JP6626830B2 - Ｄｎａ操作のための複数のトランスポザーゼアダプター - Google Patents

Ｄｎａ操作のための複数のトランスポザーゼアダプター Download PDF

Info

Publication number
JP6626830B2
JP6626830B2 JP2016552415A JP2016552415A JP6626830B2 JP 6626830 B2 JP6626830 B2 JP 6626830B2 JP 2016552415 A JP2016552415 A JP 2016552415A JP 2016552415 A JP2016552415 A JP 2016552415A JP 6626830 B2 JP6626830 B2 JP 6626830B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
adapter
transposase
dna
sequence
strand
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
JP2016552415A
Other languages
English (en)
Other versions
JP2016534757A (ja
Inventor
ベリャーエフ，アレクサンダー・エス
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Agilent Technologies Inc
Original Assignee
Agilent Technologies Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Agilent Technologies Inc filed Critical Agilent Technologies Inc
Publication of JP2016534757A publication Critical patent/JP2016534757A/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP6626830B2 publication Critical patent/JP6626830B2/ja
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1241—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6869—Methods for sequencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6869—Methods for sequencing
    • C12Q1/6874—Methods for sequencing involving nucleic acid arrays, e.g. sequencing by hybridisation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y207/00—Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)
    • C12Y207/07—Nucleotidyltransferases (2.7.7)

Description

［関連出願の相互参照］
本出願は、２０１３年１１月７日出願の米国仮特許出願第６１／９０１，０３７号および２０１４年６月１８日出願の米国仮特許出願第６２／０１３，８３３号の優先権を主張する。これらの出願の内容は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
［発明の分野］
本発明は、トランスポザーゼアダプター、ならびにＤＮＡ分子の調製、ｉｎ ｖｉｔｒｏ増幅、核酸の配列決定および目的の配列についてのＤＮＡライブラリーのスクリーニングならびに生細胞中への核酸送達における使用を含む、それらの使用に関する。
トランスポザーゼは、トランスポゾンの末端に結合し、カットアンドペースト機構または複製的転位機構によるゲノムの別の部分へのトランスポゾンの移動を触媒する酵素のクラスである。これらの酵素は、次世代配列決定（ＮＧＳ）、変異誘発、核酸送達（遺伝子治療）、および再生医学のための多能性細胞の生成のためのサンプルの調製において使用されてきた。これらの適用では、トランスポザーゼは、単離されたタンパク質としては作用しないが、特異的ＤＮＡ配列との複合体で核タンパク質として作用する。かかる配列は、一般に、トランスポザーゼ認識配列、トランスポゾン末端、逆方向反復右配列（ＩＲＲ）、逆方向反復左配列（ＩＲＬ）またはアダプターと呼ばれる。
ＮＧＳライブラリーの調製に使用する場合、トランスポザーゼ−アダプター複合体は、ハイスループット配列決定を達成するための重要なステップである、ゲノムＤＮＡの断片化に使用される。超音波処理およびＤＮＡｓｅ処理などの他の断片化技術と比較して、トランスポザーゼベースの断片化は、サンプル調製が配列決定費用全体の約５０％を構成することを考慮すると、時間、労働および設備支出において、数倍の節約になる。しかし、現在利用可能なトランスポザーゼ−アダプター複合体によるＤＮＡ断片化は、あまりランダムではない。即ち、一部の領域においてはより多い読み取りまたは他の領域においてはより少ない読み取りを生じるバイアスを有し、これは、１〜３％より高い重複率、および同じ全体的なカバー率を達成するためのより多い配列決定の試みを生じる場合が多い。従来のトランスポザーゼベースのＮＧＳサンプル調製方法もまた、時間のかかるアダプターの除去を必要とし、非常に低い量のＤＮＡを有するサンプルを処理するためには適切ではない。
従って、ランダムさを増加させ、重複率を低減させるように、適切な活性および異なる特性を有する異なるトランスポザーゼアダプターの必要性もまた存在する。非常に低い量のＤＮＡを有するサンプルのトランスポザーゼ反応における直接的な処理のためのより効率的および／または適切な方法の必要性も存在する。
本発明は、複数のトランスポザーゼアダプターを提供することによって、上述の、未だ解決されていない必要性に対処する。
一態様では、本発明は、第１の配列を含む第１の鎖と第２の配列を含む第２の鎖とを含む単離された合成核酸アダプターを提供する。この第１の配列および第２の配列は、互いに対して完全に相補的または実質的に相補的であり、このアダプターは、トランスポザーゼによって認識される。
この単離された合成核酸アダプターは、トランスポザーゼのネイティブ認識配列と比較して、１または複数の改変を有するトランスポザーゼ認識配列を含む。例えば、この第１の配列は、トランスポザーゼの親、ネイティブもしくは公知の認識配列の改変されたバージョンであるか、またはこの第２の配列は、親アダプター配列の相補体の改変されたバージョンであるか、あるいはそれら両方が、かかる改変されたバージョンであるかのいずれかである。
この単離された合成核酸アダプターは、トランスポザーゼのネイティブ認識配列と比較して、（ａ）第１の配列（第１の鎖上）の５’末端（１位）もしくは第２の配列（第２の鎖上）の３’末端、または両方における、１または複数の改変、（ｂ）第１の鎖または第１の配列における１または複数の改変されたヌクレオチドであって、この１または複数の改変されたヌクレオチドは、第１の鎖のプライマー伸長を妨害する、１または複数の改変されたヌクレオチド、および、（ｃ）第２の鎖または第２の配列における１または複数のホスホロチオエート結合、の改変のうちの１または複数を有し得る。
一実施形態では、この単離された合成核酸アダプターは、トランスポザーゼのネイティブもしくは公知の認識配列（親アダプター配列または親認識配列）と比較して、第１の配列の５’末端（１位）において、またはネイティブ認識配列の相補体と比較して、第２の配列の３’末端において、あるいはこれら末端の両方において、１または複数の改変を有する。例えば、この第１の配列は、親認識配列と比較して、その５’末端において、異なるヌクレオチドを有し得るか、少なくとも１つの付加されたヌクレオチドを有し得るか、または１つのヌクレオチドを欠損し得る。同様に、第２の配列もまた、相補体と比較して、その３’末端において少なくとも１つの異なるヌクレオチドを有し得るか、付加されたヌクレオチドを有し得るか、または１つのヌクレオチドを欠損し得る。これらのアダプターの例は、図３Ｂ、図４Ｂおよび図５Ｃに示される。
別の一実施形態では、上述の（ｂ）における１または複数の改変されたヌクレオチドは、デオキシウリジン、脱塩基部位、２’ＯＭｅで改変されたリボ核酸（ＲＮＡ）および逆方向チミジンからなる群から選択される。この逆方向チミジンは、好ましくは、第１の鎖の３’末端に存在する。一部の例では、この１または複数の改変されたヌクレオチドには、ホスホロチオエート結合またはスペーサーが先行する（即ち、改変されたヌクレオチドに対して５’側に存在する）。第２の鎖は、かかる１または複数の改変されたヌクレオチドを含まなくてもよい。
なお別の一実施形態では、少なくとも１つのホスホロチオエート結合が、第２の鎖または第２の配列の３’側の最後のヌクレオチドと３’側の最後から２番目のヌクレオチドとの間にある。この第２の鎖または第２の配列は、約１〜１８個（例えば、２〜１５個、３〜１４個または４〜１０個、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７または１８個）のホスホロチオエート結合を含み得る。第１の鎖または第１の配列は、ホスホロチオエート結合を含まなくてもよい。
上述のアダプターにおいて、第１の鎖および第２の鎖は、二重鎖を形成できる。この二重鎖は、１５〜３０ｂｐ長であり得る。その場合、この二重鎖は、第１または第２の鎖の３’末端または５’末端において（例えば、第２の鎖の３’末端または第１の鎖の５’末端において）、平滑末端または付着末端を有し得る。このアダプターにおいて、第１または第２の配列における１または複数の改変の結果、二重鎖において（例えば、第１または第２の鎖の１または複数の末端において）、１または複数の未対合のヌクレオチド、例えば、未対合の塩基またはオーバーハングが生じ得る。
好ましくは、この第１または第２の配列（または鎖）は、１７〜８０、１８〜６０または１９〜５０ヌクレオチド長、例えば、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、４０、５０、６０または８０ヌクレオチド長である。より好ましい実施形態では、この第１または第２の配列は、１９〜２１ヌクレオチド長、即ち、１９または２０または２１ヌクレオチド長である。
一部の好ましい実施形態では、親、ネイティブまたは公知の認識配列は、１位においてＣを有する。これらを含むかかる親認識配列の例は、図１に示される。一実施形態では、本発明のアダプターは、１位において、第２の配列（即ち、図３〜５に示されるアダプターの下の鎖）上にＧからＡの置換を有する（例えば、図５に示され、以下の実施例２に記載される、アダプター６、８、１３、１７および２７）。別の一実施形態では、このアダプターは、第２の配列上の１位において、ＧからＡの置換を有し、かつ反対の鎖上に、即ち、第１の配列の１位において、ミスマッチした塩基を有する（例えば、その位置においてミスマッチしたＣを有するアダプター８および２７）。なお別の一実施形態では、このアダプターは、第２の配列上の１位においてネイティブのＧを有するが、反対の鎖上にミスマッチした塩基を有する（例えば、それぞれ、その位置においてミスマッチしたＴおよびＧを有するアダプター７および１２）。これらのアダプターは全て、親アダプターと比較して増加した活性を付与する。
さらなる一実施形態では、このアダプターは、第１の配列の１位のＣに対して５’側の付加された塩基、またはアダプター配列１位のＧに対して３’側の付加された塩基を有し得る（例えば、アダプター５、９および１０）。これらのアダプターは、親アダプターよりも低い、または親アダプターと匹敵する重複率を有する。
一部の実施形態では、この第１または第２の鎖は、２−アミノプリン、２，６−ジアミノプリン、５−ブロモｄＵ、デオキシウリジン、逆方向ｄＴ、逆方向ジデオキシ−Ｔ、ジデオキシ−Ｃ、５−メチルｄＣ、デオキシイノシン、５−ニトロインドールを含むユニバーサル塩基、２’−Ｏ−メチルＲＮＡ塩基、イソ−ｄＣ、イソ−ｄＧ、リボヌクレオチド、モルホリノ、タンパク質ヌクレオチドアナログ、グリコイックヌクレオチドアナログ（ｇｌｙｃｏｉｃ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ａｎａｌｏｇｕｅ）、ロックトヌクレオチドアナログ、トレオースヌクレオチドアナログ、鎖終結ヌクレオチドアナログ、チオウリジン、プソイドウリジン、ジヒドロウリジン、キューオシンおよびウィオシン（ｗｙｏｓｉｎｅ）からなる群から選択される少なくとも１つの改変されたヌクレオチドを含み得る。他では、第１または第２の鎖における少なくとも１つのヌクレオチドは、リン酸化され得るか、もしくはリボヌクレオチドであり得、または改変された糖、非天然の結合、脱塩基部位、ジデオキシ塩基、５−メチル塩基もしくはスペーサーを有し得る。一部の実施形態では、第２の鎖は、第２の配列に対して５’側にタグ配列をさらに含み得る。同様に、第１の鎖は、第１の配列に対して３’側に、例えば、図１に示される１９位を超えて、タグ配列をさらに含み得る。第１および第２の配列へのタグは、以下に記載されるように、それらの使用に基づいて互いに対して非相補的であり得る。アダプターに対して、トランスポザーゼは、「カットアンドペースト」トランスポザーゼ、例えば、ビブリオ・ハーベイ（Ｖｉｂｒｉｏ Ｈａｒｖｅｙｉ）トランスポザーゼまたは高活性Ｔｎ５トランスポザーゼであり得る。
本発明は、（ｉ）上述の第１の単離された合成核酸アダプターと、（ｉｉ）上述の第２の単離された合成核酸アダプターとを有する、単離された合成核酸アダプターのセットもまた提供し、この第１のアダプターおよび／または第２のアダプターは、そのそれぞれの親認識配列またはその相補体と比較して、少なくとも１つの異なる改変を有する。例えば、２つのアダプターのうち少なくとも１つは、上記単離された合成核酸アダプターである。これら２つのアダプターは、同じトランスポザーゼによって、または２つの異なるトランスポザーゼによって、認識され得る。
これらのセットの例には、図５Ｃに示されるアダプター４〜１０、１２〜２３および２７〜２８、図１３に示されるアダプター３Ｕ２、８Ｕ２、３Ｕ４、８Ｕ４、３ｉ０＊ｄＴおよび８ｉ０＊ｄＴ、アダプターＥ８（図１８）、ならびに図１９に示されるアダプターの任意の組み合わせが含まれる。
この第１の配列および第２の配列は、それぞれ、配列番号７３および配列番号７４、配列番号７５および配列番号７６、配列番号２８および配列番号３６、配列番号２８および配列番号２２、配列番号２および配列番号３６、配列番号２および配列番号７４、配列番号２および配列番号７６、配列番号２６および配列番号２２、配列番号２６および配列番号３６、配列番号２６および配列番号３９、配列番号２６および配列番号４１、配列番号２４および配列番号２２、配列番号２４および配列番号３６、配列番号２４および配列番号３９、配列番号２４および配列番号４１、配列番号２８および配列番号３９、配列番号２８および配列番号４１、配列番号２および配列番号３９、配列番号２および配列番号４１、配列番号７５および配列番号３６、もしくは配列番号７３および配列番号３６を含み得るか、またはこれらから本質的になり得るか、またはこれらからなり得る。他の例には、図１１に示されるアダプター１および５〜１０のセット、アダプター５〜１０のセット、アダプター６、８、１３、１７および２７のセット、アダプター８および２７のセット、アダプター７および１２のセット、ならびにアダプター５および９のセットが含まれる。さらなる例には、アダプター５〜１０、１２、１３、１７および２７の任意の組み合わせが含まれる。他の例には、図１３に示されるアダプター対２〜４、および図１９に示されるアダプターの任意の組み合わせが含まれる。
第１のトランスポザーゼおよびこのトランスポザーゼによって認識される配列を有する上述の第１のアダプターを有するキットもまた提供される。このキットは、緩衝液、重合酵素、エンドヌクレアーゼおよび制限酵素からなる群から選択される少なくとも１つの成分、ならびに標的ＤＮＡからＤＮＡライブラリーを作製するための指示書を、さらに含み得る。一部の実施形態では、アダプターの第２の鎖は、第２の配列に対して５’側にタグ配列をさらに含み、キットは、このタグ配列に対して相補的なプライマーをさらに含む。他では、このキットは、第１のアダプターとは異なるが、第１のトランスポザーゼまたは異なるトランスポザーゼによって認識され得る、第２のアダプターをさらに含み得る。
別の一態様では、本発明は、標的ＤＮＡ分子を断片化するためのｉｎ ｖｉｔｒｏの方法を提供する。この方法は、トランスポザーゼを得るステップと、トランスポザーゼによって認識され得る上記単離された合成核酸アダプターを得るステップと、アダプター、トランスポザーゼおよび標的ＤＮＡ分子を混合するステップと、転位反応を実施するための条件下で、アダプター、トランスポザーゼおよび標的ＤＮＡをインキュベートし、それによって、アダプターおよびトランスポザーゼが標的ＤＮＡ分子と会合し、トランスポザーゼ媒介性の切断を介して標的ＤＮＡ分子を切断して、切断されたＤＮＡ産物を提供するステップとを含む。
他の態様では、本発明は、少なくとも１つのトランスポザーゼを有するトランスポザーゼ成分と本発明のアダプターとを含む、トランスポザーゼ複合体を提供する。トランスポザーゼ複合体を産生するために、１または複数のトランスポザーゼを、このトランスポザーゼの認識配列を含む本発明の１または複数のアダプターと共にインキュベートし、アダプターがトランスポザーゼに結合するのに十分な時間を与え、それによって、トランスポザーゼ複合体を創出することができる。このトランスポザーゼ複合体は、固体基材に結合され得る。その場合、特異的結合対を含むリンカー成分を使用することができる。特異的結合対のメンバーの一方は、アダプターに結合され得、他方のメンバーは、固体基材に結合され得る。かかる固体基材に結合したトランスポザーゼ複合体では、複合体１つにつきアダプターの少なくとも１つが、それに結合した特異的結合対のメンバーを有する。
なお他の一態様では、本発明は、標的ＤＮＡ分子を断片化するためのｉｎ ｖｉｔｒｏの方法を提供する。この方法は、標的ＤＮＡ分子を上述のトランスポザーゼ複合体と接触させて、反応混合物を形成するステップと、転位反応を実施するための条件下でこの反応混合物をインキュベートするステップとを含む。この標的ＤＮＡ分子は、低い数の細胞数、例えば、１〜１０細胞、１〜３細胞もしくは１つの単一細胞、または染色体からなるサンプルから得ることができる。
本発明は、標的ＤＮＡ分子の配列決定またはマイクロアレイ分析のためにアッセイサンプルを調製するための方法をさらに提供する。この方法は、標的ＤＮＡ分子を、上記単離された合成核酸アダプターおよびこのアダプターに結合するトランスポザーゼを有する複合体と接触させて、反応混合物を形成するステップと、転位反応を実施するための条件下でこの反応混合物をインキュベートして、切断されたＤＮＡ産物を生成するステップと、この切断されたＤＮＡ産物を増幅するステップとを含む。本明細書で開示する場合、このアダプターの優越性に起因して、増幅するステップの前にアダプターを除去する必要性は存在しない。即ち、この増幅するステップは、アダプターを事前に除去することなく実施される。
マイクロアレイのためのＤＮＡサンプル調製の方法もまた提供される。この方法は、サンプルＤＮＡ分子を、本明細書に開示される単離された合成核酸アダプターおよびこのアダプターに結合するトランスポザーゼを有する複合体と接触させて、反応混合物を形成するステップと、転位反応を実施するための条件下でこの反応混合物をインキュベートして、サンプルＤＮＡ分子のＤＮＡ断片を生成するステップとを含む。このアダプターは、オリゴヌクレオチドタグを有し、これらのＤＮＡ断片は、このオリゴヌクレオチドタグで両方の末端においてタグ化される。この方法は、このオリゴヌクレオチドタグに対して相補的なプライマーを使用してＤＮＡ断片を増幅するステップをさらに含み得る。このタグは、このタグに対して相補的なプライマーの着地部位として使用され得る。この１または複数のプライマーは、フルオロフォアで標識化された少なくとも１つのｄＮＴＰを含むｄＮＴＰ混合物を使用するポリメラーゼ反応において伸長され得る。
本発明の１または複数の実施形態の詳細は、以下の説明および図面中に示されている。本発明の他の特徴、目的および利点は、説明、図面および特許請求の範囲から明らかである。
一方の鎖のみが示された、アダプター中の第１の位置（Ｃ）が保存された、トランスポザーゼの、ネイティブＩＲＬおよびＩＲＲ、ならびに改変されたアダプターのリストを示す図であり、異なる色は、異なるアダプターにおける類似性および差異を示す。各配列の後ろの括弧中の数字は、その配列についての配列番号を指す。 ＤＤＥモチーフを有するＴｎ５トランスポザーゼの触媒部位、およびアダプターを示す略図を示す図である。保存されたＣ（図１中に示される１位）および反対のアダプター鎖上の保存されたＧに下線を付す。 （Ａ）Ｖｉｂｈａｒトランスポザーゼの第１および第２のアダプター配列を含む親アダプター二重鎖、ならびに（Ｂ）複数の改変されたアダプターを、模式的に示すリストを示す図であり、上の鎖および下の鎖は、それぞれ、上述の第１の配列および第２の配列に対応する。各配列の後ろの括弧中の数字は、その配列についての配列番号を指す。 （Ａ）「高活性」Ｔｎ５トランスポザーゼの親アダプター、および（Ｂ）複数の改変されたアダプターを模式的に示すリストを示す図であり、上の鎖および下の鎖は、それぞれ、上述の第１の配列および第２の配列に対応する。各配列の後ろの括弧中の数字は、その配列についての配列番号を指す。 ヌクレオチドの置換および付加に基づく、Ｖｉｂｈａｒトランスポザーゼのアダプターの例を示す略図を示す図である。（Ａ）親アダプター、（Ｂ）１位における変化／付加に基づいて番号を振ったアダプター、および（Ｃ）誘導体アダプターの例。各配列の後ろの括弧中の数字は、その配列についての配列番号を指す。 高いＤＮＡインプットにおけるＮＧＳのためのサンプル調製における複数のアダプターの活性の評価を示す略図を示す図である。異なるアダプターをロードしたＶｉｂｈａｒトランスポザーゼを使用して生成したＮＧＳサンプルを、２％アガロースゲルにおいて分離し、エチジウムブロマイドで染色した。 他の誘導体アダプターおよび親アダプター１と比較した、高いＤＮＡインプットにおけるアダプター８のより高い活性の確認を示す略図を示す図である。異なるアダプターをロードしたＶｉｂｈａｒトランスポザーゼを使用して生成したＮＧＳサンプルを、２％アガロースゲルにおいて分離し、エチジウムブロマイドで染色した。 中間の（ＡおよびＢ）および低い（ＣおよびＤ）ＤＮＡインプットにおけるＮＧＳのためのサンプル調製における複数のアダプターの活性の評価を示す略図のセットを示す図である。異なるアダプターをロードしたＶｉｂｈａｒトランスポザーゼを使用して生成したＮＧＳサンプルを、２％アガロースゲルにおいて分離し、エチジウムブロマイドで染色した。 異なるトランスポザーゼ濃度（Ａ−５ｕｇ／ｍｌ、Ｂ−１．７ｕｇ／ｍｌ、Ｃ−０．５６ｕｇ／ｍｌ）における、親アダプター１と比較した、アダプター８によってトランスポザーゼに付与されたより高い活性の確認を示す略図を示す図である。０−トランスポザーゼなしの陰性コントロール。異なるアダプターをロードしたＶｉｂｈａｒトランスポザーゼを使用して生成したＮＧＳサンプルを、２％アガロースゲルにおいて分離し、エチジウムブロマイドで染色した。 親アダプター１、ならびにＤＮＡを添加しなかった場合の背景なし（ＮＣ）と比較した、低いＤＮＡインプットにおける、アダプター８によってトランスポザーゼに付与されたより高い活性の確認を示す略図を示す図である。異なるアダプターをロードしたＶｉｂｈａｒトランスポザーゼを使用して生成したＮＧＳサンプルを、２％アガロースゲルにおいて分離し、エチジウムブロマイドで染色した。 異なるアダプターおよびそれらの混合物によってＶｉｂｈａｒトランスポザーゼに付与された重複率を示す略図を示す図である。 異なるアダプターによってＶｉｂｈａｒトランスポザーゼに付与されたＡＴドロップアウトを示す略図を示す図である。 いくつかの先行技術のオリゴヌクレオチド、ならびにＡｇＰ１、ＡｇＰ２、３ｉｌｂ、８ｉｌｂ、３ｉ０、８ｉ０、３Ｕ２、８Ｕ２、３Ｕ４、８Ｕ４、３ｉ０＊ｄＴおよび８ｉ０＊ｄＴ（それぞれ、配列番号７９〜９０）を含む本発明のいくつかの例示的な改変されたオリゴヌクレオチドを示す図である。（Ａ）ＤＮＡ挿入物、即ち、３ｉｌｂ／３ｉ０および８ｉｌｂ／８ｉ０アダプターでタグ化されたＤＮＡ断片、ならびにＰＣＲにおけるＤＮＡ断片の増幅のためのＡｇＰ１およびＡｇＰ２プライマーを含む、トランスポザーゼ反応の典型的産物の例。ＤＮＡ挿入物の両方の側にギャップが示される。ギャップ中の矢印は、ギャップのＤＮＡポリメラーゼ修復の方向を示す。（Ｂ）先行技術のアダプターおよび改変されたアダプター。矢印の実線部分は、ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドを示す。破線部分は、伸長された部分、即ち、ＤＮＡポリメラーゼによってコピーされた部分を示す。太字のＸは、妨害または遮断されたＤＮＡポリメラーゼ伸長を示す。ｄＵ：デオキシウリジン；ＩｎｖｄＴ：逆方向チミジン；およびアスタリスク：ホスホロチオエート結合。 ＳＰＲＩ精製なしのトランスポザーゼ反応からの直接的なトランスポザーゼ反応産物の増幅を示す写真を示す図である。（Ａ）トランスポザーゼ反応を、標的ＤＮＡなしであるが、アダプター対１、３または４をロードしたＶｉｂｈａｒトランスポザーゼを用いて、２５分間実施した。（Ｂ）ヒトＤＮＡ（２０ｕｌ当たり２０ｎｇ）を、アダプター対１、３または４をロードしたＶｉｂｈａｒトランスポザーゼを用いて、断片化し、２０分間または４５分間、トランスポザーゼ反応においてタグ化した。 高い標的ＤＮＡインプット（２０ｕｌ当たり２００ｎｇ）のトランスポザーゼ反応後の、ＳＰＲＩ精製ありまたはなしで得られたＰＣＲ産物の比較を示す写真を示す図である。 ＡｇＰ１、ＡｇＰ２、３ｉｌｂ、８ｉｌｂ、３ｉｌｔおよび８ｉｌｔ（それぞれ、配列番号７９、１１６、８１、８２および９１〜９２）を含む、標準的アダプターを示す略図およびＮＧＳのためのサンプル調製の模式図を示す図である。Ｐ５およびＰ７は、Ｉｌｌｕｍｉｎａフローセルへの結合に必要な部分を示す。 １５分間、２５分間または４２分間にわたる、５０ｎｇ／ｍｌおよび１００ｎｇ／ｍｌのトランスポザーゼ（それぞれ、「Ａ」および「Ｂ」）と共に標準的アダプターを使用した、ＤＮＡの断片化およびタグ化の時点で観察されたヌクレアーゼ活性を示す写真を示す図である。 ２０ｐｇのヒトＤＮＡインプット（約３つの二倍体細胞に対応する）を用いた、異なるトランスポザーゼ濃度、即ち、Ａ−１８０ｎｇ／ｍｌ、Ｂ−１２０ｎｇ／ｍｌ、Ｃ−８０ｎｇ／ｍｌにおける、アダプター７８を使用したトランスポザーゼＤＮＡの断片化およびタグ化におけるヌクレアーゼ活性の非存在、ならびにそのホスホロチオエート誘導体（アダプターＥ８）によって付与された増加したトランスポザーゼ活性を示す写真を示す図である。 トランスポザーゼアダプターの誘導体を示す図である。（Ａ）アダプター７８のホスホロチオエート誘導体の例、（Ｂ）標準的アダプターのホスホロチオエート誘導体（図１６上に示されるものに対する上の鎖のみが示される）、ならびに（Ｃ）誤対合、逆方向ｄＴおよびｄＵ改変と組み合わせたホスホロチオエートアダプター。括弧中の数字は、配列番号を指す。 Ｉｌｌｕｍｉｎａ機器でのＮＧＳ配列決定に適切なサンプル調製のための４プライマーＰＣＲ反応における、アダプター７８またはその誘導体のＰＣＲ増幅のためのプライマーを示す図である。Ｐ５およびＰ７は、Ｉｌｌｕｍｉｎａフローセルへの結合に必要な部分を示す。括弧中の数字は、配列番号を指す。 マイクロアレイのためのサンプル調製における、ＤＮＡの断片化／タグ化（Ａ）、増幅（Ｂ）、および標識化（Ｃ）を示す略図のセットを示す図である。 マイクロアレイのための、トランスポザーゼ反応において断片化およびタグ化され、それらのタグに対して相補的なプライマーを用いてＰＣＲにおいて増幅されたヒトＤＮＡを示す写真を示す図である。Ａ：１６ｐｇのＤＮＡインプット、および、Ｂ：２００ｎｇのＤＮＡインプット。
本発明は、複数の単離された合成核酸トランスポザーゼアダプターの予測されなかった発見に、少なくとも一部基づく。これらの合成アダプターは、ほとんどの保存された部位において公知の機能的トランスポザーゼアダプター（ネイティブまたは改変されたものの両方）とは異なるが、これらの合成アダプターは、活性を保持し、そのうちいくつかは、さらに高い活性を有し、ＮＧＳのために使用される場合、増加したランダムさ、低減された重複率またはそれら両方を生じることは、驚くべきことであった。一部の実施形態では、選択されたトランスポザーゼに異なる特性を付与する複数の有用なアダプターが、ネイティブアダプターにおける保存された１位を改変させることによって生成され得ることが実証された。アダプターへのいくつかの改変により、時間のかかるアダプターの除去なしにＮＧＳのためのＤＮＡサンプルを調製することが可能になり、および／または非常に低い量のＤＮＡを有するサンプルを処理することが可能になることを見出したこともまた、驚くべきことであった。
アダプター
本発明は、それぞれ上述の第１の配列および第２の配列を含むか、またはかかる配列から本質的になるか、またはかかる配列からなる、第１の鎖および第２の鎖を含む単離された合成核酸アダプターを提供する。この第１の配列および第２の配列は、互いに対して完全に相補的または実質的に相補的であり、このアダプターは、トランスポザーゼによって認識される。
上述のように、トランスポザーゼは、単離されたタンパク質としては作用しないが、特異的ＤＮＡ配列またはアダプターとの複合体で作用し、これらは、トランスポザーゼと共に安定な複合体を形成でき、従って、それらを活性にできる。これらのアダプターは、天然に見出されるトランスポザーゼ認識配列であり得、または改変されたネイティブ配列でもあり得る。従来より、通例、１つのかかる配列のみが、特異的トランスポザーゼとの使用に推奨されている。例えば、より活性に、より安定にかつより良く発現されるように変異された「高活性」Ｔｎ５トランスポザーゼは、これもまたネイティブ配列から変異された「モザイク」配列（アダプター）を認識し、この配列のみが、このトランスポザーゼとの使用に推奨されている（Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．１９９８，２７６（５）：９１３−２５；Ｂｒｏｕｉｌｅｔｔｅ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖ Ｄｙｎ．２０１２，２４１（１０）：１５８４−９０）。
トランスポザーゼのＤＤＥアミノ酸モチーフは、触媒部位の一部であることが公知であり、トランスポザーゼ活性に必要である（Ｎｅｓｍｅｌｏｖａ ａｎｄ Ｈａｃｋｅｔｔ，Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ．２０１０，３０；６２（１２）：１１８７−９５；Ｓｔｅｉｎｉｇｅｒ−Ｗｈｉｔｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｓｔｒｕｃｔ Ｂｉｏｌ．２００４，Ｆｅｂ；１４（１）：５０−７）。ＤＤＥモチーフとそれに近接してのアダプターの存在との両方が活性に必要であるので、本発明者は、複合体の特性が、ＤＤＥモチーフに近い触媒部位に位置付けられたアダプター中のヌクレオチドを変化させることによって適切にモジュレートできると認識した。しかし、厳密に保存されたＤＤＥモチーフと同様に、触媒部位に最も近いアダプター中のヌクレオチドもまた厳密に保存されているということが、当該分野で公知であった。そのために、図１は、トランスポザーゼのいくつかの公知のネイティブおよび改変されたアダプターを列挙し、一方の鎖のみが示される。この図に示すように、これらのアダプター中の第１の位置におけるＣは、異なるアダプターの全てにおいて保存されている。
本明細書で使用する場合、用語「アダプター」とは、それが引き続いて接続される核酸断片を取り扱う手段を提供する、非標的核酸成分、一般にはＤＮＡを指す。例えば、実施形態では、アダプターは、（例えば、ＤＮＡポリメラーゼによる伸長のためのプライマーなどのオリゴヌクレオチドをアニーリングするための部位、または捕捉のためもしくはライゲーション反応のためのオリゴヌクレオチドを提供することによって）このアダプターが結合されるＤＮＡの同定、認識および／または分子的操作もしくは生化学的操作を可能にするヌクレオチド配列を含む。本明細書で開示する場合、本発明のアダプターは、（ｉ）トランスポザーゼのネイティブもしくは公知の認識配列の改変されたバージョンである第１の配列を有する第１の鎖、および／または、（ｉｉ）認識配列の相補体の改変されたバージョンである第２の配列を有する第２の鎖を有する。アダプターの鎖のうちの一方は、ネイティブであり得、もう一方の鎖は、改変（複数可）を含み得る。
用語「トランスポザーゼの認識配列」、「トランスポザーゼ認識配列」、「トランスポザーゼ結合配列」および「トランスポザーゼ結合部位」は、転位を媒介する場合にトランスポザーゼが特異的に結合するトランスポゾン末端配列内に見出されるヌクレオチド配列を指すために、本明細書で相互交換可能に使用される。トランスポザーゼ結合配列は、トランスポザーゼサブユニットに結合するための１つよりも多い部位を含み得る。
「トランスポザーゼ」とは、トランスポゾン末端含有組成物（例えば、トランスポゾン、トランスポゾン末端、トランスポゾン末端組成物）と共に機能的複合体を形成することが可能であり、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏでの転位反応において共にインキュベートされる二本鎖標的ＤＮＡ中へのトランスポゾン末端含有組成物の挿入または転位を触媒することが可能な酵素を指す。
用語「トランスポゾン末端」は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏでの転位反応において機能的であるトランスポザーゼまたはインテグラーゼ酵素と共に複合体を形成するために必要なヌクレオチド配列（「トランスポゾン末端配列」）のみを示す二本鎖ＤＮＡを意味する。トランスポゾン末端は、「複合体」、「シナプス複合体」または「トランスポソーム複合体」を形成する。トランスポゾン末端は、（ｉ）「移行されるトランスポゾン末端配列」または「移行される鎖」および（ｉｉ）「移行されないトランスポゾン末端配列」または「移行されない鎖」からなる２つの相補的配列を示す。例えば、Ｖｉｂｈａｒトランスポザーゼのいくつかのトランスポゾン末端／アダプターを、図３に示す。各々における上の鎖（例えば、Ｖｉｂｈａｒ ＩＲＲについて５’−ＣＴＧＴＣＴＣＴＴＧＡＴＣＡＣＡＡＧＴ−３’、配列番号２）は、移行されないトランスポゾン末端配列を示す移行されない鎖であるが、下の鎖（例えば、Ｖｉｂｈａｒ ＩＲＲについて３’−ＧＡＣＡＧＡＧＡＡＣＴＡＧＴＧＴＴＣＡ−５’または５’−ＡＣＴＴＧＴＧＡＴＣＡＡＧＡＧＡＣＡＧ−３’、配列番号２２）は、移行されるトランスポゾン末端配列を示す移行される鎖である。同様に、図４では、各々における上の鎖（例えば、モザイク（改変されたＴｎ５）について５’−ＣＴＧＴＣＴＣＴＴＡＴＡＣＡＣＡＴＣＴ−３’、配列番号６）は、移行されない鎖であるが、下の鎖（例えば、モザイク（改変されたＴｎ５）について５’−ＡＧＡＴＧＴＧＴＡＴＡＡＧＡＧＡＣＡＧ−３’、配列番号４８）は、移行される鎖である。本明細書で使用する場合、用語「第１の鎖」とは、移行されない鎖を指し、図３〜５において、かかる第１の鎖／移行されない鎖は、各アダプターについて上の鎖として示される。用語「第２の鎖」とは、移行される鎖を指し、図３〜５において、かかる第２の鎖／移行される鎖は、各アダプターについて下の鎖として示される。野生型トランスポゾン末端では、移行されない／第１の／上の鎖は、その５’末端において保存的Ｃを有し、対応する移行される／第２の／下の鎖は、その３’末端において保存的Ｇを有する。図１３、１６、１８、１９および２１では、移行されない／第１の鎖は、各アダプターについて下の鎖として示され、対応する移行される／第２の鎖は、各アダプターについて上の鎖として示される。図１では、移行されない／第１の鎖のみが示され、その全てが、５’末端または１位において保存的Ｃを有する。
本明細書で使用する場合、「１位」とは、図１に示される野生型トランスポゾン末端の移行されない／第１の鎖上の５’末端Ｃヌクレオチドに対応する位置、および例えば図３〜５に示される対応する移行される／第２の鎖／下の鎖上の３’末端Ｇヌクレオチドに対応する位置を指す。また、図２に示され下線が付されるように、１位（移行されない／第１の上の鎖のＣおよび移行される／第２の鎖／下の鎖のＧ）は、トランスポザーゼの触媒部位にある。
上述のように、一部の実施形態では、本発明のアダプター内の第１および第２の配列は、互いに対して相補的または実質的に相補的である。本明細書で使用する場合、特記しない限り、用語「相補的」または「実質的に相補的」は、第２のヌクレオチド配列に関して第１のヌクレオチド配列を記述するために使用される場合、第１のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドが、当業者に理解される条件下で、第２のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドとハイブリダイズし、二重鎖構造を形成する能力を指す。
これは、第１のヌクレオチド配列および第２のヌクレオチド配列の全長にわたる、第１のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの、第２のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドとの塩基対合を含む。かかる配列は、本明細書で、互いに対して「完全に相補的」であると言われ得る。しかし、一部の実施形態では、第１のヌクレオチド配列および第２のヌクレオチド配列は、特記しない限り、互いに対して実質的に相補的であり得、互いに対して少なくとも約８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％相補的である。本明細書で使用する場合、第１の配列が、本明細書で第２の配列に対して「実質的に相補的」と言われる場合、これら２つの配列は、完全に相補的であり得、またはこれらは、それらの最終適用に最も適切な条件下でハイブリダイズする能力を保持しつつ、ハイブリダイゼーションの際に、１９〜２１ｂｐの長さにわたって、１もしくは複数であるが、一般には例えば４、３、２もしくは１つ以下のミスマッチした塩基対、好ましくは２または１つのミスマッチした塩基対を形成し得る。しかし、２つのオリゴヌクレオチドが、ハイブリダイゼーションの際に、１または複数の一本鎖オーバーハングを形成するように設計される場合、かかるオーバーハングは、相補性の決定に関してミスマッチとみなすべきではない。
「相補的」配列は、本明細書で使用する場合、それらがハイブリダイズする能力に関して上記要求が満たされる限り、Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ塩基対、非Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ塩基対ならびに／もしくは非天然のおよび改変されたヌクレオチドから形成される塩基対を含み得、またはかかる塩基対から完全に形成され得る。
Ａ．１位において改変を有するアダプター
一実施形態では、本発明のアダプターは、一般にトランスポザーゼのネイティブまたは公知の認識配列の改変されたバージョンである配列を有する鎖を有する。ネイティブまたは公知の認識配列の１位における厳密に保存された性質に起因して、これらのヌクレオチドを変化させることによってトランスポザーゼ複合体の特性をモジュレートする課題は、人を萎縮させるように思われた。実際、保存されたＤＤＥモチーフにおける変化が、トランスポザーゼを完全に不活性にし、従って回避すべきであるのと全く同じように、厳密に保存されたヌクレオチド位置における変化の結果、活性における鋭い低下が不可避的に生じることが、当該分野で十分に理解された。
しかし、性質における選択は、これらの保存された位置における未対合のヌクレオチドまたは改変されたヌクレオチドとしての、アダプターにおけるかかるバリエーションに対しては適用されてこなかったので、本発明者は、厳密に保存されたヌクレオチド位置におけるいくつかの変化が活性と適合性であり得ることを、予期せず見出した。かかる変化が天然においてまれに生じ得るとしても、それらは迅速に修復される。従って、子孫においてそれらを保存する機構は存在しない。これらの位置は、保存されており、従って、トランスポザーゼ活性をモジュレートするために非常に重要であるが、それらに対する選択圧が存在しないいくつかの変化を導入することが可能でなければならず、従って活性をモジュレートすることが可能でなければならない。そのために、どのヌクレオチド変化の結果、どの型のモジュレーション、例えば、より高いまたはより低い活性、高度に希釈された状態での活性（低いインプットの適用）、ＡＴまたはＧＣリッチなヌクレオチド配列のより可能性の高い認識、複合体の安定性、固体支持体上での活性、半精製または粗製サンプルにおける活性、ならびに種々のｉｎ ｖｉｔｒｏ反応条件（ｐＨ、温度、Ｍｎ＋＋またはＭｇ＋＋濃度、塩（例えば、ＮａＣｌおよびＫＣｌ）、グリセロールなど）におけるまたはｉｎ ｖｉｖｏ適用（送達ビヒクル、細胞型、オルガネラ型）次第での、上記したものの顕在化の程度が生じるかは、先験的には明らかでない。しかし、本明細書の開示を考慮すると、当業者は、当業者が自由に使える複数の適切なアダプターの利益を即座に認識し、プロジェクトおよび当業者が解決を望む具体的な問題次第で、最も適切なアダプターを選択するための実験を設計する。かかるプロジェクトおよび実験設計の例は、以下に実証される。
本発明のアダプターは、トランスポザーゼのネイティブまたは公知の認識配列と比較して、種々の変化を有し得る。転位事象におけるカットに最も近く（天然ではトランスポゾンの内側に面する）、同じファミリーのトランスポザーゼにおいて保存されているヌクレオチド位置、例えば、図１に示される１位が、改変に好ましい。２位および／または３位もまた改変され得るが、例えば、図２においてＴｎ５トランスポザーゼについて示されているように、１位は、カットに隣接しており、触媒部位中に位置付けられるので、トランスポザーゼ特性をモジュレートするために最も重要であるので、これらはあまり好ましくない。Ｖｉｂｈａｒトランスポザーゼについて図３に、「高活性」Ｔｎ５トランスポザーゼについて図４に示すように、この１位は、いずれかの鎖もしくは両方の鎖上の１つのヌクレオチドをネイティブもしくは改変されたヌクレオチドに置換することによって、または少なくとも１つのネイティブもしくは改変されたヌクレオチドを、一方または両方の鎖に付加することによって、または一方の鎖から少なくとも１つのヌクレオチドを除去することによって、あるいは上記の組み合わせによって、改変され得る。
Ｂ．プライマー伸長を妨害する改変を有するアダプター
別の一実施形態では、本発明のアダプターは、ＰＣＲ反応などにおけるプライマー伸長を妨害する１または複数の改変を有する。かかるアダプターは、トランスポザーゼを使用するＮＧＳのためのＤＮＡサンプルの調製に有用である。
従来、ＮＧＳのためのＤＮＡサンプルの調製には、オリゴヌクレオチドアダプターがロードされたトランスポザーゼを使用した標的ＤＮＡの断片化およびタグ化、その後の、未使用のアダプターからのタグ化されたＤＮＡ断片の精製、ならびに断片のＰＣＲ増幅が関与する。これまでのところ、例えば、Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ Ａｍｐｕｒｅ ＸＰ ＳＰＲＩ磁性ビーズ（Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ）またはＲＮＡ結合ナノスピンカラム（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、かなり小さいアダプターからより大きいサイズのＤＮＡ断片を精製することが必要であった。精製ステップを省略するための試みは、標的ＤＮＡの増幅を事実上生じなかったか、または所望のＤＮＡ断片の非常に低い収量を生じたかのいずれかであった。その代り、おそらくはアダプター−プライマーダイマーを含む小さいサイズの副産物（典型的には１００ｂｐ未満）が産生された。本質において、かかるＰＣＲ反応は、標的ＤＮＡ断片ではなく、これらの副産物の優先的な増幅によって「毒される」。
本明細書で開示する場合、プライマー伸長を妨害する１または複数の改変を有するアダプターは、トランスポザーゼ反応の後に上述の精製ステップを無効にすることによって、ＮＧＳサンプル調製を単純化することを可能にする。これは、ＮＧＳサンプル調製を、より速く、あまり高価でなく、自動化により従いやすいものにする。
トランスポザーゼを使用するＤＮＡの断片化およびタグ化のための一般的な方法および組成物は、当該分野で公知である。例えば、米国特許出願公開第２０１２０３０１９２５号を参照のこと。例えば、ビブリオ・ハーベイ（Ｖｉｂｈａｒ）トランスポザーゼ認識配列を含む１９ｂ．ｐ．のオリゴヌクレオチドが、かかるオリゴヌクレオチド／アダプターと共に複合体を形成し得るトランスポザーゼ上に「ロードされ」得る。標的ＤＮＡと混合される場合、ロードされたトランスポザーゼは、図１３Ａに示すように、標的ＤＮＡを切断し、アダプターによってそれらの断片（ＤＮＡ挿入物）をタグ化する。二本鎖の１９ｂｐ領域に加えて、アダプターは、ＰＣＲプライマーの着地部位を提供できる一本鎖領域を含み得る。図１３Ａに示すように、ＰＣＲプライマーＡｇＰ１およびＡｇＰ２は、Ｉｌｌｕｍｉｎａフローセル部位のためのＤＮＡ配列、Ｐ５およびＰ７を含む。
トランスポザーゼ反応の典型的な産物もまた、図１３Ａに模式的に示される。この図に示すように、アダプター（ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチド３ｉｌｂ／３ｉ０および８ｉｌｂ／８ｉ０）は、標的ＤＮＡ断片（ＤＮＡ挿入物）の末端に結合される。ＤＮＡ挿入物は、オリゴヌクレオチド３ｉｌｂおよび８ｉｌｂにおいて、アダプターに接続される。これは、プライマーＡｇＰ１およびＡｇＰ２を使用して、ＰＣＲにおいて増幅される。しかし、ＤＮＡ挿入物の両方の末端上にはギャップが存在する。このギャップは、３ｉ０および８ｉ０オリゴヌクレオチドの置換を生じるＰＣＲステップにおいて修復される（ギャップ中の矢印）。本発明者は、ＰＣＲステップにおいて、置換されたオリゴヌクレオチドが、互いと、ならびにＡｇＰ１およびＡｇＰ２ ＰＣＲプライマーと相互作用し得、そうしてアダプター−プライマーダイマーを形成すると仮説を立てた。本発明者はまた、３ｉ０および８ｉ０オリゴヌクレオチドはトランスポザーゼ反応ステップにおいてのみ有用であり、さらなる使用を有さないので、かかる改変がトランスポザーゼ反応を妨害しない限り、これらが、ダイマーの生成を妨害するように改変され得るとも仮説を立てた。
以下の実施例４に示すように、ＤＮＡポリメラーゼを止める少なくとも１つの改変を、アダプターの少なくとも１つの鎖中に導入した。増幅のためにしばしば使用されるＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼは、ｄＵ残基上で止まるので（Ｈｏｇｒｅｆｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９９（２），５９６−６０１，２００２．）、ｄＵ改変を、アダプター対２および３中に導入した（図１３Ｂ）。ＰＣＲにおけるアダプターの下の鎖（オリゴヌクレオチド３Ｕ２、８Ｕ２、３Ｕ４および８Ｕ４）のコピーを妨害するために、改変を、ＰＣＲプライマーＡｇＰ１およびＡｇＰ２の着地部位の下流に導入した。従って、アダプターのコピーおよび増幅は止まるが、ギャップ修復の後、タグ化されたＤＮＡ断片は改変されたヌクレオチドを含まないので、標的ＤＮＡ断片の増幅は妨害されずに進行する。ポリメラーゼを止める他の改変、例えば、Ｐｆｕポリメラーゼを止める脱塩基部位または２’ＯＭｅで改変されたＲＮＡが、この目的のために、当業者によって使用され得る（例えば、米国特許第７，６５９，０６９号を参照のこと）。同様に、ポリメラーゼを止める任意の改変が使用され得、それらがトランスポザーゼ反応を妨害しない限り、互いに組み合わされ得る。
別のアプローチもまた、同じ目的のために使用され得る。より具体的には、改変されたヌクレオチドが、アダプター鎖に結合され得る。図１３Ｂおよび以下の実施例４に示すように、標準的アダプター対１を用いると、オリゴヌクレオチドＡｇＰ１およびＡｇＰ２は、鋳型として機能し、それらにハイブリダイズした状態で、オリゴヌクレオチド３ｉ０および８ｉ０は、プライマーとして機能し、それによって、ＰＣＲ反応において望ましくない副産物を生成する。本発明者は、これが、アダプター−プライマーダイマーの生成に寄与し得ると仮説を立てた。従って、アダプターの下の鎖の３’末端を、このプロセスを妨害するために、逆方向ｄＴで遮断した（図１３Ｂ、アダプター対４）。さらに、この逆方向ｄＴには、ＤＮＡポリメラーゼ３’エキソヌクレアーゼ活性による逆方向ｄＴの除去を防止するために、ホスホロチオエート結合が先行し得る。他のアプローチ、例えば、スペーサーが逆方向ｄＴまたは他の３’遮断基に先行することが、同じ目的のために使用され得る。このために、多くの３’遮断基が、本明細書の開示を考慮して使用され得る。
本発明において開示されるオリゴヌクレオチド改変の適用は、トランスポザーゼを使用するゲノムＤＮＡサンプル調製に限定されない。これらは、ＰＣＲ、例えば、ＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔ、ＨａｌｏＰｌｅｘ、超音波処理を使用するゲノムＤＮＡサンプルプレップなどを実施するために、合成オリゴヌクレオチドからの標的核酸断片の精製を現在必要としている他の技術において、アダプター／タグ／ベクター精製ステップを排除するために適用され得る。特に、単一細胞適用は、本発明から利益を得うる。ＳＰＲＩ精製を含む精製ステップで、１００％効率的なものは存在しない。従って、初期ゲノム材料のいずれの喪失も、ゲノムカバー率にとって有害であり、その結果対立遺伝子ドロップアウトが生じるので、ＰＣＲ増幅前の精製ステップを無効にすることは有益である。
Ｃ．ホスホロチオエート結合を有するアダプター
なお別の一実施形態では、本発明のアダプターは、１または複数のホスホロチオエート結合を有する。かかるアダプターは、非常に低い初期インプットのＤＮＡからの、例えば、低い数の細胞、即ち、１つの単一細胞または数個の細胞（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個の細胞）からの、ＮＧＳ配列決定またはマイクロアレイ分析のためのサンプル調製に有用である。
標準的Ｖｉｂｈａｒアダプターおよびトランスポザーゼを使用する典型的なＮＧＳ配列決定サンプル調製では、これらのアダプターは、トランスポザーゼによって認識される１９ｂｐの二本鎖部分を含み、ＰＣＲプライマーの着地部位として使用される一本鎖部分もまた含む。例えば、図１６および米国特許出願公開第２０１２／０３０１９２５号を参照のこと。トランスポザーゼ反応では、インプットＤＮＡが切断され、得られた断片は、アダプターによって両方の末端においてタグ化される。次に、ＤＮＡ断片は、アダプター配列に対して相補的なプライマーを使用するＰＣＲにおいて増幅される。同時に、これらの断片には、例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａフローセル結合部位Ｐ５およびＰ７への結合に重要なＤＮＡ配列が提供される。Ｖｉｂｈａｒトランスポザーゼ、アダプター設計、トランスポザーゼ−アダプター複合体を形成する方法および組成物、インプットＤＮＡの断片化およびタグ化の機構は、当該分野で公知である。例えば、米国特許出願公開第２０１２／０３０１９２５号を参照のこと。
Ｖｉｂｈａｒトランスポザーゼ調製物は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発現宿主、または（以下で議論するように）弱い固有の非特異的ヌクレアーゼ活性のトランスポザーゼのいずれかに起源し得る微量のヌクレアーゼ活性を含む。これは、数千のヒト細胞由来の通常のＤＮＡインプットでは大した問題を提示しないが、低いＤＮＡインプットでは許容できない。図１７に示すように、３つの細胞由来のＤＮＡを用いると、満足な収量の適切なＤＮＡ断片が、２５分間のトランスポザーゼ反応の後に観察されたが、ＮＧＳのために望ましいサイズ範囲の断片（２００〜５００ｂｐ）は、反応の４２分の時点において、ほぼ完全に消失した。これは、トランスポザーゼ反応の２５分の時点においてさえも、適切な材料の喪失がかなりのものであり得、５０％以上の量になり得ることを暗示しており、これは、低いＤＮＡまたは細胞数のインプットを用いたＮＧＳ配列のためには許容できない。
ホスホロチオエート結合は、ヌクレアーゼ攻撃に対する耐性を付与することが、当該分野で公知であった。例えば、参照によって本明細書に組み込まれる、Ｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１６：８，３２０９−３２２１，１９８８を参照のこと。アダプターは、断片の両方の末端に結合されるので、アダプター中にかかる結合を含めることは、エキソヌクレアーゼ攻撃に対する保護のために有用であり得る。しかし、先験的には、アダプターにおける非天然の結合がトランスポザーゼ反応においてアダプターを不活性にするか否かは、明らかではなかった。実際、ホスホロチオエート結合は、天然ではなく、かかる結合を含むＤＮＡは、天然のホスホジエステル結合のみを含むＤＮＡよりも、酵素にとって効率的な基質ではないことが観察された（Ｃｉａｆｒｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２３：２０，４１３４−４１４２）。
以下の実施例５に示すように、ホスホロチオエート結合を、トランスポザーゼ活性を不必要に苦しめることなしにヌクレアーゼに対する保護を付与するために、アダプターの一方の鎖（移行される鎖）中にのみ、控えめに導入した。予想外に、ホスホロチオエート結合の組み合わせ（例えば、アダプターＥ８）が、トランスポザーゼ反応効率における大きな改善を付与したことが見出された（図１８）。
アダプターの移行される鎖のみがＤＮＡ断片に結合されるので、ホスホロチオエート結合は、その鎖中に導入され、標的ＤＮＡ断片からギャップによって分離される相補的アダプター鎖は、ホスホロチオエート結合を含まない。本明細書に開示されるように、これらの鎖をＰＣＲ増幅に不適切なものにすることが有益であるので、ホスホロチオエート結合なしの鎖は、保護されない。
改善が、異なるトランスポザーゼ濃度ならびに異なるインキュベーション時間において、いくつかの実験において一貫して観察された。しかし、ほとんどの部分について、この改善は、ヌクレアーゼに対する保護には関連しなかった。実際、同じヌクレオチド配列を有するがホスホロチオエート結合を含まない短いアダプター７８では、ヌクレアーゼ分解は事実上観察されなかった（図１８）。標準的アダプターとは異なり、アダプター７８およびそのホスホロチオエート誘導体Ｅ８は、トランスポザーゼによって認識され、トランスポザーゼによって結合され、大部分が隠されてヌクレアーゼ攻撃から保護される可能性が高い、１９ｂｐの二重鎖のみからなる。ヌクレアーゼ活性は、標準的アダプターの単鎖部分を認識し、それが消化するＤＮＡ断片の内部へと反転するという可能性がある。かなりのサイズのタンパク質、例えば、トランスポザーゼダイマー（ＭＷ約１０２ＫＤ）が、かかる手技に必要である。大腸菌由来の常在性ヌクレアーゼはサイズが小さく、大腸菌は十分に研究されており、かかる活性は大腸菌では記載されてこなかったので、大腸菌由来の常在性ヌクレアーゼがＤＮＡ分解を担う可能性は低いと思われる。機構が何であれ、実務上の観点から、トランスポザーゼ反応の効率が、アダプターにホスホロチオエート結合を付加することによって大きく改善され得ることが、重要である。
本明細書で議論するように、トランスポザーゼ反応の効率における数倍の改善が、単一細胞ゲノムのほぼ完全なゲノムカバー率に必要である。本発明の改変されたアダプターは、この改善を達成させる。効率をさらに改善するために、ホスホロチオエート結合を再シャッフリング、付加または除去すること、ならびに本明細書に開示されるアダプターへの他の改変を含む、さらなる手段を採ることができる。この手順は、マイクロアレイ適用のためにも採用され得、ＰＣＲまたはＤＮＡ−リガーゼ反応のいずれかにおいてかかるタグを付加することによって、Ｉｌｌｕｍｉｎａまたは他の型の機器での配列決定に必要なタグを提供し得る。限定されない例として、Ｉｌｌｕｍｉｎａタグを提供するためのかかるアダプターおよびＰＣＲプライマーのいくつかは、図１９および２０に示される。
上に開示したアダプターは、低い数の細胞、例えば単一細胞由来の核酸を配列決定するための、当該分野における必要性に対処する。単一細胞配列決定は、いくつかの形態の癌のより良い理解、診断および処置にとって有望である。しかし、この分野における迅速な進歩にもかかわらず、これらの方法の全てにおいて高いエラー率が存在し、それらの方法には十分に良いものはないというコンセンサスが存在した。問題の１つは、単一細胞から得られた少量のＤＮＡが、配列決定またはマイクロアレイのために直接的に処理（断片化およびタグ化）されないことである。まず、高度に進行性のポリメラーゼがより多くのＤＮＡを生成するために縮重プライマーと組み合わせて使用され、次いで、増幅されたＤＮＡのみが処理される、全ゲノム増幅（ＷＧＡ）において、ＤＮＡが増幅される（Ｚｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｚｈｅｊｉａｎｇ Ｕｎｉｖ Ｓｃｉ Ｂ．２０１１ Ｊａｎ；１２（１）：１−１１；Ｈｏｕ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ．２０１３ Ｄｅｃ １９；１５５（７）：１４９２−５０６）。
エラーのほとんどがＷＧＡステップにおいて生じることは、一般に許容される。まず、誤りは、ポリメラーゼ読み取りの段階で生じるが、さらに重要なことには、ゲノムの一部の領域は、他の領域よりも効率的に増幅され、一部の領域は全く増幅されない。これは、遺伝子コピー数の分析を複雑にするバイアスを生じる。さらに悪いことに、これは、対立遺伝子ドロップアウトを生じる。この理由のために、単一癌細胞ゲノム配列決定は、染色体ＤＮＡからは稀にしか試みられない。その代り、癌細胞のトランスクリプトームの配列決定またはマイクロアレイ分析が実施される。遺伝子は、複数のｍＲＮＡコピーによって提示されることが多いので、トランスクリプトームに焦点を合わせることは、対立遺伝子ドロップアウト問題を緩和する（Ｌａｗｒｅｎｃｅ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ．２０１３ Ｊｕｌ １１；４９９（７４５７）：２１４−８）。しかし、これにより、癌細胞のタンパク質コード領域に主に関する情報が得られるが、遺伝子調節領域、例えば、プロモーター、エンハンサーおよびサイレンサーに関する情報は得られない。また、ほとんどの形態の癌および他の広範な複雑な疾患への素因などの複雑な形質を担う遺伝的およびエピジェネティックなバリエーションの大部分は、非コード調節領域中に局在化するので、これは、当該分野における必要性に対処しない（Ｍｉｔｃｈｉｓｏｎ Ａ． Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ．１９９７；４６（１）：４６−５２；Ｇａｆｆｎｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２０１２，１３：Ｒ７，１−１５；Ｋｎｉｇｈｔ ＪＣ．Ｃｌｉｎ Ｓｃｉ（Ｌｏｎｄ）．２００３ Ｍａｙ；１０４（５）：４９３−５０１；Ｓａｖｉｎｋｏｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｍｏｓｃ）．２００９ Ｆｅｂ；７４（２）：１１７−２９；Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ．２０１３ Ｍａｙ；３４（５）：１０１２−７；Ｅｌａｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ．２００９ Ｍａｒ；１７９２（３）：１６３−７２；Ｒｕｉｚ−Ｎａｒｖａｅｚ ＥＡ．Ｍｅｄ Ｈｙｐｏｔｈｅｓｅｓ．２０１１ Ｍａｙ；７６（５）：６３８−４２；Ｚａｂａｌｅｔａ Ｊ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２０１２；８６３：４１１−３５；Ｓｕｓａｎｔｉｔａｐｈｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｐｈｒｏｎ Ｃｌｉｎ Ｐｒａｃｔ．２０１２；１２２（３−４）：１０７−１３；Ｉｔｚｙｋｓｏｎ Ｒ，Ｆｅｎａｕｘ Ｐ．Ｌｅｕｋｅｍｉａ．２０１３ Ｎｏｖ １９．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｌｅｕ．２０１３．３４３］；Ｖｅｚｚｏｌｉ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ．２０１１ Ｎｏｖ ２２；９：２０１；Ｍａｒｔｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｄｉａｂｅｔｅｓ．２０１３ Ｊｕｌ；６２（７）：２６０５−１２；およびＣｌａｒｋ ＳＪ．Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ．２００７ Ａｐｒ １５；１６ Ｓｐｅｃ Ｎｏ １：Ｒ８８−９５）。
従来のアプローチの技術的制限に起因して、遺伝子プロモーターは配列決定されないので、癌の発達および他の広範な複雑な疾患への素因の両方にとって最も妥当である豊富な遺伝子調節情報は、トランスクリプトームに焦点を当ててはアクセスできないままである。トランスクリプトームを配列決定することは、発現量的形質遺伝子座（ｅＱＬＴ）としても公知の、疾患と相関し得る豊富な転写物に関する情報を提供する。しかし、同じ個々の遺伝子において、発現プロファイルは、細胞型によって大きく異なり、容易に入手可能な細胞、例えばリンパ球の発現プロファイルは、有用でない場合が多い。例えば、脂肪組織における全ての遺伝子発現形質のうち５０％超は、血液における１０％未満と比較して、肥満と関連する臨床形質と強く相関した（Ｅｍｉｌｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２００８，４５２：４２３−４３０）。さらに、アルツハイマーにおける脳細胞などの最も妥当な細胞の生検は、利用可能でない場合がある。ゲノムＤＮＡの直接的配列決定は、これらの問題に対処することが理解されるが、現在、従来の単一細胞ゲノム配列決定技術の情況に起因して、実際的ではない。
個々の癌細胞のゲノムを配列決定することに加えて、単一細胞配列決定の別の適用は、非侵襲性出生前診断（ＮＩＰＤ）における適用である。母親の血液から単離された胎児の単一有核赤血球の分析は、１０億ドルを超えるＮＩＰＤ市場にとって有望である（Ｋａｎｔａｋ ｅｔ ａｌ．，Ｌａｂ Ｃｈｉｐ．２０１４ Ｍａｒ ７；１４（５）：８４１−５４）。現在、「小細胞数」技術の最も大きい商業的適用は、迅速な着床前遺伝子診断（ＰＧＤ）における適用である（Ｈａｒｐｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ．２０１３）。
ＰＧＤは、最も一般的には、胚発生の３日目における１〜２細胞または５日目の約５細胞（胚盤胞）のいずれかから実施される。最近、胚盤胞アプローチは、より信頼性が高い、即ち、より多くの細胞由来の材料に伴う対立遺伝子ドロップアウト問題がより少なく、胚盤胞段階におけるモザイク現象がより少なく、胚細胞ではなく栄養外胚葉細胞（胎盤細胞の先祖）が採取されるので胚への損傷がより少ないので、より多くの人気を得ていた（Ｈａｒｐｅｒ ａｎｄ Ｓｅｎｇｕｐｔａ．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ．２０１２ Ｆｅｂ；１３１（２）：１７５−８６）。過去において、分析は、ＰＣＲおよびＦＩＳＨ技術（同書）を使用して排他的に実施され、現在は、マイクロアレイおよびさらにはＮＧＳ技術に切り替わっている（Ｙｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｌ Ｒｅｐｒｏｄ．２０１３ Ｍａｒ ２１，８８（３）：６９；およびＺｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．２０１３，８（１）：ｅ５４２３６．）。この分析を実施するためには１〜５細胞由来の材料は十分でないので、マイクロアレイおよびＮＧＳ法の両方がＷＧＡを必要とする。しかし、ＷＧＡは、コピー数バリエーション（ＣＮＶ）概算を複雑化するバイアスの主な供給源であるだけでなく、ＰＧＤワークフローにおける時間の主要な割り当てでもある。ＰＧＤの適時性の性質および課題を考慮すると、ＷＧＡと比較してより速く、ＷＧＡと匹敵するまたはより良い性能を提供する技術の必要性が存在する。
これらの問題に対する魅力的な解決は、単一細胞由来のＤＮＡの直接的処理（断片化およびタグ化）であり、それによって、ＷＧＡ法を完全に回避する。しかし、広く使用される超音波処理による断片化は、極度に低いＤＮＡ濃度における断片へのオリゴヌクレオチドタグの引き続くライゲーションの困難性に起因して、この目的のためには不適切である。対照的に、トランスポザーゼ法におけるＤＮＡの断片化およびタグ化は、１ステップで同時に起こり、これが解決を提供すると思われる。２ステップの代わりに１ステップを有することに加えて、トランスポザーゼ反応は、本質的に２成分反応であり、ＷＧＡなどにおけるような３成分ライゲーションプロセスよりも、元来かなり効率的である。Ｉｌｌｕｍｉｎａ機器での配列決定に適切な単一細胞由来のライブラリーは、Ｖｉｂｈａｒトランスポザーゼを使用して数分以内に生成され得る。サンプルのより迅速かつより経済的な処理を前向きに提供するとはいっても、低いＤＮＡインプットにおけるトランスポザーゼ反応の不十分な効率に起因して、これまでのところ、このアプローチは、ＷＧＡ法と同じ問題に悩まされていた。実際、以下の例に示すように、単一〜数個の細胞由来のＤＮＡインプットを用いると、インプットＤＮＡ材料のごく一部が、標準的トランスポザーゼ反応において処理された。従って、トランスポザーゼ反応の改善された効率（即ち、改善されたアウトプット／インプット比）が、ＮＧＳおよびマイクロアレイのためのサンプル調製の「ＷＧＡなしの」単一細胞の方法を開発するために必要である。
ＮＧＳのためのＤＮＡサンプル調製には、トランスポザーゼ反応における標的ＤＮＡの断片化およびタグ化と、その後の断片のＰＣＲ増幅が関与する。同様に、トランスポザーゼは、ゲノム異常のマイクロアレイ分析のためのＤＮＡサンプルの調製において使用され得る。数千のヒト細胞由来の最も広く使用されるＤＮＡインプット（１０〜５０ｎｇのＤＮＡ）において、単一のＨｉＳｅｑ実行は、適切なゲノムカバー率および比較的低い重複率（それぞれ、９０％を超える、および６％を下回る）を提供する。しかし、単一細胞由来のＤＮＡまたは数個の細胞由来のＤＮＡが、ＷＧＡなしにトランスポザーゼ反応において直接処理される場合には、ゲノムカバー率は劇的に低減され、重複率はしかるべく上昇する。例えば、３つのヒト細胞ゲノム由来のＤＮＡインプットは、一般に、たった４２％のカバー率を生じさせるが、７２％の重複率を生じさせる。
本明細書に開示されるアダプターは、単一細胞のインプットにおいてさえも匹敵するまたはより良い配列決定カバー率を達成できるように、低いＤＮＡインプットにおいて、トランスポザーゼベースのＤＮＡ調製の性能を数倍改善することを可能にする。効率におけるこの改善は、ＮＧＳおよびマイクロアレイ分析のための、非常に低いインプット（例えば、単一〜数個の細胞または個々の染色体由来のサンプル）における、ゲノムＤＮＡのＷＧＡなしの処理を可能にする。さらに、これは、より高いゲノムＤＮＡおよびｃＤＮＡインプットにおいて、より良いゲノムカバー率および低減されたバイアスもまたもたらす。
本明細書に開示されるアダプターは、マイクロアレイ適用のためのサンプル調製においても使用され得る。ＮＧＳおよびマイクロアレイのためのサンプル調製は、トランスポザーゼ技術を用いて促進され得る共通のステップを有するという事実にもかかわらず、これまで、トランスポザーゼは、マイクロアレイのためのサンプル調製においては使用されなかった。ＮＧＳおよびマイクロアレイとは別に、本発明のトランスポゾンアダプターは、変異誘発のために、遺伝子治療において、および再生医学のための多能性細胞の生成においても、使用され得る（Ｐａｌａｚｚｏｌｉ ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅｔｅｃａ，２０１０，１３８（３）：２８５−９９）。
Ｄ．さらなるアダプター改変
限定されない例として、改変されたヌクレオチドの例は、２−アミノプリン、２，６−ジアミノプリン、５−ブロモｄＵ、デオキシウリジン、逆方向ｄＴ、逆方向ジデオキシ−Ｔ、ジデオキシ−Ｃ、５−メチルｄＣ、デオキシイノシン、５−ニトロインドールなどのユニバーサル塩基、２’−Ｏ−メチルＲＮＡ塩基、イソ−ｄＣ、イソ−ｄＧ、リボヌクレオチド、モルホリノ、タンパク質ヌクレオチドアナログ、グリコイックヌクレオチドアナログ、ロックトヌクレオチドアナログ、トレオースヌクレオチドアナログ、鎖終結ヌクレオチドアナログ、チオウリジン、プソイドウリジン、ジヒドロウリジン、キューオシン、ウィオシンヌクレオチドを含む。これらは、ネイティブアダプター配列に、改変されたアダプター配列、例えば「モザイク」に、または上記改変に、取り込まれ得るかまたは付加され得る。
さらに、有用な改変は、改変された塩基を必ずしも含まない。例えば、これらは、脱塩基部位；官能基、例えば、アルキン官能基、アジド官能基、例えばアジド（ＮＨＳエステル）；非天然の結合、例えば、ホスホロチオエート結合；スペーサー、例えば、１’，２’−ジデオキシリボース（ｄＳｐａｃｅｒ）、ヘキサンジオール、光切断可能なスペーサー、異なる数の炭素原子を有する異なる長さのスペーサー、例えば、Ｃ３スペーサーホスホラミダイト、Ｃ９スペーサー、例えば、トリエチレングリコールスペーサー、Ｃ１８の１８原子ヘキサエチレングリコールスペーサーなどを含み得る。かかるスペーサーは、アダプターの５’末端もしくは３’末端に、または内部において、取り込まれ得る。さらに、本発明のアダプターの少なくとも１つの鎖は、リン酸化によって改変され得る、即ち、図１に示されるように１位における５’リン酸、もしくは相補的鎖上ではあるが同じ位置における３’リン酸、またはそれら両方のいずれかを含む。上記改変を有するまたは有さないオリゴヌクレオチドは、いくつかの供給業者、例えば、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、Ｉｏｗａ）、ＴｒｉＬｉｎｋ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）、Ｅｕｒｏｆｉｎｓ ＭＷＧ Ｏｐｅｒｏｎ（Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ、ＡＬ）、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）によってカスタムメイドされ得る。本明細書で使用する場合、「スペーサー」とは、２つの部分を接続する分子または分子の群を指す。典型的なスペーサーは、アルキレン（炭素−炭素）、エーテル、アミノ、アミド、エステル、カルバメート、ウレアおよびケト、ならびにそれらの組み合わせから選択されるものなどの結合を含み得る。スペーサーは、１もしくは複数の型のヘテロ原子含有連結と交互になっている、またはかかるヘテロ原子含有連結によって隣接される、短いアルキレン部分を含み得る。非限定的な例には、−−ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−−、−−ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＨＣＨ２−−、−−Ｃ（Ｏ）ＯＣＨ２−−、−−ＯＣ（Ｏ）ＮＨＣＨ２ＣＨ２−−、−−ＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣＨ２、−−ＣＨ２ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＣＨ２ＣＨ２−−、−−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＨＣＨ２ＣＨ２ＮＨ−−および−−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＨＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ２ＣＨ２−−などが含まれるがこれらに限定されない。このスペーサー部分は、加水分解的に安定であり得、または生理学的に加水分解可能なもしくは酵素的に分解可能な連結（例えば、エステル連結）を含み得る。
トランスポザーゼは、標的ＤＮＡを切断した後にギャップを残し、改変されたアダプターは、例えばギャップ修復ステップの間に置換されて、ｉｎ ｖｉｔｒｏ適用およびｉｎ ｖｉｖｏ適用に適切な改変されていない二本鎖ＤＮＡを生じ得るので、アダプターの下の鎖上の改変（図３および図４）は、ＤＮＡ修復酵素、例えば、ポリメラーゼ、キナーゼおよびリガーゼによる認識に必ずしも適切である必要はない。本明細書の開示を考慮すると、当業者は、適用次第で、異なるオリゴヌクレオチド配列、例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａチップへの結合のために必要な配列が、かかるアダプターに結合され得ることを、即座に認識する（米国特許出願公開第２０１２／０３０１９２５号）。さらに、本明細書の開示を考慮すると、当業者は、トランスポザーゼ活性部位においてアダプター配列を改変することによってトランスポザーゼ特性を改変する可能性、および特定の必要性のために改善された特性を有するアダプターを選択する可能性を、即座に認識する。
認識配列領域に加えて、典型的には、本発明のアダプターは、増幅または他の重合反応のためのプライマー結合のために設計され得る、少なくとも１つの他の領域を含む。これらのプライマー結合領域は、二本鎖または一本鎖であり得、任意の適切なプライマー結合配列を含むように設計され得る。当業者にとって、プライマー結合配列および対応するプライマーを設計することは、慣用的な仕事であり、プライマー結合、伸長および増幅、例えば、ＰＣＲ、多置換増幅（Ｌａｓｋｅｎ ＲＳ．Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｓｏｃ Ｔｒａｎｓ．２００９ Ａｐｒ；３７（Ｐｔ２）：４５０−３）、多重アニーリングおよびルーピングベースの増幅サイクル（Ｚｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０１２ Ｄｅｃ ２１；３３８（６１１４）：１６２２−６．）などにおける使用のための適切な配列を考案することは、実施者にゆだねられる。
このアダプターは、１または複数の二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）または一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）配列（本明細書で、「タグ」とも呼ばれる）をさらに含み得る。これらのタグは、Ｉｌｌｕｍｉｎａチップなどの配列決定チップへの生成されたＤＮＡ断片の結合を可能にし、インデックス配列などの標的ＤＮＡライブラリーの供給源の同定を可能にするために、含まれ得る。
一態様では、このアダプターは、（例えば、特定のプロセスステップ、例えば、増幅および／または富化を実施した後に）引き続いて配列決定され得る縮重塩基領域（ＤＢＲ）を含むタグを有する。配列決定実行中に存在する異なるＤＢＲ配列の数は、特定の配列分析構成またはプロセスにおいて配列決定された同じ元のサンプルの同じゲノム領域に起源する個々のポリヌクレオチド分子の数を決定／概算するために使用され得る。ＤＢＲは、多くの異なる核酸配列決定適用の分析を改善するために使用され得る。例えば、ＤＢＲは、読み取り数単独からは導出できない遺伝子型決定アッセイにおける対立遺伝子コールについての統計的値の決定を可能にする。
ＤＢＲは、サンプル中の他のタグ化されたポリヌクレオチドと比較して、変動する塩基組成または配列（「ランダム」とみなされ得る）を有し得る領域である。サンプル中のポリヌクレオチドの集団中の異なるＤＢＲの数は、ＤＢＲ中の塩基の数、ならびに各位置において存在し得る異なる塩基の潜在的な数に依存する。例えば、各位置がＡ、Ｃ、ＧおよびＴのうちのいずれか１つであり得る２つの塩基位置を有するＤＢＲが結合したポリヌクレオチドの集団は、潜在的に、２４または１６の異なるＤＢＲ（ＡＡ、ＡＣ、ＡＧなど）を有する。従って、ＤＢＲは、２１〜２２０またはそれ以上の異なる順列を生じるように、１５以上、２０以上などを含む、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上の塩基を含み得る。特定の実施形態では、このＤＢＲは、３〜１０塩基長である。さらに、ＤＢＲ中の各位置は、異なる塩基組成を有し得る。例えば、４塩基のＤＢＲは、ＮＮＮＮ；ＮＲＳＮ；ＳＷＳＷ；ＢＤＨＶの組成のいずれかを有し得る。特定の実施形態では、ＤＢＲ中の塩基は、検出可能な改変またはそれに結合した他の部分を有することによって変動し得ることに、さらに留意されたい。例えば、特定の次世代配列決定プラットホーム（例えば、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（商標））が、配列決定プロセスの間の塩基におけるメチル化の差異を検出するために使用され得る。このように、ＤＢＲ中の非メチル化塩基は、ＤＢＲ中のメチル化塩基から識別され得る。従って、ＤＢＲの長さまたは塩基組成に関しては制限がないことが意図される。
ＤＢＲは、単一の領域であり得る（即ち、互いに隣接する全てのヌクレオチド塩基を有する）か、またはポリヌクレオチド上の異なる位置に存在し得る（即ち、ＤＢＲの塩基は、スプリットＤＢＲとも呼ばれる非ＤＢＲ配列によって分離される）。例えば、ＤＢＲは、ポリヌクレオチド上の第１の位置における第１のアダプター中の１または複数の塩基および同じポリヌクレオチド上の第２の位置における第２のアダプター中の１または複数の塩基を有し得る（例えば、ＤＢＲは、非対称的にタグ化されたポリヌクレオチド、即ち、非対称的アダプターを有するポリヌクレオチドの両方の末端において存在する塩基を有し得る）。これに関して制限は意図されない。
ＤＢＲを有するアダプターを生成することは、例えば、当該分野で周知のＤＮＡ合成方法を使用して、任意の従来の様式で達成され得る。親サンプル中のポリヌクレオチドに一旦結合すると、これらのポリヌクレオチドは、さらなる処理に供され得、最終的に配列決定され得る。実施され得る処理ステップは、使用者が望む任意のプロセスステップ、例えば、富化、増幅などを含む。この配列決定ステップでは、ＤＢＲならびにポリヌクレオチドの一部分（例えば、目的の領域を含む）の配列が得られる。配列が一旦得られると、目的のポリヌクレオチドに結合した異なるＤＢＲの数が決定される。この数は、配列決定結果において提示された出発親サンプル由来の目的の異なるポリヌクレオチドの数を決定または概算するために使用され得、このとき、一部の実施形態では、決定された数は、配列決定結果において提示された出発親サンプル由来の目的の異なるポリヌクレオチドの最小数である。
上述のように、本発明のアダプターは、ＮＧＳまたはマイクロアレイ分析のために、非常に低い量のＤＮＡを有するサンプル由来のＤＮＡを断片化するために特に適切である。サンプル調製のこの初期段階のための従来のアプローチの結果、１つの対立遺伝子に全て対応する読み取りの高いカバー率が生じ得、これは、二項分布に従って予測されるはずのものよりも何倍も多く生じ得る。これは、単一の染色体（即ち、目的のサンプル中に実際に存在する２つの二倍体染色体のうち一方だけ）上の遺伝子座から誘導された多数の読み取りを生じる数分子のＤＮＡ（またはさらには単一の分子）の増幅に起因する。これの結果は、カバー率の関数としての誤差が、予測された二項誤差から大幅に逸脱するというものである。ＤＢＲを使用することは、限定量のＤＮＡを有するサンプルから対立遺伝子コールを作成することにおいて、信頼度を増加させ得る。例えば、遺伝子座由来の１つの対立遺伝子の１６の配列決定読み取りが、全て同じＤＢＲ配列を含む場合、これらの読み取りは全て、同じ親ポリヌクレオチド分子由来である可能性が高い（従って、ホモ接合性対立遺伝子コールは正しいとは言えない）。しかし、１６の配列決定読み取りが各々異なるＤＢＲ配列を有する場合、各読み取りは異なる親ポリヌクレオチド分子から来ているので、より信頼度の高いホモ接合性コールが作成され得る。
遺伝学的分析におけるＤＢＲドメインは、ＮＧＳプラットホームと組み合わせた場合には、強力であり、それらの多くは、配列決定されるサンプル中に存在する各個々のポリヌクレオチドについての配列データを提供する。ポリヌクレオチドの個々のクローンが独立して配列決定される従来の配列決定アプローチとは対照的に、ＮＧＳプラットホームは、サンプル中の複数の異なるポリヌクレオチドについての配列を同時に提供する。この差異は、各々のポリヌクレオチドをクローニングし独立して配列決定する必要があることによって拘束されない、サンプル特異的な統計的分析が行われることを可能にする。従って、本明細書に記載されるＤＢＲドメイン分析は、本発明の改変されたアダプターおよびＮＧＳプラットホームと協同して、プールされたサンプルからの非常に大きい量の配列データを分析するための、改善された統計的アプローチを提供する。さらに、ＤＢＲ配列は、複雑なゲノムまたはプールを含む不均一サンプル中の配列バリアントの統計的検証などの他の分析において使用され得る。例えば、ＤＢＲは、腫瘍サンプル、微生物サンプル、環境サンプルなどにおける複雑なゲノムの分析において使用を見出す。例えば、その内容が参照によって組み込まれる米国特許第８，４８１，２９２号を参照のこと。
次世代配列決定への適用可能性を目的とすると、アダプター末端の約半分が１つの型のタグでタグ化され、もう一方の半分が異なるタグでタグ化されることが好ましく、その結果、標的ＤＮＡのトランスポザーゼ媒介性の断片化の後に、１種類のタグが、標的ＤＮＡ断片の一方の末端に結合され、別の型のタグが反対の末端に結合されて、両方の方向でのＤＮＡ断片の読み取りを可能にする。本発明者は、さらなる分析のための断片の調製のための改善されたＤＮＡ断片化（即ち、断片化の改善されたランダム化）が、２つの異なるトランスポザーゼ認識配列を組み合わせることによって達成され得ること、即ち、特定の組成物中のアダプターの一部（例えば、約５０％）が、トランスポザーゼの第１の認識配列を含み、残りのアダプターが、第２の異なる認識配列を含むことを、認識した。この認識配列は、トランスポザーゼについての天然に存在する配列であり得、またはアダプターにさらなる機能または代替的機能を提供する操作された配列であり得る。
例示的な実施形態では、この認識配列は、断片化される標的ＤＮＡの各末端について異なっている。一部の実施形態では、標的ＤＮＡ断片の末端における２つの配列は、同一または実質的に同一であり得、互いに対して少なくとも９０％（即ち、９０％〜１００％）の配列同一性を有する。一部の他の実施形態では、これら２つの配列は異なっており、互いに対して９０％未満（即ち、８９％以下、最小は約３０％）の同一性を有する。しかし、両方の認識配列が、およそ同じ程度まで、それらと併せて使用されているトランスポザーゼによって認識可能であることが好ましい。このために、トランスポザーゼ断片化の効率が、いくつかの認識配列について別々に評価され得、事実上同じ効率を有する認識配列が、一緒に使用するために選択される。あるいは、あまり効率的でないアダプターが、より効率的なアダプターと混合され得、後者は、前者よりも少ない量で使用される。例示的な実施形態では、これらの認識配列は、図１および図３〜５に示されるものなどの、天然配列および改変された配列の両方を含む。さらに、単一の型の天然もしくは改変された認識配列が使用され得るか、または同時に２つ以上の型の天然もしくは改変された認識配列が、任意の組み合わせで、使用され得る。当業者は、任意のトランスポザーゼを使用することができ、その認識配列を容易に識別できるが、これは、認識配列が、トランスポザーゼ遺伝子に隣接するＩＲＲ反復およびＩＲＬ反復として存在することが公知だからである。
当業者は、任意のヌクレオチド配列が、オリゴヌクレオチド合成の間に、または例えばＤＮＡリガーゼを使用する他の方法によって、認識配列に容易に結合され得ることを認識する。かかる配列は、ＤＮＡ断片を増幅するために、配列決定プライマーのためおよびＰＣＲプライマーの着地部位を提供し得、ＩｌｌｕｍｉｎａチップなどのＤＮＡ配列決定チップにＤＮＡ断片を結合させるという目的にも役立ち得る。さらなるヌクレオチド配列は、好ましくは一本鎖であり、または大部分が一本鎖である。さもなければ、トランスポザーゼは、基質として過剰なｄｓＤＮＡを認識するので、阻害され得る。かなり小さい程度までであるが、一本鎖伸長の結合は、トランスポザーゼ活性もまた低減させ得、従って、結合のサイズを最小に維持することが好ましい。このために、２つの異なる認識配列の使用は、これら２つの間で異なる認識配列の一部へと伸長され得るプライマーに着地部位を提供することによって、有利である（例えば、その内容が参照によって組み込まれる米国特許出願公開第２０１２／０３０１９２５号を参照のこと）。この設計は、両方のアダプターに対する同じトランスポザーゼ認識配列を使用するＮＥＸＴＥＲＡ（商標）システムにおける４つのプライマーと比較して、ＤＮＡ断片のＰＣＲ増幅のための２つのプライマーだけの使用を可能にする。４つではなく２つのプライマーの使用は、より単純かつＰＣＲ増幅においてより効率的であるという点で、以前のシステムの長所である。
アダプターを作製するために、これらのアダプターは、産生されるトランスポザーゼ（複数可）に特異的に結合するように設計される。このように、各アダプター上に存在する必要がある認識配列は、アダプターを合成する前に既知である。天然の認識配列は、トランスポザーゼのオープンリーディングフレームの５０〜２００ヌクレオチド上流およびすぐ下流に見出され得る逆方向反復を構成する場合が多く、当業者によってゲノム配列において同定され得る。これらのアダプターは、化学的合成を含む任意の適切な技術を使用して作製され得る。これらのアダプターは、二本鎖である部分を少なくとも含む。このように、使用の前に、２つの相補的部分が、ハイブリダイゼーションが生じる条件下で互いに対して曝露されて、二本鎖部分を産生することが好ましい。
一部の実施形態では、本発明のアダプターは、特異的結合対のメンバーを含む。このメンバーは、アダプターの核酸に共有結合され得、特異的結合対の他のメンバーへの特異的結合を可能にする。例示的な実施形態では、特異的結合対の他のメンバーは、固体基材に結合され得る。この方法では、アダプターは、例えば、対応するトランスポザーゼの精製および固体基材に結合したトランスポザーゼ切断産物（例えば、増幅／特徴付けのためのＤＮＡ断片）を産生するためのアダプター−トランスポザーゼ複合体の使用を促進する固体基材に特異的に結合され得る。一般に、アダプターの一方の鎖の５’末端を介した、結合対メンバー、例えば、ビオチンの結合が好ましい。しかし、結合対メンバー（複数可）は、トランスポザーゼ複合体の阻害活性を回避するために、ＤＮＡ挿入物から遠い３’末端に、または３’末端および５’末端の両方にも、結合され得る。
上に述べ、下に例示するように、本発明の合成アダプターは、ほとんどの保存された部位において公知の機能的トランスポザーゼアダプター（ネイティブまたは改変された）とは異なるが、予想外に、活性を保持する。さらに驚くべきことに、それらの一部は、さらに高い活性を有し、ＮＧＳに使用した場合、増加したランダムさもしくは低減された重複率またはそれら両方を生じる。
一部の実施形態では、選択されたトランスポザーゼに異なる特性を付与する複数の有用なアダプターが、ネイティブアダプター中の保存された１位を改変することによって生成され得ることが実証された。当業者は、選択されたトランスポザーゼのための複数のアダプターを創出し、トランスポザーゼ適用次第で、ならびにサンプル中に存在し得る不純物次第で、トランスポザーゼ特性の最適化のために複数のアダプターを適用するため、例えば、未精製の血清または半精製血液サンプルについて最良のアダプターを選択するため、単一細胞ゲノム配列決定のため、ホルマリン固定パラフィン包埋スライド由来のＤＮＡを配列決定するためなどに、これを使用できる。
増加した活性は、例えば、低いＤＮＡ濃度を有するサンプルを分析する必要性がある場合、特に、低いＤＮＡインプットの反応条件について、多数の適用のために有用である。例えば、単一細胞ゲノム配列決定は、癌の発達の機構を理解するためおよび抗癌薬物発見のために、特に目的とされる。単一のヒト細胞由来のＤＮＡの等価物ほどの少なさから出発し、可能な限り少ない増幅サイクルを用いて極少量のＤＮＡを配列決定する能力は、個別化医療の開発、比較診断および癌の全体的な理解のために高度に有利であることは、広く認識されている（Ｎａｖｉｎ ａｎｄ Ｈｉｃｋｓ，Ｇｅｎｏｍｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２０１１，３：３１）。さらに、ヒト細胞の等価物未満のＤＮＡインプットは、単離された染色体または小さいゲノムを配列決定するためなどの、いくつかの適用にとって望ましい（Ｇｉｏｒｇｉ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．２０１３；８（２）：ｅ５７９９４．ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００５７９９４）。
低いＤＮＡインプットに対する主要な適用の１つは、腫瘍中の「パッセンジャー細胞」とのそれらの混合物ではなく、転移活性を担う単一の単離された癌細胞のゲノム配列決定である。これは、癌のより良い理解を可能にし、改善された癌の処置および診断をもたらすことができるはずである。比較的少ない腫瘍細胞が、患者における癌の発達およびその広がり（転移）を担うので、個々の細胞のゲノムを配列決定することが必要である。主に背景の「パッセンジャー細胞」のゲノムは、腫瘍細胞の混合物から生成されたライブラリーにおいて配列決定されるので、癌細胞の大部分は、ただの「パッセンジャー細胞」であり、腫瘍サンプルの頻繁な分析は、癌の原因となっている変異についての答えを与えない。単一細胞ゲノム配列決定の現在の方法は、典型的に、増幅されたＤＮＡからの引き続くサンプル調製を伴う全ゲノム増幅を必要とする。このアプローチを使用して、大きい（マイクログラム）量のＤＮＡが、単一細胞から生成され得、ＮＧＳのために処理され得る。しかし、これは、選択的増幅に起因して、単一細胞ゲノムの部分的な配列カバー率のみを生じる。従って、単一細胞ＤＮＡから直接ＮＧＳのためのライブラリーを生成する必要性が存在し、低いＤＮＡ濃度において極度に少量のＤＮＡを処理（断片化およびタグ化）できるより高い活性のトランスポザーゼが、望ましい。
別の適用は、ヒト血液由来の遊離ＤＮＡの分析である。転移を担う癌細胞は、腫瘍から脱離し、脆弱であり、それらのＤＮＡは、低い濃度である場合が多いものの、血液中に存在する場合が多い。別個の適用は、妊娠女性の血液中の遊離ＤＮＡの分析である。かかるＤＮＡは、胎児に起源し得、その分析は、遺伝性疾患、または複雑な疾患への素因の診断のために有用である（Ｐａｐａｇｅｏｒｇｉｏｕ ａｎｄ Ｐａｔｓａｌｉｓ，ＢＭＣ Ｍｅｄ．２０１３，１１（１）：５６）。さらに、低いインプットの方法は、ヒト血液、食物または環境サンプル中の感染性因子の検出に適用され得る。なお別の適用は、複雑な生態系を理解することに関する。多くの微生物は現在、それらの環境の外側では培養できないので、単一細胞ＮＧＳ技術を用いない場合、ヒトマイクロバイオーム中または環境サンプル中の微生物の部分的な分析のみが実現可能である（Ｆｏｄｏｒ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．２０１２；７（７）：ｅ４１２９４．ｄｏｉ：１０．１３７１）。
トランスポザーゼ−アダプター複合体および関連組成物
本発明は、上記アダプターおよびトランスポザーゼの複合体ならびにこれらの複合体を含む組成物をさらに提供する。
種々のトランスポザーゼが、複合体を作製するために使用され得る。これらは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでトランスポザーゼ活性を有する任意のタンパク質、例えば、天然に存在するトランスポザーゼまたは組換えトランスポザーゼであり得る。このトランスポザーゼは、少なくともある程度まで、その天然の環境（即ち、細胞核またはサイトゾル）から、単離または精製され得る。好ましくは、このトランスポザーゼは、組換え産生され、好ましくは、組換え宿主環境（即ち、細胞核またはサイトゾル）から単離または精製される。最も好ましくは、このトランスポザーゼは、本発明の組成物中に含める前に、９０％以上のレベルまで、他の細胞性成分から精製される。好ましくは、このトランスポザーゼは、約９５％以上のレベル、例えば、約９８％純粋、約９９％純粋、または９９％を超えて純粋である。純度は、クマシーブルー染色、銀染色、ＨＰＬＣ、質量分析、またはタンパク質サンプル中の不純物を検出するための他の高感度技術などによって、純度を決定するための一般的な技術に基づいて決定される。ＤＮＡ不純物は、例えば、ＰＣＲを使用しても評価され得る。例示的な実施形態では、このトランスポザーゼは、転位の「カットアンドペースト」機構を有するトランスポザーゼであり（Ｙｕａｎ ａｎｄ Ｗｅｓｓｌｅｒ，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．２０１１ Ｍａｙ １０；１０８（１９）：７８８４−９）、ＩＳ４ファミリーのトランスポザーゼのメンバー、例えば、ビブリオ・ハーベイが含まれるがこれらに限定されないビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ）種において天然に見出されるものである。実施形態において、このトランスポザーゼは、Ｔｎ５トランスポザーゼでも、例えば野生型Ｔｎ５トランスポザーゼの変異誘発によってＴｎ５トランスポザーゼから誘導されたトランスポザーゼでもない。
トランスポザーゼは、それらが天然に存在する環境またはそれらが産生された環境とは異なる環境において見出される場合、単離または精製されたとみなされる。例えば、トランスポザーゼは、それらが産生される細胞の他の生体分子の一部または全てが除去される環境中に存在し得る。これらのトランスポザーゼは、それらが天然に見出される細胞ではない細胞において産生される場合、組換えであり、それらが由来または起源するトランスポザーゼ（複数可）の天然に存在する配列（複数可）とは異なるアミノ酸配列を有する場合、改変されている。例えば、本発明に従うトランスポザーゼは、天然に存在するトランスポザーゼ（野生型）のアミノ酸配列、または１もしくは複数の天然に存在するアミノ酸が欠失もしくは異なるアミノ酸で置き換えられた改変されたトランスポザーゼのアミノ酸配列を有し得るか、あるいは改変されたトランスポザーゼは、野生型配列に付加されたアミノ酸配列を有し得る。さらに、天然に存在するアミノ酸配列は、その配列中の１または複数の部位における１または複数のアミノ酸の添加によって破壊され得る。一部の実施形態では、これらのトランスポザーゼは、キメラタンパク質である、即ち、これらは、２つ以上の異なるトランスポザーゼ由来のアミノ酸配列の混合物を含むタンパク質である。
これらの複合体は、１または複数のトランスポザーゼ分子および１または複数のアダプターを含み得る。少なくとも２つのトランスポザーゼを含む複合体では、これらのトランスポザーゼのうち少なくとも２つが、核酸またはオリゴヌクレオチドアダプターに結合される。複合体が２つのトランスポザーゼを含む実施形態では、この複合体は、シナプス複合体と類似の形態を示し得る。より高次の複合体、例えば、４つのトランスポザーゼ、８つのトランスポザーゼを含む複合体、または異なる数のサイズの複合体の混合物もまた可能である。２つよりも多いトランスポザーゼを含む複合体では、全てのトランスポザーゼがオリゴヌクレオチドによって結合される必要があるわけではない。むしろ、さらなるオリゴヌクレオチドが結合され得るが、トランスポザーゼのうちの２つが結合されることが十分である。通常、２つ以上のトランスポザーゼ分子が複合体中に存在する場合、同じトランスポザーゼが、複合体において使用される。しかし、一部の実施形態では、２つ以上の異なるトランスポザーゼが、単一の複合体において使用されることが好ましい。例えば、複合体中のトランスポザーゼ分子のうち１または複数が、それらのアミノ酸配列の改変を介して部分的にまたは全体的に不活性にされ得、活性なトランスポザーゼ分子および部分的または全体的に不活性なトランスポザーゼ分子の混合物が、活性サブユニット間の距離をモジュレートするために使用され得、結果として、複合体によって産生されたＤＮＡ断片の平均サイズがモジュレートされ得る。同様に、例えば、高ＧＣ配列に対する認識配列を有するトランスポザーゼおよびより低いＧＣ含量を有する配列に対する認識配列を有する別のトランスポザーゼを含む複合体などの、異なる認識配列を有する異なる複合体が使用され得る。認識配列において異なるＧＣおよびＡＴ含量を有するトランスポザーゼを混合することは、標的ＤＮＡ配列について断片化パターンを調整することを可能にする。１つの型のオリゴヌクレオチドアダプターがＤＮＡを断片化するために使用され得るが、断片化の後に断片化されたＤＮＡの増幅および配列決定が行われる実施形態では、少なくとも２種類のオリゴヌクレオチドアダプターの使用が、ＤＮＡ断片のＰＣＲ増幅を促進するため、および両方の方向でＤＮＡ断片を配列決定するために使用される異なるＤＮＡ配列決定プライマーの異なる着地部位を提供するために、好ましい。いくつかの制限エンドヌクレアーゼとは異なり、トランスポザーゼは、１つの正確な認識配列に必ずしも限定されないので、１または複数のトランスポザーゼ認識配列が、アダプターを設計するために使用され得る。
これらのトランスポザーゼは、トランスポザーゼに加えて少なくとも１種の他の物質を含む組成物中に存在し得る。これらの組成物は、存在する物質の数および型において、特に制限されない。一般に、液体組成物は、水および複合体を含む。典型的に、塩、イオン、緩衝化化合物、金属または１種もしくは複数の生体分子などの、１種または複数の他の物質が存在する。一般に、任意の数の物質が、組成物中に含まれ得る。種々のさらなる成分の正体、数および量は、典型的には、組成物のための適用、または最適な活性のための特定のトランスポザーゼ複合体についての特定の要求によって、決定される。
特定の実施形態では、これらの組成物は、２つ以上の異なるトランスポザーゼを含む。他の物質の性質および数は、特に制限されない。多くの実施形態では、これらの組成物は、少なくとも水を含むが、特定の実施形態は、凍結組成物または乾燥（例えば、フリーズドライ）組成物に関する。例示的な実施形態では、これらの組成物は、一部の実施形態ではＥＤＴＡおよび／またはオリゴヌクレオチドが補充された細胞溶解物またはＤＮＡ断片化反応混合物中に、トランスポザーゼを含む。ＥＤＴＡは、二価カチオンをキレートし、そうして、それらの活性のためにＭｇ２＋イオンを典型的に必要とする宿主細胞ヌクレアーゼを阻害し、さもなければ、宿主細胞ヌクレアーゼはオリゴヌクレオチドを分解する。トランスポザーゼ−オリゴヌクレオチド複合体の形成が二価カチオンを必要としないという事実は、複合体の形成の破壊も維持の破壊もなしの、粗製細胞溶解物へのＥＤＴＡまたは他のヌクレアーゼインヒビターの添加を可能にする。
一部の実施形態では、本発明のこの態様の組成物は、精製されたトランスポザーゼ、またはトランスポザーゼが産生される（およびアダプターが細胞溶解の前または後に添加されている）細胞の細胞溶解物中のトランスポザーゼに結合した、アダプターを含む。精製されたトランスポザーゼ−アダプター複合体組成物もまた、複合体が溶液中に遊離していても固体基材に結合していても、ＤＮＡ切断／断片化反応などの酵素反応組成物中に含まれ得る。かかる組成物中に存在し得る非限定的な例示的な物質には、トランスポザーゼ複合体によって切断される標的ＤＮＡ、標的ＤＮＡ断片の重合のためのオリゴヌクレオチドプライマー、１または複数のＤＮＡポリメラーゼ、制限エンドヌクレアーゼ、ＤＮＡ改変酵素、ポリサッカリド、脂質膜、ナノ粒子、磁性ビーズを含むビーズ、トランスフェクション試薬、および界面活性剤が含まれる。
本発明のトランスポザーゼ−アダプター複合体は、固体基材または固体支持体に結合され得る。用語「固体基材」および「固体支持体」は、当該分野におけるそれらの意味に従って使用される。従って、これらは、精製および／または酵素反応の条件下で核酸を結合および保持するのに適切であることが当該分野で公知の任意の材料である。当業者は、固体基材として使用するのに適切な材料をよく知っている。本発明において有用な固体基材の非限定的な例には、ナイロン、ケイ酸イットリウム（ＹＳｉ）、および磁性ビーズを含むポリビニルトルエン（ＰＶＴ）ビーズ（例えば、Ｄｏｒｇａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍａｇｎｅｔｉｓｍ ａｎｄ Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ，Ｖｏｌ．１９４：ｐ．６９−７５，１９９９を参照されたい）、ナイロン、ニトロセルロースまたはＰＶＤＦメンブレン、ならびにプラスチック表面、例えば、ポリスチレンまたはポリプロピレンは含むものであって、後者は、ストレプトアビジンコーティングされたＳＴＲＥＰ Ｔｈｅｒｍｏ−Ｆａｓｔ ＰＣＲプレート（Ａｂｇｅｎｅ、Ｓｕｒｒｅｙ、ＵＫ）などの、核酸のＰＣＲ増幅のためのプレートまたはウェル上に見出される、プラスチック表面が含まれる。固体支持体は、特定の結合対の結合を促進するために、化学的に改変され得る、例えば、アミノ化（第一級アミンもしくは第二級アミン）またはカルボキシル化され得る。
固体支持体への複合体の結合は、複合体のアダプターまたはトランスポザーゼ部分のいずれかを介して、達成され得る。後者の場合、このトランスポザーゼ部分は、固体支持体への結合を可能にするタグを保有し得る。例えば、ビオチンタグは、Ｃ末端またはＮ末端のストレプトアビジン結合ペプチドを介して組換えトランスポザーゼに結合され得（Ｋｅｅｆｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ Ｐｕｒｉｆ．，Ｖｏｌ．２３，Ｎｏ．３，ｐ．４４０−４４６，２００１；Ｄｕｆｆｙ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．２６２，Ｎｏ．２，ｐ．１２２−１２８，１９９８）、この複合体は、ストレプトアビジンコーティングされたビーズまたはプレートに結合され得る。しかし、固体支持体への直接的トランスポザーゼ結合は、その酵素活性に重要なトランスポザーゼ分子の移動を立体的に妨害し得る。さらに、ペプチドタグとの融合タンパク質は、ネイティブタンパク質と比較して劣った活性を有する場合が多いが、それは、かかるタグが、タンパク質の折り畳みを妨害し得るからである。従って、本発明者は、ネイティブトランスポザーゼタンパク質を使用しつつ、そのアダプター部分を介したトランスポザーゼ−アダプター複合体の結合の洗練された解決を考え付いた。当業者によって使用され得る多くのかかるタグが存在する。任意の適切な特異的結合対が、本発明に従って使用され得、このとき、この対の少なくとも１つのメンバーが、固体支持体上に固定化され、当業者は、任意の数の考慮事項に基づいて、適切な対を自由に選択できる。結合対の非排他的な列挙には、アビジンまたはストレプトアビジンおよびビオチン、ナノ−タグおよびストレプトアビジン（例えば、Ｌａｍｌａ ａｎｄ Ｅｒｄｍａｎｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ Ｐｕｒｉｆ．Ｖｏｌ．３３，Ｎｏ．１，ｐ．３９−４７，２００４を参照のこと）、抗体（またはその抗原結合部分）ならびに抗体が特異的に結合する抗原／エピトープ、例えば、ＭｙｃまたはＦＬＡＧタグ、酵素−基質対、例えば、グルタチオントランスフェラーゼおよび還元型グルタチオン、ポリ−ヒスチジンおよびニッケルベースの樹脂、アプタマーおよびそれらの特異的標的分子、ならびにＳｉ−タグおよびシリカ粒子（例えば、Ｍｏｔｏｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ Ｐｕｒｉｆ．，Ｖｏｌ ７７，Ｎｏ．２，ｐ．１７３−１７７，２０１１を参照のこと）が含まれる。
特異的結合対のメンバーは、好ましくはその５’末端において、アダプターに共有結合により連結され得る。連結は、物質を核酸に化学的に連結させるための公知の任意の適切な技術によるものであり得る。唯一の制限は、特異的結合対のメンバーが、トランスポザーゼへのアダプターの結合を妨害し、固体基材に結合した場合にトランスポザーゼの活性を無効にし、またはＰＣＲにおける固体基材に結合したＤＮＡ断片の増幅を妨害するはずであるということである。このために、リンカーが、特異的結合対のメンバーと認識配列との間に提供され得る。例えば、その内容が参照によって組み込まれる米国特許出願公開第２０１２／０３０１９２５号および同時係属中の米国特許出願第１３／９６０，８３７号を参照のこと。
固体支持体に結合したトランスポザーゼ複合体を使用することの１つの利点は、１つのアダプターが固体支持体に結合されるという事実に由来する。このように、トランスポザーゼ複合体が標的ＤＮＡを切断する場合、この標的ＤＮＡは、アダプターを介して固体支持体上に捕捉される。この反応の結果としての、標的による酵素の置き換えは、反応成分から容易に精製され得るＤＮＡ断片を産生するための洗練された方法である。ＤＮＡ断片は、単純に洗浄することによって容易に精製され得るので、これは、ＤＮＡ断片の多重ステップの精製の必要性なしに種々の反応に供され得るＤＮＡ断片を産生するための洗練された方法でもある。
本発明はさらに、上述のアダプター−トランスポザーゼ複合体を作製する方法を提供する。一般に、この方法は、１または複数のトランスポザーゼを、トランスポザーゼ（複数可）に対する認識配列（複数可）を含むアダプターオリゴヌクレオチドと混合するステップと、アダプターがトランスポザーゼに結合して複合体を形成するのを可能にするステップとを含む。「可能にする」ステップは、列挙された作用が生じる条件を提供することを含む。かかる条件は、数時間（例えば、５〜１４時間）にわたって約０℃〜約室温（即ち、約２１℃〜２５℃）におけるトランスポザーゼおよびアダプターオリゴヌクレオチドのインキュベーションが含まれるがこれらに限定されない、任意の適切な条件であり得る。より高い温度およびより短いインキュベーション時間が使用され得るが、トランスポザーゼ活性の喪失の可能性に起因して、あまり好ましくない。この方法は、トランスポザーゼ、アダプターまたはそれら両方を産生するステップをさらに含み得る。この方法がトランスポザーゼを産生するステップを含む場合、この方法は、細胞を溶解させるステップの前に、宿主細胞においてトランスポザーゼを発現させるステップを含む。このトランスポザーゼは、それが天然に見出される細胞において発現され得、またはそのネイティブの宿主細胞ではない宿主細胞において組換え発現され得る。細菌、酵母、植物、昆虫または哺乳動物細胞などの、タンパク質の組換え産生のための多数の宿主細胞が当該分野で公知であり、実施者は、任意の適切な宿主細胞を自由に選択できる。例示的な実施形態では、大腸菌細胞は、トランスポザーゼの組換え産生のための宿主細胞として使用される。
使用
上記アダプターおよびアダプター−トランスポザーゼ複合体は、多数の使用を有する。それらの使用のうちで、本明細書は、さらなる分析手順（例えば、ハイスループット配列決定）において使用される断片化されたＤＮＡの調製のため、ならびに植物細胞および動物細胞中への遺伝子送達のための、これらのトランスポザーゼ複合体の使用を例示する。
Ａ．ＤＮＡ断片化および関連の使用
上記アダプターおよびアダプター−トランスポザーゼ複合体は、ゲノムＤＮＡなどのＤＮＡ分子を断片化するために使用され得る。断片化されたＤＮＡは、無細胞増幅（例えば、ＰＣＲ）またはハイスループット配列決定を含むいくつかの目的のために使用され得る。
一態様では、ＤＮＡを断片化する方法、および好ましくは、ＤＮＡをアダプターによってタグ化する方法が、提供される。一般に、この方法は、断片化される標的ＤＮＡを、固体基材に結合され得るトランスポザーゼ複合体と組み合わせるステップと、このトランスポザーゼ複合体によるＤＮＡ切断に適切な条件下でこの組み合わせをインキュベートして、固体基材に結合した断片化された標的ＤＮＡを得るステップとを含む。次いで、固体基材に結合したＤＮＡ断片は、任意の数の分析反応において使用され得る。一部の実施形態では、固体基材に結合していない反応混合物の成分が、例えば、当該分野で公知の任意の適切な洗浄手順によって除去される。一部の実施形態では、固体基材に結合したＤＮＡ断片が創出され、さらなる精製または調製なしに即座に使用される。例えば、ワンミックスＤＮＡ断片化および増幅混合物が提供され得、ここで、標的ＤＮＡは、固体基材に結合したＤＮＡ断片を産生するためのＤＮＡ断片化を可能にする条件下で、固体基材に結合したトランスポザーゼ複合体と組み合わされ、次いで、この混合物は、例えばＰＣＲによる、結合したＤＮＡ断片の無細胞増幅を可能にする条件に供される。
一実施形態では、ＤＮＡ断片ライブラリーを生成するためのｉｎ ｖｉｔｒｏの方法が提供される。この方法は、本発明のアダプターおよび対応するトランスポザーゼを含むトランスポゾン複合体を、転位反応を実施するための条件下で、目的の標的ＤＮＡと共にインキュベートするステップを含む。この転位反応は、標的ＤＮＡの断片化を生じ、断片化された標的ＤＮＡの５’末端中にトランスポゾン末端を取り込む。
一実施形態では、この方法は、断片化された標的ＤＮＡのトランスポゾン末端／５’末端中に対して相補的な第１および第２のオリゴヌクレオチドプライマーを使用する増幅反応において、断片化された標的ＤＮＡを増幅するステップをさらに含む。この第１および第２のプライマーは、任意選択で、以下にさらに記載される５’タグを含む。別の一実施形態では、この方法は、断片化された標的ＤＮＡの５’末端においてトランスポゾン末端を含む標的ＤＮＡの断片を、５’−３’エキソヌクレアーゼ活性または鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼと接触させるステップをさらに含み、その結果、完全に二本鎖のＤＮＡ分子が、標的ＤＮＡの断片から産生される。このステップは、転位反応において転位産物中に生成されたギャップを充填するために使用される。このギャップの長さは、特定の転位酵素に特徴的である。ＰＣＲなどの下流のステップのために転位産物を調製するために、この方法は、完全に二本鎖のＤＮＡ分子を変性させて、増幅反応における使用のための一本鎖ＤＮＡを産生するステップをさらに含み得る。
トランスポゾン末端配列が操作された切断部位を含む場合、この方法は、断片化された標的ＤＮＡを、切断部位に特異的な酵素と共にインキュベートするさらなるステップを含み得、その結果、断片化された標的ＤＮＡに取り込まれたトランスポゾン末端が、この切断部位において切断される。切断酵素は、それぞれ、ウラシル−Ｎ−グリコシラーゼまたはメチル化特異的制限酵素などのＮ−グリコシラーゼまたは制限酵素であり得る。
一実施形態では、この方法で使用される第１および／または第２のＰＣＲプライマー（複数可）の５’タグは、増幅タグ、配列決定タグおよび／または検出タグの群のうちの１または複数を含む。増幅タグは、引き続くラウンドの増幅において使用されるオリゴヌクレオチドプライマーに対して相補的な特異的配列を提供する核酸配列である。例えば、この配列は、得られた核酸の増幅を促進するために使用され得る。配列決定タグは、次世代配列決定のための鋳型としての、増幅反応から得られた増幅されたＤＮＡ断片の使用を可能にする核酸配列を提供する。例えば、この配列決定タグは、固相上でのハイブリダイゼーションによる配列決定のためのアニーリング部位を提供し得る。かかる配列決定タグは、Ｌｉｆｅ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのＩＯＮ ＴＯＲＲＥＮＴ配列決定タグ、Ｒｏｃｈｅの４５４Ａおよび４５４Ｂ配列決定タグ、Ａｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓのＳＯＬｉＤ（商標）配列決定タグ、ＩＬＬＵＭＩＮＡ（商標）ＳＯＬＥＸＡ（商標）配列決定タグ、Ｐａｃｉｆｉｃ ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓのＳＭＲＴ（商標）配列決定タグ、Ｐｏｌｌｏｎａｔｏｒ Ｐｏｌｏｎｙ配列決定タグおよびＣｏｍｐｌｅｔｅ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ配列決定タグであり得る。他方、検出タグは、中間体産物を検出およびモニタリングすることを可能にする。この検出タグは、増幅ステップから得られた核酸の検出を促進するための配列または検出可能な化学的部分もしくは生化学的部分を含み得る。検出タグの例には、特異的核酸配列、蛍光および化学発光色素、緑色蛍光タンパク質、ならびに基質の存在下で検出可能な酵素、例えば、ＮＢＴ＋ＢＣＩＰとのアルカリホスファターゼ、または適切な基質とのペルオキシダーゼが含まれる。バーコードなどの異なる検出タグを使用することによって、複数のサンプル由来の配列が、同じ機器実行において配列決定され得、検出タグの配列によって同定され得る。例としては、ＴｒｕＳｅｑ ＤＮＡ Ｓａｍｐｌｅ Ｐｒｅｐ ＫｉｔｓにおけるＩｌｌｕｍｉｎａのインデックス配列、またはＬｉｆｅ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのＳＯＬｉＤ（商標）ＤＮＡ Ｂａｒｃｏｄｉｎｇ ＫｉｔｓにおけるＭｏｌｅｃｕｌａｒ ｂａｒｃｏｄｅｓである。
本発明に従うアダプターは、ＤＮＡを断片化するために使用される場合、少なくとも２つのトランスポザーゼ分子から構成される複合体中に好ましくは存在し、このとき、各複合体のトランスポザーゼのうちの少なくとも２つは、少なくとも部分的に二本鎖であるアダプターを有するＤＮＡオリゴヌクレオチドへの化学的結合によって、会合される。好ましい実施形態では、これらの複合体は、各々がアダプターによって結合された２つのトランスポザーゼ分子を含む。トランスポザーゼ複合体内で、各トランスポザーゼは同じであり得るか、またはＤＮＡに対する同じ認識配列を有し得る。あるいは、トランスポザーゼが、いくつかのヌクレオチドが異なる配列を認識できる場合、これらの認識配列は異なり得る（例えば、米国特許出願公開第２０１２０３０１９２５号および米国特許出願第１３／９６０，８３７号を参照のこと）。さらにもう一度、これら２つは、同一性および／または認識配列が異なり得る。２つのトランスポザーゼが異なる認識配列を有する場合、これらのアダプターは、各トランスポザーゼがアダプターに結合できるように、適切に設計される。一実施形態では、使用される転位系は、ビブリオ・ハーベイなどのビブリオ種のトランスポザーゼに基づく。この方法のために、米国特許出願公開第２０１２／０３０１９２５号に記載される条件において、ｉｎ ｖｉｔｒｏで安定であるが触媒的に不活性なビブリオ・ハーベイ転位複合体をアセンブルすることができる。
これらのアダプターは、トランスポザーゼの認識配列を含むアダプターのｄｓＤＮＡ領域において、複合体のトランスポザーゼに化学的に結合され得る。特定の複合体中のアダプターは、特定のトランスポザーゼの単一の認識配列を含み得るが、必ずしも含まなくてもよい。実施形態では、これらのアダプターは、同じトランスポザーゼの２つ以上の認識配列を含み得る。あるいは、２つの異なるトランスポザーゼが複合体中にあり、各々が異なる認識配列を有する場合、この複合体の一方のアダプターは、トランスポザーゼのうちの一方に対する認識配列を有し、他方のアダプターは、他方のトランスポザーゼの認識配列を有する。
ＤＮＡ分子を断片化するために使用する場合、特定の範囲のＤＮＡインプットのためにトランスポザーゼロードを選択することが重要である。例えば、ヒト血液における遊離ＤＮＡ濃度または白血球計数は、異なる患者において顕著に変動し得る。従って、特定された濃度の範囲をカバーするトランスポザーゼ−アダプターロードを選択することは、事前のＤＮＡ濃度の測定および調整なしの、ＮＧＳのための自動サンプル処理を可能にする。より良い適したアダプターを選択することは、ちょうど異なるＤＮＡインプットに限定されない。特定の必要性次第で、選択／スクリーニングが行われ得る多くのパラメーターが存在する。例えば、選択は、例えば、土壌由来、血液由来、または他の体液もしくは組織由来の粗製、半精製または未精製のＤＮＡサンプルを処理する能力について行われ得る。別の一態様では、選択は、損なわれている可能性があるサンプル、即ち、エレメントへの曝露に起因して部分的に分解された可能性のあるサンプル、即ち、古くからのサンプルおよび法医学的サンプルを処理する能力、またはＦＦＰＥスライドの場合のように、サンプル調製技術および貯蔵を目的として行われ得る（Ｆｏｒｔｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ．２０１３ Ａｕｇ，３５（８）：６９０−５；Ｓａｈ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ Ｍｅｄ．２０１３ Ａｕｇ ３０；５（８）：７７）。例えば、より小さいサイズのトランスポザーゼ生成された断片を目指した分解されたサンプルの選択を用いると、以下の例に記載されるアダプター８が、有用であり得る。
ペアードエンド配列決定（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）およびＩｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ（Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）は、ＮＧＳプラットホームにおいて最も広く使用されている。いずれかのプラットホームのためのサンプルは、超音波処理を使用するＤＮＡ断片化と、その後のアダプターの結合とによって、または同じ反応混合物においてＤＮＡ断片化およびアダプターの結合を数分間で同時に実施するトランスポザーゼ法のいずれかによって、調製され得る。これらの方法には、良い点と悪い点とがある。超音波処理は、よりランダムなＤＮＡ断片化を達成するが、これは、トランスポザーゼ法よりもかなり労力を要し、時間がかかり、高価である。トランスポザーゼ法は、かなり迅速であり、はるかに安価である。しかし、ＤＮＡ断片化は、あまりランダムでない、即ち、これはバイアスを有し、一部の領域においてはより多い読み取りおよびより良いゲノムカバー率を生じるが、他の領域においてはあまり良くなく、これは、１〜３％より高い重複率および対応して、同じ全体的カバー率を達成するためのより多い配列決定の試みを生じる場合が多い。時間、労働および設備支出における、トランスポザーゼ法を用いたときの数倍の利益を考慮し、サンプル調製が配列決定費用全体の約５０％を構成することを考慮すると、これは、支払う代償が小さいように思われる。それにもかかわらず、重複率を低減させることは、高度に望ましい。
本明細書で開示する場合、異なるアダプターは異なる重複率を付与する。図１１に示すように、アダプター９およびアダプター５は、第１の位置においてネイティブＣＧ対を有する標準的アダプター１よりも、有意に低い重複率を付与した。アダプター６およびアダプター８は、より高い重複率を付与し、アダプター７およびアダプター１０は、アダプター１とおよそ同じ重複率を付与した。驚くべきことに、アダプターの混合物は、いずれのアダプターよりもかなり低い重複率を付与した（図１１）。可能な解釈は、異なるアダプターがロードされたトランスポザーゼが、標的ＤＮＡ上の異なる場所に偏っているということである。トランスポザーゼによってより熱心に認識されるこれらの場所は、「ホットスポット」と呼ばれる（Ｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ．１９８３，１０５（４）：８１３−２８）。ホットスポットエリアはより頻繁に配列決定されるので、これらのホットスポットは、重複を大いに担う。しかし、異なるアダプターは異なるホットスポットを付与する。これらのホットスポットは、異なるアダプターによって異なるので、異なるアダプターがロードされたトランスポザーゼ混合物を適用することは、ホットスポットをランダム化し、重複率を低減させる。さらに、低い重複率を個々に付与するアダプターの混合物について選択することは、重複率をさらにもっと低減させ得る。異なるアダプターがロードされたトランスポザーゼロードは、他の特性、例えば、異なるＡＴドロップアウト率においても異なる（図１２）。
Ｂ．低細胞数配列決定およびマイクロアレイに関する使用
上述のように、本明細書に開示されるアダプターは、マイクロアレイにおいて使用されるサンプルを調製するために使用され得る。マイクロアレイ技術は、大規模遺伝子型決定、遺伝子発現プロファイリング、比較ゲノムハイブリダイゼーション、ＤＮＡ配列決定、遺伝子発見、経路の再構築および疾患診断に使用される（Ｄｕｆｖａ Ｍ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２００９；５２９：１−２２；Ｇｉｂｒｉｅｌ ＡＡ．Ｂｒｉｅｆ Ｆｕｎｃｔ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．２０１２ Ｊｕｌ；１１（４）：３１１−８）。この分野における非の打ちどころのない利益にもかかわらず、臨床設定における適用は、いくつかの高度に特殊化された実験室における伝統的なマイクロアレイ技術の使用によって、なおも制限されている（Ｇｕａｒｎａｃｃｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．２０１４ ｐｉｉ：Ｓ０８８８−７５４３（１４））。その主な理由は、研究実験室には適切であるが診断実験室には適切でない、マイクロアレイ技術の複雑さである（同書）。
マイクロアレイのためのＤＮＡサンプル調製は、一般に、（ｉ）ＤＮＡ断片化、（ｉｉ）ＤＮＡ増幅（任意選択、および出発材料の量次第）、および（ｉｉｉ）固体支持体上に固定化されたＤＮＡプローブにハイブリダイズしたサンプルの検出を可能にするための、フルオロフォアによるＤＮＡ標識化を含む。参照および被験サンプルは、別々に処理され得、サンプル間の比較を可能にするために、異なるフルオロフォアで標識化される（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ａｒｒａｙ−Ｂａｓｅｄ ＣＧＨ ｆｏｒ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｐｒｏｔｏｃｏｌバージョン７．２ ２０１２年７月）。一般に、マイクロアレイのためのＤＮＡサンプルは、制限エンドヌクレアーゼ消化または熱ＤＮＡ断片化を使用して断片化され得る。これらの従来のアプローチの中で、エンドヌクレアーゼ消化は、より良い性能を提供するが、これは、実施するのに約２時間２０分かかる。対照的に、９５℃におけるＤＮＡ断片化は、わずか４分以内に達成される。しかし、これは、制限ヌクレアーゼ消化ほど頑強でない場合が多く、ＳＮＰ分析適用、例えば、ＳｕｒｅＰｒｉｎｔ Ｇ３ ＣＧＨ＋ＳＮＰには不適切である。
本明細書で開示する場合、本発明は、３つ全ての段階において顕著な改善を提供する。より具体的には、第１の段階において、トランスポザーゼは、特定のサイズ（２００〜５００ｂｐ、即ち、Ａｇｉｌｅｎｔアレイにとって理想的）へとＤＮＡを同時に断片化し、規定された１９ｂｐのタグを提供する（図２１Ａ）。増幅段階において、現在のＡｇｉｌｅｎｔプロトコールおよび他のＷＧＡ法とは異なり、かなり信頼性が低いランダムプライマーではなく、規定された１９ｂｐのプライマーが使用される（図２１Ｂ）。最後に、標識化ステップにおいて、ランダムプライマーではなく同じ規定されたプライマーが使用されるので、かなり速い標識化が達成される（図２１Ｃ）。
以下の実施例６に示すように、サンプルＤＮＡは、トランスポザーゼ−オリゴヌクレオチド複合体を使用して断片化され得、次いで、これらのＤＮＡ断片は、オリゴヌクレオチドタグで両方の末端においてタグ化され得る。これらのオリゴヌクレオチドタグは、タグに対して相補的なプライマーを用いてＤＮＡ断片を増幅するために使用され得、またはタグに対して相補的なプライマーの着地部位として使用され得、このプライマーは、フルオロフォアで標識化された少なくとも１つのｄＮＴＰを含むｄＮＴＰ混合物を使用して、ポリメラーゼ反応において伸長される。
ＤＮＡインプット次第で、この反応は、わずか５〜２０分の短い時間で起こり得る。より重要なことに、オリゴヌクレオチドタグは、産生されたＤＮＡ断片の各末端に結合される（図２１Ａ）。実施例６に示すように、反応をおよそ中性のｐＨで、４５℃で、短い時間にわたって実施した場合、ＤＮＡ損傷は観察されなかった。トランスポザーゼ法を用いて、理想的なサイズのＤＮＡ断片が、Ａｇｉｌｅｎｔマイクロアレイのために創出された（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ａｒｒａｙ−Ｂａｓｅｄ ＣＧＨ ｆｏｒ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｐｒｏｔｏｃｏｌバージョン７．２ ２０１２年７月）。図２２に示すように、２００ｂ．ｐ．と５００ｂ．ｐ．との間の理想的な断片長が、１６ｐｇ〜２００ｎｇの範囲のＤＮＡインプットにおいて、ルーチンで産生された。
断片化されたＤＮＡは、任意選択である増幅に供され得る。即ち、増幅は、ｇＤＮＡ量が、１パック、２パックもしくは４パックのＡｇｉｌｅｎｔマイクロアレイについては０．５ｕｇ未満、または８パックのマイクロアレイについては０．２ｕｇ未満である場合に、必要とされる。以下の実施例６において、ＤＮＡ増幅を、トランスポザーゼ反応においてＤＮＡ断片の末端に結合されたタグに対して相補的なプライマーを使用するＰＣＲを用いて、実施した（図２１Ｂ）。限定ではなく例として、そのホスホジエステル相補体との二重鎖中のホスホロチオエート含有オリゴヌクレオチド５’−Ａ＊Ｇ＊Ａ＊Ｔ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｇ＊Ａ＊Ｔ＊ＣＡＡＧＡＧＡＣＡ＊Ｇ−３’（配列番号９５）によって断片がタグ化される場合、断片は、プライマー７ ５’−ＡＧＡＴＧＴＧＡＴＣＡＡＧＡＧＡＣＡＧ−３’（配列番号９３、図２１Ｂ）を用いて増幅される。ＰＣＲサイクルの数は、出発ＤＮＡの量に依存する。
多くの熱安定性ＤＮＡポリメラーゼおよびポリメラーゼ組成物が、この目的のために使用され得、例には、Ｔａｑ、Ｔａｑ２０００、Ｐｆｕ、ＰｆｕＵｌｔｒａ、ＰｉｃｏＭａｘｘおよびＨｅｒｃｕｌａｓｅが含まれる。あるいは、ＢｓｔまたはＰｈｉ２９などの高度に進行性のポリメラーゼが、増幅に使用され得る。先行技術のランダムプライマーの代わりに、プライマー７などの本発明の規定されたプライマーを使用すると、かなり迅速かつより良好な品質の増幅を達成することができる。ランダムプライマーは、全ゲノム増幅（ＷＧＡ）法において生成されるバイアスの主要な理由であるので、より良い品質（より少ないバイアス）が、規定されたプライマーを用いて達成される。さらに、ランダムプライマーからのプライミングは、４０９６のヘキサマー組み合わせが存在する場合、着地部位に対する６マープライマーの相対濃度が低いことに起因して、非効率的である。その非効率に関する別の理由は、反応温度が、ランダムプライマーのＴｍを約３０℃上回ることである（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ａｒｒａｙ−Ｂａｓｅｄ ＣＧＨ ｆｏｒ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｐｒｏｔｏｃｏｌバージョン７．２ ２０１２年７月）。一見したところ、後者の問題は、反応温度を低下させることによって解決され得るが、この温度は、酵素反応にとって最適未満となる。従って、本発明の規定されたプライマーを使用することは、増幅バイアスの低減だけでなく、反応条件が最適である場合のサンプルのより速い処理もまた可能にする。
マイクロアレイサンプル調製における第３のステップは、ＤＮＡ標識化である。ＤＮＡ標識化ステップを改善するための理論的根拠は、ＤＮＡ増幅ステップを改善するための理論的根拠と同じであり、それは、規定されたプライマーが、先行技術におけるランダムプライマーとは対照的に、本発明において使用されるということである。一般に、標識化は、参照サンプルについてはシアニン３−ｄＵＴＰを用いて、試験サンプルについてはシアニン５−ｄＵＴＰを用いて、達成される（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ａｒｒａｙ−Ｂａｓｅｄ ＣＧＨ ｆｏｒ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｐｒｏｔｏｃｏｌバージョン７．２ ２０１２年７月）。大腸菌ＤＮＡポリメラーゼのエキソ（−）Ｋｌｅｎｏｗ断片が、ランダムプライマーと組み合わせて使用される。標識化反応は、ランダムプライマーの非効率に主に起因して、約２時間のインキュベーションを必要とする。本明細書に開示された規定されたプライマーを利用することは、ポリメラーゼＩによる塩基対合成の速度が、平均して１０ヌクレオチド／秒と２０ヌクレオチド／秒との間であるので、反応時間を数分に削減する。２００〜５００ヌクレオチドのＤＮＡ断片の３’末端にしっかりとアニーリングした規定されたプライマーを用いると（図２１Ｃ）、約１０分間が、標識化反応のために十分である。ポリメラーゼＩの速度は比較的遅く、解離速度が高いので、より良い処理能力を有するより速い酵素が、この時間をさらに低減させるために、当業者によって選択され得る（Ａｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｐｏｒｔｅｒ−ｌａｂｅｌｅｄ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｂｙ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｓ．２００５，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ３８：２５７−２６４）。例えば、Ｔａｑ、ＶｅｎｔエキソポリメラーゼまたはＰｆｕエキソポリメラーゼを使用するＰＣＲ反応における標識化もまた、選択肢である。
要するに、本明細書に開示されるアダプターおよび方法は、マイクロアレイサンプル調製の顕著な性能改善を達成することを可能にする。制限エンドヌクレアーゼを使用する典型的に好ましい従来の方法は、低いインプットにおいては非実用的であるので、ＤＮＡ断片化ステップにおける改善された品質は、特に低いＤＮＡインプットに関して達成される。熱ＤＮＡ断片化は、制限エンドヌクレアーゼよりも、低いインプットに対してより適切であるものの、ＤＮＡを損傷し、ＳＮＰ適用には適切でない。さらに、ランダムプライマーが使用されないので、品質における顕著な利益（より少ないライブラリーバイアス）が、増幅段階において達成される。改善された効率および時間における低減もまた、３つ全てのステップにおいて達成される。上述のように、ＤＮＡ断片化ステップにおいて、従来の制限エンドヌクレアーゼ消化は、一般に約２時間かかるが、トランスポザーゼアプローチは、約５〜２０分間かかる（ＤＮＡインプット次第）。５０ｎｇのＤＮＡインプットによるＤＮＡ増幅ステップにおいて、従来のＷＧＡ／ＰＣＲは約３時間かかるが、トランスポザーゼ−ＰＣＲアプローチは約１時間かかる。標識化ステップにおいて、帯流電流（ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎ ｃｕｒｒｅｎｔ）−ランダムプライマーアプローチは２時間かかるが、トランスポザーゼ−規定されたプライマーアプローチは約１０分間かかる。全体的な時間節約は、最大で約４〜５時間またはそれ以上であり得る。
本発明のアダプターは、サンプルのかなり速い処理および改善された性能と組み合わせて、マイクロアレイのためのＤＮＡサンプル調製の複雑さを低減させることを可能にする。このアプローチを使用すると、標準的プロトコール（例えば、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ａｒｒａｙ−Ｂａｓｅｄ ＣＧＨ ｆｏｒ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ａｎａｌｙｓｉｓサンプル調製プロトコール）と比較して、効率を改善し、サンプル調製のための時間を数時間低減させ、バイアスを低減させることが可能である。上述のように、これらは、着床前診断、コピー数バリエーションおよびＳＮＰ分析における、単一細胞または低細胞数適用のためにも重要である。
Ｃ．核酸送達
トランスポザーゼは、真核生物細胞、例えば、哺乳動物（Ｓｕｇａｎｕｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｌ Ｒｅｐｒｏｄ．２００５ Ｄｅｃ；７３（６）：１１５７−６３）、昆虫（Ｒｏｗａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｓｅｃｔ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２００４ Ｊｕｌ；３４（７）：６９５−７０５．）および植物（Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｊ．２０１１ ｃｔ；６８（１）：１８６−２００；Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２０１１ Ｓｅｐ；７７（１−２）：１１７−２７）中への遺伝子送達のためツールとして十分確立されている。米国特許第８，２８３，５１８号および同第８，２２７，４３２号もまた参照のこと。本発明のアダプターおよびアダプター−トランスポザーゼ複合体は、疾患の処置、有用なタンパク質の産生、ならびに遺伝子改変された植物および動物の生成のために、植物および動物の細胞中に核酸（例えば、遺伝子）を送達するために、核酸送達ビヒクル中に含まれ得る。
典型的なトランスポザーゼ遺伝子送達系は、トランスポソームを含まないが、その代わりに２つのプラスミドを含み、一方のドナープラスミドは、プロモーターに作動可能に連結された目的の遺伝子をコードし、もう一方のドナープラスミドは、トランスポザーゼをコードする。例えば、Ｍｅｉｒ ａｎｄ Ｗｕ，ＭＣｈａｎｇ Ｇｕｎｇ Ｍｅｄ Ｊ．２０１１ Ｎｏｖ−Ｄｅｃ；３４（６）：５６５−７９；Ｙｕｓａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．１０８，Ｎｏ．４，１５３１−１５３６，２０１１；Ｇｅｒｍｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｔｉｃ，Ｖｏｌ．１７３，Ｎｏ．３：２６５−２７６，２００９；Ｄｅ Ｓｉｌｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，２１：１６０３−１６１３，２０１０）を参照のこと。ドナープラスミドでは、目的の遺伝子およびプロモーターには、互いに対して逆方向のトランスポザーゼ認識配列が隣接する。ヘルパープラスミドでは、トランスポザーゼをコードする配列が、プロモーターに作動可能に連結される。真核生物宿主細胞の細胞質中への同時トランスフェクションの際に、ヘルパープラスミドの一部は、核に到達し、そこで、トランスポザーゼ遺伝子は、ｍＲＮＡへと転写され得、次いで、このｍＲＮＡは、細胞質中に輸送され得、トランスポザーゼタンパク質へと翻訳され得る。このトランスポザーゼは、ドナープラスミドＤＮＡ中のその認識配列に結合し、プラスミド外ＤＮＡ配列を切り出し、認識配列が隣接する目的の遺伝子と共に、複合体、即ち、トランスポソームを形成する。次に、この複合体は、核中に輸送され、そこで、ゲノムＤＮＡに対して作用し得、その中に組み込まれ得る。
代替的なトランスポザーゼベースの遺伝子送達系は、その内容が全体で本明細書に組み込まれる、２０１３年３月１３日出願の米国特許出願第６１／７７９，６２３号に記載されている。この代替法は、植物および動物の細胞中への遺伝子送達を大いに改善する。根本的には、この代替的系は、目的の標的（例えば、核またはミトコンドリア）または宿主細胞の予め選択されたＤＮＡ含有オルガネラにトランスポソームを標的化する標的化エレメントに可逆的にまたは放出可能に連結されたトランスポソーム（即ち、トランスポザーゼ（複数可）に対する２つの結合部位を有する核酸に結合した少なくとも１つのトランスポザーゼ）を含む複合体を含む。使用において、この複合体は、目的の細胞に送達され、それらの細胞によって取り込まれ、細胞内で、予め選択されたＤＮＡ含有オルガネラへと輸送される。一旦予め選択されたＤＮＡ含有オルガネラの内側に入ると、トランスポソームおよび標的化エレメントは、典型的には分離され、このトランスポソームは、核酸を宿主細胞のＤＮＡ中に挿入する。
本発明のアダプターおよびアダプター−トランスポザーゼ複合体は、従来の系および代替的系の両方において使用され得る。これらの系および関連の遺伝子送達方法は、例えば、２０１３年３月１３日出願の米国特許出願第６１／７７９，６２３号に記載される様式で、ゲノムＤＮＡまたは予め選択されたＤＮＡ含有オルガネラのＤＮＡ中に核酸を挿入するために使用され得る。
これらの使用を考慮すると、本発明のアダプターおよびアダプター−トランスポザーゼ複合体は、疾患もしくは障害に罹患している被験体またはかかる疾患もしくは障害を発症する高い可能性がある被験体を処置する方法において使用され得る。この方法は、疾患または障害に罹患している被験体を処置する治療方法であり得る。あるいは、この方法は、将来疾患または障害を発症する高い可能性を有すると疑われる被験体を処置する予防方法であり得る。なお他の実施形態では、この方法は、ＤＮＡワクチンなどを介して、被験体において疾患または障害を予防する方法である。所望の遺伝子をコードする核酸を、特定の制御エレメントの下で被験体の細胞中に送達することによって、特定のタンパク質もしくは核酸が、細胞において発現され得、または特定のタンパク質もしくは核酸の発現は、低減されもしくは無効にされ得、こうして、被験体の処置をもたらす。
目的の配列を有する核酸を送達する能力は、トランスジェニックの非ヒト動物および植物を創出するためにも使用され得る。かかるトランスジェニックの非ヒト動物および植物は、特定のウイルスまたは細菌に対する免疫、特定の薬物または毒素に対する耐性、耐乾燥性、増加したタンパク質対脂肪比、栄養素の産生の増加、医薬的に活性な物質の発現、および有害物質の低減された産生を含む、１または複数の所望の表現型特徴を有し得る。
キット
本発明の別の態様は、キットを提供する。一般に、本発明に従うキットは、上記本発明のアダプターのうちの少なくとも１つ、および例えば、ＤＮＡを断片化するため、断片化および配列決定のため、または核酸送達のために有用なさらなる試薬を含む。
本発明のキットの一実施形態では、１または複数のオリゴヌクレオチドアダプターが、１または複数のコンテナ中に提供される。このアダプターは、１または複数のコンテナ中に液体溶液（例えば、水溶液またはアルコール溶液）として提供され得る。あるいは、このアダプターは、１または複数のコンテナ中に乾燥組成物として提供され得る。実施形態では、２つ以上の異なるアダプターが、単一のコンテナまたは２つ以上のコンテナ中に提供され得る。２つ以上のコンテナが提供される場合、各コンテナは、単一のアダプターを含み得るか、またはこれらのコンテナのうちの１つ、一部もしくは全てが、これらのアダプターのうちの１つ、一部もしくは全ての混合物を含み得る。
このキットは、１または複数の精製されたトランスポザーゼをさらに含み得る。このトランスポザーゼは、１または複数のコンテナ中に、液体溶液としてまたは乾燥組成物として提供され得る。一部の実施形態では、２つ以上の異なる精製されたトランスポザーゼが、単一のコンテナまたは２つ以上のコンテナ中に提供される。２つ以上のコンテナが提供される場合、各コンテナは、単一のトランスポザーゼを含み得るか、またはこれらのコンテナのうちの１つ、一部もしくは全てが、これらのトランスポザーゼのうちの１つ、一部もしくは全ての混合物を含み得る。
好ましくは、これらのアダプターのうちの少なくとも１つは、これらのトランスポザーゼのうちの少なくとも１つに対する認識配列を含む。より好ましくは、このキットの少なくとも１つのトランスポザーゼの認識配列を有する少なくとも１つのアダプターが、提供される。この実施形態では、特定のトランスポザーゼが複数の関連配列を認識し得るので、キット中のトランスポザーゼおよびアダプターは一対一で一致している必要性はないことに留意すべきである。他の実施形態と同様に、キットのこの実施形態では、トランスポザーゼおよびアダプターは、異なるコンテナ中に単一で提供され得、またはトランスポザーゼおよびアダプターの任意の混合物が、任意の数のコンテナ中に提供され得る。
なお別の一実施形態では、このキットは、１または複数のトランスポザーゼ複合体を含み得る。他の実施形態と同様に、これらの複合体は、液体組成物中にまたは乾燥材料として提供され得る。さらに、任意の数の異なる複合体が、キット中に提供され得る。上記のように、これらの複合体は、異なるコンテナ中にもしくは異なるコンテナ上に単一で提供され得、または複合体の任意の混合物が、任意の数のコンテナ中にもしくは任意の数のコンテナ上に提供され得る。
例示的な一実施形態では、このキットは、ビーズまたはナノ粒子などの固体支持体に結合した１または複数のトランスポザーゼ複合体を含む。この実施形態では、この固体支持体は、複合体のためのコンテナとみなされる。これらの複合体は、リンカーによって、例えば特異的結合対によって、固体支持体に結合される。例示的な一実施形態では、これらの複合体は、ＰＣＲプレートのウェルの表面に結合されて提供される。この実施形態では、各ウェルは、単一の型の複合体を含み得る、または２つ以上の異なる複合体を含み得る。キットの別の例示的な一実施形態では、これらの複合体は、ナイロンストリップなどのナイロンメンブレンの表面に結合されて提供される。この実施形態では、これらの複合体は、任意の所望の順序および幾何学的形状で、ならびに任意の組み合わせで、メンブレンに関して分布され得る。例えば、このメンブレンは、一連の線または点としてメンブレン上に配置された単一の複合体を有し得る。あるいは、異なる複合体の一連の線または点が提供され得る（例えば、複合体１は点１上に配置され、複合体２は点２上に配置されるなど）。さらにもう一度、２つ以上の複合体の混合物が、点、線などの上に配置され得る。
上で留意したように、特定の実施形態では、ＧＣ対ＡＴのバイアスを低減させるため、従ってゲノムＤＮＡの断片化の優れた制御を提供するために、異なる認識配列を有する２つ以上の異なるトランスポザーゼ複合体を提供することが好ましい。キットを創出する前に、トランスポザーゼ複合体の混合物を含むキットに関して、１または複数の混合物は、混合物中の複合体の比率を変動させることによって、特定の標的ＤＮＡについてバイアスを最小化するために最適化され得る。当業者は、トランスポザーゼ−アダプター複合体の異なる混合物を創出する方法、それらを固体支持体上に固定化する方法、およびそれらを標的ＤＮＡの断片化に適用する方法を、容易に認識できる。当業者は、断片を増幅および配列決定する方法、配列決定データを分析する方法、最低のバイアスを有する混合物の組み合わせ（比率）を選択する方法、ならびにその組み合わせに基づいてキットを製造する方法もまた、知っている。異なる比率が、異なるＤＮＡ標的のために推奨され得、異なるキットが、異なる型の標的のために製造され得ることに、留意すべきである。例えば、当業者は、ＡＴバイアスを有するより多くのトランスポザーゼ−アダプター複合体が、ＡＴリッチ標的のために使用されるべきであることを認識できる。
２つの異なるトランスポザーゼが存在するキットの特定の実施形態では、これらのキットは、好ましくは、４つの異なるオリゴヌクレオチドアダプターを含む。これらのアダプターのうちの２つは、１つのトランスポザーゼの認識配列（複数可）を含むが、そのうち１つだけが、特異的結合対のメンバーを含む。他の２つのアダプターは、他のトランスポザーゼの認識配列（複数可）を含むが、そのうち１つのみが、特異的結合対のメンバーを含む。アダプターの組み合わせの使用を介して、トランスポザーゼ複合体が形成され得、特異的結合対のメンバーを介して固体基材に結合され得る。
本発明のキットは、本発明の方法を実施するために有用な任意の数のさらなる試薬または物質を含み得る。かかる物質には、宿主細胞の溶解のための試薬（緩衝液を含む）、二価カチオンキレート剤またはヌクレアーゼを阻害する他の薬剤、トランスポザーゼ複合体および反応の他の成分が適切に機能していることを確実にする際に使用するためのコントロールＤＮＡ、ＤＮＡ断片化試薬（緩衝液を含む）、ＰＣＲ反応試薬（緩衝液を含む）、ならびに洗浄溶液が含まれるがこれらに限定されない。本発明のキットは、任意の温度で提供される。例えば、液体中での、トランスポザーゼ、アダプターまたは複合体を含むキットの貯蔵のために、これらのキットは、０℃未満で、好ましくは−２０℃以下で、または他の場合には凍結状態で、提供および維持されることが好ましい。
これらのキットの成分は、コンテナ中または固体基材上に提供され得る。これらのコンテナおよび固体基材は、ボール紙、プラスチック、金属またはそれらの組み合わせで作られた箱などの適切な包装中に包装された組み合わせで提供される。バイオテクノロジー試薬のための適切な包装材料は、当該分野で公知であり広く使用されており、従って、本明細書で特定する必要はない。
用語「核酸」とは、本明細書で使用する場合、ＤＮＡ分子（例えば、ゲノムＤＮＡもしくはｃＤＮＡ）、ＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ）またはＤＮＡもしくはＲＮＡアナログを指す。ＤＮＡまたはＲＮＡアナログは、ヌクレオチドアナログから合成され得る。核酸分子は、一本鎖または二本鎖であり得るが、好ましくは、二本鎖ＤＮＡである。本発明の核酸アダプターは、正準および／または非正準核酸塩基を含み得る。用語「正準」は、ＤＮＡにおいて一般に見出される４種の一般的核酸塩基アデニン、シトシン、グアニンおよびチミンを指すため、または正準塩基を含むそれぞれのデオキシリボヌクレオシド、デオキシリボヌクレオチドもしくは２’−デオキシリボヌクレオシド−５’−三リン酸を指すために、使用される。用語「非正準」は、これら４種の正準塩基以外の、ＤＮＡ中の核酸塩基を指すため、または非正準塩基を含むそれぞれのデオキシリボヌクレオシド、デオキシリボヌクレオチドもしくは２’−デオキシリボヌクレオシド−５’−三リン酸を指すために、使用される。例えば、ウラシルは、ＲＮＡ中の一般的な核酸塩基であるが、ウラシルは、ＤＮＡ中では非正準塩基である。「非正準塩基」は、非正準ヌクレオチドの（例えば、オリゴヌクレオチド合成機を使用する合成による、もしくはＤＮＡポリメラーゼを使用する合成による）取り込みの結果として、または既存の塩基（正準もしくは非正準）の改変の結果として、核酸中に見出される。
用語「オリゴヌクレオチド」とは、ヌクレオチドおよび／またはヌクレオチドアナログの短いポリマーを指す。オリゴヌクレオチドは、好ましくは少なくとも４ヌクレオチド、例えば、少なくとも約１０〜１５、１０〜２０、１５〜２５または１５〜２００ヌクレオチドである。正確なサイズは、多くの因子に依存し、これらは次に、オリゴヌクレオチドの最終機能または使用に依存する。このオリゴヌクレオチドは、化学的合成、ＤＮＡ複製、逆転写、ＰＣＲ、ライゲーションまたはそれらの組み合わせを含む任意の様式で、生成され得る。
「単離された核酸」は、その構造が、いずれの天然に存在する核酸の構造とも同一ではない、または天然に存在するゲノム核酸のいずれの断片の構造とも同一ではない、核酸である。従って、この用語は、例えば、（ａ）天然に存在するゲノムＤＮＡ分子の一部の配列を有するが、それが天然に存在する生物のゲノム中の分子のその一部に隣接する配列の両方によっては隣接されない、ＤＮＡ、（ｂ）得られた分子がいずれの天然に存在するベクターともゲノムＤＮＡとも同一でないような様式で、ベクター中にまたは原核生物もしくは真核生物のゲノムＤＮＡ中に取り込まれた核酸、（ｃ）別個の分子、例えば、ｃＤＮＡ、ゲノム断片、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって産生された断片、または制限断片、および（ｄ）ハイブリッド遺伝子の一部である組換えヌクレオチド配列をカバーする。
本明細書で使用する場合、用語「単離された」、「単離すること」、「単離」、「精製された」、「精製すること」、「精製」、およびそれらの文法的等価物は、本明細書で使用する場合、特記しない限り、材料が単離されるサンプル由来または供給源（例えば、細胞）由来の少なくとも１つの夾雑物（例えば、タンパク質および／または核酸配列）の量における低減を指す。従って、精製は、「富化」、即ち、サンプル中の望ましいタンパク質および／または核酸配列の量における増加を生じる。
本明細書で使用する場合、「タグ」とは、それが接続される核酸断片を取り扱うための手段を提供する、非標的核酸成分、一般にはＤＮＡを指す。例えば、好ましい実施形態では、タグは、タグが結合されるＤＮＡの同定、認識および／または分子的操作もしくは生化学的操作を可能にするヌクレオチド配列を含む（例えば、ＤＮＡポリメラーゼによる伸長のためのプライマーなどのオリゴヌクレオチドをアニーリングするための部位、または捕捉のためもしくはライゲーション反応のためのオリゴヌクレオチドを提供することによる）。タグをＤＮＡ分子に接続するためのプロセスは、時折、本明細書で「タグ化」と呼ばれ、タグ化を受けるＤＮＡまたはタグを含むＤＮＡは、「タグ化された」と言われる（例えば、「タグ化されたＤＮＡ」）。「タグ部分」または「タグドメイン」は、所望の意図した目的または適用のための配列を示すタグの一部分またはドメインを意味する。
本明細書で使用する場合、「配列決定タグ」または「配列決定タグドメイン」は、タグ化された環状ｓｓＤＮＡ断片を合成するため（例えば、合成による配列決定のためのプライミング部位を提供するため、またはライゲーションによる配列決定のためのアニーリング部位を提供するため、またはハイブリダイゼーションによる配列決定のためのアニーリング部位を提供するため）の方法を使用してタグが接続されるｓｓＤＮＡ断片の配列決定を促進することを目的とした配列を示す、タグまたはタグドメインを意味する。例えば、一部の実施形態では、この配列決定タグドメインは、このｓｓＤＮＡ断片またはこのｓｓＤＮＡ断片の相補体のＤＮＡ合成をプライミングするための部位を提供する。
本明細書で使用する場合、「増幅タグ」または「増幅タグドメイン」は、タグが付け加えられる核酸の増幅を促進することを目的とした配列を示す、タグまたはタグドメインを意味する。例えば、一部の実施形態では、この増幅タグまたはドメインは、ＤＮＡポリメラーゼを使用する核酸増幅反応（例えば、ＰＣＲ増幅反応もしくは鎖置換増幅反応、またはローリングサークル増幅反応）のためのプライミング部位、または核酸増幅反応において鋳型依存的リガーゼを使用するプローブのライゲーション（例えば、ライゲーション連鎖反応）のためのライゲーション鋳型を提供する。
本明細書で使用する場合、「検出タグ」または「検出タグドメイン」は、タグ化されたｓｓＤＮＡ断片の検出を促進することを目的とした配列または検出可能な化学的もしくは生化学的部分を示す、タグまたはタグドメインを意味する（例えば、ここで、この配列または化学的部分は、検出可能な分子を含むまたは検出可能な分子に接続される。例えば、可視的、蛍光、化学発光もしくは他の検出可能な色素のなかから選択される検出可能な分子、基質の存在下で検出可能な酵素、例えば、ＮＢＴ＋ＢＣＩＰとのアルカリホスファターゼ、または適切な基質とのペルオキシダーゼ）、検出可能なタンパク質、例えば、緑色蛍光タンパク質、ならびに検出可能な部分に結合される、または別の検出可能な親和性結合分子と親和性結合対もしくは特異的結合対を形成し得る、親和性結合分子、あるいは当該分野で公知の任意の多くの他の検出可能な分子または系）。
本明細書で使用する場合、「アドレスタグ」または「アドレスタグドメイン」は、特定のサンプルの同定を可能にする配列を示す、タグまたはタグドメインを意味する（例えば、ここで、移行される鎖は、各サンプルについて異なる配列を示す異なるアドレスタグドメインを有する）。
本明細書で使用する場合、「ＤＮＡ断片ライブラリー」または「ＤＮＡ断片のライブラリー」は、標的ＤＮＡから生成されたタグ化されたＤＮＡ断片の収集または集団を意味し、ここで、この収集または集団中のタグ化されたＤＮＡ断片の組み合わせは、タグ化されたＤＮＡ断片が生成された標的ＤＮＡの配列を定性的におよび／または定量的に代表する配列を示し、この収集または集団中にあるタグ化されたＤＮＡ断片は、標的ＤＮＡのヌクレオチドまたは配列組成に基づいてタグ化されたＤＮＡ断片を含むまたは排除するかのいずれかの方法を意図的に使用することによって、それについて選択されていない、またはそれに対して選択されていない。種々の理由のために、ＤＮＡ断片ライブラリーは、標的ＤＮＡによって示される全ての配列を示すタグ化されたＤＮＡ断片を含まない可能性があり得る。
本明細書で使用する場合、「標的ＤＮＡ」とは、例えば、タグ化されたＤＮＡ断片のライブラリーを生成するために、転位に供される目的の任意のｄｓＤＮＡを指す。標的ＤＮＡは、１つまたは複数の細胞、組織、臓器、または生きているもしくは死んだかのいずれかの生物由来、あるいは任意の生物学的または環境供給源（例えば、水、空気、土壌）由来を含む、任意のｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏの供給源から誘導され得る。例えば、一部の実施形態では、この標的ＤＮＡは、ヒト、動物、植物、真菌（例えば、カビもしくは酵母）、細菌、ウイルス、ウイロイド、マイコプラズマまたは他の微生物に起源するまたはこれらから誘導される、真核生物および／または原核生物ｄｓＤＮＡを含む、あるいはかかる真核生物および／または原核生物ｄｓＤＮＡからなる。一部の実施形態では、この標的ＤＮＡは、ゲノムＤＮＡ、サブゲノムＤＮＡ、染色体ＤＮＡ（例えば、単離された染色体もしくは染色体の一部分由来、例えば、染色体由来の１もしくは複数の遺伝子もしくは遺伝子座由来）、ミトコンドリアＤＮＡ、葉緑体ＤＮＡ、プラスミドもしくは他のエピソーム由来ＤＮＡ（または、その中に含まれる組換えＤＮＡ）、または第１鎖ｃＤＮＡを生成するためにＲＮＡ依存的ＤＮＡポリメラーゼもしくは逆転写酵素を使用してＲＮＡを逆転写し、ｄｓＤＮＡを生成するために第１鎖ｃＤＮＡにアニーリングしたプライマーを次いで伸長させることによって作製された二本鎖ｃＤＮＡを含む、あるいはこれらからなる。一部の実施形態では、この標的ＤＮＡは、核酸分子中のまたは核酸分子から調製された複数のｄｓＤＮＡ分子（例えば、生物学的（例えば、細胞、組織、臓器、生物）もしくは環境（例えば、水、空気、土壌、唾液、痰、尿、糞便）供給源中のもしくはこれらの供給源由来のゲノムＤＮＡもしくはＲＮＡから調製されたｃＤＮＡ中のまたはかかるゲノムＤＮＡもしくはｃＤＮＡから調製された、複数のｄｓＤＮＡ分子）を含む。一部の実施形態では、この標的ＤＮＡは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ供給源由来である。例えば、一部の実施形態では、この標的ＤＮＡは、一本鎖ＤＮＡからまたは一本鎖ＲＮＡもしくは二本鎖ＲＮＡから（例えば、当該分野で周知の方法、例えば、適切なＤＮＡ依存的および／またはＲＮＡ依存的ＤＮＡポリメラーゼ（逆転写酵素）を使用するプライマー伸長を使用して）ｉｎ ｖｉｔｒｏで調製されるｄｓＤＮＡを含むまたはかかるｄｓＤＮＡからなる。一部の実施形態では、この標的ＤＮＡは、ＤＮＡもしくはＲＮＡ増幅（例えば、ＰＣＲもしくは逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）、転写媒介性の増幅方法、１もしくは複数の核酸分子の全てもしくは一部分の増幅を用いる）、適切な宿主細胞において引き続いて複製されるプラスミド、フォスミド、ＢＡＣもしくは他のベクター中の１もしくは複数の核酸分子の全てもしくは一部分の分子クローニング、またはハイブリダイゼーションによる、例えば、アレイもしくはマイクロアレイ上のＤＮＡプローブへのハイブリダイゼーションによる、１もしくは複数の核酸分子の捕捉（例えば、「配列捕捉」による；例えば、ＲＯＣＨＥ ＮＩＭＢＬＥＧＥＮ、ＡＧＩＬＥＮＴまたはＦＥＢＩＴ製のキットおよび／またはアレイを使用する）、のための方法を含む、当該分野で公知の任意の方法を使用して、１または複数の二本鎖または一本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡ分子の全てまたは一部分から調製されるｄｓＤＮＡを含む、あるいはかかるｄｓＤＮＡからなる。
「プライマー」は、核酸ポリメラーゼによって伸長され得る遊離３’−ＯＨ基を一般に有する、オリゴヌクレオチド（「オリゴ」）である。鋳型依存的ポリメラーゼのために、一般に、プライマーオリゴの少なくとも３’部分は、ＤＮＡポリメラーゼによる合成の開始のためのプライマー／鋳型複合体を得るために、オリゴが水素結合および他の分子力によって鋳型に「結合する」（または「複合体化する」、「アニーリングする」もしくは「ハイブリダイズする」）、ならびにＤＮＡ合成のプロセスにおいて鋳型に対して相補的なその３’末端において連結された共有結合した塩基の付加によって伸長される（即ち、「プライマー伸長される」）、鋳型核酸の一部分に対して相補的である。その結果は、プライマー伸長産物である。鋳型依存的ＤＮＡポリメラーゼ（逆転写酵素を含む）は、一般に、ＤＮＡ合成を開始するために（「プライミング」）、一本鎖鋳型へのオリゴヌクレオチドプライマーの複合体化を必要とするが、ＲＮＡポリメラーゼは、一般に、ＤＮＡ鋳型に対して相補的であるＲＮＡの合成（転写）のためにプライマーを必要としない。
本明細書で開示する場合、いくつかの値の範囲が提供される。その範囲の上限と下限との間の、下限の単位の１０分の１までの各介在する値もまた、文脈が明確に他を示さない限り、具体的に開示されていることが理解される。述べられた範囲における任意の述べられた値または介在する値と、その述べられた範囲における任意の他の述べられた値または介在する値との間の、各々のより小さい範囲は、本発明内に包含される。これらのより小さい範囲の上限および下限は、その範囲中に独立して含まれまたは排除され得、より小さい範囲中にいずれかの限界値が含まれる、いずれの限界値も含まれない、または両方の限界値が含まれる各範囲もまた、本発明の範囲内に包含され、述べられた範囲における任意の具体的に排除された限界値の支配下にある。述べられた範囲が、これらの限界値の一方または両方を含む場合、これらの含まれた限界値のいずれかまたは両方を排除する範囲もまた、本発明に含まれる。
特異的トランスポザーゼのための複数のアダプターを設計する
この実施例は、ネイティブまたは公知のトランスポザーゼ認識配列に基づいてトランスポザーゼアダプターを設計および生成することを記載する。
ネイティブまたは公知のトランスポザーゼ認識（アダプター）配列を、「高活性」Ｔｎ５トランスポザーゼの「モザイク」などのように刊行物から（Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．１９９８；２７６（５）：９１３−２５）、またはＶｉｂｈａｒトランスポザーゼについてと同様にバイオインフォマティクスの方法を使用して（米国特許出願公開第２０１２０３０１９２５号）、得た（図１）。簡潔に述べると、微生物ヌクレオチドｂｌａｓｔを、ｂｌａｓｔｎアルゴリズム（高度に類似した配列のために最適化されたＭｅｇａｂｌａｓｔ、代表的ゲノムのみ、最大標的配列２５０、期待閾値１０、ギャップコスト線形、低い複雑さの領域をフィルタリング）を使用して、ＮＣＢＩ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ＢＬＡＳＴウェブサイト（ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ？ＰＡＧＥ＿ＴＹＰＥ＝ＢｌａｓｔＳｅａｒｃｈ＆ＰＲＯＧ＿ＤＥＦ＝ｂｌａｓｔｎ＆ＢＬＡＳＴ＿ＰＲＯＧ＿ＤＥＦ＝ｍｅｇａＢｌａｓｔ＆ＳＨＯＷ＿ＤＥＦＡＵＬＴＳ＝ｏｎ＆ＢＬＡＳＴ＿ＳＰＥＣ＝ＭｉｃｒｏｂｉａｌＧｅｎｏｍｅｓ）上で、公知のトランスポザーゼ認識配列に対して実施した。発見されたトランスポザーゼ認識配列（アダプター）の妥当性を、配列の近くにあるトランスポザーゼ遺伝子を見出すことによって確認した。
次に、複数のアダプターを、ネイティブトランスポザーゼアダプターに基づいて、または特定のトランスポザーゼのために既に開発された改変されたアダプター、例えば、Ｔｎ５トランスポザーゼのための「モザイク」もしくはＶｉｂｈａｒトランスポザーゼのためのアダプター３ｉｌおよび８ｉｌに基づいて、設計した（米国特許出願公開第２０１２０３０１９２５号）。転位事象におけるカットに最も近く（天然にトランスポゾンの内側に面する）、同じファミリーのトランスポザーゼの間で保存されているヌクレオチド位置を、改変のために選択した。図１に示される１位が好ましかったが、例えば、図２にＴｎ５トランスポザーゼについて示されるように、１位は、カットに隣接しており、触媒部位中に位置付けられるので、トランスポザーゼ特性をモジュレートするためには１位が最も重要であるので、２位および／または３位はあまり好ましくない。
Ｖｉｂｈａｒトランスポザーゼについて図３に、「高活性」Ｔｎ５トランスポザーゼについて図４に示すように、この位置は、いずれかの鎖もしくは両方の鎖上の１つのヌクレオチドを、ネイティブもしくは改変されたヌクレオチドに置換すること、または少なくとも１つのネイティブもしくは改変されたヌクレオチドを一方の鎖もしくは両方の鎖に付加すること、または１つの鎖から少なくとも１つのヌクレオチドを除去すること、または上記の組み合わせによって、改変され得る。改変されたヌクレオチドの例は、上記されている。
高い、中間のおよび低いインプットのＮＧＳのためにアダプターを選択する
この実施例では、上記実施例１で生成したいくつかのトランスポザーゼアダプターを、異なるＤＮＡインプットレベルにおけるＮＧＳのためにゲノムＤＮＡを断片化することにおけるそれらの活性について試験した。
説明を単純にするために、この実施例で使用したアダプターを、図５Ｂに示すように番号付けし、図中、両方の鎖上の１位における塩基、上の鎖上のさらに５’の塩基、および下の鎖上のさらに３’の塩基のみが示される。Ｖｉｂｈａｒトランスポザーゼに、以前に記載されたように（米国特許出願公開第２０１２／０３０１９２５号）Ｉｌｌｕｍｉｎａ機器での配列決定に必要なさらなるヌクレオチド配列が提供された３ｉｌおよび８ｉｌアダプターをロードし、大腸菌ＤＮＡ（ＡＴＣＣカタログ番号８７３９Ｄ−５）の断片化に適用した。
高いＤＮＡインプットについて、断片化を、２００ｎｇの大腸菌ＤＮＡである大腸菌（Ｍｉｇｕｌａ）ＣａｓｔｅｌｌａｎｉおよびＣｈａｌｍｅｒｓ（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）、１０ｍＭ Ｂｉｃｉｎｅ−ＮＨ４ ｐＨ７．５、５ｍＭ ＭｎＣｌ２、１２ｍＭグルタミン酸カリウムならびに５０ｕｇ Ｖｉｂｈａｒトランスポザーゼを含む２０μｌの反応混合物中で実施した。この反応混合物を、４６℃または５６℃で１５分間インキュベートし、最大２０ｍＭのＥＤＴＡの添加によって停止させた。断片化およびタグ化されたＤＮＡを、製造業者の指示に従って、Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ ＡＭＰｕｒｅ ＸＰシステム、別名ＳＰＲＩビーズ（Ｂｅｃｋｍａｍ Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）を使用して、取り込まれていないアダプターから精製した。１回のＰＣＲ反応由来のＤＮＡを、ビーズから２０μｌの水中に溶出させた。
次に、断片化およびタグ化されたＤＮＡを、ＰＣＲにおいて増幅した。２０μｌのＰＣＲ反応混合物は、２μｌのＳＰＲＩビーズ精製された鋳型、４μｌの５×Ｈｅｒｃｕｌａｓｅ ＩＩ Ｒｘｎ緩衝液、０．５μｌ Ｈｅｒｃｕｌａｓｅ（登録商標）ＩＩ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、ＣＡ）、１ｍＭ ｄＮＴＰｓ、５％ＤＭＳＯ、共に１ｕＭの濃度のフォワードプライマーＡｇＰ１ ５’−ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡＴＣＴＡＣＡＣＧＣＴＧＡＣＧＴＣＧＡＧＡＣＴＴＧＴＧＡ−３’（配列番号７７）およびリバースプライマーＡｇＰ２ ５’−ＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡＣＧＡＧＡＴＣＧＧＴＧＧＡＧＣＴＧＴＧＣＧＴＡＧＡＴＧＴＧＡ−３’（配列番号７８）を含んでいた。増幅を、アダプターギャップを充填し、下のアダプター鎖を置換するために、７２℃で２分間のインキュベーションで開始し、その後、９５℃で３分間のＤＮＡ融解ステップ、ならびに１１サイクルの、ｉ）９５℃で４０秒間の変性、ｉｉ）６１℃で１．５分間のアニーリング、およびｉｉｉ）７２℃で３分間の伸長を行った。これらのサイクルの後に、ＰＣＲ断片が完全に二本鎖になるのを確実にするために、７２℃で１０分間のインキュベーションを行った。ＰＣＲ断片を、２％アガロースゲルにおいて分離し、エチジウムブロマイドで染色した。これらのゲルを、ＭｕｌｔｉＩｍａｇｅ（商標）ｍｕｌｔｉｉｍａｇｅ ｌｉｇｈｔ ｃａｂｉｎｅｔ（Ａｌｐｈａ Ｉｎｎｏｔｅｃｈ、Ｓａｎ Ｌｅａｎｄｒｏ、ＣＡ）を使用して、３０２ｎＭの波長で写真撮影した。
図６に示されるゲルからわかるように、高いＤＮＡインプットでは、アダプターのほとんどが、Ｉｌｌｕｍｉｎａ機器でのＮＧＳのためのＤＮＡの断片化およびタグ化において適切な活性を示し、これは、保存された１位における変化のほとんどが、十分に耐容されたことを示している。従って、適切な活性を有する複数のアダプターが、Ｖｉｂｈａｒネイティブアダプターの１位において保存的ＣＧ対を変化させているにもかかわらず、創出された。さらに、アダプターは、トランスポザーゼに異なる特性を付与し、例えば、アダプター８は、より高い活性を付与するようであり、これはより小さい断片サイズを生じ、これをさらなる実験において確認した（図７）。
増加した活性は、特に、低いＤＮＡ濃度を有するサンプルを分析する必要性がある場合に、多数の適用のために有用である。これらの使用の例には、単一細胞ゲノム配列決定、単離された染色体または小さいゲノムの配列決定、血液由来の遊離ＤＮＡの分析、および複雑な生態系の理解が含まれる。例えば、Ｇｉｏｒｇｉ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．２０１３；８（２）：ｅ５７９９４．ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００５７９９４，Ｆｏｄｏｒ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．２０１２；７（７）：ｅ４１２９４．ｄｏｉ：１０．１３７１）を参照のこと。従って、いくつかのアダプターを、中間のおよび低いＤＮＡインプットについて評価した。
実験を、より少ないＤＮＡおよびより少ないトランスポザーゼをこれらの研究において使用し、より多くのＰＣＲ増幅サイクルを適用したことを除いて、高いＤＮＡインプットについてと同様に実施した。図８Ａに示すデータからわかるように、２０ｎｇのインプット、１１回のＰＣＲサイクルで、最良の活性が、アダプター１２を用いて得られた。１ｎｇのインプット（図８Ｂ）、１５回のＰＣＲサイクルでは、同じアダプター１２は、アダプター６、７、８および２７と共に、親アダプター１および他の誘導体アダプターよりも有意に高い活性もまた示した。
同様に、アダプター６、８、１２および２７、ならびにさらにアダプター１３および１７は、６８ｐｇのＤＮＡインプット（図８Ｃ）、１９サイクルにわたる増幅において、より高い活性を示した。最後に、アダプター８、１７および２７は、４ｐｇのＤＮＡインプット（図８Ｄ）、即ち、単一のヒト細胞のＤＮＡ含量未満において、最良の活性を示した。増幅は、２３サイクルにわたって実施した。アダプター８は、一貫して、ロードされたトランスポザーゼ濃度の広い範囲において、アダプター１よりもＤＮＡ断片の良い収量を付与した（図９）。重要なことに、２６回のＰＣＲサイクルを要した０．５ｐｇ（二倍体ヒト細胞の約１／１３のＤＮＡ含量）の低いＤＮＡインプットでさえも、いずれの試薬由来のバックグラウンドも存在しなかった（図１０）。比較のために、市販のキット（Ｎｅｘｔｅｒａ ＸＴ ＤＮＡ Ｓａｍｐｌｅ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｋｉｔｓ、Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を使用した処理のために推奨される最も少量のＤＮＡは、１ｎｇであり、即ちヒト細胞のＤＮＡ含量よりも約１５０倍多い。全体として、１位におけるＧからＡへの置換は、より高い活性を付与し（アダプター６、８、１３、１７および２７）、この位置におけるＧからＡへの置換およびミスマッチの組み合わせは、反対の鎖上にＣを含むアダプター８および２７において、活性をさらに増加させた。１位にネイティブのＧを有するが、反対の鎖上にミスマッチを有するアダプター７および１２もまた、増加した活性を付与した。別の重要な一態様は、異なるアダプターがロードされたトランスポザーゼ量が、特定の範囲のトランスポザーゼロードおよび標的ＤＮＡ濃度において動作することである。例えば、実験の条件において、アダプター１２がロードされたＶｉｂｈａｒトランスポザーゼは、ＤＮＡインプット範囲６８ｎｇ〜２０ｎｇにおいて良好に動作したが、アダプター１７がロードされたトランスポザーゼは、範囲４〜６８ｐｇにおいて良好に動作し、１ｎｇでは活性をほとんど有さず、２０μｌのトランスポザーゼ反応当たり２０ｎｇのより高いＤＮＡインプットでは、事実上不活性であった（図８）。アダプター１３は、狭い活性範囲を付与し、６８ｐｇのＤＮＡインプットにおいてのみ最良に動作した。
ＮＧＳのためのサンプル調製においてバイアスを最小化する
ペアードエンド配列決定（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）およびＩｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ（Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）は、ＮＧＳプラットホームにおいて最も広く使用されている。いずれかのプラットホームのためのサンプルは、同じ反応混合物においてＤＮＡの断片化およびアダプターの結合を数分間で同時に実施するトランスポザーゼ法を使用して、調製され得る。しかし、上述のように、従来のトランスポザーゼ媒介性のＤＮＡ断片化は、あまりランダムではなく、ランダムさを増加させ重複率を減少させる必要性が存在する。
この実施例では、異なるアダプターが異なる重複率を付与することが発見された。図１１に示すように、アダプター９およびアダプター５は、第１の位置においてネイティブのＣＧ対を有する標準的アダプター１よりも有意に低い重複率を付与した。アダプター６およびアダプター８は、より高い重複率を付与し、アダプター７およびアダプター１０は、アダプター１とおよそ同じ重複率を付与した。驚くべきことに、アダプターの混合物は、これらのアダプターのいずれよりもかなり低い重複率を付与した（図１１）。
可能な解釈は、異なるアダプターがロードされたトランスポザーゼが、標的ＤＮＡ上の異なる場所に偏っているということである。トランスポザーゼによってより熱心に認識されるこれらの場所は、「ホットスポット」と呼ばれる（Ｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ．１９８３，１０５（４）：８１３−２８）。ホットスポットエリアはより頻繁に配列決定されるので、これらのホットスポットは、重複を大いに担う。しかし、異なるアダプターは異なるホットスポットを付与する。これらのホットスポットは、異なるアダプターによって異なるので、異なるアダプターがロードされたトランスポザーゼ混合物を適用することは、ホットスポットをランダム化し、重複率を低減させる。さらに、低い重複率を個々に付与するアダプターの混合物について選択することは、重複率をさらにもっと低減させ得る。異なるアダプターがロードされたトランスポザーゼロードは、他の特性、例えば、異なるＡＴドロップアウト率においても異なる（図１２）。
ＮＧＳサンプル調製のためにプライマー伸長を妨害する
この実施例では、アッセイを実施して、ＮＧＳサンプル調製のためにプライマー伸長を妨害する改変を有するトランスポザーゼアダプターを試験した。
１つのアプローチでは、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼが止まるｄＵ改変を、図１３Ｂに示すように、アダプター対２および３中に、ＰＣＲプライマーＡｇＰ１およびＡｇＰ２の着地部位の下流に導入して、ＰＣＲにおけるアダプターの下の鎖（オリゴヌクレオチド３Ｕ２、８Ｕ２、３Ｕ４および８Ｕ４）のコピーを妨害した。アダプターのコピーおよび増幅は止まったが、ギャップ修復の後、タグ化されたＤＮＡ断片は改変されたヌクレオチドを含まないので、標的ＤＮＡ断片の増幅は妨害されずに進行した。別のアプローチでは、アダプターの下の鎖の３’末端を、プライマー伸長プロセスを妨害するように、逆方向ｄＴで遮断した（図１３Ｂ、アダプター対４を参照のこと）。この逆方向ｄＴには、ホスホロチオエート結合が先行して、ＤＮＡポリメラーゼの３’エキソヌクレアーゼ活性による逆方向ｄＴの除去を防止した。
トランスポザーゼ反応を、上記の様式で実施し、トランスポザーゼ反応産物を、ＡｇＰ１およびＡｇＰ２プライマーと共にＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（ＨｅｒｃｕｌａｓｅＩＩ、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用するＰＣＲにおいて直接増幅し、２％アガロースゲルにおいて分離し、エチジウムブロマイドで染色し、このとき、１ｋｂ＋ＤＮＡラダー（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を、試験したＤＮＡサンプルと並行して泳動した。
図１４Ａに示すように、標的ＤＮＡインプットなしでＡｇＰ１およびＡｇＰ２プライマーを使用するＰＣＲにおいて増幅した場合、標準的アダプター対１がロードされたＶｉｂｈａｒトランスポザーゼによるトランスポザーゼ反応は、大量の小さいサイズの副産物を生成した。対照的に、これらの小さいサイズ副産物の生成は、アダプター対３および４を使用した場合には妨害された。中間のＤＮＡインプット（即ち、２０μｌのトランスポザーゼ反応当たり２０ｎｇの標的ヒトＤＮＡおよび５ｕｇのロードされたトランスポザーゼ）を、トランスポザーゼ反応において使用したところ、標準的トランスポザーゼアダプター対１を使用する反応のＰＣＲ増幅は、有用な産物を事実上を生じなかった。図１４Ｂを参照のこと。対照的に、アダプター対３または４は、満足な収量のタグ化されたＤＮＡ産物を生じた。
上記の結果は、ｄＵまたは逆方向ｄＴのいずれかを用いて妨害することが、アダプター−プライマーダイマーの産生を実質的に低減させ、中間のＤＮＡインプットにおいて、満足な収量のタグ化されたＤＮＡ ＰＣＲ産物をもたらしたことを示している。
これらのアッセイを、高いＤＮＡインプット（即ち、２０ｕｌのトランスポザーゼ反応当たり２００ｎｇの標的ヒトＤＮＡおよび５０ｕｇのロードされたトランスポザーゼ）を使用しても実施した。図１５に示すように、高いＤＮＡインプットを用いた場合、同じプライマーを用いたトランスポザーゼ反応の増幅は、再び、標準的トランスポザーゼアダプター１、またはアダプター対２もしくは３を使用した場合には、有用な産物を事実上生じなかった。しかし、タグ化されたＤＮＡ断片の収量は、アダプター対４がロードされたトランスポザーゼを使用した場合、満足のいくものであった。これらの結果は、高いＤＮＡインプットにおいて、アダプター対２および３の妨害能力が、アダプター対４のものよりも効率的でなく、アダプター対４と同様に３’末端を遮断することが、好ましい実施形態を提示することを示している。
重要なことに、本発明の全てのアダプター改変は、トランスポザーゼ反応と適合性である。ＰＣＲ増幅をＳＰＲＩ精製後に実施した場合、改変されたアダプター対２、３、４または改変されていないアダプター対１のいずれも、匹敵する量の標的ＤＮＡ断片を生成した（図１５、ＳＰＲＩ＋）。さらに、アダプター対４を用いると、これらの断片の収量は、ＳＰＲＩ精製ありでもなしでも事実上同じであった（図１５）。
つまり、より少ないアダプターをトランスポザーゼ反応において使用し、結果としてより少ないアダプターがＰＣＲに添加された場合には、アダプター対３および４の両方が、ＰＣＲ反応が「毒される」ことを防止することにおいて効率的であったが（図１４Ｂ）、アダプター対４のみが、増加した標的ＤＮＡおよびアダプターインプットでＰＣＲが「毒される」ことを防止することにおいて効率的であった（図１５）。これらの結果を考慮すると、標的ＤＮＡインプット次第でロードされたトランスポザーゼの量を、トランスポザーゼ反応において特定のアダプター改変に対して使用されるロードされたトランスポザーゼの量を最適化する方法は、当業者に即座に明らかである。
低い数の細胞からのＮＧＳのためのＤＮＡサンプルの調製
この実施例では、ホスホロチオエート結合ありまたはなしのトランスポザーゼアダプターを使用して、低い数の細胞からのＮＧＳのためにＤＮＡサンプルを調製した。
簡潔に述べると、ＤＮＡを、３つのヒト細胞由来のＤＮＡ材料に対応する２０ｐｇのヒトＤＮＡから調製した。このＤＮＡを、ホスホロチオエート結合を有さない標準的アダプター３ｉｌ／８ｉｌを使用し、異なる濃度のトランスポザーゼ（５０または１００ｎｇ／ｍｌ）を用いるトランスポザーゼ反応において、断片化およびタグ化し、ＡｇＰ１およびＡｇＰ２プライマーを使用してＰＣＲサイクルにおいて増幅した。次いで、これらのＰＣＲ断片を、２％アガロースゲルにおいて分離し、エチジウムブロマイドで染色した。結果を図１７に示す。この図に示すように、満足な収量の適切なＤＮＡ断片が、３つの細胞由来のＤＮＡを用いた２５分間のトランスポザーゼ反応の後に観察されたが、ＮＧＳのために望ましいサイズ範囲の断片（２００〜５００ｂｐ）は、反応の４２分の時点において、ほぼ完全に消失した。この結果は、トランスポザーゼ反応の２５分の時点においてさえも、適切な材料の喪失がかなりのものであり得、５０％以上の量になり得ることを示しており、これは、ＮＧＳ適用のためには許容できない。
上記のアッセイを、アダプターＥ８およびアダプター７８を用いて繰り返した。これら２つのアダプターは、アダプターＥ８が図１８の上において示される位置においてホスホロチオエート結合を有することを除いて、同一である。結果を図１８に示す。
この図に示すように、ホスホロチオエート結合の組み合わせ（アダプターＥ８）が、トランスポザーゼ反応効率における大きな改善を付与したことは、予測されていなかった。改善は、異なるトランスポザーゼ濃度（２０ｐｇのヒトＤＮＡインプットで、１８０ｎｇ／ｍｌ、１２０ｎｇ／ｍｌおよび８０ｎｇ／ｍｌ）ならびに異なるインキュベーション時間（６〜７０分間）におけるいくつかの実験において、一貫して観察された。ほとんどの部分について、この改善は、ヌクレアーゼに対する保護に起因しなかったこともまた見出された。実際、ヌクレアーゼ分解は、同じヌクレオチド配列を有するがホスホロチオエート結合を含まない短いアダプター７８では事実上観察されなかった（図１８）。
標準的アダプター３ｉｌおよび８ｉｌ（図１６）とは異なり、アダプター７８およびそのホスホロチオエート誘導体Ｅ８は、トランスポザーゼによって認識され、そのトランスポザーゼによって結合され、大部分が隠されてヌクレアーゼ攻撃から保護される可能性が高い、１９ｂ．ｐ．の二重鎖のみからなった。ヌクレアーゼ活性は、標準的アダプターの単鎖部分を認識し、それが消化するＤＮＡ断片の内部へと反転するという可能性がある。かなりのサイズのタンパク質、例えば、トランスポザーゼダイマー（ＭＷ約１０２ＫＤ）が、かかる手技に必要である。大腸菌由来の常在性ヌクレアーゼはサイズが小さく、大腸菌は十分に研究されており、かかる活性は大腸菌では記載されてこなかったので、大腸菌由来の常在性ヌクレアーゼがＤＮＡ分解を担う可能性は低いと思われる。
要するに、これらの結果は、トランスポザーゼ反応の効率が、ホスホロチオエート結合をアダプターに付加することによって大きく改善されたことを示している。
マイクロアレイ適用のためのＤＮＡサンプルの調製
この実施例では、ホスホロチオエート結合ありまたはなしのトランスポザーゼアダプターを使用して、マイクロアレイ適用のためのＤＮＡサンプルを調製した。そのために、１６ｐｇおよび２００ｎｇのＤＮＡを、図２１Ａ〜Ｃに示されるプロセスに供した。
最初に、サンプルＤＮＡを、トランスポザーゼ−オリゴヌクレオチド複合体を使用して断片化し、そのホスホジエステル相補体との二重鎖中にホスホロチオエート含有オリゴヌクレオチド５’−Ａ＊Ｇ＊Ａ＊Ｔ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｇ＊Ａ＊Ｔ＊ＣＡＡＧＡＧＡＣＡ＊Ｇ−３’（配列番号９５）を有するオリゴヌクレオチドタグで、両方の末端においてタグ化した。次いで、増幅段階において、断片化されたＤＮＡを、トランスポザーゼ反応においてＤＮＡ断片の末端に結合されたタグに対して相補的であるプライマー７（５’−ＡＧＡＴＧＴＧＡＴＣＡＡＧＡＧＡＣＡＧ−３’、配列番号９３）を使用してＰＣＲ増幅した（図２１Ｂ）。ここで、従来のプロトコールおよびＷＧＡとは異なり、信頼性の低いランダムプライマーではなく、規定された１９ｂｐプライマーを使用した（図２１Ｂ）。ＰＣＲサイクルの数は、出発ＤＮＡの量に依存する。最後に、標識化ステップにおいて、オリゴヌクレオチドタグおよびプライマーを使用して、フルオロフォアで標識化された少なくとも１つのｄＮＴＰを含むｄＮＴＰ混合物の存在下で、ＤＮＡ断片を増幅した。このステップを、ランダムプライマーベースの従来の方法よりもかなり速い、約１０分間で実施した。
得られたＤＮＡ断片を、１ｋｂ＋ＤＮＡラダー（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と共に、２％アガロースゲルにおいて分離し、エチジウムブロマイドで染色した。結果を図２２Ａ〜Ｂに示す。これらの図に示されるように、２００ｂｐと５００ｂｐとの間の長さを有する断片を、１６ｐｇ〜２００ｎｇの範囲のＤＮＡインプットにおいてルーチンで産生したところ、ＤＮＡ断片化段階において、トランスポザーゼが、特定したサイズ（２００〜５００ｂｐ、これはアレイにとって理想的であった）へとＤＮＡを同時に断片化し、規定された１９ｂｐのタグを提供したことが示された（図２１Ａ）。反応をおよそ中性のｐＨで、４５℃で、短い時間にわたって実施した場合、ＤＮＡ損傷は観察されなかった。トランスポザーゼ法を用いて、理想的なサイズのＤＮＡ断片が、Ａｇｉｌｅｎｔマイクロアレイのために創出された（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ａｒｒａｙ−Ｂａｓｅｄ ＣＧＨ ｆｏｒ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｐｒｏｔｏｃｏｌバージョン７．２ ２０１２年７月）。
先行技術のランダムプライマーの代わりに、プライマー７などの規定されたプライマーを使用することで、より早くかつより良い品質の増幅が達成されたことが見出された。これらの結果は、規定されたプライマーを使用することで、反応条件が最適な場合には、増幅バイアスの低減だけでなく、サンプルのより速い処理もまた可能になることを示している。
好ましい実施形態の上述の例および説明は、特許請求の範囲によって規定される本発明を限定するのではなく、例示すると解釈すべきである。容易に理解されるように、上に示される特徴の多数のバリエーションおよび組み合わせが、特許請求の範囲に示される本発明から逸脱することなしに、利用され得る。かかるバリエーションは、本発明の範囲からの逸脱とはみなされず、全てのかかるバリエーションが、以下の特許請求の範囲の範囲内に含まれる意図である。本明細書に引用される全ての参考文献は、その全体が本明細書に組み込まれる。

Claims (37)

  1. 第１の配列を含む第１の鎖と、
    前記第１の配列に対して相補的または実質的に相補的である第２の配列を含む第２の鎖と
    を含む、単離された合成核酸アダプターであって、
    前記アダプターは、トランスポザーゼのネイティブ認識配列と比較して、１または複数の改変を有するトランスポザーゼ認識配列を含み、前記１または複数の改変は、以下：
    （ａ）前記第１の配列の５’末端（１位）もしくは前記第２の配列の３’末端、またはそれらの両方における、１または複数の改変、
    （ｂ）前記第１の鎖または前記第１の配列における１または複数の改変されたヌクレオチドであって、前記１または複数の改変されたヌクレオチドは、前記第１の鎖のプライマー伸長を妨害する、１または複数の改変されたヌクレオチド、および
    （ｃ）前記第２の鎖または前記第２の配列における１または複数のホスホロチオエート結合、
    からなる群から選択される改変であり、かつ、前記アダプターは前記トランスポザーゼによって認識され、
    前記第１の配列および前記第２の配列が、それぞれ、配列番号７５および配列番号７６、配列番号２８および配列番号３６、配列番号２８および配列番号２２、配列番号２および配列番号３６、配列番号２および配列番号７４、配列番号２６および配列番号２２、配列番号２６および配列番号３６、配列番号２４および配列番号３６、または配列番号７５および配列番号３６である、単離された合成核酸アダプター。
  2. 前記第１の配列が、前記ネイティブ認識配列と比較して、その５’末端において少なくとも１つの付加されたヌクレオチドを有するか、または前記第２の配列が、相補体と比較して、その３’末端において少なくとも１つの付加されたヌクレオチドを有する、請求項１に記載のアダプター。
  3. 前記第１の配列が、前記ネイティブ認識配列と比較して、その５’末端において少なくとも１つのヌクレオチドを欠失しているか、または前記第２の配列が、相補体と比較して、その３’末端において少なくとも１つのヌクレオチドを欠失している、請求項１に記載のアダプター。
  4. 前記（ｂ）の前記１または複数の改変されたヌクレオチドが、デオキシウリジン、脱塩基部位、２’ＯＭｅで改変されたリボ核酸（ＲＮＡ）および逆方向チミジンからなる群から選択される、請求項１から３のいずれか１項に記載のアダプター。
  5. 前記逆方向チミジンが、前記第１の鎖の３’末端に存在する、請求項４に記載のアダプター。
  6. 前記１または複数の改変されたヌクレオチドに、ホスホロチオエート結合またはスペーサーが先行する、請求項１から５のいずれか１項に記載のアダプター。
  7. 前記第２の鎖が、前記１または複数の改変されたヌクレオチドを含まない、請求項１から６のいずれか１項に記載のアダプター。
  8. １つのホスホロチオエート結合が、前記第２の鎖または前記第２の配列の３’側の最後のヌクレオチドと３’側の最後から２番目のヌクレオチドとの間に存在する、請求項１から７のいずれか１項に記載のアダプター。
  9. 前記第２の鎖または前記第２の配列が、約１〜１８のホスホロチオエート結合を含む、請求項８に記載のアダプター。
  10. 前記第２の鎖または前記第２の配列が、約２〜１５のホスホロチオエート結合を含む、請求項９に記載のアダプター。
  11. 前記第２の鎖または前記第２の配列が、約９のホスホロチオエート結合を含む、請求項１０に記載のアダプター。
  12. 前記第１の鎖または第１のアダプター配列が、ホスホロチオエート結合を含まない、請求項１から１１のいずれか１項に記載のアダプター。
  13. 前記第１または第２の鎖が、１７〜８０ヌクレオチド長である、請求項１から１２のいずれか１項に記載のアダプター。
  14. 前記第１の鎖および前記第２の鎖が、１５〜３０ｂｐ長である二重鎖を形成する、請求項１から１３のいずれか１項に記載のアダプター。
  15. 前記二重鎖が、前記第２の鎖の３’末端または前記第１の鎖の５’末端において、平滑末端または付着末端を有する、請求項１４に記載のアダプター。
  16. 前記第１または第２の配列における前記１または複数の改変の結果、前記二重鎖において１または複数の未対合のヌクレオチドが生じる、請求項１４または１５に記載のアダプター。
  17. 前記第１または第２の鎖が、２−アミノプリン、２，６−ジアミノプリン、５−ブロモｄＵ、デオキシウリジン、逆方向ｄＴ、逆方向ジデオキシ−Ｔ、ジデオキシ−Ｃ、５−メチルｄＣ、デオキシイノシン、５−ニトロインドールを含むユニバーサル塩基、２’−Ｏ−メチルＲＮＡ塩基、イソ−ｄＣ、イソ−ｄＧ、リボヌクレオチド、モルホリノ、タンパク質ヌクレオチドアナログ、グリコイックヌクレオチドアナログ、ロックトヌクレオチドアナログ、トレオースヌクレオチドアナログ、鎖終結ヌクレオチドアナログ、チオウリジン、プソイドウリジン、ジヒドロウリジン、キューオシンおよびウィオシンからなる群から選択される少なくとも１つの改変されたヌクレオチドを含む、請求項１から１６のいずれか１項に記載のアダプター。
  18. 前記第１または第２の鎖における少なくとも１つのヌクレオチドが、リン酸化されている、請求項１から１７のいずれか１項に記載のアダプター。
  19. 前記第１または第２の鎖における少なくとも１つのヌクレオチドが、改変された糖、非天然の結合、脱塩基部位、ジデオキシ塩基、５−メチル塩基およびスペーサーからなる群から選択される１または複数を含む、請求項１から１８のいずれか１項に記載のアダプター。
  20. 前記第１または第２の鎖における少なくとも１つのヌクレオチドが、リボヌクレオチドである、請求項１から１９のいずれか１項に記載のアダプター。
  21. 前記トランスポザーゼが、「カットアンドペースト」トランスポザーゼである、請求項１から２０のいずれか１項に記載のアダプター。
  22. 前記トランスポザーゼが、ビブリオ・ハーベイトランスポザーゼまたは高活性Ｔｎ５トランスポザーゼである、請求項１から２１のいずれか１項に記載のアダプター。
  23. 前記ネイティブ認識配列が、１位においてＣを有する、請求項１から２２のいずれか１項に記載のアダプター。
  24. 前記ネイティブ認識配列が、図１に示されるネイティブ認識配列（配列番号１〜２１）から選択される、請求項１から２３のいずれか１項に記載のアダプター。
  25. 前記第２の鎖が、前記第２の配列に対して５’側にタグ配列をさらに含むか、または前記第１の鎖が、前記第１の配列に対して３’側にタグ配列をさらに含む、請求項１から２４のいずれか１項に記載のアダプター。
  26. 前記タグ配列が縮重塩基領域を含む、請求項２５に記載のアダプター。
  27. 単離された合成核酸アダプターのセットであって、
    （ｉ）請求項１から２６のいずれか１項に記載の第１の単離された合成核酸アダプターと、
    （ｉｉ）請求項１から２６のいずれか１項に記載の第２の単離された合成核酸アダプターと
    を含み、前記第１のアダプターおよび前記第２のアダプターは、ネイティブ認識配列またはその相補体と比較して、少なくとも１つの異なる改変を有する、単離された合成核酸アダプターのセット。
  28. １または複数のトランスポザーゼ分子と、請求項１から２６のいずれか１項に記載の１または複数のアダプターとを含む、トランスポザーゼ複合体。
  29. 標的ＤＮＡ分子を断片化するためのｉｎ ｖｉｔｒｏの方法であって、
    標的ＤＮＡ分子を請求項２８に記載のトランスポザーゼ複合体と接触させて、反応混合物を形成するステップと、
    転位反応を実施するための条件下で前記反応混合物をインキュベートするステップと
    を含む、方法。
  30. 前記標的ＤＮＡ分子が、１〜１０細胞からなるサンプルから得られる、請求項２９に記載の方法。
  31. 前記標的ＤＮＡ分子が、１〜３細胞からなるサンプルから得られる、請求項３０に記載の方法。
  32. 標的ＤＮＡ分子の配列決定またはマイクロアレイ分析のためにアッセイサンプルを調製するための方法であって、
    標的ＤＮＡ分子を、請求項１から２６のいずれか１項に記載の単離された合成核酸アダプターおよび前記アダプターに結合するトランスポザーゼを有する複合体と接触させて、反応混合物を形成するステップと、
    転位反応を実施するための条件下で前記反応混合物をインキュベートして、切断されたＤＮＡ産物を生成するステップと、
    前記切断されたＤＮＡ産物を増幅するステップと
    を含む、方法。
  33. 前記増幅するステップが、前記反応混合物から、前記アダプターを事前に除去することなく、または前記切断されたＤＮＡ産物を分離することなく実施される、請求項３２に記載の方法。
  34. マイクロアレイのためのＤＮＡサンプル調製の方法であって、
    サンプルＤＮＡ分子を、請求項１から２６のいずれか１項に記載の単離された合成核酸アダプターおよび前記アダプターに結合するトランスポザーゼを有する複合体と接触させて、反応混合物を形成するステップと、
    転位反応を実施するための条件下で前記反応混合物をインキュベートして、前記サンプルＤＮＡ分子のＤＮＡ断片を生成するステップと
    を含み、前記アダプターは、オリゴヌクレオチドタグを含み、前記ＤＮＡ断片は、前記オリゴヌクレオチドタグで両方の末端においてタグ化されている、方法。
  35. 前記オリゴヌクレオチドタグに対して相補的なプライマーを使用して前記ＤＮＡ断片を増幅するステップをさらに含む、請求項３４に記載の方法。
  36. 前記タグが、前記タグに対して相補的なプライマーの着地部位として使用される、請求項３４に記載の方法。
  37. 前記１または複数のプライマーが、フルオロフォアで標識化された少なくとも１つのｄＮＴＰを含むｄＮＴＰ混合物を使用するポリメラーゼ反応において伸長される、請求項３５または３６に記載の方法。
JP2016552415A 2013-11-07 2014-09-05 Ｄｎａ操作のための複数のトランスポザーゼアダプター Active JP6626830B2 (ja)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201361901037P 2013-11-07 2013-11-07
US61/901,037 2013-11-07
US201462013833P 2014-06-18 2014-06-18
US62/013,833 2014-06-18
PCT/US2014/054218 WO2015069374A1 (en) 2013-11-07 2014-09-05 Plurality of transposase adapters for dna manipulations

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JP2016534757A JP2016534757A (ja) 2016-11-10
JP6626830B2 true JP6626830B2 (ja) 2019-12-25

Family

ID=53041926

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2016552415A Active JP6626830B2 (ja) 2013-11-07 2014-09-05 Ｄｎａ操作のための複数のトランスポザーゼアダプター

Country Status (5)

Country Link
US (2) US10287622B2 (ja)
EP (1) EP3066114B1 (ja)
JP (1) JP6626830B2 (ja)
CN (1) CN105705515B (ja)
WO (1) WO2015069374A1 (ja)

Families Citing this family (40)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014210223A1 (en) 2013-06-25 2014-12-31 Prognosys Biosciences, Inc. Spatially encoded biological assays using a microfluidic device
WO2015113725A1 (en) * 2014-02-03 2015-08-06 Thermo Fisher Scientific Baltics Uab Method for controlled dna fragmentation
US11136576B2 (en) 2014-02-03 2021-10-05 Thermo Fisher Scientific Baltics Uab Method for controlled DNA fragmentation
WO2015179706A1 (en) * 2014-05-23 2015-11-26 Fluidigm Corporation Haploidome determination by digitized transposons
CN107532207B (zh) 2015-04-10 2021-05-07 空间转录公司 生物样本的空间区别、多重核酸分析
WO2017123758A1 (en) * 2016-01-12 2017-07-20 Seqwell, Inc. Compositions and methods for sequencing nucleic acids
MX2018011429A (es) * 2016-03-25 2019-06-06 Karius Inc Añadiduras de ácidos nucleicos sintéticos.
US10240196B2 (en) 2016-05-27 2019-03-26 Agilent Technologies, Inc. Transposase-random priming DNA sample preparation
CN108265101A (zh) * 2016-12-30 2018-07-10 天津强微特生物科技有限公司 一种快速稳定的Tn5转座酶酶活测定方法
CN106801044B (zh) * 2017-01-09 2021-03-23 北京全式金生物技术有限公司 一种环状转座子复合物及其应用
WO2018195224A1 (en) * 2017-04-18 2018-10-25 Fred Hutchinson Cancer Research Center Barcoded transposases to increase efficiency of high-accuracy genetic sequencing
EP3615671B1 (en) 2017-04-23 2021-07-21 Illumina Cambridge Limited Compositions and methods for improving sample identification in indexed nucleic acid libraries
EP3615692A1 (en) 2017-04-23 2020-03-04 Illumina Cambridge Limited Compositions and methods for improving sample identification in indexed nucleic acid libraries
AU2018260627A1 (en) * 2017-04-23 2019-11-14 Illumina Cambridge Limited Compositions and methods for improving sample identification in indexed nucleic acid libraries
US10934584B2 (en) 2017-04-23 2021-03-02 Illumina, Inc. Compositions and methods for improving sample identification in indexed nucleic acid libraries
US20210163927A1 (en) * 2018-06-15 2021-06-03 Roche Sequencing Solutions, Inc. Generation of double-stranded dna templates for single molecule sequencing
WO2020123319A2 (en) 2018-12-10 2020-06-18 10X Genomics, Inc. Methods of using master / copy arrays for spatial detection
US11649485B2 (en) 2019-01-06 2023-05-16 10X Genomics, Inc. Generating capture probes for spatial analysis
US11926867B2 (en) 2019-01-06 2024-03-12 10X Genomics, Inc. Generating capture probes for spatial analysis
EP3976820A1 (en) 2019-05-30 2022-04-06 10X Genomics, Inc. Methods of detecting spatial heterogeneity of a biological sample
WO2021092433A2 (en) 2019-11-08 2021-05-14 10X Genomics, Inc. Enhancing specificity of analyte binding
SG11202106899SA (en) 2019-12-23 2021-09-29 10X Genomics Inc Methods for spatial analysis using rna-templated ligation
US11702693B2 (en) 2020-01-21 2023-07-18 10X Genomics, Inc. Methods for printing cells and generating arrays of barcoded cells
US11732299B2 (en) 2020-01-21 2023-08-22 10X Genomics, Inc. Spatial assays with perturbed cells
US11898205B2 (en) 2020-02-03 2024-02-13 10X Genomics, Inc. Increasing capture efficiency of spatial assays
US11732300B2 (en) 2020-02-05 2023-08-22 10X Genomics, Inc. Increasing efficiency of spatial analysis in a biological sample
EP4242325A3 (en) 2020-04-22 2023-10-04 10X Genomics, Inc. Methods for spatial analysis using targeted rna depletion
WO2021237087A1 (en) 2020-05-22 2021-11-25 10X Genomics, Inc. Spatial analysis to detect sequence variants
WO2021236929A1 (en) 2020-05-22 2021-11-25 10X Genomics, Inc. Simultaneous spatio-temporal measurement of gene expression and cellular activity
WO2021252499A1 (en) 2020-06-08 2021-12-16 10X Genomics, Inc. Methods of determining a surgical margin and methods of use thereof
CN116034166A (zh) 2020-06-25 2023-04-28 10X基因组学有限公司 Dna甲基化的空间分析
US11761038B1 (en) 2020-07-06 2023-09-19 10X Genomics, Inc. Methods for identifying a location of an RNA in a biological sample
US11926822B1 (en) 2020-09-23 2024-03-12 10X Genomics, Inc. Three-dimensional spatial analysis
US11827935B1 (en) 2020-11-19 2023-11-28 10X Genomics, Inc. Methods for spatial analysis using rolling circle amplification and detection probes
AU2021409136A1 (en) 2020-12-21 2023-06-29 10X Genomics, Inc. Methods, compositions, and systems for capturing probes and/or barcodes
EP4284942A1 (en) 2021-01-29 2023-12-06 10X Genomics, Inc. Method for transposase mediated spatial tagging and analyzing genomic dna in a biological sample
EP4314279A1 (en) * 2021-03-29 2024-02-07 Illumina, Inc. Improved methods of library preparation
EP4334442A1 (en) * 2021-05-03 2024-03-13 European Molecular Biology Laboratory Methods for isolating and/or obtaining captured polynucleotide fragments
WO2023034489A1 (en) 2021-09-01 2023-03-09 10X Genomics, Inc. Methods, compositions, and kits for blocking a capture probe on a spatial array
CN114250266A (zh) * 2021-12-20 2022-03-29 南京诺唯赞生物科技股份有限公司 一种转座酶活性测定方法

Family Cites Families (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5925545A (en) 1996-09-09 1999-07-20 Wisconsin Alumni Research Foundation System for in vitro transposition
US20030143740A1 (en) * 2001-10-15 2003-07-31 Christine Wooddell Processes for transposase mediated integration into mammalian cells
AU2003231048A1 (en) 2002-04-22 2003-11-03 Regents Of The University Of Minnesota Transposon system and methods of use
US20040172667A1 (en) 2002-06-26 2004-09-02 Cooper Richard K. Administration of transposon-based vectors to reproductive organs
DE10322662A1 (de) * 2002-11-06 2004-10-07 Grünenthal GmbH Wirksame und stabile DNA-Enzyme
EP1924704B1 (en) 2005-08-02 2011-05-25 Rubicon Genomics, Inc. Compositions and methods for processing and amplification of dna, including using multiple enzymes in a single reaction
US20070172839A1 (en) 2006-01-24 2007-07-26 Smith Douglas R Asymmetrical adapters and methods of use thereof
US7659069B2 (en) 2007-08-31 2010-02-09 Agilent Technologies, Inc. Binary signaling assay using a split-polymerase
AU2009205523A1 (en) * 2008-01-14 2009-07-23 Applied Biosystems, Llc Compositions, methods, and kits for detecting ribonucleic acid
DK2376517T3 (da) 2008-10-24 2013-02-11 Epict Technologies Corp Transposon-ende-sammensætninger og fremgangsmåder til at modificere nukleinsyrer
ES2595433T3 (es) 2010-09-21 2016-12-30 Population Genetics Technologies Ltd. Aumento de la confianza en las identificaciones de alelos con el recuento molecular
EP2635679B1 (en) * 2010-11-05 2017-04-19 Illumina, Inc. Linking sequence reads using paired code tags
AU2012211081B2 (en) * 2011-01-28 2016-02-04 Illumina, Inc. Oligonucleotide replacement for di-tagged and directional libraries
US9005935B2 (en) * 2011-05-23 2015-04-14 Agilent Technologies, Inc. Methods and compositions for DNA fragmentation and tagging by transposases
US20130017978A1 (en) * 2011-07-11 2013-01-17 Finnzymes Oy Methods and transposon nucleic acids for generating a dna library
US9145623B2 (en) 2011-07-20 2015-09-29 Thermo Fisher Scientific Oy Transposon nucleic acids comprising a calibration sequence for DNA sequencing
WO2015113725A1 (en) * 2014-02-03 2015-08-06 Thermo Fisher Scientific Baltics Uab Method for controlled dna fragmentation

Also Published As

Publication number Publication date
EP3066114A4 (en) 2017-10-11
JP2016534757A (ja) 2016-11-10
US10287622B2 (en) 2019-05-14
CN105705515A (zh) 2016-06-22
WO2015069374A1 (en) 2015-05-14
US20190284613A1 (en) 2019-09-19
EP3066114A1 (en) 2016-09-14
US20160289737A1 (en) 2016-10-06
CN105705515B (zh) 2021-05-25
EP3066114B1 (en) 2019-11-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6626830B2 (ja) Ｄｎａ操作のための複数のトランスポザーゼアダプター
US20200325471A1 (en) Compositions and methods for detecting nucleic acid regions
US11434526B2 (en) Enhanced nucleic acid identification and detection
JP6982087B2 (ja) 競合的鎖置換を利用する次世代シーケンシング（ｎｇｓ）ライブラリーの構築
Van Dijk et al. Library preparation methods for next-generation sequencing: tone down the bias
CA2936564C (en) Methods for generating double stranded dna libraries and sequencing methods for the identification of methylated cytosines
CN115927563A (zh) 用于分析修饰的核苷酸的组合物和方法
JP6925424B2 (ja) 短いｄｎａ断片を連結することによる一分子シーケンスのスループットを増加する方法
KR102592367B1 (ko) 게놈 및 치료학적 적용을 위한 핵산 분자의 클론 복제 및 증폭을 위한 시스템 및 방법
US20130123117A1 (en) Capture probe and assay for analysis of fragmented nucleic acids
KR20210114918A (ko) 복합체 표면-결합 트랜스포좀 복합체
CN110914418A (zh) 用于对核酸进行测序的组合物和方法
JP6876785B2 (ja) 単分子配列決定のための一本鎖環状ｄｎａライブラリーを生成するための方法
US20230095295A1 (en) Phi29 mutants and use thereof
WO2023116373A1 (zh) 一种生成标记的核酸分子群的方法及其试剂盒
WO2022256228A1 (en) Method for producing a population of symmetrically barcoded transposomes
WO2022251510A2 (en) Oligo-modified nucleotide analogues for nucleic acid preparation
JP2024511760A (ja) エラー補正のための固有分子識別子を有するトランスポゾンベースの技術を使用した指向性タグメンテーション配列決定ライブラリーの調製方法

Legal Events

Date Code Title Description
A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20170904

A977 Report on retrieval

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007

Effective date: 20180712

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20180907

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20181206

A02 Decision of refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02

Effective date: 20190524

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20190924

A911 Transfer to examiner for re-examination before appeal (zenchi)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911

Effective date: 20191001

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20191101

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20191202

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Ref document number: 6626830

Country of ref document: JP

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250