JP6542841B2

JP6542841B2 - 汚水処理

Info

Publication number: JP6542841B2
Application number: JP2017122476A
Authority: JP
Inventors: タタルコ，マシュー
Original assignee: ノボザイムスバイオロジカルズ，インコーポレイティド
Priority date: 2007-04-12
Filing date: 2017-06-22
Publication date: 2019-07-10
Anticipated expiration: 2028-04-11
Also published as: CN104478092B; CN104478093B; CN102863085B; US7988856B2; CN104478092A; WO2008128032A3; WO2008128032A2; JP2010523330A; JP2017169591A; EP2698353B1; CN101687673B; CN101687673A; JP6166238B2; US20080251450A1; EP2698353A2; CA2682864A1; US20100213122A1; JP2015051432A; EP2698353A3; US7731851B2

Description

発明の分野
本発明は、一般的に汚水処理、及びにおいを制御し、化学的酸素要求量（ＣＯＤ）を減少させ、特に汚水に含まれる化合物を分解する方法に関する。

寄託された材料についての相互参照
本発明は、寄託微生物に関する。寄託微生物の内容は、参考として本明細書に十分に援用される。

発明の背景
関連技術の説明
汚水中の主な化学物質は、窒素、リン、脂肪、油及びグリースである。

不愉快なにおいは、汚水に典型的に存在する様々な物質によって起こる。これらは、イオウ、及び硫化水素酸、硫酸、特にメチル及びジメチルメルカプタン及びジメチルスルフィド（ＤＭＤＳ）を含むメルカプタン（Ｒ−ＳＨ）を含む数個のイオウ含有化合物；多数の有機酸、例えばプロピオン酸、酢酸、酪酸、イソ吉草酸；アンモニア：尿素；並びに様々なテルペン、例えばカレン、ピネン、リモネン、を含む。これらの物質は、嫌気的条件下で顕著なにおいを最も頻繁に引き起こす。

オクテル・ガムレン（Octel Gamlen）は、ムコル・ヒエマリス（Mucor hiemalis）、トリコデルマ・アトロビリデ（Trichoderma atroviride）、パエシロマイセス・バリオチイ（Paecitomyces variottii）及びアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）の各株を含む汚水処理組成物を販売している。

米国特許第７，１６０，４５８号明細書は、細菌種を加えることを含む、ケロシン脱硫植物から水を精製する方法を開示している。

本発明の目的は、改善された汚水処理組成物を提供することである。

発明の概要
本発明は、ムコル・ラセモサス（Mucor racemosus）、パエシロマイセス・リラシヌス（Paecitomyces lilacinus）、アスペルギルス・アスタス（Aspergillus ustus）又はトリコデルマ・インハマタム（Trichoderma inhamatum）（無性世代は、ヒポクレア・ゲラチノサ（Hypocrea gelatinosa））の株を含む、汚水処理組成物に関する。

別の実施態様では、本発明は、ムコル・ラセモサス（Mucor racemosus）、パエシロマイセス・リラシヌス（Paecitomyces lilacinus）、アスペルギルス・アスタス（Aspergillus ustus）又はトリコデルマ・インハマタム（Trichoderma inhamatum）（無性世代は、ヒポクレア・ゲラチノサ（Hypocrea gelatinosa））の株を汚水に添加することを含む、汚水の処理方法に関する。

本発明はまた、汚水中に含まれる化合物を分解する方法、及び１以上の微生物株の生物的に純粋な培養物に関する。

発明の詳細な説明
汚水処理組成物
本発明は、ムコル・ラセモサス（Mucor racemosus）、パエシロマイセス・リラシヌス（Paecitomyces lilacinus）、アスペルギルス・アスタス（Aspergillus ustus）又はトリコデルマ・インハマタム（Trichoderma inhamatum）の株を含む汚水処理組成物、ムコル・ラセモサス、パエシロマイセス・リラシヌス、アスペルギルス・アスタス又はトリコデルマ・インハマタムの株を汚水に添加することを含む汚水処理方法に関する。

ムコル・ラセモサス、パエシロマイセス・リラシヌス、アスペルギルス・アスタス又はトリコデルマ・インハマタムの株は、NRRL USDA-ARSパテント・カルチャー・コレクション1815 N. University Street, Peoria, Illinois 61604において、ブタペスト条約の下に特許目的で寄託された。寄託は、Novozymes Biologicals Inc.によって２００７年３月２０日になされ、以下の寄託番号を与えられた。
ムコル・ラセモサス NRRL 50031
パエシロマイセス・リラシヌス NRRL 50032
アスペルギルス・アスタス NRRL 50033
トリコデルマ・インハマタム NRRL 50034

好ましい実施態様では、該汚水組成物は、ムコル・ラセモサス株を含む。

別の好ましい実施態様では、該汚水組成物は、パエシロマイセス・リラシヌス株を含む。

別の好ましい実施態様では、該汚水組成物は、アスペルギルス・アスタス株を含む。

別の好ましい実施態様では、該汚水組成物は、トリコデルマ・インハマタム株を含む。

別の好ましい実施態様では、該汚水組成物は、ムコル・ラセモサス株及びパエシロマイセス・リラシヌス株を含む。

別の好ましい実施態様では、該汚水組成物は、ムコル・ラセモサス株及びアスペルギルス・アスタス株を含む。

別の好ましい実施態様では、該汚水組成物は、ムコル・ラセモサス株及びトリコデルマ・インハマタム株を含む。

別の好ましい実施態様では、該汚水組成物は、パエシロマイセス・リラシヌス株及びアスペルギルス・アスタス株を含む。

別の好ましい実施態様では、該汚水組成物は、パエシロマイセス・リラシヌス株及びトリコデルマ・インハマタム株を含む。

別の好ましい実施態様では、該汚水組成物は、アスペルギルス・アスタス株及びトリコデルマ・インハマタム株を含む。

別の好ましい実施態様では、該汚水組成物は、ムコル・ラセモサス株、パエシロマイセス・リラシヌス株及びアスペルギルス・アスタス株を含む。

別の好ましい実施態様では、該汚水組成物は、ムコル・ラセモサス株、パエシロマイセス・リラシヌス株及びトリコデルマ・インハマタム株を含む。

別の好ましい実施態様では、該汚水組成物は、パエシロマイセス・リラシヌス株、アスペルギルス・アスタス株及びトリコデルマ・インハマタム株を含む。

別の好ましい実施態様では、該汚水組成物は、ムコル・ラセモサス株、パエシロマイセス・リラシヌス株、アスペルギルス・アスタス株及びトリコデルマ・インハマタム株を含む。

該株は、野生型株でも又は変異型株でもよい。

好ましい実施態様では、本組成物は、１ｘ１０^２〜１ｘ１０^９コロニー形成単位（ＣＦＵ）／ｍＬ、好ましくは１ｘ１０^４〜１ｘ１０^９コロニー形成単位（ＣＦＵ）／ｍＬの濃度で上記微生物を含む。本組成物が１超の微生物を含むとき、かかる微生物は、１ｘ１０^４〜０．５ｘ１０^９コロニー形成単位（ＣＦＵ）／ｍＬの濃度で存在する。

別の好ましい実施態様では、本組成物は、上記微生物（複数）のための栄養物を更に含む。例えば、栄養物は、無機リン化合物、特に溶解性リン酸塩又はオルトリン酸塩、好ましくはリン酸、モノ、ジ、又はトリリン酸塩、又はリン酸二アンモニムでよい。加えて、栄養素は、アンモニア（ＮＨ_３）又はアンモニウム（ＮＨ_４ ^＋）塩、好ましくは無水アンモニア、アンモニア−水溶液、硝酸アンモニウム又はリン酸二アンモニムである。栄養素は、微量元素、好ましくはアルミニウム、アンチモン、バリウム、ホウ素、カルシウム、コバルト、銅、鉄、鉛、マグネシウム、マンガン、モリブデン、ニッケル、ストロンチウム、チタン、スズ、亜鉛及び／又はジルコニウムでもよい。

別の好ましい実施態様では、本組成物は、アラビナン、アラビノース、セルロース、フルクトース、ガラクタン、ガラクトース、グルカン、グルコース、マンナン、マンノース、スクロース、キシラン及びキシロース、又は木質線維、木材パルプ、あるいは他のパルプ副産物からなる群より選ばれる糖類を更に含む。好ましくは、本組成物は、前記糖類が単糖類である時に１００〜４００ｍｇ／Ｌの濃度の糖類、及び前記糖類が多糖類である時に８，０００〜１５，０００ｍｇ／Ｌの濃度の糖類を含む。

本発明の方法に供せられる汚水は、窒素又はリンの任意の追加源が添加される必要なしに培養のための十分な栄養物、例えば窒素及びリンを含むことがある。しかし、汚水がこれらの成分を不足している場合には、栄養物が汚水に添加されることがある。約１ｐｐｍ以上／１００ＢＯＤ_５の汚水中のリンレベル達成するために、例えば、必要ならば、リン源、例えば無機リン化合物、特に溶解性リン酸塩又はオルトリン酸塩、好ましくはリン酸、モノ、ジ、又はトリリン酸塩、又はリン酸二アンモニムの添加によって、リンが補充されてよい。同様に、窒素源、例えばアンモニア（ＮＨ_３）、尿素、又はアンモニウム塩、好ましくは無水アンモニア、アンモニア水溶液、硝酸アンモニウム又はリン酸二アンモニムは、少なくとも約１０ｐｐｍ以上／１００ＢＯＤ_５の栄養できる窒素量を達成するために添加され得る。

別の実施態様では、栄養素は、微量元素、好ましくはアルミニウム、アンチモン、バリウム、ホウ素、カルシウム、コバルト、銅、鉄、鉛、マグネシウム、マンガン、モリブデン、スズ、又は亜鉛を含む。

汚水処理方法
本発明はまた、本発明の汚水処理組成物で汚水を処理するための方法に関する。

本発明の汚水処理方法は、ブタン酸、2-メチルフェノール、ヘプタン酸、ノナン酸、5-ブロモチオフェン-2-カルボキサミド、イソキサゾリデン、及び2-メチル-1-ニトロプロパンのような汚水中に含まれる化合物のにおいを減少させ、及び分解することがある。

本発明の汚水処理組成物によって分解されることがある他のにおい発生物質は、硫化水素、トリメチルアミン、メタンチオール、ブタン酸、3-メチルブタン酸、ペンタン酸、4-メチルフェノール、ジメチルスルフィド、ジメチルジスルフィド、プロパン酸、酢酸、2-メチルプロパン酸、インドール、及び3-メチル-1H-インドールである。

汚水処理組成物は、汚水の化学的酸素要求量（ＣＯＤ）を減少させることもある。

本発明で使用される株は、バッチ式、半連続的又は連続的な処理のいずれかを用いて、例えばパルプ製紙工場（pulp and paper mill）由来の汚水中で培養され得、そして、汚水中に存在する化合物を分解し及び該化合物を除き、あるいは、該化合物を、生物学的汚水処理装置において通常見出される他の生物体によって分解されることができる成分に分解するために十分な時間、培養される。

本発明の微生物株は、イオン交換樹脂処理装置、散水ろ床処理装置、炭素吸収装置、活性汚泥処理装置、屋外の潟湖又はプール等で採用され得る。

基本的に、必要とされることは、パルプ製紙工場由来の汚水との接触の状態に置かれるべき微生物（複数）に関する。汚水中に存在する物質を分解するために、汚水は、１５℃〜４５℃、好ましくは２０℃〜４５℃、より好ましくは１８℃〜３７℃、及び最も好ましくは３０℃〜３５℃の温度で生物体（複数）で処理される。望ましくは、ｐＨは、１〜１０、このましくは４．５〜８．５の範囲で維持される。ｐＨは、該ｐＨ範囲を達成するために、装置を監視することによって及び好適なｐＨ調整物質の添加によって調整され得る。

一般的に、処理は、所望の化合物のにおいの減少又は該化合物の分解を達成するために十分な時間行われ、一般的に、約２４時間〜約８週以上である。但し、これは、培養温度、処理される培養液の濃度及び量、及び他の因子に依拠することになる。好ましい実施態様では、汚水は、２時間〜１４日間、好ましくは２時間〜５日間、微生物（複数）で処理される。

処理は、好気性又は嫌気性条件下で行われる。好気性条件が使用される場合には、処理は０．５〜０．７ミリグラム／リットルの溶解された酸素濃度で行われる。これらの条件は、当該分野で慣用の、及び採用される処理装置設計に好適な、任意の方法で簡便に達成される。例えば、空気は該装置にバブルされ、該装置は、攪拌され、滴下装置が採用される、などである。好気性処理では、処理は、−２００ｍＶ〜２００ｍＶ、好ましくは０ｍＶ〜２００ｍＶの酸化還元電位で行われる。嫌気性条件が使用される場合には、処理は、−５５０ｍＶ〜−２００ｍＶの酸化還元電位で行われる。

通常の好気性測定は、汚水中の着色剤及び生物化学的酸素要求量（ＢＯＤ）を減少させるために画される。好気的技術は、滴下フィルタ、活性汚泥、回転生物学的接触器、酸化溝、連続バッチ反応器及び制御された湿地さえも含む。

嫌気性又は嫌気的に扱いやすい種類の技術も汚水を処理するために使用され得る。現在利用できる嫌気性技術は、連続フロー攪拌タンク反応器、接触反応器、上流汚泥ブランケット、嫌気性フィルタ（上流及び顆粒）、拡大床又は流動床、及び嫌気性処理における酸形成相及びメタン形成相を分離する２段階の装置を含む高速装置である。

好気性及び嫌気性処理は、処理装置に組み合わされる。嫌気性処理は、高濃度流中の有機物質を除くために使用され、そして、好気性処理は、より低濃度流に、又は汚水から残余の有機物質及び栄養物質を更に除くために仕上げステップとして使用されてよい。

好ましい実施態様では、汚水処理は、微生物（複数）による処理の、１〜５サイクル、好ましくは１サイクル又は２サイクルを含む。好ましくは、各サイクルは、好気性及び嫌気性処理を変化させることを含む。より好ましくは、第１サイクルは、好気性条件下で行われる。好ましい実施態様では、サイクルは、連続バッチ反応器中で行われる。別の好ましい実施態様では、該処理は、サイクル間でアルカリを添加することを更に含む。

好ましくは、汚水は、きつい又は濃縮したパルプ製紙工場汚水、薄い黒色液、酸段階での漂白植物濾液、又はアルカリ段階での漂白植物濾液のような、パルプ製紙工場汚水である。処理されることがある汚水の他の種類は、洗浄及び洗濯汚水、食品加工汚水、及び工業処理水、例えば植物油流出物又は繊維含有副産物を有する廃棄物質、を含む。

この処理はまた、重力浄化器、ガス浮遊ユニットを含む汚水処理又は膜処理のような濾過処理において一般的に使用される化学着色分離処理からの廃棄を処理するために使用され得る。

別の好ましい実施態様では、固体廃棄物の液体廃棄物に対する比は、１：５０〜１０：１、好ましくは１：１０〜５：１である。

別の好ましい実施態様では、汚水は、嫌気性条件下、特にパックされた生物学的反応器又はカラム、人工湿地、又は嫌気性連続バッチ反応器（ＡｎＳＲ）中で、木繊維を通過する。あるいは、汚水は、パルプ製紙工場処理由来の廃棄木繊維、石灰及び細粒炭を含む集合体を通過する。好ましくは、汚水は、セルロース繊維、プラスチック、粉末又はセラミック媒体と共に木繊維を通過する。汚水の割合は、好ましくは、０．０５〜１リットル汚水／日／ｋｇの湿った木繊維量である。

最も好ましい実施態様では、木繊維は、以下のステップ：（ａ）連続バッチ反応器、（ｂ）任意の潟湖又は安定盆地、（ｃ）活性汚泥系、（ｄ）凝固及び凝集、次いで沈殿、及び（ｅ）濾過、の１以上を含み、嫌気性条件下で生物学的媒体として使用される。汚水は、電子受容体、特にクロロメタン、クロロホルム、クロロリグニン、クロロメタン、クロロフェノール、フミン酸塩、リグニン、キニーネ、又はスルホン化リグニンの存在下で、微生物（複数）で処理されてよい。

本発明の微生物は、単独で、又は汚水を処理するための慣用的手段、例えば化学的（例えば、ミョウバン、鉄質、石灰又は高分子電解質）、生物学的（例えば、白色の腐れ真菌）及び物理的処理（例えば、限界濾過、イオン交換及び炭素吸収）、と組合わせて採用され得る。

上記の方法では、かかる汚水流に存在する有機化合物は、沈殿、塩素化等の任意の追加の慣用的処理後の川及び小川への排出のために好適な処理汚水を提供するために、有利に処理され得る。

製剤
上記の各々の真菌株又は混合物は、該株を培養するために使用される最初の媒体物質に上に提供され、あるいは様々な物理的メカニズムによって最初の成長基質から除かれ、所定の適用のために所望の濃度を達成するために別個の基質又は添加物上に再混合され得る。例えば、真菌胞子又は他の目立たない珠芽は、超音波処理、洗浄又は基質破壊によって、次いで当業者に公知の、篩、遠心分離又は他のサイズ排除法のような濃縮ステップ（strep）によって除かれ得る。かかる分離された及び/又は濃縮された珠芽は、直接的に混合され適用されるか、あるいは適用のために別個の基質上に配置されることがある。このようにして、最初の成長基質の望ましくない物理的性質、例えば非溶解性又は低液体ポンプ特性は改善することができ、そして生成物は、より簡便に、容易に又は経済的に適用されてよい。好ましい実施態様では、ムコル・ラセモサス（Mucor racemosus）の真菌胞子は、超音波処理によって成長媒体から除かれ、篩及び遠心分離によって濃縮され、次いで１以上の他の株と組合わされて、所望の汚水反応領域にポンプによって自動的に送達されることがある液状濃縮物懸濁液を提供する。様々な懸濁剤及び/又は界面活性剤は、濃縮された真菌珠芽混合物の汲み上げを助け、又はその沈殿を減少させるために添加され得る。

培養
本発明はまた、ムコル・ヒエマリス（Mucor hiemalis）、パエシロマイセス・バリオチイ（Paecitomyces variottii）、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）、及びトリコデルマ・アトロビリデ（Trichoderma atroviride）の株の生物学的に純粋な培養物に関する。本発明の具体例としてそれに限定する意図ではないが、以下の実施例を示す。
本明細書において他に示さない限り、すべての部分、パーセント等は重量基準である。

実施例１
材料及び方法：
媒体及び基質：
パルプ製紙工場廃棄物：研究室試験で使用された汚水は、米国及びフランスの様々なパルプ製紙工場から得られた。汚水流物質は、ＳＳＣ基準の栄養素（Ｎ＆Ｐ）補正媒体の添加によってｐＨ７．８に調整した（以下の表参照）。

パルプ製紙工場廃棄物：該廃棄物は、記載しない限り本試験で受けたものとして使用した。該廃棄物は、建築的及び機能的コーティング、及びプラスチック添加物を製造する場所由来のものであり（衝撃的な調整剤及び処理補助剤）、ラテックスについての規定の問題がある。該廃棄物のｐＨは８．９であり、多数の原生動物を含むことも分かった。溶解性ＣＯＤは、４７７±８ｍｇ／Ｌであった。廃棄物は、１４００ｍｇ／Ｌの平均流入ＣＯＤ、４００ｍｇ／Ｌの流出を有することが報告された。受け入れた廃棄物は、輸送中のＣＯＤ損失に因らず、回収された時の汚水流の低ＣＯＤに因る、低ＣＯＤを有した。汚水の顕微鏡検査は、試料中に存在する原生動物を明らかにした。

洗濯廃棄物：洗濯廃棄物は、容認されたものとして使用し、０．２％ＡｑｕａｚｙｍｅＵｌｔｒａｓ１２００Ｌを有するデニム繊維工場由来のものであった。この廃棄物の最初のｐＨは５．６であった。

廃棄物調製：廃棄物の殺菌は、特に記載しない限り、濾過によって行った。廃棄物は、最初に、１２，０００ＸＧで６０分間遠心した。次いで、この材料を、ワットマン９３４−ＡＨフィルタによって１００〜１５０ｍＬアリコートに通過させ、次いでワットマンＧＦ／Ｆフィルタで濾過し、ＧｅｌｍａｎＳｃｉｅｎｃｅｓ０．４５ミクロンＭｅｔｒｉｃｅｌ膜フィルタによって濾過した。最終的な殺菌は、０．２２ミクロン膜フィルタを備えた予備殺菌Ｎａｌｇｅｎｅ濾過ユニットによって濾過することによって行った。

栄養添加物：栄養媒体の成分は以下の表に記載する。これらは、１０倍濃縮物として調製し、以下の表に記載の最終濃度を与えるように廃棄物に添加した。

培養条件：パルプ製紙工場廃棄物のインキュベーションは、１０ｍＬのフィルタ殺菌廃棄物を含む殺菌１５０ｍＬ血清バイアル中で行った。バイアルの上部は、酸素移動ができるように「蒸気紙」で覆った。インキュベーションは３０℃で行った。洗濯廃棄物及び工業廃棄物との反応は、５０又は１００ｍＬの濾過殺菌廃棄物を含む２５０ｍＬの振とうフラスコ中で行った。

接種調製：調合されたサンプルＡ１、サンプルＢ又はＮＺＢ−Ｃサンプル生成物を含む実験については、リン酸バッファーに０．１〜１グラムまでの生成物を加えて、最終濃度０．１１グラム生成物／ｍｌのバッファーを与えた。次いで、これを手首の振動で３０分間攪拌した。特に記載しない限り、この生成物を最終濃度１グラム／３００ｍｌの廃棄物に加えた。

乾燥生成物製造：この試験で使用した乾燥生成物は、以下の表に記載の性質を有した。サンプル生成物は、５０グラムのもみ殻、５０グラムの糠及び１０グラムのデンプンからなる媒体で、１０グラム単位の単離された真菌を最初に成長させることによって製造した。この材料に、湿気のために１００ｍＬの５０％ジャガイモデキストロースアガー（ＰＤＡ）を添加した。この材料をオートクレーブにかけ、真菌の菌糸及び予備成長ＰＤＡプレート由来の胞子で接種した。Ｐ．クリソスポリウム（chrysosporium）を除いて、最初にすべてのインキュベーションは、２５℃で７〜１０日間、１９０Ｘ１００ｍｍガラス皿で加湿した成長チャンバー中で行った。Ｐ．クリソスポリウムは、３９℃で最初に培養した。最初のインキュベーションの最後に、培養物を加湿成長チャンバーから取り出し、更なる５〜７日間、室温で風乾した。最終的な乾燥は、凍結乾燥機中で減圧下に行った。

次いで、原料を水和及び連続的希釈に供して、標準的な研究室的方法を用いて珠芽数／グラムを決定した。Ｐ．クリソスポリウムを除いて、すべての真菌は、１．０Ｘ１０^９〜１．０Ｘ１０^７珠芽／グラムの収量を得た。Ｐ．クリソスポリウムは、４．０Ｘ１０^３珠芽／グラムを与えた。

ＣＯＤアッセイ：所定の時間に、５２２０Ｃ法（標準法）によって溶解性ＣＯＤを決定した。すべての材料を１３，０００ＸＧで２０分間遠心して、粒子を除いた。すべてのデータは、溶解性ＣＯＤを示し、特に記載しない限り、３つの測定の平均±１標準偏差単位を示す。

結果：
純粋培養物での実験：個々の真菌の役割を評価するために、真菌の純粋かつ混合培養物は、パルプ製紙工場の「強烈な沼」由来の廃棄物でインキュベートした。各真菌の種類及び濃度を以下の表に示す。真菌コンソーシアムについて、競合の真菌をより高濃度で加えたことに着目するのは重要である。

パルプ製紙工場由来の一次浄化器からの廃棄物の分解を表１に示す。ＮＺＢ−Ｃサンプルは競合サンプルよりもＣＯＤの高い除去を証明した。

実施例２
この実験のために、総数６０個の１５０ｍｌ血清バイアルを使用し、ブチル化ゴムストッパーで蓋をした。各サンプルは３点で行った。バイアルは、次いで１２１℃で３０分間オートクレーブによって殺菌した。

汚水をフランスで入手した。サンプル中に懸濁された大量の粒子物質によって、中程度の廃棄物及び出口汚水を濾過した。濾過は、最終フィルタサイズが０．２ミクロンになるまで、連続的により小さいフィルタサイズを用いて行った。サンプル中の大きな粒子物質を除くために最初に、ワットマン９３４−ＡＨフィルタ（１．５ミクロン）を使用した。次いで、所望の濾過サイズを達成するために、Ｆｉｓｈｅｒｂｒａｎｄ０．４５ミクロン膜ＭＣＥフィルタ（カタログ番号０９−７１９−２Ｅ）及びＦｉｓｈｅｒｂｒａｎｄ０．２ミクロン膜フィルタ（カタログ番号０９−７１９−２Ｂ）を連続的に使用した。

中程度の廃棄物及び出口廃棄物を濾過殺菌した後に、層流フードの下でバイアルの各々に１０ｍｌ容の汚水を加えた。真菌成長を助けるために各バイアルを２×ＳＳＣで補充した。

１ｘＳＳＣ栄養媒体を以下のように調製した。

１ｘＳＳＣを血清バイアルの各々に加えた。２つの乾燥生成物（ＮＺＢ−Ｃ、すなわちNRRLで寄託され、各々、寄託番号NRRL 50031、NRRL 50032、NRRL 50033及びNRRL 50034で寄託された、Bi-Chem1005PP、Novozymes Biologicalsの細菌性生物の、ムコル・ラセモサス（Mucor racemosus）、パエシロマイセス・リラシヌス（Paecitomyces lilacinus）、アスペルギルス・アスタス（Aspergillus ustus）及びトリコデルマ・インハマタム（Trichoderma inhamatum）株のコンソーシアム）からの接種材料を調製するために、２．５ｇの生成物を殺菌試験管中の２５ｍｌの殺菌リン酸バッファーに加え、次いで、１５分間、手首を振動させて攪拌した。単一真菌株培養物からの接種材料を調製するために、各株のプレートを取得し、殺菌綿スワブでＭｇＣｌ_２、胞子及び菌糸の混合物をプレート表面から採取した。次いで、このスワブを２ｍＭを含む９９ｍｌの０．３ｍＭのリン酸バッファー（ｐＨ７．４）中に浸し、１５分間激しく攪拌して、バッファー中に胞子／菌糸を放出させた。綿スワブの吸収性のために、リン酸バッファーのいくらかを損失した。プレートの拭き取りの完了後に体積を１０ｍｌに戻した。ムコルの場合には、ＰＤＡ上で成長したムコルの２つのプレートを８つの部分に切断し、９９ｍｌのリン酸バッファーに加えた。攪拌後、接種材料（乾燥混合物又は個々の培養物から採取した）を１０分間静置し、粒子物質を沈殿させ、ついで１００μｌの懸濁液を取り、汚水及び１ｘＳＳＣを含む対応する血清バイアルを接種するために使用した。次いでバイアルを３５℃で１４日間インキュベートした。

Ｎｏｒａｍｐａｃ由来の処理汚水のＳＰＭＥ装備ＧＣ／ＭＳ分析
汚水中に存在する特定の化合物を検出するために、ＳＰＭＥ（固相マイクロ抽出）を用いて、サンプルのＧＣ／ＭＳ（ガスクロマトグラフィー／質量分光分析）分析を行った。各サンプルのＣＯＤ分析の後に、サンプルの残り（約９ｍｌ）を２０ｍｌのヘッドスペースバイアルに加えた。ジビニルベンゼン／カルボキセン／ポリジメチルシロキサン（ＤＶＢ／ＣＡＲ／ＰＤＭＳ）ファイバ（灰色容器）を選択した。このサンプルを６０℃まで５分間加熱し、同時に３２０ｒｐｍで５秒間攪拌し、３０秒間静置し、気化させた。次いで、サンプルを６０℃で３０分間抽出し、同時に先に記載したようにして攪拌した。サンプルを２５０℃で１分間脱着した。スプリット比を１：２に設定し、セプタムパージを２．５ｍｌ／分に設定した。においの原因となるイオウ化合物がサンプル中に存在すると考えられたので、このサンプルをＳＰＢ−１イオウカラムで分析した。脱着後、カラムを４０℃で３分間維持した。次いで、温度を４℃／分の速度で１２５℃まで上昇させた。次いで、２５℃／分〜２００℃／分のより速い傾斜で上昇させた。質量分光分析は、新たな調整の後、４５〜１０００ａｍｕでスキャンするように設定した。

Ｎｏｒａｍｐａｃ試験２由来の処理汚水のＳＰＭＥ装備ＧＣ／ＭＳ分析
化合物がＳＰＭＥ装備ＧＣ／ＭＳを用いて検出され得ることを確認した後、汚水中の未知化合物の分解能を示すために第２試験を設定した。ＮＺＢ−Ｃが分解することができた場合に、非処理サンプル対処理サンプルから得られたクロマトグラムに示されるだろうと予測した。例えば、非処理サンプルにおいて１６．３８２分の保持時間を有するピークは、処理サンプルでは１６．３８２分で理論上現れるはずである。３つのピークの面積を分析し、真菌生成物の分解能についての結論を導き出すことができた。この具体的な試験のために、Ｎｏｒａｍｐａｃ由来の出口水は、０．２ミクロン殺菌フィルタで濾過し、次いで各々の２０ｍｌヘッドスペースバイアルに加えた。これは３点で行った。ＳＳＣ濃度を１ｘにするために、各バイアルにＳＳＣを加えた。そのために以下の手段を用いた。

ＳＳＣの１０倍濃縮物の媒体成分を以下の表に示す。白色沈殿が形成されそれは一般的である。１０×媒体を振とうし、次いで１０倍に希釈し、その後で蒸留水に加えた。最終媒体をオートクレーブにかけてもよいが、濾過殺菌が好ましい。

処理サンプルを調製するために、５０ｍｌ試験管中の２５ｍｌの殺菌リン酸バッファーに添加した２．５ｇのＮＸＺＢ−Ｃ乾燥生成物を用いて１０％ＮＺＢ−Ｃ溶液を調製した。試験管を１５分間攪拌した。攪拌が終了し、糠が底に沈殿したら、上記の糠を１００μｌ、液体層から採取した。各々の処理バイアルを接種するためにこれを使用した。次いで、バイアルに蓋をし、３０℃で１４日間インキュベートし、次いで先のセクション「Ｎｏｒａｍｐａｃ由来の処理汚水のＳＰＭＥ装備ＧＣ／ＭＳ分析」に記載のＧＣ／ＭＳプロトコルを用いて読んだ。

Ｎｏｒａｍｐａｃ試験２由来の処理汚水のＳＰＭＥ装備ＧＣ／ＭＳ分析
ある化合物がＳＰＭＥによるＧＣ／ＭＳヘッドスペース分析を用いて検出され得ることを確認した後、処理サンプルと非処理サンプルとの単純なピーク比較によって化合物の分解の比較を行った。３つのピークをこの比較試験のために単離した。これらのピークの同一性は、使用したＳｈｉｍａｄｚｕＧＣ／ＭＳ装置（ＧＣＭＳ−ＱＣ２０１０Ｓ）の内部化合物ライブラリーによって提供された。この結果を表２に示す。これは、ＮＺＢ−Ｃがこれらの検出化合物を分解することができる証拠である。

この結果は、ＮＺＢ−Ｃが５−ブロモチオフェン−２−カルボキミド、イソオキサゾリジン及び２−メチル−１−ニトロプロパンを分解することを示している。

実施例３
フランス、ボンデュエル（Ｂｏｎｄｕｅｌｌｅ）でのパルプ製紙工場の潟湖処理施設中のにおい発生及びある厄介な廃棄化合物を減少させるＮＺＢ−Ｃ真菌コンソーシアムの能力の評価分野が画された。上記のようにして調製されたＮＺＢ−Ｃ材料は、１．５ｇＮＺＢ−Ｃ／処理潟湖に存在する１．０Ｋｇの総ＣＯＤの割合で、７，５００ｍ^３／日の流速で加えた。位置が類似しているが別個の潟湖は、ＮＺＢ−Ｃで処理せず、対照とした。実験の最初に（０日目）及び２３日目に、潟湖出口でサンプルを採取した。これらは、実施例１に記載のＳＰＭＥ分析法を有するＧＣ／ＭＳを用いて評価した。結果を表３に示す。これは、あるにおい関連化合物の相当のかつ顕著な減少がこの時間に起こったことを示している。

Claims

ムコル・ラセモサス（Mucor racemosus）NRRL 50031株の生物的に純粋な培養物。