JP6557461B2 - 顆粒状簡易平板培地組成物 - Google Patents

Description

本発明は、簡易な平板培地組成物に関する。

食品、環境、病院などにおいて微生物を検出、同定するにあたり、従来から平板塗抹法、混釈法、液体培地法などによる微生物の培養が行なわれている。これらの方法における培地の調製は、加温溶解、滅菌、保温などの温度管理を厳密に行わなければならず、熟練と時間が必要であった。

かかる観点から、微生物検査の簡易化が要望され、吸水性シートに栄養成分、ゲル化剤等を予め担持させたシート状簡易培地が開発され、使用されている（特許文献１〜６）。

特開平９−１９２８２号公報 特開２０００−３２５０７２号公報 特開昭５７−５０２２００号公報 特開平６−１８１７４１号公報 特開２００１−１６９７７２号公報 特開２０１３−２３６５５３号公報

しかしながら、従来の簡易培地においては、１ｍＬ程度の少量の試料を３５℃で２４〜４８時間培養するには水の蒸発を防ぐために特殊な容器やフィルムが必要であり、製造方法も複雑であった。一方、生培地は保存可能期間が比較的短かく、混釈培養のように１ｍＬ程度の少量の試料を検査できないという欠点があった。
従って、本発明の課題は、短時間かつ簡便な操作で、少量の試料でも長期間培養可能な培地を形成できる手段を提供することにある。

そこで本発明者は、水に添加するだけでゲル化させて平板培地を形成させる手段について検討してきたが、ゲル化剤が均一に溶解する前に一部でゲル化が生じたり、ゲル化剤を含む粉体がダマになって均一なゲルが形成できないことが判明した。そこで、さらに検討したところ、ゲル化剤及び／又は微生物栄養成分を含有する組成物を一定の粒子径を有する顆粒状とし、かつ含有するゲル化剤の量を特定の範囲とすれば、水に添加したときゲル化剤がダマにならず、簡便な混合操作で均一な平板ゲル培地が形成できるため、特殊な容器や特殊なフィルムを使用する必要がなくなることを見出し、本発明を完成した。

すなわち、本発明は、次の〔１〕〜〔７〕を提供するものである。

〔１〕（Ａ）使用時濃度が３０〜１００ｇ／Ｌになる量の粒子径１５０μｍ以上１０００μｍ以下のゲル化剤顆粒状物と（Ｂ）微生物栄養成分を含有する顆粒状組成物であって、当該顆粒状組成物を水又は水溶液に添加し混合してゲル状培地を形成して使用する顆粒状簡易平板培地組成物。
〔２〕顆粒状組成物が、粒子径１５０μｍ以上１０００μｍ以下のゲル化剤顆粒状物と、粒子径１μｍ以上１０００μｍ以下の微生物栄養成分含有粉粒状物との混合物である〔１〕記載の顆粒状簡易平板培地組成物。
〔３〕顆粒状組成物が、ゲル化剤と微生物栄養成分含有組成物との混合物の顆粒化物であって、粒子径１５０μｍ以上１０００μｍ以下の顆粒化物である〔１〕記載の顆粒状簡易平板培地組成物。
〔４〕さらに、（Ｃ）微生物検出用成分を含有する〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の顆粒状簡易平板培地組成物。
〔５〕水又は水溶液に添加後１０秒以内に混合してゲル状培地を形成して使用するものである〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載の顆粒状簡易平板培地組成物。
〔６〕（Ａ）ゲル化剤と（Ｂ）微生物栄養成分の含有質量比（Ａ／Ｂ）が、０．１〜５０である〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載の顆粒状簡易平板培地組成物。
〔７〕水又は水溶液の使用量が１〜２５０ｍＬである〔１〕〜〔６〕のいずれかに記載の顆粒状簡易平板培地組成物。

本発明の顆粒状組成物を用いれば、微生物検査を行おうとする現場で、組成物を水に添加して短時間混合するだけで均一な平板ゲル培地が形成でき、少量の試料接種により長時間の培養が可能になる。また、形成された平板培地上にシートを載置すれば画線培養も可能である。

本発明簡易培地組成物の操作手順の例を示す。

本発明の顆粒状簡易平板培地組成物は、（Ａ）使用時濃度が３０〜１００ｇ／Ｌになる量の粒子径１５０μｍ以上１０００μｍ以下のゲル化剤顆粒状物と、（Ｂ）微生物栄養成分を含有する顆粒状組成物であって、当該顆粒状組成物を検査試料を含む水又は水溶液に添加し混合してゲル状培地を形成して使用するものである。

前記顆粒状組成物は、(Ａ)使用時濃度が３０〜１００ｇ／Ｌになる量のゲル化剤と、（Ｂ）微生物栄養成分を含有し、かつ少なくともゲル化剤又は全体の粒子径が１５０μｍ以上１０００μｍ以下であればよく、（１）粒子径１５０μｍ以上１０００μｍ以下のゲル化剤顆粒状物と、粒子径１μｍ以上１０００μｍ以下の微生物栄養成分含有粉粒状物との混合物である形態、又は（２）ゲル化剤と微生物栄養成分含有組成物との混合物の顆粒化物であって、粒子径１５０μｍ以上１０００μｍ以下の顆粒化物である形態のいずれでもよい。

本発明に用いられる（Ａ）ゲル化剤としては、水溶性ゲル化剤、すなわち水に容易に分散してゲル化する高分子が挙げられ、具体的にはペクチン、グアーガム、キサンタンガム、タマリンドガム、ローカストビーンガム、ジェランガム、アラビアガム、タラガム、カラギーナン、カルボキシメチルセルロース等が挙げられる。このうち、水に対する分散性、ゲルの安定性等の点から、ペクチン、グアーガム、キサンタンガムがより好ましく、キサンタンガムが特に好ましい。

本発明に用いる（Ａ）ゲル化剤は、顆粒状物の混合物の形態（１）の場合、水に速やかに分散し、容易に均一なゲルを形成させる点から、粒子径１５０μｍ以上１０００μｍ以下の顆粒状物であることが重要である。粒子径が１５０μｍ未満の粉末状ゲル化剤を用いた場合には、水への分散性が悪く、ダマになったり、均一にゲル化せず、局所的にゲル化するため、簡便な操作でゲル状培地が得られない。また、粒子径が１０００μｍを超えると、凸凹の大きな固まりのまま残存することとなる。
好ましい顆粒状物の粒子径は１５０μｍ以上８５０μｍ以下であり、より好ましくは１８０μｍ以上８５０μｍ以下である。

本発明の組成物における（Ａ）ゲル化剤の使用量は、均一なゲルの形成性、ゲル強度の点から、使用時濃度（形成された培地中の濃度）が３０〜１００ｇ／Ｌとなる量が好ましく、３０〜８０ｇ／Ｌとなる量がより好ましく、４０〜８０ｇ／Ｌとなる量がさらに好ましく、５０〜６０ｇ／Ｌとなる量がさらに好ましい。

本発明に使用される（Ｂ）微生物栄養成分としては、一般的な水溶性の栄養培地成分であればよく、例えばペプトン、大豆ペプトン、酵母エキス、肉エキス、ブドウ糖、無機塩等が挙げられる。無機塩としては、リン酸塩、塩化ナトリウム等が挙げられる。
（Ｂ）微生物栄養成分は、顆粒状物の混合物の形態（１）の場合、水に速やかに分散し、容易に均一なゲルを形成させる点から、粒子径１μｍ以上１０００μｍ以下の粉粒状物が好ましい。粒子径が１μｍ未満では水への分散性が低下し、又は１０００μｍを超えると凸凹の大きな固まりのまま残存することとなる。好ましい粉粒状物の粒子径は１μｍ以上８５０μｍ以下であり、より好ましくは１μｍ以上８５０μｍ以下である。
（Ｂ）微生物栄養成分の含有量は、特に制限されないが、使用時濃度（形成された培地中の濃度）として、１〜１５０ｇ／Ｌとなる量が好ましく、３〜１００ｇ／Ｌとなる量がさらに好ましい。

（Ａ）ゲル化剤と（Ｂ）微生物栄養成分の含有質量比（Ａ／Ｂ）は、（Ａ）ゲル化剤の水分散性を向上させる点から、０．１〜５０が好ましく、１〜１０がより好ましく、１．５〜８がさらに好ましく、１．５〜５がさらに好ましい。（Ａ／Ｂ）をこれらの範囲とすることにより、（Ａ）ゲル化剤単独の場合に比べて、（Ａ）ゲル化剤の水分散性が向上する。

また、本発明の組成物には、必要に応じて、（Ｃ）微生物検出用成分を含有させることができる。微生物検出用成分としては、抗生物質、合成抗菌剤等の抗菌剤、発色剤、界面活性剤、無機塩等が挙げられる。抗菌剤としては、検出すべき微生物は生育し、他の微生物の生育は抑制するものが選択される。発色剤としては、微生物が産生する酵素により発色する発色性基質、色素、酸化還元指示薬等が挙げられる。界面活性剤としては、ドデシル硫酸塩等、タウロコール酸、胆汁酸塩、デオキシコール酸塩が挙げられる。無機塩としては、亜セレン酸塩、亜テルル酸塩、亜硫酸塩、窒化ナトリウム等が挙げられる。なお、これらの成分も、顆粒状物の混合物の形態（１）の場合、粒子径１μｍ以上１０００μｍ以下、より好ましくは１μｍ以上８５０μｍ以下、さらに好ましくは１μｍ以上８５０μｍ以下であるのが好ましい。

本発明の顆粒状組成物は、水に速やかに分散し、容易に均一なゲルを形成させる点から、少なくともゲル化剤が、あるいは全体顆粒が粒子径１５０μｍ以上１０００μｍ以下の顆粒状物であることが重要である。粒子径が１５０μｍ未満の場合には、水への分散性が悪く、ダマになったり、均一にゲル化せず、局所的にゲル化するため、簡便な操作でゲル状培地が得られない。また、粒子径が１０００μｍを超えると、凸凹の大きな固まりのまま残存することとなる。
好ましい顆粒状物の粒子径は１５０μｍ以上８５０μｍ以下であり、より好ましくは１８０μｍ以上８５０μｍ以下である。

なお、本発明の顆粒状組成物のゲル化剤あるいは全体顆粒においては、１５０μｍ以上１０００μｍ以下の粒子径を有する顆粒状物が含まれていればよいので、粒子径１５０μｍ未満の粒子の含有を妨げるものではない。しかし、１５０μｍ未満及び１０００μｍ超の粒子の含有量は、水への分散性、均一なゲルの形成性の点から、顆粒状組成物全体中の２０質量％以下であるのが好ましく、１０質量％以下であるのがより好ましい。

また、本発明の顆粒状組成物は顆粒状物であることが水分散性及び均一なゲル形成性の点で重要である。当該顆粒状物は、かさ密度が小さい造粒物がより好ましく、かさ密度が８００ｋｇ／ｍ³以下であるのが好ましく、３００ｋｇ／ｍ³以上８００ｋｇ／ｍ³以下であるのがさらに好ましい。

本発明の顆粒状組成物は、顆粒状物の混合物の形態（１）の場合は、前記の一定の粒子径の顆粒状ゲル化剤と（Ｂ）成分の粉粒状物を混合することにより製造できる。一方、前記顆粒化物の形態（２）の場合は、ゲル化剤と微生物栄養成分含有組成物とを混合して、通常の顆粒化手段により顆粒化すればよい。ここで、前記（Ｃ）微生物検出用成分等の任意成分は、（Ｂ）微生物栄養成分含有組成物中に添加するのが好ましい。

本発明において、顆粒又は顆粒状物とは、粒子の造粒物又は粒子の凝集物であればよく、結合剤なしに造粒されたものを含む。従って顆粒化方法にも、結合剤なしに造粒する方法が含まれる。好ましい顆粒化方法としては、必要に応じてポリビニルピロリドン等の結合剤を混合し、撹拌造粒、流動層造粒、押し出し造粒等を行えばよい。
また、本発明の顆粒又は顆粒状物は、水に速やかに分散し、容易に均一なゲルを形成するものであれば、その製法や成分を問わないが、例えば低水分で造粒した顆粒、マンニトール、エリスリトール等の糖アルコールを配合して造粒した多孔質顆粒、糖やアルコール等を混合した液を乾燥した多孔質顆粒、クロスポビドン、カルメロースカルシウム、クロスカルメロースナトリウム、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、結晶セルロース等の崩壊剤を配合して得られた顆粒等が挙げられる。
なお、粒子径の調整は、ふるいを用いればよい。

本発明の顆粒状組成物は、γ線などの滅菌後、水又は水溶液に添加し混合してゲル状培地を形成して使用される。

顆粒状組成物を添加する水又は水溶液は、平板培養に適した容器に入れておくのが好ましい。当該容器としては、培地用のシャーレであればよい。当該容器に使用する水は滅菌精製水であればよい。また、水溶液としては、緩衝液等が挙げられる。

本発明の組成物は簡易平板培地の形成に使用されるものであることから、使用される水又は水溶液の量は１ｍＬ〜２５０ｍＬ程度が好ましく、マルチウェルプレートでは１〜２ｍＬ、直径５ｃｍシャーレでは５ｍＬ、直径９ｃｍシャーレでは１５ｍＬ程度が好ましい。

容器中の水又は水溶液に本発明の顆粒状組成物を添加し、すぐに混合して、組成物を水又は水溶液中に分散溶解させて、ゲル状培地を形成する。ゲル化剤を速やかに水中に分散させる点から、組成物添加後は、すぐに、好ましくは１０秒以内、より好ましくは５秒以内に混合、例えば容器を振動させて混合するのが好ましい。本発明の組成物が水に均一に分散した後、数分間放置すれば均一な平板ゲル培地が形成される。

本発明の滅菌済み顆粒状組成物は微生物測定に用いる混釈培養用培地として使用できるが、試料を塗抹して使用する場合には、形成された平板培地上にシートを載置し、そのシートの上から試料を塗抹して培養すればよい。

容器への水の注入から、組成物の添加、混釈培養まで、また必要に応じてシートを載置して塗抹培養までの手順の例を図１に示す。

本発明の顆粒状組成物を用いれば、従来複雑な操作が必要であった培地が、簡便な操作で数分間で作製できる。
従って、検査センター、食品メーカー、消毒メーカー、水産メーカー等において、緊急の検査が必要になった場合、数分間で混釈培養または平板ゲル培地を作製し、速やかな微生物検査が可能となる。

次に実施例を挙げて本発明を詳細に説明する。

実施例１
（１）粒子径が１０μｍのものが多いキサンタンガム粉体と培地成分（表１記載の培地：Ｅ．ｃｏｌｉ検出用ブルーライト培地）を混合した顆粒状組成物を用いて、５φｃｍシャーレ中の５ｍＬの水に対する分散性を検討した。分散性は、図１のように、組成物を水に添加後軽く振動させて検討した。その結果、ダマが生じ、均一なゲルが形成できなかった。

（２）次に、キサンタンガム顆粒の粒子径を変化させて、キサンタンガム顆粒（０．２５ｇ／５ｍＬ）及び培地成分（表１）（０．０８７ｇ／５ｍＬ）の混合物の水への分散性（均一なゲル形成性）を検討した。
その結果、表２及び表３に示すように、キサンタンガム顆粒の粒子径が大きい程、水への分散性がよく、均一なゲルが形成できることが判明した。

実施例２
キサンタンガムの顆粒を篩を用いて分級し、粒子径の相違による水への分散性、ゲル形成法を検討した。キサンタンガム顆粒単独（０．２５ｇ／５ｍＬ）の水への分散性、ゲル形成性、及びキサンタンガム顆粒（０．２５ｇ／５ｍＬ）と培地成分（（表１）のブルーライト培地）（０．０８７ｇ／５ｍＬ）との混合物の水への分散性、ゲル形成性を検討した。検討方法は、実施例１（１）と同様にして行った。

その結果、表４に示すように、キサンタンガム顆粒単独では、その粒子径が２１２μｍ以上で水への分散性、均一なゲル形成性が良好であった。また、キサンタンガム顆粒に培地成分粒子を混合すると、水への分散性が顕著に向上し、キサンタンガム顆粒の粒子径１５０μｍ以上で水分散性及び均一なゲル形成性が良好となった。

実施例３
粒子径１８０μｍ以上１０００以下のキサンタンガム顆粒と培地成分（ブルーライト培地（表１））とを混合し、その混合比率を変化させて、水分散性、ゲル形成性及びコロニー形成を検討した。

その結果、表５に示すように、キサンタンガム顆粒と培地成分顆粒との含有比が２．８〜３．５の範囲で、水への分散性、均一なゲル形成性及びコロニー形成性が良好であった。

なお、キサンタンガム顆粒以外のゲル化剤の混合は、良好なゲル化剤と培地成分との含有比はこの範囲でなく、１．５〜５であった。

実施例４
本発明の簡易培地〔キサンタンガム顆粒（１８０〜８５０μｍ）０．２５ｇ／Ｌ＋ブルーライト培地１７．４ｇ／Ｌ〕と、標準寒天培地（表６）との混合物をγ線滅菌後に用い、表７記載の供試菌株の発育性を評価した。本発明の簡易培地は、実施例１（１）と同様の操作で培地を作製した。

その結果、表８及び表９に示すように、本発明の簡易培地は、標準寒天培地と同様の菌の発育性が確認できた。

実施例５（混合物の顆粒化）
表１のブルーライト培地組成１７．４ｇ／Ｌにキサンタンガム顆粒（１８０〜８５０μｍ）５０．０ｇ／Ｌを混合し、少量のポリビニルピロリドン、エタノール及び水を加えて、流動層装置Glatt-powrex ＷＳＧ−５型を用いて培地の顆粒化を行った。
得られた顆粒の粒子径と水への分散性との関係を検討した。
その結果、表１０に示すように、１５０μｍ以上の顆粒の水への分散性が良好であった。

また、１５０μｍ以上の顆粒に１５０μｍ未満の顆粒を添加して水への分散性を検討したところ、１０質量％以下の添加では水への分散性はあまり低下しなかった。

実施例６
顆粒状組成物（実施例５）０．３３７ｇを直径５ｃｍのシャーレ中の水５ｍＬに添加した後、手で軽く揺すって溶解させた。顆粒を添加後、振動させるまでの時間と、分散性との関係を検討した。
その結果、顆粒添加後１０秒以内、好ましくは５秒以内であれば水への分散性が良好であった（表１１）。

Claims (7)

1. （Ａ）顆粒状組成物を容器中の水又は水溶液に添加し混合しゲル状培地を形成して使用する際のゲル化剤の濃度が５０〜１００ｇ／Ｌになる量の粒子径１５０μｍ以上１０００μｍ以下のゲル化剤顆粒状物と（Ｂ）微生物栄養成分を含有する顆粒状組成物であって、
   当該顆粒状組成物を容器中の水又は水溶液に添加し混合してゲル状培地を形成して使用する顆粒状簡易平板培地組成物。
2. 顆粒状組成物が、粒子径１５０μｍ以上１０００μｍ以下のゲル化剤顆粒状物と、粒子径１μｍ以上１０００μｍ以下の微生物栄養成分含有粉粒状物との混合物である請求項１記載の顆粒状簡易平板培地組成物。
3. 顆粒状組成物が、ゲル化剤と微生物栄養成分含有組成物との混合物の顆粒化物であって、粒子径１５０μｍ以上１０００μｍ以下の顆粒化物である請求項１記載の顆粒状簡易平板培地組成物。
4. さらに、（Ｃ）微生物検出用成分を含有する請求項１〜３のいずれかに記載の顆粒状簡易平板培地組成物。
5. 水又は水溶液に添加後１０秒以内に混合してゲル状培地を形成して使用するものである請求項１〜４のいずれかに記載の顆粒状簡易平板培地組成物。
6. （Ａ）ゲル化剤と（Ｂ）微生物栄養成分の含有質量比（Ａ／Ｂ）が、０．１〜５０である請求項１〜５のいずれかに記載の顆粒状簡易平板培地組成物。
7. 水又は水溶液の使用量が１〜２５０ｍＬである請求項１〜６のいずれかに記載の顆粒状簡易平板培地組成物。