JP6614619B2 - シグナル伝達系 - Google Patents

Description

（発明の分野）
本発明は、キメラ抗原受容体シグナル伝達系に関する。

（発明の背景）
伝統的に、抗原特異的Ｔ細胞は、標的抗原に対して本来的に特異的な末梢血Ｔ細胞の選択的増殖によって生成されている。しかしながら、大部分の癌抗原に特異的な多数のＴ細胞を選択および増殖することは困難であり、非常に多くの場合には不可能である。キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）のトランスジェニック発現は、末梢血Ｔ細胞のバルク集団のエクスビボウイルスベクター形質導入によって、任意の表面抗原に特異的な多数のＴ細胞の生成を可能にするので、組み込みベクターによる遺伝子療法は、この問題の解決策を提供する。

キメラ抗原受容体は、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）の特異性をＴ細胞のエフェクター機能に結び付けるタンパク質である。キメラ抗原受容体の通常形態は、抗原認識性アミノ末端、スペーサー、Ｔ細胞生存および活性化シグナルを伝達する複合エンドドメインにすべて連結された膜貫通ドメインを有するＩ型膜貫通ドメインタンパク質の形態である（図１Ａ参照）。

これらの分子の最も一般的な形態は、シグナル伝達エンドドメインにスペーサーおよび膜貫通ドメインを介して融合された、標的抗原を認識するモノクローナル抗体から誘導された１本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）の融合体である。上記分子は、その標的のｓｃＦｖによる認識に応答してＴ細胞の活性化をもたらす。Ｔ細胞がかかるＣＡＲを発現すると、Ｔ細胞はその標的抗原を発現する標的細胞を認識し、殺す。いくつかのＣＡＲが腫瘍関連抗原に対して開発されており、かかるＣＡＲ発現Ｔ細胞を用いる養子移入手法は、現在様々ながんの処置についての臨床試験にかけられている。

ＣＡＲ研究からいくつかの毒性が報告されており、さらなる理論上の毒性が存在する。このような毒性としては、ＣＡＲ Ｔ細胞の持続的で強力な活性化によって引き起こされ、マクロファージ活性化症候群（ＭＡＳ）をもたらす免疫学的毒性、および「オンターゲットオフ腫瘍（Ｏｎ−ｔａｒｇｅｔ ｏｆｆ−ｔｕｍｏｒ）」毒性（すなわち、正常組織上の標的抗原の認識）が挙げられる。

Ｔ細胞の持続的な活性化および増殖が抗原によって駆動され、次に、大量の炎症性サイトカインが放出され、マクロファージの過剰活性化および免疫活性化のフィードフォワードサイクルが導かれることにより、ＭＡＳが引き起こされると推定される。血清中ＩＬ−６の急増が特徴的であり、この症候群は、ＩＣＵ入院が必要な重度の全身性疾患をもたらし得る。

オンターゲットオフ腫瘍毒性は他のＣＡＲでも報告されており、例えば、腎細胞癌腫抗原ＣＡＩＸに対するＣＡＲで処置された患者群は、予想外で処置限定的な胆汁毒性を発症した。ＣＡＲ研究では、２人の死亡者が報告されている：１人の患者が、大用量の第３世代抗ＥＲＢＢ２ ＣＡＲ Ｔ細胞の注入直後に生じた呼吸窮迫症候群で死亡した；異なる研究では、第２世代抗ＣＤ１９ ＣＡＲによるＣＬＬの処置後に、さらなる患者が、考えられるサイトカインストーム後に死亡した。

これらの毒性は、詳細な動物研究または非ヒト霊長類研究を用いてさえ非常に予測困難である。重要なことに、小分子および生物製剤（ｂｉｏｌｏｇｉｃ）とは異なり、ＣＡＲ Ｔ細胞は半減期を有さず、投与を中止して作用物質の分解／排泄を待つことができない。ＣＡＲ Ｔ細胞は自律的であり、生着および増殖し得る。したがって、毒性は、進行性かつ劇症性であり得る。

自殺遺伝子は、それらを発現する細胞を条件付きで破壊し得る、遺伝的に発現される要素である。例としては、単純ヘルペススウイルスチミジンキナーゼ（これは、細胞をガンシクロビルに対して感受性にする）；誘導性カスパーゼ９（これは、細胞を小分子ホモ二量体およびＣＤ２０に対して感受性にする）ならびにＲＱＲ８（これは、細胞をリツキシマブに対して感受性にする）が挙げられる。

この技術は、一定の安全性をＣＡＲ Ｔ細胞療法に与えるが、限界がある。第１に、それは、自殺剤の追加にあたり、すべてのＣＡＲ Ｔ細胞が破壊されるバイナリーアプローチである。加えて、医薬品は、多くの場合に治療域（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｗｉｎｄｏｗ）を有する。自殺遺伝子を用いる場合、許容可能な毒性を伴う有効性が達成され得るように、生成物の効力を調整することができない。第２に、自殺遺伝子が上記免疫毒性の一部に役立つかは不明である：例えば、マクロファージ活性化症候群が起きる時点までに、ＣＡＲ Ｔ細胞の永続化はもはや不要であり得、自殺遺伝子はもはや役立たないであろう。恐らくは、より急性のサイトカイン放出症候群が非常に迅速に生じて、自殺遺伝子が機能することができない。

したがって、ＣＡＲ Ｔ細胞を制御するための代替方法であって、上記欠点および問題を伴わない代替方法が必要である。
本発明の実施形態において、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
（ｉ）抗原結合ドメインと、膜貫通ドメインと、第１の結合ドメインとを含む受容体構成要素；および
（ｉｉ）シグナル伝達ドメインと、該受容体構成要素の該第１の結合ドメインに特異的に結合する第２の結合ドメインとを含む細胞内シグナル伝達構成要素
を含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）系であって、
作用物質の存在によって、該第１の結合ドメインと第２との結合ドメインの結合が破壊され、その結果、該作用物質の非存在下では、該受容体構成要素および該シグナル伝達構成要素がヘテロ二量体化し、抗原への該抗原結合ドメインの結合が、該シグナル伝達ドメインを介したシグナル伝達をもたらすのに対して、該作用物質の存在下では、該受容体構成要素および該シグナル伝達構成要素がヘテロ二量体化せず、抗原への該抗原結合ドメインの結合が、該シグナル伝達ドメインを介したシグナル伝達をもたらさない、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）系。
（項目２）
前記受容体構成要素が、前記膜貫通ドメインと前記第１の結合ドメインとの間にリンカーを含む、項目１に記載のＣＡＲ系。
（項目３）
前記リンカーが、配列番号３に示されている配列を含むか、または配列番号３に示されている配列からなる、項目２に記載のＣＡＲ系。
（項目４）
前記第１の結合ドメインがＴｅｔリプレッサータンパク質（ＴｅｔＲ）もしくはその変異型を含み、前記第２の結合ドメインが転写誘導ペプチド（ＴｉＰ）もしくはその変異型を含み；または該第１の結合ドメインがＴｉＰまたはその変異型を含み、該第２の結合ドメインがＴｅｔＲまたはその変異型を含み；
前記作用物質が、テトラサイクリン、ドキシサイクリンもしくはミノサイクリンまたはそれらの類似体である、前記項目のいずれかに記載のＣＡＲ系。
（項目５）
前記受容体構成要素が、ＴｅｔＲドメインである２つの第１の結合ドメインを含む、項目４に記載のＣＡＲ系。
（項目６）
前記２つのＴｅｔＲドメインがリンカーによって分離されている、項目５に記載のＣＡＲ系。
（項目７）
各ＴｅｔＲドメインが、前記作用物質に対して異なる親和性を有する、項目５または６に記載のＣＡＲ系。
（項目８）
それぞれが異なる抗原を認識する複数の受容体構成要素がある、前記項目のいずれかに記載のＣＡＲ系。
（項目９）
前記複数の受容体構成要素の前記結合ドメインが、前記シグナル伝達構成要素の前記結合ドメインへの結合において異なり、その結果各抗原が異なるシグナル伝達強度を伝搬する、項目８に記載のＣＡＲ系。
（項目１０）
前記複数の受容体構成要素の前記結合ドメインが、前記作用物質への結合において異なり、その結果各抗原が該作用物質の存在下で異なるシグナル伝達強度を伝搬する、項目８または９に記載のＣＡＲ系。
（項目１１）
前記シグナル伝達構成要素の前記シグナル伝達ドメインが、ＣＤ３ゼータエンドドメイン、ＣＤ２８エンドドメイン、４１ＢＢエンドドメインおよびＯＸ４０エンドドメインから選択される単一のエンドドメインを含む、項目１〜９のいずれかに記載のＣＡＲ系。
（項目１２）
前記シグナル伝達構成要素の前記シグナル伝達ドメインが、ＣＤ３ゼータエンドドメイン、ＣＤ２８エンドドメイン、４１ＢＢエンドドメインおよびＯＸ４０エンドドメインのうちの少なくとも１つを含む、前記項目のいずれかに記載のＣＡＲ系。
（項目１３）
それぞれがシグナル伝達ドメインと結合ドメインとを含む複数のシグナル伝達構成要素を含み、該結合ドメインがそれぞれ、該受容体構成要素の同じ結合ドメインを認識するが、該シグナル伝達ドメインが異なるエンドドメインを含む、前記項目のいずれかに記載のＣＡＲ系。
（項目１４）
前記複数のシグナル伝達構成要素が、それぞれが異なる親和性で前記受容体構成要素の前記結合ドメインを独立して認識する複数の結合ドメインを含む、項目１３に記載のＣＡＲ系。
（項目１５）
項目１〜１４のいずれかに記載のＣＡＲ系において使用するために適切な受容体構成要素であって、抗原結合ドメインと、膜貫通ドメインと、ペプチド結合ドメインとを含む、受容体構成要素。
（項目１６）
項目１〜１４のいずれか一項に記載のＣＡＲシグナル伝達系において使用するために適切なシグナル伝達構成要素であって、シグナル伝達ドメインと結合ドメインとを含む、シグナル伝達構成要素。
（項目１７）
項目１５に記載の受容体構成要素をコードする、核酸配列。
（項目１８）
項目１６に記載のシグナル伝達構成要素をコードする、核酸配列。
（項目１９）
項目１〜１４のいずれか一項に記載のＣＡＲシグナル伝達系をコードする核酸配列であって、翻訳後に該受容体構成要素と該シグナル伝達構成要素との間で切断される自己切断ペプチドによって、前記受容体構成要素およびシグナル伝達構成要素が共発現される、核酸配列。
（項目２０）
項目１７〜２０のいずれか一項に記載の核酸配列を含む、ベクター。
（項目２１）
項目２０に記載のベクターを含む、レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターまたはトランスポゾン。
（項目２２）
項目１５に記載の受容体構成要素および項目１６に記載のシグナル伝達構成要素を発現する、Ｔ細胞またはＮＫ細胞。
（項目２３）
項目１７〜１９のいずれかに記載の核酸または項目２０もしくは２１に記載のベクターを含む、項目２２に記載のＴ細胞またはＮＫ細胞。
（項目２４）
複数の、項目２２または２３に記載のＴ細胞またはＮＫ細胞を含む、医薬組成物。
（項目２５）
疾患の処置および／または予防において使用するための、項目２４に記載の医薬組成物。
（項目２６）
疾患を処置および／または予防するための方法であって、項目２４に記載の医薬組成物を被験体に投与する工程を含む、方法。
（項目２７）
以下の工程：
（ｉ）試料を含有するＴ細胞またはＮＫを単離する工程；
（ｉｉ）項目１７〜１９のいずれかに記載の核酸配列または項目２０もしくは２１に記載のベクターを該ＴまたはＮＫ細胞に形質導入またはトランスフェクトする工程；および
（ｉｉｉ）（ｉｉ）からの該Ｔ細胞またはＮＫ細胞を被験体に投与する工程
を含む、項目２６に記載の方法。
（項目２８）
前記被験体における毒性活性をモニタリングすることを伴い、項目１〜１４のいずれかに記載のＣＡＲシグナル伝達系において使用するための作用物質を該被験体に投与して、有害な毒性効果を軽減する工程を含む、項目２６または２７に記載の方法。
（項目２９）
前記被験体における疾患進行をモニタリングすること、および／または毒性活性をモニタリングすることを伴い、項目１〜１４のいずれかに記載のＣＡＲシグナル伝達系において使用するための作用物質を該被験体に投与して、許容され得るレベルの疾患進行および／または毒性活性を提供する工程を含む、項目２７または２８に記載の方法。
（項目３０）
前記疾患が癌である、項目２５に記載の医薬組成物の使用、または項目２６〜２９のいずれか一項に記載の方法。
（項目３１）
疾患の処置および／または予防のための医薬の製造における、項目２４に記載の医薬組成物の使用。
（項目３２）
項目１７〜１９のいずれかに記載の核酸または項目２０もしくは２１に記載のベクターを含む、キット。
（項目３３）
項目２２または２３に記載のＴまたはＮＫ細胞を作製するための方法であって、項目１７〜１９のいずれかに記載の核酸配列または項目２０もしくは２１に記載のベクターをＴまたはＮＫ細胞に導入する工程を含む、方法。
（項目３４）
前記ＴまたはＮＫ細胞が、被験体から単離された試料に由来する、項目３３に記載の方法。
（項目３５）
項目２２または２３に記載のＴまたはＮＫ細胞を含む被験体において項目１〜１４のいずれかに記載のＣＡＲシグナル伝達系を阻害するための方法であって、前記作用物質を該被験体に投与する工程を含む、方法。

図１（ａ）は、古典的ＣＡＲを説明する概略図である：図１（ｂ）〜（ｄ）は、ＣＡＲエンドドメインの異なる世代および並べ替えを示す：（ｂ）最初の設計はＦｃεＲ１−γまたはＣＤ３ζエンドドメインのみを通じてＩＴＡＭシグナルを伝達し、後の設計は、シス配列で（ｃ）さらに１つまたは（ｄ）さらに２つの共刺激シグナルを伝達した。

図２は、ＴｅｔＲおよびＴｉＰの構造を示す。（ａ）任意のタンパク質のアミノ末端に結合したＴｉＰの配列；（ｂ）ＴｅｔＲと相互作用するＴｉＰの構造に由来した結晶構造解析（ＰＤＢ ２ＮＳ８およびＬｕｃｋｎｅｒら（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３６８，７８０−７９０（２００７）から）。テトラサイクリンが結合する残基の多くと結合するＴｅｔＲホモ二量体内において、ＴｉＰが深く関与していることが分かり得る。

図３（ａ）膜貫通受容体構成要素は、細胞外抗原結合ドメインと、膜貫通ドメインと、ＴｅｔＲに対する細胞内リンカーとを含む。別の分子（シグナル伝達構成要素）は、ＴｉＰと１つまたは複数のＴ細胞シグナル伝達ドメインとの融合によって生成された細胞内タンパク質を含む。テトラサイクリンまたはテトラサイクリン類似体の非存在下では、受容体構成要素およびシグナル伝達構成要素は相互作用し、同族抗原の存在下では、前記系はシグナルを伝達する。図３（ｂ）テトラサイクリンまたはテトラサイクリン類似体の存在下では、ＴｉＰはＴｅｔＲから排除され、同族抗原の存在下でさえも、前記受容体はシグナルを伝達し得ない。

図４は、ＣＤ４由来の細胞内リンカードメインを示す。

図５は、前記系の機能を実証するためのｅＧＦＰを有する試験コンストラクトを示す。（ａ）２Ａ部位で自己切断して、ｅＧＦＰに融合したＴｉＰと；そのエンドドメインとしてＴｅｔＲを有するＣＡＲとを生じる単一転写産物として発現させたバイシストロン性コンストラクト；（ｂ）テトラサイクリンの非存在下でこのコンストラクトを発現するＳｕｐＴ１細胞の蛍光顕微鏡写真。細胞膜では、ｅＧＦＰ蛍光が明確に見られ得る；（ｃ）テトラサイクリンの存在下における同じ細胞の蛍光顕微鏡写真。ここで、ｅＧＦＰは細胞質内にあり、テトラサイクリンがＴｉＰを排除したことを示している。

図６は、初期ＴｅｔＣＡＲコンストラクトおよび対照を示す。（ａ）２Ａ部位で自己切断して、フレキシブルリンカーを介してＣＤ３ゼータのエンドドメインに融合したＴｉＰを含むシグナル伝達構成要素と；ＣＤ３３認識ｓｃＦｖ、ＩｇＧ１のＦｃドメイン由来のスペーサー、ＣＤ４由来の膜貫通および細胞内ドメインならびにＴｅｔＲを含む受容体構成要素とを生じる単一転写産物として発現されたバイシストロン性コンストラクト。（ｂ）シグナル伝達構成要素にＴｉＰが存在しない以外は同一の対照もまた構築した。（ｃ）基本ＴｅｔＣＡＲの注釈付きアミノ酸配列を示す。

図７は、対照と比較した、初期ＴｅｔＲコンストラクトの機能を示す。（ａ）ＢＷ５ Ｔ細胞において、ＴｅｔＣＡＲを発現させた。これらのＴ細胞を、野生型ＳｕｐＴ１細胞、またはテトラサイクリンの非存在下でもしくは漸増濃度のテトラサイクリンの存在下でＣＤ３３を発現するように操作したＳｕｐＴ１細胞でチャレンジした。野生型ＳｕｐＴ１細胞でチャレンジしたＴ細胞は、テトラクラインの存在下または非存在下のいずれにおいても活性化しない；ＣＤ３３を発現するＳｕｐＴ１細胞でチャレンジしたＴ細胞は、テトラサイクリンの非存在下で活性化するが、テトラサイクリンの存在下では活性化が急速に阻害され、１００ｎＭのテトラサイクリンの存在下では活性化が完全に阻害される。（ｂ）ＴｉＰドメインを欠く対照ＴｅｔＣＡＲをＢＷ５に形質導入した。再び、これらのＴ細胞を、野生型ＳｕｐＴ１細胞、またはテトラサイクリンの非存在下もしくは漸増濃度のテトラサイクリンの存在下でＣＤ３３を発現するように操作したＳｕｐＴ１細胞でチャレンジした。シグナル伝達構成要素におけるＴｉＰ要素の欠如は、いかなる条件においてもシグナル伝達をもたらさなかった。

図８は、二重ｔｅｔＲドメインｔｅｔＣＡＲを示す。ｔｅｔＲは、互いに結合した２つのＴｅｔＲを有する単鎖として発現される。テトラサイクリン（およびしたがってＴｉＰ）に対して異なる親和性を有するｔｅｔＲドメインを使用する場合、ＴｉＰのテトラサイクリン媒介性排除の速度は、シグナル伝達のレベルを調節し得る。

図９は、単一のエンドドメインを含有する複数のシグナル伝達構成要素を利用するｔｅｔＣＡＲシグナル伝達系を示す。多くの異なるシグナル伝達構成要素（これらはすべてアミノ末端にＴｉＰを含むが、複合的なシグナル伝達ドメインとは対照的に、個々に異なるシグナル伝達ドメインを含む）と共に、単一のＣＡＲを発現させる。これらは、受容体構成要素とランダムに相互作用する。異なるシグナル伝達ドメインとそれらの二次メッセンジャーとの間の立体的相互作用の欠如は、それらの機能を改善する。

図１０は、単一のエンドドメインおよび異なるＴｉＰドメインを含有する複数のシグナル伝達構成要素を利用するｔｅｔＣＡＲシグナル伝達系を示す。各シグナル伝達構成要素は、個々のシグナル伝達ドメインを含む。各シグナル伝達構成要素はまた、ＴｉＰを含むが、各ＴｉＰは、ＴｅｔＲドメインへの異なる親和性を有する。したがって、ＣＡＲとシグナル伝達ドメインとの間の相互作用の化学量論は、変動し得る。示されている例では、シグナル伝達系は、ＯＸ４０＞ＣＤ３ゼータ＞ＣＤ２８となるように構築されている。

図１１は、複数の受容体構成要素と、各シグナル伝達構成要素が単一のエンドドメインを含有する複数のシグナル伝達構成要素とを利用するｔｅｔＣＡＲシグナル伝達系を示す。

図１２は、一次細胞におけるＴｅｔＣＡＲシグナル伝達を示す。（ａ）試験された異なるコンストラクト：（ｉ）古典的ＣＡＲ；（ｉｉ）ｔｅｔＣＡＲ；（ｉｉｉ）ＴｉＰを削除した対照ｔｅｔＣＡＲ。（ｂ）非形質導入細胞およびＳｕｐＴ１．ＣＤ１９細胞をＣＤ１９について染色した；（ｃ）非形質導入Ｔ細胞、および異なるＣＡＲコンストラクトを形質導入したＴ細胞を抗Ｆｃで染色した。

図１３は、異なる濃度のテトラサイクリンにおける、非形質導入Ｔ細胞、および異なるＣＡＲコンストラクト（（ｉ）古典的な第１世代ＣＡＲ、（ｉｉ）ｔｅｔＣＡＲおよび（ｉｉｉ）対照ｔｅｔＣＡＲ）で形質導入し、ＳｕｐＴ１細胞でチャレンジしたＴ細胞、ＳｕｐＴ１．ＣＤ１９細胞からのインターフェロン−ガンマ放出を示す。 図１３は、異なる濃度のテトラサイクリンにおける、非形質導入Ｔ細胞、および異なるＣＡＲコンストラクト（（ｉ）古典的な第１世代ＣＡＲ、（ｉｉ）ｔｅｔＣＡＲおよび（ｉｉｉ）対照ｔｅｔＣＡＲ）で形質導入し、ＳｕｐＴ１細胞でチャレンジしたＴ細胞、ＳｕｐＴ１．ＣＤ１９細胞からのインターフェロン−ガンマ放出を示す。

図１４は、標的細胞の死滅を示す。テトラサイクリンの非存在下における標的細胞（ＳｕｐＴ１．ＣＤ１９）の死滅を実証するために、クロム放出アッセイを使用した。記号表：（ｉ）−通常のＣＡＲ；（ｉｉ）−ｔｅｔＣＡＲ；（ｉｉｉ）−対照ｔｅｔＣＡＲ（エンドドメイン上にＴｉＰなし）。

（発明の態様の概要）
本発明者らは、ＣＡＲの抗原認識構成部分とシグナル伝達構成要素とを分離して、ＣＡＲ系の抗原認識構成部分への抗原の結合が継続しているにもかかわらず、シグナル伝達を迅速に阻害／終了し得る系を生成することが可能であることを見出した。このシグナル伝達の阻害は、さもなければＣＡＲの細胞外抗原結合構成部分（本明細書では受容体構成要素と称される）と細胞内シグナル伝達構成要素との間で起こるであろう共局在化および相互作用を阻害する作用物質（例えば、小分子）の存在下で起こる。

したがって、第１の態様において、本発明は、
（ｉ）抗原結合ドメインと、膜貫通ドメインと、第１の結合ドメインとを含む受容体構成要素；および
（ｉｉ）シグナル伝達ドメインと、該受容体構成要素の該第１の結合ドメインに特異的に結合する第２の結合ドメインとを含む細胞内シグナル伝達構成要素
を含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）系であって、
作用物質の存在によって、該第１の結合ドメインと第２との結合ドメインの結合が破壊され、その結果、該作用物質の非存在下では、該受容体構成要素および該シグナル伝達構成要素がヘテロ二量体化し、抗原への該抗原結合ドメインの結合が、該シグナル伝達ドメインを介したシグナル伝達をもたらすのに対して、該作用物質の存在下では、該受容体構成要素および該シグナル伝達構成要素がヘテロ二量体化せず、抗原への該抗原結合ドメインの結合が、該シグナル伝達ドメインを介したシグナル伝達をもたらさない、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）系を提供する。

受容体構成要素は、膜貫通ドメインと第１の結合ドメインとの間にリンカーを含み得る。

リンカーは、配列番号３として示されている配列を含み得または前記配列からなり得る。

第１の結合ドメインは、Ｔｅｔリプレッサータンパク質（ＴｅｔＲ）またはその変異型を含み得、第２の結合ドメインは、ＴｅｔＲ誘導ペプチド（Ｋｌｏｔｚｓｃｈｅら；Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ；２００５；２８０（２６）；２４５９１−９によって記載されているＴｉＰ）（ＴｉＰ）を含み得る；またはその逆も同様である。この場合、作用物質は、テトラサイクリン、ドキシサイクリンまたはミノサイクリンまたはそれらの類似体であり得る。

受容体構成要素は、ＴｅｔＲドメインである２つの第１の結合ドメインを含み得る。２つのＴｅｔＲドメインは、リンカーによって分離され得る。各ＴｅｔＲドメインは、作用物質に対して異なる親和性を有し得る。

本発明の第１の態様のＣＡＲ系は、それぞれが異なる抗原を認識する複数の受容体構成要素を含み得る。

前記複数の受容体構成要素の前記第１の結合ドメインが、前記シグナル伝達構成要素の前記第２の結合ドメインへの結合において異なり得、その結果各抗原が異なるシグナル伝達強度を伝搬する。

前記複数の受容体構成要素の前記第１の結合ドメインが、前記作用物質への結合において異なり得、その結果各抗原が該作用物質の存在下で異なるシグナル伝達強度を伝搬する。

前記シグナル伝達構成要素の前記シグナル伝達ドメインが、ＣＤ３ゼータエンドドメイン、ＣＤ２８エンドドメイン、４１ＢＢエンドドメインおよびＯＸ４０エンドドメインから選択される単一のエンドドメインを含み得る。

前記シグナル伝達構成要素の前記シグナル伝達ドメインが、ＣＤ３ゼータエンドドメイン、ＣＤ２８エンドドメイン、４１ＢＢエンドドメインおよびＯＸ４０エンドドメインのうちの少なくとも１つを含み得る。

本発明の第１の態様のＣＡＲ系は、それぞれがシグナル伝達ドメインと第２の結合ドメインとを含む複数のシグナル伝達構成要素を含み得、該第２の結合ドメインがそれぞれ、該受容体構成要素の同じ第１の結合ドメインを認識するが、該シグナル伝達ドメインが異なるエンドドメインを含む。

前記複数のシグナル伝達構成要素が、それぞれが異なる親和性で前記受容体構成要素の前記第１の結合ドメインを独立して認識する複数の第２の結合ドメインを含み得る。

第２の態様において、本発明は、本発明の第１の態様のＣＡＲ系において使用するために適切な受容体構成要素であって、抗原結合ドメインと、膜貫通ドメインと、第１の結合ドメインとを含む、受容体構成要素を提供する。

第３の態様において、本発明は、本発明の第１の態様のＣＡＲシグナル伝達系において使用するために適切なシグナル伝達構成要素であって、シグナル伝達ドメインと第２の結合ドメインとを含む、シグナル伝達構成要素を提供する。

第４の態様において、本発明は、本発明の第２の態様に記載の受容体構成要素をコードする、核酸配列を提供する。

第５の態様において、本発明は、本発明の第３の態様に記載のシグナル伝達構成要素をコードする、核酸配列を提供する。

第６の態様において、本発明は、本発明の第１の態様のＣＡＲシグナル伝達系をコードする核酸配列であって、翻訳後に該受容体構成要素と該シグナル伝達構成要素との間で切断される自己切断ペプチドによって、前記受容体構成要素およびシグナル伝達構成要素が共発現される、核酸配列を提供する。

第７の態様では、本発明は、本発明の第４〜第６の態様の核酸配列を含むベクターを提供する。

第８の態様では、本発明は、本発明の第７の態様のベクターを含む、レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターまたはトランスポゾンを提供する。

第９の態様では、本発明は、本発明の第２の態様の受容体構成要素と、本発明の第３の態様のシグナル伝達構成要素とを発現するＴ細胞またはＮＫ細胞を提供する。

Ｔ細胞またはＮＫ細胞は、本発明の第４〜第６の態様の核酸または本発明の第７もしくは第８の態様のベクターを含み得る。

第１０の態様では、本発明は、複数の本発明の第９の態様のＴ細胞またはＮＫ細胞を含む医薬組成物を提供する。

第１１の態様では、本発明は、疾患を処置および／または予防するのに使用するための本発明の第１０の態様の医薬組成物を提供する。

第１２の態様では、本発明は、疾患を処置および／または予防するための方法であって、第１０の態様に記載の医薬組成物を被験体に投与する工程を含む、方法に関する。

本発明の第１２の態様に記載の方法は、以下の工程：
（ｉ）試料を含有するＴ細胞またはＮＫを単離する工程；
（ｉｉ）本発明の第４〜第６の態様のいずれかに記載の核酸配列または第７もしくは第８に記載のベクターを該ＴまたはＮＫ細胞に形質導入またはトランスフェクトする工程；および
（ｉｉｉ）（ｉｉ）からの該Ｔ細胞またはＮＫ細胞を被験体に投与する工程
を含み得る。

前記方法は、Ｔ細胞／ＮＫ細胞を被験体に投与することを伴い得、前記Ｔ細胞／ＮＫ細胞は、前記被験体から予め単離され、本発明の第４〜第６の態様のいずれかの核酸配列または本発明の第７もしくは第８の態様のベクターを形質導入／トランスフェクトされたものである。

本発明の第１２の態様の方法は、前記被験体における毒性活性をモニタリングすることを伴い得、本発明の第１の態様のＣＡＲ系において使用するための作用物質を前記被験体に投与して、有害な毒性効果を軽減する工程を含み得る。

当該方法は、前記被験体における毒性活性をモニタリングすることを伴い得、本発明の第１の態様のＣＡＲ達系において使用するための作用物質を該被験体に投与して、許容され得るレベルの疾患進行および／または毒性活性を提供する工程を含み得る。

本発明の第１０の態様の医薬組成物の使用または本発明の第１２の態様の方法では、疾患は、癌であり得る。

第１３の態様では、本発明は、疾患の処置および／または予防のための医薬の製造における本発明の第１０の態様の医薬組成物の使用に関する。

第１４の態様では、本発明は、本発明の第４〜第６の態様の核酸または本発明の第７もしくは（ｏｆ）第８の態様のベクターを含むキットを提供する。

第１５の態様では、本発明は、本発明の第９の態様のＴまたはＮＫ細胞を作製するための方法であって、本発明の第４〜６の態様の核酸配列または本発明の第７もしくは第８の態様のベクターをＴまたはＮＫ細胞に導入する工程を含む方法に関する。

Ｔ細胞またはＮＫ細胞は、被験体から単離された試料に由来し得る。

第１６の態様では、本発明は、本発明の第９の態様のＴまたはＮＫ細胞を含む被験体において本発明の第１の態様に記載のＣＡＲシグナル伝達系を阻害するための方法であって、前記作用物質を該被験体に投与する工程を含む、方法に関する。

したがって、本発明は、受容体構成要素とシグナル伝達構成要素との共局在化を妨げる作用物質（例えば、小分子）の存在下で、シグナル伝達が阻害され得るＣＡＲ系を提供する。これは、衰えないシグナル伝達に関連する潜在的な毒性効果を回避するために、ＣＡＲシグナル伝達およびしたがってＣＡＲ細胞の効力を、制御可能な様式で可逆的に終了させることを可能にする。さらに、本発明の系はまた、ＣＡＲ細胞の効力を薬理学的に制御し、所望の治療効果の達成と望ましくない毒性の回避との間の許容され得るバランスに調整することを可能にする。

（詳細な説明）
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）
図１で概略的に示されているＣＡＲは、細胞外抗原認識ドメイン（バインダー）を細胞内シグナル伝達ドメイン（エンドドメイン）に結び付けるキメラＩ型膜貫通タンパク質である。バインダーは、典型的にはモノクローナル抗体（ｍＡｂ）から誘導された１本鎖可変フラグメント（ｓｃＦＶ）であるが、抗体様抗原結合部位を含む他のフォーマットに基づくことも可能である。スペーサードメインは、膜からバインダーを単離し、好適な配向をもたせるのに必要であり得る。使用される一般的なスペーサードメインは、ＩｇＧ１のＦｃである。より小型のスペーサー、例えば、抗原によっては、ＣＤ８αからのストーク、さらにはＩｇＧ１ヒンジ単独でも十分であり得る。膜貫通ドメインは、細胞膜にタンパク質をつなぎ止め、スペーサーをエンドドメインに結び付ける。

初期のＣＡＲ設計は、ＦｃεＲ１またはＣＤ３ζのγ鎖のどちらかの細胞内部分から誘導されたエンドドメインを有していた。したがって、これらの第一世代受容体は、免疫学的シグナル１を伝達するもので、同種標的細胞のＴ細胞による致死を誘発するのに十分ではあったが、Ｔ細胞を十分に活性化して増殖および生存をもたらすことはなかった。この限界を克服するため、複合エンドドメインが構築された：Ｔ細胞共刺激分子の細胞内部分とＣＤ３ζの細胞内部分の融合により、抗原認識後活性化シグナルおよび共刺激シグナルを同時に伝達することができる第二世代受容体がもたらされる。最も一般的に使用される共刺激ドメインは、ＣＤ２８の共刺激ドメインである。これは、Ｔ細胞増殖を誘発する最も強力な共刺激シグナル、すなわち免疫学的シグナル２を供給する。また、生存シグナルを伝達する密接に関連したＯＸ４０および４１ＢＢなど、ＴＮＦ受容体ファミリーのエンドドメインを含む一部の受容体も記載されている。活性化シグナル、増殖シグナルおよび生存シグナルを伝達することができるエンドドメインを有するさらにいっそう強力な第三世代ＣＡＲが現在記載されている。

ＣＡＲエンコード核酸は、例えば、レトロウイルスベクターを用いてＴ細胞に移入され得る。こうして、多数の抗原特異的Ｔ細胞が、養子細胞移入のために生成され得る。ＣＡＲが標的抗原と結合したとき、これにより、活性化シグナルの、それが発現されるＴ細胞への伝達がもたらされる。すなわち、ＣＡＲは、標的抗原を発現する細胞に向けたＴ細胞の特異性および細胞傷害性を誘導する。

第１の態様では、本発明は、抗原認識／抗原結合ドメインおよび膜貫通ドメインが、細胞膜に局在する第１の分子（本明細書では「受容体構成要素」と称される）上に提供されるＣＡＲ系に関する。細胞内シグナル伝達ドメインは、第２の細胞内分子（本明細書では「シグナル伝達構成要素」と称される）上に提供される。

重要なことに、受容体構成要素は、第１の結合ドメインを含み、シグナル伝達構成要素は、受容体構成要素の第１の結合ドメインに特異的に結合する第２の結合ドメインを含む。したがって、第２の結合ドメインへの第１の結合ドメインの結合は、受容体構成要素とシグナル伝達構成要素とのヘテロ二量体化および共局在化を引き起こす。抗原が受容体構成要素の抗原結合ドメインに結合するとき、シグナル伝達構成要素を介したシグナル伝達が起こる。

第１または第２の結合ドメインはまた、互いの結合ドメインに加えて、さらなる作用物質に結合することができる。さらなる作用物質は、例えば、小分子であり得る。作用物質と第１または第２の結合ドメインとの間の結合は、第１の結合ドメインと第２の結合ドメインとの間の結合よりも高い親和性のものである。したがって、作用物質が存在する場合、それは、第１または第２の結合ドメインに優先的に結合し、受容体構成要素とシグナル伝達構成要素との間のヘテロ二量体化を阻害／破壊する。さらなる作用物質の存在下において、抗原が受容体構成要素の抗原結合ドメインに結合するとき、シグナル伝達構成要素を介したシグナル伝達が起こらない。

具体的には、作用物質の存在下では、受容体構成要素およびシグナル伝達構成要素は、確率的な分散様式で位置し、受容体構成要素の抗原結合ドメインによる抗原結合は、シグナル伝達構成要素を介したシグナル伝達をもたらさない。

本明細書では、受容体構成要素とシグナル伝達構成要素との「共局在化」または「ヘテロ二量体化」は、受容体構成要素の第１の結合ドメインとシグナル伝達構成要素の第２の結合ドメインとの結合を介した、受容体構成要素へのシグナル伝達構成要素のライゲーション／リクルートに類似する。

作用物質の存在下における受容体構成要素による抗原結合は、シグナル伝達構成要素を介した「非生産的」シグナル伝達をもたらすと称され得る。このようなシグナル伝達は、細胞活性化、例えばＴ細胞活性化をもたらさない。作用物質の非存在下における受容体構成要素による抗原結合は、シグナル伝達構成要素を介した「生産的」シグナル伝達をもたらすと称され得る。このシグナル伝達は、Ｔ細胞活性化をもたらし、例えば標的細胞の死滅およびＴ細胞の活性化を引き起こす。

作用物質の非存在下における受容体構成要素による抗原結合は、作用物質の存在下において抗原が受容体構成要素によって結合された場合に起きるシグナル伝達よりも２倍、５倍、１０倍、５０倍、１００倍、１，０００倍または１０，０００倍高い、シグナル伝達構成要素を介したシグナル伝達をもたらし得る。

シグナル伝達構成要素を介したシグナル伝達は、当技術分野で公知の様々な方法によって決定され得る。このような方法としては、シグナル伝達のアッセイ、例えば、特定のタンパク質チロシンキナーゼ（ＰＴＫ）のレベル、ホスファチジルイノシトール−４，５−ビホスフェート（ＰＩＰ_２）の破壊、タンパク質キナーゼＣ（ＰＫＣ）の活性化および細胞内カルシウムイオン濃度の上昇のアッセイが挙げられる。機能的な読み出し情報、例えばＴ細胞のクローン増殖、細胞表面上の活性化マーカーのアップレギュレーション、エフェクター細胞への分化および細胞傷害性またはサイトカイン分泌の誘導もまた利用され得る。例証として、本実施例では、本発明者らは、様々な濃度の作用物質の存在下で抗原が受容体構成要素に結合した際の、本発明のＣＡＲ系の受容体構成要素およびシグナル伝達構成要素を発現するＴ細胞によって産生されたインターロイキン−２（ＩＬ−２）のレベルを決定した。

第１の結合ドメイン、第２の結合ドメインおよび作用物質
本ＣＡＲ系の第１の結合ドメイン、第２の結合ドメインおよび作用物質は、作用物質の非存在下における受容体構成要素とシグナル伝達構成要素との選択的な共局在化および二量体化を可能にする分子／ペプチド／ドメインの任意の組み合わせであり得る。

このように、第１の結合ドメインと第２の結合ドメインとは、特異的に結合することができる。

本発明のシグナル伝達系は、特定の二量体化系の配置によって限定されない。シグナル伝達構成要素が、作用物質の非存在下における受容体構成要素とシグナル伝達構成要素との共局在化を可能にする、対応する相補的結合ドメインを含む限り、受容体構成要素は、所定の二量体化系の第１の結合ドメインまたは第２の結合ドメインのいずれかを含み得る。

第１の結合ドメインおよび第２の結合ドメインは、ペプチドドメインおよびペプチド結合ドメインであり得、またはその逆も同様である。ペプチドドメインおよびペプチド結合ドメインは、特異的に結合することができるペプチド／ドメインの任意の組み合わせであり得る。

作用物質は、第１の結合ドメインと第２の結合ドメインとの間の結合よりも高い親和性で、第１の結合ドメインまたは第２の結合ドメインに特異的に結合することができる分子（例えば、小分子）である。

例えば、結合系は、ペプチド：ペプチド結合ドメイン系に基づくものであり得る。第１または第２の結合ドメインは、ペプチド結合ドメインを含み得、他方の結合ドメインは、前記ペプチドよりも低い親和性でペプチド結合ドメインに結合するペプチド模倣物を含み得る。作用物質としてのペプチドの使用は、競合結合を介したペプチド結合ドメインへのペプチド模倣物の結合を破壊する。ペプチド模倣物は、ペプチド結合ドメインに対する結合親和性を減少させるための１つまたはそれを超える（ｏｎｅ ｏｆ ｍｏｒｅ）アミノ酸変化を有する以外は、「野生型」ペプチドと類似のアミノ酸配列を有し得る。

例えば、作用物質は、第１の結合ドメインと第２の結合ドメインとの間の親和性よりも少なくとも１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、１０００倍または１００００倍高い親和性で、第１の結合ドメインまたは第２の結合ドメインに結合し得る。

作用物質は、第１の結合ドメインと第２の結合ドメインとの間の親和性よりも高い親和性で、第１の結合ドメインまたは第２の結合ドメインに優先的に結合する任意の薬学的に許容され得る分子であり得る。

作用物質は、標的細胞の細胞質に送達され、細胞内結合に利用可能であり得る。

作用物質は、血液脳関門を通過することができるものであり得る。

ペプチドの共局在化を制御するための小分子系は、当技術分野で公知であり、例えば、Ｔｅｔリプレッサー（ＴｅｔＲ）、ＴｅｔＲ相互作用タンパク質（ＴｉＰ）、テトラサイクリン系である（Ｋｌｏｔｚｓｃｈｅら；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８０，２４５９１−２４５９９（２００５）；Ｌｕｃｋｎｅｒら；Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３６８，７８０−７９０（２００７））。

Ｔｅｔリプレッサー（ＴｅｔＲ）系
Ｔｅｔオペロンは、哺乳類細胞での使用に適合されている周知の生物学的オペロンである。ＴｅｔＲは、ホモ二量体としてテトラサイクリンに結合して立体構造変化を受け、次いで、これがＴｅｔＲ分子のＤＮＡ結合を調節する。（上記）Ｋｌｏｔｚｓｃｈｅらには、ＴｅｔＲを活性化するファージディスプレイ由来ペプチドが記載されている。このタンパク質（ＴｅｔＲ相互作用タンパク質／ＴｉＰ）は、ＴｅｔＲ中に結合部位（これは、テトラサイクリン結合部位と重複するが同一ではない）を有する（Ｌｕｃｋｎｅｒら；上記）。したがって、ＴｉＰとテトラサイクリンとは、ＴｅｔＲの結合について競合する。

本ＣＡＲ系では、シグナル伝達構成要素の第２の結合ドメインが対応する相補的結合パートナーである限り、受容体構成要素の第１の結合ドメインは、ＴｅｔＲまたはＴｉＰであり得る。例えば、受容体構成要素の第１の結合ドメインがＴｅｔＲである場合、シグナル伝達構成要素の第２の結合ドメインはＴｉＰである。受容体構成要素の第１の結合ドメインがＴｉＰである場合、シグナル伝達構成要素の第２の結合ドメインはＴｅｔＲである。

例えば、第１の結合ドメインまたは第２の結合ドメインは、配列番号１または配列番号２として示されている配列を含み得る：

機能するために、ＴｅｔＲは、ホモ二量体化しなければならない。したがって、受容体構成要素上の第１の結合ドメインがＴｅｔＲである場合、受容体構成要素は、膜貫通ドメインと第１の結合ドメイン（ＴｅｔＲ）との間にリンカーを含み得る。リンカーは、ＴｅｔＲが、隣接する受容体構成要素由来のＴｅｔＲとホモ二量体化して、正しい方向に配置することを可能にする。

リンカーは、配列番号３として示されている配列であり得る。

あるいは、リンカーは、配列番号３として示されている配列と類似の長さおよび／またはドメイン配置特性を有する別のリンカー配列を含み得る。

リンカーは、ＴｅｔＲが、隣接する受容体構成要素由来のＴｅｔＲとホモ二量体化して、正しい方向に配置することを可能にする機能を提供する限り、配列番号３と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の配列同一性を有し得る。

ＴｅｔＲ／ＴｉＰ系の１つの潜在的欠点は、ＴｅｔＲが異種性および免疫原性であることである。したがって、ＴｅｔＲ配列は、より低い免疫原性であるが、ＴｉＰに特異的に結合する能力を保持する変異型であり得る。

第１および第２の結合ドメインがＴｅｔＲまたはＴｉＰまたはそれらの変異型である場合、作用物質は、テトラサイクリン、ドキシサイクリン、ミノサイクリンまたはそれらの類似体であり得る。

類似体は、テトラサイクリン、ドキシサイクリンまたはミノサイクリンの変異型であって、ＴｅｔＲに特異的に結合する能力を保持する変異型を指す。

本ＣＡＲ系で使用され得る結合ドメインと作用物質との他の組み合わせは、当技術分野で公知である。例えば、ＣＡＲ系は、ストレプトアビジン／ビオチンベースの結合系を使用し得る。

ストレプトアビジン結合エピトープ
第１または第２の結合ドメインは、１つまたはそれを超えるストレプトアビジン結合エピトープ（複数も可）を含み得る。他の結合ドメインは、ビオチン模倣物を含み得る。

ストレプトアビジンは、細菌Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｖｉｄｉｎｉｉ由来の５２．８ｋＤａのタンパク質である。ストレプトアビジンのホモ四量体は、ビオチン（ビタミンＢ７またはビタミンＨ）に対して非常に高い親和性を有し、解離定数（Ｋｄ）は、約１０^−１５Ｍである。ビオチン模倣物は、野生型ビオチンよりも低いストレプトアビジンに対する親和性を有するので、その結果、ビオチンそれ自体を、ストレプトアビジンドメインとビオチン模倣ドメインとの間のヘテロ二量体化を破壊または防止するための作用物質として使用し得る。ビオチン模倣物は、例えば、１ｎＭ〜１００ｕＭのＫｄでストレプトアビジンに結合し得る。

「ビオチン模倣」ドメインは、例えば、ストレプトアビジンに特異的に結合する短いペプチド配列（例えば、６〜２０、６〜１８、８〜１８または８〜１５アミノ酸）を含み得る。

ビオチン模倣物は、表１に示されている配列を含み得る。

ビオチン模倣物は、以下の群：ＳｔｒｅｐｔａｇＩＩ、Ｆｌａｎｋｅｄｃｃｓｔｒｅｐｔａｇおよびｃｃｓｔｒｅｐｔａｇから選択され得る。

ストレプトアビジンドメインは、配列番号１１に示されている配列、またはビオチンに結合する能力を保持するその断片もしくは変異型を有するストレプトアビジンを含み得る。

全長ストレプトアビジンは、１５９アミノ酸を有する。１５９残基の全長タンパク質のＮ末端およびＣ末端がプロセシングされて、通常は残基１３〜１３９から構成されるより短い「コア」ストレプトアビジンが生じる；Ｎ末端およびＣ末端の除去は、高いビオチン結合親和性に必要である。

「コア」ストレプトアビジンの配列（残基１３〜１３９）は、配列番号１１として示されている。

ストレプトアビジンは、天然ではホモ四量体として存在する。ストレプトアビジン単量体の二次構造は、８本の逆平行βストランドから構成され、これがフォールディングされて、逆平行ベータバレル三次構造が生じる。ビオチン結合部位は、各βバレルの一端に位置する。４つの同一のストレプトアビジン単量体（すなわち、４つの同一のβバレル）が会合して、ストレプトアビジンの四量体四次構造が生じる。各バレル中のビオチン結合部位は、隣接するサブユニット由来の保存されたＴｒｐ１２０と共に、バレルの内部由来の残基からなる。このように、各サブユニットは、隣接するサブユニット上の結合部位に寄与するので、四量体は、機能的二量体の二量体とも考えられ得る。

本発明のＣＡＲ系のストレプトアビジンドメインは、ストレプトアビジン単量体、二量体または四量体から本質的になり得る。

ストレプトアビジン単量体、二量体または四量体の配列は、配列番号１１に示されている配列、またはビオチンに結合する能力を保持するその変異型の全部または一部を含み得る。

変異型ストレプトアビジンの配列は、配列番号１１またはその機能的部分と少なくとも７０、８０、９０、９５または９９％の同一性を有し得る。変異型ストレプトアビジンは、ビオチン結合に関与する以下のアミノ酸：残基Ａｓｎ２３、Ｔｙｒ４３、Ｓｅｒ２７、Ｓｅｒ４５、Ａｓｎ４９、Ｓｅｒ８８、Ｔｈｒ９０およびＡｓｐ１２８のうちの１つまたはそれより多くを含み得る。変異型ストレプトアビジンは、例えば、これらの残基の８個すべてを含み得る。変異型ストレプトアビジンが二量体または四量体（ｔｅｒａｍｅｒ）として結合ドメイン中に存在する場合、それはまた、隣接するサブユニットによるビオチン結合に関与するＴｒｐ１２０を含み得る。

タンパク質間相互作用を破壊する小分子作用物質が医薬目的で長年開発されている（Ｖａｓｓｉｌｅｖらによる総説；Ｓｍａｌｌ−Ｍｏｌｅｃｕｌｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ＩＳＢＮ：９７８−３−６４２−１７０８２−９）。記載されているＣＡＲ系は、このような小分子を使用し得る。その相互作用が破壊されたタンパク質またはペプチド（または、これらのタンパク質の関連断片）は、第１および／または第２の結合ドメインとして使用され得、小分子は、ＣＡＲ活性化を阻害する作用物質として使用され得る。このような系は、小分子およびタンパク質を代えることによって変化され得、このような系は記載されているように機能するが、小分子は、（例えば、Ｒｉｖｅｒａら、（Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ；１９９６；２；１０２８−１０３２）に記載されているものと同様の様式で）望ましくない薬理学的活性を欠く。

その相互作用が、小分子などの作用物質を使用して破壊可能なタンパク質／ペプチドのリストは、表２に示されている。これらの破壊可能なタンパク質間相互作用（ＰＰＩ）は、本発明のＣＡＲ系で使用され得る。これらのＰＰＩについてのさらなる情報は、Ｗｈｉｔｅら、２００８（Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．１０：ｅ８）から入手可能である。

上記作用物質と同じ第１の結合ドメインに競合的に結合する第２の結合ドメインであって、そして作用物質の非存在下における本シグナル伝達系の受容体構成要素とシグナル伝達構成要素とを共局在化するために使用され得る第２の結合ドメインは、当技術分野で周知の技術および方法を使用して同定され得る。例えば、このような第２の結合ドメインは、単一ドメインＶＨＨライブラリのディスプレイによって同定され得る。

本シグナル伝達系の第１の結合ドメインおよび／または第２の結合ドメインは、互いの結合ドメインに特異的に結合できる変異型であって、したがって受容体構成要素とシグナル伝達構成要素との共局在化を促進することができる変異型（複数も可）を含み得る。

変異型の配列は、前記配列が有効な二量体化系を提供する限り、野生型配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の配列同一性を有し得る。すなわち、前記配列が、作用物質の非存在下において受容体構成要素とシグナル伝達構成要素との十分な共局在化を促進する限り、抗原結合ドメインが抗原に結合すると、生産的シグナル伝達が起こる。

本発明はまた、本発明の第１の態様のＣＡＲ系を阻害するための方法であって、作用物質を投与する工程を含む方法に関する。上記のように、作用物質の投与は、、受容体構成要素とシグナル伝達構成要素との間の共局在化の破壊をもたらし、その結果、抗原が抗原結合ドメインに結合すると、シグナル伝達構成要素を介したシグナル伝達が阻害される。

第１および第２の結合ドメインは、ＣＡＲ系を介したシグナル伝達（これは、存在する作用物質の濃度に比例する）を促進し得る。したがって、作用物質は、第１の結合ドメインと第２の結合ドメインとの間の結合親和性よりも高い親和性で、第１の結合ドメインまたは第２の結合ドメインに結合する一方、低濃度の作用物質の存在下では、受容体構成要素とシグナル伝達構成要素との共局在化は、完全に除去され得ない。例えば、低濃度の作用物質は、完全に阻害せずに、抗原に対する応答においてシグナル伝達の総レベルを減少させ得る。作用物質の特定の濃度は、必要なシグナル伝達のレベルならびに特定の結合ドメインおよび作用物質に応じて異なる。シグナル伝達のレベルおよび作用物質濃度との相関は、上記のように、当技術分野で公知の方法を使用して決定され得る。

受容体構成要素
本発明は、抗原結合ドメインと、任意選択のスペーサードメインと、膜貫通ドメインと、第１の結合ドメインとを含む受容体構成要素を提供する。細胞において発現される場合、受容体構成要素は、細胞膜に局在する。ここで、分子の抗原結合ドメインは、膜の細胞外側に配向され、第１の結合ドメインは、膜の細胞内側に局在する。

したがって、受容体構成要素は、本発明のＣＡＲ系の抗原結合機能を提供する。

抗原結合ドメイン
抗原結合ドメインは、抗原を認識する古典的なＣＡＲの一部である。本発明のシグナル伝達系では、抗原結合は、受容体構成要素内に位置する。

抗体の抗原結合部位、抗体模倣物およびＴ細胞受容体をベースとするものを含む多数の抗原結合ドメインが、当技術分野で公知である。例えば、抗原結合ドメインは、モノクローナル抗体由来の単鎖可変断片（ｓｃＦＶ）；標的抗原の天然リガンド；標的に対して十分な親和性を有するペプチド；単一ドメイン結合剤（例えば、ラクダ科動物）；Ｄａｒｐｉｎのような人工単一結合剤；またはＴ細胞受容体由来の単鎖を含み得る。

以下の表１に示されているように、様々な腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）が公知である。本発明で使用される抗原結合ドメインは、そこに示されているように、ＴＡＡに結合することができるドメインであり得る。

膜貫通ドメイン

膜貫通ドメインは、膜を貫通する古典的なＣＡＲの配列である。本発明のシグナル伝達系では、膜貫通ドメインは、受容体構成要素中に位置する。それは、疎水性アルファヘリックスを含み得る。膜貫通ドメインはＣＤ２８に由来し得、良好な受容体安定性を与える。
シグナルペプチド

シグナルペプチド
本発明のＣＡＲ系の受容体構成成分はシグナルペプチドを含み得、その結果、受容体構成要素がＴ細胞などの細胞において発現されるとき、新生タンパク質を小胞体、それに続いて細胞表面へと指向させ、そこで発現される。

シグナルペプチドのコアは、単一アルファ−へリックスを形成する傾向を有する疎水性アミノ酸の長いストレッチを含み得る。シグナルペプチドは、アミノ酸の短い正に荷電したストレッチから始まり得、これが転位中におけるポリペプチドの適切なトポロジーを強化する助けとなる。シグナルペプチドの末端に、典型的にはシグナルペプチダーゼにより認識され、切断されるアミノ酸のストレッチが存在する。シグナルペプチダーゼは、転位中または転位完了後に切断して、遊離シグナルペプチドおよび成熟タンパク質を生成させ得る。次いで、遊離シグナルペプチドは、特異的プロテアーゼにより消化される。

シグナルペプチドは、分子のアミノ末端に位置し得る。

シグナルペプチドは、配列番号１２、１３もしくは１４に示されるような配列または５、４、３、２もしくは１のアミノ酸変異（挿入、置換または付加）を有するその変異型を含み得るが、ただし、シグナルペプチドは、依然としてＣＡＲの細胞表面発現を誘発するべく機能するものとする。

配列番号１２のシグナルペプチドは、小型であり高効率である。末端グリシンの後約９５％切断を与えることから、シグナルペプチダーゼによる効率的な除去をもたらすと予測される。

配列番号１３のシグナルペプチドは、ＩｇＧ１から誘導される。

配列番号１４のシグナルペプチドは、ＣＤ８から誘導される。
スペーサードメイン

本明細書に記載されるＣＡＲシステムは、受容体構成要素中の膜貫通ドメインを伴う抗原結合ドメインを連結するためのスペーサー配列を含み得る。撓性スペーサーは、抗原結合ドメインを異なる方向で配向させることにより、結合を促進し得る。

スペーサー配列は、例えば、ＩｇＧ１ Ｆｃ領域、ＩｇＧ１ヒンジまたはヒトＣＤ８ストークまたはマウスＣＤ８ストークを含み得る。あるいは、スペーサーは、ＩｇＧ１ Ｆｃ領域、ＩｇＧ１ヒンジまたはＣＤ８ストークと類似した長さおよび／またはドメインスペーシング特性を有する代替的リンカー配列を含み得る。ヒトＩｇＧ１スペーサーは、Ｆｃ結合性モチーフを除去するために改変され得る。

これらのスペーサーについてのアミノ酸配列の例を以下に示す：

複数の第１の結合ドメインを含む受容体構成要素
受容体構成要素は、複数の第１の結合ドメインを含み得るので、複数のシグナル伝達構成要素をリクルートすることができるものであり得る。

複数の第１の結合ドメインは、受容体構成要素の単一の細胞内ドメイン中に存在し得る。

受容体構成要素は、各第１の結合ドメインが細胞膜の細胞内側に配向されるような、適切な数の膜貫通ドメインを含み得る。例えば、受容体構成要素は、３個、５個、７個、９個、１１個またはそれを超える膜貫通ドメインを含み得る。このように、単一の受容体構成要素は、抗原に応答してシグナル伝達を増幅する複数のシグナル伝達構成要素をリクルートし得る。

第１の結合ドメインはそれぞれ、シグナル伝達構成要素の第２の結合ドメインに対して異なる親和性を有する変異型であり得る。

複数の受容体構成要素
本発明の別の実施形態では、ＣＡＲ系は、それぞれが異なる抗原を認識するが同じ第１の細胞内結合ドメインから構成される２つまたはそれを超える受容体構成要素を含み得る。このようなＣＡＲ系は、複数の抗原を認識することができるであろう（図１１）。これは、例えば、腫瘍回避を防ぐのに有用であり得る。本発明のさらなる関連態様では、受容体構成要素の第１の結合ドメインは、シグナル伝達構成要素の第２の結合ドメインに対する親和性を決定する残基が異なる。このように、ＣＡＲ系は、一方の抗原に対するシグナル伝達が、別のものに対するものよりも大きくまたは小さくなるように調整され得る（図１１）。これは、例えば、２つの腫瘍抗原を同時に標的とする場合に有用であり得るが、一方が他方よりも高密度で発現される。この抗原に対する応答は、過剰刺激によって引き起こされる毒性を回避するために下方調整され得る。

２つのドメイン間の結合親和性が変化するように第１または第２の結合ドメインのアミノ酸残基を変化させるために適切な方法は当技術分野で公知であり、標的化突然変異誘発とランダム突然変異誘発との両方を使用したアミノ酸の置換、付加および除去が挙げられる。第１の結合ドメインと第２の結合ドメインとの間の結合親和性を決定するための方法もまた当技術分野で周知であり、タンパク質間相互作用のバイオインフォマティクス予測、アフィニティー電気泳動、表面プラズモン共鳴、バイオレイヤー干渉法、二重偏波干渉法、静的光散乱および動的光散乱が挙げられる。

シグナル伝達構成要素
本発明はまた、シグナル伝達ドメインと第２の結合ドメインとを含むシグナル伝達構成要素を提供する。シグナル伝達構成要素は可溶性分子であるので、それが細胞（例えば、Ｔ細胞）において発現されると、細胞質に局在する。

本発明によって提供される受容体構成要素と共局在しない限り、シグナル伝達は、シグナル伝達構成要素のシグナル伝達ドメインを介して起こらない。このような共局在化は、上記のように作用物質の非存在下においてのみ起こる。

細胞内シグナル伝達ドメイン
細胞内シグナル伝達ドメインは、古典的なＣＡＲのシグナル伝達部分である。本発明のシグナル伝達系では、細胞内シグナル伝達ドメイン（シグナル伝達ドメイン）は、シグナル伝達構成要素中に位置する。作用物質の非存在下では、膜結合の、受容体構成要素および細胞内シグナル伝達構成要素は、近接している。抗原認識の後、受容体クラスタ、天然ＣＤ４５およびＣＤ１４８がシナプスから排除され、シグナルが細胞に伝達される。

このように、シグナル伝達構成要素のシグナル伝達ドメインは、古典的なＣＡＲ分子のエンドドメインに類似する。

最も一般的に使用されるシグナル伝達ドメインは、３つのＩＴＡＭを含むＣＤ３−ゼータエンドドメインのシグナル伝達ドメインである。これは、抗原が結合された後、活性化シグナルをＴ細胞に伝達する。ＣＤ３−ゼータは、十分に適格な活性化シグナルを提供しない可能性があるので、追加の共刺激シグナル伝達が必要とされ得る。例えば、キメラＣＤ２８およびＯＸ４０は、ＣＤ３−ゼータと併用されて、増殖／生存シグナルを伝達し得るか、または３つ全部が一緒に使用され得る（図１Ｂにおいて説明される）。

本明細書記載のシグナル伝達構成要素はシグナル伝達ドメインを含み、それは、ＣＤ３ゼータエンドドメインのみを含み得るか、ＣＤ２８もしくはＯＸ４０のいずれかのエンドドメインと共にＣＤ３ゼータエンドドメインを含み得るか、またはＣＤ２８エンドドメインならびにＯＸ４０およびＣＤ３ゼータエンドドメインを含み得る（図３Ａ）。

本発明のＣＡＲ系のシグナル伝達構成要素は、配列番号２０、２１もしくは２２に示されている配列、または少なくとも８０％の配列同一性を有するそれらの変異型を含み得る。

変異型の配列は、前記配列が有効な細胞内シグナル伝達ドメインを提供する限り、配列番号２０、２１または２２と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の配列同一性を有し得る。

複数のシグナル伝達構成要素
本発明の第１の態様のシグナル伝達系は、それぞれがシグナル伝達ドメインと第２の結合ドメインとを含む複数のシグナル伝達構成要素を含み得、各第２の結合ドメインは、受容体構成要素の同じ第１の結合ドメインに結合されているが、シグナル伝達ドメインは、異なるエンドドメインを含む（図９）。このように、複数の異なるエンドドメインは、同時に活性化され得る。各シグナル伝達ドメインは、他のシグナル伝達ドメインから妨害されないので、これは、複合的なシグナル伝達ドメインよりも有利である。

各シグナル伝達構成要素が、受容体構成要素の第１の結合ドメインに対するそれらの親和性を変化させる残基が異なる第２の結合ドメインを含む場合、異なるシグナル伝達ドメインを含むシグナル伝達構成要素は、異なる速度で第１の結合ドメインにライゲーションする（図１０）。異なるシグナル伝達構成要素が、様々な速度／ダイナミクスで受容体構成要素にリクルートされるので、これは、受容体構成要素による抗原結合に応答するシグナル伝達のより優れた制御を可能にする。複合的なエンドドメインによって伝達された一定の同じ比率のシグナルよりもむしろ、最適なＴ細胞活性化シグナルは、異なる割合の異なる免疫学的シグナルを必要とし得るので、これは有利である。

核酸
本発明はさらに、第２の態様の受容体構成要素をコードする核酸、および第３の態様のシグナル伝達構成要素をコードする核酸を提供する。

本明細書で使用される用語「ポリヌクレオチド」、「ヌクレオチド」および「核酸」は、互いに同義語であることを意図する。

当業者は、多数の異なるポリヌクレオチドおよび核酸が、遺伝コードの縮重の結果として同じポリペプチドをコードし得ることを理解するであろう。加えて、当業者は、ポリペプチドが発現される任意の特定の宿主生物のコドン使用頻度を反映するために、ルーチンな技術を使用して、本明細書記載のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド配列に影響を与えないヌクレオチド置換を行い得ると理解されよう。

本発明の核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡを含み得る。それらは、単鎖または二本鎖であり得る。それらはまた、その中に合成ヌクレオチドまたは改変ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドであり得る。オリゴヌクレオチドに対するいくつかの異なる種類の改変が、当技術分野で公知である。これらとしては、メチルホスホネートおよびホスホロチオエート骨格、分子の３’および／または５’末端におけるアクリジンまたはポリリシン鎖の付加が挙げられる。本明細書記載の使用の目的のために、ポリヌクレオチドは、当技術分野で利用可能な任意の方法によって改変され得ると理解すべきである。このような改変は、目的のポリヌクレオチドのインビボ活性または寿命を増強するために行われ得る。

ヌクレオチド配列に関する用語「変異型」、「相同体」または「誘導体」は、配列からのまたは配列への１つ（またはそれを超える）核酸の任意の置換、変異、改変、交換、欠失または付加を含む。

本発明の核酸は、受容体構成要素とシグナル伝達構成要素との両方をコードする核酸であり得る。

核酸は、切断部位により連結された受容体構成要素およびシグナル伝達構成要素を含むポリペプチドを生成し得る。切断部位は、ポリペプチドが産生されるとき、外部の切断活性を一切必要とせずに受容体構成要素およびシグナル伝達構成要素へと直ちに切断されるように、自己切断性であり得る。

示された配列を有する、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）２ａ自己切断性ペプチドを含む、様々な自己切断性部位が知られている：

または

核酸は、配列番号２５として示されている配列を含むポリペプチドを生産し得る。

．．．．．は、抗原結合ドメイン配列が含まれ得る位置を示す。任意の抗原結合ドメイン、例えば本明細書記載のｓｃＦＶが含まれ得る。

共発現配列は、配列内リボソーム進入配列（ＩＲＥＳ）であり得る。共発現配列は、内部プロモーターであり得る。

本発明はまた、第２の態様の受容体構成要素をコードする核酸および／または第３の態様のシグナル伝達構成要素をコードする核酸を含むキットを提供する。

ベクター
本発明はまた、本発明の第２の態様の受容体構成要素および／または本発明の第３の態様のシグナル伝達構成要素をコードする１つまたはそれを超える核酸配列（複数も可）を含む、ベクターまたはベクターのキットを提供する。このようなベクターは、それが、本発明の第１の態様のＣＡＲ系の受容体構成要素およびシグナル伝達構成要素を発現するように、核酸配列（複数も可）を宿主細胞に導入するために使用され得る。

ベクターは、例えば、プラスミドまたはウイルスベクター、例えばレトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターまたはトランスポゾンベースのベクターまたは合成ｍＲＮＡであり得る。

ベクターは、Ｔ細胞またはＮＫ細胞をトランスフェクトまたは形質導入することができるものであり得る。

細胞溶解性免疫細胞
本発明はまた、本発明の第１の態様のＣＡＲ系を含む免疫細胞に関する。

細胞溶解性免疫細胞は、本発明の核酸またはベクターを含み得る。

細胞溶解性免疫細胞は、本発明の受容体構成要素およびシグナル伝達構成要素を含み得る。

細胞溶解性免疫細胞は、少なくとも１つの本発明のシグナル伝達構成要素を含み得る。例えば、細胞溶解性免疫細胞は、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、多数の本発明のシグナル伝達構成要素を含み得る。

細胞溶解性免疫細胞は、少なくとも１つの本発明の受容体構成要素を含み得る。例えば、細胞溶解性免疫細胞は、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、多数の本発明の受容体構成要素を含み得る。

細胞溶解性細胞は、細胞媒介性免疫において中心的役割を演じるリンパ球のタイプであるＴ細胞またはＴリンパ球であり得る。それらは、細胞表面におけるＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の存在により、Ｂ細胞およびナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）など、他のリンパ球とは区別することができる。下記で概説する通り、様々なタイプのＴ細胞がある。

ヘルパーＴヘルパー細胞（ＴＨ細胞）は、形質細胞および記憶Ｂ細胞へのＢ細胞の成熟、ならびに細胞傷害性Ｔ細胞およびマクロファージの活性化を含む、免疫学的プロセスで他の白血球を補助する。ＴＨ細胞は、それらの表面でＣＤ４を発現する。ＴＨ細胞は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面でＭＨＣクラスＩＩ分子によりペプチド抗原と共に提示されたときに活性化される。これらの細胞は、種々のサイトカインを分泌することにより、種々のタイプの免疫応答を促進する、ＴＨ１、ＴＨ２、ＴＨ３、ＴＨ１７、Ｔｈ９、またはＴＦＨを含む、幾つかのサブタイプのうちの１つに分化し得る。

細胞溶解性Ｔ細胞（ＴＣ細胞またはＣＴＬ）は、ウイルス感染細胞および腫瘍細胞を破壊し、また移植拒絶でも関与する。ＣＴＬは、それらの表面でＣＤ８を発現する。これらの細胞は、全有核細胞の表面に存在する、ＭＨＣクラスＩに随伴する抗原に結合することにより標的を認識する。調節性Ｔ細胞により分泌されるＩＬ−１０、アデノシンおよび他の分子を通じて、ＣＤ８＋細胞はアネルギー状態に不活化され得、実験的自己免疫脳脊髄炎などの自己免疫疾患を防止する。

記憶Ｔ細胞は、感染の消散後長期にわたって持続する抗原特異的Ｔ細胞のサブセットである。それらは、それらの同種抗原に再曝露されると、迅速に多数のエフェクターＴ細胞に拡大し、過去の感染に対する「記憶」をもつ免疫系を提供する。記憶Ｔ細胞は、３つのサブタイプ：セントラル記憶Ｔ細胞（ＴＣＭ細胞）および２タイプのエフェクター記憶Ｔ細胞（ＴＥＭ細胞およびＴＥＭＲＡ細胞）を含む。記憶細胞は、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋のいずれかであり得る。記憶Ｔ細胞は、典型的には細胞表面タンパク質ＣＤ４５ＲＯを発現する。

以前にはサプレッサーＴ細胞として知られていた、調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ細胞）は、免疫寛容の維持に非常に重要である。それらの主たる役割は、免疫反応の終末に向けてＴ細胞媒介性免疫を制止し、胸腺での負の選択のプロセスを逃れた自己反応性Ｔ細胞を抑制することである。

ＣＤ４＋Ｔｒｅｇ細胞の２つの主なクラス−天然に存在するＴｒｅｇ細胞および適応Ｔｒｅｇ細胞については記載されている。

天然に存在するＴｒｅｇ細胞（ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋Ｔｒｅｇ細胞としても知られている）は、胸腺で生じ、ＴＳＬＰで活性化された骨髄性（ＣＤ１１ｃ＋）樹状細胞および形質細胞様（ＣＤ１２３＋）樹状細胞の両方と発達中のＴ細胞との間の相互作用に関連付けられている。天然に存在するＴｒｅｇ細胞は、ＦｏｘＰ３と呼ばれる細胞内分子の存在により他のＴ細胞からは区別され得る。ＦＯＸＰ３遺伝子の変異は、調節性Ｔ細胞の発達を防止し得るため、致命的な自己免疫疾患ＩＰＥＸが引き起こされ得る。

適応Ｔｒｅｇ細胞（Ｔｒ１細胞またはＴｈ３細胞としても知られている）は、正常な免疫応答中に生じ得る。

ナチュラルキラー細胞（またはＮＫ細胞）は、先天性免疫系の一部を形成する細胞溶解性細胞の１タイプである。ＮＫ細胞は、ＭＨＣ非依存的にウイルス感染細胞からの内生シグナルに対して、迅速な応答を提供する。

ＮＫ細胞（自然リンパ球の群に属する）は、大顆粒リンパ球（ＬＧＬ）として定義され、Ｂリンパ球およびＴリンパ球を生じる共通のリンパ性前駆細胞から分化した第３の種類の細胞を構成する。ＮＫ細胞は、骨髄、リンパ節、脾臓、扁桃および胸腺で分化および成熟し、次いでそこから循環系に入ることが知られている。

本発明のＣＡＲ細胞は、上記で挙げた細胞タイプのいずれでもよい。

本発明の第１の態様のＣＡＲシステムの分子を発現するＴまたはＮＫ細胞は、患者自身の末梢血から（第１団）、またはドナー末梢血からの造血幹細胞移植の状況において（第２団）、または非関連ドナーからの末梢血（第３団）から生体外で作製され得る。

あるいは、本発明の第１の態様のＣＡＲシステムの分子を発現するＴまたはＮＫ細胞は、Ｔ細胞への誘導性前駆細胞または胚性前駆細胞の生体外分化から誘導され得る。あるいは、溶解機能を保持し、治療薬として作用することができる不死化Ｔ細胞系も使用され得る。

これらのすべての実施形態において、ＣＡＲ細胞は、ウイルスベクターでの形質導入、ＤＮＡまたはＲＮＡでのトランスフェクションを含む多くの手段のうちの１つにより受容体構成要素およびシグナル伝達構成要素をコードするＤＮＡまたはＲＮＡを導入することにより生成される。

本発明のＣＡＲ細胞は、被験体由来のエクスビボＴまたはＮＫ細胞であり得る。ＴまたはＮＫ細胞は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）試料に由来し得る。ＴまたはＮＫ細胞は、例えば、抗ＣＤ３モノクローナル抗体による処理によって、本発明の第１の態様のＣＡＲ系を提供する分子をコードする核酸を形質導入される前に、活性化および／または増殖され得る。

本発明のＴまたはＮＫ細胞は、
（ｉ）上記被験体または他の供給源から、ＴまたはＮＫ細胞含有試料を単離すること；ならびに
（ｉｉ）本発明の第２および第３の態様のＣＡＲ系の受容体構成要素および／またはシグナル伝達構成要素をコードする１つまたはそれを超える核酸配列（複数も可）をＴまたはＮＫ細胞に形質導入またはトランスフェクトすることによって作製され得る。

次いで、ＴまたはＮＫ細胞は精製され、例えば、抗原結合ポリペプチドの抗原結合ドメインの発現に基づいて選択され得る。

本発明はまた、本発明の第１の態様のＣＡＲ系を含むＴまたはＮＫ細胞を含むキットを提供する。
医薬組成物

本発明はまた、本発明の第１の実施態様のＣＡＲシステムの構成要素を発現する複数の細胞溶解性免疫細胞を含む医薬組成物に関する。医薬組成物は、さらに薬学的に許容し得る担体、希釈剤または賦形剤を含んでいてもよい。医薬組成物は、所望により１種またはそれより多くのさらなる医薬活性ポリペプチドおよび／または化合物を含んでいてもよい。かかる製剤は、例えば、静脈内注入に好適な形態であり得る。

処置方法
本発明は、疾患を処置および／または予防するための方法であって、（例えば、上記医薬組成物中の）本発明の細胞溶解性免疫細胞を被験体に投与する工程を含む方法を提供する。

疾患を処置するための方法は、本発明の細胞溶解性免疫細胞の治療用途に関する。本明細書では、疾患に関連する少なくとも１つの症候を緩和、軽減もしくは改善するために、および／または疾患進行を遅延、軽減もしくは阻止するために、前記細胞は、既存の疾患または症状を有する被験体に投与され得る。

疾患を予防するための方法は、本発明の細胞溶解性免疫細胞の予防用途に関する。本明細書では、疾患の原因を予防もしくは弱めるために、または疾患に関連する少なくとも１つの症候の発症を軽減もしくは予防するために、このような細胞は、疾患にまだ罹っていない被験体、および／または疾患のいずれの症候も示していない被験体に投与され得る。被験体は、疾患を発症する素因を有し得るか、または疾患を発症するリスクを有すると考えられ得る。

前記方法は、
（ｉ）ＴまたはＮＫ細胞含有試料を単離する工程；
（ｉｉ）本発明によって提供される核酸配列またはベクターをこのような細胞に形質導入またはトランスフェクトする工程；
（ｉｉｉ）（ｉｉ）からの細胞を被験体に投与する工程
を含み得る。

ＴまたはＮＫ細胞含有試料は、例えば、上記のように被験体から、または他の供給源から単離され得る。ＴまたはＮＫ細胞は、被験体自身の末梢血（第一団）から、または造血幹細胞移植の場合にはドナー末梢血（第二団）から、または非連関ドナー由来の末梢血（第三団）から単離され得る。

疾患を処置するための本発明によって提供される方法は、疾患進行および任意の毒性活性をモニタリングすること、ならびに本発明の第１の態様のＣＡＲ系において使用するために適切な作用物質を投与して、ＣＡＲシグナル伝達を阻害し、それにより、任意の有害な毒性効果を軽減または緩和することを含み得る。

疾患を処置するための本発明によって提供される方法は、疾患進行をモニタリングすること、および任意の毒性活性をモニタリングすること、ならびに被験体に投与される作用物質の用量を調整して、許容され得るレベルの疾患進行および毒性活性を提供することを含み得る。

疾患進行のモニタリングは、それらが軽減／改善または増加／悪化しているかを決定するために、疾患に関連する症候を経時的に評価することを意味する。

毒性活性は、被験体への投与後に本発明のＣＡＲ細胞によって引き起こされる有害効果に関する。毒性活性としては、例えば、免疫学的毒性、胆汁毒性および呼吸窮迫症候群が挙げられ得る。

本発明の第１の態様のシグナル伝達系を介したシグナル伝達のレベル、およびしたがってシグナル伝達系を発現するＣＡＲ細胞の活性化のレベルは、存在する作用物質の量、または存在する作用物質の時間を変化させることによって調整され得る。本方法では、ＣＡＲ細胞活性化のレベルは、被験体に投与される作用物質の用量を減少させること、またはその投与頻度を減少させることによって増大され得る。逆に、ＣＡＲ細胞活性化のレベルは、被験体への作用物質の用量、または被験体への投与頻度を増加させることによって減少され得る。

より高レベルのＣＡＲ細胞活性化は、毒性活性の増加ではなく疾患進行の減少に関連する可能性がある一方、より低レベルのＣＡＲ細胞活性化は、毒性活性の減少ではなく疾患進行の増加に関連する可能性がある。

本発明はまた、本発明の細胞を含む被験体における疾患を処置および／または予防するための方法であって、第１の態様のＣＡＲ系において使用するために適切な作用物質を被験体に投与する工程を含む方法を提供する。このように、この方法は、適切な作用物質を、本発明のＣＡＲ細胞を既に含む被験体に投与することを含む。

このように、許容され得るレベルの疾患進行と毒性活性との両方を提供するために、被験体に投与される作用物質の用量、または投与頻度は変化され得る。「許容され得る」と決定される特定のレベルの疾患進行および毒性活性は、特定の状況に応じて変動し、このような基準で評価されるべきである。本発明は、この適切なレベルを達成するために、ＣＡＲ細胞の活性化レベルを変化させるための方法を提供する。

作用物質は、医薬組成物の形態で投与され得る。医薬組成物は、薬学的に許容され得る担体、希釈剤または賦形剤をさらに含み得る。医薬組成物は、１つまたはそれを超えるさらなる薬学的に活性なポリペプチドおよび／または化合物を場合により含み得る。このような製剤は、例えば、静脈内注入に適切な形態であり得る。

本発明は、疾患の処置および／または予防において使用するための本発明のＣＡＲ細胞を提供する。

本発明はまた、疾患の処置および／または予防のための医薬の製造における本発明のＣＡＲ細胞の使用に関する。

本発明はまた、疾患の処置および／または予防において使用するための、本発明の第１の態様のＣＡＲ系を阻害するために適切な作用物質を提供する。

本発明はまた、ＣＡＲ細胞における本発明の第１の態様のＣＡＲ系の阻害において使用するための作用物質を提供する。

本発明はまた、疾患の処置および／または予防のための医薬の製造における、本発明の第１の態様のＣＡＲ系を阻害するために適切な作用物質の使用を提供する。

本発明の方法によって処置および／または予防すべき疾患は、ウイルス感染症などの感染症であり得る。

本発明の方法はまた、例えば自己免疫疾患、アレルギーおよび移植片対宿主拒絶における、病的免疫応答の制御に関するものであり得る。

本方法は、膀胱がん、乳がん、結腸がん、子宮体がん、腎臓がん（腎細胞）、白血病、肺がん、メラノーマ、非ホジキンリンパ腫、膵臓がん、前立腺がんおよび甲状腺がんなどのがん性疾患の処置に関するものであり得る。

本発明のＣＡＲ細胞は、癌細胞などの標的細胞を死滅することができるものであり得る。標的細胞は、ＴＡＡの発現、例えば上記表１に示されているＴＡＡの発現によって認識可能なものであり得る。

本発明のＣＡＲ細胞および医薬組成物は、上記疾患の処置および／または予防に使用するためのものであり得る。

本発明のＣＡＲ細胞および医薬組成物は、上記方法のいずれかに使用するためのものであり得る。

以下、実施例により本発明をさらに記載するが、これは、本発明を実施する上で当業者を助ける役割を果たすことを意味するもので、本発明の範囲をいかなる意味にせよ限定する意図はない。

実施例１−ＴｅｔＣＡＲシグナル伝達系の機能
２Ａ部位で自己切断して、ｅＧＦＰに融合したＴｉＰと、そのエンドドメインとしてＴｅｔＲを有するＣＡＲとを生じる単一転写産物として、バイシストロン性コンストラクトを発現させた（図５ａ）。

テトラサイクリンの非存在下でこのコンストラクトを発現するＳｕｐＴ１細胞の蛍光顕微鏡法により、細胞膜では、ｅＧＦＰ蛍光が明確に見られ得ることを実証した（図５ｂ）；一方、テトラサイクリンの存在下では、ｅＧＦＰは細胞質内にあった（図５ｃ）。これらのデータは、テトラサイクリンがＴｅｔＲ ＣＡＲからＴｉＰを排除したことを実証している。

実施例２−ＴｅｔＣＡＲ系を介したシグナル伝達
２Ａ部位で自己切断して、フレキシブルリンカーを介してＣＤ３ゼータのエンドドメインに融合したＴｉＰを含むシグナル伝達構成要素と；ＣＤ３３認識ｓｃＦｖ、ＩｇＧ１のＦｃドメイン由来のスペーサー、ＣＤ４由来の膜貫通および細胞内ドメインならびにＴｅｔＲを含む受容体構成要素とを生じる単一転写産物として、バイシストロン性コンストラクトをＢＷ５ Ｔ細胞において発現させた（図６ａ）。ＴｉＰが存在しない以外はシグナル伝達構成要素と同一の対照も発現させた（図６ｂ）。

ＢＷ５ Ｔ細胞を、野生型ＳｕｐＴ１細胞、またはテトラサイクリンの非存在下でもしくは漸増濃度のテトラサイクリンの存在下でＣＤ３３を発現するように操作したＳｕｐＴ１細胞でチャレンジした。野生型ＳｕｐＴ１細胞でチャレンジしたＴ細胞は、テトラサイクリン（Ｔｅｔｒａｃｙｌｉｎｅ）の存在下または非存在下のいずれかにおいて活性化しなかった；ＣＤ３３を発現するＳｕｐＴ１細胞でチャレンジしたＴ細胞は、テトラサイクリンの非存在下で活性化されたが、テトラサイクリンの存在下では活性化が急速に阻害され、１００ｎＭのテトラサイクリンの存在下では活性化が完全に阻害される（図７ａ）。

ＴｉＰドメインを欠く対照ＴｅｔＣＡＲもまたＢＷ５に形質導入した。再び、これらのＴ細胞を、野生型ＳｕｐＴ１細胞、またはテトラサイクリンの非存在下でもしくは漸増濃度のテトラサイクリンの存在下でＣＤ３３を発現するように操作したＳｕｐＴ１細胞でチャレンジした。シグナル伝達構成要素中のＴｉＰ要素の欠如は、いかなる条件においてもシグナル伝達をもたらさなかった（図７ｂ）。

実施例３−一次Ｔ細胞におけるＴｅｔＣＡＲ系のシグナル伝達
（ＣＤ１９陰性の）ＳｕｐＴ１細胞をＣＤ１９陽性になるように操作して、標的陰性および陽性細胞株（これらは、可能な限り類似していた）を得た。３つのＣＡＲコンストラクト：（ｉ）「古典的な」第１世代抗ＣＤ１９ ＣＡＲ；（ｉｉ）第１世代抗ＣＤ１９ ｔｅｔＣＡＲ；（ｉｉｉ）エンドドメインからＴｉＰが欠損している対照抗ＣＤ１９ ｔｅｔＣＡＲを、３人のドナー由来の一次ヒトＴ細胞に形質導入した。非形質導入Ｔ細胞、および異なるＣＡＲコンストラクトを形質導入したＴ細胞を、異なる濃度のテトラサイクリンの存在下でＳｕｐＴ１細胞またはＳｕｐＴ１．ＣＤ１９細胞のいずれかによって１：１でチャレンジした。４８時間チャレンジした後に、上清をサンプリングした。バックグラウンド（Ｔ細胞のみ）および最大（ＰＭＡ／イオノマイシンで刺激したＴ細胞）の上清もまたサンプリングした。ＥＬＩＳＡによって、上清中のインターフェロン−ガンマを測定した（図１３）。「古典的な」ＣＡＲ Ｔ細胞は、テトラサイクリンに関係なく、ＳｕｐＴ１．ＣＤ１９によって活性化された。ＴｅｔＣＡＲ Ｔ細胞は、ＳｕｐＴ１．ＣＤ１９細胞によって活性化されたが、活性化は、テトラサイクリンによって阻害された。対照ＴｅｔＣＡＲおよびＮＴ Ｔ細胞は、ＳｕｐＴ１．ＣＤ１９細胞に対して応答しなかった。

実施例４−標的細胞の死滅
実施例３に記載されているインターフェロン−ガンマ放出研究の後、クロム放出アッセイを使用して、標的細胞の死滅を実証した。^５１ＣｒをＳｕｐＴ１およびＳｕｐＴ１．ＣＤ１９細胞にロードし、テトラサイクリンの存在下または非存在下で対照およびＴｅｔ−ＣＡＲ Ｔ細胞と共に４時間インキュベートした。上清中の^５１Ｃｒをカウントすることによって、標的細胞の溶解を決定した。結果を図１４に示す。テトラサイクリンの非存在下においてのみ、Ｔｅｔ−ＣＡＲ Ｔ細胞は、ＳｕｐＴ１．ＣＤ１９標的細胞を溶解したことが示された。

上記の明細書で挙げた出版物は全て、参照により本明細書に援用する。本発明の記載された方法および系の様々な修飾および変形は、本発明の範囲および趣旨から逸脱することなく当業者には明らかである。本発明を特定の好ましい実施形態と共に記載したが、請求されている本発明は、かかる特定の実施形態に過度に限定されるべきではないことを理解するべきである。事実、分子生物学、細胞免疫学または関連分野における専門家にとって明白な、本発明を実施するために記載された方法の様々な修飾も以下の特許請求の範囲の範囲内に含まれるものとする。

Claims (30)

1. （ｉ）抗原結合ドメインと、膜貫通ドメインと、第１の結合ドメインとを含む受容体構成要素；および
   （ｉｉ）シグナル伝達ドメインと、該受容体構成要素の該第１の結合ドメインに特異的に結合する第２の結合ドメインとを含む細胞内シグナル伝達構成要素
   を含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）系であって、
   作用物質の存在によって、該第１の結合ドメインと第２との結合ドメインの結合が破壊され、その結果、該作用物質の非存在下では、該受容体構成要素および該シグナル伝達構成要素がヘテロ二量体化し、抗原への該抗原結合ドメインの結合が、該シグナル伝達ドメインを介したシグナル伝達をもたらすのに対して、該作用物質の存在下では、該受容体構成要素および該シグナル伝達構成要素がヘテロ二量体化せず、抗原への該抗原結合ドメインの結合が、該シグナル伝達ドメインを介したシグナル伝達をもたらさない、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）系。
2. 前記受容体構成要素が、前記膜貫通ドメインと前記第１の結合ドメインとの間にリンカーを含む、請求項１に記載のＣＡＲ系。
3. 前記リンカーが、配列番号３に示されている配列を含むか、または配列番号３に示されている配列からなる、請求項２に記載のＣＡＲ系。
4. 前記第１の結合ドメインがＴｅｔリプレッサータンパク質（ＴｅｔＲ）もしくはその変異型を含み、前記第２の結合ドメインが転写誘導ペプチド（ＴｉＰ）もしくはその変異型を含み；または該第１の結合ドメインがＴｉＰまたはその変異型を含み、該第２の結合ドメインがＴｅｔＲまたはその変異型を含み；
   前記作用物質が、テトラサイクリン、ドキシサイクリンもしくはミノサイクリンまたはそれらの類似体である、請求項１〜３のいずれかに記載のＣＡＲ系。
5. 前記受容体構成要素が、ＴｅｔＲドメインである２つの第１の結合ドメインを含む、請求項４に記載のＣＡＲ系。
6. 前記２つのＴｅｔＲドメインがリンカーによって分離されている、請求項５に記載のＣＡＲ系。
7. 各ＴｅｔＲドメインが、前記作用物質に対して異なる親和性を有する、請求項５または６に記載のＣＡＲ系。
8. それぞれが異なる抗原を認識する複数の受容体構成要素がある、請求項１〜７のいずれかに記載のＣＡＲ系。
9. 前記複数の受容体構成要素の前記結合ドメインが、前記シグナル伝達構成要素の前記結合ドメインへの結合において異なり、その結果各抗原が異なるシグナル伝達強度を伝搬する、請求項８に記載のＣＡＲ系。
10. 前記複数の受容体構成要素の前記結合ドメインが、前記作用物質への結合において異なり、その結果各抗原が該作用物質の存在下で異なるシグナル伝達強度を伝搬する、請求項８または９に記載のＣＡＲ系。
11. 前記シグナル伝達構成要素の前記シグナル伝達ドメインが、ＣＤ３ゼータエンドドメイン、ＣＤ２８エンドドメイン、４１ＢＢエンドドメインおよびＯＸ４０エンドドメインから選択される単一のエンドドメインを含む、請求項１〜９のいずれかに記載のＣＡＲ系。
12. 前記シグナル伝達構成要素の前記シグナル伝達ドメインが、ＣＤ３ゼータエンドドメイン、ＣＤ２８エンドドメイン、４１ＢＢエンドドメインおよびＯＸ４０エンドドメインのうちの少なくとも１つを含む、請求項１〜１１のいずれかに記載のＣＡＲ系。
13. それぞれがシグナル伝達ドメインと結合ドメインとを含む複数のシグナル伝達構成要素を含み、該結合ドメインがそれぞれ、該受容体構成要素の同じ結合ドメインを認識するが、該シグナル伝達ドメインが異なるエンドドメインを含む、請求項１〜１２のいずれかに記載のＣＡＲ系。
14. 前記複数のシグナル伝達構成要素が、それぞれが異なる親和性で前記受容体構成要素の前記結合ドメインを独立して認識する複数の結合ドメインを含む、請求項１３に記載のＣＡＲ系。
15. 請求項１〜１４のいずれか一項に記載のＣＡＲシグナル伝達系をコードする核酸であって、翻訳後に該受容体構成要素と該シグナル伝達構成要素との間で切断される自己切断ペプチドによって、前記受容体構成要素およびシグナル伝達構成要素が共発現される、核酸。
16. 請求項１５に記載の核酸を含む、ベクター。
17. 請求項１６に記載のベクターを含む、レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターまたはトランスポゾン。
18. 請求項１〜１４のいずれか一項に記載のＣＡＲシグナル伝達系を発現する、Ｔ細胞またはＮＫ細胞。
19. 請求項１５に記載の核酸または請求項１６もしくは１７に記載のベクターを含む、請求項１８に記載のＴ細胞またはＮＫ細胞。
20. 複数の、請求項１８または１９に記載のＴ細胞またはＮＫ細胞を含む、医薬組成物。
21. 疾患の処置および／または予防において使用するための、請求項２０に記載の医薬組成物。
22. 以下の工程：
    （ｉ）試料を含有するＴ細胞またはＮＫを単離する工程；
    （ｉｉ）請求項１５に記載の核酸または請求項１６もしくは１７に記載のベクターを該ＴまたはＮＫ細胞に形質導入またはトランスフェクトする工程；および
    （ｉｉｉ）（ｉｉ）からの該Ｔ細胞またはＮＫ細胞を被験体に投与する工程
    を含む方法において使用するための組成物であって、
    該核酸または該ベクターを含む、組成物。
23. 被験体において疾患を処置および／または予防する方法において使用するための組成物であって、該方法は、請求項２０に記載の医薬組成物を該被験体に投与する工程を含むか、または請求項２２に記載の工程を含み、該方法は、前記被験体における毒性活性をモニタリングすることを伴い、請求項１〜１４のいずれかに記載のＣＡＲシグナル伝達系において使用するための作用物質を該被験体に投与して、有害な毒性効果を軽減する工程を含み、該組成物は、該作用物質を含む、組成物。
24. 前記方法が、前記被験体における疾患進行をモニタリングすること、および／または毒性活性をモニタリングすることを伴い、請求項１〜１４のいずれかに記載のＣＡＲシグナル伝達系において使用するための作用物質を該被験体に投与して、許容され得るレベルの疾患進行および／または毒性活性を提供する工程を含む、請求項２３に記載の組成物。
25. 前記疾患が癌である、請求項２１、２３および２４のいずれか一項に記載の組成物。
26. 疾患の処置および／または予防のための医薬の製造における、請求項２０に記載の医薬組成物の使用。
27. 請求項１５に記載の核酸または請求項１６もしくは１７に記載のベクターを含む、キット。
28. 請求項１８または１９に記載のＴまたはＮＫ細胞を作製するためのインビトロの方法であって、請求項１５に記載の核酸または請求項１６もしくは１７に記載のベクターをＴまたはＮＫ細胞に導入する工程を含む、方法。
29. 前記ＴまたはＮＫ細胞が、被験体から単離された試料に由来する、請求項２８に記載の方法。
30. 請求項１８または１９に記載のＴまたはＮＫ細胞を含む被験体において請求項１〜１４のいずれかに記載のＣＡＲシグナル伝達系を阻害するための組成物であって、前記作用物質を含む、組成物。

Images