JP2022547938A - 老化に影響を及ぼす物質の同定方法 - Google Patents

老化に影響を及ぼす物質の同定方法 Download PDF

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Abstract

老化に影響を与えることができる物質を同定する方法を提供し、その方法は、候補物質がZip11の活性及び／又は発現に及ぼす影響を決定すること、及びZip11の活性及び／又は発現を変化させる候補物質を老化に影響を与えることができる物質として同定することを含んでいる。さらに、Zip11の活性及び／又は発現量を増加させることができる物質の医薬品の調製への使用であって、該医薬品が老化の遅延又は改善のために使用されることを特徴とする、Zip11の活性及び／又は発現量を増加させることができる物質の使用を提供する。

Description

本願は、バイオ医薬の分野に関し、特に、老化に影響を与えることができる物質を同定する方法に関し、前記物質は、Zip11の活性及び／又は発現に影響を与えることができるものであることを特徴とする。
加齢は避けられない生物学的なプロセスであり、通常、罹患率や死亡率につながる生理機能の低下によって特徴付けられ、この進行中の生理機能の低下は、身体的および精神的能力の全体的な低下として表れる。機能的、組織的、細胞的な老化はすべての多細胞生物に共通する現象だが、老化が起こる速度は、環境要因と遺伝的要因が組み合わさって個体間でかなり差が生じうる。ヒトゲノムの全ゲノム解析により、ApoE、Sirtl、Foxo3、Nrf3など、長寿や健康に大きく関連する特定の遺伝子における遺伝子変異が特定されているものの、地域的制約、安全性や有効性に問題があり、これらの製品の使用は大きく制限されている。そのため、優れた可能性を持つ新たな長寿関連遺伝子を開発する必要がある。(参照：Zeng Y , etc. Sex Differences in Genetic Associations With Longevity, JAMA Netw Open. 2018 Aug ;l(4). Pii: el81670)。
本申請により、炎症、腫瘍、代謝など複数の領域で重要な役割を果たし、小腸、胃、生殖器、肝臓など複数の臓器で高発現しているSolute carrier family 3 9（SLC39）のメンバーをコードするZip11遺伝子を予想外に発見した。Zip11タンパク質の発現を制御することで、生物の老化度や寿命に影響を与える関連反応を調節することが可能であり、Zip11遺伝子は優れた長寿関連遺伝子として期待されている。
本願は、老化に影響を与えることができる物質を同定する方法であって、候補物質がZip11の活性及び／又は発現に及ぼす影響を判定すること、及びZip11の活性及び／又は発現に前記変化をもたらす候補物質を老化に影響を与えることができる物質として同定することを含む、前記方法を提供するものである。本発明はまた、Zip11の活性および／または発現を増加させることができる物質を薬剤の調製のために使用することを提供し、前記薬剤は老化を遅延または改善するために使用されるものである。
一方、本願は、老化に影響を与えることができる物質を同定する方法を提供し、前記方法は、候補物質がZip11の活性及び／又は発現に及ぼす影響を決定すること、及びZip11の活性及び／又は発現に前記変化を引き起こす候補物質を老化に影響を与えることができる物質として同定することを含むことを特徴としている。
いくつかの実施形態では、Zip11の活性及び／又は発現に対する候補物質の効果を決定することは、前記Zip11核酸の発現レベル及び／又は活性に対する前記候補物質の効果を決定することを含む。
いくつかの実施形態では、前記Zip11の核酸発現量及び／又は活性は、Zip11を特異的に増幅することができるプライマー、及び前記Zip11を特異的に認識することができる核酸プローブからなる群より選択される物質を用いて決定される。
いくつかの実施形態ではて、Zip11の活性及び／又は発現に対する候補物質の効果を決定することは、前記Zip11タンパク質の発現レベル及び／又は活性に対する前記候補物質の効果を決定することを含む。
いくつかの実施形態では、前記Zip11タンパク質の発現量及び／又は活性は、Zip11タンパク質を特異的に認識する試薬、及びZip11タンパク質の活性を測定できる物質からなる群より選択される物質を用いて決定される。
いくつかの実施形態では、前記Zip11の活性及び／又は発現の増加をもたらす候補物質が、老化を遅延又は改善することができる物質として同定される。
いくつかの実施形態では、前記Zip11の活性及び／又は発現の低下を引き起こす候補物質が、老化を促進又は悪化させる物質として同定される。
いくつかの実施形態では、前記方法は、前記候補物質を非ヒト動物、器官、組織及び／又は細胞に投与すること、前記非ヒト動物、器官、組織及び／又は細胞における前記Zip11の活性及び／又は発現に対する前記候補物質の影響を判定し、前記Zip11の活性及び／又は発現に変化をもたらす候補物質を老化に影響を与える物質として特定することを含む、方法。
いくつかの実施形態では、前記方法は、in vitroまたはex vivoの方法である。
いくつかの実施形態では、前記老化状態は、身体形態、毛髪状態、免疫レベル状態、腫瘍状態、肝臓状態、脾臓状態、生殖能力状態、運動能力状態、長寿状態、及び認知能力状態からなる群の1以上を評価することによって決定される。
いくつかの実施形態では、前記身体形態は、脊椎形態を検出することによって評価される。
いくつかの実施形態では、前記毛髪の状態は、脱毛を検出することによって評価される。
いくつかの実施形態では、免疫レベルの状態は、サイトカインレベルを検出することによって評価される。
いくつかの実施形態では、前記腫瘍の状態は、腫瘍体積、腫瘍の発生及び／又は腫瘍細胞の存在を検出することによって評価される。
いくつかの実施形態では、前記肝臓の状態は、グルタチオン活性、グルタチオン活性及び／又は肝臓／体重比を検出することによって評価される。
いくつかの実施形態では、前記脾臓の状態は、体重に対する脾臓を測定することによって評価される。
いくつかの実施形態では、前記受胎可能状態は、受胎可能な卵の割合を検査することによって評価される。
いくつかの実施形態では、前記運動性の状態は、疲労型バトン旋回試験の結果によって評価される。いくつかの実施形態では、長寿の状態は、生存時間を検出することによって評価される。
いくつかの実施形態では、認知状態は、オープンフィールドテストによって評価される。
一方、本願は、Zip11の活性及び／又は発現を増加させることができる物質の、薬剤の調製のための使用を提供し、前記薬剤は、老化を遅延又は改善するために使用されるものである。
いくつかの実施形態では、前記老化の遅延又は改善は、脊椎の湾曲の防止又は治療、脱毛の防止又は治療、サイトカインレベルの増加、免疫力の向上、腫瘍の防止又は治療、寿命の延長、肝臓障害の防止又は治療、脾臓障害の防止又は治療、生殖能力の低下の防止又は治療、運動能力の向上及び／又は行動認知能力の向上から構成される。
いくつかの実施形態では、前記増加とは、前記物質の投与後に、前記物質を投与しない場合と比較して、前記Zip11の活性及び／又は発現が少なくとも15倍増加することをいう。
いくつかの実施形態では、Zip 11の前記活性及び／又は発現は、Zip 11核酸のレベル及び／又はZip 11タンパク質のレベルでの活性及び／又は発現を含む。
一方、本願は、老化に影響を与えることができる物質を同定するシステムであって、候補物質がZip11の活性及び／又は発現に及ぼす影響を判定することができる物質を含む、前記システムを提供するものである。
いくつかの実施形態では、前記システムは、前記Zip11の核酸発現のレベル及び／又は活性を決定することができる物質を含む。
いくつかの実施形態では、前記Zip11の核酸発現のレベル及び／又は活性を決定できる前記物質は、Zip11を特異的に増幅できるプライマー及び／又はZip11を特異的に認識できるプローブから構成される。
いくつかの実施形態では、前記システムは、前記Zip11のタンパク質の発現レベル及び／又は活性を決定することができる物質を含む。
いくつかの実施形態では、前記Zip11のタンパク質発現レベル及び／又は活性を決定できる物質は、Zip11タンパク質を特異的に認識できる試薬及び／又はZip11タンパク質の活性を決定できる試薬から構成される。
一方、本願は、薬剤の調製のためのZip11をコードする核酸分子またはその発現産物の使用も提供し、前記薬剤は、老化を遅らせたり改善したりするために使用されるものである。
いくつかの実施形態では、前記老化の遅延又は改善は、脊椎の湾曲の防止又は治療、脱毛の防止又は治療、サイトカインレベルの増加、免疫力の向上、腫瘍の防止又は治療、寿命の延長、肝臓障害の防止又は治療、脾臓障害の防止又は治療、生殖能力の低下の防止又は治療、運動能力の向上及び／又は行動認知能力の向上から構成される。
いくつかの実施形態では、前記核酸分子は、SEQ ID No.1のいずれか1つに示されるヌクレオチド配列を含む。
一方、本願は、Zip11をコードする核酸分子またはその発現産物の有効量を、それを必要とする対象に投与することを含む、老化を遅延または改善する方法も提供するものである。
いくつかの実施形態では、前記老化の遅延又は改善は、脊椎湾曲の防止又は治療、脱毛の防止又は治療、サイトカインレベルの増加、免疫力の向上、腫瘍の防止又は治療、寿命の延長、肝臓障害の防止又は治療、脾臓障害の防止又は治療、生殖能力の低下の防止又は治療、運動能力の向上、運動能力が低下する時期の遅延、及び／又は行動認知能力の向上。
いくつかの実施形態では、前記核酸分子は、SEQ ID No.1に示されるヌクレオチド配列からなる。
一方、本願は、被験者の老化状態を特定する方法も提供し、前記方法は、被験者のZip11活性及び／又は発現を測定すること、を含む。
いくつかの実施形態では、前記Zip11活性及び／又は発現は、Zip11核酸発現レベル及び／又は活性、及び／又はZip11タンパク質発現レベル及び／又は活性を含む。
いくつかの実施形態では、被験体における前記Zip11核酸発現のレベル及び／又は活性は、Zip11を特異的に増幅できるプライマー、及び前記Zip11を特異的に認識できる核酸プローブからなる群より選択される物質を用いて決定される。
いくつかの実施形態では、被験体における前記Zip11のタンパク質発現レベル及び／又は活性は、Zip11タンパク質を特異的に認識する試薬及びZip11タンパク質活性を測定できる物質からなる群より選択される物質を用いて決定される。
いくつかの実施形態では、前記老化の状態は、以下のグループの1つ以上の状態：身体形態状態、毛髪状態、免疫レベル状態、腫瘍を有する状態、肝臓状態、脾臓状態、生殖能力状態、運動能力状態、長寿状態、及び認知能力状態を評価することによって決定される。
いくつかの実施形態では、前記身体形態は、脊椎形態を検出することによって評価される。
いくつかの実施形態では、前記毛髪の状態は、脱毛を検出することによって評価される。
いくつかの実施形態では、免疫レベルの状態は、サイトカインレベルを検出することによって評価される。
いくつかの実施形態では、前記腫瘍の状態は、腫瘍体積、腫瘍の発生及び／又は腫瘍細胞の存在を検出することによって評価される。
いくつかの実施形態では、前記肝臓の状態は、グルタチオン活性、グルタチオン活性及び／又は肝臓／体重比を検出することによって評価される。
いくつかの実施形態では、前記脾臓の状態は、体重に対する脾臓の比率を検出することによって評価される。
いくつかの実施形態では、前記受胎可能状態は、受胎可能な卵の割合を検査することによって評価される。
いくつかの実施形態では、前記運動性の状態は、疲労型バトン旋回試験の結果によって評価される。
いくつかの実施形態では、長寿の状態は、生存時間を検出することによって評価される。
いくつかの実施形態では、前記認知状態は、オープンフィールド実験によって評価される。
一方、本願は、Zip11活性及び／又は発現を測定するための物質を試薬の調製に用いることも提供し、前記試薬は、被験者の老化状態を識別するために使用される。
いくつかの実施形態では、前記Zip11活性及び／又は発現は、Zip11核酸発現レベル及び／又は活性、及び／又はZip11タンパク質発現レベル及び／又は活性を含む。
いくつかの実施形態では、前記物質は、Zip11を増幅することができるプライマー、Zip11と特異的に認識することができる核酸プローブ、Zip11タンパク質を特異的に認識することができる試薬、及び／又はZip11タンパク質の活性を測定できる物質から構成されている。
いくつかの実施形態では、前記老化の状態は、身体の形態的状態、毛髪の状態、免疫レベルの状態、腫瘍を有する状態、肝臓の状態、脾臓の状態、生殖能力の状態、運動能力の状態、寿命の状態、及び認知能力の状態の群のうちの1以上の状態を評価することにより決定される。
いくつかの実施形態では、前記身体形態は、脊椎形態を検出することによって評価される。いくつかの実施形態では、前記毛髪の状態は、脱毛を検出することによって評価される。
いくつかの実施形態では、免疫レベルの状態は、サイトカインレベルを検出することによって評価される。
いくつかの実施形態では、前記腫瘍の状態は、腫瘍体積、腫瘍の発達及び／又は腫瘍細胞の存在を検出することによって評価される。
いくつかの実施形態では、前記肝臓の状態は、グルタチオン活性、グルタチオン活性及び／又は肝臓／体重比を検出することによって評価される。
いくつかの実施形態では、前記脾臓の状態は、体重に対する脾臓を測定することによって評価される。
いくつかの実施形態では、前記受胎可能状態は、受胎可能な卵の割合を検査することによって評価される。
いくつかの実施形態では、運動性の状態は、疲労バトン試験の結果によって評価される。
いくつかの実施形態では、長寿の状態は、生存時間を検出することによって評価される。
いくつかの実施形態では、認知状態は、オープンフィールドテストによって評価される。
一方、本願は、Zip11の発現及び／又は活性を測定できる物質を含む、被験者の老化状態を特定するためのシステムを提供するものである。
いくつかの実施形態では、前記システムは、前記Zip11の核酸発現のレベル及び／又は活性を決定することができる物質を含む。
いくつかの実施形態では、前記Zip11核酸発現のレベル及び／又は活性を決定することができる前記物質は：Zip11を増幅することができるプライマー及び／又はZip11を特異的に識別することができる核酸プローブと、を含む。
いくつかの実施形態では、前記システムは、前記Zip11のタンパク質の発現レベル及び／又は活性を決定することができる物質を含む。
いくつかの実施形態では、前記Zip11タンパク質の発現レベル及び／又は活性を決定することができる前記物質は、Zip11タンパク質を特異的に認識することができる物質及び／又はZip11タンパク質の活性を決定することができる物質から構成される。
いくつかの実施形態では、前記老化の状態は、身体の形態的状態、毛髪の状態、免疫レベルの状態、腫瘍を有する状態、肝臓の状態、脾臓の状態、生殖能力の状態、運動能力の状態、寿命の状態、及び認知能力の状態の群のうちの1以上の状態を評価することにより決定される。
いくつかの実施形態では、前記身体形態は、脊椎形態を検出することによって評価される。
いくつかの実施形態では、前記毛髪の状態は、脱毛を検出することによって評価される。
いくつかの実施形態では、免疫レベルの状態は、サイトカインレベルを検出することによって評価される。
いくつかの実施形態では、前記腫瘍の状態は、腫瘍の体積を検出することによって評価される。
いくつかの実施形態では、前記肝臓の状態は、グルタチオン活性、グルタチオン活性及び／又は肝臓／体重比を検出することによって評価される。
いくつかの実施形態では、前記脾臓の状態は、体重に対する脾臓を測定することによって評価される。
いくつかの実施形態では、前記生殖能力の状態は、受精卵比率を検査することによって評価される。
いくつかの実施形態では、前記運動性の状態は、疲労型バトン旋回試験の結果によって評価される。
いくつかの実施形態では、長寿の状態は、生存時間を検出することによって評価される。
いくつかの実施形態では、前記認知状態は、欠席者フィールドテストを検出することによって評価される。
一方、本願は、被験者の加齢状態に対する候補物質の効果を評価する方法を提供し、前記方法は、以下を含む。
1)前記被験者に前記評価対象候補物質を投与するステップと；
2)前記投与の前後で、前記対象におけるZip11の発現及び／又は活性の変化を比較するステップ；及び
3)前記Zip11の発現及び／又は活性の変化に基づいて、前記候補物質が前記被験者の老化状態に及ぼす影響を評価するステップと。
いくつかの実施形態では、Zip11の前記活性及び／又は発現は、Zip11核酸のレベル及び／又はZip11タンパク質のレベルでの活性及び／又は発現を含む。
いくつかの実施形態では、前記候補物質は、前記投与後に前記対象において前記Zip11の発現がアップレギュレートされ及び／又は活性が増強される場合、前記対象の老化状態を遅延又は改善させる。
いくつかの実施形態では、前記老化の遅延又は改善は、脊椎湾曲の防止又は治療、脱毛の防止又は治療、サイトカインレベルの増加、免疫力の向上、腫瘍の防止又は治療、寿命の延長、肝臓障害の防止又は治療、脾臓障害の防止又は治療、生殖能力の低下の防止又は治療、運動能力の向上、運動能力が低下する時期の遅延、及び／又は行動認知能力の向上。
いくつかの実施形態では、前記候補物質は、前記投与後に前記対象においてZip11の発現が低下し、及び／又は活性が低下した場合、前記対象の老化状態を加速又は悪化させる。
いくつかの実施形態では、前記加速又は悪化した老化は、脊椎湾曲の悪化、脱毛の悪化、サイトカインレベルの低下、免疫力の低下、腫瘍の悪化又は再発、寿命の短縮、肝臓障害の悪化、脾臓障害の悪化、生殖能力の低下の悪化、運動能力の低下、及び／又は行動認知能力の低下から構成される。
別の態様では、本願は、Zip11を過剰発現する非ヒト動物又はその一部も提供する。
いくつかの実施形態では、前記非ヒト動物又はその一部は、対応する野生型と比較して、Zip11遺伝子の追加のコピー数を含む。
いくつかの実施形態では、前記Zip11遺伝子は、組織特異的プロモーターによって制御的に発現される。
いくつかの実施形態では、前記追加コピー数のZip11遺伝子は、肝臓で特異的に発現する。
いくつかの実施形態では、前記組織特異的プロモーターは、SEQ ID NO.1に示されるヌクレオチド列を含んでなる。
いくつかの実施形態では、前記非ヒト動物又はその一部は、老化状態を遅延又は改善させる表現型を示す。
いくつかの実施形態では、前記老化の遅延又は改善は、脊椎湾曲の防止又は治療、脱毛の防止又は治療、サイトカインレベルの増加、免疫力の向上、腫瘍の防止又は治療、寿命の延長、肝臓障害の防止又は治療、脾臓障害の防止又は治療、生殖能力の低下の防止又は治療、運動能力の向上、運動能力が低下する時期の遅延、及び／又は行動認知能力の向上。
別の態様において、本願は、Zip11遺伝子の発現及び／又は機能が破壊されている非ヒト動物又はその一部も提供する。
いくつかの実施形態では、Zip11遺伝子の少なくとも一部がノックアウトされる。
いくつかの実施形態では、前記Zip11遺伝子のエクソン5の少なくとも一部がノックアウトされる。
いくつかの実施形態では、前記非ヒト動物又はその一部は、加速又は悪化した老化状態の表現型を示す。
いくつかの実施形態では、前記加速または悪化した老化は、脊椎湾曲の増加、脱毛の増加、サイトカインレベルの低下、免疫力の低下、腫瘍の悪化または再発、寿命の短縮、肝臓損傷の増加、脾臓損傷の増加、生殖能力の低下、運動能力の低下、および／または行動認知力の低下から構成される。
本出願の他の態様や優位性は、以下の詳細な説明から当業者が容易に察することができる。下記の詳細な説明では、本出願の例示的な実施形態のみを示し、説明する。当業者が認識するように、本出願の内容は、当業者が本出願に関連する発明の精神と範囲から逸脱することなく、開示された特定の実施形態に変更を加えることを可能にする。したがって、本出願の図面および明細書に記載は、例示的なものにすぎず、限定的なものではない。
本出願に関連する具体的に特徴は、添付の請求項に示されている。下記の実施形態および図面を参考することで、本出願が対象とする本発明の特徴および優位性は、よりよく理解することができる。図面の簡単な説明は下記の通り。
ヒトのZip 11とゼブラフィッシュのZip 11の配列を比較した結果を示す図である。 本願発明に記載のZip11ノックアウト・ゼブラフィッシュを構築する工程を示す図である。 本願発明に記載のZip11-/-ゼブラフィッシュの形態的特徴を示す図である。 本願発明に記載のZip11-/-ゼブラフィッシュの生存曲線を示す図である 本願発明に記載のZip11-/-ゼブラフィッシュのF2世代の繁殖率を示す図である。 本願発明に記載のZip11-/-マウスモデルの構築過程を示す図であり、A：ノックアウトの模式図、B：ベクター構造、C：Zip 11 mRNAレベルである。 本願発明に記載のZip11-/-マウスの脱毛状態を示す図である。 本願発明に記載のZip11-/-マウスの脱毛および脾臓の状態を示す図である。 本願発明に記載のZip11-/-マウスの脾臓切片の状態を示す図である。 本願発明に記載のZip11-/-マウスの肝臓切片の状態を示す図である。 本願発明に記載のZip11-/-マウスの外観および遺伝子型のエレクトロフェログラムを示す図である。 本願発明に記載のZip11-/-マウスの腫瘍の増殖状態を示す図である。 本願発明に記載のZip11-/-マウスにおける炎症性因子の分泌量を示す図である。 本願発明に記載のZip11-/-マウスの運動性を示す図である。 本願発明に記載のZIP11 KIマウスモデルの構築過程を示す図である。 ナイフ・ビートルプロテインAによる炎症時の野生型マウスのZIP11 mRNAの発現量を示している。 野生型マウスとZIP11 KIマウスの肝臓（A）、肝臓／体重比（B）、ALT（C）およびAST（D）値の比較結果である。 ZIP11 KIマウスの肝細胞の形態を、異なる染色法で示したものである。 ビタミンがヒト由来の細胞においてZIP11遺伝子の発現量を増加させることを示している。 高脂肪食を与えたZip11-/-マウスの体重増加量を示している。 Zip11-/-雄マウスの学習・認知能力の低下を示したものである。 オープンフィールド実験におけるマウスの軌跡を示したグラフである。 Zip11-/-マウスにおけるp53タンパク質量の増加を示している。 LPS刺激後のZip11-/-マウスのM1マクロファージの減少（A）とM2マクロファージの増加（B）を示したものである。 ZIP11過剰発現マウスにおけるビリルビンの減少を示したものである。 Zip11-/-マウスのビリルビンの上昇を示したものである。
下記の具体的な実施形態は、本願が実施される態様を示すものであり、本願における他の優位性および効果は、本明細書に開示されているように、当業者によって容易に理解され得る。
Zip11核酸、Zip11タンパク質
本出願において、用語「Zip11」、「Zip11」、「ZIP11」、「SLC39A11」は互換的に用いられ、一般に、Solute carrier protein family 39（SLC39）のメンバーを意味する。また、Zip11タンパク質をコードする遺伝子を指す場合もある。本願に記載のZip11は、ヒトZip11、ゼブラフィッシュZip11／orマウスZip11またはその機能的断片、バリアントを含んでいてもよく、また、他の種におけるホモログを含んでいてもよい。
例えば、ヒトZIP11は、342アミノ酸の断片から構成されていてもよく、そのアミノ酸配列は、NCBIデータベースGene IDによってコードされるNCBIアクセッション番号NP_001153242.1において見出されることができる。201266; ゼブラフィッシュZip11タンパク質は123アミノ酸断片を含むことができ、そのアミノ酸配列はNCBI accession number XP_021335877.1に、ゼブラフィッシュZip11遺伝子配列はNCBI accession number NC_007123.7 に見出すことができる; マウスZip11は342アミノ酸断片を含むことができ、そのアミノ酸配列は NCBI accession number NP_001159975.1; マウスZip11遺伝子はMGIデータベースID:1917056に掲載されている。本願では、Zip11ノックアウトをZip11 KOまたはZip11 KOまたはZip11-/-と表記することができる。Zip11のノックインまたは過剰発現は、ZIP11 KIまたはZIP11 KIと表記することができる。
本願発明者らは、ゲノムワイド関連解析により、百寿者2178人（男性564人、女性1614人）と中年対照者2299人（男性773人、女性1526人）のゲノムを比較し、長寿と有意な関連（p<105）を有する複数の配列変異、男性および女性それぞれにおける一塩基多型（SNPs）を発見しました。 男性ではZIP11を含む複数のSNP遺伝子が老化状態と有意に関連していることが明らかになった（Zeng Y , etc. Sex Differences in Genetic Associations With Longevity, JAMA Netw Open. 2018 Aug;l(4).pii: el81670.）。
老化現象
本願において、「老化」とは、一般に、生体に生じる経時的な変化の積み重ねを指す。このような変化は、遺伝子や細胞の機能に影響を与えるものから、臓器、器官系、生物全体の機能に影響を与えるものまで、多岐にわたる。特に老化は、生物が生物学的に成熟した後に起こる変化であり、最終的に生物が死ぬまで進行する可能性がある。加齢状態は、身体形態、毛髪状態、免疫レベル状態、腫瘍状態、肝臓状態、脾臓状態、生殖能力状態、運動能力状態、寿命状態、認知能力状態などの一群の状態を評価して判断することができる。
本願発明者らは、Zip11の活性および／または発現が増加した個体において、老化が遅延または改善されることを見出した。遅延または改善」とは、一般に、状態、疾患、障害または表現型（異常または症状を含む）の進行を低減、最小化または排除することにより、予防または治療することを意味する。老化を遅延または改善するという用語には、脊椎の湾曲の防止または治療、脱毛の防止または治療、サイトカインレベルの増加、免疫力の向上、腫瘍の防止または治療、寿命の延長、肝臓障害の防止または治療、脾臓障害の防止または治療、生殖能力の低下の防止または治療、運動能力の増強および／または運動能力が低下する時点の遅延、および／または行動認知力の増強が含まれる。前記脊椎の湾曲の前記予防又は治療は、脊椎の湾曲の程度の減少又は脊椎の矯正を含んでいてもよい。前記脱毛の予防又は治療は、脱毛の程度の軽減又は脱毛のない状態からなるものであってもよい。前記サイトカインは、IL-6、IL-2、IL-l-β、IL-7、IL-10、IL-12、TNF-α、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、GM-CSF、G-CSFから構成されていてもよい。前記免疫の増強は、サイトカインレベルを増加させることを含んでいてもよい。前記免疫力を高めることは、M1型マクロファージの割合を増加させ、M2型マクロファージの割合を減少させることを含んでいてもよい。前記腫瘍を予防又は治療することは、腫瘍のサイズを小さくすること、又は腫瘍を発生させないことを含んでもよい。前記寿命の延長は、老化関連遺伝子の活性／発現レベルを低下させることを含んでいてもよい。前記寿命の延長は、生存時間を延長すること、又は集団生存を増加させることを含んでいてもよい。前記肝障害の予防又は治療は、肝炎に対する感受性を改善することを含んでいてもよく、例えば、肝炎に対する感受性は、グルタチオン及びグルタチオンレベル、並びに肝細胞形態に基づいて評価することができる。前記受胎能力低下の予防又は治療は、受胎可能な受精卵の割合を増加させることを含んでいてもよい。前記運動能力の向上には、運動を維持する時間を延長すること、運動能力が低下する時点を遅延させること等が含まれ得る。前記認知能力の向上には、未知の空間を探索する欲求の増大（オープンフィールド実験など）が含まれる場合がある。
また、本願発明者らは、Zip11の活性および／または発現が低下した個体では、老化が促進または悪化することを見出した。加速または悪化」とは、一般に、状態、疾患、障害または表現型（異常または症状を含む）の増加、増強または維持を意味する。老化の促進・悪化には、脊椎湾曲の促進・悪化、脱毛の促進・悪化、サイトカインの減少、免疫力の低下、腫瘍の促進・悪化、寿命の短縮、肝臓障害の促進・悪化、脾臓障害の促進・悪化、生殖機能の低下、運動能力の低下および/または認知能力の低下などが含まれる。前記加速された又は悪化された脊椎湾曲は、脊椎湾曲の程度の増加を含んでいてもよい。前記脱毛の促進や悪化には、頭髪や体毛の異常な脱毛や完全な脱毛が含まれることがある。前記サイトカインとしては、IL-6、IL-2、IL-l-β、IL-7、IL-10、IL-12、TNF-α、IFN-α、IFN-β、IFN-Γ、GM-CSF、G-CSFなどを挙げることができる。前記免疫の弱化は、サイトカインレベルを低下させることを含んでいてもよい。前記免疫力の低下は、Ml型マクロファージの割合を減少させ、M2型マクロファージの割合を増加させることを含んでいてもよい。腫瘍の前記加速又は悪化は、腫瘍の大きさを増大させることを含んでいてもよい。前記寿命の短縮は、生存時間の短縮または静かな人口生存率の短縮を含んでいてもよい。肝障害の加速や悪化は、肝臓の肥大を構成する可能性があります。前記加速または悪化した脾臓の損傷は、脾臓の肥大を含んでいてもよい。前記受胎能力の低下の加速又は悪化は、受精可能な卵の割合の減少を含んでいてもよい。前記運動能力の低下には、運動能力を維持する時間の短縮や、運動能力が低下する時期の早期化が含まれる場合がある。当該認知能力の低下は、未知の空間を探索する欲求の低下（例えば、オープンフィールド実験）を含む場合がある。
前記Zip11の活性及び／又は発現の変化は、免疫組織化学的方法、PCR、RT-PCR、in situ hybridisation、サザンブロット、ウェスタンブロット、ノーザンブロット、分光光度法、遺伝子チップ、フローサイトメーター（FACS）、タンパク質マイクロアレイ、DNA配列決定及びELISAなどの当業者に周知の方法を用いて測定することが可能である。いくつかの実施形態では、前記方法は、Zip 11を特異的に増幅することができるプライマーと、前記Zip 11を特異的に認識することができる核酸プローブとを含んでいてもよい。前記プローブは、Zip11遺伝子上の特定の部位に特異的に結合し、Zip11遺伝子以外の遺伝子には結合しない場合があり、それによってZip11遺伝子を「特異的に同定」し、前記プローブは検出可能なシグナルを担う。当該プライマーは、Zip11遺伝子を増幅し、他の遺伝子を増幅しない、すなわち「特異的増幅」である。いくつかの実施形態では、前記候補はオリゴヌクレオチド断片からなる。このようなフラグメントは、サンプルのRNAまたはDNAとハイブリダイゼーションできるような十分な長さが必要である。10-40ヌクレオチドまたはそれ以上、例えば45、50、100、500、あるいは全長までであってもよい。場合によっては、前記方法は、Zip11タンパク質を特異的に認識する試薬と、Zip11タンパク質の活性を測定することができる物質と、を含んでいてもよい。前記物質は、Zip11又はそのタンパク質断片と特異的に結合する抗体やリガンドなどのタンパク質結合分子であってもよい。
用途、方法、システム
本願は、老化に影響を与えることができる物質を同定する方法を提供し、前記方法は、候補物質が活性及び／又は発現に及ぼす影響を判定すること、及び前記活性及び／又は発現を変化させる候補物質を老化に影響を与えることができる物質として同定することを含むことができる。いくつかの実施形態では、前記方法は、薬物スクリーニングのために使用され得る。例えば、Zip11の活性及び／又は発現を増加させる物質を老化に影響を与えることができる物質として特定し、当該物質を用いて薬剤を調製し、当該薬剤を用いて老化を遅延又は改善させることができる。例えば、Zip11の活性及び／又は発現を低下させる物質が、老化に影響を与える物質としてZip11の活性及び／又は発現を増加させることができる物質として同定された場合、当該物質は毒性を有する副作用を有する可能性がある。
本願は、老化に影響を与えることができる物質を同定するためのシステムを提供し、前記システムは、候補物質がZip11の活性及び／又は発現に及ぼす影響を判定することができる物質を含んでいてもよい。また、前記システムは、キットを含んで構成されてもよい。当該キットは、本願に記載された老化に影響を与えることができる物質を適切な包装で含み、使用説明書、臨床試験の考察、副作用のリストなどの書面を含むことができる。そのようなキットには、科学文献、添付文書、臨床試験結果、及び／又はその要約などの、前記組成物の活性及び／又は利点を示す又は確認する情報、及び／又は投与法、投与、副作用、薬物相互作用又は医療従事者に有用な他の情報を記載した参照文献などの情報も含まれ得る。前記キットは、さらに別の薬剤を含んでいてもよい。場合によっては、前記老化に影響を与えることができる物質と前記薬剤は、別の組成物としてキット内の別の容器に提供される。場合によっては、前記老化に影響を与えることができる物質と前記薬剤とが、キットの容器内に単一の組成物として提供されることもある。適切な包装および追加アイテム（例えば、液体製剤用の計量カップ、空気への曝露を最小限に抑えるためのホイル包装など）は当技術分野で知られており、前記キットに含めることができる。場合によっては、システムは、医療提供者、医師、看護師、薬剤師、処方者、医薬品開発者、医薬品製造者等を含む関係者に提供、販売及び／又はマーケティングされるかもしれない。他の場合には、システムは消費者に直接販売されるかもしれない。また、前記システムは、消費者に直接販売される場合もある。
本願は、Zip11をコードする核酸分子またはその発現産物を薬剤の調製のために使用することを提供し、前記薬剤は、老化を遅延または改善するために使用されるものである。いくつかの実施形態では、Zip11をコードする前記核酸分子又はその発現産物は、遺伝子治療のための薬剤の調製に使用され得る。前記薬剤は、前記核酸分子を発現させることができるベクターを含んでいてもよい。前記ベクターは、それが結合している別の核酸を増殖させることができる核酸分子であってもよい。自己複製する核酸構造体として機能するベクターや、ベクターが導入された宿主細胞のゲノムに取り込まれるベクターも含まれる。ある種のベクターは、それに作動可能に連結された核酸の発現を誘導することができる。前記薬剤としては、例えば、Zip11のプロモーターやエンハンサー領域に作用して発現促進作用を有する物質や、Zip11遺伝子のmRNAへの転写促進作用を有する物質、あるいは、例えば、細胞内の転写因子の助けを借りて同様の効果を発揮する物質などを挙げることができる。また、前記薬剤は、これらの薬剤の使用方法を説明する包装材と一緒に置くことができる容器で構成されていてもよい。一般に、これらの指示書は、薬剤の濃度を説明する確定的な記述を含み、いくつかの実施形態では、医薬組成物を再構成するために必要な賦形剤成分または希釈剤（例えば、水、生理食塩水、またはPBS）の相対量を含む場合がある。
本願はまた、Zip11をコードする核酸分子またはその発現産物の有効量を、それを必要とする対象に投与することを含む、老化を遅延または改善するための方法を提供する。本出願の目的上、「被験者」という用語は、一般に、任意の人または非ヒト動物を指す。非ヒト動物とは、哺乳類、非哺乳類などすべての脊椎動物を指し、例えば、非ヒト霊長類、羊、犬、猫、牛、馬、鶏、魚、ネズミ、ウサギ、両生類、爬虫類などが含まれる。
本出願の目的では、「有効量」という用語は、一般に、無毒であるが所望の生物学的結果をもたらすのに十分な薬剤の量を意味する。その量は、状態（老化の症状又は関連する状態）又は症状の重症度及び／又は期間を低減及び／又は改善するために、前記状態の悪化を防ぐために、前記状態の低下を引き起こすために、前記状態に関連する1又は複数の症状の再発、発症又は発症を防ぐために、又は別の治療（例えば予防又は治療剤）の予防又は治療効果を増強又は改善するために十分な量である。例えば、有効量は、老化を遅らせたり改善したりする量であってもよい。
本願の文脈において、用語「投与」は、一般に、物質または医薬組成物の投与量を対象（例えば、加齢の症状を有する患者）に投与する方法を指す。投与は、注射（皮下、静脈内、非経口、腹腔内、髄腔内など）、経口、吸入、直腸および皮内を含むがこれらに限定されない任意の適切な手段で行うことができる。
例えば、Zip11の活性及び／又は発現を増加させる本願記載の物質、Zip11をコードする核酸分子又はその発現産物、及び前記ベクターは、別々に又は一緒に経口投与に適した形態で調製することが可能である。例えば、結合試薬、充填剤、滑り剤、崩壊剤または湿潤剤などの薬学的に許容される賦形剤を添加し、従来の手段で調製した錠剤またはカプセルを挙げることができる。錠剤のカプセル化の方法は、当業者に公知である。経口投与のために、液体の調製は、例えば、溶液、シロップまたは懸濁液の形態をとることができ、またはそれらは、使用前に水または他の適切な賦形剤担体と組成した乾燥製品の形態で提供することができる。様々な送達システムが知られており、リポソーム、粒子、マイクロカプセルへのカプセル化、化合物を発現することができる組換え細胞、受容体媒介性細胞分裂、レトロウイルスまたは他のベクターの一部としての核酸の構築など、本発明の化合物を投与するために用いることが可能である。
いくつかの実施形態では、Zip11をコードする核酸又はその発現産物を含む核酸分子は、Zip11の異常発現及び／又は活性に関連する疾患又は障害を治療、抑制又は予防するために遺伝子治療の方法で投与され得る。遺伝子治療とは、発現または発現可能な核酸を被験者に投与することにより行う治療のことである。本出願に記載された核酸分子は、それによってコード化された治療効果を媒介するタンパク質を産生する。例えば、前記コード化核酸分子又はその発現産物のZip11活性及び／又は発現は、それを必要とする対象への投与後に増加することができる。
本願は、Zip11の活性及び／又は発現を測定できる物質又は当該物質から調製した試薬を用いて、被験者のZip11の活性及び／又は発現を測定し、当該Zip11の活性及び／又は発現と標準活性及び／又は発現と比較し、それにより前記Zip11遺伝子の活性又は発現の増加又は減少を求める、ことを含む被験者の加齢状態の識別方法を提供するものである。いくつかの実施形態では、前記方法は、診断／医学的検査に使用されてもよく、例えば、開業医が、対象におけるZip11活性及び／又は発現に基づいて、対象の老化状態を決定することができる。場合によっては、研究において、例えば、被験者の加齢状態に対する候補物質の効果を評価するために、記載された方法を使用することができる。場合によっては、記載された方法は、老化状態への影響についてスクリーニングされるべき物質の同定など、医薬プロセスにおいても使用することができる。場合によっては、本方法は、診断／医療プロセス、例えば、被験者の加齢状態を識別するために使用することもできる。
本願は、被験者の加齢状態を識別するために使用される、試薬の調製のためのZip11活性及び／又は発現の決定のための物質の使用を提供するものである。場合によっては、Zip11の発現／活性を検出することができる試薬を調製し、診断および／または医療検査に利用することができる。
本願は、Zip11の発現及び／又は活性を測定することができる物質を含む、被験者の加齢状態を識別するためのシステムを提供するものである。いくつかの実施形態では、前記システムは、医療提供者、医師、看護師、薬剤師、処方者、医薬品開発者、医薬品製造者等を含む利害関係者に提供、販売及び／又はマーケティングされ得る。また、当該システムを直接消費者に販売することも可能である。
また、本願は、候補物質が被験者の加齢状態に及ぼす影響を評価する方法を提供するものである。場合によっては、前記方法は薬物スクリーニングに使用することができる。例えば、前記評価対象候補物質を前記被験者に投与し、前記投与前後の前記被験者のZip11の発現及び／又は活性を比較し、Zip11の発現及び／又は活性が増加している場合には、前記評価対象候補物質は、老化を遅延又は改善できる物質として抗加齢薬の調製に使用することが可能である。その他、候補物質の安全性を評価するために、記載された方法を用いることができる。例えば、前記被験者に前記評価対象候補物質を投与し、前記投与の前後における前記被験者のZip11の発現及び／又は活性の変化を比較することにより、前記物質が加齢毒性を促進又は悪化させる物質であるほどZip11の発現及び／又は活性が低下している場合に、前記評価対象候補物質が加齢毒性促進物質であると判定することができる。
人間以外の動物またはその一部
本願は、Zip11を過剰発現する非ヒト動物またはその一部を提供する。 本願において、「過剰発現」という用語は、一般に、同じ組織型の正常細胞と比較して、対応する細胞上で検出可能に高いレベルで転写または翻訳される遺伝子を意味する。
したがって、過剰発現とは、タンパク質やRNAの過剰発現（転写、転写後処理、翻訳、翻訳後処理、安定性の変化、タンパク質分解の変化による）、局所的過剰発現（核局在の増加）、タンパク質輸送パターンの変化による機能活性の向上などを指すことがある。例えば、過剰発現とは、正常細胞または対照細胞と比較して、100％、150％、200％、250％、300％、400％、500％またはそれ以上の発現量の増加を指す場合がある。前記過剰発現は、当技術分野で公知の方法によって達成することができる。例えば、外来遺伝子を導入する手段で実現することができる。例えば、プロモーターを含むベクターを用いて非ヒト動物のゲノムに導入することで、Zip11遺伝子を過剰発現させることができる。前記プロモーターは、強力なCAGプロモーターであってもよい。前記ベクターは、相同組換えにより宿主の標的遺伝子領域に標的遺伝子を挿入する機能を有し、プラスミドベクター、ウイルスベクター、粘膜ベクター、細菌人工染色体（BAC）、酵母人工染色体（YAC）などの遺伝子工学で利用できる任意のベクター、およびプラスミド以外のベクターであることができる。いくつかの実施形態では、マウスのH11遺伝子座を標的とするsgRNAは、Cas9／RNAシステム遺伝子ターゲティング技術を使用して構築することができる。本願において、「H11」という用語は、一般に、より高い発現を駆動するためにそこに外来性の強力なプロモーターを挿入することを可能にするモチーフの普及を意味する。他の場合、CAG-Loxp-Stop-Loxp-hZ/P7J-P2A-tdTomato断片を有するベクターを同時に作成し、Cas9と共打ちし、Cas9によってDNA鎖が切断された後、相同組み換えによってCAG-Loxp-Stop-Loxp-hZIP11-P2A-tdTomato断片が標的サイトに組み換えられることが可能である。ノックインベクターが導入される宿主細胞は、前記非ヒト動物の細胞又は前記非ヒト動物の細胞へ分化可能な細胞（細胞クラスターを含む）である。このような宿主細胞としては、例えば、ES細胞、iPS細胞などの多能性幹細胞、生殖細胞への分化能を有する精子幹細胞などの生殖系幹細胞、受精卵など、目的に応じて種々の細胞を使用することができる。前記ノックインベクターの前記宿主細胞への導入は、エレクトロポレーション法等の公知の方法によって行うことができる。前記多能性幹細胞をマイクロインジェクション等の公知の方法で初期胚に注入し、代理母に移植して発生させることにより、キメラ動物を得ることができる。あるいは、キメラ動物を交配することにより、その子孫からノックインアレイが精製された個体を得ることができる。
本願に記載のZIP11遺伝子を過剰発現する非ヒト動物または部品（例えば、ZIP 11 KIマウス）は、ZIP11活性および／または発現が増加し、免疫刺激に対する感受性が増加し（例えば、ナイフビーンタンパク質誘発肝損傷において、ZIP 11 KIマウスは野生型に比べて少なくとも4倍、例えば4倍、5倍、6倍またはそれ以上のグルタミナーゼとグルタチオン量の増加を示す）および／または、老化関連疾患に大きな耐性を示す。記載されているようにZIP 11遺伝子を過剰発現させた非ヒト動物または部品は、腫瘍を縮小または遅らせることが可能である。例えば、同じく腫瘍を患う雌のZip11-/-マウスは、野生型に比べて腫瘍の体積が大きくなっている。
また、本願は、非ヒト動物またはその一部を提供し、非ヒト動物またはその一部は、げっ歯類または魚類であってもよい。例えば、ネズミかもしれません。前記非ヒト動物又はその一部のZip11遺伝子の発現及び／又は機能が破壊されていてもよい。本願において、「破壊された」という用語は、一般に、遺伝子が発現しないこと、及び／又は発現産物としての機能を喪失することを意味する。遺伝子が少なくとも1つの変異または構造変化を含むように、遺伝子が構造的に破壊される（例えば、Flp/FRT要素またはCre/Loxp要素の挿入によって）ことで、破壊された遺伝子が発現しないか、発現産物の効率的発現を指示できないことが考えられる。前記破壊は、Zip11遺伝子の少なくとも一部をノックアウトすることにより達成され得る。ノックアウトは、当技術分野で既知の任意の方法によって構築することができる。
場合によっては、Crisper/Cas9システムのコンストラクトの助けを借りて得ることができる。具体的には、Flox遺伝子座を有するZip11アレルマウスとCreを特異的に発現するツールマウスを交配することにより、Zip11遺伝子の発現および／または機能が破壊されたモデルマウスを得ることが可能である。また、相同組換えの原理を利用して、標的遺伝子をノックアウトすることも可能である。例えば、Slc39all遺伝子は、胚性幹細胞ターゲティングを用いてFlox修飾することができる。場合によっては、前記Zip11遺伝子のエクソン5の少なくとも一部がノックアウトされる。例えば、前記非ヒト動物又はその一部は、Zip11遺伝子がノックアウトされたマウスモデルであってもよい。ここで、「破壊された」とは、Zip11遺伝子をノックアウトしていない野生型と比較して、前記Zip11の活性及び／又は発現が著しく低下していることを意味する。
本願明細書に記載されたZip11遺伝子の発現及び／又は機能が破壊された非ヒト動物又は部位は、Zip11活性及び／又は発現が低下し、老化状態の表現型が加速又は悪化していることを示す。例えば、Zip11 KOゼブラフィッシュモデルでは、生後6～12ヶ月の雌の受精卵は約10％～約100％（例えば、約20％～約90％、約30％～約80％、約40％～約70％、または約50％～約60％）の生殖率の低下、生後0～3ヶ月の雄の受精卵は約10％～約100％（例えば、約20％～約80％、約30％～約70％、約30％～約60％、または約40％～約50％）、生後6～12ヶ月の雄は約1％に満たず生殖率は減少するとされている。例えば、Zip11 KOゼブラフィッシュでは、野生型と比較して、生後10カ月時点でのメスの生存率は85％、オスの生存率は25％にとどまっている。例えば、Zip11をノックアウトしたマウスは、運動能力が少なくとも30％低下する（例えば、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％以上）ことができる。
いくつかの実施形態では、前記非ヒト動物又はその一部は、Zip11活性及び／又は発現レベルに対する候補物質の効果を評価するなどの研究に使用され得る。いくつかの実施形態では、前記非ヒト動物又は部位は、Zip11活性及び／又は発現に影響を与える物質のスクリーニングを同定するなどの医薬プロセスにおいて使用され得る。いくつかの実施形態では、前記非ヒト動物又は部位は、被験者の老化状態を特定するなどの診断及び／又は医療検査プロセスで使用されてもよい。場合によっては、前記非ヒト動物またはその一部を、研究者、営業担当者、製薬担当者等の関係者に提供、販売および／またはマーケティングすることがある。
本出願では、「含む」という用語は、通常、明確に指定された特徴を含むが、他の要素を排除しないことを指す。
本願において、「約」とは、一般に、規定値に対して0.5%から10%の範囲、例えば、0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%、4%、4.5%、5%、5.5%、 6%、6.5%、7%、7.5%、8%、8.5%、9%、9.5%、10%上または下を意味するものとする。
以下の実施例は、理論に限定されることを意図するものではなく、本出願の融合タンパク質、調製方法、用途等を説明するためにのみ使用され、本出願の範囲を限定するために使用されるものではない。
実施例
実施例1 ゼブラフィッシュZip11ノックアウト(KO)モデルの構築
ゼブラフィッシュ遺伝子（NCBIデータベースGene ID: 101882215で入手可能な配列）については、sgRNAを設計し、その配列をSEQ ID NO:4に示した。pT7-gRNAプラスミドをPCRの鋳型とし、ガムカットによりgRNA鋳型を精製し、T7キットを用いてin vitro転写を行った。1%アガロースゲル電気泳動ではsgRNAが転写されることが確認され、フェノールクロロホルムのイソアミルアルコール抽出精製方法により顕微注射に使用できるgRNA原液を得た。pXT7-Cas9プラスミドを制限酵素Xbalで直鎖化し、アガロースゲル電気泳動で直鎖化の完了を確認後、T7キットを用いてカラム精製を行いCas9 mRNAを体外転写テンプレートとし、アガロースゲル電気泳動でgRNAを精製してマイクロインジェクション用Cas9 mRNA原液とした。sgRNAとCas9-mRNAを適切な濃度で混合し、ゼブラフィッシュ受精卵にマイクロインジェクションで注入し、注入されていない野生型ゼブラフィッシュ胚をコントロールとした。インキュベーションして、Zipノックアウト・ゼブラフィッシュのF0世代を得た。図1Aは、ヒトとゼブラフィッシュのZip11のアミノ酸配列比較の結果、図1Bは、ノックアウト・ゼブラフィッシュZip11遺伝子のCas/gRNA標的部位の位置を示している。
実施例2 Zip11 KOゼブラフィッシュモデル老化状態表現型
雌と雄のF0世代を交配して純粋なゼブラフィッシュ（Zip11-/-）のF1世代を作り、F1世代を交配してZip11-/-変異体のF2世代を作り、培養し、表現型を観察し記録した。その結果を図2に示す。Zip11ノックアウトと野生型ゼブラフィッシュの連続比較観察により、1.5歳のF1世代雌は背骨が曲がっていることが明らかになった。F2世代の雌雄のゼブラフィッシュは、背骨が曲がり、ヒレが細く退化していたが、野生型のヒレは無傷であった。
F2世代と野生型ゼブラフィッシュの生後3ヶ月から24ヶ月までの生存率を記録し、生存曲線をプロットした。図3に示すように、Zip11-/-F2世代の出生から6ヶ月齢までの生存率は野生型ゼブラフィッシュと同程度であった。6ヶ月齢から、雄のF2世代は高い死亡率を示し、16ヶ月齢までにすべて死亡した。雌のF2世代は生後8カ月で死亡が確認され、生後20カ月以降の生存率は60％以下であった。Zip11-/-世代の雌の生存率は、雄のそれより高いことがわかる。
異なる年齢（0～3ヶ月齢、6～12ヶ月齢）の雌雄のゼブラフィッシュのF2世代の卵または精子を、野生型ゼブラフィッシュの精子または卵と体外受精させて培養し、完全な個体に成長した受精卵の割合を数え、結果を図4に示した。図4から、月齢が上がるにつれて受精卵の割合が減少し、F2世代の雄のゼブラフィッシュは雌よりも受精卵の割合が低いことがわかる。
図2～4は、Zip11を欠損したゼブラフィッシュが、脊椎の湾曲、悪液質、再生能力の低下、早発性不妊、寿命の短縮などの老化表現型を示し、老化は雄でより深刻であることを示している。
実施例3 Zip11ノックアウト(KO)マウスの構築
相同組換えの原理を利用して、標的遺伝子MGI No.1917056またはEnsembl No.ENSMUSG00000041654、転写バージョンENSMUST00000071539のZip11 KOモデルマウスを構築した。胚性幹細胞標的化ベクターは、インフュージョン社によって構築され、3.4kb5、相同アーム（5、相同アームフォワードプライマーSEQ ID NO：5、5'相同腕リバースプライマー SEQ ID NO：9、3'相同腕フォワードプライマー SEQ ID NO：9, 3, ホモロジーアームリバースプライマー SEQ ID NO：10）、2.3kbFlox領域（SEQ ID NO：13）、PGK-Neo-polyA（SEQ ID NO：14）、3.3kb 3、相同性アームおよびMCl-TK-polyA（SEQ ID NO：15）ネガティブスクリーニングマーカー、ここでFloxはエクソン5をターゲットとする。図5Bは、ターゲティングベクターのプラスミドマップである。このベクターを直鎖化し、エレクトロポレーション法によりJm8a3胚性幹細胞に導入した。G418とGancの薬剤でスクリーニングした結果、耐性クローンが得られた。陽性クローンは、long fragment PCRで相同組換えをスクリーニングした。
陽性胚性幹細胞クローンを増幅してC57BL/6マウスの胚盤胞に注入し、注入した胚盤胞を標準手順に従い仮妊娠雌マウス（C57BL/6J）の卵管に移植し、出産後、毛色からキメラマウスであるかどうか、キメラの程度を判定し、キメラマウスを得た。
このキメラ雄マウスをFlpマウスと交配させ、F1世代マウスを得た。Neo含有ヘテロ接合体陽性マウスはPCRで同定され、シークエンスで確認された。その後、陽性F1ヘテロ接合体マウスとFlpマウスを交配し、F2世代マウスを得た。脱ネオヘテロ接合体陽性マウスはPCRで同定され、シークエンスで確認された。Flpを介した相同組換えにより、Zip11 CKO（Conditional Knockout）の両端にFlox部位を持つ標的マウス、すなわちFlox部位を持つZip11対立遺伝子マウスを得た。Flox遺伝子座を持つZip11アレルマウスを、その組織に特異的にCreリコンビナーゼを発現するツールマウスと交配させた後、Flox純化したCre陽性マウスでFlox領域をノックアウトすると、特定の組織や細胞種で標的遺伝子Zip11の機能欠失が見られる。このコンストラクトを図5Aに示す。図5Cから、KOマウスはZip11の発現量が減少し、mRNAの転写がほとんどないことがわかり、ノックダウンに成功したことがわかる。
実施例4 Zip11 KOマウスの老化状態のフェノタイピング
4.1 脱毛の兆候を示すZip11 KOマウスのオスとメス
マウスはSPF動物舎で飼育し、離乳後22日目にオスとメスのケージに分け、自由に飲食させた。動物舎は、温度22±3℃、湿度35～5％、昼夜12時間サイクルで保たれている。マウスは定期的にフェノロジーの変化を観察した。
図6は、Zip11-/-雄マウスが生後6ヶ月で頭髪喪失の兆候を示すことを示している。図7は、Zip11 KO雌マウスが生後8ヶ月で背中と頭の両方に脱毛の兆候を示すことを示している。
4.2 脾臓肥大の兆候を示すZip11マウス
8ヶ月齢のZip11ノックアウトマウスと野生型マウスを麻酔して処刑し、その脾臓と肝臓を素早く取り出し、4％パラホルムアルデヒドで48時間固定し、パラフィン包埋して午後5時に組織切開し、ヘマトキシリン・エオジン（H&E）でルーチン染色して中性ゴムでシールし、顕微鏡で組織変化を観察した。
図8は、8ヶ月齢のZip11 KO雌マウスが、対照群の野生型マウスと比較して脾臓肥大の兆候を示し、脾臓の肥大が見られたこと；および脾臓切片はZip11ノックアウトマウスの脾臓組織の肥大を示したことを示している（図9）。
4.3 Zip11 KOマウスは肝臓肥大の兆候を示した
マウスの肝臓の切片を上記と同様に観察したところ、Zip11KOマウスの肝組織が大きくなっていることが確認された（図10）。
4.4 Zip11 KOマウスにおける自然発生的な腫瘍の形成
図11は、左が実験マウスの写真、右が雌の実験マウスの遺伝子型を示すエレクトロフェログラムであり、このマウスがZip11ノックアウトマウスであることを示している。5ヶ月齢でこのZip11ノックアウトマウスの左前肢に腫瘤が観察され、さらに乳腺腫瘤が観察された。同じケージの野生型コントロールマウスでは自然な腫瘍の成長は観察されなかった（図12）。図12からわかるように、Zip11 KOマウスは腫瘍の成長が顕著であった。
4.5 Zip11 KOマウスは炎症性因子のレベルが高い
Zip11-/-マウスの肝組織を野生型マウスと比較してRT-PCRした結果（図13）、Zip11欠損マウスではIL-6やTNF-αなどの炎症因子のmRNA発現レベルが上昇しており、炎症反応が強くなっていることが示唆された。
4.6 Zip11 KOマウスの運動量低下
Zip11の運動機能への影響は、直線加速回転計（Panlab/Harvard Apparatus> Holliston, USA）を用いて評価した。Zip11 KOマウスと野生型マウスにリニア加速度計を装着した。300秒のサイクルで4rpmから40rpmまで回転数を上げていった。回転計への適応を不要とし、性能向上の不均衡による各マウスから得られる結果の乖離を最小にするため、加速度プロトコルを採用した。各試験はマウスがバトンスイベルから落下した時点で終了し、各マウスは各実験日に3回のバトンスイベル加速走行を受け、4回の実験日を試行した。疲労誘導によるパフォーマンスの低下を防ぐため、試行と試行の間に5分間動物を回復させた。Zip11 KOマウスと野生型マウスの間で、バトンスイベルから落下するまでの時間を比較した。
結果は図14に示すとおりで、Zip11 KOマウスは野生型に比べて回転を維持する時間が短く、運動能力が弱いことがわかった。
実施例5 Zip11 KOマウスは雄マウスに肥満をもたらす
Zip11 KO雄マウスマウスと野生型マウスに高脂肪食（HFD）を与えて高脂肪モデルを構築し、野生型マウス3匹、Zip11+/-マウス4匹、Zip11-/-マウス4匹に高脂肪食を与えて毎週体重を測定した。その結果を図20に示す。 Zipir1'雄マウスは野生型マウスに比べてやや体重が重く、雄マウスでのノックアウトは雄マウスの肥満の出現につながることがわかる。
実施例6 Zip11 KOマウスにおける認知・学習障害
Zip11ノックアウトマウスを7週間高脂肪成型した後、オープンフィールド実験によりマウス（4.5ヶ月齢）の一連の行動能力をプローブした。この実験は、マウスの回避性、すなわち、マウスは開放的で不慣れな環境を恐れるため、壁際、すなわちオープンフィールドの周辺部に移動する傾向がある一方、マウスには新しい環境を探索する自然な傾向があり、中央部で探索を行うことを利用したものである。中央のエリアでのマウスの移動時間や距離が長い場合は、探索欲求や認知能力が高いことを示し、逆に中央のエリアでのマウスの移動時間や距離が短い場合は、探索欲求や認知能力が低いことを示している。
以下のように、ノックアウト雄マウス（Zip11+/-マウス4匹、Zip11-/-マウス4匹）と野生型雄マウス（3匹）をそれぞれオープンフィールド実験装置の中央に配置し、15分間実験装置内で自由に移動させ、オープンフィールドでの移動距離、中央での移動距離、オープンフィールドでの移動距離と時間の合計を記録した。各マウス終了後、前のマウスの残した臭いが次のマウスの行動性能に影響しないよう、75%アルコールで装置を拭き取り、糞尿をきれいにした。
オープンフィールド実験の統計結果を図21に、マウスの移動軌跡を図22に示す。 Zip11ノックアウトマウスでは、中央部での移動距離と移動時間が減少しており、探索意欲や認知能力が低下し、学習・認知能力に影響が出ることが示唆された。
実施例7 Zip11 KOマウスにおけるp53タンパク質量の増加
8ヶ月齢のZip11雌雄ノックアウトマウスとそれに対応する野生型マウスを麻酔し、尾部組織を迅速に切断し、マウス組織細胞からタンパク質を抽出し、細胞破片などの不純物を除去し、p53タンパク質発現量をウェスタンブロットで検出した。 p53レベルはノックアウトマウスで有意に増加していることがわかり（図23）、Zip11ノックアウトはp53の老化促進に関連していることが示唆された。
実施例8 LPS刺激下でマクロファージ免疫機能が低下したZip11 KOマウス
野生型(WT)マウス(n=6)とZip11 KOマウス(n=4)に、LPS (2.5mg/kg) とD-ガラクトサミン (D-galactosamine) (0.25g/kg) を腹腔内注射して急性炎症を誘発し、6時間後にマウスを麻酔して解剖し、血液と脾臓を採取し、それぞれ標識抗CD86抗体とCD 206抗体を加え、フローサイトメトリーでケト系CD86陽性 (Ml型マクロファージ) とCD206陽性 (M2型マクロファージ) の細胞比率を測定した。
M1型マクロファージは、強い炎症促進能と抗原提示能を示し、病原体や腫瘍細胞に対する宿主免疫のクリアランスとして機能する。一方、M2マクロファージは、抗炎症作用、創傷治癒・線維化作用、組織修復作用、腫瘍の増殖・浸潤促進作用を有する。その結果、マウスをLPSで刺激すると、M1マクロファージは有意に減少し（図24A）、M2マクロファージは有意に増加し、マクロファージの免疫機能が低下していることがわかった（図24B）。
実施例9 ZIP11ノックインマウスモデルの構築
マウスのH11遺伝子座を標的としたsgRNAの構築（5,～3,の配列はSEQ ID NO: 2を示す）およびPAM配列（SEQ ID NO:3に示す配列）を有する。sgRNAをもとに対応するドナーを設計し、Loxpに挟まれた強力なCAGプロモーターと終止シグナルも含むZip11のコーディング領域と、2AショートペプチドでヒトZIP11に連結したtdTomatoレポーター遺伝子を挿入したターゲティングプラスミドベクターを構築した。図15Aは、ZIP 11KIマウスモデルの構築を示したものである。ヒトZip11（hZip11）のコーディング領域の塩基配列をSEQ ID NO: 1に示す。
その後、このベクターをC57BL/6J胚性幹細胞にマイクロインジェクションで注入した。この胚盤胞を擬妊娠のC57BL/6J雌マウスに移植し、キメラマウスを得た。マイクロインジェクションで生まれたマウスは、PCR、シークエンス、サザンブロットによる同定を行い、陽性F0マウスを得た。このF0マウスを個々にC57BL/6Jと交配し、PCR、シークエンス、サザン同定により陽性のF1世代マウスを得た。次に、ヘテロ接合体マウスとCreリコンビナーゼを特異的に発現するツールマウスを交配し、H11-ZIP11ノックイン（KI）マウスを得ることにより、純粋なノックインマウスを得た。マウスを麻酔して致死させた後、ZIP 11 KIマウスの肝臓を素早く採取し、ZIP mRNAの発現量を測定した。 図15Bは、Z7P77KIマウスの肝間質細胞が野生型と比較してZIP 11を特異的に過剰発現していることを示し、ノックインが成功していることを示している。
実施例10 コンカナバリンAによるZip11の発現量の低下
野生型C57BL/6マウスを2群に分け、実験群は10 mg/kgのコンカナバリン (ConA) を尾静脈注射により投与し、18時間後に肝臓組織を摘出し、RT-PCRを用いてZIP 11の発現レベルを測定し、参照としてβ-アクチンを用いた。その結果を図16に示すが、ConAによってZIP 11レベルが減少した。
実施例11 ZIP11 KIマウスは、コンカナバリンAによって誘導される肝炎反応に対してより感受性が高い。
8週齢の大型ZIP11 KIマウスおよび同一ケージ内の野生型コントロールマウスに、尾静脈からイカタンパク質（ConA）10 mg/kgを投与し、18時間後に麻酔をかけ、心臓穿刺後にマウスを処刑して血清を抽出した。組織は4％パラホルムアルデヒドで固定し，パラフィンに包埋し，H＆EとTUNELで染色し，封入して組織学的変化を観察した。
血清中のグルタミン酸オキサリルトランスアミナーゼ（ALT）とグルタミン酸アラニントランスアミナーゼ（AST）の濃度を測定した。その結果を図17、図18に示す。
図17Aは、ConAによる肝炎傷害モデルにおける野生型マウスとZIP KIマウスの肝臓の大きさと色の見え方の比較を示したものである。図17Bは体重に対する肝臓重量の比率を、図17Cおよび図17DはZIP 11 KIマウスにおける血清ALTおよびASTレベルの上昇を示す図である。図18は、異なる染色方法による肝細胞の形態を示している。これらの結果から、ZIP 11 KIマウスはConAによる肝障害に対してより感受性が高いことが示された。
実施例12 ZIP11 KI雄マウスにおけるビリルビンレベルの低下
肝臓にZIP11を過剰発現させたマウスおよび野生型8週齢雄マウス、ZIP11ノックアウトマウスにMCD（Methionine and Choline Deficient L-Amino Acid Diet. メチオニンおよびコリン欠乏食、すなわちメチオニンおよびコリン源を含まない食事）食を与え、マウスにはアドリビタン食を与えて 4週間後、マウスを麻酔し、肝臓を解剖して重量を測定し、一連の生理学的試験を行った。
図25Aは、野生型マウスと雄の過剰発現マウスの肝臓を比較したものである。浙江大学薬物安全性評価研究センターで血清中のビリルビン濃度を測定した結果、ZIP11の肝臓を過剰発現させた雄マウスの血清中のビリルビンは野生型マウスに比べて有意に減少し（図25B）、ZIP11ノックアウト雄マウスの血清中のビリルビンは野生型マウスに比べて有意に増加した（図26A～26C）。以上のことから、ZIP11はNASH形成のためにMCDを与えたマウスにおいて保護的な役割を担っていることがわかった。
実施例13 ビタミンはZip11の発現量を増加させる
ヒト由来のHEK293細胞およびHT1080細胞に、それぞれ異なる濃度のビタミンB3（10μM、50μM、l00μM）、ビタミンB12（1μM、l0μM、50μM）およびビタミンC（10μM M、100μM、500μM）を24時間処理し、Zip11 mRNAの相対発現を検出し、結果を図19に示す。その結果、ビタミンが発現量を高めることがわかった。
前述の詳細な説明は、説明および例として提供されるものであり、添付の請求項の範囲を限定することを意図するものではありません。本願に現在列挙されている実施形態の様々な変形は、当業者には明らかであり、添付の特許請求の範囲及びその均等物の範囲内に留まるであろう。

Claims (98)

  1. 老化に影響を与えることができる物質を同定するための方法であって、前記方法は、以下を含む：
    候補物質がZip11の活性及び／又は発現に及ぼす影響を判定し、前記Zip11の活性及び／又は発現に変化をもたらす候補物質を、老化に影響を与える物質として同定すること。
  2. 前記Zip11の活性及び／又は発現に対する候補物質の効果を判定することが、前記Zip11核酸の発現量及び／又は活性に対する前記候補物質の効果を判定することを含む、請求項1に記載の方法。
  3. 前記Zip11核酸発現のレベル及び／又は活性を、Zip11を特異的に増幅できるプライマー、及び前記Zip11を特異的に認識できる核酸プローブからなる群より選ばれる物質を用いて決定する、請求項2に記載の方法。
  4. 前記Zip11の活性及び／又は発現に対する候補物質の影響を判定することが、前記Zip11タンパク質の発現量及び／又は活性に対する前記候補物質の影響を判定することを含む、請求項1～3のいずれか1項に記載の方法。
  5. 前記Zip11タンパク質の発現量及び／又は活性を、Zip11タンパク質を特異的に認識する試薬、及びZip11タンパク質の活性を測定できる物質からなる群より選ばれる物質を用いて決定する、請求項4に記載の方法。
  6. 前記Zip11の活性及び／又は発現を上昇させる候補物質が、老化を遅延又は改善することができる物質として特定される、請求項1～5のいずれか一項に記載の方法。
  7. 前記Zip11の活性及び／又は発現の低下を引き起こす候補物質が、老化を促進又は悪化させる可能性のある物質として特定される、請求項1～6のいずれか一項に記載の方法。
  8. 前記方法が、前記候補物質を非ヒト動物、器官、組織及び／又は細胞に投与すること、前記候補物質が前記非ヒト動物、器官、組織及び／又は細胞における前記Zip11の活性及び／又は発現に及ぼす影響を判定し、前記Zip11の活性及び／又は発現に変化をもたらす候補物質を老化に影響を与える物質として特定することを含む、請求項1-7のいずれか一項に記載の方法。
  9. 前記方法がin vitroまたはex vivoの方法である、請求項1～8のいずれか一項に記載の方法。
  10. 前記加齢の状態が、身体形態、毛髪の状態、免疫レベルの状態、腫瘍の状態、肝臓の状態、脾臓の状態、生殖能力の状態、運動の状態、寿命の状態、認知能力の状態のうち1つ以上を評価することによって決定される、請求項1～9のいずれか一項に記載の方法。
  11. 請求項10に記載の方法において、前記身体形態状態は、脊椎形態を検出することによって評価されることを特徴とする方法。
  12. 前記毛髪の状態は、脱毛を検出することによって評価される、請求項10～11のいずれか1項に記載の方法。
  13. 前記免疫レベルの状態が、サイトカインレベルを検出することによって評価される、請求項10～12のいずれか一項に記載の方法。
  14. 前記患部腫瘍の前記状態は、腫瘍体積、腫瘍の発育状態及び／又は腫瘍細胞の存在を検出することによって評価される、請求項10～13のいずれか一項に記載の方法。
  15. 前記肝臓の状態を、グルタチオントランスアミナーゼ活性、グルタチオントランスアミナーゼ活性及び／又は肝臓／体重比を検出することにより評価する、請求項10～14のいずれか1項に記載の方法。
  16. 前記脾臓の状態が、脾臓／体重比重の測定によって評価される、請求項10～15のいずれか1項に記載の方法。
  17. 前記受胎可能状態は、受胎可能卵比率を検出することによって評価される、請求項10～16のいずれか1項に記載の方法。
  18. 前記運動性の状態が、疲労型バトントランスデューサーの試験結果によって評価される、請求項10～17のいずれか1項に記載の方法。
  19. 前記長寿の状態は、生存時間を検出することによって評価される、請求項10～18のいずれか1項に記載の方法。
  20. 前記認知状態は、オープンフィールドテストによって評価される、請求項10～19のいずれか1項に記載の方法。
  21. Zip11活性を増加させ、発現を減少させることができる物質の薬剤の調製への使用であって、前記薬剤は、老化を遅延または改善させるために使用されること。
  22. 前記老化の遅延又は改善は、脊椎の湾曲の防止又は治療、脱毛の防止又は治療、サイトカインレベルの増加、免疫力の向上、腫瘍の防止又は治療、寿命の延長、肝臓障害の防止又は治療、脾臓障害の防止又は治療、生殖能力の低下の防止又は治療、運動能力の向上、運動能力が低下する時期の遅延及び／又は行動認知能力の向上からなる、請求項21に記載の使用方法。
  23. 前記増加とは、前記物質を投与した後に、前記物質を投与しない場合と比較して、前記Zip11の活性及び／又は発現が少なくとも15倍増加することを意味する、請求項21～22のいずれか一項に記載の使用。
  24. Zip11の前記活性及び／又は発現が、Zip11核酸のレベル及び／又はZip11タンパク質のレベルでの活性及び／又は発現を含む、請求項21～23のいずれか1項に記載の使用。
  25. 老化に影響を与えることができる物質を同定するシステムであって、前記システムは、候補物質がZip11の活性及び／又は発現に及ぼす影響を判定することができる物質を含むことを特徴とする、老化に影響を与えることができる物質を同定するシステム。
  26. 前記Zip11の核酸発現のレベル及び／又は活性を測定することができる物質を含む、請求項25に記載のシステム。
  27. 前記Zip11の核酸発現レベル及び／又は活性を測定できる物質が、Zip11を特異的に増幅できるプライマー及び／又はZip11を特異的に認識できるプローブからなる、請求項26に記載のシステム。
  28. 前記Zip11のタンパク質の発現レベル及び／又は活性を測定することができる物質を含む、請求項26～27のいずれか1項に記載のシステム。
  29. 前記Zip11のタンパク質の発現レベル及び／又は活性を測定できる物質が、Zip11のタンパク質を特異的に認識できる試薬及び／又はZip11のタンパク質の活性を測定できる試薬からなることを特徴とする請求項28に記載のシステム。
  30. Zip11をコードする核酸分子またはその発現産物の薬剤の調製への使用であって、前記薬剤が老化を遅延または改善するために使用されること。
  31. 前記老化の遅延又は改善は、脊椎の湾曲の防止又は治療、脱毛の防止又は治療、サイトカインレベルの増加、免疫力の向上、腫瘍の防止又は治療、寿命の延長、肝臓障害の防止又は治療、脾臓障害の防止又は治療、生殖能力の低下の防止又は治療、運動能力の向上、運動能力が低下する時期の遅延及び／又は行動認知能力の向上からなる、請求項30に記載の使用方法。
  32. 前記核酸分子が、SEQ ID No.1に示されるヌクレオチド配列を含む、請求項30～31のいずれか一項に記載の使用。
  33. Zip11をコードする核酸分子またはその発現産物の有効量を、それを必要とする被験者に投与することを含む、老化を遅延または改善するための方法。
  34. 前記老化の遅延又は改善は、脊椎の湾曲の防止又は治療、脱毛の防止又は治療、サイトカインレベルの増加、免疫力の向上、腫瘍の防止又は治療、寿命の延長、肝臓障害の防止又は治療、脾臓障害の防止又は治療、生殖能力の低下の防止又は治療、運動能力の増強、運動能力が低下する時期の遅延及び／又は行動認知能力の増強から成る、請求項33に記載の方法。
  35. 前記核酸分子が、SEQ ID No.1に示されるヌクレオチド配列を含む、請求項33～34のいずれか一項に記載の方法。
  36. 被験者の老化状態を特定する方法であって、前記方法は、被験者におけるZip11の活性及び／又は発現を測定することを含む、方法。
  37. 前記Zip11活性及び／又は発現が、Zip11核酸発現レベル及び／又は活性、及び／又はZip11タンパク質発現レベル及び／又は活性を含む、請求項36に記載の方法。
  38. Zip11を特異的に増幅することができるプライマー、及び前記Zip11を特異的に認識することができる核酸プローブからなる群より選択される物質を用いて、対象における前記Zip11の核酸発現レベル及び／又は活性を測定する、請求項37に記載の方法。
  39. Zip11タンパク質を特異的に認識する試薬、及びZip11タンパク質の活性を測定できる物質からなる群より選択される物質を用いて、対象における前記Zip11タンパク質の発現レベル及び／又は活性を測定する、請求項37～38のいずれか一項に記載の方法。
  40. 前記加齢の状態が、体型の状態、毛髪の状態、免疫レベルの状態、腫瘍を有する状態、肝臓の状態、脾臓の状態、生殖能力の状態、運動能力の状態、寿命の状態、認知能力の状態、の群の1以上の状態を評価することによって決定される、請求項36～39のいずれか一項に記載の方法。
  41. 請求項40に記載の方法において、前記身体形態状態は、脊椎形態を検出することによって評価されることを特徴とする方法。
  42. 前記毛髪の状態は、脱毛を検出することによって評価される、請求項40～41のいずれか一項に記載の方法。
  43. 前記免疫レベルの状態が、サイトカインレベルを検出することによって評価される、請求項40～42のいずれか一項に記載の方法。
  44. 前記患部腫瘍の前記状態は、腫瘍体積、腫瘍の発生、及び／又は腫瘍細胞の存在を検出することによって評価される、請求項40～43のいずれか一項に記載の方法。
  45. 前記肝臓の状態を、グルタチオントランスアミナーゼ活性、グルタチオントランスアミナーゼ活性及び／又は肝臓／体重比を検出することにより評価する、請求項40～44のいずれか1項に記載の方法。
  46. 前記脾臓の状態が、体重に対する脾臓の比率を検出することによって評価される、請求項40～45のいずれか一項に記載の方法。
  47. 前記受胎可能状態は、受胎可能卵比率を検出することによって評価される、請求項40～46のいずれか一項に記載の方法。
  48. 前記運動性の状態が、疲労型バトントランスデューサーの試験結果によって評価される、請求項40～47のいずれか一項に記載の方法。
  49. 前記長寿の状態は、生存時間を検出することによって評価される、請求項40～48のいずれか一項に記載の方法。
  50. 前記認知状態は、オープンフィールドテストによって評価される、請求項40～49のいずれか1項に記載の方法。
  51. 試薬の調製のためのZip11活性及び／又は発現を決定するための物質の使用であって、前記試薬は被験者の加齢状態を識別するために使用されること。
  52. 請求項51に記載の使用であって、前記Zip11の活性及び／又は発現が、Zip11核酸発現レベル及び／又は活性、及び／又はZip11タンパク質発現レベル及び／又は活性を含む、使用。
  53. 請求項51～52のいずれか1項に記載の使用であって、前記物質は、Zip11を増幅することができるプライマー、Zip11と特異的に認識することができる核酸プローブ、Zip11タンパク質を特異的に認識することができる試薬、及び／又はZip11タンパク質の活性を測定できる物質からなることを特徴とする、使用。
  54. 前記加齢の状態が、身体形態、毛髪の状態、免疫レベルの状態、腫瘍の状態、肝臓の状態、脾臓の状態、生殖能力の状態、運動能力の状態、寿命の状態および認知能力の状態の群のうちの1つ以上を評価することによって決定される、請求項51～53のいずれか一項に記載の使用。
  55. 前記身体形態状態は、脊椎形態を検出することによって評価される、請求項54に記載の使用。
  56. 前記毛髪の状態は、脱毛を検出することによって評価される、請求項54～55のいずれか一項に記載の使用。
  57. 前記免疫レベルの状態が、サイトカインレベルを検出することによって評価される、請求項54～56のいずれか一項に記載の使用。
  58. 前記腫瘍の前記状態が、腫瘍体積、腫瘍の発生、及び／又は腫瘍細胞の存在を検出することによって評価される、請求項54～57のいずれか一項に記載の使用。
  59. 前記肝臓の状態が、グルタチオン活性、グルタチオン活性及び／又は肝臓／体重比を検出することによって評価される、請求項54～58のいずれか一項に記載の使用。
  60. 前記脾臓の状態が、脾臓／体重比を測定することによって評価される、請求項54～59のいずれか1項に記載の使用。
  61. 前記受胎可能状態は、受胎可能卵比率を測定することによって評価される、請求項54～60のいずれか1項に記載の使用。
  62. 前記運動性の状態が、疲労型ロータメータ実験の結果によって評価される、請求項54～61のいずれか1項に記載の使用。
  63. 前記長寿の状態が、生存時間を検出することによって評価される、請求項54～62のいずれか一項に記載の使用。
  64. 前記認知状態は、不在者フィールドテストによって評価される、請求項54～63のいずれか1項に記載の使用。
  65. Zip11の発現及び／又は活性を測定できる物質を含む、被験者の加齢状態を識別するためのシステム。
  66. 前記Zip11の核酸発現のレベル及び／又は活性を測定することができる物質を含む、請求項65に記載のシステム。
  67. Zip11の前記核酸発現のレベル及び／又は活性を決定できる前記物質が、Zip11を増幅できるプライマー及び／又はZip11を特異的に識別できる核酸プローブと、を含む、請求項66に記載のシステム。
  68. 前記Zip11のタンパク質の発現レベル及び／又は活性を測定することができる物質を含む、請求項65～67のいずれか1項に記載のシステム。
  69. 前記Zip11のタンパク質発現量及び／又は活性を測定可能な物質が、Zip11タンパク質を特異的に認識可能な物質及び／又はZip11タンパク質活性を測定可能な物質を含む、請求項68に記載のシステム。
  70. 身体形態条件、毛髪条件、免疫レベル条件、腫瘍条件、肝臓条件、脾臓条件、生殖能力条件、運動能力条件、寿命条件、認知能力条件の群のうち1つ以上を評価して前記老化状態を判定する、請求項65～69のいずれか1項に記載のシステム。
  71. 請求項70に記載のシステムにおいて、前記身体形態は、背骨の形態を検出することによって評価されることを特徴とするシステム。
  72. 前記毛髪の状態は、脱毛を検出することによって評価される、請求項70～71のいずれか一項に記載のシステム。
  73. 前記免疫レベルの状態が、サイトカインレベルを検出することによって評価される、請求項70～72のいずれか一項に記載のシステム。
  74. 前記患部腫瘍の前記状態は、腫瘍体積を検出することによって評価される、請求項70～73のいずれか一項に記載のシステム。
  75. 前記肝臓の状態が、グルタチオントランスアミナーゼ活性、グルタチオントランスアミナーゼ活性及び／又は肝臓／体重比を検出することによって評価される、請求項70～74のいずれか1項に記載のシステム。
  76. 前記脾臓の状態は、脾臓／体重比重を検出することによって評価される、請求項70～75のいずれか1項に記載のシステム。
  77. 前記受胎可能状態は、受胎可能卵比率を検出することによって評価される、請求項70～76のいずれか一項に記載のシステム。
  78. 前記運動状態は、疲労型ロータメータ実験の結果によって評価される、請求項70～77のいずれか一項に記載のシステム。
  79. 前記長寿の状態は、生存時間を検出することによって評価される、請求項70～78のいずれか1項に記載のシステム。
  80. 前記認知状態は、オープンフィールドテストによって評価される、請求項70～79のいずれか1項に記載のシステム。
  81. 候補物質が被験者の老化状態に及ぼす影響を評価する方法であって、前記方法は、以下を含むことを特徴とする：
    1) 前記被験者に前記評価対象候補物質を投与するステップと：
    2) 前記投与の前後で、前記対象におけるZip11の発現及び／又は活性の変化を比較するステップ；及び
    3) 前記Zip11の発現及び／又は活性の変化に基づいて、前記候補物質が前記被験者の老化状態に及ぼす影響を評価するステップと
  82. Zip11の前記活性及び／又は発現が、Zip11核酸のレベル及び／又はZip11タンパク質のレベルでの活性及び／又は発現を含む、請求項81に記載の方法。
  83. 前記候補物質が、前記投与後に前記対象においてZip11の発現がアップレギュレートされ、及び／又は活性が増強される場合、前記対象の老化状態を遅延又は改善する、請求項81～82のいずれか一項に記載の方法。
  84. 前記老化の遅延又は改善は、脊椎の湾曲の防止又は治療、脱毛の防止又は治療、サイトカインレベルの増加、免疫力の向上、腫瘍の防止又は治療、寿命の延長、肝臓障害の防止又は治療、脾臓障害の防止又は治療、生殖能力の低下の防止又は治療、運動能力の増強、行動認知の増強及び／又は運動能力が低下する時期の遅延を含むことを特徴とする請求項83に記載の方法。
  85. 前記候補物質が、前記投与後に前記対象においてZip11の発現が低下している場合、及び／又は前記候補物質の活性が低下している場合に、前記対象の老化状態を加速又は悪化させる、請求項81～84のいずれか一項に記載の方法。
  86. 前記老化の加速又は悪化が、脊椎湾曲の悪化、脱毛の悪化、サイトカインレベルの低下、免疫力の低下、腫瘍の悪化又は再発、寿命の短縮、肝臓損傷の悪化、脾臓損傷の悪化、生殖能力の低下の悪化、運動能力の低下及び／又は行動認知能力の低下を含むことを特徴とする請求項85に記載の方法。
  87. Zip11を過剰発現している非ヒト動物またはその一部である。
  88. 対応する野生型と比較して、Zip11遺伝子のコピー数が追加されてなる、請求項87に記載の非ヒト動物またはその一部。
  89. 前記Zip11遺伝子が、組織特異的プロモーターによって制御的に発現される、請求項88に記載の非ヒト動物またはその一部。
  90. 前記Zip11遺伝子の追加コピー数が肝臓に特異的に発現している、請求項88～89のいずれか一項に記載の非ヒト動物またはその一部。
  91. 前記組織特異的プロモーターが、SEQ ID NO.1に示される塩基配列からなる、請求項89～90のいずれか1項に記載の非ヒト動物またはその一部。
  92. 老化状態を遅延または改善する表現型を示す、請求項87～91のいずれか1項に記載の非ヒト動物またはその一部。
  93. 前記老化の遅延又は改善は、脊椎湾曲の防止又は治療、脱毛の防止又は治療、サイトカインレベルの増加、免疫力の向上、腫瘍の防止又は治療、寿命の延長、肝臓障害の防止又は治療、脾臓障害の防止又は治療、生殖能力の低下の防止又は治療、運動能力の向上、運動能力が低下する時点の遅延及び／又は行動認知能力の向上を含むことを特徴とする請求項92記載の非ヒト動物又はその一部分。
  94. Zip11遺伝子の発現及び／又は機能が破壊されている、非ヒト動物又はその一部。
  95. Zip11遺伝子の少なくとも一部がノックアウトされている、請求項94に記載の非ヒト動物またはその一部。
  96. 前記Zip11遺伝子のエクソン5の少なくとも一部がノックアウトされている、請求項95に記載の非ヒト動物またはその一部。
  97. 老化の促進または悪化した表現型を示す、請求項94～96のいずれか1項に記載の非ヒト動物またはその一部。
  98. 前記加速または悪化した老化が、.を含む、請求項94～97のいずれか1項に記載の非ヒト動物またはその一部。脊椎湾曲の悪化、脱毛の悪化、サイトカインレベルの低下、免疫力の低下、腫瘍の悪化または再発、寿命の短縮、肝臓障害の悪化、脾臓障害の悪化、生殖能力の低下の悪化、運動能力の低下、行動的認知能力の低下。
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