JP6535036B2 - 出血性疾患の治療における止血を改善するためのヒトプロトロンビン及び活性化第ｘ因子の組成物 - Google Patents

Description

関連出願の相互参照
本出願は、参照によりその全内容を本明細書に組み入れる、2014年3月14日に出願された米国仮特許出願第61/953,496号の利益を主張する。

分野
本明細書に開示されているのは、出血性疾患の治療における止血及び抗凝固活性の逆転（reversal）を改善するための組成物及び方法である。

人体が血栓を形成する凝固カスケードは、出血を止める人体の主要なメカニズムである。血栓は、フィブリンマトリクス中に付着する血小板によって生成され、損傷した血管部位で栓を形成する。人体が血栓を形成できないと、過度の出血が生じて非常に危険な状態となり得る。個体において適切に凝固できない血液は、しばしば出血性疾患の徴候である。

血栓を形成できないのは、凝固カスケードにおける凝固因子の不足又は欠損のためであり得る。例えば、血友病の最も一般的な型であるＡ型血友病は、大部分が遺伝性の第VIII因子（FVIII）欠損性の出血性疾患である。Ａ型血友病の人が怪我をした場合、出血は容易には止まらず、より長時間の止血が必要である。FVIII置換療法に応答したFVIIIに対する抗体（インヒビターとも呼ばれる）の出現がＡ型血友病の治療のための更なる課題である。

血友病のより一般的ではない型であるＢ型血友病も、第IX因子（FIX）欠損をもたらす大部分が遺伝性の出血性疾患であり、「クリスマス病」としても知られている。FIX置換療法に応答したFIXに対する抗体（インヒビターとも呼ばれる）の出現がＢ型血友病の治療のための更なる課題である。

もう一つの出血性疾患であるフォン・ヴィレブラント病も遺伝性の遺伝子疾患であり、血液凝固タンパク質であるフォン・ヴィレブラント因子（vWF）の欠損又は欠陥によって生じる。vWFは血小板と相互作用して損傷部位に栓を形成するため、血液凝固の初期段階で非常に重要である。

出血性疾患の治療は通常、不足しているか、又は欠損している血液凝固因子を置き換えることを含む。因子は、献血されたヒト血漿から精製したもの（血漿由来因子）であっても、組換えによって作製したもの（組換え因子）であっても良い。

インヒビターとも呼ばれる抗体は、出血性疾患を有する個体をFVIII置換療法で治療した場合に生じることがあり、その場合、身体は治療を治療ではなく脅威として認識する。認識された脅威に対して、免疫系はFVIIIを攻撃する抗体（インヒビターとも呼ばれる）を作製する。インヒビターはFVIIIが出血を制御するのを抑制又は阻害し得るため、これは非常に危険なことであり得る。従って、投与された凝固因子に対するインヒビターが出現した場合、バイパス療法を適用しなければならない。重症Ａ型血友病患者の約30％で生じるFVIII中和抗体の出現のために、Ａ型血友病の治療は困難である。同様の阻害性又は中和抗体の形成は、FIX又はvWF置換療法で治療した患者においても生じ得る。現在、FVIII又はFIXに対するインヒビターが生じた血友病患者のための標準的な治療選択は2つある：FEIBA（登録商標）（Baxter Healthcare Corporation, Deerfield, IL）又は組換えFVIIaによる単剤療法である。プロトロンビン複合体の使用又は更に血漿交換等の他の選択肢があるが、これらは副作用がより多く、それ程有効ではない。FEIBA（登録商標）（第VIII因子インヒビターバイパス活性）は、血友病患者の治療において30年以上使用されてきた。これはインヒビターを有する血友病患者におけるバイパス療法には不可欠のものであり、エピソードの93％で出血を制御し、高い安全性プロファイルを有している。一部の患者はFEIBA（登録商標）又は組換えFVIIaでの単剤療法に不応性又は非応答性であり、従って、当分野においてインヒビター治療の改善の必要性がある。本発明者等は、FEIBA（登録商標）と同様に有効であるが、FIIの必要量が少ない、出血性疾患の治療のためのヒトプロトロンビン（FII）及び活性化第X因子（FXa）の有効な比率を同定した。FII及びFXaは組換え体、又は血漿由来のいずれでもあり得る。

本発明の組成物及び方法は、出血性疾患の治療における止血の改善及び抗凝固活性の逆転の補助に関する。

出血性疾患の治療及び抗凝固活性の逆転を補助するために、プロトロンビン（FII）及び活性化第X因子（FXa）の有効な比率が本明細書に記載されている。FII及びFXaはいずれも組換え体又は血漿由来であり得る。

特定の実施形態は、FII及びFXaを含有し、FXaのFIIに対するモル比が1:20,000未満である、出血性疾患の治療のための組成物を含む。

別の実施形態において、出血性疾患を治療するための組成物は、約0.44 mg/kgのFII及び約826 ng/kgのFXaを含有する。あるいはまた、組成物は、約0.2 mg/kg〜約1 mg/kgのFII及び約560 ng/kg〜約1100 ng/kgのFXaを含有し得る。あるいはまた、組成物は、約4.4 mg/kgのFII及び約275 ng/kgのFXaを含有し得る。あるいはまた、組成物は、約1.2 mg/kg〜約5 mg/kgのFII及び約200 ng/kg〜約540 ng/kgのFXaを含有し得る。

更に別の実施形態において、出血性疾患は、Ａ型血友病、Ｂ型血友病、フォン・ヴィレブラント病、インヒビターを有する先天性Ａ型血友病又はFVIIIに対する阻害性自己抗体を有する後天性Ａ型血友病、インヒビターを有する先天性Ｂ型血友病又はFIXに対する阻害性自己抗体を有する後天性Ｂ型血友病、外傷による失血、第VII因子（FVII）欠乏症、第V因子（FV）欠乏症、第X因子（FX）欠乏症、第XI因子（FXI）欠乏症、第XIII因子（FXIII）欠乏症、フィブリノゲン欠乏症、プロトロンビン欠乏症、希釈性（dilutional）凝固障害、血小板減少症、高リスクの手術による失血、脳出血、フォン・ヴィレブラント因子に対するインヒビターを有するフォン・ヴィレブラント病、又はこれらの組合せを含み得る。

別の実施形態は、FXaのFIIに対するモル比が1:20,000未満であるFII及びFXa、及び少なくとも1種の賦形剤を含有する、出血性疾患の治療のための医薬組成物を含む。FII及びFXaは血漿由来又は組換え体であり得る。

特定の実施形態において、医薬組成物は、約0.44mg/kgのFII及び約826 ng/kgのFXa及び少なくとも1種の賦形剤を含有し得る。あるいはまた、医薬組成物は、約0.2 mg/kg〜約1 mg/kgのFII及び約560 ng/kg〜約1100 ng/kgのFXa及び少なくとも1種の賦形剤を含有し得る。あるいはまた、医薬組成物は、約4.4 mg/kgのFII及び約275 ng/kgのFXa及び少なくとも1種の賦形剤を含有し得る。あるいはまた、医薬組成物は、約1.2 mg/kg〜約5 mg/kgのFII及び約200 ng/kg〜約540 ng/kgのFXa及び少なくとも1種の賦形剤を含有し得る。

別の実施形態において、FXaのFIIに対するモル比が1:20,000未満であるFII及びFXaを含有する組成物を投与することを含む、出血性疾患の治療方法が記載される。FII及びFXaは組換え体又は血漿由来であり得る。

更なる実施形態は、FXaのFIIに対するモル比が1:20,000未満であるFII及びFXaを含有する、抗凝固活性の逆転を補助するための組成物を含む。FII及びFXaは組換え体又は血漿由来であり得る。

FVIII阻害されたヒト血漿中のヒトプロトロンビン（FII）及び活性化第X因子（FXa）の様々な組合せのトロンビン生成の例示的プロファイルを示す。 FVIII阻害されたヒト血漿を用いた較正自動トロンボグラフィー（calibrated automated thrombography, CAT）アッセイにおけるFII及びFXaの相互滴定（cross-titration）を示す。 血友病誘導ウサギのネイルクリップ出血モデルにおけるFII及びFXaの様々な組合せの正確な有効性を示す。図３Ａは実験手順の概略図である。 血友病誘導ウサギのネイルクリップ出血モデルにおけるFII及びFXaの様々な組合せの正確な有効性を示す。図３Ｂは、FII及び／又はFXa、FEIBA（登録商標、陽性対照）、又は緩衝液（陰性対照）の静脈内投与前後の30分間モニタリングしたネイルカット後の相対的血液損失を示す。各群の中央値を黒の線で示す。 FII及びFXaを単独で若しくは組み合わせて用いて処置したFVIII阻害されたウサギ由来の全血サンプルのex vivo分析を示す。 FII及びFXaを単独で若しくは組み合わせて用いて処置したFVIII阻害されたウサギ由来の血漿サンプルのCAT分析を示す。

出血性疾患の治療及び抗凝固活性の逆転を補助するためのヒトプロトロンビン（FII）及び活性化第X因子（FXa）の効果的な比率が本明細書中に記載されている。

本明細書中で開示するのは、FII及びFXaを含有し、FXaのFIIに対するモル比が1:20,000未満である、出血性疾患の治療のための組成物である。FII及びFXaは血漿由来又は組換え体であり得る。

FII及びFXa等の組換えタンパク質の作製は、当分野において周知である。例えば、EP1460131号には、ヒト細胞株における組換えヒト血液凝固因子の作製方法が記載されている。更に、WO 2005/038019号には、組換えによる凝固因子の高収率の作製が記載されている。血漿製品からの凝固因子の単離方法も、当分野において周知である。例えば、米国特許第4,883,598号には、液体クロマトグラフィーを使用した血漿又は血漿製品からの凝固因子の単離方法が記載されている。

FEIBA（登録商標）は、インヒビターを有する血友病患者における出血エピソードを治療するために使用される血漿由来の活性化プロトロンビン複合体濃縮物である。FII及びFXaは、FEIBA（登録商標）の止血効果を仲介する最も重要な成分であるとして同定されている。FEIBA（登録商標）におけるFXa及びFIIのモル比は、1:20,000-40,000の範囲であり、すなわち、1 U/mlのFEIBA（登録商標）によって、0.035-0.07 nMのFXa及び1400 nMのFIIの血漿濃度がもたらされる。FEIBA（登録商標）におけるFXaのFIIに対するモル比の範囲の結果、多量のプロトロンビンが必要とされ、これは組換えによって作製するには困難である。FII及びFXは複数の構造ドメインを有し、翻訳後修飾を有する複合タンパク質である。いずれのタンパク質も、哺乳動物の細胞株、例えばCHOで組換えによって作製することができる。第X因子は、本発明の実施形態の組成物中でFIIと共に製剤化（co-formulation）するために、FXaに更に活性化される必要がある。

「インヒビターを有する」血友病患者とは、抗体、中和抗体、阻害性抗体等を有する血友病患者を意味し得る。インヒビターは、出血性疾患を有する個体を置換療法で治療し、身体がその療法を治療ではなく脅威（threat）として認識した場合に生じる。

従来、FEIBA（登録商標）中に存在するFXa/FII比率に基づいて、凝固因子のこの組合せの有効性を調査するために、組換え部分プロトロンビナーゼが開発されてきた。しかしながら、このアプローチにおいて、多量の組換えFIIの発現及び生成が制限因子であった。FEIBA（登録商標）と同様に活性があって有効であるが、FIIの必要量がより少量であるヒトFII及びFXaの有効な比率を同定するための研究が行われた。更に、最先端の発現プラットフォーム及びクローンスクリーニング技術を用いた探索的発現試験によって、組換え第X因子及びプロトロンビン生成の技術的な実現可能性が実証された。CHO細胞における最先端の発現システムによって、両方の因子について、高いタンパク質品質及び効力で高収量がもたらされた。組換えFXa及びプロトロンビンの組合せは、血友病インヒビター治療のための選択肢として使用することができる。本実施形態の組成物の更なる利点は、FII濃度がより低いために自発的な凝固イベントがより少なくなり得ることから、特に抗凝固逆転のために非血友病患者で使用する場合の血栓症のリスクが低減することであり得る。

驚くべきことに、FEIBA（登録商標）で見出されたものとは非常に異なるFIIのFXaに対する比率が、出血を制御するのに有効であることが見出された。特定の実施形態において、出血性疾患を治療するための組成物は、FXaのFIIに対するモル比が約1:20,000未満、約1:19,000未満、約1:18,000未満、約1:17,000未満、約1:16,000未満、約1:15,000未満、約1:14,000未満、約1:13,000未満、約1:12,000未満、約1:11,000未満、約1:10,000未満、約1:9,000未満、約1:8,000未満、約1:7,000未満、約1:6,000未満、約1:5,000未満、約1:4,000未満、約1:3,000未満、約1:2,000未満、約1:1,000未満、約1:950未満、約1:900未満、約1:850未満、約1:800未満、約1:750未満、約1:700未満、約1:650未満、約1:600未満、約1:550未満、約1:500未満、約1:450未満、約1:400未満、約1:350未満、約1:300未満、約1:250未満、約1:200未満、約1:150未満、約1:100未満、約1:95未満、約1:90未満、約1:85未満、約1:80未満、約1:75未満、約1:70未満、約1:65未満、約1:60未満、約1:55未満、約1:50未満、約1:45未満、約1:40未満、約1:35未満、約1:30未満、約1:25未満、約1:20未満、約1:15未満、約1:10未満、又は約1:5未満である、FII及びFXaを含有する。

別の実施形態において、出血性疾患を治療するための組成物はFII及びFXaを含有し、FXaのFIIに対するモル比は約1:19,999、約1:19,500、約1:18,500、約1:17,500、約1:16,500、約1:15,500、約1:14,500、約1:13,500、約1:12,500、約1:11,500、約1:10,500、約1:9,500、約1:8,500、約1:7,500、約1:6,500、約1:5,500、約1:4,500、約1:3,500、約1:2,500、約1:1,500、約1:950、約1:900、約1:850、約1:800、約1:750、約1:700、約1:650、約1:600、約1:550、約1:500、約1:450、約1:400、約1:350、約1:300、約1:250、約1:200、約1:150、約1:100、約1:95、約1:90、約1:85、約1:80、約1:75、約1:70、約1:65、約1:60、約1:55、約1:50、約1:45、約1:40、約1:35、約1:30、約1:25、約1:20、約1:15、約1:10、又は約1:5である。

別の実施形態において、出血性疾患を治療するための組成物は、約0.1 mg/kgのFII及び約800 ng/kgのFXa、約0.15 mg/kgのFII及び約700 ng/kgのFXa、約0.2 mg/kgのFII及び約600 ng/kgのFXa、約0.25 mg/kgのFII及び約500 ng/kgのFXa、約0.3 mg/kgのFII及び約400 ng/kgのFXa、約0.35 mg/kgのFII及び約300 ng/kgのFXa、約0.4 mg/kgのFII及び約200 ng/kgのFXa、約0.45 mg/kgのFII及び約200 ng/kgのFXa、又は約0.5 mg/kgのFII及び約100 ng/kgのFXaを含有する。更に別の実施形態において、出血性疾患を治療するための組成物は、約0.44 mg/kgのFII及び約826 ng/kgのFXaを含有する。別の実施形態において、出血性疾患を治療するための組成物は、約4.4 mg/kgのFII及び約275 ng/kgのFXaを含有する。

特定の実施形態において、出血性疾患を治療するための組成物は、約0.1 mg/kg〜約0.5 mg/kgのFII及び約600 ng/kg〜約1100 ng/kgのFXa、約0.5 mg/kg〜約1 mg/kgのFII及び約500 ng/kg〜約1000 ng/kgのFXa、約1 mg/kg〜約1.5 mg/kgのFII及び約450 ng/kg〜約950 ng/kgのFXa、約2.0 mg/kg〜約2.5 mg/kgのFII及び約400 ng/kg〜約900 ng/kgのFXa、約2.5 mg/kg〜約3.0 mg/kgのFII及び約350 ng/kg〜約850 ng/kgのFXa、約3.5 mg/kg〜約4.5 mg/kgのFII及び約300 ng/kg〜約600 ng/kgのFXa、又は約4.5 mg/kg〜約5.5 mg/kgのFII及び約200 ng/kg〜約600 ng/kgのFXaを含有する。別の実施形態において、出血性疾患を治療するための組成物は、約0.2 mg/kg〜約1 mg/kgのFII及び約560 ng/kg〜約1100 ng/kgのFXaを含有する。更に別の実施形態において、出血性疾患を治療するための組成物は、約1.2 mg/kg〜約5 mg/kgのFII及び約200 ng/kg〜約540 ng/kgのFXaを含有する。

一部の実施形態において、FXaはおよそ90％がFXaα形態であり、10％がFXaβ形態である。あるいはまた、FXaは、およそ100％がFXaα形態で0％がFXaβ形態、およそ80％がFXaα形態で20％がFXaβ形態、およそ70％がFXaα形態で30％がFXaβ形態、およそ60％がFXaα形態で40％がFXaβ形態、およそ50％がFXaα形態で50％がFXaβ形態、およそ40％がFXaα形態で60％がFXaβ形態、およそ30％がFXaα形態で70％がFXaβ形態、およそ20％がFXaα形態で80％がFXaβ形態、およそ10％がFXaα形態で90％がFXaβ形態、又はおよそ0％がFXaα形態で100％がFXaβ形態であり得る。

出血性疾患としては、限定するものではないが、Ａ型血友病、Ｂ型血友病、フォン・ヴィレブラント病、インヒビターを有する先天性Ａ型血友病又はFVIIIに対する阻害性自己抗体を有する後天性Ａ型血友病、インヒビターを有する先天性Ｂ型血友病又はFIXに対する阻害性自己抗体を有する後天性Ｂ型血友病、外傷による失血、FVII欠乏症、FV欠乏症、FX欠乏症、FXI欠乏症、FXIII欠乏症、フィブリノゲン欠乏症、プロトロンビン欠乏症、希釈性凝固障害、血小板減少症、高リスクの手術による失血、脳出血、フォン・ヴィレブラント因子に対するインヒビターを有するフォン・ヴィレブラント病、又はこれらの組合せが挙げられる。

抗凝固剤は、血栓を治療及び予防するために使用される。血栓を生じるリスクを有するか、あるいは既に存在する血栓が成長するのを防止する必要のある個体に、抗凝固剤を投与する。血栓を生じるリスクを有する者としては、心房細動、人工心臓弁、心内膜炎、僧帽弁狭窄症、特定の血液疾患を有する者、及び人工股関節置換術又は人工膝関節置換術を受けた者が挙げられる。例えば出血のリスクが高い状況においては、抗凝固剤の拮抗が必要な場合がある。ワルファリン等の一部の抗凝固剤の薬理作用は、ビタミンＫの投与によって容易に逆転させることができる。アピキサバン（apixaban）、ベトリキサバン（betrixaban）、及びリバロキサバン（rivaroxaban）等のより最近になって導入された抗凝固剤の一部は、ビタミンＫの投与によって容易に逆転させることができない。現在、これらの抗凝固剤によって引き起こされる望まない出血に対する解毒剤は存在せず、非常に危険であり得る。従って、本明細書に開示する組成物の更なる利点は、抗凝固剤の逆転のために非血友病患者で使用する場合に、自発的な凝固イベントがより少ないことである。

開示した組成物の投与経路としては、限定するものではないが、非経口注入、静脈注射、皮下注射、及び筋肉内注射が挙げられる。

投与は単回投与であっても累積的（連続的）投与であっても良く、当業者によって容易に決定され得る。例えば、先天性血友病の治療は、本明細書に開示された組成物の有効投与量の生涯にわたる投与を含み得る。非限定的な例として、本明細書に開示される組成物の有効投与量は、例えば単回注射として個体に1回で投与され得る。あるいはまた、出血性疾患の治療は、一定期間にわたって、例えば毎日、数日毎に1回、又は毎週実施される、本明細書に開示される組成物の有効投与量の複数回投与を含み得る。非限定的な例として、本明細書に開示される組成物は、週に2回又は3回、個体に投与され得る。投与のタイミングは、個体の症状の重篤度等の因子に応じて個体によって変動し得る。例えば、本明細書に開示される組成物の有効投与量は、無期限の期間の間、1日1回、又は2日〜3日毎に個体に投与され得る。当業者であれば、治療期間にわたって個体の状態をモニタリングできること、及び本明細書に開示される組成物の投与される有効量をそれに応じて調節できることを認識するであろう。臨床的有効性は、出血を制御することによって説明することができる。投与は、必要に応じて、予防的、術前又は周術期（peri-operative）であり得る。

特定の実施形態は、FXaのFIIに対するモル比が1:20,000未満である血漿由来のFII及びFXa、及び少なくとも1種の賦形剤を含有する、出血性疾患の治療のための医薬組成物を含む。賦形剤としては、限定するものではないが、水、NaCl又は等張性のための他の塩、5％デキストロース水溶液、pH2-8の緩衝溶液、安定化剤としてトレハロース、マンニトール、若しくはソルビトール、リン酸塩若しくは酢酸塩緩衝剤等の緩衝剤、塩若しくはアミノ酸等の等張化剤、及び界面活性剤ポリオキシエチレン-ソルビタンモノオレエート（TWEEN 80）が挙げられる。更に、医薬組成物は、凍結乾燥することができる。

一部の実施形態において、出血性疾患の治療のための医薬組成物は、少なくとも1種の賦形剤、FII及びFXaを含有し、FXaのFIIに対するモル比は、約1:20,000未満、約1:19,000未満、約1:18,000未満、約1:17,000未満、約1:16,000未満、約1:15,000未満、約1:14,000未満、約1:13,000未満、約1:12,000未満、約1:11,000未満、約1:10,000未満、約1:9,000未満、約1:8,000未満、約1:7,000未満、約1:6,000未満、約1:5,000未満、約1:4,000未満、約1:3,000未満、約1:2,000未満、約1:1,000未満、約1:950未満、約1:900未満、約1:850未満、約1:800未満、約1:750未満、約1:700未満、約1:650未満、約1:600未満、約1:550未満、約1:500未満、約1:450未満、約1:400未満、約1:350未満、約1:300未満、約1:250未満、約1:200未満、約1:150未満、約1:100未満、約1:95未満、約1:90未満、約1:85未満、約1:80未満、約1:75未満、約1:70未満、約1:65未満、約1:60未満、約1:55未満、約1:50未満、約1:45未満、約1:40未満、約1:35未満、約1:30未満、約1:25未満、約1:20未満、約1:15未満、約1:10未満、又は約1:5未満である。

別の実施形態において、出血性疾患の治療のための医薬組成物は、少なくとも1種の賦形剤、FII及びFXaを含有し、FXaのFIIに対するモル比は、約1:19,999、約1:19,500、約1:18,500、約1:17,500、約1:16,500、約1:15,500、約1:14,500、約1:13,500、約1:12,500、約1:11,500、約1:10,500、約1:9,500、約1:8,500、約1:7,500、約1:6,500、約1:5,500、約1:4,500、約1:3,500、約1:2,500、約1:1,500、約1:950、約1:900、約1:850、約1:800、約1:750、約1:700、約1:650、約1:600、約1:550、約1:500、約1:450、約1:400、約1:350、約1:300、約1:250、約1:200、約1:150、約1:100、約1:95、約1:90、約1:85、約1:80、約1:75、約1:70、約1:65、約1:60、約1:55、約1:50、約1:45、約1:40、約1:35、約1:30、約1:25、約1:20、約1:15、約1:10、又は約1:5である。

更に別の実施形態において、出血性疾患の治療のための医薬組成物は、少なくとも1種の賦形剤、及び約0.1 mg/kgのFII及び約800 ng/kgのFXa、約0.15 mg/kgのFII及び約700 ng/kgのFXa、約0.2 mg/kgのFII及び約600 ng/kgのFXa、約0.25 mg/kgのFII及び約500 ng/kgのFXa、約0.3 mg/kgのFII及び約400 ng/kgのFXa、約0.35 mg/kgのFII及び約300 ng/kgのFXa、約0.4 mg/kgのFII及び約200 ng/kgのFXa、約0.45 mg/kgのFII及び約200 ng/kgのFXa、又は約0.5 mg/kgのFII及び約100 ng/kgのFXaを含有する。別の実施形態において、出血性疾患の治療のための組成物は、約0.44 mg/kgのFII及び約826 ng/kgのFXaを含有する。別の実施形態において、出血性疾患の治療のための組成物は、約4.4 mg/kgのFII及び約275 ng/kgのFXaを含有する。

特定の実施形態において、出血性疾患の治療のための医薬組成物は、少なくとも1種の賦形剤、及び約0.1 mg/kg〜約0.5 mg/kgのFII及び約600 ng/kg〜約1100 ng/kgのFXa、約0.5 mg/kg〜約1 mg/kgのFII及び約500 ng/kg〜約1000 ng/kgのFXa、約1 mg/kg〜約1.5 mg/kgのFII及び約450 ng/kg〜約950 ng/kgのFXa、約2.0 mg/kg〜約2.5 mg/kgのFII及び約400 ng/kg〜約900 ng/kgのFXa、約2.5 mg/kg〜約3.0 mg/kgのFII及び約350 ng/kg〜約850 ng/kgのFXa、約3.5 mg/kg〜約4.5 mg/kgのFII及び約300 ng/kg〜約600 ng/kgのFXa、又は約4.5 mg/kg〜約5.5 mg/kgのFII及び約200 ng/kg〜約600 ng/kgのFXaを含有する。別の実施形態において、出血性疾患の治療のための組成物は、約0.2 mg/kg〜約1 mg/kgのFII及び約560 ng/kg〜約1100 ng/kgのFXaを含有する。別の実施形態において、出血性疾患の治療のための組成物は、約1.2 mg/kg〜約5 mg/kgのFII及び約200 ng/kg〜約540 ng/kgのFXaを含有する。

出血性疾患を治療する上で有用なFXaのFIIに対するモル比を決定するために、in vitro-to-in vivo並進アプローチを用いた。まず、組合せを、ヒト血漿と共に止血グローバルアッセイシステムを用いてFEIBA（登録商標）と比較したそれらの凝血促進能についてin vitroで試験した。第2に、選択されたFII/FXa血漿濃度を血友病誘導ウサギのための投与量に変換し、急性出血モデルにおける有効性を評価した。

ヒトFII及びFXaの種々の比率のin vitro及びin vivoでの評価のための実験は、酵素研究所（Enzyme Research Laboratories）から供給される市販の血漿由来タンパク質を慎重に選択して行った。選択のために、様々な供給業者からのタンパク質を、純度（銀染色、ウェスタンブロッティング）、活性（ヒト及びウサギの血漿中のトロンビン生成）、濃度及び価格設定について試験した。

多成分FEIBA（登録商標）の組成及び活性成分がわかっているため、2つの凝固因子：ヒトFII及びFXaの組合せを作製した。ヒト血漿ベースの較正自動トロンボグラフィー（calibrated automated thrombography, CAT）アッセイを適用して、FVIII阻害血漿中でFEIBA（登録商標）と同様のin vitro凝固促進効果を有する特定の比率のFII/FXaの組み合わせを同定した。3つのFII/FXa比率を選択し、前臨床投与量に変換し、ウサギ出血モデルにおける有効性を評価した。3つの組成物：100％のFII及びFXaを有する第1の組成物（FEIBA（登録商標）と同じ）、10％のプロトロンビン及び300％のFXaを有する第2の組成物、及びFEIBA（登録商標）が、統計的に有意な有効性を示した。後者の投与量は、以前の試験と比較して約20倍少ないFIIと4倍多いFXaを含む。25％のFII及び200％のFXaを含む投与は有効ではなかった。観察された止血効果は、FII及びFXaのいずれによっても単独では仲介されないように思われる。結論として、FII及びFXaの比率を、活性及びin vivoの有効性が変化せず、FII/FXaの組換え型についての組換えタンパク質の製造が実現可能であるように調整した。

［実施例１：トロンビン生成アッセイにおけるFXa/FIIの組合せのin vitro評価］
較正自動トロンボグラフィー（CAT）アッセイを使用して、ヒト血漿中の物質の凝固促進効果及び抗凝固効果をモニタリングした。トロンボグラムは凝固血漿中のトロンビンの濃度を記載するものであり、従ってCATは止血システムの一般的な生理学的機能試験である。このアッセイは、組織因子（TF）による凝固開始後のトロンビンによる蛍光発生基質Z-G-G-R-AMCの経時的分解によって発生する蛍光の測定に基づく。アッセイは、Thermo Scientific社から入手できる96-ウェルプレートの蛍光光度計、Thrombograph^TMで実施し、内部フィルター効果、血漿色のドナーによる変動、基質の欠乏及び装置の違いを補正するために必要なトロンビン較正器を使用する。

様々な組合せの血漿由来FII（140-1400 nM）及びFXa（0.035-0.21 nM）の凝血促進活性を、FVIII-阻害血漿中のCATによって評価した。正常ヒト血漿プール（George King Biomedical）を50ベセスダ単位（BU）/mLのヤギ抗FVIII血漿（Baxter）で処理した。コーントリプシンインヒビター（CTI、40μg/mL、Haematologic Technologies）を添加して、第XIIa因子による前活性化（pre-activation）を阻害した。凝固は1pM TF ＋ 4μM リン脂質（PL）（PPP LOW試薬、Thrombinoscope BV）で誘発した。カルシウム再沈着後のトロンビン生成をFluoroskan Ascent reader（Thermo Scientific; 波長390/460nm）で37℃で90分間モニタリングした。各サンプルについて2回の（duplicate）測定を実施した。

ウサギ血漿のために最適化させたCATプロトコル（40μL/mL CTI、最終血漿希釈1:3、0.6 pM TF及び4μM PL）を使用して、ヒトFII及びFXaがウサギ血漿中でも活性であることをスパイク-イン（spike-in）研究で確認した。ネイルクリップ（nail clip）出血試験におけるex vivoウサギ血漿サンプルの分析のために同じCATプロトコルを使用した。

FII/FXaの組合せにおけるFII量低減の実現可能性を、最初にヒト血漿ベースのCATアッセイで試験した。出発点はFEIBA（登録商標）に見られるFXa:FII比（1:20,000）であり、これは、0.07 nMのFXa及び1400 nMのFIIの血漿濃度と等価である。FXa濃度を0.14 nM（200％）で一定に維持しながらFII濃度を1400 nM（100％ FII）から140 nM（10％ FII）に低下させた効果を図１に示す。0.14 nMのFXaは単独で、1 U/mL FEIBA（登録商標）と同様にFVIII阻害血漿中のトロンビン生成を補正することが観察された。FIIの存在は用量依存的に内因性トロンビン産生量（ETP）を上昇させ、1 U/mLのFEIBA（登録商標）よりも高いトロンビン生成をもたらした。

次に、より広い濃度範囲のFII（105 nM〜1400 nM）及びFXa（0.035〜0.21 nM）をCATアッセイで相互滴定した（図２）。FII/FXaの所望の凝固促進活性のための標的範囲を、20種の異なる1 U/mLのFEIBA（登録商標）のロットの効果を試験することによって確立した。ETPがFII/FXaに応答して最も顕著な変化を示すため、これを比較のためのCATパラメーターとして使用した。FVIII-阻害血漿におけるトロンビン生成を補正するFEIBA（登録商標）活性の範囲内にある数個のFII/FXaの組合せを同定し、FEIBA（登録商標）と比較して100％〜7.5％のプロトロンビンと100〜300％のFXaが得られた（表１）。FII低減によるトロンビン生成のわずかな減少は、FXaの適度な増加によって相殺することができる。Ａ型血友病誘導ウサギにおけるin vivo有効性モデルで試験するために3つの組合せを選択した。

［実施例２：血友病誘導ウサギモデルにおける有効性のin vivoでの概念実証］
この概念実証試験の目的は、FVIII阻害したウサギにおけるネイルクリップ出血モデルで併用投与又は単独投与された3つのFII/FXa投与量の有効性を評価することであった（図３Ａ）。最も高いFII量を有する投与量は4.4 mg/kgのFII＋275 ng/kgのFXaであり、これを「FEIBA（登録商標）比率」及びFII及びFXaの双方について100％であると定義する。2つ目の投与量1.1 mg/kg FII＋551 ng/kg FXaは、FIIが25％まで減少し、FXaが200％まで増加していた。3つ目の投与量0.44 mg/kg FII＋826 ng/kg FXaは、FIIが10％まで減少し、FXaが300％まで増加していた。緩衝液のみの対照群と比較した処置後の血液損失の減少によって、各処置について有効性を決定した。FEIBA（登録商標）（75 U/kg）を陽性対照とした。

意識のある（conscious）ニュージーランドホワイト（NZW）ウサギに2 mL/kgのFVIIIインヒビター（17,000 BU/kg）を静脈内投与して内在性FVIIIを枯渇させた。約20分後、5 mg/kgのキシラジン及び75 mg/kgのケタミンを皮下注射して動物を麻酔した。ウサギを加温パッド上に横たわらせて低体温になるのを防ぎ、右後肢の第2指（digit II）の毛を剃った。インヒビター血漿の適用から45分後に血液供給マトリクスの末端から3mmで爪を切った。次いで、出血している爪を浸すことによって、生理食塩水（室温）を入れたチューブに30分間血液を採取した。この最初の観察期間の後、生理食塩水のチューブを交換して傷口の乾燥を防いだ。各群につき6匹の雄のNZWウサギを使用した。動物に試験物質又は対照物質を静脈内投与した。試験物質又は対照物質の投与10分後、出血している爪を生理食塩水の入った3番目のチューブに入れ、再び30分間血液を採取した。各チューブについて、血液量を重量測定法で測定した。実験の手順を図３Ａに示す。第2の観察期間の終了時に過剰量のペントバルビタールの注射によってウサギを犠牲にした。

処置の適用前後30分以内の血液損失を、中央値、四分位範囲（IQR）、範囲（最小から最大）、算術平均及び図３Ｂに示すような変動係数を使用して、治療群でまとめた。約826 ng/kgのFXa及び約0.44 mg/kgのFIIの有効投与量は、FEIBA（登録商標）の比率と比較して90％低減したFII量を有する。この結果から、FII量を低減し、FXaをわずかに増加させることで、血友病動物モデルにおける出血を治すために十分であることが実証される。

動物をFVIIIインヒビターで前処理して、インヒビターを有する血友病患者の状況に非常に類似した一過性のＡ型血友病の状態にした。ネイルクリップ出血モデルを使用して試験物質及び対照物質の有効性を評価した；トロンボエラストグラフィー及びCATアッセイを実施して追加の情報を取得した（実施例３を参照されたい）。ネイルクリップ出血アッセイでは、緩衝液の場合よりもFEIBA（登録商標）（75 U/kg）の場合に血液損失が統計的に有意に少なく（p=0.02273）、複雑な実験系が正しく機能している統計的証拠が得られた。予備的な観点から、FII（4.38 mg/kg）＋FXa（275 ng/kg）及びFII（0.44 mg/kg）＋FXa（826 ng/kg）での処置によって、緩衝液よりも統計的に有意に少ない血液損失が示された（p≦ 0.01403）。結論として、FXaの量をわずかに増加させることによって、止血効果を失くすことなくFII/FXaの組合せにおけるFIIの量を劇的に減少することが実現可能である。このことは、FII/FXaの組換え体の組合せのための組換えFIIの商業的生産を経済的により容易にするであろう。

［実施例３：トロンボエラストグラフィー及びCATアッセイによるウサギ全血又は血漿のex vivo分析］
FEIBA（登録商標）、FII若しくはFXaの単独または組合せ、あるいは緩衝液の投与後のFVIII阻害されたウサギの血液サンプルを、トロンボエラストグラフィー（TEG）によってex vivoで分析した。測定は、TEG hemostasis analyzer 5000（Haemonetics Corp, USA）を使用して37℃で実施した。FVIII-インヒビター血漿の投与前及び投与45分後、試験物質又は対照物質の投与直後、及び2回目の出血観察期間の最後（試験物質投与のおよそ40分後）に血液をサンプリングした。血液は、0.1 mLのクエン酸ナトリウム及び21μLのCTI（Haematologic Technologies, 3 mg/mL）を充填した2-mLのシリンジ（20ゲージ針）を使用して中央耳動脈（central ear artery）に穿刺することによってサンプリングした。2回目の出血観察期間の最後に心穿刺を行って動物から放血させた。1 mLのクエン酸加全血（血液：クエン酸＝10:1）を採った。各血液サンプル（320μL）を20μLのTF（最終濃度0.04 pM）と混合し、予め温めたTEGキュベット中の20μLの0.2 M CaCl₂溶液で37℃で再石灰化した。速やかに測定を開始し、各血液サンプルについて並行して二重に測定した。TEG測定は、全ての関連する測定が得られた後に停止するか、又は凝血塊が形成しない場合には2時間後に中止した。凝固時間（R-時間）、凝血塊形成速度（K-時間）、凝血塊強化速度（角度）及び凝血塊の最大硬度（MA）のTEGパラメーターを記録した。

75 U/kgのFEIBA（登録商標）での処置5分後にTEGでウサギ全血をex vivo分析した結果（図４）、緩衝液の場合と比較してR-時間の統計的に有意な短縮が示された（p<0.001）。全ての他の処置群でも同様であった（p<0.001）。試験物質投与のおよそ40分後である試験終了時にも、凝固時間がFVIII-阻害血液のレベルに戻ったFII単独処置群を除いて、効果が観察された。一般に、TEGアッセイはFXaに対して非常に感受性が高いようである。FXa単独ではin vivoでの相対的血液損失の減少には有効ではなかったが、血液サンプルはex vivoで有意に低下したR-時間を示した。

ウサギ血漿サンプルをCAT分析によっても分析した。図５は、4つの時点の全てでの各投与群1匹の代表的なトロンビン生成プロファイルを示す。FII単独投与した群は示していないが、トロンビン生成に対して効果を有さなかった。陽性対照（75 U/mL FEIBA(登録商標)）の投与によって、処置5分後のトロンビン生成が最も大きく上昇した。FVIII-阻害したウサギを血漿由来のヒトFII及びFXaを組合せて処置すると、ウサギ血漿におけるトロンビン生成に有益な効果が示され、FEIBA（登録商標）対照よりも正常なベースラインにより近いETP値に達した。トロンビン生成の緩やかな上昇は、血栓形成活性の指標となり得るため、膨大なトロンビン生成よりも好ましい。CATアッセイでの種々のFII/FXa投与量間で最も明らかな相違は、FII濃度に依存したトロンビンプロファイルの高いETP値（曲線下面積）である。このことは、血漿サンプルに導入され、FXaによってトロンビンに速やかに活性化されるプロトロンビン形態の追加の基質によって説明することができる。単独で投与されるFII又はFXa及び緩衝液を投与された動物の血漿では、トロンビン生成に顕著な影響はなかった。

他に示さない限り、明細書及び請求の範囲において使用する成分の量、分子量等の性質、反応条件等を表す全ての数値は、「約」との用語によって全ての場合に改変されることが理解されるべきである。従って、逆の記載がない限り、明細書及び添付した請求の範囲に示す数値パラメーターは、本発明によって得ようとする所望の性質に応じて変動し得る近似値である。少なくとも、そして請求の範囲への均等論の適用を制限する試みとしてでなく、各数値パラメーターは、少なくとも報告された有効桁の数を考慮して、通常の端数処理技術（rounding techniques）を適用して、解釈されるべきである。本発明の広い範囲を示す数値範囲及びパラメーターが近似値である一方、具体的な例において記載した数値は可能な限り正確に報告されている。しかしながら、いずれの数値も、それら個々の試験測定でみられる標準偏差から必然的に生じるいくらかの誤差を内在的に含む。

本発明を記載する文脈（特に以下の請求項の文脈）で使用される用語「a」、「an」、「the」及び類似の指示対象は、本明細書中で他に記載のない限り、あるいは文脈によって明らかに矛盾のない限り、単数及び複数の双方を含むものと解釈されるべきである。本明細書中の数値範囲の記載は、単にその範囲内にあるそれぞれ別個の数値の個々の記載を省略した方法として機能していることが意図される。本明細書中で他に記載のない限り、それぞれの個々の数値が、本明細書中で個々に記載されているように明細書中に組み入れられる。本明細書中で記載した全ての方法は、本明細書中で他に記載のない限り、あるいは文脈によって明らかに矛盾のない限り、適切な任意の順序で実施することができる。本明細書に提供された任意及び全ての例、又は例示的な用語（例えば「等」）の使用は、単に本発明の理解をより容易にすることを意図するものであり、別の方法で請求された本発明の範囲に制限を課すものではない。明細書中のいずれの用語も、本発明の実施に必須の請求されていない要素を示すものと解釈されるべきではない。

本明細書に開示された本発明の択一的要素又は実施形態のグループ分けは、制限的なものとして解釈されるべきではない。各グループのメンバーは、個々に、又は、本明細書中に見出されるそのグループの他のメンバー又は他の要素との任意の組み合わせで言及され、請求項に記載され得る。あるグループの1以上のメンバーが、便宜的な理由及び／又は特許性の理由によってグループに含められ、又はグループから外され得ることが予測される。そのような包含又は削除が生じた場合、本明細書は、添付した請求の範囲に使用される全てのマーカッシュグループの記載要件を満たすように改変されたグループを含むものとみなされる。

本発明を実施するために本発明者等が知り得るベストモードを含めた本発明の特定の実施形態が本明細書に記載されている。当然のことであるが、これらの記載された実施形態に対する変更は、上記の記載を読めば当業者には明らかであろう。本発明者等は、当業者がそのような変更を適宜用いることを予測しており、本明細書に具体的に記載されたものとは異なって本発明が実施されることを意図する。従って、本発明は、適用される法によって許容されているように添付した請求の範囲に記載された主題の全ての改変及び等価物を包含する。更に、本明細書中で別に記載のない限り、あるいは文脈によって明らかに矛盾のない限り、上記の構成要件のその全ての可能な変更における任意の組合せが本発明に包含される。

更に、本明細書全体を通して特許及び刊行物を数多く引用している。上記の引用した文献及び刊行物はそれぞれ、参照によりその全体を本明細書に個別に組み入れられる。

最後に、本明細書に開示した本発明の実施形態は本発明の原理の説明であることが理解されるべきである。使用可能な他の改変が本発明の範囲内に含まれる。従って、限定するものではなく、例として、本発明の他の形態を、本明細書の教示に従って利用することができる。従って、本発明は、示されかつ記載されたものに厳密に限定されるものではない。

Claims (12)

1. プロトロンビン（FII）及び活性化第X因子（FXa）を含有する出血性疾患の治療のための組成物であって、該組成物中に存在するFIIがFXa 1モルに対して20,000モル未満であり、かつ組成物中のFIIの濃度が約105〜700nMである、上記組成物。
2. FII及びFXaが血漿由来であるか、又は組換え体である、請求項１記載の組成物。
3. 患者における出血性疾患の治療のための医薬の製造における使用のための組成物であって、該組成物がプロトロンビン（FII）及び活性化第X因子（FXa）を含有し、該組成物中に存在するFIIがFXa 1モルに対して20,000モル未満であり、かつ組成物中のFIIの濃度が約105〜700nMである、上記組成物。
4. FIIの投与量が約0.44mg/kgであり、FXaの投与量が約826ng/kgである、請求項３記載の使用のための組成物。
5. FIIの投与量が約0.2mg/kg〜約1mg/kgであり、FXaの投与量が約560ng/kg〜約1100ng/kgである、請求項３記載の使用のための組成物。
6. FIIの投与量が約1.2mg/kg〜約5mg/kgであり、FXaの投与量が約200ng/kg〜約540ng/kgである、請求項３記載の使用のための組成物。
7. 出血性疾患がＡ型血友病、Ｂ型血友病、フォン・ヴィレブラント病、インヒビターを有する先天性Ａ型血友病又はFVIIIに対する阻害性自己抗体を有する後天性Ａ型血友病、インヒビターを有する先天性Ｂ型血友病又はFIXに対する阻害性自己抗体を有する後天性Ｂ型血友病、外傷による失血、FVII欠乏症、FV欠乏症、FX欠乏症、FXI欠乏症、FXIII欠乏症、フィブリノゲン欠乏症、プロトロンビン欠乏症、希釈性（dilutional）凝固障害、血小板減少症、高リスクの手術による失血、脳出血、フォン・ヴィレブラント因子に対するインヒビターを有するフォン・ヴィレブラント病、又はこれらの組合せである、請求項１〜６のいずれか1項記載の組成物。
8. 非経口注入、皮下注射、筋肉内注射、又は静脈内注射を介して投与される、請求項１〜７のいずれか1項記載の組成物。
9. 組成物が医薬組成物である、請求項１〜８のいずれか1項記載の組成物。
10. 少なくとも1種の賦形剤を更に含有する、請求項１〜９のいずれか1項記載の組成物。
11. 賦形剤が、水、NaCl又は等張性のための他の塩、5％デキストロース水溶液、pH2-8の緩衝溶液、トレハロース、マンニトール、ソルビトール、リン酸塩緩衝剤、酢酸塩緩衝剤、塩又はアミノ酸等の等張化剤、及び界面活性剤ポリオキシエチレン-ソルビタンモノオレエート（TWEEN 80）からなる群より選択される、請求項１０記載の組成物。
12. ヒトプロトロンビン（FII）及び活性化第X因子（FXa）を含有する抗凝固活性の逆転を補助するための組成物であって、該組成物中に存在するFIIがFXa 1モルに対して20,000モル未満であり、かつ組成物中のFIIの濃度が約105〜700nMである、上記組成物。

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