を用いて測定したTxn1活性の結果を示している。Homo抽出蛋白をWT抽出蛋白と混合しても活性阻害がなく、F54L変異型がドミナントネガティブ効果を持たないことが明らかになった。
（実験例４）Txn1遺伝子改変ラットの寿命
本実験例では、実施例１で作製したHomo、Hetero、および、野生型WTラットについて、寿命を確認した。WTの寿命が2〜3年であるのに比べ、Homoは生後約3-4ヶ月で死亡し、Heteroは9ヶ月頃から死亡する傾向が認められ、Txn1遺伝子改変ラットは寿命が短いこと、また性差があり雄のTxn1遺伝子改変ラットは雌よりも寿命が短いことが確認された（図６）。これにより、当該Txn1遺伝子改変ラットは老化および腎臓病、心血管疾患、高血圧、大動脈解離、慢性閉塞性肺疾患、年齢依存性てんかん、脂質代謝異常、貧血、骨粗鬆症、免疫異常の疾患の性差の研究に有用な動物モデルとして利用可能であると考えられた。
本実験例では、実施例１で作製したHomo、Hetero、および、野生型WTラットについて、寿命を確認した。WTの寿命が2〜3年であるのに比べ、Homoは生後約3-4ヶ月で死亡し、Heteroは9ヶ月頃から死亡する傾向が認められ、Txn1遺伝子改変ラットは寿命が短いこと、また性差があり雄のTxn1遺伝子改変ラットは雌よりも寿命が短いことが確認された（図６）。これにより、当該Txn1遺伝子改変ラットは老化および腎臓病、心血管疾患、高血圧、大動脈解離、慢性閉塞性肺疾患、年齢依存性てんかん、脂質代謝異常、貧血、骨粗鬆症、免疫異常の疾患の性差の研究に有用な動物モデルとして利用可能であると考えられた。
（実験例５）Txn1遺伝子改変ラットの体重と全身健康状態の変化
本実験例では、実施例１で作製したHomo、Hetero、および、野生型WTラットの体重を0-12ヶ月までの月齢を追って測定し、健康状態を観察した。図7Aは雄の体重変化を、図7Bは雌の体重変化を示したグラフである。ホモで３ヶ月以降、ヘテロで11ヶ月以降に体重減少が認められる。図7Cに生後４ヶ月時の外見と肉眼的臓器所見を示す。ホモでは顕著なやせ、脊椎変形、脱毛、内臓脂肪の著減、胸腺退縮が認められる。図7Dに生後11ヶ月時の外見と肉眼的臓器所見を示す。ヘテロでは顕著なやせ、脊椎変形、脱毛、内臓脂肪の著減、胸腺退縮が認められる。
本実験例では、実施例１で作製したHomo、Hetero、および、野生型WTラットの体重を0-12ヶ月までの月齢を追って測定し、健康状態を観察した。図7Aは雄の体重変化を、図7Bは雌の体重変化を示したグラフである。ホモで３ヶ月以降、ヘテロで11ヶ月以降に体重減少が認められる。図7Cに生後４ヶ月時の外見と肉眼的臓器所見を示す。ホモでは顕著なやせ、脊椎変形、脱毛、内臓脂肪の著減、胸腺退縮が認められる。図7Dに生後11ヶ月時の外見と肉眼的臓器所見を示す。ヘテロでは顕著なやせ、脊椎変形、脱毛、内臓脂肪の著減、胸腺退縮が認められる。
（実験例６）Txn1遺伝子改変ラットにおける進行性腎機能障害
本実験例では、実施例１で作製したHomo、Hetero、および、野生型WTラットにおける進行性腎機能障害、高コレステロール血症、貧血の病態について確認した。0-12ヶ月までの月齢を追って血液および尿を採取し、生化学検査を行った。図８のAは血清アルブミン、Bは血中尿素窒素（Blood Urea Nitrogen；Bun）、Cは総コレステロール（Total Cholesterol; T-Cho）、Dはヘモグロビン（Hb）、Eは尿中アルブミン量(Urinary Albumin)、Fは尿潜血、Gは血糖値（Glucose, Glu）、Hは白血球数の月齢推移を示している。Homoは生後３ヶ月で尿中アルブミンとBunが高値となり、末期腎不全にて3-4ヶ月で死亡し、Heteroは７ヶ月頃から尿中アルブミンとBunが上昇し、約１年で末期腎不全となり死亡した。
本実験例では、実施例１で作製したHomo、Hetero、および、野生型WTラットにおける進行性腎機能障害、高コレステロール血症、貧血の病態について確認した。0-12ヶ月までの月齢を追って血液および尿を採取し、生化学検査を行った。図８のAは血清アルブミン、Bは血中尿素窒素（Blood Urea Nitrogen；Bun）、Cは総コレステロール（Total Cholesterol; T-Cho）、Dはヘモグロビン（Hb）、Eは尿中アルブミン量(Urinary Albumin)、Fは尿潜血、Gは血糖値（Glucose, Glu）、Hは白血球数の月齢推移を示している。Homoは生後３ヶ月で尿中アルブミンとBunが高値となり、末期腎不全にて3-4ヶ月で死亡し、Heteroは７ヶ月頃から尿中アルブミンとBunが上昇し、約１年で末期腎不全となり死亡した。
生後１ヶ月、３ヶ月のWT、Hetero、Homoラット、および、生後10-12ヶ月のWT、Heteroラットの腎臓を摘出し、病理組織学的解析を行った。図９は腎臓の切片をMasson trichrome染色した写真である。腎臓の線維化の進行を示している。図１０は腎臓の切片をPeriodic Acid-Schiff (PAS)染色した写真である。Txn1遺伝子改変ラットにおける糸球体病変、尿細管病変を示している。すなわち、糸球体の硬化、管内および管外細胞増殖、メサンギウム細胞増多、尿細管萎縮、尿細管拡張、尿細管壊死、間質線維化が認められる。
末期腎不全による透析患者は世界的に増加しており、医療経済上の大きな問題である。わが国の透析患者数は2011年には約30万人（全国民450人に１人）で、その原因は種々であるが、末期腎不全の予備軍である慢性腎臓病（CKD）患者数はわが国の成人の12.9％で、1330万人（成人の8人に1人）が治療介入の必要なCKD患者と推定されている。全世界でCKDは患者数５億人と言われている。CKDの背景因子は糖尿病、高血圧などの生活習慣病が多く、社会の高齢化の影響もあり、今後10年間さらに患者が増えると見込まれている。当該Txn1遺伝子改変ラットは腎機能低下の進行が速いため、短期間で治療薬の効果判定ができる点、特に臨床上問題となる生命予後の延長の評価ができる点において、本Txn1遺伝子改変ラットは優れた慢性腎臓病モデルラットとして利用可能である。実験誘発性の腎臓病モデルは多数あるが本発明は遺伝性の慢性腎臓病モデルであり、他の腎臓病モデルとは異なり事前に動物に処置を施すことなく自然発症により症状が出る点、他の腎臓病モデルが特定の症状しか呈しないのに比し本慢性腎臓病モデルラットは多くの腎臓病関連合併症を呈する点に優位性がある。本発明ラット、本発明ラットから単離される細胞、およびチオレドキシンの単位時間あたりのNADPH消費を正常の10％〜90％に低下させた細胞は、病態の機序解明研究のみならず、病態を反映したバイオマーカーの探索、治療剤のスクリーニングや薬剤の効能解析に利用可能と考えられる。
（実験例７）Txn1遺伝子改変ラットにおける心疾患
本実験例では、実施例１で作製したHomo、Hetero、および、野生型WTラットにおける心疾患の病態について確認した。
本実験例では、実施例１で作製したHomo、Hetero、および、野生型WTラットにおける心疾患の病態について確認した。
図１１はWT、Hetero、Homoラットにおける循環器疾患を示している。左のグラフは血圧測定データと心拍数のデータである。Homoは生後３ヶ月で血圧が高値になり、Heteroラットでは７ヶ月頃から血圧が高値になる。中央には、生後11ヶ月のWT、Hetero、および、生後３ヶ月のHomoの大血管の切断面を示している。大血管の中膜の断裂、石灰化および、線維の不整が観察される。右には生後９ヶ月のWTとHeteroから摘出した心臓と、心室レベルでの断割面の組織切片を示した。HeteroやHomoで線維化、炎症細胞浸潤、心筋拡張が観察された。
（実験例８）Txn1遺伝子改変ラットにおける慢性閉塞性肺疾患
本実験例では、実施例１で作製したHomo、Hetero、および、野生型WTにおける慢性閉塞性肺疾患の病変について確認した。
本実験例では、実施例１で作製したHomo、Hetero、および、野生型WTにおける慢性閉塞性肺疾患の病変について確認した。
図１２には、Homo、Hetero、および、WTの肺の組織切片を示した。WTに比べて、Hetero、Homoでは、気腫性の変化が見られた。すなわち、Txn1遺伝子改変ラットでは、細気管支壁のリンパ球浸潤、肺胞腔の融合・拡張を認めた。
（実験例９）Txn1遺伝子改変ラットにおける胸腺萎縮
本実験例では、実施例１で作製したHomo、Hetero、および、野生型WTにおける胸腺萎縮について確認した。胸腺はT細胞の分化、成熟など免疫系に関与する一次リンパ器官であり、胸小葉とよばれる二葉からなる。成熟した胸腺において外側の部分である皮質には未熟なリンパ球が存在し、内側の髄質はリンパ球のほかにマクロファージや樹状細胞といった抗原提示の細胞などが認められる。
本実験例では、実施例１で作製したHomo、Hetero、および、野生型WTにおける胸腺萎縮について確認した。胸腺はT細胞の分化、成熟など免疫系に関与する一次リンパ器官であり、胸小葉とよばれる二葉からなる。成熟した胸腺において外側の部分である皮質には未熟なリンパ球が存在し、内側の髄質はリンパ球のほかにマクロファージや樹状細胞といった抗原提示の細胞などが認められる。
図１３には、Homo、Hetero、および、WTの胸腺の組織切片を示した。WTでは胸腺全体が染色されるのに比べて、生後３ヶ月のHomo、10-12ヶ月のHeteroでは脂肪化と萎縮が進み、胸腺組織を示すのはほんの一部だけであった。胸腺は加齢とともに脂肪化が始まり、萎縮が進むといわれており、WTに比べてHomo、Heteroで早期に萎縮が起きることが認められた。
（実験例１０）Txn1遺伝子改変ラットにおける卵巣萎縮
本実験例では、実施例１で作製したHomo、および、野生型WTにおける卵巣萎縮について確認した。WTに比べて、Homoラットでは卵巣萎縮、成熟卵胞の減少が観察された（図１４）。
本実験例では、実施例１で作製したHomo、および、野生型WTにおける卵巣萎縮について確認した。WTに比べて、Homoラットでは卵巣萎縮、成熟卵胞の減少が観察された（図１４）。
（実験例１１）Txn1遺伝子改変ラットにおける骨・ミネラル代謝の解析
本実験例では、実施例１で作製したHomo、Hetero、および、野生型WTラットについて0-12ヶ月までの月齢を追って採血し、カルシウム、無機リン、アルカリホスファターゼについて生化学検査を行った。また、Homo、Hetero、および、WTについて月齢4ヶ月でコンピュータ断層撮影（Computed Tomography：CT）を行った。
本実験例では、実施例１で作製したHomo、Hetero、および、野生型WTラットについて0-12ヶ月までの月齢を追って採血し、カルシウム、無機リン、アルカリホスファターゼについて生化学検査を行った。また、Homo、Hetero、および、WTについて月齢4ヶ月でコンピュータ断層撮影（Computed Tomography：CT）を行った。
図１５のAはカルシウム、Bは無機リン、Cはアルカリホスファターゼの月齢推移を示している。その結果、Homoでは３ヶ月頃、Heteroでは１１ヶ月頃からまた無機リンの上昇（高リン血症）が観察された。３ヶ月のHomoでアルカリホスファターゼの低下が観察された。図１５Dの左に全体像を、右側に腹部の断面像を示している。HomoはWTに比べ、やせ細って筋肉が弱り、体幹および下肢骨格筋の容量の減少が観察された。
（実験例１２）Txn1遺伝子改変ラットにおけるてんかん発作
本実験例では、実施例１で作製したHomo、Hetero、および、野生型WTラットにおけるてんかん発作について確認した。てんかん発作は生後4-5週齢に集中して出現し、６週齢以降、てんかん発作は徐々に減少して消失した。より詳しくは、年齢依存的に変容を示すてんかん発作について確認した。
本実験例では、実施例１で作製したHomo、Hetero、および、野生型WTラットにおけるてんかん発作について確認した。てんかん発作は生後4-5週齢に集中して出現し、６週齢以降、てんかん発作は徐々に減少して消失した。より詳しくは、年齢依存的に変容を示すてんかん発作について確認した。
Txn1遺伝子改変ラットは４週齢から疾走する部分発作と繰り返し飛び跳ねる発作および全身強直発作が出現した。（図１６A）は、4-5週齢のHeteroの発作時のビデオ脳波同時記録を示したものである。20秒毎に一瞬体がビクッとなって飛び上がる発作を繰り返し、脳波上はてんかん発作に一致した速波と低電圧化を認め、ヒトにおけるウエスト症候群のシリーズ形成性てんかん性スパズムに類似の発作を認めた。また、一瞬の飛び跳ね発作時には全般性多棘波が出現しており、ミオクロニー様発作（図１６B）が認められた。さらに、棘徐波複合を伴う欠神様発作が確認された（図１６C）。
（実験例１３）遺伝子改変ラットにおける脳病理解析
Txn1遺伝子改変ラットのてんかん発作が観察される前の生後３週齢から、４週齢、５週齢、７週齢の脳病変をHE染色で病理検査を行った。ヘテロで３週齢から５週齢において脳の下丘、視床、視床下部に空胞変性を認めた（図17B）。この所見は、Homoでも認められ、より病変部位が広かった。（図17C）に下丘の空胞変性の拡大写真をしめす。この変性は、生後７週齢では治癒した（図17Aと図17B）。
Txn1遺伝子改変ラットのてんかん発作が観察される前の生後３週齢から、４週齢、５週齢、７週齢の脳病変をHE染色で病理検査を行った。ヘテロで３週齢から５週齢において脳の下丘、視床、視床下部に空胞変性を認めた（図17B）。この所見は、Homoでも認められ、より病変部位が広かった。（図17C）に下丘の空胞変性の拡大写真をしめす。この変性は、生後７週齢では治癒した（図17Aと図17B）。
年齢依存性てんかんは、小児期に認められるてんかん症候群である。脳の発達に伴って病型が変化する特徴があり、特定の年齢で発症と病型の年齢依存性変化が認められる。この齢依存性変化には、自然に治癒することも含まれる。年齢依存性てんかんには、ウエスト症候群、レノックス・ガストー症候群、Doose症候群、小児欠神てんかん、中心・側頭部に棘波をもつ良性小児てんかん等が該当する。
近年、遺伝子解析により、様々な年齢依存性てんかんの原因遺伝子が同定されている。それに伴い世界各国のてんかん研究施設でモデル動物作製が試みられているが、遺伝子改変マウス・ラットでは年齢依存性てんかんの病態や病変を反映するモデル動物が存在しない。Txn1遺伝子改変ラットは優れた年齢依存性てんかんモデルラットとして利用可能と考えられる。本発明ラット、本発明ラットから単離される神経細胞、およびチオレドキシンの単位時間あたりのNADPH消費を正常の10％〜90％に低下させた細胞は、病態の機序解明研究のみならず、発症予防法、治療剤のスクリーニングや薬剤の効能解析に利用可能と考えられる。
（実験例１４）Txn1遺伝子改変マウスの作製
CRISPR/Cas9システムを用いてTxn1遺伝子改変マウスを作成した。まず、マウスTxn1遺伝子の第54番目のコドン近辺の配列を含むガイドRNAを作成し、Cas9蛋白、および、54番目コドンの変異型配列を持つ１本鎖DNA断片（サイレント変異２箇所を含む）と共にC57BL/6J マウスの受精卵に導入した。導入した受精卵136個を仮母親の子宮に移植した。出生した仔マウスF0は９匹であったが５匹が死亡した。残り４匹（F0-#1、F0-#2、F0-#3、F0-#4）の尻尾先端を切除し、得られたDNAを用いて、Txn1遺伝子第54番目のコドンを含む363塩基をPCRで増幅しシークエンス解析を行った。上記の遺伝子改変マウスF0をC57BL/6J野生型マウスと交配を行い、産仔マウスF1を得た。
CRISPR/Cas9システムを用いてTxn1遺伝子改変マウスを作成した。まず、マウスTxn1遺伝子の第54番目のコドン近辺の配列を含むガイドRNAを作成し、Cas9蛋白、および、54番目コドンの変異型配列を持つ１本鎖DNA断片（サイレント変異２箇所を含む）と共にC57BL/6J マウスの受精卵に導入した。導入した受精卵136個を仮母親の子宮に移植した。出生した仔マウスF0は９匹であったが５匹が死亡した。残り４匹（F0-#1、F0-#2、F0-#3、F0-#4）の尻尾先端を切除し、得られたDNAを用いて、Txn1遺伝子第54番目のコドンを含む363塩基をPCRで増幅しシークエンス解析を行った。上記の遺伝子改変マウスF0をC57BL/6J野生型マウスと交配を行い、産仔マウスF1を得た。
図１８上段は、F0-#3マウス（ホモ接合体の遺伝子改変マウス；雌）と、その産仔F1マウス４匹（ヘテロ接合体の遺伝子改変マウス；雄３匹、雌１匹）の写真図である。図１８下段は、Txn1遺伝子改変マウスF0-#3のTxn1遺伝子をシークエンス解析した図である。Txn1遺伝子の第54番目のコドンTTCがCTCへ変化しており、その結果第54番目のアミノ酸がフェニルアラニン（F）からロイシン（L）に置換していることが確認された。
以上詳述したように、本発明のチオレドキシンをコードする遺伝子が改変された非ヒトモデル動物は、酸化ストレスが深く関わる疾患研究動物として、特に、老化、腎臓病、心血管疾患、慢性閉塞性肺疾患、年齢依存性てんかん、脂質代謝異常、貧血、骨粗鬆症、免疫異常などのモデル動物として有用である。また、健康食品や栄養食品の有効性評価にも有用である。
本発明のチオレドキシンをコードする遺伝子が改変された非ヒトモデル動物は、前述の複数の疾患が出現するため、複数の臓器疾患の連関の病態解析に有用である。例えば、心腎連関、心肺連関、腎脳連関などである。また、医薬品、健康食品などが、併存する複数の疾患に及ぼす影響を評価するのに有用である。例えば、心臓疾患に対する医薬品等が、併存する腎臓疾患や肺疾患にどのように影響・効果を及ぼすか、腎臓疾患に対する医薬品等が、併存する心臓疾患や脳疾患にどのように影響・効果を及ぼすか等、人の多臓器疾患患者への医薬品開発、健康食品開発等に有用である。
本発明のチオレドキシンをコードする遺伝子が改変された非ヒトモデル動物は、各臓器や胎児繊維芽細胞等の初代培養細胞およびその株化細胞や幹細胞、本発明の非ヒトモデル動物由来のiPS細胞を提供することができる。それぞれの細胞は、老化、腎臓病、心血管疾患、慢性閉塞性肺疾患、年齢依存性てんかん、脂質代謝異常、貧血、骨粗鬆症などの研究や治療剤のスクリーニング等に、応用可能である。
Claims (2)
- チオレドキシンをコードする遺伝子が改変された非ヒトモデル動物であって、
前記改変された遺伝子が、基質タンパク質のジスルフィド結合を還元するために消費される単位時間あたりのNADPH（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸）量を減少させ、その減少割合が10％から90％の範囲にあることを特徴とする、非ヒトモデル動物。 - 老化、腎臓病、心血管疾患、高血圧、大動脈解離、慢性閉塞性肺疾患、年齢依存性てんかん、脂質代謝異常、貧血、骨粗鬆症および免疫異常からなる群から選択されるいずれかの疾患にモデルとして適応される、請求項１に記載の非ヒトモデル動物。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2017238612 | 2017-12-13 | ||
| JP2017238612 | 2017-12-13 | ||
| PCT/JP2018/045008 WO2019117022A1 (ja) | 2017-12-13 | 2018-12-06 | 遺伝子改変非ヒトモデル動物 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPWO2019117022A1 JPWO2019117022A1 (ja) | 2019-12-19 |
| JP6650649B2 true JP6650649B2 (ja) | 2020-02-19 |
Family
ID=66820277
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2019514326A Active JP6650649B2 (ja) | 2017-12-13 | 2018-12-06 | 遺伝子改変非ヒトモデル動物 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US11970706B2 (ja) |
| EP (1) | EP3725879B1 (ja) |
| JP (1) | JP6650649B2 (ja) |
| CN (1) | CN111712571B (ja) |
| WO (1) | WO2019117022A1 (ja) |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6689775B2 (en) | 1999-06-03 | 2004-02-10 | Arizona Board Of Regents, Acting On Behalf Of The University Of Arizona | Uses of thioredoxin |
| JP2006506968A (ja) * | 2002-07-03 | 2006-03-02 | メルク エンド カムパニー インコーポレーテッド | アグーチ関連蛋白質欠損細胞、非ヒトトランスジェニック動物及びエネルギー代謝を調節する化合物の選択方法 |
| WO2016003702A1 (en) * | 2014-07-02 | 2016-01-07 | Texas Tech University System | Thioredoxin and thioredoxin derivatives or peptides for the treatment of high blood pressure |
-
2018
- 2018-12-06 JP JP2019514326A patent/JP6650649B2/ja active Active
- 2018-12-06 WO PCT/JP2018/045008 patent/WO2019117022A1/ja unknown
- 2018-12-06 US US16/771,541 patent/US11970706B2/en active Active
- 2018-12-06 CN CN201880080055.4A patent/CN111712571B/zh active Active
- 2018-12-06 EP EP18887944.9A patent/EP3725879B1/en active Active
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2019117022A1 (ja) | 2019-06-20 |
| US11970706B2 (en) | 2024-04-30 |
| US20210171978A1 (en) | 2021-06-10 |
| EP3725879B1 (en) | 2024-07-03 |
| CN111712571B (zh) | 2024-02-09 |
| JPWO2019117022A1 (ja) | 2019-12-19 |
| EP3725879A4 (en) | 2021-09-15 |
| EP3725879A1 (en) | 2020-10-21 |
| CN111712571A (zh) | 2020-09-25 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Tardiff et al. | A truncated cardiac troponin T molecule in transgenic mice suggests multiple cellular mechanisms for familial hypertrophic cardiomyopathy. | |
| EP1005542B1 (en) | APOLIPOPROTEIN E TRANSGENIC mice AND ASSAY METHODS | |
| US7960606B2 (en) | Mouse model of chronic heart failure and coronary atherosclerosis regression | |
| JP6650649B2 (ja) | 遺伝子改変非ヒトモデル動物 | |
| US6437215B1 (en) | SR-BI and ApoE knockout animals and use thereof as models for atherosclerosis and heart attack | |
| US7202394B1 (en) | Animal with the mass expression of human gene and test method by using the animal | |
| US6353151B1 (en) | Transgenic model for heart failure | |
| Tomatsu et al. | Production of MPS VII mouse (Gus tm (hE540A· mE536A) Sly) doubly tolerant to human and mouse β-glucuronidase | |
| JP5939487B2 (ja) | Ｅｐｏ欠損ＧＦＰ貧血マウス | |
| US7906701B2 (en) | p300 transgenic animal | |
| JP5308651B2 (ja) | Ｄｒｐ１欠損非ヒト哺乳動物 | |
| US7705198B2 (en) | KSR2 knockout mice and methods of use thereof | |
| JP6587091B2 (ja) | 寿命短縮化モデル非ヒト哺乳動物 | |
| JP2007312641A (ja) | 非ヒト哺乳動物、その作製方法及びそれを用いた筋疾患用治療薬のスクリーニング方法 | |
| JP3817638B2 (ja) | トランスジェニック非ヒト哺乳動物 | |
| EP1699289B1 (en) | Non-human mammal comprising a modified serca2 gene and methods, cells, genes, and vectors thereof | |
| JP2022547938A (ja) | 老化に影響を及ぼす物質の同定方法 | |
| WO2021058708A1 (en) | Transgenic non-human models for lipodystrophy and/or peld | |
| Aigner et al. | Animal Models for the Study of Human Disease: Chapter 32. Genetically Tailored Pig Models for Translational Biomedical Research | |
| JP2005318892A (ja) | 非ヒト糖尿病モデル動物 | |
| WO2006022361A1 (ja) | Psf1遺伝子欠損動物およびその利用方法 | |
| US20110185440A1 (en) | CISD2-Knockout Mice and Uses Thereof | |
| JP2006141283A (ja) | ３−ホスホグリセレートデヒドロゲナーゼの発現が低下したノックアウト非ヒト哺乳動物 | |
| JP2009082090A (ja) | Ｅｒｋ２ノックダウン非ヒト動物 | |
| JP2008035839A (ja) | Ｔｉｍｐ−３／ＡｐｏＥ遺伝子ダブルノックアウト動物およびそれを用いた薬剤のスクリーニング方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20190402 |
|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20190402 |
|
| A871 | Explanation of circumstances concerning accelerated examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A871 Effective date: 20190402 |
|
| AA64 | Notification of invalidation of claim of internal priority (with term) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A241764 Effective date: 20190618 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20190705 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20190705 |
|
| A975 | Report on accelerated examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971005 Effective date: 20190821 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20190911 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20191002 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20200107 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20200115 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6650649 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |