JP6593595B2 - Ａｔｐ可視化動物およびその用途 - Google Patents

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Description

本発明は、哺乳類生体内のＡＴＰ分布と変動を観察することが可能なＡＴＰ可視化動物とその用途に関する。
アデノシン三リン酸（以下単に「ＡＴＰ」という。）は、生体内におけるエネルギー通貨と呼ばれ、様々な生体反応に利用される。そのため、ＡＴＰ濃度をモニタリングすることは生体の状況を把握する上で重要である。これまで最も一般的に用いられているＡＴＰの測定方法は、細胞を取得後、重さを量るまたは細胞数を数えた後に細胞を破砕して、その抽出物にルシフェラーゼを主成分とした試薬を混ぜることにより、発光量にてATP量を測定するルシフェラーゼ法である。しかし、この方法では、細胞数が正確に測れない、感度は高いが誤差値が大きい、試薬混合後の時間に依存して発光量が変化するため正確に測定できない、抽出方法により結果にムラがある、ルシフェラーゼの発光を主原理とするため、酸素濃度・pHなどに大きく依存する、細胞内の詳細な区分（細胞質・ミトコンドリアなどの細胞小器官）ができない、定点測定のみ可能で、経時的な変化は測定不可能である、といった問題がある。
別の方法として、細胞・組織の前処理をおこなった後に質量分析装置にて測定する質量分析法がある。しかし、この方法も、多くの細胞数が必要、細胞内の詳細な区分（細胞質・ミトコンドリアなどの細胞小器官）ができない、定点測定のみ可能で、経時的な変化は測定不可能、前処理の方法で誤差値が大きい、1細胞での量は測定不可能である、といった問題がある。
新たな測定方法として、ＡＴＰ、ＡＤＰ及びＡＭＰなどのアデノシン核酸に反応しうるタンパク質であるイノシンモノホスフェート脱水素酵素２(inosine monophosphate dehydrogenase 2:IMPDH2)のＣＢＳドメインに、シアンフルオレセントプロテイン（ＣＦＰ）及びイエローフルオレセントプロテイン（ＹＦＰ）を結合させた蛍光共鳴エネルギー移動（fluorescence resonance energy transfer:ＦＲＥＴ）の手法を用いた測定方法が報告されている（非特許文献１）。さらに、特許文献１ではBacillus subtilis由来のＡＴＰ合成酵素F0F1 ATPaseのATP感受ペプチドであるεタンパク質に、ＦＲＥＴにおけるドナー及びアクセプターとなりうる２種類の蛍光物質をそれぞれ結合させた蛍光標識融合タンパク質を用いたＡＴＰ測定方法が開示されている。しかしながら、生体内の1細胞内におけるＡＴＰ量やその分布・経時的な変化を定量的に測定することは難しかった。
WO2008/117792
Nat Biotechnol. 2007; 25(2):170-172.
本発明は、非ヒト哺乳類生体内の1細胞内におけるＡＴＰ量とその分布や経時的な変化を定量的に測定する手段とこれを用いて生体特性を計測することで各種疾患の定量化や予防・治療する物質のスクリーニング方法に有用なトランスジェニック動物を提供することを課題とする。
本発明者は上記課題を解決すべく鋭意検討を行った。その結果、ＡＴＰ合成酵素のεサブユニットのアミノ末端側およびカルボキシ末端側に、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）におけるドナー及びアクセプターとなりうる２種類の蛍光タンパク質をそれぞれ結合させてなる融合タンパク質を発現するマウスを作製することに成功し、このマウスを用いれば細胞や組織内のＡＴＰの分布や経時変化を定量的に測定できることを見出した。さらに、各種疾患の予防・治療する物質のスクリーニング方法にも有用であることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下の通りである。
（１）ＡＴＰ合成酵素のεサブユニットのアミノ末端側およびカルボキシ末端側に、蛍光共鳴エネルギー移動におけるドナー及びアクセプターとなりうる２種類の蛍光タンパク質をそれぞれ結合させてなる融合タンパク質を発現する非ヒト哺乳動物。
（２）ＡＴＰ合成酵素のεタンパク質サブユニットが配列番号１または２に記載のアミノ酸配列を含む、（１）に記載の非ヒト哺乳動物。
（３）ドナー及びアクセプターとなりうる蛍光タンパク質の組み合わせが、シアンフルオレセントプロテイン（ＣＦＰ）、イエローフルオレセントプロテイン（ＹＦＰ）、ブルーフルオレセントプロテイン（ＢＦＰ）、グリーンフルオレセントプロテイン（ＧＦＰ）、レッドフルオレセントプロテイン（ＲＦＰ）及びクサビラオレンジプロテイン（KO）などFRETを生じることのできる組み合わせである、（１）または（２）の非ヒト哺乳動物。
（４）前記融合タンパク質をコードするＤＮＡが染色体上のＲＯＳＡ２６遺伝子座に挿入された、（１）〜（３）のいずれかに記載の非ヒト哺乳動物。
（５）前記融合タンパク質をコードするＤＮＡはlox系配列を有し、Cre recombinaseがlox系配列で挟まれた領域を除去することにより、前記融合タンパク質が発現する、（１）〜（４）のいずれかに記載の非ヒト哺乳動物。
（６）前記融合タンパク質をコードするＤＮＡはCAGプロモーターの制御下におかれた、（１）〜（５）のいずれかに記載の非ヒト哺乳動物。
（７）（１）〜（６）のいずれかに記載の非ヒト哺乳動物と、疾患モデル動物との掛け合わせによって得られる、非ヒト哺乳動物。
（８）疾患モデル動物が、自閉症モデル動物または心疾患モデル動物である、（７）に記載の非ヒト哺乳動物。
（９）マウスである、（１）〜（８）のいずれかに記載の非ヒト哺乳動物。
（１０）（１）〜（９）のいずれかに記載の非ヒト哺乳動物又は該非ヒト哺乳動物から得られる細胞、組織もしくは器官に被験物質を投与し、蛍光強度に基づいてＡＴＰ濃度を測定することを特徴とする、ＡＴＰの測定方法。
（１１）（１０）に記載の方法によってＡＴＰを測定し、該測定結果に基づいて被験物質の薬効を評価することを特徴とする、薬剤のスクリーニングまたは薬効評価方法。
本発明により、非ヒト哺乳動物生体内の1細胞内におけるＡＴＰ量とその分布や経時的な変化を定量的に測定できるようになった。細胞は破砕せずに生細胞のままATP量を測定でき、誤差値4%以内でＡＴＰ量を正確に測定できる。さらに、測定は酸素濃度には無関係である。また、細胞内小器官内のＡＴＰ量を定量的に測定することもできる。また、発生期間中の非ヒト哺乳動物胚などでのＡＴＰの分布も詳細に調べることができる。
GO-ATeam発現用コンストラクトの模式図。 ATP濃度とFRET比をプロットしたグラフ。 各GO-ATeam マウス胚（１細胞、２細胞および４細胞期）のATP分布を示す蛍光顕微鏡写真。 各GO-ATeam マウス胚（８細胞期、１６細胞期および桑実胚）のATP分布を示す蛍光顕微鏡写真。 各GO-ATeam マウス胚（胚盤胞、E4.5およびE5.5）のATP分布を示す蛍光顕微鏡写真。 各GO-ATeam マウス胚（E6.5およびE7.5）のATP分布を示す蛍光顕微鏡写真。 各GO-ATeam マウス（新生仔）臓器のATP分布を示す蛍光顕微鏡写真。 各GO-ATeam マウス（12ヶ月）臓器のATP分布を示す蛍光顕微鏡写真。 各GO-ATeam マウス（12ヶ月）脳のATP分布を示す蛍光顕微鏡写真（右）。左は２Ｄ massイメージングを参照として示す。 GO-ATeam 2マウスと自閉症モデルマウス(Caps2Δexon3)の掛け合わせで得られたマウス及び野生型マウスの小脳のATP分布を示す蛍光顕微鏡写真。 GO-ATeam 1マウスまたは2マウスと自閉症モデルマウス(Caps2Δexon3)の掛け合わせで得られたマウス及び野生型マウスの海馬のATP分布を示す蛍光顕微鏡写真。 GO-ATeam 2マウスの通常状態における心臓の経時変化のATP分布を示す蛍光顕微鏡写真。 GO-ATeam 2マウスの低酸素状態における心臓の経時変化のATP分布を示す蛍光顕微鏡写真。 GO-ATeam 2マウスの慢性心筋梗塞状態における心臓の経時変化のATP分布を示す蛍光顕微鏡写真。 GO-ATeam 2可視化マウスに薬剤(βブロッカー)を投与して心拍数を低下させたときの心臓の蛍光実体顕微鏡写真と各心室・心房におけるATP量の経時変化を示すグラフ。グラフの縦軸はATP量の相対値を示している。 GO-ATeam 2可視化マウスの正常時と低酸素処理時の各臓器のATP分布を示す蛍光顕微鏡写真。 GO-ATeam 2可視化マウスに心筋梗塞を起こさせた時（赤）と、疑似手術した時（コントロール：青）とで各臓器におけるATP量の経時変化を比較したグラフ。グラフの縦軸はATP量の相対値を示しており、横軸の時間は１０秒単位であり、１００は１０００秒である。中央は、コントロール(0秒)のGO-ATeam 2可視化マウスの内臓のATP分布を示す蛍光顕微鏡写真。 成体のGO-ATeam 2可視化マウスから単離された心筋細胞に電気刺激を与えたときに起こる筋収縮-弛緩サイクルにおけるATP量の経時変化を示すグラフ。グラフの縦軸はATP量の相対値を示している。横軸は時間を示す。 GO-ATeam 2可視化マウスから単離された心筋細胞において、電気刺激をかける事により収縮運動を起こした時の細胞面積（点線）とATP量（実線）の変化を示すグラフ。グラフの縦軸は実線に対してはATP量の相対値を示しており、点線に対しては細胞面積を示している。また、横軸は時間を示す。時間は30ミリ秒単位であり、13は390ミリ秒である。1ppsは1パルス/秒の電気刺激を示す。上は単離心筋細胞のATP分布を示す蛍光顕微鏡写真。 GO-ATeam 2可視化マウスの坐骨神経を電気刺激して筋収縮を起こさせた時の前頸骨筋におけるATP動態を調べた結果を示すグラフ。グラフの縦軸はATP量の相対値を示しており、横軸は時間（秒）を示す。２つの矢印の間、30秒間電気刺激を加えた。
以下に本発明を詳しく説明する。
本発明の非ヒト哺乳動物は、Bacillus subtilis由来のＡＴＰ合成酵素F0F1 ATPaseのATP感受ペプチドであるεサブユニットのアミノ末端側およびカルボキシ末端側に、ＦＲＥＴにおけるドナー及びアクセプターとなりうる２種類の蛍光タンパク質をそれぞれ結合させてなる融合タンパク質（以下、蛍光融合タンパク質ということがある）を発現する非ヒト哺乳動物である。
本発明の非ヒト哺乳動物は、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ブタ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ヒツジ、ウシ、マーモセットなどの任意の非ヒト哺乳動物であり得る。
ＡＴＰ合成酵素は、Ｆ型及びＶ型に分類され、Ｆ型はさらにＦ1部位とＦ0部位に分類される。Ｆ1部位は、α、β、γ、δ、εなどのサブユニットから構成される。ＡＴＰ合成酵素のεサブユニットはＡＴＰに親和性が高く、ＡＴＰ以外のヌクレオチド、例えばＡＤＰ、ｄＡＴＰ、ＧＴＰなどへの親和性がない、また、ＡＴＰに結合すると構造変化を起すことから、ＡＴＰの測定に有効である。
本発明において使用されるεサブユニットは、いずれの生物種由来のものであってもよいが、取扱いの簡便さを考えると、微生物由来、例えばBacillus sp. PS3由来(GenBank accession No.AB044942（配列番号１）)やBacillus subtilis由来(GenBank accession No.Z28592（配列番号２）)に示すεサブユニットを好適に使用することができる。また、これらの菌種以外の菌種から得られたεサブユニットを用いることもできる。由来する生物種が異なれば、ＡＴＰへのアフィニティーが異なる(J. Biological Chemistry 2003; 278, 36013-36016., FEBS Letters 2005; 579, 6875-6878)。そのため、低濃度のＡＴＰに応答するものから、細胞内部のＡＴＰのように高濃度のＡＴＰに応答するものまで、異なるεサブユニットを使い分けることで、様々な濃度領域に感受性を有するＡＴＰ測定用試薬の創出が可能と考えられる。
εサブユニットは、Ｎ末端ドメインとＣ末端ドメインの２つのドメインを含む。Ｎ末端ドメインは、εサブユニットのＮ末端側から８５番目くらいまでのアミノ酸で構成され、１０本程度のβストランドからなる。Ｃ末端ドメインは、εサブユニットのＣ末端側から４５番目くらいまでのアミノ酸で構成され、２本のαへリックスからなる。Ｃ末端ドメインは、εサブユニット単独の場合は折りたたまれた結晶構造を示し、該εサブユニットがＡＴＰ合成酵素の他のサブユニットであるγサブユニットと複合体を構成する場合は、伸びた構造を示す。また生化学的な実験結果から、γサブユニット等との複合体中では、εサブユニットのＣ末端ドメインはＡＴＰの有無により構造変化を起こし、ＡＴＰがなければ伸びた状態であり、ＡＴＰが存在すると折りたたまれた構造になることが示される。これらにより、εサブユニットはＡＴＰが存在しない場合ではＣ末端ドメインが伸びた、又は動きやすい状態にあり、ＡＴＰが結合すると折りたたまれたコンパクトな状態になるものと考えられる。
本発明において、εサブユニットは全長である必要はなく、部分断片でもよい。部分断片は、εタンパク質において、少なくともＡＴＰ特異的に構造変化を生じうる部位を構成するアミノ酸配列の部分であればよく、特に限定されない。例えば、上述のＮ末端ドメインとＣ末端ドメインの２つのドメインを含み、それらがＡＴＰの存在により構造変化を生じるうる構成であればよい。
εサブユニットは、上記ＡＴＰ特異的に構造変化を生じうる部位を構成するアミノ酸配列を含むのであれば、天然型サブユニットであってもよいし、該天然型εサブユニットのアミノ酸配列において、１または数個、例えば、１〜５個のアミノ酸が、置換、欠失、挿入又は付加されていてもよい。例えば、εサブユニットとＡＴＰとの反応によるεタンパク質の構造変化を阻害しうる物質がεサブユニットに結合するのを防ぐために、アミノ酸の配列を一部置換してもよい。例えば、εサブユニットにおいて、他のサブユニットであるγサブユニットとの相互作用に必要な疎水的なアミノ酸残基（配列番号１ではVal20/Val42/Phe67/Leu78、配列番号２ではVal42/Phe67/Leu78）を、親水的なアミノ酸残基に置換することができる。また、配列番号３で示すように、野生型においてR122K/R126Kの変異を導入してもよい。
本発明における蛍光融合タンパク質は、２種類の蛍光タンパク質とεサブユニットとの融合タンパク質である。
結合される２種類の蛍光タンパク質は、ＦＲＥＴにおけるドナー及びアクセプターとなりうる組み合わせからなる蛍光タンパク質であればよく、特に限定されない。ここにＦＲＥＴとは、ドナーとアクセプターと呼ばれる２種類の蛍光物質が一定の距離以内に近づいた時に、ドナーが吸収した光エネルギーがアクセプターに移動することをいう。ＦＲＥＴの検出は、通常ドナーの励起波長を照射し、ドナー又はアクセプターの蛍光強度を測定することにより行う。ドナーの蛍光強度を測定する場合、２種類の蛍光タンパク質が近い位置にあるとアクセプターに光が吸収されるためにドナーの蛍光強度は低くなり、距離が離れると蛍光強度が高くなる。アクセプターの蛍光強度を測定する場合はその逆で、距離が近いと蛍光強度が強くなり、離れると強度が低くなる。
蛍光タンパク質は、一般的に使用されているものを用いることができる。具体的には、オワンクラゲ由来の緑色蛍光タンパク質に代表されるグリーンフルオレセントプロテイン（ＧＦＰ）、ＧＦＰに種々の変異を導入し、蛍光の色を変化させたイエローフルオレセントプロテイン（ＹＦＰ）やシアンフルオレセントプロテイン（ＣＦＰ）、ブルーフルオレセントプロテイン（ＢＦＰ）、あるいは珊瑚由来の赤色蛍光タンパク質であるレッドフルオレセントプロテイン（ＲＦＰ）、クサビラオレンジプロテイン（KO）等が挙げられる。他にも、Nature Methods vol. 9, No. 10, 1005-1012 (2012)のTable 1に記載された蛍光タンパク質も使用できる。
蛍光タンパク質がＦＲＥＴの機能を発揮するために、ドナー及びアクセプターの組み合わせとして、例えば、ＣＦＰ及びＹＦＰ、ＢＦＰ及びＧＦＰ、あるいはＧＦＰ及びＲＦＰにより使用することができる。いずれがεサブユニットのアミノ末端側、カルボキシ末端側でもよい。これらの蛍光タンパク質は、市販のものを使用することができる。例えば、ＣＦＰとしてはInvitrogen社のCFPが、ＹＦＰとしてはInvitrogen社のYFPの他にEvrogen社のPhi-Yellowが、ＧＦＰとしてはClontech社のEGFPの他にEvrogen社のTag-GFPが、ＲＦＰとしてはClontech社のDsRed2-monomer、Evrogen社のHcRed-Tandemが使用可能である。
本発明の非ヒト哺乳動物は、前記蛍光融合タンパク質をコードするＤＮＡを非ヒト哺乳動物の染色体上に組み込んで、前記蛍光融合タンパク質を発現させることで得ることができる。
前記蛍光融合タンパク質をコードするＤＮＡは非ヒト哺乳動物の細胞で機能し得るプロモーターの制御下で発現されることが好ましい。プロモーターとしては、β-アクチンプロモーター、CMVプロモーター、CAG（CAGGS）プロモーター等が例示されるが、発現効率の点ではCAG（CAGGS）プロモーターが特に好ましい。なお、プロモーターは時期特異的プロモーターや、組織特異的プロモーターであってもよい。
蛍光融合タンパク質をコードするＤＮＡ構築物は、選択マーカーを含んでもよい。「選択マーカー」とは、選択マーカーが導入された細胞に選択可能な表現型を提供する遺伝エレメントをいい、一般には、遺伝子産物が細胞の増殖を阻害するかまたは細胞を殺傷する薬剤に対する耐性を与える遺伝子である。具体的には、例えば、Ｎｅｏ遺伝子、Ｈｙｇ遺伝子、ｈｉｓＤ遺伝子、Ｇｐｔ遺伝子およびＢｌｅ遺伝子が挙げられる。選択マーカーの存在を選択するために有用な薬物としては、例えば、Ｎｅｏ遺伝子に対してはＧ４１８、Ｈｙｇ遺伝子に対してはハイグロマイシン、ｈｉｓＤ遺伝子に対してはヒスチジノール、Ｇｐｔ遺伝子に対しては６−チオキサンチン、そしてＢｌｅ遺伝子に対してはブレオマイシンが挙げられる。
蛍光融合タンパク質をコードするＤＮＡ構築物はさらに、相同組換えによって染色体上の内因性遺伝子を置き換える場合には、染色体上の目的部位と相同な配列をさらに含むことが好ましい。ここで、染色体上の目的部位としては、Rosa26遺伝子座が好ましい。
マウスROSA26遺伝子座は、Friedrich及びSorianoにより1991年に、レトロウイルスを感染させた胚性幹(ES)細胞を用いるジーントラップ実験により発見された(Friedrich, G.及びP. Soriano, Genes & Development, 1991, 5, 1513〜1523)。ROSA26遺伝子座をマウスES細胞でターゲティングすることは、トランスジェニックマウスモデルを構築するために広く用いられている(Kisseberthら, Developmental Biology, 1999, 214, 128〜138; MaoX.ら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1999, 96, 5037〜5042; Soriano, 1999, 上記; Awatramaniら, Nature Genetics, 2001, 29, 257〜259; Mao X.ら, Blood, 2001, 97, 324〜326; Possematoら., Genesis, 2002, 32, 184〜186; Mao, J.ら, Nucleic Acids Res.,2005, 33, e155; Yuら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2005, 102, 8615〜8620; 国際出願WO 99/53017、WO 02/098217、WO 03/020743、WO 2004/063381及びWO 2005/116070)。
蛍光融合タンパク質をコードするＤＮＡ構築物は、さらに、Cre recombinaseやFlp recombinaseなどの遺伝子組み換えタンパク質によって認識されるlox系配列を代表とする認識配列を含んでもよい。例えば、プロモーターと融合タンパク質をコードするＤＮＡの間にストップコドンや薬剤耐性遺伝子を配置し、Cre recombinaseが発現したときに、該プロモーターと融合タンパク質をコードするＤＮＡが直接連結し、該プロモーターによる転写が開始するようにしてもよい。lox系配列としては、例えば、loxP, lox71, lox66, lox511, lox2272, Vlox (VCre), Slox (SCre)などが例示される。また、FLPにより認識されるFRT配列を使用することもできる。
本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物は、例えば、以下の（ａ）〜（ｇ）の工程を含む方法により得ることができる。
（ａ）蛍光融合タンパク質をコードするＤＮＡ構築物を含むターゲッティングベクターを非ヒト哺乳動物の胚性幹（ES）細胞に導入する工程
（ｂ）蛍光融合タンパク質をコードするＤＮＡが挿入された染色体を有するES細胞を選択する工程
（ｃ）選択したES細胞を受精卵に導入する工程
（ｄ）該受精卵を偽妊娠雌性非ヒト哺乳動物の卵管あるいは子宮に移植する工程
（ｅ）該非ヒト哺乳動物を飼育し、産まれた仔から、生殖系列キメラを選択する工程
（ｆ）該生殖系列キメラを交配させ、産まれた仔から、蛍光融合タンパク質をコードするＤＮＡが挿入された染色体を有する個体を選択する工程
（ｇ）（ｆ）で得られた個体同士を交配させ、産まれた仔から、両方の相同染色体において、蛍光融合タンパク質をコードするＤＮＡが挿入されたホモ接合体を選択する工程
このような方法は、例えば、Hoganら、Manipulating the Mouse Embryo： A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory（1986）や、米国特許第5,616,491号および5,750,826号などに記載されている。
以下、作製方法についてより詳しく説明する。
ＥＳ細胞は、適切な条件下において、インビトロで移植前の胚を培養することによって得られる（Nature 292：154-156（1981）；Nature 309：255-258（1984）；Proc．Natl．Acad．Sci．USA 83：9065-9069（1986）；およびNature 322：445-448（1986））。
ターゲッティングベクターは、当該分野で公知の種々の方法（エレクトロポレーション、リン酸カルシウム共沈、プロトプラストまたはスフェロプラストの融合、リポフェクションおよびＤＥＡＥデキストラン媒介性トランスフェクションを含む）を使用するＤＮＡトランスフェクションによって、ＥＳ細胞中に効率的に導入され得る。
ターゲッティングベクターとしてウイルスベクターを使用する場合、アデノウイルス、レトロウイルス、レンチウイルスなどのウイルス感染もまた、非ヒト動物中に遺伝子を導入するために使用できる。発達中の非ヒト胚を、胚盤胞段階までインビトロで培養する。この間に、割球にウイルスを感染させる（Proc．Natl．Acad．Sci．USA 73：1260-1264（1976））。トランスフェクションは、ウイルスを産生する細胞の単層上において割球を培養することによって、簡単かつ効率的に達成される（EMBO J．6：383-388（1987））。あるいは、より後期の段階で、感染させてもよい。ウイルスまたはウイルスを産生する細胞を胞胚腔内に注入してもよい（Nature 298：623-628（1982））。
さらに、妊娠中期の胚の子宮内ウイルス感染によって、生殖細胞系列中に導入遺伝子を導入することもまた可能である。受精卵または初期胚の卵黄周囲腔にウイルス粒子またはウイルスを産生するマイトマイシンＣ処理細胞を微量注入することも可能である。
核微量注入（米国特許第４，８７３，１９１号）；胚性幹細胞における遺伝子標的化（Cell 56：313-321（1989））；胚のエレクトロポレーション（Mol Cell．Biol．3：1803-1814（1983））；および精子媒介性遺伝子移入（Cell 57：717-723（1989））などの方法を採用してもよい。
このようにして目的遺伝子が導入されたＥＳ細胞は、その後、胚盤胞段階の胚の胞胚腔内に導入された後に胚に組み込まれ、キメラ動物の生殖細胞系列に組み込まれる。導入遺伝子が、選択されるための手段を提供する場合には、トランスフェクトされたＥＳ細胞を胞胚腔内に導入する前に、トランスフェクトされたＥＳ細胞を種々の選択プロトコールに供して、導入遺伝子を組み込んだＥＳ細胞を濃縮することができる。あるいは、ＰＣＲを使用して、導入遺伝子を組み込んだＥＳ細胞をスクリーニングし得る。これにより、導入効率を上げることができる。
注入された胚を、偽妊娠の雌の卵管／子宮に移植し、そして最終的にトランスジェニック動物を得る。一旦、創始動物が作製されると、この創始動物を交配、同系交配、異系交配または交雑して、特定の動物の個体群を生じさせることができる。例えば、疾患モデル非ヒト哺乳動物と掛け合わせると、疾患の評価や治療薬スクリーニングに有用である。
疾患モデル非ヒト哺乳動物としては、自閉症モデル動物(例えば、Caps2Δexon3, Sadakata, T. et al. PNAS 2012: www.pnas.org/content/early/2012/11/28/1210055109.full.pdf) や心疾患モデル動物が例示される。心疾患モデル動物としては、低酸素状態や心筋梗塞状態を惹起したモデル動物が例示される。
また、db/dbマウスなどの糖尿病モデル動物や、p53/k-ras変異マウスなどの癌モデル動物や感染症モデル動物が例示されるが、これらには限定されない。
本発明の蛍光融合タンパク質を発現する非ヒト哺乳動物および該動物から得られる組織や細胞は、生体内でのＡＴＰの濃度やその分布、さらには、時間変化などを測定するために使用できる。生体内に存在するＡＴＰによって、ＡＴＰ合成酵素のεサブユニットの構造が変化し、それによって、ＦＲＥＴ反応が生じて蛍光が発せられるため、蛍光顕微鏡などを用いてＡＴＰの存在をモニターすることができる。
本発明の非ヒト哺乳動物および該動物から得られる組織や細胞は、がん医薬品候補のスクリーニングに使用可能である。例えば、本発明の非ヒト哺乳動物またはそれから得られる組織や細胞に医薬候補物質を投与し、がん細胞特異的に死滅させる医薬品候補・濃度のスクリーニングをＡＴＰ濃度の正確な変化・計測により行うことが可能になる。また、薬物の安全性試験にも使用可能である。例えば、毒性や肝臓への負担など、薬物が肝臓に与える影響を、肝臓の細胞を使用して、ＡＴＰ量の変化を観察する事により正確に調べることができる。
本発明の非ヒト哺乳動物および該動物から得られる組織や細胞は、様々な病態の解析や評価、薬剤の評価やスクリーニングに使用できる。例えば、各細胞のエネルギー代謝状態を変化させる疾患の治療薬のスクリーニングや薬効評価にも使用可能である。また、心臓の組織や細胞を用いることで、心臓疾患の治療薬のスクリーニングや薬効評価にも使用可能である。また、自閉症を呈するように施した本発明の非ヒト哺乳動物に薬剤候補物質を投与し、該物質がＡＴＰ濃度を低下させる作用を有するかを評価することで、ＡＴＰ濃度が過剰になって代謝異常をきたすような疾患の治療薬の候補物質のスクリーニングを行うことができる。逆に、物質がＡＴＰ濃度を上昇させる作用を有するかを評価することで、ＡＴＰ濃度が低下して代謝異常をきたすような疾患の治療薬の候補物質のスクリーニングを行うことができる。
評価またはスクリーニングに使用する治療剤候補物質としての化合物は、例えば、合成又は天然の低分子又は高分子化合物、金属含有化合物、糖質、ペプチド、タンパク質、ペプチド模倣物、糖タンパク質、リポタンパク質、核酸、抗体などが使用可能である。多数の天然化合物および合成化合物を含むライブラリーもまた、使用可能である。
また、心臓などの運動などによるエネルギー代謝が経時的に変化する細胞・臓器では、その運動・機能の異常をＡＴＰ量と分布の経時的変化の異常として捉えることができるため、本発明の非ヒト哺乳動物またはそれから得られる組織や細胞を用いることで、新規の診断法や治療法の開発も可能である。そのＡＴＰ量の分布と変化の情報から臓器などの動き（例えば歩行時の足の筋肉のATP分布と変化から歩行を再現）を機械などで再現することも可能である。
また、筋肉の細胞や組織を用いて運動からの回復能を調べることができるので、筋疾患への応用だけでなく、運動・スポーツ器機開発や食品・筋肉増強剤開発などにも利用可能である。
本発明の非ヒト哺乳動物から得られる細胞などを用いてＡＴＰの定量を行うことが可能である。
測定条件として、以下が考えられる。被験物質としては、ＡＴＰを含むものであれば良く、例えばＡＴＰを含む溶液、細胞などの生体試料、生体試料からＡＴＰを抽出したものなどが挙げられる。溶解緩衝液としては特に限定されないが、例えば蛍光物質の蛍光を最適な条件で発しうるｐＨのものを選択することができる。具体的には、ＹＦＰを蛍光物質として用いる場合は、ＹＦＰの蛍光は酸性側では減少するため、ｐＨ７以上の緩衝液を用いることが好ましい。反応温度は、蛍光タンパク質プローブが構造変化を起こしうる温度であればよく、例えば３７±１℃や、２５±１℃において測定することができる。反応時間についても適宜決定することができるが、好ましくは１分以上であり、タンパク質が失活しない程度の時間反応させることができる。反応には、適宜添加物を加えることができる。例えば０．０５％の界面活性剤（TritonX100）もしくは１ｍｇ／ｍＬウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）などを安定化の目的で加えることができる。被験試料に混在するマグネシウムの影響を避けるためには、例えばＥＤＴＡやＥＧＴＡなどのキレート剤を添加してもよい。
反応終了後の被験物質についての蛍光スペクトルは、蛍光光度計を用いて、ドナーの励起光を照射し、それぞれの蛍光物質の蛍光強度が単独でピークとなる波長で蛍光強度をそれぞれ測定して、その比を計算することにより測定することができる。一方濃度既知のＡＴＰ溶液を調製し、同様に蛍光強度の比をとり、検量線を作成しておく。この検量線を用いれば検体のＡＴＰ濃度を求めることができる。
以下に実施例を示し、本発明をさらに具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
ATP可視化マウスは各GO-ATeam cDNA（GO-ATeam1及びGO-ATeam2）をマウスROSA26領域へ挿入するようにターゲティングベクターを作製した（図１）。これらのGO-ATeamはCAGGSプロモーターで制御できるように、更にCreが発現する部位・時期以降から発現するようにLoxPで挟んだSTOP配列を挿入する形で作製した。
＜コンストラクトの作製方法＞
マウスROSA26 5' arm 1080bp (Ch6 113076036-113077116)にSplice acceptor, bgh pAの後にCAGGS, LoxP, pA, Neo (逆方向), MC1 (逆方向), STOP配列( SV40pA含む), LoxP, bgh pAを結合し、その後にROSA26 3' arm 4267bp (ch6 114900586-114904926)を結合し、その後にPGK promoter, DT-A, bgh pAをつなげた配列を持つpBlueScript（星野克明博士より供与）を利用した(以下ROSA26-CAG-STOPベクター)。
pBlueScriptのMCSの両端にMCS側からAscI, PmeI, SwaI配列を挿入したpBS-APSベクターをPmeIで消化した後、T4 DNA polymerase処理を行い、そこへ、ROSA26-CAG-STOPベクターのSTOP配列 149bp, LoxPの後にpEF-BOSベクター（Nucleic Acids Res. 1990 Sep 11;18(17):5322.）のstuffer配列, G-CSF pAを結合し、さらに、ROSA26 3' arm 49bp (ch6 114904549-114904597)を挿入したベクターを利用した（以下IiMOG-GA_pBS-APSベクター）。
cDNAはGO-ATeam1及びGO-ATeam2それぞれがpcDNAベクターに入ったもの（今村博臣博士より供与）をNheI-HindIIIで切り出し、HindIIIサイトはT4 DNA polymerase処理を行った。
IiMOG-GA_pBS-APSベクターをNheI-XbaIで消化し、XbaIサイトはT4 DNA polymerase処理を行った。
これらを結合し、GO-ATeam1_ IiMOG-GAおよびGO-ATeam2_ IiMOG-GAを得た。
このGO-ATeam1_ IiMOG-GAおよびGO-ATeam2_ IiMOG-GAをSwaI消化した後、cDNAを含む断片を得て、AscI-NruI消化した後に、T4 DNA polymerase処理を行ったROSA26-CAG-STOPベクターとGeneArt(Invitrogen社)にて結合させてターゲティングベクターを得た。
なお、GO-Ateam 1及びGO-Ateam 2は以下の通り。
Ateam (Adenosine 5'-Triphosphate indicator based on Epsilon subunit for Analytical Measurement)
GO-Ateam (GFP- and OFP-based ATeam)
GO-Ateam 1: Bacillus subtilis F0F1-ATP synthaseのεサブユニット（配列番号2）のN末側にGFP (cp173-mEGFP)を、C末側にOFP (mKOκ)を挿入したコンストラクト：シグナルを有さないので細胞質で発現する。
GO-Ateam 2: GO-Ateam 1のεsubunitにおいてR122K/R126Kとしたmutant（配列番号3）：
シグナルを有さないので細胞質で発現する。
参考文献
Imamura et al., Pro N.A.S. 2009, 106, 15651-15656
Nakano et al., ACS Chem. Biol. 2011, 6, 709-715
Waldeck-Weiermair et al., PLoS ONE 7(9): e45917 2012
WO2008/117792
＜マウスの作製＞
上記ターゲティングベクターをAsiSIで直線化した後、定法によりES細胞(C57/BL6×129hybrid)へ導入した後、遺伝子組換えが正確に起こったES細胞だけをネオマイシン耐性遺伝子, PCR法、Southern Blotting法により選択して、Creが発現した細胞のみでGO-ATeamが発現するようにしたES細胞を得た。常時GO-ATeamが発現するES細胞は上記ES細胞へCMV-Creベクターを導入することにより得た。
キメラマウスはICRマウスから得た桑実胚と上記より得たES細胞をアグリゲーション法にて融合させた後に偽妊娠処理を施したICR♀マウスの子宮へ移植することにより得た。
以上により、GO-ATeam1, GO-ATeam2が細胞質で発現するマウスを作出した。
＜ATPの測定＞
上記で得られたGO-ATeam1及びGO-ATeam2可視化マウスの胎生13日胚からMEF細胞を取得し、培養した。
継代4代目を用いてglass coat dishへ播種した。MEF細胞をPermilization buffer (140mM KCl, 6mM NaCl, 0.1mM EGTA, 10mM HEPES pH7.4)でwashした後、α-Hemolycin(Sigma cat#H9395)をPermilization bufferで希釈して終濃度50μg/mlの中で37℃ 30分処理を行った。その後、MgATPを0mMから30mMの間で希釈したCalibration buffer (140mM KCl, 6mMNaCl, 0.5mM MgCl2, 10mM HEPES pH7.4)に馴染ませて、各ATP濃度時のGO-ATeam1及びGO-ATeam2が発する蛍光画像を共焦点顕微鏡にて取得した。共焦点顕微鏡は488nmのレーザーをexcitation DMとしてDM405/488を使用し、ダイクロイックミラーLM01-552で分光した後にBA505-540とBA575-675のフィルターにてGFP蛍光とKusabiraOrange蛍光を得た。得られた蛍光画像はMetamorphにてFRET Ratio値を計算することでFRET ratio値を得た。各ATP濃度と、その時に取るFRET ratio値をプロットすることでグラフを作成した。結果を図２に示す。
GO-ATeam1はATP濃度2-20mMの間でATP濃度とFRET ratio値が直線状に変化し、GO-ATeam2はATP濃度0.2-6mMの間でATP濃度とFRET ratio値が直線状に変化した。またその誤差値は約4.5%以下であった。これよりGO-ATeam1及びGO-ATeam2可視化マウスではATP濃度2-20mMと0.2-6mMの間でATP量を定量できることがわかった。
＜ATP濃度のインビボイメージング＞
GO-ATeam1及びGO-ATeam2可視化マウス（メス）と野生型マウスを交配して受精卵を得た。受精卵はDMEM(Sigma)/10%FCS内にて回収し、受精後3日目まではM2 medium (sigma)内で37℃ 5%CO2にて培養した。観察は共焦点顕微鏡にてM2 medium (フェノールレッドなし)内で37℃ 5%CO2の条件下で上記と同じ方法にて画像を取得した。受精後4日目以降はM2 mediumの代わりにDMEM(sigma)/rat serum 50%を使用した。FRET ratio値も上記と同様に得た。
結果を図３〜６に示す。
各時期でのATP量を計測できた。またcytosol内でATP濃度分布に違いが見られた。1細胞期において核周囲でのATP量は他の部位と比較して低い。4細胞期においては、割球の接合部付近でのATP量は他の部位と比較して低い。また、5.5日胚と比較して、6.5日胚から胚性外胚葉でのATP量が上昇している事が分かる。また、7.5日胚ではnodeにおけるATP量が亢進している。
マウス胚で計測したATP量とルシフェラーゼ法を用いて計測したATP量に相関性があった。
＜マウス成体での分布＞
マウス新生児・成体を気化麻酔下で開胸し、蛍光写真を得た。マウス脳は脱頭後に急性スライスを用いて約200nmのスライスを作成後に蛍光写真を得た。撮影は実体蛍光顕微鏡（ライカ社 M165 FC）を用いて、フィルターGFP3(励起波長ST470/40nm, 吸収波長 ET525/50nm), GFP/OFP(励起波長ET470/40, 吸収波長ET585/40)を利用して蛍光写真を得た。得られた蛍光画像はMetamorphにてFRET Ratio値を計算することでFRET ratio値を得た。結果を図７，８に示す。マウス成体内の臓器でATP量を測定するとルシフェラーゼ法での測定でATP量が高いと報告されている筋肉や心臓でATP値が高い事が分かった。
さらに、マウス成体（12ヶ月）脳の蛍光写真も得た（図９）。マウス脳内のATP量の計測を質量イメージングとGO-Ateam knock-in mouseとで比較したところ、GO-Ateam knock-in mouseを用いた方法は質量イメージング法よりも高解像度に経時的な変化を観察可能であることがわかった。
以上より、各臓器や脳の各部位でのATP量を計測できた。これまでLuciferase法やイメージ質量分析法で測定された値に近い値が得られた。また解像度は数百個の細胞毎で観察・計測されていたものが1細胞・subcelluarレベルでの解析が可能となった。
次に、小脳での形態的異常及びBDNFの局在の異常が報告されている自閉症モデルマウス(Caps2Δexon3, Sadakata, T. etal PNAS 2012)とGO-ATeam1またはGO-ATeam 2可視化マウスを掛け合わせ、ATP可視化自閉症モデルマウスを作製し、これを用いて、自閉症モデルマウスにおいてATPの量を観察した。小脳における蛍光像を野生型マウスと比較して図１０に示す。その結果、自閉症モデルマウスでは小脳でのATP量が亢進している事がわかる。また、海馬における蛍光像を野生型マウスと比較して図１１に示す。海馬ではCA1のMolecular layerにおいて、神経の細胞体ではATPが低く、その突起ではATPが高い事がわかってきたが、自閉症モデルマウスではこのATPの分布が消失している。
次に、GO-ATeam 2可視化マウスの心臓において、通常状態、低酸素状態、及び心筋梗塞状態におけるATPの経時変化を調べた。通常状態の心臓（図１２）では、拍動(約5回/秒)と共に心房・心室でのATP増減・分布の変動が観察される。様々な心疾患(心筋梗塞や心奇形など）を生理的な機能面から評価・定量できる可能性がある。
図１３の低酸素処理（人工呼吸器にて呼吸させている時に人工呼吸器を停める事により実施）時には通常と比較して心房でのATP量の増減が消失する。また心室では増減が低下することがわかった。
図１４の心筋梗塞(冠状動脈を結紮した後、5日後）を起こした心臓では梗塞部位の心室でのATPの低下が観察される。同時に梗塞部位以外での心室ではATP量が亢進している部位、通常より低下している部位が観察される。
次に、GO-ATeam 2可視化マウスに麻酔をかけ、人工呼吸器を取り付けた状態で、βブロッカーであるプロプラノロールを頚静脈から０．１μｇ／ｋｇ／分で注入して心拍数を低下させたときに、心臓の左右心室・左心房におけるATP量の経時変化を調べた。結果を図１５に示す。この結果から、心拍低下薬剤であるβブロッカーの効果を心拍低下前および低下後に心室、心房とに分けて効果を計測する事が可能であった。
また、GO-ATeam 2可視化マウスの各臓器を、95% 窒素と5% 二酸化炭素の混合液内に入れる事により低酸素状態を作り出して低酸素処理し、各臓器において、ATPの経時変化を調べ、正常状態と比較した。結果を図１６に示す。この結果から、全臓器の細胞活動の質をATP量の変化として計測する事が可能であることがわかった。
また、麻酔をかけ、人工呼吸器を取り付けたGO-ATeam 2可視化マウスの左前下行枝を結紮する事で急性虚血（心筋梗塞）を起こすよう処理し、各臓器において、ATPの経時変化を調べ、コントロール（疑似手術されたGO-ATeam 2可視化マウス）と比較した。結果を図１７に示す。０秒の矢印のタイミングで心筋梗塞を起こさせたところ、肝臓では２４分後、膵臓では３１分後、腎臓では２０分後、白色脂肪では直後にATP量の異常が見られた。この結果から、各臓器で心筋梗塞によるATP異常の起こるタイミングが異なることが分かり、心筋梗塞時に起こる各臓器のATP動態を計測する事により、各臓器・細胞の異常を計測する事が可能であることが分かった。つまり、全身で薬理・毒性評価などが可能である事を示している。
次に、GO-ATeam 2可視化マウスの心臓から心筋細胞を単離し、単離心筋細胞を用いて、電気パルスをかける事により収縮運動を起こした時のATPの経時変化を調べた。結果を図１８に示す。この結果から、成熟心筋細胞内のATP動態が測定できることが明らかになった。収縮期の最後にATP量が急増するが、これはミオシンからADPが細胞質へ放出され、クレアチンリン酸からADPにリン酸が渡された事を意味しており、その後、収縮と共に徐々に細胞質のATP量は低下するが、これはATPがミオシンに結合しはじめた事を示している。
また、図１９では、1秒間に1回から3回までの異なる電気刺激（1pps(pulse/second), 2pps, 3pps）をかける事により筋収縮運動を起こした時の単離心筋細胞の面積（点線）とATP量（実線）の変化を示す。1pps, 2ppsでは電気パルスに併せて変化するが、3ppsでは電気パルスについていけずにいる。このように、パルスの強さによって単離心筋細胞の面積とATP量は異なった変化を示し、単離心筋細胞を用いてATP動態を測定することで心エネルギーに対するドラッグスクリーニングなどにも応用可能であることがわかった。
図２０ではGO-ATeam 2可視化マウスの坐骨神経を電気刺激して筋収縮を起こさせた時の前頸骨筋におけるATP動態を調べた結果を示す。マウスを麻酔後に坐骨神経を剖出して電極を付け、毛皮を取り除く事で前頸骨筋を観察できるようにして蛍光実体顕微鏡システムにて観察した。電気刺激は30秒間で、その後、ATPの回復が観察された。この結果から、運動負荷に対するATP量の回復度と回復時間を詳細に調べる事ができ、ATP可視化マウスは運動・スポーツ器機開発や食品・筋肉増強剤開発などにも利用可能であることがわかった。
本発明のマウスは、医療や医薬開発、運動科学、基礎研究などの分野で有用である。

Claims (17)

  1. 融合タンパク質を発現する非ヒトトランスジェニック哺乳動物であって、
    前記融合タンパク質が、ＡＴＰ合成酵素のεサブユニットと、蛍光共鳴エネルギー移動のためのドナーおよびアクセプターとして２種類の蛍光タンパク質の組合せとを含み、
    前記非ヒトトランスジェニック哺乳動物が、前記非ヒトトランスジェニック哺乳動物の染色体上のＲＯＳＡ２６遺伝子座に挿入されている、前記融合タンパク質をコードするＤＮＡを含み、
    前記ＤＮＡがＣＡＧプロモーター配列と作動可能に連結されている、前記非ヒトトランスジェニック哺乳動物。
  2. 前記εサブユニットが、配列番号１、２または３に記載のアミノ酸配列を含む、あるいは、配列番号１、２または３に記載のアミノ酸配列において１〜５個のアミノ酸置換、挿入または欠失を含むバリアント配列を含む、請求項１に記載の非ヒトトランスジェニック哺乳動物。
  3. 前記２種類の蛍光タンパク質の一方が前記εサブユニットのアミノ末端側に結合され、他方が前記εサブユニットのカルボキシ末端側に結合されている、請求項１または２に記載の非ヒトトランスジェニック哺乳動物。
  4. 前記２種類の蛍光タンパク質が、シアンフルオレセントプロテイン（ＣＦＰ）、イエローフルオレセントプロテイン（ＹＦＰ）、ブルーフルオレセントプロテイン（ＢＦＰ）、グリーンフルオレセントプロテイン（ＧＦＰ）、レッドフルオレセントプロテイン（ＲＦＰ）およびオレンジフルオレセントプロテイン（ＯＦＰ）からなる群より選択される２種類の組合せである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の非ヒトトランスジェニック哺乳動物。
  5. マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ブタ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ヒツジ、ウシまたはマーモセットである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の非ヒトトランスジェニック哺乳動物。
  6. マウスである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の非ヒトトランスジェニック哺乳動物。
  7. 前記ＤＮＡが、Ｓｔｏｐ配列および少なくとも２つの標的配列を含み、
    前記Ｓｔｏｐ配列は前記標的配列で挟まれるように配置され、
    前記ＤＮＡにコードされた融合タンパク質は、前記標的配列を認識するリコンビナーゼにより前記Ｓｔｏｐ配列が除去された場合に発現する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の非ヒトトランスジェニック哺乳動物。
  8. 前記標的配列が、ｌｏｘＰ、ｌｏｘ７１、ｌｏｘ６６、ｌｏｘ５１１、ｌｏｘ２２７２、Ｖｌｏｘ（ＶＣｒｅ）、Ｓｌｏｘ（ＳＣｒｅ）またはＦＲＴ配列である、請求項７に記載の非ヒトトランスジェニック哺乳動物。
  9. 前記Ｓｔｏｐ配列がＳＶ４０ｐＡ配列を含む、請求項７または８に記載の非ヒトトランスジェニック哺乳動物。
  10. 疾患モデル動物である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の非ヒトトランスジェニック哺乳動物。
  11. 前記疾患モデル動物が、自閉症モデル動物、糖尿病モデル動物、癌モデル動物、感染症モデル動物または心疾患モデル動物である、請求項１０に記載の非ヒトトランスジェニック哺乳動物。
  12. 請求項１〜９のいずれか一項に記載の非ヒトトランスジェニック哺乳動物と疾患モデル動物とを交配させる工程を含む、非ヒトトランスジェニック哺乳動物の作出方法。
  13. 被験物質のＡＴＰレベルを改変する能力を評価する方法であって、
    請求項１〜１１のいずれか一項に記載の融合タンパク質を発現する非ヒトトランスジェニック哺乳動物または前記非ヒトトランスジェニック哺乳動物の細胞、組織もしくは器官と、被検物質とを接触させる工程；
    前記融合タンパク質に由来する蛍光を測定する工程；および
    測定した蛍光に基づいて、前記被験物質のＡＴＰレベルを改変する能力を評価する工程を含む、方法。
  14. 前記測定工程が、接触工程の前および後に蛍光を測定することを含み；および
    前記評価工程が、前記接触工程前に測定した蛍光と、前記接触工程後に測定した蛍光とを比較することを含む、請求項１３に記載の方法。
  15. ＡＴＰレベルの変化を測定する方法であって、
    請求項１〜１１のいずれか一項に記載の融合タンパク質を発現する非ヒトトランスジェニック哺乳動物またはその器官、組織、細胞もしくは細胞小器官における前記融合タンパク質に由来する蛍光を少なくとも１回測定する工程を含む、方法。
  16. 前記ＡＴＰレベルの変化が運動によって生じ、
    測定した蛍光に基づいて、ＡＴＰレベルの変化からエネルギー代謝を評価する工程をさらに含む、請求項１５に記載の方法。
  17. 前記ＡＴＰレベルの変化がＡＴＰレベルを改変し得る被験物質によって生じ、
    測定した蛍光に基づいて、ＡＴＰレベルの変化から前記被検物質のＡＴＰレベルを改変する能力を評価する工程をさらに含む、請求項１５に記載の方法。
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