CN106413744B - 用于在出血性疾病治疗中改善止血的人凝血酶原和活化的因子x的组合物 - Google Patents

Abstract

本文公开了一种用于在出血性疾病治疗中改善止血和逆转抗凝血活性的组合物以及方法。本文中公开了，与

Description

用于在出血性疾病治疗中改善止血的人凝血酶原和活化的因 子X的组合物

相关申请的交叉引用

本申请主张2014年3月14日提交的美国临时专利申请No.61/953,496的权益，并通过引用将其全部内容并入本文。

技术领域

本文公开了一种用于在出血性疾病治疗中改善止血和逆转抗凝血活性的组合物以及方法。

背景技术

人体通过凝血级联来产生血块，是身体止血的主要机理。血块通过血小板在纤维蛋白基质中粘附在一起以在损伤的血管处形成栓子而产生。身体如果不能形成血块会导致可能非常危险的出血过多。在个体中如果血液不能适当地凝血，这通常是出血性疾病的标志。

不能形成血块可能是由于凝血级联中凝血因子的缺乏或缺失。例如，作为最常见的血友病类型，血友病甲主要是一种缺乏因子VIII(FVIII)的遗传性出血性疾病。对于受伤的患有血友病甲的人来说，出血不容易止住，需要更长的时间才能被控制。在FVIII替代疗法中，抗FVIII的抗体(也称之为抑制物)的研究，是血友病甲的治疗中的另一挑战。

另外一种相对少见的血友病，血友病乙也主要是一种遗传性出血性疾病，其导致因子IX(FIX)缺乏，也被称为Christmas疾病。在FIX替代疗法中，抗FIX的抗体(也称之为抑制物)的研究，是血友病乙的治疗中的另一挑战。

另一种出血性疾病，冯·威利布兰德疾病，也是一种遗传性基因疾病，它是由冯·威利布兰德因子(vWF)的缺乏或缺陷引起的。该vWF在血液凝结的起始步骤中很关键，因为其与血小板相互作用在伤口处形成栓子。

出血性疾病的治疗通常涉及缺失或缺乏的凝血因子的替代。这些因子可以从捐献的人血浆中纯化(血浆源因子)，或者通过基因重组制备(重组因子)。

当患有出血性疾病的个体使用FVIII替代疗法治疗，且身体将这种治疗视为威胁而非治疗时，会产生抗体(也被称为抑制物)。响应于这种察觉的威胁，免疫系统会产生抗体(也被称为抑制物)，其将攻击FVIII。这可能会非常危险，因为抑制物会阻止或抑制FVIII控制出血。因此，在形成抵抗给药的凝血因子的抑制物的情况下，必须实施旁路治疗(bypasstherapies)。在约30％的患有严重血友病甲的患者中，FVIII中和抗体的形成使得血友病甲的治疗变得复杂。类似的抑制物或中和抗体的形成也会在使用FIX或vWF替代疗法的病人身上发生。目前，对于已经形成抗FVIII或FIX的抑制物的患者而言，存在两种标准治疗方案：使用

(巴克斯特医疗保健公司，迪尔菲尔德，伊利诺伊州)或者重组因子FVIIa的单一药物治疗。还存在其它方案，例如使用凝血酶原复合物甚至血浆置换，但其副作用更多而且还不能一样有效。

(因子八抑制物旁路活性)在血友病患者的治疗中已经使用了超过三十年。它已经成为带有抑制物的血友病患者的旁路疗法的主要部分，可在93％的情况中控制出血，并且具有很高的安全性。一些患者使用

或重组FVIIa的单药治疗难以治疗或者无响应，因此，本领域存在改进抑制物疗法的需求。本申请发明人已经发现了用于出血性疾病治疗的人凝血酶原(FII)和活化的因子X(FXa)的有效比，其需要更少量的FII。FII和FXa可以是重组的或血浆源的。

发明内容

本发明的组合物和方法涉及在出血性疾病的治疗中改善止血和帮助逆转抗凝血活性。

本文中记载了有助于出血性疾病的治疗和逆转抗凝血活性的凝血酶原(FII)和活化的因子X(FXa)的有效比。FII和FXa可以是重组的或血浆源的。

在特定的实施方式中，包括用于治疗出血性疾病的组合物，该组合物含有FII和FXa，其中，FXa对FII的摩尔比大于1∶20,000。

在其他实施方式中，用于治疗出血性疾病的组合物含有约0.44mg/kg的FII和约826ng/kg的FXa。或者，该组合物可含有约0.2mg/kg～约1mg/kg的FII和约560ng/kg～约1100ng/kg的FXa。或者，该组合物可含有约4.4mg/kg的FII和约275ng/kg的FXa。或者，该组合物可含有约1.2mg/kg～约5mg/kg的FII和约200ng/kg～约540ng/kg的FXa。

在其他实施方式中，出血性疾病可包括血友病甲、血友病乙、冯·威利布兰德病、带抑制物的先天性血友病甲或带FVIII抑制性自身抗体的获得性血友病甲、带抑制物的先天性血友病乙或带FIX抑制性自身抗体的获得性血友病乙、创伤失血、因子VII(FVII)缺乏、因子V(FV)缺乏、因子X(FX)缺乏、因子XI(FXI)缺乏、因子XIII(FXIII)缺乏、纤维蛋白原缺乏、凝血酶原缺乏、稀释性凝血病、血小板减少症、高风险手术导致的失血、颅内出血、带冯·威利布兰德因子抑制物的冯·威利布兰德病，或者这些疾病的组合。

其他的实施方式包括用于治疗出血性疾病的药物组合物，该药物组合物含有FII、FXa和至少一种赋形剂，其中，FXa与FI的摩尔比大于1∶20,000。FII和FXa可以是血浆源的或重组的。

在特定实施方式中，药物组合物可含有约0.44mg/kg的FII、约826ng/kg的FXa和至少一种赋形剂。或者，该药物组合物可含有约0.2mg/kg～约1mg/kg的FII、约560ng/kg～约1100ng/kg的FXa和至少一种赋形剂。或者，该药物组合物可含有约4.4mg/kg的FII、约275ng/kg的FXa和至少一种赋形剂。或者，该药物组合物可含有约1.2mg/kg～约5mg/kg的FII、约200ng/kg～约540ng/kg的FXa和至少一种赋形剂。

在其他实施方式中，记载了一种治疗出血性疾病的方法，该方法包括给药含有FII和FXa的组合物，其中，FXa对FII的摩尔比大于1∶20,000。FII和FXa可以是血浆源的或重组的。

进一步的实施方式中包括一种用于帮助逆转抗凝血活性的组合物，该组合物含有FII和FXa，其中，FXa对FII的摩尔比大于1∶20,000。FII和FXa可以是血浆源的或重组源的。

附图说明

图1为显示在FVIII抑制性人血浆中，人凝血酶原(FII)和活化的因子X(FXa)的不同组合的代表性的凝血酶生成情况的图表。

图2为显示使用FVIII抑制性人血浆的自动校正凝血酶曲线法(CAT)检测中的FII和FXa的交叉滴定(cross-titrated)的图表。

图3显示了，在诱导性血友病兔的剪指甲(nail-clip)出血模型中，人凝血酶原(FII)和活化的因子X(FXa)的不同组合的即时疗效。图3A为实验过程的示意性总结。图3B为显示在剪指甲后的相对失血量的图表，该失血量在静脉给药FII和/或FXa、

(阳性对照)或缓冲剂(阴性对照)前后监测30分钟。每组的中位数用黑线显示。

图4为显示来自单独或联合使用FII和FXa治疗的FVIII抑制性兔子的全血样本的体外分析的图表。

图5为显示来自单独或联合使用FII和FXa治疗FVIII抑制性兔子的血浆样本的CAT分析的图表。

具体实施方式

本文中记载了帮助出血性疾病治疗和逆转抗凝血活性的人凝血酶原(FII)和活化的因子X(FXa)的有效比。

本文公开的用于治疗出血性疾病的组合物含有FII和FXa，其中，FXa对FII的摩尔比大于1∶20,000。FII和FXa可以是血浆源的或重组的。

重组蛋白例如FII和FXa的制备为本领域周知。例如，EP 1460131描述了一种在人类细胞系中制备重组人凝血因子的方法。进一步地，WO 2005/038019描述了重组制备高产量的凝血因子。本领域也周知从血浆制品中分离凝血因子的方法。例如美国专利4,883,598描述了使用液相色谱从血浆或血浆制品中分离凝血因子的方法。

是血浆源的活化的凝血酶原复合物浓缩剂，过去常常用于治疗带抑制物的血友病患者的出血情况。FII和FXa被认为是介导

止血效果的最关键成分。在

中的FXa对FII的摩尔比在1∶20,000-40,000的范围内，即1U/mL的

产生0.035-0.07nM的FXa和1400nM的FII的血浆浓度。在FXa对FII的摩尔比范围会导致较高的凝血酶原需求，而凝血酶原的重组生产具有挑战性。FII和FXa是具有多结构域和翻译后修饰的复杂蛋白质。这两者均可以在哺乳动物细胞系，例如CHO中，重组生产。在本实施方式的组合物中，因子X需要进一步活化为FXa从而与FII共同配制。

“带抑制物”的血友病患者可以指带有抗体、带有中和抗体、带有抑制性抗体等的血友病患者。当患有出血性疾病的个体使用替代疗法治疗且身体将这种疗法视为一种威胁而非治疗时，可能形成抑制物。

传统上，基于

中所示的FXa/FII比，已经开发了重组的部分凝血酶原酶，以探索凝血因子的组合的疗效。然而，在该方法中，高含量的重组FII的表达和生产被认为是限制因素。已经进行了大量研究以寻找具有与

同样活性和疗效、但需要较低含量的FII的人FII与FXa的有效比。通过使用最新技术的表达平台和克隆筛选技术的探索性表达研究证明了重组因子X和凝血酶原的生成的技术可行性。在CHO细胞中的最新技术的表达系统为两种因子以高蛋白质品质和功效提供了高产量。重组FXa和凝血酶原的组合可以被用作血友病抑制物疗法的方案。本实施方式的组合物的另一个优点是降低了血栓形成的风险，因为FII的浓度更低，这可能导致更少的自发凝血事件，特别是在非血友病患者中用于逆转抗凝血活性时。

令人惊讶地是，与

中所发现的FII与FXa的比值非常不同的FII与FXa的比值，在控制出血上同样有效。在特定的实施方式中，用于治疗出血性疾病的组合物含有FII和FXa，其中FXa对FII的摩尔比大于约1∶20,000、大于约1∶19,000、大于约1∶18,000、大于约1∶17,000、大于约1∶16,000、大于约1∶15,000、大于约1∶14,000、大于约1∶13,000、大于约1∶12,000、大于约1∶11,000、大于约1∶10,000、大于约1∶9,000、大于约1∶8,000、大于约1∶7,000、大于约1∶6,000、大于约1∶5,000、大于约1∶4,000、大于约1∶3,000、大于约1∶2,000、大于约1∶1,000、大于约1∶950、大于约1∶900、大于约1∶850、大于约1∶800、大于约1∶750、大于约1∶700、大于约1∶650、大于约1∶600、大于约1∶550、大于约1∶500、大于约1∶450、大于约1∶400、大于约1∶350、大于约1∶300、大于约1∶250、大于约1∶200、大于约1∶150、大于约1∶100、大于约1∶95、大于约1∶90、大于约1∶85、大于约1∶80、大于约1∶75、大于约1∶70、大于约1∶65、大于约1∶60、大于约1∶55、大于约1∶50、大于约1∶45、大于约1∶40、大于约1∶35、大于约1∶30、大于约1∶25、大于约1∶20、大于约1∶15、大于约1∶10或者大于约1∶5。

在其他实施方式中，用于治疗出血性疾病的组合物含有FII和FXa，其中的FXa对FII的摩尔比为约1∶19,999、约1∶19,500、约1∶18,500、约1∶17,500、约1∶16,500、约1∶15,500、约1∶14,500、约1∶13,500、约1∶12,500、约1∶11,500、约1∶10,500、约1∶9,500、约1∶8,500、约1∶7,500、约1∶6,500、约1∶5,500、约1∶4,500、约1∶3,500、约1∶2,500、约1∶1,500、约1∶950、约1∶900、约1∶850、约1∶800、约1∶750、约1∶700、约1∶650、约1∶600、约1∶550、约1∶500、约1∶450、约1∶400、约1∶350、约1∶300、约1∶250、约1∶200、约1∶150、约1∶100、约1∶95、约1∶90、约1∶85、约1∶80、约1∶75、约1∶70、约1∶65、约1∶60、约1∶55、约1∶50、约1∶45、约1∶40、约1∶35、约1∶30、约1∶25、约1∶20、约1∶15、约1∶10或者约1∶5。

在其他实施方式中，用于治疗出血性疾病的组合物含有约0.1mg/kg的FII和约800ng/kg的FXa、约0.15mg/kg的FII和约700ng/kg的FXa、约0.2mg/kg的FII和约600ng/kg的FXa、约0.25mg/kg的FII和约500ng/kg的FXa、约0.3mg/kg的FII和约400ng/kg的FXa、约0.35mg/kg的FII和约300ng/kg的FXa、约0.4mg/kg的FII和约200ng/kg的FXa、约0.45mg/kg的FII和约200ng/kg的FXa，或者约0.5mg/kg的FII和约100ng/kg的FXa。在另一实施方式中，用于治疗出血性疾病的组合物含有约0.44mg/kg的FII和约826ng/kg的FXa。在其他实施方式中，用于治疗出血性疾病的组合物含有约4.4mg/kg的FII和约275ng/kg的FXa。

在特定的实施方式中，用于治疗出血性疾病的组合物含有约0.1mg/kg～约.5mg/kg的FII和约600ng/kg～约1100ng/kg的FXa、约0.5mg/kg～约1mg/kg的FII和约500ng/kg～约1000ng/kg的FXa、约1mg/kg～约1.5mg/kg的FII和约450ng/kg～约950ng/kg的FXa、约2.0mg/kg～约2.5mg/kg的FII和约400ng/kg～约900ng/kg的FXa、约2.5mg/kg～约3.0mg/kg的FII和约350ng/kg～约850ng/kg的FXa、约3.5mg/kg～约4.5mg/kg的FII和约300ng/kg～约600ng/kg的FXa或者约4.5mg/kg～约5.5mg/kg的FII和约200ng/kg～约600ng/kg的FXa。在其他实施方式中，用于治疗出血性疾病的组合物含有约0.2mg/kg～约1mg/kg的FII和约560ng/kg～约1100ng/kg的FXa。在另一实施方式中，用于治疗出血性疾病的组合物含有约1.2mg/kg～约5mg/kg的FII和约200ng/kg～约540ng/kg的FXa。

在一些实施方式中，FXa为约90％FXaα和10％FXaβ的形式。或者，FXa可以为约100％FXaα和0％FXaβ的形式、约80％FXaα和20％FXaβ的形式、约70％FXaα和30％FXaβ的形式、约60％FXaα和40％FXaβ的形式、约50％FXaα和50％FXaβ的形式、约40％FXaα和60％FXaβ的形式、约30％FXaα和70％FXaβ的形式、约20％FXaα和80％FXaβ的形式、约10％FXaα和90％FXaβ的形式或者约0％FXaα和100％FXaβ的形式。

出血性疾病包括但不限于血友病甲、血友病乙、冯·威利布兰德病、带抑制物的先天性血友病甲或带FVIII抑制性自身抗体的获得性血友病甲、带抑制物的先天性血友病乙或带FIX抑制性自身抗体的获得性血友病乙、创伤失血、因子VII(FVII)缺乏、因子V(FV)缺乏、因子X(FX)缺乏、因子XI(FXI)缺乏、因子XIII(FXIII)缺乏、纤维蛋白原缺乏、凝血酶原缺乏、稀释性凝血病、血小板减少症、高风险手术导致的失血、颅内出血、带冯·威利布兰德因子抑制物的冯·威利布兰德病，或者这些疾病的组合。

抗凝血剂过去常常用于治疗和防止血栓。具有形成血栓风险或者为防止血栓增大的个体被给药抗凝血剂。具有形成血栓风险的个体包括具有心房纤颤、机械心脏瓣膜、心内膜炎、二尖瓣狭窄、某些血液疾病，以及进行过髋关节置换术或膝关节置换手术的个体。有些情况下有必要逆转抗凝血，例如在具有高出血风险的情况下。一些抗凝血剂例如华法林的药理效应，可以通过给药维生素K而容易地逆转。一些最近推出的抗凝血剂例如阿哌沙班、贝曲西班和利伐沙班则不能通过给药维生素K而容易地逆转。目前，不存在由这些抗凝血剂引起的出血的解决办法，这是相当危险的。因此，本文所公开的组合物的另外一个优点是当其在非血友病患者中用于逆转抗凝血时，产生较少的自发凝血事件。

本申请所公开的组合物的给药途径包括但不限于肠胃外注射、静脉注射、皮下注射和肌肉注射。

剂量可以是单剂量或者累积剂量(连续剂量)，本领域技术人员可以容易地进行决定。例如，先天性血友病的治疗可能包括终身给药有效剂量的本文所公开的组合物。作为非限定性的例子，本文所公开的组合物的有效剂量可以是对个体的一次给药，例如，单次注射。或者，出血性疾病的治疗可以包括将有效剂量的本文所公开的组合物在下述一段时期内的多次给药，例如每天，每若干天，或者每周。作为非限制性的例子，本文所公开的组合物可以每周对个体给药两次或三次。给药的时间可以依据个体的不同而不同，其取决于例如个体症状的严重程度等因素。例如，本文所公开的组合物的有效剂量可以是在一段不确定的时期内，对个体每天给药一次，或者每两到三天给药一次。本领域技术人员知道可以在整个治疗的疗程中监测个体的状况，据此调整本文所公开的组合物的给药有效剂量。临床疗效可以通过控制出血来进行描述。给药可以是按需的、预防性的、术前或围手术期。

特定实施方式包括用于治疗出血性疾病的组合物，其含有血浆源的FII、FXa和至少一种赋形剂，其中，FXa对FII的摩尔比大于约1∶20,000。赋形剂包括但不限于水、用于等渗的NaCl或其他盐、5％的葡萄糖水溶液、pH为2～8的缓冲溶液，作为稳定剂的海藻糖、甘露醇或山梨醇，缓冲液例如磷酸盐或乙酸盐缓冲液，等渗剂例如盐或氨基酸，以及表面活性剂聚氧乙烯-脱水山梨醇单油酸酯(TWEEN 80)。进一步地该药物组合物可为冻干的。

在一些实施方式中，用于治疗出血性疾病的药物组合物含有至少一种赋形剂、FII和FXa，其中，FXa对FII的摩尔比为大于约1∶20,000、大于约1∶19,000、大于约1∶18,000、大于约1∶17,000、大于约1∶16,000、大于约1∶15,000、大于约1∶14,000、大于约1∶13,000、大于约1∶12,000、大于约1∶11,000、大于约1∶10,000、大于约1∶9,000、大于约1∶8,000、大于约1∶7,000、大于约1∶6,000、大于约1∶5,000、大于约1∶4,000、大于约1∶3,000、大于约1∶2,000、大于约1∶1,000、大于约1∶950、大于约1∶900、大于约1∶850、大于约1∶800、大于约1∶750、大于约1∶700、大于约1∶650、大于约1∶600、大于约1∶550、大于约1∶500、大于约1∶450、大于约1∶400、大于约1∶350、大于约1∶300、大于约1∶250、大于约1∶200、大于约1∶150、大于约1∶100、大于约1∶95、大于约1∶90、大于约1∶85、大于约1∶80、大于约1∶75、大于约1∶70、大于约1∶65、大于约1∶60、大于约1∶55、大于约1∶50、大于约1∶45、大于约1∶40、大于约1∶35、大于约1∶30、大于约1∶25、大于约1∶20、大于约1∶15、大于约1∶10或者大于约1∶5。

在其他实施方式中，用于治疗出血性疾病的药物组合物含有至少一种赋形剂、FII和FXa，其中，FXa对FII的摩尔比为约1∶19,999、约1∶19,500、约1∶18,500、约1∶17,500、约1∶16,500、约1∶15,500、约1∶14,500、约1∶13,500、约1∶12,500、约1∶11,500、约1∶10,500、约1∶9,500、约1∶8,500、约1∶7,500、约1∶6,500、约1∶5,500、约1∶4,500、约1∶3,500、约1∶2,500、约1∶1,500、约1∶950、约1∶900、约1∶850、约1∶800、约1∶750、约1∶700、约1∶650、约1∶600、约1∶550、约1∶500、约1∶450、约1∶400、约1∶350、约1∶300、约1∶250、约1∶200、约1∶150、约1∶100、约1∶95、约1∶90、约1∶85、约1∶80、约1∶75、约1∶70、约1∶65、约1∶60、约1∶55、约1∶50、约1∶45、约1∶40、约1∶35、约1∶30、约1∶25、约1∶20、约1∶15、约1∶10、或约1∶5.

在另一实施方式中，用于治疗出血性疾病的组合物含有至少一种赋形剂和，约0.1mg/kg的FII和约800ng/kg的FXa、约0.15mg/kg的FII和约700ng/kg的FXa、约0.2mg/kg的FII和约600ng/kg的FXa、约0.25mg/kg的FII和约500ng/kg的FXa、约0.3mg/kg的FII和约400ng/kg的FXa、约0.35mg/kg的FII和约300ng/kg的FXa、约0.4mg/kg的FII和约200ng/kg的FXa、约0.45mg/kg的FII和约200ng/kg的FXa或者约0.5mg/kg的FII和约100ng/kg的FXa。在其他实施方式中，用于治疗出血性疾病的组合物含有约0.44mg/kg的FII和约826ng/kg的FXa。在其他实施方式中，用于治疗出血性疾病的组合物含有约4.4mg/kg的FII和约275ng/kg的FXa。

在特定实施方式中，用于治疗出血性疾病的药物组合物含有至少一种赋形剂和，约0.1mg/kg～约0.5mg/kg的FII和约600ng/kg～约1100ng/kg的FXa、约0.5mg/kg～约1mg/kg的FII和约500ng/kg～约1000ng/kg的FXa、约1mg/kg～约1.5mg/kg的FII和约450ng/kg～约950ng/kg的FXa、约2.0mg/kg～约2.5mg/kg的FII和约400ng/kg～约900ng/kg的FXa、约2.5mg/kg～约3.0mg/kg的FII和约350ng/kg～约850ng/kg的FXa、约3.5mg/kg～约4.5mg/kg的FII和约300ng/kg～约600ng/kg的FXa、或者约4.5mg/kg～约5.5mg/kg的FII和约200ng/kg～约600ng/kg的FXa。在其他实施方式中，用于治疗出血性疾病的组合物含有约0.2mg/kg～约1mg/kg的FII和约560ng/kg～约1100ng/kg的FXa。在其他实施方式中，用于治疗出血性疾病的组合物含有约1.2mg/kg～约5mg/kg的FII和约200ng/kg～约540ng/kg的FXa.

为确定有助于治疗出血性疾病的FXa对FII的摩尔比，采用体外-体内翻译方法。首先，使用全球止血检验系统，采用人血浆对组合的促凝血能力进行体外实验，并与

对比。接着，将所选定的FII/FXa血浆浓度转换为诱导性血友病兔的剂量，和急性出血模型中评估的疗效。

用于体外和体内评估人FII和FXa的不同比例的实验，采用经谨慎选择的市售的酶研究实验室(Enzyme Research Laboratories)提供的血浆源的蛋白质执行。针对该选择，从纯度(银染法、蛋白质印迹法)、活性(人和兔血浆中的凝血酶生成)、浓度和价格方面，对不同供应商提供的蛋白质进行了检测。

在多组分

的组合物和活性成分已知的情况下，进行两种因子的组合：人FII和FXa。使用基于人血浆的自动校正凝血酶曲线法(CAT)检测，以识别特定比例的FII/FXa组合，其在FVIII抑制性血浆中具有与

类似的体外促凝血效果。选择了三种FII/FXa比值，将其转换为临床前剂量和在兔出血模型中评估的疗效。三种组合物，第一种具有100％的FII和FXa(与

相同)、第二种具有10％的凝血酶原和300％的FXa，以及

它们表现出统计上的显著疗效。相比于之前的研究，后者剂量中含有少于～20倍的FII和大于4倍的FXa。具有25％的FII和200％的FXa的剂量并不有效。观察到的止血效果显示其并非由单独的FII或单独的FXa而得。总之，调节FII/FXa的比值以使活性和体内疗效维持不变，并且使重组型FII/FXa的重组蛋白生产仍然是可行的。

实施例1：在凝血酶生成检测中体外评价FXa/FII组合

使用自动校正凝血酶曲线法(CAT)检测来监测人血浆中物质的促-和抗凝血效果。凝血酶曲线(thrombogram)代表凝血酶在凝血血浆中的浓度，因此CAT是止血系统的一般性生理功能检测。该检测基于随组织因子(TF)启动的凝血的时间推移，测量凝血酶对荧光底物Z-G-G-R-AMC的裂解产生的荧光。该测量在购自赛默科技的96孔板荧光计Thrombograph^TM中实施，并必须使用凝血酶校准器来矫正内滤效应、不同捐献者的血浆颜色差别、底物消除和仪器差别。

采用CAT在FVIII抑制性血浆中检测血浆源的FII(140-1400nM)和FXa(0.035-0.21nM)的不同组合的促凝血活性。采用50贝特斯达(Bethesda)单位(BU)/mL的山羊抗FVIII血浆(巴克斯特)处理标准人血浆池(George King Biomedical)。添加玉米胰蛋白酶抑制物(CTI，40μg/mL，Haematologic Technologies)以抑制因子XIIa的预活化。采用1pMTF+4μM磷脂(PL)(PPP LOW试剂，Thrombinoscope BV)引发凝血。复钙后，在FluoroskanAscent读数仪(赛默科技；波长390/460nm)中，在37℃下监测凝血酶的产生90分钟。对每个样品进行重复测量。

使用针对兔血浆(40μL/mL CTI，最终血浆稀释度1∶3，0.6pM TF和4μM PL)优化的CAT方法，确认在加标(spike-in)研究中，人FII和FXa在兔血浆中仍具有活性。在剪指甲出血研究中，采用同样的CAT方法分析活体外(ex vivo)兔血浆样本。

首先在基于人血浆的CAT检测中，检测降低FII/FXa组合中FII的量的可行性。起始点为在

中发现的FXa∶FII比值(1∶20,000)，其等同于0.07nM FXa和1400nM FII的血浆浓度。在维持FXa的浓度恒定为0.14nM(200％)的同时，将FII的浓度从1400nM(100％FII)降低到140nM(10％FII)的效果如图1所示。可以观察到单独的0.14nM FXa可将FVIII抑制性血浆中凝血酶的生成修正到与1U/mL

一样好。FII的存在，以剂量依赖的方式，将增加内源性凝血酶潜力(ETP)，因而获得比1U/mL

更高的凝血酶生成。

然后，在CAT检测中进行更宽浓度范围的FII(105nM～1400nM)和FXa(0.035～0.21nM)的交叉滴定(图2)。通过测定20个不同批次的1U/mL的

的效果，确定具有理想凝血活性的FII/FXa的目标范围。使用ETP作为CAT的比较参数，因其显示了响应于FII/FXa的最显著变化。若干FII/FXa的组合被认为落入能够修正FVIII抑制性血浆中凝血酶生成的

的活性的范围内，结果为等同于

的100％～7.5％的凝血酶原和100～300％的FXa(表1)。FII减少带来的轻微的凝血酶生成的降低可以通过FXa的适度增加来抵消。选择三种组合在诱导性血友病甲兔的体内疗效模型中进行试验。

表1.在使用FVIII抑制性人血浆的CAT检测中，具有等同于1U/mL

的促凝血效果(基于ETP值)的FXa∶FII摩尔比的总结。

(*表示在

中所发现的比例。标记为灰色的组合被选择用于体内研究。)

实施例2：体内：在诱导血友病兔模型中的疗效概念验证

本概念验证研究的目的是在FVIII抑制性兔的剪指甲(nail-clip)出血模型中，评价三种FII/FXa剂量共同给药或者单独给药的疗效(图3A)。FII含量最高的剂量为4.4mg/kgFII+275ng/kg FXa，其被定义为“

比例”，FII和FXa两者被定义为100％。第二个剂量1.1mg/kg FII+551ng/kg FXa中，FII被减少至25％且FXa被增加到200％。第三个剂量0.44mg/kg FII+826ng/kg FXa中，FII被减少至10％且FXa被增加到300％。对于每种治疗，疗效采用相比于只有缓冲剂的对照组，治疗后失血量的减少来确定。以

(75U/kg)作为阳性对照。

对意识清醒的新西兰大白(NZW)兔经静脉给药2mL/kg FVIII抑制物(17,000BU/kg)，以耗尽内源性FVIII。在大约20分钟后，通过皮下注射5mg/kg的甲苯噻嗪和75mg/kg的氯胺酮将动物麻醉。将兔放在加热垫上以防止体温过低，并且剃掉右后肢脚趾II上的毛。在施用抑制物血浆45分钟后从供血基质的远端边缘剪掉3mm指甲。在装有生理盐水(室温)的试管中，通过浸没流血的指甲，收集30分钟血。在第一观察期之后，替换生理盐水试管防止造成的伤口干燥。每组使用6只雄性NZW兔。使动物接受试验物或对照物的静脉给药。在施用试验物或对照物十分钟后，将出血的指甲插入到第三个装有生理盐水的第三个试管中，再次收集30分钟血。通过重量法测定每个试管的血量。实验过程如图3A所述。在第二观察期结束后通过注射过量的戊巴比妥杀死兔。

在实施治疗的前后30分钟内的失血量，如图3所述，使用中位数、四分位距(IQR)、范围(最小到最大)、算术平均值和变异系数对处理组进行总结。约826ng/kg的FXa和约0.44mg/kg的FII的有效剂量，相比于

比值，减少了90％的FII。该结果证实降低FII的含量并轻微提高FXa足以修正血友病动物模型中的出血。

采用FVIII抑制物预处理动物，使其患暂时性血友病甲，近似地模拟了带有抑制物的血友病患者的情况。采用剪指甲出血模型评价试验物和对照物的疗效；实施血栓弹性描记法和CAT检测以获得附加信息(参考实施例3)。在剪指甲出血模型中，相比于缓冲剂，使用

(75U/kg)在统计上显著地减少了失血量(p＝0.02273)，这提供了该复杂试验系统操作正确的统计学证据。从探索性的角度，使用FII(4.38mg/kg)+FXa(275ng/kg)和FII(0.44mg/kg)+FXa(826ng/kg)进行的治疗，相比于缓冲剂，显示了统计上显著的减少的失血量(p≤0.01403)。总之，在FII/FXa组合中，大量地减少FII的含量并轻微增加FXa的含量，而不损失止血疗效是可行的。这将是用于重组的FII/FXa组合的重组FII的商业生产在经济上更为容易。

实施例3：使用血栓弹性描记法和CAT检测对兔全血或血浆进行活体外分析

在给药

单独的FII或FXa、FII和FXa的组合或者缓冲液之后，对FVIII抑制性兔的血样使用血栓弹性描记法(TEG)进行活体外分析。使用TEG止血分析仪5000(美国血液技术公司，美国)在37℃执行测量。在给药FVIII抑制物血浆的前后45分钟、在给药试验物或对照物后立即、以及在第二出血观察期结束时(约试验物给药40分钟后)对血液进行采样。通过使用装有0.1mL柠檬酸钠和21μL CTI(美国血液技术公司，3mg/mL)的2-mL注射器(20号针头)穿刺中央耳动脉进行血液采样。在第二出血观察期结束时，通过心脏穿刺对动物进行放血。取1毫升的柠檬酸化的全血(血∶柠檬酸＝10∶1)。将每个血液样品(320μL)与20μL的TF.(0.04pM最终浓度)进行混合，在预热的37℃的比色皿中，采用20μL的0.2M CaCl₂溶液进行复钙。迅速进行测量，并且对每个血样平行进行多次测量。在获得所有相关的测量后，或者在没有血栓形成的情况下2小时后停止TEG运行。记录TEG参数：凝血时间(R-时间)、血栓形成速度(K-时间)、血栓强化速度(角度)和最大血栓硬度(MA)。

对使用75U/kg

处理五分钟后的TEG兔全血进行活体外分析，相比缓冲液，其显示了R-时间在统计上的显著减少(p＜0.001)(图4)。所有其他处理组也是同样(p＜0.001)。在研究结束时，约为给药试验物40分钟后，仍可以观察到该效果，除了单独使用FII的组，在该组中凝血时间恢复到FVIII抑制性血液的水平。总之，TEG分析显示出其对FXa非常敏感。当在体内FXa单独不能有效地减少相对失血量时，活体外血样显示出R-时间的显著降低。

兔血浆样品也采用CAT分析进行了分析。图5显示了每个剂量组的一只动物的在全部四个时间点的代表性凝血酶生成情况。采用单独的FII剂量的组没有进行图示，但其对凝血酶生成没有效果。阳性对照(75U/mL

)的给药在处理5分钟后获得了最大的凝血酶生成增加。使用血浆源的人FII和FXa的对FVIII抑制性兔的联合治疗，显示出它们对兔血浆中的凝血酶生成的有益效果，并获得了相比

对照更接近正常基线的ETP值。凝血酶生成的适度增加，相比于凝血酶大量生成更为优选，因为后者可能是血栓形成活性的指标。在CAT检测中，不同的FII/FXa剂量的最显著的不同为取决于FII浓度的凝血酶曲线的高ETP值(曲线下的面积)。这可以解释为凝血酶原形式的额外底物被添加到血浆样品中，其被FXa迅速地激活为凝血酶。采用单独给药FII或FXa以及缓冲剂的动物血浆，没有显著的影响凝血酶生成的效果。

除非另有声明，说明书和权利要求中使用的表示成分的数量、性能如分子量、反应条件等的数字应理解为在所有情况下均被词语“约”修饰。因此，除非有相反说明，在说明书和所附的权利要求中阐述的数值参数为近似值，其可根据本发明所寻求获得的期望性能而变更。最低限度上，不要试图将本发明限制为等同于权利要求的范围的教条，每个数字参数均应至少参考所记载的有效数字，通过进行通常的舍入技术进行理解。尽管阐述本发明较宽范围的数值范围和参数为近似值，但对具体实施例中列出的数值尽可能地进行了精确记载。然而，任何数值均由于其各自的测量方法的标准偏差而必然固有地含有一定的误差。

除非本文中另有说明或在内容上显出明显矛盾，在描述本发明的内容中(特别是在后述权利要求的内容中)，用语“一”、“一个”、“该”和类似指示词的使用，应解释为其涵盖了单数和复数两者。本文中所述的数值范围仅是作为一种单独地表述落在该范围之内的每个单个数值的简略方式。除非本文中另有说明，每个单个数值都被并入本说明书中，如同该数值在本文中被单独地列举。本文中描述的所有方法能够以任何合适的顺序实施，除非本文中另有说明或在内容上显出明显矛盾。除非另有说明，本文中提供的任意的和所有实施例或例证性语言的使用(如“例如”)，仅仅是为了更好的阐述本发明的实施方式，而不是对本发明的范围进行限制。说明书中的任何语言，均不应被解释为是表明任何未限定成分对本发明的实施是必要的。

本文公开的替代元素的分组或本发明实施例，都不该被理解为是限制。每个组成员均可以单独被引用或者被限定，或者与该组的其他元素或者本文中的其他元素进行任意组合。出于便利性和/或专利性的原因，将一个或多个元素包括进一个组或从一个组中删除。当任何这种包含或删除发生，说明书被认为包含修正后的该组，因而满足从属权利请求中使用的所有马库什组的书面描述。

本文中描述了本发明的特定实施例，包括发明人已知的实施发明的最佳模式。当然，上述实施例的变体对于在阅读上述说明之后的本领域的技术人员是显而易见的。本发明人预期本领域技术人员可适当采用这样的变体，并且本发明人预计本发明可以通过本文中的具体描述以外的方式实施。因此，根据适用法律所许可，本发明包括所附的权利要求中记载的主题的所有修改和等同物。进一步地，除非本文中另有说明或在内容上显出明显矛盾，本发明包括上述元素的任何组合在其任何可能的变体。

进一步地，在整个说明书中大量引用了专利和印刷出版物。每项上述所引用的参考文献和印刷出版物的全部内容通过引用完整地并入本文。

最后，应当理解本文中所公开的本发明的实施方法是对本发明的主旨的说明。在本发明的范围内可以采用其他的修改。因此，通过举例而非限制的方式，可以根据本文中的教导实施本发明的替代配置。因此，本发明的并不局限于其所精确显示和描述的内容。

Claims (16)

1.一种用于治疗出血性疾病的组合物，其含有凝血酶原(FII)和活化的因子X(FXa)，其中，FXa对FII的摩尔比大于1:2500，所述组合物中FII的浓度为140～700nM，并且所述组合物中FXa的浓度为0.07～0.21nM。

2.如权利要求1所述的组合物，其中，FII和FXa是血浆源的或重组的。

3.如权利要求1或2所述的组合物，其中，FII的浓度为0.44mg/kg，FXa的浓度为826ng/kg。

4.如权利要求1或2所述的组合物，其中，FII的浓度为0.2mg/kg～1mg/kg，FXa的浓度为560ng/kg～1100ng/kg。

5.如权利要求1或2所述的组合物，其中，FII的浓度为1.2mg/kg～5mg/kg，FXa的浓度为200ng/kg～540ng/kg。

6.如权利要求1或2所述的组合物，其中，所述出血性疾病为血友病甲、血友病乙、冯·威利布兰德病、创伤失血、FVII缺乏、FV缺乏、FX缺乏、FXI缺乏、FXIII缺乏、纤维蛋白原缺乏、凝血酶原缺乏、稀释性凝血病、血小板减少症、高风险手术导致的失血、颅内出血或者这些疾病的组合。

7.如权利要求6所述的组合物，其中，所述出血性疾病为带抑制物的先天性血友病甲、带FVIII抑制性自身抗体的获得性血友病甲、带抑制物的先天性血友病乙或者带FIX抑制性自身抗体的获得性血友病乙。

8.如权利要求1或2所述的组合物，其中，所述组合物通过肠胃外注射进行给药。

9.如权利要求8所述的组合物，其中，所述组合物通过皮下注射、肌肉注射或静脉注射进行给药。

10.如权利要求1或2所述的组合物，其中，所述组合物为药物组合物。

11.如权利要求1或2所述的组合物，其中，进一步含有至少一种赋形剂。

12.如权利要求11所述的组合物，其中，所述赋形剂选自于由以下构成的组：水、pH2～8的缓冲溶液、海藻糖、甘露醇、山梨醇、等渗剂以及表面活性剂聚氧乙烯-脱水山梨醇单油酸酯TWEEN 80。

13.如权利要求12所述的组合物，其中，所述赋形剂为5％的葡萄糖水溶液。

14.如权利要求12所述的组合物，其中，所述赋形剂选自用于等渗的NaCl或其它盐、磷酸盐缓冲液或者乙酸盐缓冲液。

15.如权利要求12所述的组合物，其中，所述等渗剂选自盐或氨基酸。

16.一种有助于逆转抗凝血活性的组合物，其含有人凝血酶原(FII)和活化的因子X(FXa)，其中，FXa对FII的摩尔比大于1:2500，所述组合物中FII的浓度为140～700nM，并且所述组合物中FXa的浓度为0.07～0.21nM。

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