JP6612258B2 - 自己免疫疾患の診断のための方法 - Google Patents

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Description

発明の分野
本発明は、自己免疫疾患の診断方法、ペプチド、及び自己免疫疾患の処置に関する。
発明の背景
１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）の生理病理学は、調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ細胞）ホメオスタシス及びそれ故に免疫寛容を損なうインターロイキン−２（ＩＬ−２）経路における複数の欠陥に関係する。
処置がより有効であり得る前駆症状の段階にの間に、有リスク被験体に提供され得る新規な免疫療法の数が増加している特に今日では、Ｔ１Ｄを有するヒトにおいて、進行中の自己免疫の新規バイオマーカーの開発が早急に必要とされている。新規バイオマーカーは、Ｔ１Ｄを発症する高いリスクのそのような個体をより良好に定義することを助けることができるだろう。
今日、（Ｔ１Ｄの発症に先行する）ＩＡＡ自己抗体（以下、自己抗体）の測定と、膵臓β細胞に対する並びに感受性ＨＬＡ−ＤＱ８及びＤＱ２アレルの存在に対するＴ細胞応答とが、Ｔ１Ｄの診断に使用されている。
特許文献１には、タンパク質マーカーのアディポネクチン及びレプチンのレベルを測定することによって、１型糖尿病と２型糖尿病とを区別するための組成物及び方法が記載されており、前記タンパク質マーカーは、１型糖尿病、２型糖尿病及び／又は糖尿病性障害を患っている患者のサンプルでは、コントロール被験体のサンプルと比較して、差次的に存在することが開示されている。特許文献１には、これらのタンパク質マーカーを検出することによって、１型糖尿病、２型糖尿病及び／又は糖尿病性障害の診断の補助として使用され得る方法及びキットも開示されている。患者サンプルにおけるこれらのタンパク質マーカーの単独又は組み合わせての測定は、診断医が、１型糖尿病、２型糖尿病及び／又は糖尿病性障害の程度に関する推定診断と相関させ得る情報を提供する。
国際公開第２００５／０９４２００号
発明の概要
本発明者らは、中和能力を有する抗ＩＬ−２自己抗体（ＩＬ−２ＡＡｂ）がＴ１Ｄに関連することを発見した。本発明者らは更に、Ｔ１Ｄだけではなく、全身性エリテマトーデス、関節リウマチ、シェーグレン症候群及び自己免疫性筋炎患者においても、ＩＬ−２自己抗体が高頻度で存在することを発見した。
本発明者らはまた、Ｔ１Ｄでは、ＩＬ−２自己反応性Ｔ及びＢ細胞の存在によって証明されるように、ＩＬ−２に対する免疫寛容が喪失していることを観察した。
本発明者らは更に、Ｔ１Ｄにおける自己反応性抗ＩＬ−２ Ｔ細胞応答が、主に１つの特定のエピトープに対するものであることを発見した。
本発明の目的は、Ｔ１Ｄ及び他の自己免疫疾患の新規バイオマーカーを提供することである。
図１ａ及びｂはそれぞれ、ＥＬＩＳＡによって測定した、異なる患者群における抗ｈＩＬ−２ ＩｇＧ自己抗体の血清力価、及び異なる患者群におけるｈＩＬ−２Ａについて陽性のカットオフを確立するために、健常ドナーのプール及びＴ１Ｄ患者のプールを用いて行われる。パネルｃ及びｄは、抗ＩＬ２自己抗体についてのＥＬＩＳＡの結果を示し、図ｄは、ＥＬＩＳＡによるＩＬ−２自己抗体の定量実験におけるカットオフを決定するために使用したＲＯＣ曲線を示す。 図２は、健常ドナー、Ｔ２Ｄ患者及び５つの自己免疫疾患において、ヒトＩＬ−２を用いて実施した競合ＥＬＩＳＡアッセイの結果を示す。結果は、ヒトＩＬ−２の量に応じたＥＬＩＳＡシグナル阻害の割合として表されている。 図３ａ及びｂはそれぞれ、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイの結果を表す。細胞１０６個当たりのＩＬ−２特異的ＩｇＧスポットの数は、マウス（ＮＯＤ又はＢ６）及び細胞組織（脾臓又は骨髄）の性質の種類に応じて示されている。 図４ａ及びｂはそれぞれ、異なる患者群における抗ｈＩＬ−２ ＩｇＧ自己抗体の血清力価、及び異なる患者群におけるｈＩＬ−２Ａ陽性患者の割合を表す。 図５は、ＣＢＡによって測定した、ＩＬ−２由来ペプチドに応じた、脾細胞の上清中のＩＦＮ−ｇ産生を表す。 図６は、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイの結果を表す。異なるＩＬ−２ペプチド及び他のコントロールペプチドを用いたＰＢＭＣの刺激後における、バックグラウンド除去後のＰＢＭＣ １０６個当たりのＩＦＮ−γスポット形成細胞（ＳＦＣ）の数が示されている。 図７は、ＥＬＩＳＡアッセイにおける異なるマウス系統のＩＬ−２／ＩＬ−２Ａ複合体の血清力価の結果を示す。 図８ａ及びｂは、多重粒子ベースのフローサイトメトリーによるＩＬ−２自己抗体の定量の結果を示す。結果は、異なるマウス系統における、及び血清を様々な量のｍＩＬ−２と共にプレインキュベーションする競合アッセイにおける、蛍光強度として表されている。 図９は、中和アッセイにおけるＩＬ−２自己抗体の中和能力の評価結果を示す。結果は、血清希釈の関数として、コントロールと比較したＣＴＬＬ−２細胞の増殖％として表されている。 図１０は、増殖アッセイによるＩＬ−２特異的Ｔ細胞の定量の結果を示す。 図１１は、ＩＬ−２で刺激し、ｈＩＬ−２ＡＡｂ−ＨＤ血清又はｈＩＬ−２ＡＡｂ＋Ｔ１Ｄ血清と共にプレインキュベーションした調節性Ｔ細胞におけるＳＴＡＴ５のリン酸化を示す。
好ましい実施態様の説明
自己免疫疾患を有する患者、特にＴ１Ｄ、全身性エリテマトーデス及び関節リウマチ患者は、高頻度のＩＬ−２ＡＡｂを示す。したがって、ｈＩＬ−２自己抗体は、このような疾患のバイオマーカーである。
したがって、本出願の主題は、患者が自己免疫疾患を有するか、又は自己免疫疾患を有する若しくは発症するリスクがあるかどうかを決定するための、或いは、自己免疫疾患の重症度を評価するか又は自己免疫疾患の転帰を予測するためのin vitro方法であって、患者から得られた生物学的サンプルにおける免疫抗ＩＬ２応答を検出又は定量する工程を含む、in vitro方法である。
免疫抗ＩＬ２応答は、
− 抗ＩＬ２自己抗体を産生するＢ細胞；
− 抗ＩＬ２抗体；
− ＩＬ−２特異的Ｔ細胞
の１つ以上の検出によって証明され得る。
パラメータの好ましい組み合わせは、
− 抗ＩＬ２自己抗体を産生するＢ細胞と、抗ＩＬ２抗体、
− 抗ＩＬ２抗体と、ＩＬ−２特異的Ｔ細胞、並びに
− ＩＬ−２特異的Ｔ細胞と、抗ＩＬ２自己抗体を産生するＢ細胞
である。
本出願の主題は、特に、患者が自己免疫疾患を有するか、又は自己免疫疾患を有する若しくは発症するリスクがあるかどうかをin vitroで決定するための方法であって、患者から得られた生物学的サンプルにおける自己抗体の存在を検出又は定量する工程を含み、該自己抗体が抗ＩＬ２自己抗体、特に中和抗ＩＬ２自己抗体である、方法である。
例えば、治療的処置としてＩＬ２を受けている患者から得られた生物学的サンプルにおける中和抗ＩＬ２自己抗体の存在の定量は、投与されるＩＬ２の量を調整し、ＩＬ２処置に対する患者の応答を予測することを可能にする。
本発明の別の主題は、患者における自己免疫疾患の転帰を予測するための方法であって、患者から得られた生物学的サンプルにおける自己抗体の存在を検出又は定量する工程を含み、該自己抗体が抗ＩＬ２自己抗体、特に中和抗ＩＬ２自己抗体である、方法である。
自己免疫疾患は、好ましくは、１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、関節リウマチ（ＲＡ）、シェーグレン症候群（ＳＪＯ）及び多発性筋炎（poymyositis）（ＪＯ１）からなる群より選択され、特に１型糖尿病である。
本方法において使用され得るサンプルは、例えば、血漿、血清、全血、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、サイタフェレーシス材料、脾臓細胞、リンパ節細胞及び骨髄、培養免疫細胞の上清（supernantant）、好ましくは血清及びＰＢＭＣである。
生物学的サンプルにおける抗ＩＬ−２抗体を産生するＢ細胞の存在の検出は、当技術分野で周知の方法（例えばＢ細胞ＥＬＩＳＰＯＴ）にしたがって、又はフローサイトメトリーによって、好ましくはＢ細胞ＥＬＩＳＰＯＴにしたがって、行われ得る。
生物学的サンプルにおける自己抗体の存在の検出は、当技術分野で周知の方法、例えばＥＬＩＳＡ、競合ＥＬＩＳＡ又は改変したＥＬＩＳＡ（例えば、ビオチンにカップリングされたペプチド／タンパク質を使用するもの、又はＩＬ−２／抗ＩＬ−２抗体複合体を検出するように改変されたもの）、ＩＬ−２応答性細胞、ＩＬ−２依存性細胞株を使用するＩＬ−２中和、例えばＣＴＬＬ−２ベースのアッセイ、多重粒子ベースのフローサイトメトリー、液相免疫沈降、電気化学発光、ラジオイムノアッセイ、及び好ましくは免疫酵素法によって行われ得る。
生物学的サンプルにおける抗ＩＬ−２抗体を産生するＢ細胞の存在の定量は、当技術分野で周知の方法（例えばＢ細胞ＥＬＩＳＰＯＴ）にしたがって又はフローサイトメトリーによって、行われ得る。
このような好ましい方法は、例えば、
− 患者のサンプル（有利には、ＰＢＭＣ）を提供し、Ｂ細胞ＥＬＩＳＰＯＴを実施して、抗ＩＬ−２抗体を産生するＢ細胞を測定することに存する。
生物学的サンプルにおける自己抗体の存在の定量はまた、ＥＬＩＳＡ、競合ＥＬＩＳＡ又は任意の改変したＥＬＩＳＡ（例えば、ビオチンにカップリングされたペプチド／タンパク質を使用するもの）、ＩＬ−２応答性細胞、ＩＬ−２依存性細胞株を使用するＩＬ−２中和、例えばＣＴＬＬ−２ベースのアッセイ、多重粒子ベースのフローサイトメトリー、液相免疫沈降、電気化学発光、ラジオイムノアッセイ等の当該分野で周知の方法、及び好ましくは免疫酵素法によって、行われ得る。
このような好ましい方法は、例えば、
− 患者のサンプル（有利には、血清）を提供し、ＥＬＩＳＡ試験を実施して、抗ＩＬ−２抗体を測定すること
− サンプル（有利には、患者の血清）を提供し、競合ＥＬＩＳＡ試験を実施して、抗ＩＬ−２抗体を測定すること
− サンプル（有利には、患者の血清）を提供し、ＩＬ−２／抗ＩＬ−２抗体免疫複合体を測定するように設計されたＥＬＩＳＡを実施すること
− サンプル（有利には、患者の血清）を提供し、多重粒子ベースのフローサイトメトリー試験を実施して、抗ＩＬ−２抗体を測定すること
− サンプル（有利には、患者の血清）を提供し、ＩＬ−２応答性細胞及び／又はＩＬ−２依存性細胞株を使用するＩＬ−２中和試験、例えばＣＴＬＬ−２ベースのアッセイを実施して、抗ＩＬ−２抗体の存在を評価すること
に存する。
本発明の目的はまた、治療目的で外因性投与されたＩＬ−２に対する応答を予測／調整するための方法であって、患者から得られた生物学的サンプルにおける免疫抗ＩＬ２応答を検出又は定量する工程を含む方法である。
外因性投与されたＩｌ−２（例えば、Proleukin（登録商標）など）に対する患者の応答を予測するために、前記方法は、好ましくは、
− 患者から得られた生物学的サンプルを提供すること
− 当技術分野で周知の方法、例えばＥＬＩＳＡ、競合ＥＬＩＳＡ又は任意の改変したＥＬＩＳＡ（例えば、ビオチンにカップリングされたペプチド／タンパク質を使用するもの）、ＩＬ−２応答性細胞、ＩＬ−２依存性細胞株を使用するＩＬ−２中和、例えばＣＴＬＬ−２ベースのアッセイ、多重粒子ベースのフローサイトメトリー、液相免疫沈降、電気化学発光、ラジオイムノアッセイ、及び好ましくは免疫酵素法のいずれかを使用して、抗ＩＬ− ２抗体（自己抗体、又は外因性投与されたＩＬ−２に対して検出された抗体）の存在を検出すること
− 又は或いは、例えば、複合体を検出するための特定のＥＬＩＳＡ、又は複合体の解離工程を含むＥＬＩＳＡを使用して、ＩＬ−２／抗ＩＬ−２循環複合体の存在を検出すること
に存する工程を含み、
− 例えば前記技術のために確立されたカットオフよりもＥＬＩＳＡによって得られたＡＵの値が高い、抗ＩＬ−２抗体が存在する場合には、患者に投与すべきＩＬ−２の量を、所望の免疫応答に応じて適合すべきである。
外因性投与されたＩＬ−２に対する処置された患者の応答を調整するために、前記方法は、好ましくは
− 処置された患者から得られた生物学的サンプルを提供すること
− 抗ＩＬ−２抗体の存在を定量すること
に存する工程を含み、
− 抗ＩＬ−２抗体が、各技術のために定義されたカットオフよりも高い場合には、投与されるＩｌ−２の量を増加させなければならず、反対に、ＩＬ−２抗体がカットオフ値未満である場合には、投与されるＩＬ−２の量を改変してはならない。
或いは、外因性投与されたＩＬ−２に対する処置された患者の応答を調整するために、すなわち調節性Ｔ細胞の割合を増加させるために低用量ＩＬ−２を使用して、又は或いはＮＫ及びＣＤ８＋Ｔ細胞の割合を増加させるために高用量ＩＬ−２を使用して、前記方法を所望の生物学的応答に適合させられるだろう。
例えば、調節性Ｔ細胞の割合を増加させるためにＩＬ−２を投与する場合には、Ｔｒｅｇの固定した増加（例えば、ＩＬ−２投与後における血中の調節性Ｔ細胞の割合の２０％の増加）を得るために、抗ＩＬ−２抗体を有する患者において、投与されるＩＬ−２の量は調整されるべきである。このＩＬ−２用量調整から利益を受け得る処置の例は、低用量（８週間の０．３×１０６、１×１０６又は３×１０６IU/m2体表面、その後４週間の中断）又は超低用量ＩＬ−２（５日間の０．５×１０５、１×１０５又は２×１０５IU/m2/日）でＩＬ−２を投与する移植片対宿主病の処置であり得る；
Ｔｒｅｇの割合の固定した増加を得るために、抗ＩＬ−２抗体を有する患者のＩＬ−２投与が適合され得る処置の別の例は、Ｔ１Ｄ（５日間の（１×１０６又は３×１０６IU/m2/日でＩＬ−２を投与し得る場合）又は自己免疫性血管炎（９日間又は１６日間のウォッシュアウトによって隔てられた３×１０６IU/日の５日間の４サイクルとしてＩｌ−２を投与し得る）である。
前記方法は、好ましくは、
− 処置された患者から得られた生物学的サンプルを提供すること、抗ＩＬ−２抗体の存在を検出すること、ＩＬ−２を患者に注射すること、及び３回の毎日のＩＬ−２注射後に得られる調節性Ｔ細胞の割合の増加に基づいて最適用量を規定することに存する工程を含むであろう。
例えば、ＮＫ細胞又はＣＤ８＋Ｔ細胞の割合を増加させるためにＩＬ−２を投与する場合には、これらの集団の固定した増加を得るために、抗ＩＬ−２抗体を有する患者において、投与されるＩＬ−２の量を調整すべきである。このような処置の一例は、異なるスケジュールで、高用量でＩＬ−２を投与する（例えば：最大１４回の用量で１５分間の静脈内注入によって８時間ごとに６×１０５IU/Kgで投与する）転移性メラノーマ又は腎細胞ガンの処置である。
前記方法は、好ましくは、
− 処置された患者から得られた生物学的サンプルを提供すること、抗ＩＬ−２抗体の存在を検出すること、ＩＬ−２を患者に注射すること、及び３回の毎日ＩＬ−２注射後に得られたＮＫ細胞又はＣＤ８＋Ｔ細胞の割合の増加に基づいて最適な用量を規定することに存する工程を含むであろう。
前述のように、本発明者らは更に、Ｔ１Ｄにおける自己反応性抗ＩＬ−２ Ｔ細胞応答が任意のＩＬ−２由来ペプチドに対するものであり、主に１つの特定のエピトープに対するものであることを発見した。
これが、本発明の目的が、Ｔ１Ｄ、全身性エリテマトーデス、関節リウマチ、シェーグレン症候群及び自己免疫性多発性筋炎患者の抗ＩＬ２抗体又はＩＬ−２特異的Ｔ細胞によって特異的に認識される任意のペプチドであって、ＩＬ−２に由来し、特に式Ｉ
Ｒ１−ＬＴＲＭＬＴＦＫＦＹＭＰＫＫＡ−Ｒ２（Ｉ）
（式中、
Ｒ１は、Ｎ末端アミノ酸の遊離又は置換第一級アミノ官能基を表し、
Ｒ２は、Ｃ末端アミノ酸のカルボキシル官能基の遊離又は置換ヒドロキシル基を表す）のＩＬ−２由来ペプチドであるペプチドを含む理由である。
本明細書で使用される用語「ペプチド」は、少なくとも６個のアミノ酸であって、５０個未満のアミノ酸、好ましくは４０個未満のアミノ酸、より好ましくは３０個未満のアミノ酸、特に２５個未満のアミノ酸、より具体的には２０個未満のアミノ酸を有するアミノ酸配列を有するアミノ酸産物を指す。
本発明の目的はまた、このようなペプチドの機能保存的変異体を含む。
本明細書で使用される「機能保存的変異体」は、ペプチドの全体的なコンフォメーション及び機能の変化を伴わずに（上記を参照のこと）、ペプチドの所定のアミノ酸残基が変更（挿入、欠失又は置換）されているものを指す。このような変異体は、欠失、挿入及び／又は置換などのアミノ酸変化を有するペプチドを含む。「欠失」は、ペプチドにおける１個以上のアミノ酸の欠如を指す。「挿入」は、ペプチドにおける１個以上のアミノ酸の付加を指す。「置換」は、ペプチドにおける別のアミノ酸残基による１個以上のアミノ酸の置換を指す。
典型的には、所定のアミノ酸は、類似の特性（例えば、極性、水素結合ポテンシャル、酸性、塩基性、疎水性、芳香族など）を有するアミノ酸で置換される。保存的と示されているもの以外のアミノ酸はペプチドが異なり得るので、類似の機能の任意の２つのペプチド間のタンパク質又はアミノ酸配列類似性の割合は変動し得、例えば、アライメントスキーム（例えば、類似性がMEGALIGNアルゴリズムに基づくクラスタ法）にしたがって決定した場合に７０％〜９０％であり得る。「機能保存的変異体」はまた、BLAST又はFASTAアルゴリズムによって決定した場合に少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８５％、更に好ましくは少なくとも９０％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドであって、それと比較されるネイティブなペプチド又は親ペプチドと同じ又は実質的に類似の特性又は機能を有するポリペプチドを含む。アミノ酸の８０％超、好ましくは８５％超、好ましくは９０％超が同一であり、又はより短い配列の全長にわたって約９０％超、好ましくは９５％超が類似（機能的に同一）である場合、２つのアミノ酸配列は、「実質的に相同」又は「実質的に類似」である。好ましくは、類似配列又は相同配列は、例えば、GCG (Genetics Computer Group, Program Manual for the GCG Package, Version 7, Madison, Wisconsin)パイルアッププログラム、又は配列比較アルゴリズム、例えばＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡなどのいずれかを使用してアラインメントによって同定される。
本発明の目的はまた、このようなペプチドの機能保存的化学誘導体を含む。「機能保存的化学誘導体」はまた、式Ｉのペプチドの好ましくはＲ１及びＲ２官能基で、又は側鎖アミノ若しくはカルボキシル官能基で化学的に改変されたペプチドを含む。
本発明の好ましいペプチドは、
− ＬＴＲＭＬＴＦＫＦＹＭＰＫＫＡ 配列番号：１
− ＥＦＬＮＲＷＩＴＦＳＱＳＩＩＳ 配列番号：２
又はこのようなペプチドの機能保存的変異体である。
変異体に関して、免疫学の当業者に公知のように、天然ペプチド鎖の改変が可能であるが、しかしながら、免疫原性ペプチドの免疫学的特性の性質は改変しない。したがって、前述のように、ネイティブなペプチドのこのエピトープ部位の免疫学的特性を保持しつつ、これらの天然配列と高度に相同なＩＬ−２ペプチドの誘導体も挙げられ得る。それらの相同性領域は、５〜４０残基、例えば８〜４０残基又は８〜３５残基、好ましくは１０〜３５残基、しかし１２〜３５残基、特に１２〜３０残基、具体的には１５〜３０残基、より具体的には１５〜２５残基で変動し得る。
改変が免疫原性を相当には減少させないことを条件に、化学基（メチル、アセチルなど）を付加することによって、又は立体化学的改変（Ｄ型アミノ酸の使用）によって、ＩＬ−２ペプチド誘導体は、改変残基を含有し得る。サイトカインペプチド誘導体は、ＩＬ−２ペプチドのように、ＩＬ−２と相互作用する抗体を誘導すべきである。
本発明のＩＬ−２ペプチド誘導体は、それらを構成するアミノ酸において１つ以上の改変、例えば１個以上のアミノ酸の欠失、置換、付加又は官能化（例えば、アシル化）を、これらの改変が上述の枠組み（免疫学的特徴）内にとどまる程度まで含み得る。例えば、一般に、イソロイシン残基によるロイシン残基の置換は、このような特性を改変しない；改変は、一般に、アミノ酸の４０％未満、特に３０％未満、好ましくは２０％未満、特に具体的には天然ペプチドのアミノ酸の１０％未満に関すべきである。改変ペプチドによって誘導される抗体は、ネイティブなサイトカインに対して活性であることが重要である。
これらの改変は当業者の範囲内であり、当業者であれば、簡単な試験によって改変の発生を確認し得る。このような改変誘導体の免疫原性は、マウスの免疫化後にＥＬＩＳＡ（ＥＬＩＳＡによって試験される抗原は、サイトカイン全体又は免疫サイトカインペプチドである）によって、又はサイトカインレセプター結合遮断試験によって、評価され得る。可能な改変は、好ましくは、８個未満のアミノ酸、有利には６個未満のアミノ酸、具体的には４個未満のアミノ酸、特に３個以下のアミノ酸、例えば２個又は１個の単一アミノ酸に影響を与える。
本発明の主題はまた、少なくとも１つの上記サイトカインペプチド又はサイトカインペプチド誘導体を含有することを特徴とする化合物である。このような化合物は、線状形態で、若しくは枝付き燭台構造の形態で、又は担体タンパク質と混合カップリングされて、同一のペプチド／誘導体の繰り返し、又は異なるペプチド／誘導体の組み合わせを含み得る。このような化合物はまた、環化形態で提供され得る。したがって、本発明のＩＬ−２ペプチド又はＩＬ−２ペプチド誘導体は、例えば、特に良好なコンフォメーションを提供するより長いアミノ酸配列に挿入され得るか、又は外因性Ｔエピトープと組み合わされて得る（タンパク質又はＤＮＡ免疫化にかかわらず）。
それらは、有利には、例えばＫＬＨなどの担体タンパク質と共有様式で連結され得る。
本発明のこれらのＩＬ−２ペプチド又はＩＬ−２誘導体は、天然ＩＬ−２の他のエピトープとの相同性を含まない任意のタンパク質配列に含められ得る。例えば、それらは、環状構造をペプチドに付与するためにシステインが末端に単に付加されたレセプターに結合する部位であり得る。別の例は、破傷風毒素のＴエピトープの配列によって囲まれたペプチドである。更に別の例は、レセプター結合部位の配列に対応するペプチドを含み得るが、それらのアゴニスト効果を回避するために、特定のアミノ酸がそれらのＤ型異性体によって置換されている。
免疫応答を増加させるために、本発明のＩＬ−２ペプチド又はＩＬ−２誘導体は、担体タンパク質にカップリングされ得る。考えられるカップリング方法及び担体タンパク質は、ターゲットペプチドに応じて異なり得る：それらは、例えば、当業者に周知の化学的方法、例えばカルボジイミド、グルタルアルデヒド又はビス−ジアゾ化ベンジジンカップリングによるものによってペプチドにコンジュゲートされたキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）タンパク質及び破傷風トキソイド（ＴＴ）であり得る。これらのカップリングの実施は、例えばリジン、ヒスチジン、チロシン又はシステイン残基などのアミノ酸を配列に付加又は組み込むことによって容易になり得る。化学的又は遺伝学的にかかわらず、（熱帯熱マラリア原虫、ＫＬＨなどに由来する）外因性Ｔエピトープにカップリングされたこのようなペプチド化合物もまた、本発明の範囲内である。
本発明のペプチドは、特に、化学合成又は遺伝子工学又は任意の他の適切な方法によって生産され得る。ジスルフィド架橋を作るために、システインのような１個以上のアミノ酸を鎖の末端に必要に応じてグラフトする環状ペプチドの合成により、これらのペプチドフラグメントがタンパク質の三次元構造中に有する二次構造の部分を元に戻すことが可能となる。
本発明のペプチドは、有利な特性を有する。それらは、Ｔ細胞によって特異的に認識される。したがって、それらは、Ｔ細胞によって媒介される進行中の免疫応答を検出するために使用され得る。それらはまた、ヒトにおいて臨床目的に使用されるネイティブな形態又は突然変異ＩＬ−２形態のＩＬ−２に対する寛容を誘導するために使用され得る。これらの特性は、実験の部において以下に説明される。それらは、薬物としての上記本発明のペプチドの使用を正当化する。
それらは、患者由来のＩＬ−２抗体を生成するためのワクチンとして特に使用され得る。
本発明の好ましいペプチドは、
− ＬＴＲＭＬＴＦＫＦＹＭＰＫＫＡ 配列番号：１
− ＥＦＬＮＲＷＩＴＦＳＱＳＩＩＳ 配列番号：２
又はこのようなペプチドの機能保存的変異体である。
生物学的サンプルにおける当該ペプチド特異的Ｔ細胞の存在の検出は、当技術分野で周知の方法、例えばin vitroにおける当該ペプチドとの遭遇時のＴ活性化の測定によって行われ得る。Ｔ細胞活性化の測定は、チミジン取り込みによるＴ細胞増殖の測定、又はＥＬＩＳＡ、ルミネックス若しくはフローサイトメトリーによるサイトカイン産生の測定などの方法によって行われ得る。
生物学的サンプルにおけるＩＬ−２特異的Ｔ細胞の存在の定量は、当技術分野で周知の方法、例えばチミジン取り込みによるＴ細胞増殖の測定、又はＥＬＩＳＰＯＴ、ＥＬＩＳＡ、ルミネックス若しくはフローサイトメトリーによるサイトカイン産生の測定によって行われ得る。
このような好ましい方法は、例えば、
− 患者のサンプル（有利には、ＰＢＭＣ）を提供し、ＩＬ−２配列由来ペプチドのライブラリーを使用してin vitro Ｔ細胞活性化アッセイを実施し、ＥＬＩＳＰＯＴによってＩＦＮ−ｇ産生を測定すること
− 患者のサンプル（有利には、ＰＢＭＣ）を提供し、ＩＬ−２配列由来ペプチドのライブラリーを使用してin vitro Ｔ細胞活性化アッセイを実施し、サイトメトリービーズアレイ（ＣＢＡ）によってＩＦＮ−ｇ産生を測定すること
− 患者のサンプル（有利には、ＰＢＭＣ）を提供し、ＩＬ−２配列由来ペプチドのライブラリーを使用してin vitro Ｔ細胞活性化アッセイを実施し、チミジン取り込みを測定すること
に存する。
本発明はまた、ヒト又は動物の体の治療的処置の方法において（すなわち、薬物として）使用するための、任意のＩＬ−２由来ペプチドであって、Ｔ１Ｄ、全身性エリテマトーデス、関節リウマチ、シェーグレン症候群及び自己免疫性多発性筋炎患者の抗ＩＬ２抗体又はＩＬ−２特異的Ｔ細胞によって特異的に認識され、特に、式Ｉ
Ｒ１−ＬＴＲＭＬＴＦＫＦＹＭＰＫＫＡ−Ｒ２（Ｉ）
（式中、
Ｒ１は、Ｎ末端アミノ酸の遊離又は置換第一級アミノ官能基を表し、
Ｒ２は、Ｃ末端アミノ酸のカルボキシル官能基の遊離又は置換ヒドロキシル基を表す）のＩＬ−２由来ペプチドであるペプチド
並びにこのようなペプチドの機能保存的変異体に関する。
本発明の好ましいペプチドは、
− ＬＴＲＭＬＴＦＫＦＹＭＰＫＫＡ 配列番号：１
− ＥＦＬＮＲＷＩＴＦＳＱＳＩＩＳ 配列番号：２
又はこのようなペプチドの機能保存的変異体である。
より具体的には、ＩＬ−２タンパク質又はＩＬ−２由来ペプチド又はそれらの機能保存的変異体、好ましくはＩＬ−２由来ペプチド又はその機能保存的変異体は、ネイティブな形態又は突然変異ＩＬ−２形態のＩＬ−２に対する寛容を誘導する臨床目的で使用され得る。
これらの特性及び用途はまた、医薬組成物における上記本発明のペプチドの使用を正当化する。
医薬として、本発明のＩＬ−２ペプチド又はＩＬ−２誘導体は、ワクチン分野で使用される任意の標準経路（特に、皮下経路による、筋肉内経路による、静脈内経路による又は経口経路による）を意図する医薬組成物に組み込まれ得る。投与は、単回投与で、又はある期間後に１回以上繰り返して、行われ得る。
本発明の新規医薬組成物、特にワクチンは、有効量の少なくとも１つのＩＬ−２ペプチド又は好ましくは式Ｉのペプチド又はそれらの機能保存的変異体と、不活性医薬担体又は賦形剤とから構成される。
本出願の主題はまた、有効成分として１つ以上の上記ＩＬ２ペプチド又はＩＬ２誘導体を含むことを特徴とする治癒的医薬組成物又は予防的医薬組成物である。
免疫原性剤は単独でコンディショニングされ得るか、又は賦形剤と混合され得るか、又はアジュバントとしての薬学的に許容し得る賦形剤と混合され得る。本出願の主題は、より具体的には、免疫原として上記ＩＬ−２ペプチド又はＩＬ−２誘導体を含有するワクチンである。
本発明の主題はまた、上記組成物を調製するための方法であって、自体公知の方法にしたがって、有効成分又は成分を、許容し得る（特に、薬学的に許容し得る）賦形剤と混合することを特徴とする方法である。
本発明の新規組成物は、ＩＬ−２に対する寛容を誘導するために使用され得るので、例えば、免疫媒介性疾患の治癒処置及び予防処置の両方において、例えば自己免疫疾患の処置において、及び炎症性疾患の処置において有用である。それらはまた、Ｔ１Ｄの処置において、及びＳＬＥの治療において使用され得る。それらはまた、ＲＡ、ＳＪＯ、ＪＯ−１、ＭＳの処置において使用され得る。
通常の用量は、被験体及び問題の症状に応じて変化するが、例えば、ＲＡ、ＳＪＯ、ＪＯ−１、ＭＳの処置の場合には、ペプチドＬＴＲＭＬＴＦＫＦＹＭＰＫＫＡ（配列番号：１）の１〜１０００μg、特に１０〜５００μgを、皮下経路によって３カ月間月１回、その後、誘導された血清抗体の数の関数として定期的に、例えば２〜６カ月ごとであり得る。
これが、本発明の目的が、自己免疫疾患の治療的処置の方法において及び炎症性疾患の処置において使用するための、任意のＩＬ−２由来ペプチドであって、Ｔ１Ｄ、全身性エリテマトーデス、関節リウマチ、シェーグレン症候群及び自己免疫性多発性筋炎患者の抗ＩＬ２抗体又はＩＬ−２特異的Ｔ細胞によって特異的に認識され、特に、式Ｉ
Ｒ１−ＬＴＲＭＬＴＦＫＦＹＭＰＫＫＡ−Ｒ２（Ｉ）
（式中、
Ｒ１は、Ｎ末端アミノ酸の遊離又は置換第一級アミノ官能基を表し、
Ｒ２は、Ｃ末端アミノ酸のカルボキシル官能基の遊離又は置換ヒドロキシル基を表す）のＩＬ−２由来ペプチドであるペプチド
並びにこのようなペプチドの機能保存的変異体でもある理由である。
自己免疫疾患は、好ましくは、Ｔ１Ｄ及びＳＬＥである。本発明のペプチドはまた、ＲＡ、ＳＪＯ、ＪＯ−１及びＭＳの処置において使用され得る。
本発明の好ましいペプチドは、
− ＬＴＲＭＬＴＦＫＦＹＭＰＫＫＡ 配列番号：１
− ＥＦＬＮＲＷＩＴＦＳＱＳＩＩＳ 配列番号：２
である。
抗ＩＬ２抗体又は自己抗体を産生するＢ細胞は、抗ＩＬ−２抗体の製造に使用され得る。当該抗ＩＬ−２抗体は、前述のように、研究、診断、又は臨床用途に使用され得る。
抗ＩＬ２抗体は、標準的な方法、例えば、対応するＢ細胞クローンを不死化し、ハイブリドーマによって産生される抗ＩＬ２抗体を回収することによって、又は抗ＩＬ２抗体若しくは抗ＩＬ−２自己抗体を産生するＢ細胞を有する被験体から得られるＤＮＡ産物に基づいてリコンビナント抗体を作製することによって製造され得る。
したがって、本発明の更なる目的は、上記診断用途又は臨床用途における、上記方法にしたがって得られる抗ＩＬ−２抗体又は自己抗体の使用である。
以下の実施例は、本発明を例証する。
上記方法を行うための好ましい条件もまた、想定される上記本発明の他の主題に適用される。
以下の実施例を参照することによって、本発明の範囲をより良く理解することができ、以下の実施例の目的は、本発明の利点を説明することである。
実験データ
使用したヒト血清及び血漿サンプルを以下に説明する。
１．血清サンプルは、健常ドナー（ＨＤ；ｎ＝２４９）及び２型糖尿病（Ｔ２Ｄ；ｎ＝２４）、１型糖尿病（Ｔ１Ｄ；コホート１はｎ＝３９、コホート２はｎ＝１５及びコホート３はｎ＝２１）を患っている患者から得た。
成人健常ドナー、Ｔ２Ｄ又はＴ１Ｄ（コホート１）患者は、地域倫理ガイドラインにしたがって、パリ（フランス）のDiabetology Unit of the Pitie Salpetriere Hospitalで募集した。健常ドナー及びＴ１Ｄ（コホート２）患者由来の血清サンプルは、ＤＡＳＰプログラム（http://www.cdc.gov/labstandards/diabetes_dasp.html）によって提供された。コホート３からの健常ドナー及びＴ１Ｄ患者は、地域倫理ガイドラインにしたがって、ミラノ（イタリア）のSan Raffaele Instituteで募集した。最終分析では、成人Ｔ１Ｄ患者のみが含まれていた。
２．異なる炎症性／自己免疫疾患を患っている患者に対応する健常ドナーは、ルーアン（フランス）のINSERM U905で募集した。このコホートには、確立された分類基準にしたがって、患者を分類した：抗ｄｓＤＮＡ自己抗体を有するＳＬＥの場合にはACR改訂基準、抗ＣＣＰ抗体及び／又はリウマチ因子を有するＲＡの場合にはARA基準、抗ＳＳＡ及び／又は抗ＳＳＢ自己抗体を有する一次シェーグレン症候群の場合には改訂欧州基準、抗ｔＲＮＡシンテターゼＪｏ−１自己抗体を有する重複筋炎の場合にはTroyanov基準、並びに前記。
2005 McDonald基準によるＭＳ及びEFNS基準による慢性炎症性脱髄性多発神経障害（ＣＩＤＰ）を患っている患者は、クレテイユ（フランス）のHenri Mondor Hospital/UPEC Universityで募集した。ＭＳの再発の場合にはメチルプレドニゾロン（methylpredinisolone）の開始前に、及びＣＩＤＰの場合には静脈内免疫グロブリン処置の開始前に、血清を採取した。この後ろ向き研究は、倫理基準委員会の承認を受け、フランスの基準にしたがって研究のために匿名データを収集することを患者に通知した。
異なるガン（メラノーマ、頭頸部、肺、結腸直腸又は乳房）を患っている患者由来の血清は、地域倫理ガイドラインにしたがって、Curie Institut Paris (Dr. S. Saada)のCentre de Ressources Biologiquesから得た。
全ての血清サンプルを使用まで−２０℃又は−８０℃に維持した。
実施例１．ヒト血清及び血漿サンプルにおける抗ヒトＩＬ−２自己抗体の定量−糖尿病
ｈＩＬ−２ＡＡｂの血清力価をＥＬＩＳＡによって評価した。マイクロタイター９６ウェルプレート（Medisorp, Nunc）を、１０５IU/ml ｈＩＬ−２を含有する１００μl／ウェルのカーボネートコーティング緩衝液（「ＩＬ−２コーティングウェル」）又は緩衝液のみ（「非コーティングウェル」、ブランク）と共に４℃で一晩インキュベーションした。ＰＢＳ／２％ＢＳＡで２時間ブロッキングした後、プレートを、連続希釈血清サンプル５０μlと共に室温で２時間インキュベーションした。ＰＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ２０で十分に洗浄した後、ＨＲＰ結合抗ヒトＩｇＧ（１：２，０００；Dako）を各ウェルに追加し、プレートを室温で１時間維持した。前述のようにＴＭＢ基質を用いて、ペルオキシダーゼ活性を測定した。ＨＲＰ結合ヤギ抗ラットＩｇで明らかにした２倍連続希釈のラット抗ヒトＩＬ−２（クローンMQ1-17H12、eBioscience）を使用して、標準曲線を作成した。ブランクの控除後に得られたＯ．Ｄ．値を使用して、各サンプルの任意単位を計算した。ヒト競合アッセイには、ｈＩＬ−２ＡＡｂ−健常ドナー又はｈＩＬ−２ＡＡｂ＋患者由来の血清（１／１００、１／２００又は１／３００希釈）を、漸増濃度のｈＩＬ−２と共に室温で１時間プレインキュベーションした。次いで、サンプルをＥＬＩＳＡプレートに追加し、プレートを上記のように処理した。
結果：
異なる患者群における抗ｈＩＬ−２ ＩｇＧの血清力価及び異なる患者群におけるｈＩＬ−２Ａ陽性患者の割合の結果を図１ａ及び１ｂに示す（実施例の図５ａ、ｂ）。左のグラフの破線は、陽性の閾値を示す。記号は個々の被験者を表し、横方向のバーは中央値である。＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１（フィッシャーの直接確率検定）。ｈＩＬ−２ＡＡｂを定量するＥＬＩＳＡ試験には、本発明者らは、９５％の特異性で健常ドナーとＴ１Ｄ被験者とを識別することを可能にする、陽性の閾値を２４．３AUの値に固定した。患者としてコホート１、２及び３のＴ１Ｄ被験者（ｎ＝７５）；並びにコントロールとしてこれらのコホートの健常ドナー（ｎ＝１０３）を使用して、９５％信頼区間のＲＯＣ曲線を用いて、このカットオフを計算した（図１ｃ〜ｄ）。
健常ドナー（４．４％）及びＴ２Ｄ患者（４．２％）において観察された低い割合と比較して、有意に高い割合のＴ１Ｄ患者由来の血清がｈＩＬ−２ＡＡｂ＋であった（それぞれコホート１、２及び３では２３．１、３３．３及び２３．８％）。
結論
異なるコホート間の抗ｈＩＬ−２陽性被験者の割合の結果（右のグラフ）は、１型糖尿病では、ＩＬ−２自己抗体が高頻度で存在していることを証明している。
したがって、抗ｈＩＬ−２抗体を１型糖尿病のマーカーとして使用し得る。
実施例２．ヒトＩＬ−２ Ｅｌｉｓａ競合アッセイ
マイクロタイター９６ウェルプレート（Medisorp, Nunc）を、１０５IU/ml ｈＩＬ−２を含有する１００μl／ウェルのカーボネートコーティング緩衝液（「ＩＬ−２コーティングウェル」）又は緩衝液のみ（「非コーティングウェル」、ブランク）と共に４℃で一晩インキュベーションした。ＰＢＳ／２％ＢＳＡで２時間ブロッキングした後、プレートを、漸増濃度のｈＩＬ−２と共に室温で１時間プレインキュベーションした又はプレインキュベーションしなかった連続希釈血清サンプル５０μlと共に室温で２時間インキュベーションした。ＰＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ２０で十分に洗浄した後、ＨＲＰ結合抗ヒトＩｇＧ（１：２，０００；Dako）を各ウェルに追加し、プレートを室温で１時間維持した。前述のようにＴＭＢ基質を用いて、ペルオキシダーゼ活性を測定した。ＨＲＰ結合ヤギ抗ラットＩｇで明らかにした２倍連続希釈のラット抗ヒトＩＬ−２（クローンMQ1-17H12、eBioscience）を使用して、標準曲線を作成した。ブランクの控除後に得られたＯ．Ｄ．値を使用して、各サンプルの任意単位を計算した。
結果を図２に示す。
結果は、１型糖尿病、全身性エリテマトーデス及び関節リウマチでは、発色基質のＥＬＩＳＡシグナルがｈＩＬ−２用量依存的パターンに従い減少することを証明している。したがって、この抗体は、ＩＬ−２特異的である。
実施例３．マウスによる抗ＩＬ−２自己抗体を産生するＢ細胞の検出−Ｅｌｉｓｐｏｔ
３５％エタノールで活性化した後、９６ウェルＰＶＤＦプレート（MAIP4510, Millipore）を、７０μL／ウェルの５μg/mL ｍＩＬ−２（Peprotech）によって４℃で一晩コーティングした。ＰＢＳで洗浄した後、プレートを、無タンパク質ブロッキング緩衝液（Thermo）によって室温で１時間ブロッキングし、次いで、完全ＲＰＭＩ培地によって室温で３０分間ブロッキングした。１０〜１８週齢の雌性Ｂ６又はＮＯＤマウス由来の連続希釈脾臓細胞又は骨髄細胞（完全ＲＰＭＩ培地中、１ウェル当たり細胞５×１０４〜４×１０５個）をＥＬＩＳＰＯＴプレートに追加した。一連の実験では、１０〜１８週齢の雌性Ｂ６又はＮＯＤマウス由来の脾臓細胞を、１０μg/mL ＣｐＧ−ＯＤＮ １０１８を含む完全ＲＰＭＩ培地中、細胞１×１０６個／mLで６日間培養して、記憶Ｂ細胞を増殖させた。次いで、連続希釈ＣｐＧ前活性化脾細胞（１ウェル当たり細胞５×１０４〜４×１０５個）をＥＬＩＳＰＯＴプレートに追加した。１８時間培養した後、プレートをＰＢＳ／０．２５％Ｔｗｅｅｎ−２０で３回洗浄し、ＰＢＳで３回洗浄し、次いで、ＰＢＳ／２％ＢＳＡで希釈したアルカリホスファターゼ−抗マウス−ＩｇＧ（１：１，０００；Sigma-Aldrich）と共に室温で２時間インキュベーションした。次いで、プレートを洗浄し、１００μL／ウェルの基質（Bio-Rad）を追加して、ホスファターゼ活性を測定した。１５分間インキュベーションした後、水道水で十分に洗浄することによって、反応をブロックした。ＡＩＤカメラを用いて、スポットをカウントした。
結果を図３ａ及び３ｂに示す。
抗ＩＬ−２抗体を産生するＢリンパ球は、ＮＯＤマウスにおいてのみ検出される。
結論
上記結果は、Ｂ細胞による抗ＩＬ−２抗体の産生を検出するために、ヒトでは、Ｂ細胞Ｅｌｉｓｐｏｔなどの技術を使用し得ることを証明している。
実施例４．ヒト血清及び血漿サンプルにおける抗ヒトＩＬ−２自己抗体の定量−他の自己免疫疾患。
血清サンプルは、健常ドナー（ＨＤ、ｎ＝２４９）、Ｔ１Ｄ（プールした３つのコホートにおいて、ｎ＝７５）、多発性硬化症（ＭＳ；ｎ＝３３）、シェーグレン症候群（ＳＪＯ；ｎ＝２２）、抗ＪＯ１陽性多発性筋炎（ＪＯ１；ｎ＝１６）、関節リウマチ（ＲＡ；ｎ＝３３）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ；ｎ＝２０）、慢性炎症性脱髄性多発神経障害（ＣＩＰＤ；ｎ＝５１）及びガン（ガン；ｎ＝１２８）患者から得た。（ａ）異なるコホートにおける抗ｈＩＬ−２ ＩｇＧの血清力価。破線は、陽性の閾値（実施例１と同じ値に設定）を示す。（ｂ）異なるコホート間の抗ｈＩＬ−２陽性被験者の割合。記号は個々の被験者を表し、横方向のバーは中央値である。＊Ｐ＜０．０５；＊＊＊Ｐ＜０．００１（フィッシャーの直接確率検定）。
結果を図４に示す。
グラフは両方とも、Ｔ１Ｄ患者と同様に、ＳＬＥ、ＲＡ、ＳＪＯ及びＪＯ−１患者が高頻度のｈＩＬ−２ＡＡｂを示すことを示している。
結論
ＳＬＥ、ＲＡ、ＳＪＯ及びＪＯ−１を有する患者は高頻度のｈＩＬ−２Ａを示すので、上記結果は、ｈＩＬ−２Ａがこのような疾患のバイオマーカーであることを証明している。
実施例５．ＣＢＡによるＩＬ−２特異的Ｔ細胞の定量
ＤＭＳＯ、ｍＩＬ−２ペプチド（これは、最初のスクリーニングにおいて陽性応答をもたらした）（３及び１０μmol/Lの各ペプチド）、Ｐ３１ペプチド（３及び１０μmol/L）又はａＣＤ３−ＣＤ２８コーティングビーズ（１ビーズ：１細胞の比）で７２時間刺激した後、１０〜１８週齢の雌性Ｂ６（ｎ＝３）又は前糖尿病ＮＯＤ（ｎ＝７）の脾臓細胞によるＩＦＮ−ｇ産生を、ＣＢＡによって培養上清中で定量した。記号は、個々のマウスを表す。データは、２回の独立した実験の累積である。
結果を図５に示す。
結果は、ｍＩＬ−２配列由来の２つのペプチドのみが、Ｂ６の脾細胞ではなくＮＯＤの脾細胞によるＩＦＮ−ｇ産生を誘導し得ることを示している。
結論
ＮＯＤマウスは、（２つの異なるペプチドに対して反応性の）ＩＬ−２特異的Ｔ細胞を示すので、上記結果は、（ＩＬ−２ペプチドによる再刺激後にＩＦＮｇ ＣＢＡによって検出される）ＩＬ−２特異的Ｔ細胞をＴ１Ｄのバイオマーカーとして使用し得ることを証明している。
実施例６．ＥＬＩＳＰＯＴによるＩＬ−２特異的Ｔ細胞の定量
以下のヒトＩＬ−２ペプチドのライブラリーを調製した：２１。
ｈＩＬ−２又はProleukin（Ｐｒｏ）ペプチド（１０μM／各）（これは、最初のプールスクリーニングにおいて陽性応答をもたらした）、細胞内ＩＡ−２、アデノウイルス溶解物（ＡｄＶ）又はＰＨＡで刺激した後、ＨＤ（ｎ＝１４、黒丸）又はＴ１Ｄ患者（ｎ＝１３、白丸）由来のＰＢＭＣによるＩＦＮ−ｇ産生を、ＥＬＩＳＰＯＴによって定量した。ＰＢＭＣ １０６個当たりのＩＦＮ−ｇスポット形成細胞（ＳＦＣ）の数を示し、破線は陽性カットオフを示し、灰色の領域は検出不可能な応答（すなわち、自然発生的なバックグラウンド応答と同一；閾値決定の材料及び方法を参照のこと）を示す。陽性Ｔ１Ｄ（上の数字）及びＨＤ（下の数字）の割合を各条件について示し、ＨＤ患者とＴ１Ｄ患者との間で有意に異なる応答をもたらす抗原は太字である（フィッシャーの直接確率検定によりＰ＜０．０３）。
結果を図６に示す。
結果は、ｈＩＬ−２配列由来の１つのペプチドのみが、ＨＤ ＰＢＭＣではなくＴ１Ｄ ＰＢＭＣによるＩＦＮ−ｇ産生を誘導し得ることを示している。
結果はまた、Proleukin（登録商標）タンパク質のｈＩＬ−２配列由来のペプチドＥＦＬＮＲＷＩＴＦＳＱＳＩＩＳ（Ｐｒｏ１１６−１３０と略す）が、ＨＤ ＰＢＭＣと比較して有意に高頻度のＴ１Ｄ ＰＢＭＣにおいてＩＦＮ−ｇ産生を誘導し得ることを示している。
結論
Ｔ１Ｄ患者は、（１つのペプチドに対して特異的ではなく多くに対して反応性の）ＩＬ−２特異的Ｔ細胞を示すので、上記結果は、（ＩＬ−２ペプチドによる再刺激後にＩＦＮｇ ＥＬＩＳＰＯＴによって検出される）ＩＬ−２特異的Ｔ細胞をＴ１Ｄのバイオマーカーとして使用し得ることを証明している。
加えて、外因性投与されたＩＬ−２（この特定の場合にはProleukin）に対する免疫応答を検出するために、ｈＩＬ−２配列由来のペプチドＥＦＬＮＲＷＩＴＦＳＱＳＩＩＳなどのペプチドを使用し得る。
実施例７．ＥＬＩＳＡによるＩＬ−２／ＩＬ−２Ａ免疫複合体の定量
マウスを後眼窩洞から採血し、ＩＬ−２／ＩＬ−２ＡＡｂ免疫複合体の血清力価をＥＬＩＳＡによって定量した。マイクロタイター９６ウェルプレート（Medisorp, Nunc）を、０．５μg/mLポリクローナル抗ｍＩＬ−２（PeproTech）を含有する１００μl／ウェルのカーボネートコーティング緩衝液（ｐＨ９．６）と共に４℃で一晩インキュベーションした。ＰＢＳ／２％ＢＳＡで２時間ブロッキングした後、プレートを、２連の連続希釈血清５０μlと共に室温で２時間インキュベーションした。ＰＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ２０で十分に洗浄した後、ビオチン標識抗マウスＩｇＧ（１：５，０００；Southern Biotech）を各ウェルに追加し、プレートを室温で１時間維持した。続いて、プレートを、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合ストレプトアビジン（１：２，０００；Invitrogen）と共に３０分間インキュベーションし、続いて、ＴＭＢ基質（eBioscience又はBD Biosciences）と共に１０分間インキュベーションした。反応を酸でブロックし、DTX 880 Multimode Detector (Beckman Coulter)を用いて、吸光度を４５０nmで読み取った。
結果を図７に示す。
レジェンド
血清サンプルは、異なるマウス系統（全てが年齢適合の雌）から得た：Ｂ６、野生型ＮＯＤ、ＮＯＤ．Ｉｄｄ３Ｂ６、Ｉｌ２−半接合ＮＯＤ：ＮＯＤ．Ｉｄｄ３ＮＯＤ／ＮＯＤ−ＩＬ−２ｎｕｌｌ（ＮＯＤ．Ｉｌ２＋／−）。異なるマウス系統におけるＩＬ−２／ＩＬ−２ＡＡｂ複合体の血清力価（ｂ）。記号は個々のマウスを表し、横方向のバーは中央値である。ｎｓ、非有意。＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１（ノンパラメトリックマンホイットニー検定）。
図１０に見られ得るように、ＮＯＤマウスは、Ｂ６マウスよりも高い力価のＩＬ−２／ＩＬ−２Ａ免疫複合体を示す。
結論：
ＮＯＤは、（ＥＬＩＳＡによって検出されたように）高い力価のＩＬ−２／ＩＬ−２Ａ免疫複合体を示すので、上記結果は、（本実施例でＥＬＩＳＡによって検出されたような）ＩＬ−２／ＩＬ−２Ａ免疫複合体をＴ１Ｄのバイオマーカーとして使用し得ることを証明している。
実施例８．多重粒子ベースのフローサイトメトリーによるＩＬ−２自己抗体の定量
リコンビナントｍＩＬ−２をカルボキシル化ビーズ（Bio-Rad Laboratories）に共有結合させた。最初に、ビーズを、製造業者の説明書にしたがって、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（Thermo Fisher）の存在下、１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミドヒドロクロリドによって活性化して、アミン反応性中間体を形成した。活性化ビーズを、回転下、反応混合物中で、１０μg/mL ｍＩＬ−２と共に室温で２時間インキュベーションした。次いで、ビーズを、製造業者の説明書にしたがってブロッキング及び保存した。市販の抗ｍＩＬ−２モノクローナル抗体（クローンJES6-1A12、eBioscience）、ビオチン−抗ラットＩｇ（BD Biosciences）及び次いでＰＥ−ストレプトアビジン（Invitrogen）を使用して、カップリングを確認した。ｍＩＬ−２結合ビーズを、暗所において、水平シェーカー上の９６ウェルプレート中で、Ｂ６マウス又はＮＯＤマウス由来の連続希釈血清と共に室温で２時間インキュベーションした。ビーズをＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０で２回洗浄し、ビオチン標識抗マウスＩｇＧ抗体（１：２５０；Southern Biotech）と共に１時間インキュベーションし、洗浄し、ＰＥ−ストレプトアビジン（１：１２５；Invitrogen）と共に３０分間インキュベーションし、再度洗浄し、ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０ １００μLに再懸濁した。次いで、ビーズをLSRIIフローサイトメーター（BD Biosciences）によって分析し、データをFlowJoソフトウェアによって分析した。ｍＩＬ−２ＡＡｂ競合アッセイには、Ｂ６マウス又はＮＯＤマウス由来の血清（１／１０希釈）を、漸増濃度のｍＩＬ−２と共に室温で２時間プレインキュベーションした。次いで、ｍＩＬ−２コーティングビーズを追加し、上記のように、多重粒子ベースのフローサイトメトリーによって処理した。
結果を図８に示す。
ＩＬ−２コーティング蛍光ビーズを用いてＦＡＣＳによって、抗マウスＩＬ−２ ＩｇＧの力価を定量した。（ｂ）競合アッセイ：抗ｍＩＬ−２陰性Ｂ６マウス（黒丸）又は抗ｈＩＬ−２陽性前糖尿病ＮＯＤマウス（白丸）由来の血清を、漸増量の遊離リコンビナントｍＩＬ−２と共に１時間プレインキュベーションし、次いで、ＩＬ−２コーティング蛍光ビーズを用いてＦＡＣＳによって、抗ｍＩＬ−２の力価を定量した。記号は個々のマウスを表し、横方向のバーは中央値である。データは、少なくとも２回の独立した実験の累積である。
図８ａに見られ得るように、Ｂ６マウスではなくＮＯＤマウスは、多重粒子ベースのフローサイトメトリーによって検出されたように、高い力価のｍＩＬ−２ＡＡｂを示す。
図８ｂに見られ得るように、多重粒子ベースのフローサイトメトリーによって検出された、ＮＯＤマウスの血清中のｍＩＬ−２ＡＡｂは特異的である。
結論：
多重粒子ベースのフローサイトメトリーは、特定のＩＬ−２ＡＡｂの検出を可能にするので、上記結果は、（多重粒子ベースのフローサイトメーター、競合多重粒子ベースのフローサイトメトリーによって検出される）ＩＬ−２ＡＡｂをＴ１Ｄのバイオマーカーとして使用し得ることを証明している。
実施例９．中和アッセイによるＩＬ−２自己抗体の中和能力の研究
Ｂ６マウス又はＮＯＤマウス由来の熱不活性化（５６℃で３０分間）連続希釈血清を用いて又は用いずに、ｍＩＬ−２不含、１ng/mL ｍＩＬ−２含有又は３ＩU/mL ｈＩＬ−２含有の完全ＲＰＭＩ培地（Gibco）中、９６ウェルプレートにおいて、ＣＴＬＬ−２細胞（ＡＴＣＣ、マイコプラズマを含まない）を培養した（細胞１０４個／ウェル）。４８時間後、培養物を［３Ｈ］−チミジン（１μCi／ウェル）で１８時間パルスし、液体シンチレーションによってカウントした。
結果を図９に示す。
レジェンド
１ng/mL ｍＩＬ−２及び異なる濃度のＢ６（黒丸）又はＮＯＤ（白丸）血清と共に３日間培養したＣＴＬＬ−２細胞の増殖。増殖は、コントロール（マウス血清なしで１ng/mL ｍＩＬ−２と共に３日間培養したＣＴＬＬ−２）に対する割合として表されている。記号及び曲線は個々のマウスを表し、横方向のバーは中央値である。データは、少なくとも２回の独立した実験の累積である。
図９に見られ得るように、ＩＬ−２依存性細胞株ＣＴＬＬ−２の増殖は、Ｂ６血清ではなくＮＯＤ血清によってのみ阻害され、これは、ＮＯＤマウスが中和ＩＬ−２ＡＡｂを示すことを示している。
結論：
ＣＴＬＬ−２ベースの中和アッセイは、中和ＩＬ−２ＡＡｂの検出を可能にするので、上記結果は、（in vitro中和アッセイによって検出される）中和ＩＬ−２ＡＡｂをＴ１Ｄのバイオマーカーとして使用し得ることを証明している。
実施例１０ 増殖アッセイによるＩＬ−２特異的Ｔ細胞の定量
１２アミノ酸が重複し、（シグナルペプチドを含む）ｍＩＬ−２配列全体をカバーする１５ｍｅｒのペプチドライブラリーを作製した（GL-Biochem）。ペプチド（１０mmol/L）を使用まで−２０℃のＤＭＳＯ中で保存した。１０〜１８週齢の雌性ＮＯＤマウス由来の脾細胞を、ＤＭＳＯ（ネガティブコントロール）、ａＣＤ３−ＣＤ２８ビーズ（ポジティブコントロール、１ビーズ：１細胞の比、Life Technologies）又はペプチド（１０μmol/L）を含有するX-Vivo 15無血清培地（Lonza）中、３連で培養した（細胞４×１０５個／１５０μL／ウェル）。９６時間後、培養物を［３Ｈ］−チミジン（１μCi／ウェル）で１８時間パルスし、液体シンチレーションによってカウントした。
結果を図１０に示す。
レジェンド
ＤＭＳＯ、ｍＩＬ−２ペプチド（これは、最初のスクリーニングにおいて陽性応答をもたらした）（１０μmol/L）又はａＣＤ３−ＣＤ２８コーティングビーズ（１ビーズ：１細胞の比）による９６時間の刺激後、１０〜１８週齢の雌性前糖尿病ＮＯＤ（ｎ＝３）脾細胞による増殖（ｃｐｍ）をチミジン取り込みによって定量した。
結果は、ＮＯＤ脾細胞が、細胞増殖によって、ｍＩＬ−２配列由来の２つのペプチドに応答することを示している。
結論
ＮＯＤマウスは、（２つの異なるペプチドに対して反応性の）ＩＬ−２特異的Ｔ細胞を示すので、上記結果は、（ＩＬ−２ペプチドによる再刺激後にチミジン増殖アッセイによって検出される）ＩＬ−２特異的Ｔ細胞をＴ１Ｄのバイオマーカーとして使用し得ることを証明している。
実施例１１．ヒトＩＬ−２中和アッセイ
ｈＩＬ−２ＡＡｂ−健常ドナー又はａｈＩＬ−２ＡＡｂ＋Ｔ１Ｄ患者由来の熱不活性化（５６℃で３０分間）血清（１／１０希釈）を用いて又は用いずに、１IU/mL ｈＩＬ−２を含有する無ＳＶＦ ＲＰＭＩ培地（Gibco, France）中、７５μL／ウェルで、９６ウェルプレートにおいて、健常ドナー由来のＰＢＭＣを培養した。５分間の刺激後、培養物を、２２５μL／ウェルのＰＢＳ／２％ホルムアルデヒドによって室温で１０分間固定した。ＰＢＳ／０．２％ＢＳＡで洗浄した後、細胞を、１００μL／ウェルの氷冷メタノールによって氷上で１０分間透過処理した。次いで、細胞をＰＢＳ／０．２％ＢＳＡで洗浄し、抗ＣＤ３ ＰＥ−Ｃｙ７（クローンUCHT1；１：２００；Beckman-Coulter）、抗ＣＤ４ ＰｅｒＣＰ（クローンRPA-T4 １：１００；Ozyme）、抗ＣＤ２５ ＰＥ（クローンM-A251；１：５；BD Biosciences及びクローン３Ｇ１０；１：１０；Miltenyi）、抗Ｆｏｘｐ３ Ａｌｅｘａ４８８（クローン236A/E7；１：２０；eBiosciences）及び抗ｐＳＴＡＴ５ Ａｌｅｘａ６４７（クローン47/Stat5(pY694）；１：２０；BD Biosciences）によって４℃で４５分間染色した。細胞を、LSRII又はFortessaフローサイトメーターによって取得し、FlowJoソフトウェアを用いて分析した。
結果を図１１に示す。
グラフは、抗ｈＩＬ−２自己抗体を含有する患者の血清の存在下では、ｐＳＴＡＴ５ Ｔｒｅｇの割合が減少しているが（右のグラフ）、抗ｈＩＬ−２自己抗体を含まない患者の血清の存在下では減少していない（左のグラフ）ことを示している。
結論
上記結果は、抗ＩＬ−２自己抗体がin vitro中和活性を有し得ることを証明している。
実施例１２．ワクチン
ＩＳＡ（SEPPIC, Paris）５０％と、ＫＬＨ（１００μg／用量）にカップリングされたヒトＩＬ２由来の合成ペプチドＬＴＲＭＬＴＦＫＦＹＭＰＫＫＡの水溶液５０％とから構成される油中水型エマルジョンから、ワクチン調製物を製造した。

Claims (11)

  1. 患者が自己免疫疾患を有するか又は自己免疫疾患を有する若しくは発症するリスクがあるかどうかを決定するための、或いは、自己免疫疾患の重症度を評価する又は自己免疫疾患の転帰を予測するためのin vitro方法であって、患者から得られた生物学的サンプルにおける免疫抗ＩＬ−２応答を検出又は定量する工程を含み、ここで
    自己免疫疾患は、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、関節リウマチ（ＲＡ）、シェーングレン症候群（ＳＪＯ）及び自己免疫性多発性筋炎（ＪＯ１）からなる群より選択される、in vitro方法。
  2. −抗ＩＬ−２自己抗体を産生するＢ細胞；
    −抗ＩＬ−２抗体；
    −ＩＬ−２特異的Ｔ細胞
    の１つ以上の検出又は定量によって、免疫抗ＩＬ２応答が証明される、請求項１に記載のin vitro方法。
  3. 抗ＩＬ−２自己抗体を産生するＢ細胞又は抗ＩＬ−２抗体の検出又は定量によって、免疫抗ＩＬ２応答が証明され、該自己抗体が中和抗ＩＬ−２自己抗体である、請求項１又は２に記載のin vitro方法。
  4. 患者が自己免疫疾患を有するか、又は自己免疫疾患を有する若しくは発症するリスクがあるかどうかを決定するための方法である、請求項１〜３のいずれか一項に記載のin vitro方法。
  5. 自己免疫疾患の重症度を評価するための方法である、請求項１〜４のいずれか一項に記載のin vitro方法。
  6. 自己免疫疾患の転帰を予測するための方法である、請求項１〜５のいずれか一項に記載のin vitro方法。
  7. 治療目的で外因性投与されたＩＬ−２に対する応答を予測／調整するための方法である、請求項１〜６のいずれか一項に記載のin vitro方法。
  8. １型糖尿病（Ｔ１Ｄ）、全身性エリテマトーデス、関節リウマチ、シェーグレン症候群及び自己免疫性多発性筋炎患者の抗ＩＬ２抗体又はＩＬ−２特異的Ｔ細胞によって特異的に認識されるペプチドであって、アミノ酸配列が、
    ＬＴＲＭＬＴＦＫＦＹＭＰＫＫＡ（配列番号１）、又は
    ＥＦＬＮＲＷＩＴＦＳＱＳＩＩＳ（配列番号２）
    からなる、ペプチド。
  9. 生物学的サンプルにおけるＴ細胞媒介性免疫応答を検出するためのin vitro方法であって、請求項８に記載のペプチドを検出に使用する、in vitro方法。
  10. ヒト又は動物の体の疾患の治療的処置の方法において使用するための、請求項８に記載のペプチドであって、
    ヒト又は動物の体の疾患が、１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、関節リウマチ（ＲＡ）、シェーグレン症候群（ＳＪＯ）及び自己免疫性多発性筋炎（ＪＯ１）からなる群より選択される、ペプチド。
  11. 請求項８に記載のペプチドを有効成分として含み、そして、医薬賦形剤を含む、ヒト又は動物の体の疾患の治療的処置の方法において使用するための医薬組成物であって、
    ヒト又は動物の体の疾患が、１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、関節リウマチ（ＲＡ）、シェーングレン症候群（ＳＪＯ）及び自己免疫性多発性筋炎（ＪＯ１）からなる群より選択される、医薬組成物。
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