JP6478569B2 - 温度応答性細胞塊作製方法 - Google Patents
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Description
本発明は、高温溶解型高分子を細胞培養系に添加することによって細胞塊を作製する方法、及び細胞の単層培養状態と細胞塊培養状態を可逆的に制御する方法に関する。
温度応答性高分子は、低音溶解型（Ｌｏｗｅｒ Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ：ＬＣＳＴ型）と高温溶解型（Ｕｐｐｅｒ Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ：ＵＣＳＴ型）の２種類に大別できる。生理的条件下でＬＣＳＴ型挙動を示すポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）（ＰＮＩＰＡＭ）は体温付近に相転移温度を持つことから、バイオマテリアルへの応用が盛んに研究されている。一方、有機溶液中で相転移を示すＵＳＣＴ型高分子の報告例はいくつか存在するが、水溶液中で、特に生理的条件下（例えば、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５）の溶媒中で相転移を示す高分子は非常に少ない（非特許文献１〜６）。
これまでに、本発明者らは、ウレイド基を有するポリアリルアミン−ｃｏ−ポリアリルウレア（ＰＡＵ）が生理的条件下においてＵＣＳＴ型挙動を示す珍しい高分子であることを報告してきた（特許文献１、非特許文献７）。ウレイド基が分子内又は分子間で水素結合を形成することで相分離すると考えられる。また、ＰＡＵは主鎖の分子量やウレイド基導入率を変化させることにより、相分離温度（ｐｈａｓｅ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ：Ｔｐ）を８〜６５℃の広範囲で制御可能である。このように新しい物性を持つＰＡＵは、生体分子等と特殊な相互作用をする可能性がある。
しかしながら、培養液中でＵＣＳＴ型高分子を添加し、温度変化によって、単層培養細胞から細胞塊を作製したという報告例はない。
Costa, R. O. R. & Freitas, R. F. S., Polymer, (2002) 43, 5879-5885
Pagonis, K. & Bokias, G., Polymer, (2004) 45, 2149-2153
Hoogenboom, R., et al., U. S. Aust. J. Chem., (2010) 63, 1173-1178
Hoogenboom, R., et al., U. S. Soft Matter, (2009) 5, 3590-3592
Koyama, M., et al., J. Phys. Chem. B, (2008), 112, 10854-10860
Buscall, R., et al., Eur. Polym. J., (1982) 18, 967-974
Shimada, N., et al., Biomacromolecules, (2011) 12, 3418-3422
本発明は、再生医療等の細胞培養において、細胞を単層培養状態から細胞塊状態に迅速かつ効率的に作製し、細胞塊を提供するための技術を提供することを目的とする。
本発明者らは、上記課題を解決すべく、細胞を細胞培養プレートに播種前又は播種後に、ＵＣＳＴ型高分子を添加し、培養温度を変化させることによって細胞塊を作製することに成功し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、以下の通りである。
［１］細胞塊を作製する方法であって、下記：
（ａ）下記式（Ｉ）：
［１］細胞塊を作製する方法であって、下記：
（ａ）下記式（Ｉ）：
（式中、
Ｒ１は、−ＮＨ２、−ＣＯＮＨ２、−ＣＯＯＮＨ２、−ＣＯＯＨ、
Ｒ１は、−ＮＨ２、−ＣＯＮＨ２、−ＣＯＯＮＨ２、−ＣＯＯＨ、
で示される置換基からなる群から選択され；
Ｒ２は、下式：
Ｒ２は、下式：
で示される置換基を意味し；
ｍは、１０以上の整数を意味し；
ｎは、０．４≦ｎ≦１を満たす数を意味し；及び
ｐ及びｑは、独立して、０〜６の整数を意味する）
で表される化合物又はその付加塩の水溶液を用意する工程；
（ｂ）上記工程（ａ）で用意した化合物又はその付加塩の水溶液を、細胞培養プレートに細胞を播種前又は播種後に添加する工程；及び
（ｃ）５％ＣＯ２存在下、相転移温度より低い温度又は３７℃で、１〜４８時間、細胞を培養する工程
を含み、ここで、工程（ｂ）で使用される式（Ｉ）で表される化合物又はその付加塩は、細胞培養液中で、４〜５０℃の範囲に相転移温度を有し、当該相転移温度より低い温度で不溶相を形成し、当該相転移温度より高い温度で溶解相を形成する、細胞塊を作製する方法。
ｍは、１０以上の整数を意味し；
ｎは、０．４≦ｎ≦１を満たす数を意味し；及び
ｐ及びｑは、独立して、０〜６の整数を意味する）
で表される化合物又はその付加塩の水溶液を用意する工程；
（ｂ）上記工程（ａ）で用意した化合物又はその付加塩の水溶液を、細胞培養プレートに細胞を播種前又は播種後に添加する工程；及び
（ｃ）５％ＣＯ２存在下、相転移温度より低い温度又は３７℃で、１〜４８時間、細胞を培養する工程
を含み、ここで、工程（ｂ）で使用される式（Ｉ）で表される化合物又はその付加塩は、細胞培養液中で、４〜５０℃の範囲に相転移温度を有し、当該相転移温度より低い温度で不溶相を形成し、当該相転移温度より高い温度で溶解相を形成する、細胞塊を作製する方法。
［２］式（Ｉ）において、ｐ及びｑが０であり、Ｒ１が−ＮＨ２である、上記［１］に記載の作製方法。
［３］式（Ｉ）で表される化合物又はその付加塩の水溶液の濃度が、１〜１０００ｍｇ／ｍｌである、上記［１］又は［２］に記載の作製方法。
［４］単層培養状態と細胞塊培養状態を制御する方法であって、下記：
（ａ）請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法を用いて細胞塊を作製する工程；
（ｂ）５％ＣＯ２存在下、相転移温度より高い温度又は３７℃で、１〜７２時間、細胞塊を培養することによって細胞を単層状態にする工程；及び
（ｃ）場合により、工程（ａ）を繰り返すことによって再び細胞塊を作製する工程
を含む制御方法。
（ａ）請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法を用いて細胞塊を作製する工程；
（ｂ）５％ＣＯ２存在下、相転移温度より高い温度又は３７℃で、１〜７２時間、細胞塊を培養することによって細胞を単層状態にする工程；及び
（ｃ）場合により、工程（ａ）を繰り返すことによって再び細胞塊を作製する工程
を含む制御方法。
本発明の細胞塊を形成させる方法は、相転移温度が細胞培養温度に適した温度の範囲内にある高温融解型高分子（ＰＡＵ）を用いることを特徴とし、培養温度を制御するだけで、相転移温度の変化によるＰＡＵの構造変化に起因して、単層状態の培養細胞を容易に３次元培養の状態へと変化させることができる。さらに、単層培養状態と細胞塊培養状態の制御を可逆的に行うことができる。
１．本発明の高温溶解型高分子及びその製造方法
１−１．高温融解型高分子
本発明の高温融解型高分子は、下記式（Ｉ）で示される。
１−１．高温融解型高分子
本発明の高温融解型高分子は、下記式（Ｉ）で示される。
上記式（Ｉ）中、「ｍ」は、本発明の高温融解型高分子の重合度を表す。具体的には、ｍは１０以上の整数を意味する。好ましくは１０〜５０００であり、より好ましくは２０〜２０００であり、特に好ましくは２０〜１０００である。
上記式（Ｉ）中、「ｎ」は、本発明の高温融解型高分子における水素結合性官能基（Ｒ１及びＲ２）の導入度を表す。具体的には、ｎは０.４≦ｎ≦１の数を示す。生理的条件の観点からより好ましくは０.８４≦ｎ≦１であり、さらに好ましくは０．８７≦ｎ≦１である。
上記式（Ｉ）中、「ｐ」及び「ｑ」は、独立して、１〜６の整数を意味する。好ましくは１〜４、より好ましくは０又は１である。
本発明において、Ｒ１で示される置換基は、プロトンアクセプター又はプロトンドナーを有する基であってもよく、このような基としては、限定されないが、下記：−ＮＨ２、−ＣＯＮＨ２、−ＣＯＯＮＨ２、−ＣＯＯＨ、
を挙げることができる。
本発明において、Ｒ２で示される置換基は、末端にアミノ基を有する置換基であれば限定されないが、好ましくは、下式：
で示される置換基である。
本発明の高温融解型高分子の付加塩とは、該高分子を構成するモノマー単位中の側鎖アミノ基及び／又はカルボキシル基への付加塩を挙げることができる。かかる付加塩としては、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、硫酸塩、リン酸塩、ホスホン酸塩、酢酸塩等のカルボン酸塩類、メタンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、クエン酸塩や酒石酸塩などオキシカルボン酸塩、安息香酸塩を例示することができる。
本発明の高温融解型高分子及びその付加塩は、ｐＨ３〜１０．５の少なくとも１ｍＭの塩を有する水溶液又は細胞培養液（血清を含む又は含まない）中で、４〜５０℃の範囲に相転移温度を有することを特徴とする。ここで、「４〜５０℃の範囲に相転移温度を有する」とは、高温融解型高分子（Ｉ）又はその付加塩が上記水溶液又は細胞培養液中で不溶化し、不溶相を形成する温度と、該高分子（Ｉ）又はその付加塩が上記水溶液又は細胞培養液中で溶解し、溶解相を形成する温度との境界温度が、４〜５０℃の範囲にあることを意味する。つまり「相転移」とは、上記水溶液又は細胞培養液において高温融解型高分子（Ｉ）又はその付加塩によって形成される不溶相と溶解相との相転移を意味する。
かかる「相転移温度」は、例えば、高温融解型高分子（Ｉ）又はその付加塩を少なくとも１ｍＭの塩を含有する水溶液に溶解し、降温させながら石英セル中で５００ｎｍ又は７００ｎｍの可視光の透過率を測定し、当該化合物が完全に溶解しているときの清澄溶液の可視光の透過率を１００％とした場合に、これを降温したときに該透過率が減少し始める温度として求めることができる。
本明細書で使用するとき、「塩」とは、ＫＣｌ、ＮａＣｌ、ＣａＣｌ２、ＭｇＣｌ２、ＫＢｒ、ＮａＢｒ、Ｎａ２ＳＯ４、及びＭｇＳＯ４等を挙げることができるが、高温融解型高分子（Ｉ）が、後述する式（ＩＩＩ）で示されるカルバモイル化ポリアリルアミン（Ｃａｒｂ−ＰＡＡ）である場合、好適には塩化ナトリウムを挙げることができる。
１−２．高温融解型高分子の製造方法
本発明の高温融解型高分子は、当業者であれば、従来技術を用いて製造することができる。例えば、ＵＣＳＴ型の温度応答性高分子化合物を製造する方法を記載した特許文献１（国際公開ＷＯ２０１１／１１８５８７、上述）を参照して、本発明の高温融解型高分子を製造することができる。より具体的には、本発明の高温融解型高分子（前述の一般式（Ｉ））のうち、Ｒ１が水素原子であり、Ｒ２がカルバモイル基であり、ｐ＝ｑ＝０である化合物（ＩＩＩ）は、下式（ＩＩ）で示されるポリアリルアミン又はその塩をシアン酸塩（ＭＣＮＯ）と反応させることによって製造することができる。ここで、ポリアリルアミン（ＩＩ）の塩としては、塩酸塩、硫酸塩、及びリン酸塩などの無機塩を挙げることができる。
本発明の高温融解型高分子は、当業者であれば、従来技術を用いて製造することができる。例えば、ＵＣＳＴ型の温度応答性高分子化合物を製造する方法を記載した特許文献１（国際公開ＷＯ２０１１／１１８５８７、上述）を参照して、本発明の高温融解型高分子を製造することができる。より具体的には、本発明の高温融解型高分子（前述の一般式（Ｉ））のうち、Ｒ１が水素原子であり、Ｒ２がカルバモイル基であり、ｐ＝ｑ＝０である化合物（ＩＩＩ）は、下式（ＩＩ）で示されるポリアリルアミン又はその塩をシアン酸塩（ＭＣＮＯ）と反応させることによって製造することができる。ここで、ポリアリルアミン（ＩＩ）の塩としては、塩酸塩、硫酸塩、及びリン酸塩などの無機塩を挙げることができる。
なお、ポリアリルアミン（ＩＩ）又はその塩の製造方法は既に公知であり、具体的には例えば、特開昭６０−１０６８０３号公報の記載に従って調製することができる。塩を含まないフリーのタイプのポリアリルアミン（ＩＩ）は、既知のポリアリルアミンの塩をアルカリで中和後、副生する中和塩を水に対して透析することで調製することができる。また、市販のポリアリルアミン（塩フリー）を使用することもできる。かかる市販品としては、濃度１５％のポリアリルアミン（分子量約１万）水溶液（ＰＡＡ−１５：日東紡績（株）製）、濃度１０％のポリアリルアミン（分子量約１万）水溶液（ＰＡＡ−１０Ｃ：日東紡績（株）製）、濃度２０％のポリアリルアミン（分子量約１万）水溶液（ＰＡＡ−Ｌ：日東紡績（株）製）、及び濃度２０％のポリアリルアミン（分子量約１０万）水溶液（ＰＡＡ−Ｈ：日東紡績（株）製）を例示することができる。
ポリアリルアミン（ＩＩ）を溶液にするために使用する溶媒としては、水、有機溶媒又はこれらの混合液を挙げることができる。有機溶媒としては、ポリアリルアミンの溶解性から極性溶媒であることが好ましく、例えばメタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、１−ブタノール等のアルコール類；アセトニトリル、ホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、テトラヒドロフラン、１，４−ジオキサン等を挙げることができる。反応に使用するポリアリルアミン溶液におけるポリアリルアミン濃度としては、制限されないが、通常１〜５０重量％、好ましくは２〜３０重量％、より好ましくは５〜２０重量％を挙げることができる。
ポリアリルアミン（ＩＩ）又はその塩と反応させるシアン酸塩（ＭＣＮＯ）としては、シアン酸カリウムやシアン酸ナトリウム等のシアン酸のアルカリ金属塩を好適に例示することができる。好ましくはシアン酸カリウムである。かかるシアン酸塩の使用割合としては、上記ポリアリルアミン（ＩＩ）にカルバモイル基を有する置換基が所望の割合（導入率）（一般式（ＩＩＩ）中、ｎが０．４≦ｎ≦１）で導入されるように、化学量論的に必要な計算量を挙げることができる。シアン酸塩の使用割合として、具体的には、ポリアリルアミン１モルに対して、０．４〜１０モルになるような割合を挙げることができる。上限は１０モル以下であればよいが、好ましくは５モル以下、より好ましくは３モル以下である。下限は該置換基の導入率（カルバモイル化度）に応じて対応するモル数に設定することができる。例えば、カルバモイル化度を０．４にする場合には０．４モル程度、０．８にする場合には０．８モル程度に設定調整することができる。
ポリアリルアミン（ＩＩ）又はその塩とシアン酸塩（ＭＣＮＯ）とを反応させて、Ｒ１が水素原子で、Ｒ２がカルバモイル基である本発明の高分子化合物（ＩＩＩ）を製造する場合、最初に、原料のポリアリルアミン（ＩＩ）又はその塩の溶液にシアン酸塩（ＭＣＮＯ）をゆっくりと滴下することが好ましい。このとき、溶媒にシアン酸塩（ＭＣＮＯ）を溶解させて、原料のポリアリルアミン（ＩＩ）又はその塩の溶液に滴下することもできる。この場合、シアン酸塩（ＭＣＮＯ）を溶解させるための溶媒は、通常、原料のポリアリルアミンを溶解させるための溶媒と同じである。ポリアリルアミン（ＩＩ）又はその塩とシアン酸塩（ＭＣＮＯ）との反応は、撹拌しながら行うことが好ましい。反応温度は、特に制限されないが、好ましくは０〜１００℃、より好ましくは３０〜６０℃に維持することが望ましい。反応時間も特に制限されないが、通常１２〜４８時間、好ましくは１２〜２５時間で、本発明の高温融解型高分子（ＩＩＩ）の溶液を得ることができる。
反応終了後、副生したアルコールと反応溶媒を除去するために、反応溶液を、真空乾燥することにより、本発明の高温融解型高分子（ＩＩＩ）を、固体として得ることができる。
また、本発明の高温融解型高分子（ＩＩＩ）の付加塩は、原料として、ポリアリルアミンの部分塩を用い、これとシアン酸塩（ＭＣＮＯ）とを、フリーのポリアリルアミンを用いた場合と同様に、反応させることにより、製造することができる。通常、原料のポリアリルアミンの部分塩とシアン酸塩（ＭＣＮＯ）とを反応させた場合、そのポリアリルアミンのＮＨで、塩を形成していないＮＨが、優先的に水素結合性置換基で置換される。反応終了後、得られる高温融解型高分子（ＩＩＩ）の塩の溶液を、アセトン等の溶媒に加えて再沈することにより、本発明の高温融解型高分子（ＩＩＩ）の付加塩を、固体として取り出すことが可能となる。
２．本発明の高温融解型高分子を用いた細胞塊の作製方法
本発明は、上記高温融解型高分子を細胞培養系に添加することによって細胞塊を作製し、さらには細胞の単層培養状態と細胞塊培養状態を可逆的に制御することができる。このような細胞塊の作製及び制御は、本発明の高温融解型高分子の温度制御による高分子の構造変化に起因していると考えられる。本発明によれば、本発明の高温融解型高分子がその相転移温度よりも低い温度で不溶し、不溶相を形成する性質と、相転移温度よりも高い温度で溶解し、溶解相を形成する性質を利用し、培養温度を単に制御することによって容易に細胞塊を作製する方法を提供することができる。
本発明は、上記高温融解型高分子を細胞培養系に添加することによって細胞塊を作製し、さらには細胞の単層培養状態と細胞塊培養状態を可逆的に制御することができる。このような細胞塊の作製及び制御は、本発明の高温融解型高分子の温度制御による高分子の構造変化に起因していると考えられる。本発明によれば、本発明の高温融解型高分子がその相転移温度よりも低い温度で不溶し、不溶相を形成する性質と、相転移温度よりも高い温度で溶解し、溶解相を形成する性質を利用し、培養温度を単に制御することによって容易に細胞塊を作製する方法を提供することができる。
一実施形態において、本発明は、（ａ）上記高温融解型高分子（Ｉ）又はその付加塩の水溶液（細胞培養液を含む）を用意する工程、（ｂ）該高温融解型高分子（Ｉ）又はその付加塩の水溶液を、細胞培養プレートに細胞を播種前又は播種後に添加する工程；及び（ｃ）５％ＣＯ２存在下、相転移温度より低い温度又は３７℃で、１〜４８時間、細胞を培養する工程を含む細胞塊を作製する方法を提供することができる。ここで、本発明の細胞塊を作製するために使用される高温融解型高分子（Ｉ）又はその付加塩の水溶液の濃度は、細胞塊を作製することができる濃度であれば特に限定されない。例えば、該水溶液の濃度は、０．１ｍｇ／ｍｌ以上であればよく、好ましくは０．５〜２０００ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは１〜１０００ｍｇ／ｍｌである。
本発明によれば、細胞培養系に高温融解型高分子（Ｉ）又はその付加塩を添加する場合の水溶液は、限定されないが、１ｍＭの塩を含有する水溶液であってもよい。別の態様として、水溶液は、血清不含又は血清含有の培養培地であってもよい。使用される培養培地は、通常、培養される細胞が増殖及び／又は分化等の所望の機能を発揮又は維持できるように調整された市販の培地であってもよい。例えば、細胞が哺乳動物の場合には、例えば、Ａｌｐｈａ−ＭＥＭ、Ｄｏｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）、ＤＭＥＭ：Ｈａｍ’ｓ Ｆ１２混合培地（１：１）、ＲＰＭＩ１６４０、ＤＭＥＭ：ＲＰＭＩ１６４０混合培地（１：１）、Ｈａｍ’ｓ Ｆ１２ ｍｅｄｉｕｍ（大日本製薬株式会社等）、Ｈａｍ’ｓ Ｆ１２：ＲＰＭＩ１６４０混合培地（１：１）、Ｗｉｌｌｉａｍｓ’ ｍｅｄｉｕｍ Ｅなどの市販培地を使用することができる。また、細胞を培養する場合に、通常、使用されている血清（例えば、ＦＢＳ、ＦＣＳ）を培地に添加してもよい。培地に添加した血清の最終濃度は、１〜１０％、好ましくは５％である。
本発明によれば、本発明の細胞塊を作製する場合に使用される細胞、培養容器（培養プレートを含む）、培養装置（インキュベーターなど）、細胞培地は、限定されない。細胞は、作製された細胞塊の使用目的に応じて、適宜に選択可能である。後述する実施例２に示されるように、本発明の方法を用いることによって、細胞種を限定することなく、細胞塊を作製することができる。ここで、使用される培養細胞は、培養基材に接着性の培養であってもよく、又は培養基材に接着させず、浮遊培養に適した細胞のいずれであってもよい。また、細胞の由来も限定されず、細胞は、限定されないが、哺乳動物細胞、酵母、昆虫細胞等の真核細胞、大腸菌、枯草菌などの原核細胞であってもよい。さらに、培養容器及び培養プレートは、培養細胞に応じて、適宜に選択可能である。例えば、組織培養用ディッシュ（ＩＷＡＫＩ）などの市販のものを使用することができる。また、培養装置も限定されず、細胞を培養するために必要とされる条件、例えば、温度、湿度、ＣＯ２濃度を制御できるものであれば限定されない。
細胞塊を形成させるためには、細胞を培養する温度を調節することによって、その目的が達成される。上記した通り、高温融解型高分子（Ｉ）又はその付加塩は、水溶液又は血清を含んでもよい培養液中で、４〜５０℃の範囲に相転移温度を有し、当該相転移温度より低い温度で不溶相を形成し、当該相転移温度より高い温度で溶解相を形成する特性を有する。したがって、高温融解型高分子（Ｉ）の相転移温度が、細胞を培養する場合に適しているとされる３７℃よりも低い場合には、その相転移温度よりも低い温度で細胞を培養することが好ましい。一方、高温融解型高分子（Ｉ）の相転移温度が、３７℃よりも高い場合には、３７℃又はそれよりも低い温度で細胞を培養することが好ましい。なお、高温融解型高分子（Ｉ）の水溶液又は培養培地に血清を含む場合の相転移温度を測定すると、血清を含まない場合の該高分子の相転移温度と比較して高くなることがある。このような場合に、相転移温度が３７℃を超える場合には、３７℃又はそれよりも低い温度で細胞を培養することが好ましい。
本明細書で使用するとき、用語「細胞塊」とは、単層培養状態と比較して、３次元的に細胞が集合した状態を指し、このような集合体を構成する細胞数は２個以上である。細胞塊を構成する細胞数や細胞塊の径を調節するためには、増殖因子やサイトカインなので添加剤を必要とせず、培養時間、培養温度を適宜調節することによって可能となる。細胞塊の径の調整は、集合する各々の細胞の移動（運動）に起因していると考えられるため、培養時間を長く又は短くし、さらには細胞の移動能を抑制しない程度の培養温度の条件を採用することによって行うことができる。なお、実施例１において示されるように、細胞塊の径が大きくなると、細胞塊の内部に存在する細胞に栄養供給がなされないため、壊死する細胞も出現することがある。したがって、細胞塊を形成するための培養時間は、０．５〜９６時間、好ましくは１〜７２時間である。
３．本発明の高温融解型高分子を用いた単層培養状態と細胞塊培養状態を制御する方法
本発明によれば、本発明によって作製された細胞塊を、温度調節することによって、単層培養状態にすることができ、さらに単層培養状態から細胞塊培養状態に戻すことができる。より具体的には、本発明は、単層培養状態と細胞塊培養状態を制御する方法であって、（ａ）前述の細胞塊を作製する方法を用いて細胞塊を作製する工程；（ｂ）５％ＣＯ２存在下、相転移温度より高い温度又は３７℃で、１〜４８時間、細胞塊を培養することによって細胞を単層状態にする工程；及び（ｃ）場合により、工程（ａ）を繰り返すことによって再び細胞塊を作製する工程、を含む制御方法を提供することができる。ここで、上記の工程（ａ）及び（ｂ）における細胞塊を作製する工程は、前述の通りである。一方、工程（ｂ）は、一度作製された細胞塊を温度制御によって単層培養状態に戻す工程である。ここでは、細胞塊を作製する場合の相転移温度の利用とは反対に、高温融解型高分子（Ｉ）又はその付加塩が、工程（ａ）と同じ水溶液又は細胞培養液中で溶解し、溶解相を形成する温度まで上昇させることを利用している。すなわち、工程（ｂ）においては、高温融解型高分子（Ｉ）の相転移温度が、細胞を培養する場合に適しているとされる３７℃よりも低い場合には、その相転移温度よりも高い温度又は３７℃で細胞を培養することが好ましく、一方、高温融解型高分子（Ｉ）の相転移温度が、３７℃よりも高い場合には、相転移温度で培養することが好ましい。言うまでもないが、相転移温度が３７℃より遥かに高い場合には、細胞が死滅する可能性があるため、このような相転移温度を有する高温融解型高分子の使用は適さない。
本発明によれば、本発明によって作製された細胞塊を、温度調節することによって、単層培養状態にすることができ、さらに単層培養状態から細胞塊培養状態に戻すことができる。より具体的には、本発明は、単層培養状態と細胞塊培養状態を制御する方法であって、（ａ）前述の細胞塊を作製する方法を用いて細胞塊を作製する工程；（ｂ）５％ＣＯ２存在下、相転移温度より高い温度又は３７℃で、１〜４８時間、細胞塊を培養することによって細胞を単層状態にする工程；及び（ｃ）場合により、工程（ａ）を繰り返すことによって再び細胞塊を作製する工程、を含む制御方法を提供することができる。ここで、上記の工程（ａ）及び（ｂ）における細胞塊を作製する工程は、前述の通りである。一方、工程（ｂ）は、一度作製された細胞塊を温度制御によって単層培養状態に戻す工程である。ここでは、細胞塊を作製する場合の相転移温度の利用とは反対に、高温融解型高分子（Ｉ）又はその付加塩が、工程（ａ）と同じ水溶液又は細胞培養液中で溶解し、溶解相を形成する温度まで上昇させることを利用している。すなわち、工程（ｂ）においては、高温融解型高分子（Ｉ）の相転移温度が、細胞を培養する場合に適しているとされる３７℃よりも低い場合には、その相転移温度よりも高い温度又は３７℃で細胞を培養することが好ましく、一方、高温融解型高分子（Ｉ）の相転移温度が、３７℃よりも高い場合には、相転移温度で培養することが好ましい。言うまでもないが、相転移温度が３７℃より遥かに高い場合には、細胞が死滅する可能性があるため、このような相転移温度を有する高温融解型高分子の使用は適さない。
以下、製造例及び実験例を挙げて本発明の構成及び効果をより明確に説明する。但し、本発明はこれらの実施例によって何ら制限されるものではない。
実施例１：高温融解型高分子による細胞塊の形成
（１）材料
培養系に添加する高温融解型高分子として、主鎖となるポリ（アリルアミン）（「ＰＡＡ」）の分子量が１５，０００Ｄａであり、側鎖にウレイド基を９３％の含有率で有するポリ（アリルアミン−ｃｏ−ポリアリルウレア）（以下、「ＰＡＵ１５Ｋ９３」と称する）を合成し、使用した。細胞は、３Ｔ３細胞（マウス由来線維芽細胞）を用いた。培養容器として、３５ｍｍ径の細胞培養ディッシュ（細胞培養用ペトリディッシュ、Ｎｕｎｃ）を使用した。細胞培養溶液は、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を５％又は１０％含有させたダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）を使用した。
（１）材料
培養系に添加する高温融解型高分子として、主鎖となるポリ（アリルアミン）（「ＰＡＡ」）の分子量が１５，０００Ｄａであり、側鎖にウレイド基を９３％の含有率で有するポリ（アリルアミン−ｃｏ−ポリアリルウレア）（以下、「ＰＡＵ１５Ｋ９３」と称する）を合成し、使用した。細胞は、３Ｔ３細胞（マウス由来線維芽細胞）を用いた。培養容器として、３５ｍｍ径の細胞培養ディッシュ（細胞培養用ペトリディッシュ、Ｎｕｎｃ）を使用した。細胞培養溶液は、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を５％又は１０％含有させたダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）を使用した。
（２）方法
３×１０５細胞／３５ｍｍディッシュになるように調整した３Ｔ３細胞をディッシュに播種した。５％ＣＯ２の存在下、３７℃にて２４時間培養した。次に、５％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ中に溶解したＰＡＵ１５Ｋ９３溶液（終濃度１ｍｇ／ｍＬ、２ｍＬ）と培地交換した。その後、３７℃にて細胞をインキュベートした。また、２４時間後の細胞塊については、死細胞の指標であるＰｒｏｐｉｄｉｕｍ Ｉｏｄｉｄｅ（ＰＩ）で染色後、共焦点レーザー走査型顕微鏡（Ｃｏｎｆｏｃａｌ Ｌａｓｅｒ Ｓｃａｎｎｉｎｇ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ、Ｚｅｉｓｓ）下で細胞の形態変化を観察した。具体的には、２４時間後の細胞塊を４％パラホルムアルデヒドによって固定し、ＰＩ染色後、観察を行った。さらに、別の２４時間後の細胞塊を、生細胞の指標であるＣａｌｃｅｉｎ−ＡＭで染色後、共焦点レーザー走査型顕微鏡によって観察を行った。
３×１０５細胞／３５ｍｍディッシュになるように調整した３Ｔ３細胞をディッシュに播種した。５％ＣＯ２の存在下、３７℃にて２４時間培養した。次に、５％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ中に溶解したＰＡＵ１５Ｋ９３溶液（終濃度１ｍｇ／ｍＬ、２ｍＬ）と培地交換した。その後、３７℃にて細胞をインキュベートした。また、２４時間後の細胞塊については、死細胞の指標であるＰｒｏｐｉｄｉｕｍ Ｉｏｄｉｄｅ（ＰＩ）で染色後、共焦点レーザー走査型顕微鏡（Ｃｏｎｆｏｃａｌ Ｌａｓｅｒ Ｓｃａｎｎｉｎｇ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ、Ｚｅｉｓｓ）下で細胞の形態変化を観察した。具体的には、２４時間後の細胞塊を４％パラホルムアルデヒドによって固定し、ＰＩ染色後、観察を行った。さらに、別の２４時間後の細胞塊を、生細胞の指標であるＣａｌｃｅｉｎ−ＡＭで染色後、共焦点レーザー走査型顕微鏡によって観察を行った。
（３）結果
ＰＡＵ１５Ｋ９３の相転移温度は、透過率測定から５％ＦＢＳを含まないＤＭＥＭ中では４３℃であり、５％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ中では４５℃であった。３７℃にて３Ｔ３細胞をインキュベートし、培地交換から２４時間及び４８時間後に顕微鏡で観察した結果を図１に示す。図１Ａは、２４時間後の細胞の形態を観察したものであるが、ＰＡＵ未添加と比較して、細胞塊の形成により培養基材上で細胞が占める面積は非常に少なくなり、コアセルベートが非常に多いことが観察された。４８時間後には、細胞塊の径はさらに多くなった（図１Ｂ）。さらに、共焦点レーザー走査型顕微鏡を用いて観察した結果を図２に示す。この観察結果からも明らかなように、細胞塊は、ＸＹ平面、Ｚ軸方向ともに細胞が凝集している球状のスフェロイドであった。観察した細胞塊の直径は約５０μｍ、高さは約５０μｍであった。なお、本観察では、細胞をパラホルムアルデヒドによって固定したため、全ての細胞がＰＩ染色された。また、生細胞をＣａｌｃｅｉｎ−ＡＭで染色した結果を図３に示す。細胞塊内部に若干の死細胞（ＰＩ染色）が観察されるものの、細胞塊は、主に生細胞（Ｃａｌｃｅｉｎ−ＡＭ染色）で形成されていることが分かった。
ＰＡＵ１５Ｋ９３の相転移温度は、透過率測定から５％ＦＢＳを含まないＤＭＥＭ中では４３℃であり、５％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ中では４５℃であった。３７℃にて３Ｔ３細胞をインキュベートし、培地交換から２４時間及び４８時間後に顕微鏡で観察した結果を図１に示す。図１Ａは、２４時間後の細胞の形態を観察したものであるが、ＰＡＵ未添加と比較して、細胞塊の形成により培養基材上で細胞が占める面積は非常に少なくなり、コアセルベートが非常に多いことが観察された。４８時間後には、細胞塊の径はさらに多くなった（図１Ｂ）。さらに、共焦点レーザー走査型顕微鏡を用いて観察した結果を図２に示す。この観察結果からも明らかなように、細胞塊は、ＸＹ平面、Ｚ軸方向ともに細胞が凝集している球状のスフェロイドであった。観察した細胞塊の直径は約５０μｍ、高さは約５０μｍであった。なお、本観察では、細胞をパラホルムアルデヒドによって固定したため、全ての細胞がＰＩ染色された。また、生細胞をＣａｌｃｅｉｎ−ＡＭで染色した結果を図３に示す。細胞塊内部に若干の死細胞（ＰＩ染色）が観察されるものの、細胞塊は、主に生細胞（Ｃａｌｃｅｉｎ−ＡＭ染色）で形成されていることが分かった。
実施例２：細胞種の相違による細胞塊の形成
実施例１では、３Ｔ３細胞による細胞塊の形成を観察したが、細胞塊の形成における細胞種の相違による影響を検討した。培養細胞として、ＨｅｐＧ２細胞（ヒト肝癌由来細胞株）を用いた。培養条件、ＰＡＵの添加濃度等は実施例１と同様であったが、培養液に含まれるＦＢＳ濃度を５％及び１０％とした。図４Ａ及びＢに示されるように、ＨｅｐＧ２細胞を用いた場合も、３Ｔ３細胞と同様に、ＰＡＵ未添加系では細胞塊が形成されなかったが、同濃度のＰＡＵ添加系では細胞塊が形成された。この結果から、本発明の細胞塊を作製する方法は、細胞種の相違による影響はないといえる。なお、図４Ｂにおいては、ＦＢＳ濃度の差による細胞塊の形成を検討したところ、ＦＢＳが高濃度（１０％）である培養系においては、細胞塊がより形成し易かった。
実施例１では、３Ｔ３細胞による細胞塊の形成を観察したが、細胞塊の形成における細胞種の相違による影響を検討した。培養細胞として、ＨｅｐＧ２細胞（ヒト肝癌由来細胞株）を用いた。培養条件、ＰＡＵの添加濃度等は実施例１と同様であったが、培養液に含まれるＦＢＳ濃度を５％及び１０％とした。図４Ａ及びＢに示されるように、ＨｅｐＧ２細胞を用いた場合も、３Ｔ３細胞と同様に、ＰＡＵ未添加系では細胞塊が形成されなかったが、同濃度のＰＡＵ添加系では細胞塊が形成された。この結果から、本発明の細胞塊を作製する方法は、細胞種の相違による影響はないといえる。なお、図４Ｂにおいては、ＦＢＳ濃度の差による細胞塊の形成を検討したところ、ＦＢＳが高濃度（１０％）である培養系においては、細胞塊がより形成し易かった。
実施例３：単層培養状態と細胞塊培養状態の可逆的制御
培養温度の変化によって、単層培養状態と細胞塊培養状態を可逆的に制御できるかどうかを試みた。高温融解型高分子としてＰＡＵ５Ｋ９１を用いた。ＰＡＵ５Ｋ９１の相転移温度は、透過率測定から５％ＦＢＳを含まないＤＭＥＭ中では２３．５℃であり、５％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ中では３７℃であった。細胞種、播種濃度、ＰＡＵの濃度及び添加量は実施例１と同様とした。ＰＡＵを添加し、３Ｔ３細胞を２４時間培養後の細胞の形態観察（明視野）では、径は小さいながらも細胞塊を形成していた（図５、パネルＢ）。その後、２５℃を維持した系と３７℃に上昇させた系を用意し、それぞれ２４時間培養（ＰＡＵ添加から４８時間）後、細胞の形態を観察した。２５℃に維持した径では、細胞塊の径はさらに大きくなった（パネルＣ）のに対して、３７℃に変化させた系では、細胞が伸展し、細胞塊状態から単層状態に変化した（パネルＥ）。さらに、温度を３７℃から再度２５℃に変化させ、４８時間培養した系では、単層状態から細胞塊状態に戻った（パネルＦ）。このように、本発明のＰＡＵの使用によって、単に培養温度を変化させるだけ単層培養状態と細胞塊培養状態を制御できることが分かった。
培養温度の変化によって、単層培養状態と細胞塊培養状態を可逆的に制御できるかどうかを試みた。高温融解型高分子としてＰＡＵ５Ｋ９１を用いた。ＰＡＵ５Ｋ９１の相転移温度は、透過率測定から５％ＦＢＳを含まないＤＭＥＭ中では２３．５℃であり、５％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ中では３７℃であった。細胞種、播種濃度、ＰＡＵの濃度及び添加量は実施例１と同様とした。ＰＡＵを添加し、３Ｔ３細胞を２４時間培養後の細胞の形態観察（明視野）では、径は小さいながらも細胞塊を形成していた（図５、パネルＢ）。その後、２５℃を維持した系と３７℃に上昇させた系を用意し、それぞれ２４時間培養（ＰＡＵ添加から４８時間）後、細胞の形態を観察した。２５℃に維持した径では、細胞塊の径はさらに大きくなった（パネルＣ）のに対して、３７℃に変化させた系では、細胞が伸展し、細胞塊状態から単層状態に変化した（パネルＥ）。さらに、温度を３７℃から再度２５℃に変化させ、４８時間培養した系では、単層状態から細胞塊状態に戻った（パネルＦ）。このように、本発明のＰＡＵの使用によって、単に培養温度を変化させるだけ単層培養状態と細胞塊培養状態を制御できることが分かった。
本明細書に引用する全ての刊行物及び特許文献は、参照により全体として本明細書中に援用される。なお、例示を目的として、本発明の特定の実施形態を本明細書において説明したが、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、種々の改変が行われる場合があることは、当業者に容易に理解されるであろう。
Claims (4)
- 細胞塊を作製する方法であって、下記：
（ａ）下記式（Ｉ）：
Ｒ１は、−ＮＨ２、−ＣＯＮＨ２、−ＣＯＯＮＨ２、−ＣＯＯＨ、
Ｒ２は、下式：
ｍは、１０以上の整数を意味し；
ｎは、０．４≦ｎ≦１を満たす数を意味し；及び
ｐ及びｑは、独立して、０〜６の整数を意味する）
で表される化合物又はその付加塩の水溶液を用意する工程；
（ｂ）上記工程（ａ）で用意した化合物又はその付加塩の水溶液を、細胞培養プレートに細胞を播種前又は播種後に添加する工程；及び
（ｃ）５％ＣＯ２存在下、（ｉ）相転移温度が３７℃より低い場合は、相転移温度より低い温度で、又は（ｉｉ）相転移温度が３７℃より高い場合は、３７℃以下の温度で、１〜４８時間、細胞を培養する工程
を含み、ここで、工程（ｂ）で使用される式（Ｉ）で表される化合物又はその付加塩は、細胞培養液中で、４〜５０℃の範囲に相転移温度を有し、当該相転移温度より低い温度で不溶相を形成し、当該相転移温度より高い温度で溶解相を形成する、細胞塊を作製する方法。 - 式（Ｉ）において、ｐ及びｑが０であり、Ｒ１が−ＮＨ２である、請求項１に記載の作製方法。
- 式（Ｉ）で表される化合物又はその付加塩の水溶液の濃度が、１〜１０００ｍｇ／ｍｌである、請求項１又は２に記載の作製方法。
- 単層培養状態と細胞塊培養状態を制御する方法であって、下記：
（ａ）請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法を用いて細胞塊を作製する工程；
（ｂ）５％ＣＯ２存在下、（ｉ）相転移温度が３７℃より低い場合は、相転移温度より高い温度若しくは３７℃で、又は（ｉｉ）相転移温度が３７℃より高い場合は、相転移温度で、１〜７２時間、細胞塊を培養することによって細胞を単層状態にする工程；及び
（ｃ）場合により、工程（ａ）を繰り返すことによって再び細胞塊を作製する工程
を含む制御方法。
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