JP2016086782A - 温度応答性細胞塊作製方法 - Google Patents
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Abstract
Description
[1]細胞塊を作製する方法であって、下記:
(a)下記式(I):
R1は、−NH2、−CONH2、−COONH2、−COOH、
R2は、下式:
mは、10以上の整数を意味し;
nは、0.4≦n≦1を満たす数を意味し;及び
p及びqは、独立して、0〜6の整数を意味する)
で表される化合物又はその付加塩の水溶液を用意する工程;
(b)上記工程(a)で用意した化合物又はその付加塩の水溶液を、細胞培養プレートに細胞を播種前又は播種後に添加する工程;及び
(c)5%CO2存在下、相転移温度より低い温度又は37℃で、1〜48時間、細胞を培養する工程
を含み、ここで、工程(b)で使用される式(I)で表される化合物又はその付加塩は、細胞培養液中で、4〜50℃の範囲に相転移温度を有し、当該相転移温度より低い温度で不溶相を形成し、当該相転移温度より高い温度で溶解相を形成する、細胞塊を作製する方法。
(a)請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法を用いて細胞塊を作製する工程;
(b)5%CO2存在下、相転移温度より高い温度又は37℃で、1〜72時間、細胞塊を培養することによって細胞を単層状態にする工程;及び
(c)場合により、工程(a)を繰り返すことによって再び細胞塊を作製する工程
を含む制御方法。
1−1.高温融解型高分子
本発明の高温融解型高分子は、下記式(I)で示される。
本発明の高温融解型高分子は、当業者であれば、従来技術を用いて製造することができる。例えば、UCST型の温度応答性高分子化合物を製造する方法を記載した特許文献1(国際公開WO2011/118587、上述)を参照して、本発明の高温融解型高分子を製造することができる。より具体的には、本発明の高温融解型高分子(前述の一般式(I))のうち、R1が水素原子であり、R2がカルバモイル基であり、p=q=0である化合物(III)は、下式(II)で示されるポリアリルアミン又はその塩をシアン酸塩(MCNO)と反応させることによって製造することができる。ここで、ポリアリルアミン(II)の塩としては、塩酸塩、硫酸塩、及びリン酸塩などの無機塩を挙げることができる。
本発明は、上記高温融解型高分子を細胞培養系に添加することによって細胞塊を作製し、さらには細胞の単層培養状態と細胞塊培養状態を可逆的に制御することができる。このような細胞塊の作製及び制御は、本発明の高温融解型高分子の温度制御による高分子の構造変化に起因していると考えられる。本発明によれば、本発明の高温融解型高分子がその相転移温度よりも低い温度で不溶し、不溶相を形成する性質と、相転移温度よりも高い温度で溶解し、溶解相を形成する性質を利用し、培養温度を単に制御することによって容易に細胞塊を作製する方法を提供することができる。
本発明によれば、本発明によって作製された細胞塊を、温度調節することによって、単層培養状態にすることができ、さらに単層培養状態から細胞塊培養状態に戻すことができる。より具体的には、本発明は、単層培養状態と細胞塊培養状態を制御する方法であって、(a)前述の細胞塊を作製する方法を用いて細胞塊を作製する工程;(b)5%CO2存在下、相転移温度より高い温度又は37℃で、1〜48時間、細胞塊を培養することによって細胞を単層状態にする工程;及び(c)場合により、工程(a)を繰り返すことによって再び細胞塊を作製する工程、を含む制御方法を提供することができる。ここで、上記の工程(a)及び(b)における細胞塊を作製する工程は、前述の通りである。一方、工程(b)は、一度作製された細胞塊を温度制御によって単層培養状態に戻す工程である。ここでは、細胞塊を作製する場合の相転移温度の利用とは反対に、高温融解型高分子(I)又はその付加塩が、工程(a)と同じ水溶液又は細胞培養液中で溶解し、溶解相を形成する温度まで上昇させることを利用している。すなわち、工程(b)においては、高温融解型高分子(I)の相転移温度が、細胞を培養する場合に適しているとされる37℃よりも低い場合には、その相転移温度よりも高い温度又は37℃で細胞を培養することが好ましく、一方、高温融解型高分子(I)の相転移温度が、37℃よりも高い場合には、相転移温度で培養することが好ましい。言うまでもないが、相転移温度が37℃より遥かに高い場合には、細胞が死滅する可能性があるため、このような相転移温度を有する高温融解型高分子の使用は適さない。
(1)材料
培養系に添加する高温融解型高分子として、主鎖となるポリ(アリルアミン)(「PAA」)の分子量が15,000Daであり、側鎖にウレイド基を93%の含有率で有するポリ(アリルアミン−co−ポリアリルウレア)(以下、「PAU15K93」と称する)を合成し、使用した。細胞は、3T3細胞(マウス由来線維芽細胞)を用いた。培養容器として、35mm径の細胞培養ディッシュ(細胞培養用ペトリディッシュ、Nunc)を使用した。細胞培養溶液は、ウシ胎児血清(FBS)を5%又は10%含有させたダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)を使用した。
3×105細胞/35mmディッシュになるように調整した3T3細胞をディッシュに播種した。5%CO2の存在下、37℃にて24時間培養した。次に、5%FBSを含有するDMEM中に溶解したPAU15K93溶液(終濃度1mg/mL、2mL)と培地交換した。その後、37℃にて細胞をインキュベートした。また、24時間後の細胞塊については、死細胞の指標であるPropidium Iodide(PI)で染色後、共焦点レーザー走査型顕微鏡(Confocal Laser Scanning Microscopy、Zeiss)下で細胞の形態変化を観察した。具体的には、24時間後の細胞塊を4%パラホルムアルデヒドによって固定し、PI染色後、観察を行った。さらに、別の24時間後の細胞塊を、生細胞の指標であるCalcein−AMで染色後、共焦点レーザー走査型顕微鏡によって観察を行った。
PAU15K93の相転移温度は、透過率測定から5%FBSを含まないDMEM中では43℃であり、5%FBSを含有するDMEM中では45℃であった。37℃にて3T3細胞をインキュベートし、培地交換から24時間及び48時間後に顕微鏡で観察した結果を図1に示す。図1Aは、24時間後の細胞の形態を観察したものであるが、PAU未添加と比較して、細胞塊の形成により培養基材上で細胞が占める面積は非常に少なくなり、コアセルベートが非常に多いことが観察された。48時間後には、細胞塊の径はさらに多くなった(図1B)。さらに、共焦点レーザー走査型顕微鏡を用いて観察した結果を図2に示す。この観察結果からも明らかなように、細胞塊は、XY平面、Z軸方向ともに細胞が凝集している球状のスフェロイドであった。観察した細胞塊の直径は約50μm、高さは約50μmであった。なお、本観察では、細胞をパラホルムアルデヒドによって固定したため、全ての細胞がPI染色された。また、生細胞をCalcein−AMで染色した結果を図3に示す。細胞塊内部に若干の死細胞(PI染色)が観察されるものの、細胞塊は、主に生細胞(Calcein−AM染色)で形成されていることが分かった。
実施例1では、3T3細胞による細胞塊の形成を観察したが、細胞塊の形成における細胞種の相違による影響を検討した。培養細胞として、HepG2細胞(ヒト肝癌由来細胞株)を用いた。培養条件、PAUの添加濃度等は実施例1と同様であったが、培養液に含まれるFBS濃度を5%及び10%とした。図4A及びBに示されるように、HepG2細胞を用いた場合も、3T3細胞と同様に、PAU未添加系では細胞塊が形成されなかったが、同濃度のPAU添加系では細胞塊が形成された。この結果から、本発明の細胞塊を作製する方法は、細胞種の相違による影響はないといえる。なお、図4Bにおいては、FBS濃度の差による細胞塊の形成を検討したところ、FBSが高濃度(10%)である培養系においては、細胞塊がより形成し易かった。
培養温度の変化によって、単層培養状態と細胞塊培養状態を可逆的に制御できるかどうかを試みた。高温融解型高分子としてPAU5K91を用いた。PAU5K91の相転移温度は、透過率測定から5%FBSを含まないDMEM中では23.5℃であり、5%FBSを含有するDMEM中では37℃であった。細胞種、播種濃度、PAUの濃度及び添加量は実施例1と同様とした。PAUを添加し、3T3細胞を24時間培養後の細胞の形態観察(明視野)では、径は小さいながらも細胞塊を形成していた(図5、パネルB)。その後、25℃を維持した系と37℃に上昇させた系を用意し、それぞれ24時間培養(PAU添加から48時間)後、細胞の形態を観察した。25℃に維持した径では、細胞塊の径はさらに大きくなった(パネルC)のに対して、37℃に変化させた系では、細胞が伸展し、細胞塊状態から単層状態に変化した(パネルE)。さらに、温度を37℃から再度25℃に変化させ、48時間培養した系では、単層状態から細胞塊状態に戻った(パネルF)。このように、本発明のPAUの使用によって、単に培養温度を変化させるだけ単層培養状態と細胞塊培養状態を制御できることが分かった。
Claims (4)
- 細胞塊を作製する方法であって、下記:
(a)下記式(I):
R1は、−NH2、−CONH2、−COONH2、−COOH、
R2は、下式:
mは、10以上の整数を意味し;
nは、0.4≦n≦1を満たす数を意味し;及び
p及びqは、独立して、0〜6の整数を意味する)
で表される化合物又はその付加塩の水溶液を用意する工程;
(b)上記工程(a)で用意した化合物又はその付加塩の水溶液を、細胞培養プレートに細胞を播種前又は播種後に添加する工程;及び
(c)5%CO2存在下、相転移温度より低い温度又は37℃で、1〜48時間、細胞を培養する工程
を含み、ここで、工程(b)で使用される式(I)で表される化合物又はその付加塩は、細胞培養液中で、4〜50℃の範囲に相転移温度を有し、当該相転移温度より低い温度で不溶相を形成し、当該相転移温度より高い温度で溶解相を形成する、細胞塊を作製する方法。 - 式(I)において、p及びqが0であり、R1が−NH2である、請求項1に記載の作製方法。
- 式(I)で表される化合物又はその付加塩の水溶液の濃度が、1〜1000mg/mlである、請求項1又は2に記載の作製方法。
- 単層培養状態と細胞塊培養状態を制御する方法であって、下記:
(a)請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法を用いて細胞塊を作製する工程;
(b)5%CO2存在下、相転移温度より高い温度又は37℃で、1〜72時間、細胞塊を培養することによって細胞を単層状態にする工程;及び
(c)場合により、工程(a)を繰り返すことによって再び細胞塊を作製する工程
を含む制御方法。
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JP2006089480A (ja) * | 2004-09-22 | 2006-04-06 | Natrocell Technologies Ltd | 複合殺鼠剤 |
JP2006211959A (ja) * | 2005-02-03 | 2006-08-17 | Kuraray Medical Inc | 細胞培養材料 |
WO2011118587A1 (ja) * | 2010-03-23 | 2011-09-29 | 国立大学法人九州大学 | 温度、pH及び塩濃度感応性分離材及びその用途 |
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Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH0833486A (ja) * | 1994-07-25 | 1996-02-06 | Res Dev Corp Of Japan | 細胞培養担体と、細胞培養方法 |
JP2006089480A (ja) * | 2004-09-22 | 2006-04-06 | Natrocell Technologies Ltd | 複合殺鼠剤 |
JP2006211959A (ja) * | 2005-02-03 | 2006-08-17 | Kuraray Medical Inc | 細胞培養材料 |
WO2011118587A1 (ja) * | 2010-03-23 | 2011-09-29 | 国立大学法人九州大学 | 温度、pH及び塩濃度感応性分離材及びその用途 |
Non-Patent Citations (4)
Title |
---|
EVONIK JAPAN CO., LTD.,"EUDRAGIT(登録商標)",[ONLINE],[平成30年10 月11 日検索], JPN6018041438, ISSN: 0003903467 * |
YAMADA K. ET AL.: "Efficient induction of hepatocyte spheroids in a suspension culture using a water-soluble synthetic", J BIOCHEM., vol. 123, no. 6, JPN6018041434, June 1998 (1998-06-01), pages 1017 - 23, XP002955752, ISSN: 0003903466 * |
医学検査, vol. 51, no. 5, JPN6018041439, 2002, pages 695 - 700, ISSN: 0003903468 * |
嶋田直彦 他: "ウレイド高分子が培養細胞に与える影響", 第36回日本バイオマテリアル学会大会予稿集, JPN6018041441, 17 November 2014 (2014-11-17), pages 185, ISSN: 0003950420 * |
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