JP6478410B2 - ペプチド提示タンパク質及びそれを用いたペプチドライブラリー - Google Patents
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Description
ファージディスプレイ法では、濃縮されたファージに提示されたペプチドと、それをコードする遺伝子が1対1で対応するため、目的のペプチドが容易に特定可能である。また、遺伝子を容易に増幅(増殖)できるため、ペプチドのスクリーニング方法として、広範に用いられている。
従って、本発明の目的は、標的分子との特異性の高いペプチドのスクリーニング方法を提供することである。
本発明者は、提示されるペプチドの構造の自由度を抑制する方法について、鋭意研究した結果、驚くべきことに、superfolderGFP(非特許文献2;以下、sfGFPと称することがある)の131番〜139番の領域にペプチドを組込むことにより、ペプチドの構造の自由度が抑制され、標的分子と特異的に結合することのできるペプチドをスクリーニングできることを見出した。
本発明は、こうした知見に基づくものである。
従って、本発明は、
[1]配列番号54で表されるアミノ酸配列における131番〜139番の提示領域にペプチドが提示されたペプチド提示タンパク質であって、前記提示が、4〜15個のペプチドのアミノ酸配列を、前記131番〜139番のアミノ酸配列に挿入、若しくは131番〜139番のアミノ酸配列の1〜9個のアミノ酸配列と置換するものであって、且つ131番〜139番のアミノ酸配列に相当するアミノ酸配列の鎖長が15個以下である、ペプチド提示タンパク質、
[2]前記配列番号54で表されるアミノ酸配列における1番〜130番のアミノ酸配列又は140番〜238番のアミノ酸配列において、1又は複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び/又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つ蛍光発生活性を有する[1]に記載のペプチド提示タンパク質、
[3]前記挿入又は置換される4〜15個のペプチドの末端のアミノ酸配列が、制限酵素サイトを含む塩基配列から翻訳されたアミノ酸配列である、[1]又は[2]に記載のタンパク質、
[4]前記[1]〜[3]のいずれかに記載のペプチド提示タンパク質及び表面提示タンパク質の融合タンパク質、
[5]前記[1]〜[3]のいずれかに記載のペプチド提示タンパク質、又は[4]に記載の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、
[6][5]に記載のポリヌクレオチドを含むベクター、
[7][6]に記載のベクターを含む宿主、
[8]前記提示されるペプチドがランダムなアミノ酸配列からなる複数のペプチドである、[7]の宿主を含むライブラリー、
[9]配列番号54で表されるアミノ酸配列における131番〜139番の提示領域にペプチドが提示可能なペプチド提示用タンパク質であって、前記提示が、4〜15個のペプチドのアミノ酸配列を、前記131番〜139番のアミノ酸配列に挿入、若しくは131番〜139番のアミノ酸配列の1〜9個のアミノ酸配列と置換するものであって、且つ131番〜139番のアミノ酸配列に相当するアミノ酸配列の鎖長が15個以下である、ペプチド提示用タンパク質、
[10]前記配列番号54で表されるアミノ酸配列における1番〜130番のアミノ酸配列又は140番〜238番のアミノ酸配列において、1又は複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び/又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つ蛍光発生活性を有する[9]に記載のペプチド提示用タンパク質、
[11]前記挿入又は置換される4〜15個のペプチドの末端のアミノ酸配列が、制限酵素サイトを含む塩基配列の翻訳されたアミノ酸配列である、[9]又は[10]に記載のペプチド提示用タンパク質、
[12]前記[9]〜[11]のいずれかに記載のペプチド提示用タンパク質及び表面提示タンパク質の融合タンパク質、
[13]前記[9]〜[11]のいずれかに記載のペプチド提示用タンパク質及び[12]に記載の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、
[14][13]に記載のポリヌクレオチドを含むベクター、
[15][14]に記載のベクターを含む宿主、
[16](1)前記[14]に記載のベクターに、4〜15個のペプチドであって、そのアミノ酸配列を、前記131番〜139番の提示領域のアミノ酸配列に挿入、若しくは131番〜139番の提示領域のアミノ酸配列の1〜9個のアミノ酸配列と置換し、且つ131番〜139番のアミノ酸配列に相当するアミノ酸配列の鎖長が15個以下であるペプチド、をコードするヌクレオチドを組込み、発現ベクターを得る工程、及び(2)前記発現ベクターを宿主に導入する工程、を含むライブラリーの構築方法、
[17](1)標的分子及び[8]に記載のペプチドライブラリーを接触させる工程、(2)標的分子に結合した宿主を回収する工程、を含む標的分子に結合するペプチドのスクリーニング方法、
[18](3)前記回収した宿主を増幅する工程、を更に含む[17]に記載のペプチドのスクリーニング方法、及び
[19]前記接触工程(1)、宿主回収工程(2)及び増幅工程(3)を繰り返す、[18]に記載のペプチドのスクリーニング方法、
に関する。
《ペプチド提示タンパク質》
本発明のペプチド提示タンパク質は、配列番号54で表されるアミノ酸配列における131番〜139番の提示領域にペプチドが提示されたペプチド提示タンパク質であって、前記提示が、4〜15個(好ましくは4〜14個、より好ましくは4〜13個、更に好ましくは4〜12個)のペプチドのアミノ酸配列を、前記131番〜139番のアミノ酸配列に挿入、若しくは131番〜139番のアミノ酸配列の1〜9個のアミノ酸配列と置換するものであって、且つ131番〜139番のアミノ酸配列に相当するアミノ酸配列の鎖長が15個以下(好ましくは14個以下、より好ましくは13個以下、更に好ましくは12個以下)である。また、131番〜139番のアミノ酸配列に相当するアミノ酸配列の鎖長の下限は、好ましくは5個以上である。本発明のペプチド提示タンパク質は、配列番号54で表されるアミノ酸配列における1番〜130番のアミノ酸配列又は140番〜238番のアミノ酸配列において、1又は複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び/又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つ蛍光発生活性を有するペプチド提示タンパク質であってもよい。配列番号54で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質は、非特許文献2に記載のsfGFPであるが、本発明のペプチド提示タンパク質において、ペプチドが組込まれる親タンパク質としては、GFP系のタンパク質を用いることができる。すなわち、GFP又はGFP由来のGFP変異体タンパク質を、限定されることなく用いることができる。具体的な親タンパク質としては、GFP、YFP、CFP、BFP、又はRFPを挙げることができる。
本発明のペプチド提示タンパク質は、より好ましくは配列番号54で表されるアミノ酸配列における131番〜138番の領域にペプチドが提示されたペプチド提示タンパク質であって、前記提示が、4〜14個(好ましくは4〜13個、より好ましくは4〜12個)のペプチドのアミノ酸配列を、前記131番〜138番のアミノ酸配列に挿入、若しくは131番〜138番のアミノ酸配列の1〜8個のアミノ酸配列と置換するものであって、且つ131番〜138番のアミノ酸配列に相当するアミノ酸配列の鎖長が14個以下(好ましくは13個以下、より好ましくは12個以下)である。また、131番〜138番のアミノ酸配列に相当するアミノ酸配列の鎖長の下限は、好ましくは4個以上である。この場合、本発明のペプチド提示タンパク質は、好ましくは配列番号54で表されるアミノ酸配列における1番〜130番のアミノ酸配列又は139番〜238番のアミノ酸配列において、1又は複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び/又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つ蛍光発生活性を有するペプチド提示タンパク質であってもよい。
本発明のペプチド提示タンパク質は、より好ましくは配列番号54で表されるアミノ酸配列における131番〜137番の領域にペプチドが提示されたペプチド提示タンパク質であって、前記提示が、4〜13個(好ましくは4〜12個)のペプチドのアミノ酸配列を、前記131番〜137番のアミノ酸配列に挿入、若しくは131番〜137番のアミノ酸配列の1〜7個のアミノ酸配列と置換するものであって、且つ131番〜137番のアミノ酸配列に相当するアミノ酸配列の鎖長が13個以下(好ましくは12個以下)である。また、131番〜137番のアミノ酸配列に相当するアミノ酸配列の鎖長の下限は、好ましくは4個以上である。この場合、本発明のペプチド提示タンパク質は、好ましくは配列番号54で表されるアミノ酸配列における1番〜130番のアミノ酸配列又は139番〜238番のアミノ酸配列において、1又は複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び/又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つ蛍光発生活性を有するペプチド提示タンパク質であってもよい。
なお、提示されるペプチドの長さが短い方が、タンパク質の凝集が抑制されることがある点で好ましい。また、提示される領域が131〜139番の領域に比べて、131番〜138番の領域、又は131番〜137番の領域の場合、タンパク質の凝集が抑制されることがある点で好ましい。
本発明のペプチド提示用タンパク質は、配列番号54で表されるアミノ酸配列における131番〜139番の提示領域にペプチドが提示可能なペプチド提示用タンパク質であって、前記提示が、4〜15個(好ましくは4〜14個、より好ましくは4〜13個、更に好ましくは4〜12個)のペプチドのアミノ酸配列を、前記131番〜139番のアミノ酸配列に挿入、若しくは131番〜139番のアミノ酸配列の1〜9個のアミノ酸配列と置換するものであって、且つ131番〜139番のアミノ酸配列に相当するアミノ酸配列の鎖長が15個以下(好ましくは14個以下、より好ましくは13個以下、更に好ましくは12個以下)である。また、131番〜139番のアミノ酸配列に相当するアミノ酸配列の鎖長の下限は、好ましくは5個以上である。
更に、本発明のペプチド提示用タンパク質は、配列番号54で表されるアミノ酸配列における1番〜130番のアミノ酸配列又は140番〜238番のアミノ酸配列において、1又は複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び/又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つ蛍光発生活性を有する前記のペプチド提示用タンパク質であってもよい。配列番号54で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質は、非特許文献2に記載のsfGFPであるが、本発明のペプチド提示用タンパク質において、ペプチドが組込まれる親タンパク質としては、GFP系のタンパク質を用いることができる。すなわち、GFP又はGFP由来のGFP変異体タンパク質を、限定されることなく用いることができる。具体的な親タンパク質としては、GFP、YFP、CFP、BFP、又はRFPを挙げることができる。
本発明のペプチド提示用タンパク質は、より好ましくは配列番号54で表されるアミノ酸配列における131番〜138番の領域にペプチドを提示できるペプチド提示用タンパク質であって、前記提示が、4〜14個(好ましくは4〜13個、より好ましくは4〜12個)のペプチドのアミノ酸配列を、前記131番〜138番のアミノ酸配列に挿入、若しくは131番〜138番のアミノ酸配列の1〜8個のアミノ酸配列と置換するものであって、且つ131番〜138番のアミノ酸配列に相当するアミノ酸配列の鎖長が14個以下(好ましくは13個以下、より好ましくは12個以下)である。また、131番〜138番のアミノ酸配列に相当するアミノ酸配列の鎖長の下限は、好ましくは4個以上である。この場合、本発明のペプチド提示用タンパク質は、好ましくは配列番号54で表されるアミノ酸配列における1番〜130番のアミノ酸配列又は139番〜238番のアミノ酸配列において、1又は複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び/又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つ蛍光発生活性を有するペプチド提示タンパク質であってもよい。
本発明のペプチド提示用タンパク質は、より好ましくは配列番号54で表されるアミノ酸配列における131番〜137番の領域にペプチドが提示されたペプチド提示用タンパク質であって、前記提示が、4〜13個(好ましくは4〜12個)のペプチドのアミノ酸配列を、前記131番〜138番のアミノ酸配列に挿入、若しくは131番〜137番のアミノ酸配列の1〜7個のアミノ酸配列と置換するものであって、且つ131番〜137番のアミノ酸配列に相当するアミノ酸配列の鎖長が13個以下(好ましくは12個以下)である。また、131番〜137番のアミノ酸配列に相当するアミノ酸配列の鎖長の下限は、好ましくは4個以上である。この場合、本発明のペプチド提示用タンパク質は、好ましくは配列番号54で表されるアミノ酸配列における1番〜130番のアミノ酸配列又は139番〜238番のアミノ酸配列において、1又は複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び/又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つ蛍光発生活性を有するペプチド提示タンパク質であってもよい。
一方、本明細書において「ペプチド提示用タンパク質」とは、例えばsfGFPの131番〜139番の領域に、ペプチドが提示可能なように設計されたタンパク質を意味する。例えば、131番〜139番の領域に、ペプチドスクリーニングに用いる任意のペプチドが組込み可能であるが、まだスクリーニングされるペプチドが組込まれていないsfGFPのタンパク質を意味する。具体的な1つの態様としては、sfGFPの131番〜139番の領域にペプチドが組込み可能に設計されたベクターから、翻訳されるタンパク質を意味する。従って、ペプチド提示用タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、任意のペプチドをコードするヌクレオチドを導入するための制限酵素サイトを有することが好ましい。
前記131番〜139番の領域は、好ましくは131番〜138番の領域であり、更に好ましくは131番〜137番の領域である。領域の長さが短い方が、ペプチド提示タンパク質が可溶化しやすい傾向があるからである。更に、挿入されるペプチドの長さは、好ましくは4〜15個であり、より好ましくは4〜14個であり、更に好ましくは4〜13個であり、最も好ましくは4〜12個である。挿入されるペプチドの長さが短い方が、ペプチド提示タンパク質が可溶化しやすい傾向があるからである。
sfGFPのアミノ酸配列における131番〜139番のアミノ酸配列は「KEDGNILGH」(配列番号78)である。この9個のアミノ酸配列の領域を、4〜15個(好ましくは4〜14個)のアミノ酸配列からなるペプチドに置換した場合、ペプチドの構造自由度が制限され、安定した構造でsfGFP上に提示される。そのため、ペプチドライブラリーとして用いることにより、標的分子に対して特異性の高いペプチドをスクリーニングすることができる。
提示領域が131番〜139番のアミノ酸配列の場合、挿入又は置換されるアミノ酸配列は4〜15個であり、好ましくは4〜14個であり、131番〜139番のアミノ酸配列の1部を含んでいてもよい。従って、131番〜139番のアミノ酸配列を欠失することなく、4〜6個のアミノ酸配列が挿入されてもよい。また、131番〜139番のアミノ酸配列の1〜9個のいずれかの数のアミノ酸配列を欠失させ、合計で5〜15個、好ましくは5〜14個となるように外来のアミノ酸配列を組込んでもよい。
提示領域は、好ましくは131番〜138番のアミノ酸配列である。この場合、挿入又は置換されるアミノ酸配列は4〜14個であり、好ましくは4〜13個であり、131番〜138番のアミノ酸配列の1部を含んでいてもよい。従って、131番〜138番のアミノ酸配列を欠失することなく、4〜6個のアミノ酸配列が挿入されてもよい。また、131番〜138番のアミノ酸配列の1〜8個のいずれかの数のアミノ酸配列を欠失させ、合計で4〜14個、好ましくは4〜13個となるように外来のアミノ酸配列を組込んでもよい。
更に、効率的にペプチドライブラリーを構築するためには、挿入又は置換されるペプチドの両末端のアミノ酸配列が、制限酵素サイトを含む塩基配列の翻訳されたアミノ酸配列であることが好ましい。ペプチドの組み込みに用いられる制限酵素サイトは、限定されるものではないが、例えばBamHI、EcoRI、ScaI、SalI、SphI、PstI、NcoI、NheI、SspI、NotI、SacI、PvuII、MfeI、HindIII、SbfI、EagI、EcoRV、AvrII、BstXI、PciI、HpaI、AgeI、BsmBI、BspQI、SapI、KpnI又はBsaIを用いることができる。例えば、挿入又は置換される4〜14個のペプチドの両末端のアミノ酸配列はこれらの制限酵素が認識する塩基配列を含むヌクレオチドから翻訳されるアミノ酸配列であってもよい。
なお、このような制限酵素サイトから翻訳されるペプチドをリンカーペプチドと称することがある。
前記のように、本発明の「ペプチド提示タンパク質」、及び「ペプチド提示用タンパク質」の親タンパク質は、GFP系のタンパク質を用いることができるが、GFP系のタンパク質をコードするアミノ酸配列において、1若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び/又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つ蛍光発生活性を有するタンパク質であってもよい。
本発明において、「アミノ酸配列において、1若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び/又は付加されたアミノ酸」とは、GFP系のタンパク質であることを意味するか、又は部位特異的突然変異誘発法等の周知の方法により、又は天然に生じ得る程度の数個の数のアミノ酸の置換等により改変がなされたことを意味する。アミノ酸の改変の個数は、好ましくは1〜15個、より好ましくは1〜10個、更に好ましくは1〜5個、更により好ましくは1〜3個、最も好ましくは1個である。
本発明のポリペプチドの改変アミノ酸配列の例は、好ましくは、そのアミノ酸が、1又は数個(好ましくは、1、2、3又は4個)の保存的置換を有するアミノ酸配列であることができる。
本発明の融合タンパク質は、本発明のペプチド提示タンパク質、又はペプチド提示用タンパク質と、表面提示タンパク質とが融合したタンパク質である。
本明細書において、表面提示タンパク質とは、後述の宿主の表面に提示されるタンパク質を意味する。例えば、宿主がファージの場合は、ファージの表面タンパク質を意味する。また、宿主が細菌の場合は、細菌表面タンパク質を意味する。更に、宿主が酵母の場合は、酵母の表面タンパク質を意味し、宿主が動物細胞の場合は、動物細胞の表面タンパク質を意味する。
ペプチド提示タンパク質、又はペプチド提示用タンパク質と、宿主の表面たんぱく質とが融合することにより、ペプチド提示タンパク質は、宿主の表面に提示されることができる。従って、本発明のペプチドライブラリーを用いて、目的ペプチドのアフィニティーセレクション(スクリーニング)を行う場合、容易に目的ペプチドの濃縮を行うことができる。
細菌の表面タンパク質、例えば大腸菌の表面タンパク質としては、限定されるものではないが、OmpAを挙げることができる。
酵母の表面タンパク質としては、限定されるものではないが、Flo1、αアグルチニン、又はAGA2を挙げることができる。
動物細胞の表面タンパク質としては、限定されるものではないが、human Toll-like receptor 4、EGFR、LDL receptor、angiotensin II receptor、又はPDGFRを挙げることができる。
本発明のポリヌクレオチドは、本発明のペプチド提示タンパク質をコードするポリヌクレオチド(以下、ペプチド提示ポリヌクレオチドと称することがある)、ペプチド提示用タンパク質をコードするポリヌクレオチド(以下、ペプチド提示用ポリヌクレオチドと称することがある)、又は融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド(以下、融合ポリヌクレオチドと称することがある)である。融合ポリヌクレオチドは、ペプチド提示タンパク質又はペプチド提示用タンパク質と、表面提示タンパク質との間に存在することのあるリンカーポリペプチドをコードするヌクレオチドを含んでもよい。なお、配列番号53の塩基配列は、sfGFPをコードするヌクレオチドの塩基配列である。
本発明のポリヌクレオチドは、限定されるものではないが、ベクターに組み込むことによって、容易に増幅させることができる。また、ペプチド提示タンパク質、又は融合タンパク質として、容易に発現させることができる。
前記ポリヌクレオチドを組込むベクターとしては、宿主細胞において複製可能である限り、プラスミド、ファージ、又はウイルス等のいかなるベクターも用いることができる。例えば、pBR322、pBR325、pUC118、pUC119、pKC30、pCFM536等の大腸菌プラスミド、pUB110等の枯草菌プラスミド、pG−1、YEp13、YCp50等の酵母プラスミド、λgt110、λZAPII等のファージのDNA等が挙げられ、哺乳類細胞用のベクターとしては、バキュロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス等のウイルスDNA、SV40とその誘導体等が挙げられる。ベクターは、複製開始点、選択マーカー、プロモーターを含み、必要に応じてエンハンサー、転写終結配列(ターミネーター)、リボソーム結合部位、ポリアデニル化シグナル等を含んでいてもよい。
例えば、本発明のライブラリーとして用いる場合、M13ファージベクター、又はT7ファージベクターを用いることが好ましい。ファージディスプレイのベクターとして用いることができるからである。
本明細書において「宿主」とは、前記ベクターが組込まれ、ペプチド提示タンパク質又は融合タンパク質を発現できる限りにおいて、限定されるものでなく、ファージ、細菌、酵母、昆虫細胞、又は動物細胞を挙げることができる。例えば、ファージベクターの宿主としては、M13ファージ、fdファージ、又はT7ファージを挙げることができる。
また、細菌のベクターの宿主としては、大腸菌、ストレプトミセス、又は枯草菌を挙げることができる。更に、酵母ベクターの宿主としては、パン酵母、又はメタノール資化性酵母を挙げることができる。昆虫細胞ベクターの宿主としては、ドロソフィラS2、スポドプテラSf9を挙げることができる。更に、動物細胞ベクターの宿主としては、CHO、COS、BHK、3T3、C127を挙げることができる。
本発明のライブラリーは、ペプチド提示ライブラリーであり、提示されるペプチドは任意のアミノ酸配列を有するものである。本発明のペプチド提示ライブラリーは、標的分子に結合するペプチドをスクリーニングするために用いることができる。従って提示されるペプチドは、ランダムなアミノ酸配列からなる複数(多種類)のペプチドが含まれているものが好ましい。また、本発明のライブラリーは、前記の宿主を含むライブラリーであり、ファージディスプレイ、又は細菌、酵母、昆虫細胞、若しくは動物細胞の細胞ディスプレイのライブラリーを挙げることができる。
本発明のライブラリーを用いたスクリーニングに供される提示ペプチドの長さは特に限定されるものではないが、例えば4〜15であり、好ましくは4〜14であり、より好ましくは4〜13である。
本発明のライブラリーの構築方法は、(1)本発明のペプチド提示用タンパク質をコードするポリペプチドを含むベクターに、4〜15個(好ましくは4〜14個)のペプチドであって、そのアミノ酸配列を、前記131番〜139番の提示領域のアミノ酸配列に挿入、若しくは131番〜139番の提示領域のアミノ酸配列の1〜9個のアミノ酸配列と置換し、且つ131番〜139番の提示領域のアミノ酸配列に相当するアミノ酸配列の鎖長が15個以下(好ましくは14個以下)であるペプチド、をコードするヌクレオチドを組込み、ベクターを得る工程、及び(2)前記ベクターを宿主に導入する工程、
を含む。ライブラリーは、具体的にはペプチド提示ライブラリーであり、任意のペプチドを提示することのできるライブラリーである。
本発明のライブラリーの構築方法は、好ましくは(1)本発明のペプチド提示用タンパク質をコードするポリペプチドを含むベクターに、4〜14個(好ましくは4〜13個)のペプチドであって、そのアミノ酸配列を、前記131番〜138番の提示領域のアミノ酸配列に挿入、若しくは131番〜138番の提示領域のアミノ酸配列の1〜8個のアミノ酸配列と置換し、且つ131番〜138番の提示領域のアミノ酸配列に相当するアミノ酸配列の鎖長が14個以下(好ましくは13個以下)であるペプチド、をコードするヌクレオチドを組込み、ベクターを得る工程、及び(2)前記ベクターを宿主に導入する工程、を含む。
組込まれるヌクレオチドがコードするポリペプチドの長さは、特に限定されるものではないが、例えば4〜15であり、好ましくは4〜14であり、より好ましくは4〜13である。
ライブラリーに組込む遺伝子は、公知の方法で調整することができる。
例えば、ランダムなアミノ酸をコードするNNKコドン(NはA、G、C、Tのいずれかの塩基、KはGもしくはTのいずれかの塩基)を任意のアミノ酸をコードするコドンと部位特異的に置換する。置換には当該領域を含むオリゴDNAを化学合成し、制限酵素を利用して組込む、あるいはPCRを用いてベクター全長を複製する方法が用いられる。
本発明のスクリーニング方法は、(1)標的分子及び前記のペプチドライブラリーを接触させる工程、(2)標的分子に結合した宿主を回収する工程、
を含み、好ましくは(3)前記回収した宿主を増幅する工程を更に含む。本発明のスクリーニング方法は、前記接触工程(1)、宿主回収工程(2)及び増幅工程(3)を繰り返し、標的分子に結合するペプチドを濃縮することが好ましい。前記接触工程(1)における標的分子及びペプチドライブラリーの接触は、標的分子を不溶性担体(例えば、ウエル又はディッシュ)に固相化して行うことができる。
本発明のスクリーニング方法は、本発明のライブラリーを用いる以外は、公知の方法に従って行うことができる。例えば、宿主としてファージを用いたファージライブラリーのスクリーニングは、以下のようにことができる。プレートなどに、固相化した標的分子と、ファージライブラリーとを接触させることにより反応させる。洗浄によって標的分子と結合しなかったファージを除去する。標的分子に結合したファージを回収し、大腸菌に感染させ、溶菌、そして増殖させる。溶菌後の培養上清、又は精製したファージを、更に固相化した標的分子と反応させる(パンニングさせる)ことによって、標的分子に特異的な結合分子を提示したファージを濃縮する。最終的にファージをクローン化し、提示ペプチドをシークエンスにより同定する。
得られたペプチドは、標的分子と結合することができるペプチドである。本発明のスクリーニング方法では、ペプチドが本発明のペプチド提示用タンパク質に提示されているため、ペプチドの構造が安定し、標的分子に特異性の高いペプチドをスクリーニングすることができる。
本参考例では、sfGFPを発現するベクターを構築した。
Enhanced GFP(EGFP)の遺伝子を持つベクターpGEX−6P−3−PTD−3−ODD−EGFP(Kizaka-Kondohら、Clin. Cancer. Res.、2009年、15巻、3433−3441頁)を鋳型として、プライマー(配列番号1及び2)(表2)を用いて、KOD FX(TOYOBO)にてPCRを行い、両端に制限酵素Bam HI及びEco RI認識部位が付加された0.7kbのEGFP遺伝子断片を得た。この断片をBam HI及びEco RIで切断し、予めBam HI及びEco RIで切断しておいたクローニングベクターpGEM−3Zf(+)(プロメガ)に連結した。これにより、EGFP遺伝子が挿入されたベクターpGEM−EGFPを得た。
ベクターpGEM−EGFPを鋳型としてプライマー(配列番号3−16)(表2)を用いて、PfuUltra High fidelity DNA Polymerase(アジレント・テクノロジー)にてPCRを行い、9個のアミノ酸を置換するための変異を部位特異的に導入してsfGFP遺伝子が挿入されたベクターpGEM−sfGFPを得た。このベクターをBam HI及びEco RIで切断してBam HI−Eco RI断片を得た。この断片をGST融合タンパク質発現用ベクターpGEX−6P−3(GEヘルスケア)のBam HI部位とEco RI部位に連結し、sfGFP遺伝子を挿入したベクターpGEX−sfGFPを得た。pGEX−sfGFPは、5.6kbpの大きさであり、tacプロモーターの下流にGST及びsfGFPの構造遺伝子の塩基配列をこの順で有する。従って、pGEX−sfGFPは、GST及びsfGFPを、この順に1つの融合タンパク質として大腸菌細胞内に発現する。
本実施例では、sfGFPの131番〜139番のアミノ酸配列に、カスパーゼ3の認識ペプチドを導入したペプチド提示タンパク質を作成した。
参考例1で構築したベクターpGEX−sfGFPを鋳型として、プライマー(配列番号17、18、23−28、31−46、58−59、64−71)(表2)を用いて、PfuUltra High fidelity DNA PolymeraseにてPCRを行い、部位特異的にCaspase−3認識ペプチド配列(DEVD)を組み込んだsfGFPを発現するためのベクターpGEX−m1(実施例1)、pGEX−m4〜pGEX−m6(実施例2〜4)、pGEX−m10〜pGEX−m22(実施例5〜実施例17)を得た。置換されたペプチドの長さ及び位置を表1に示す。なお、実施例16(m10)及び実施例17(m22)で得られたペプチド提示タンパク質は、不溶化しやすかった。
本比較例では、sfGFPの131番〜139番のアミノ酸配列の領域以外のアミノ酸配列に、カスパーゼ3の認識ペプチドを導入したペプチド提示タンパク質を作成した。
プライマーとして、配列番号19及び20(比較例1)、配列番号21及び22(比較例2)、配列番号29及び30(比較例3)、配列番号60及び61(比較例4)、配列番号62及び63(比較例5)のプライマーを用いた以外は、実施例1の操作を繰り返して、ベクターpGEX−m2(比較例1)、pGEX−m3(比較例2)、pGEX−m7(比較例3)、pGEX−m8(比較例4)、pGEX−m9(比較例5)を得た。置換されたペプチドの長さ及び位置を表1に示す。
前記実施例1〜17及び比較例1〜5で得られたベクターを用いて、ペプチド提示タンパク質の発現及び精製を行った。
前記発現ベクターpGEX−sfGFP、pGEX−m1〜pGEX−m22を、ヒートショック法で大腸菌Escherichia Coli BL21−CodonPlus(DE3)株(アジレント・テクノロジー)にそれぞれ導入した。発現ベクターが導入された大腸菌を、50mLのLBA培地(0.01%アンピシリンを含む、1%Bacto Tryptone、0.5%Bacto Yeast extract、1%NaCl培地)中で37℃にてO.D.600=0.5になるまで培養した。イソプロピル−β−チオガラクトピラノシドを0.1mMになるように培養液に添加し、20℃にて一晩培養してGST融合タンパク質を発現させた大腸菌を得た。
pGEX−m1〜m9及びm11〜m21から得られたペプチド提示タンパク質は、カスパーゼ3認識ペプチド配列(DEVD)が組込まれている。この提示ペプチドの構造自由度を検討のために、ペプチド提示タンパク質のカスパーゼ3による切断を行った。
10μMのペプチド提示タンパク質m1〜m9及びm11〜m21をカスパーゼ3反応バッファー(20mM Pipes(pH7.2)、100mM NaCl、0.1%CHAPS、10%スクロース、10mM DTT)中で、4mU/mLのヒトカスパーゼ3(Sigma-Aldrich)と37℃で24時間反応させた。コントロールとしてsfGFPを用いた。反応液は15%アクリルアミドゲルで電気泳動し、Hybond ECL membranes(GEヘルスケア)に20V電圧一定で1時間転写した。次に5%スキムミルクでブロッキングを行い、一次抗体(ラビットポリクローナル抗GFP抗体)を4℃で一晩反応させ、二次抗体(HRP結合抗ラビットIgG抗体)を室温で1時間反応させ、ECL prime(GEヘルスケア)を添加して切断断片を検出した。この結果、m2(比較例1)、m3(比較例2)、m7(比較例3)、m8(比較例4)、m9(比較例5)はカスパーゼ3に分解された。一方、m1(実施例1)、m4(実施例2)、m5(実施例3)、m6(実施例4)、m11(実施例5)、m12(実施例6)、m13(実施例7)、m14(実施例8)、m15(実施例9)、m16(実施例10)、m17(実施例11)、m18(実施例12)、m19(実施例13)、m20(実施例14)、m21(実施例15)ではほとんど切断されなかった(表1及び図2)。これはsfGFPの131番〜139番の領域に、アミノ酸長5−14の認識ペプチドを組み込んだ場合、カスパーゼ3に結合されないことを示し、これ以外の領域ではカスパーゼ3が結合可能であることを示している。すなわち、sfGFPの131番〜139番の領域に組込まれたペプチドは、構造的に固定されており、ペプチドの構造自由度が制限されていると考えられた。
ペプチドを組込むことによるペプチド提示タンパク質の蛍光強度への影響を検討した。
ペプチド提示タンパク質(m1〜m9及びm11〜m21)を、バッファー(20mM Pipes(pH7.2)、100mM NaCl、0.1%CHAPS、10スクロース、10mM DTT)で10μMに調整して蛍光を測定した(励起/蛍光波長=480/510nm)。ペプチドの構造自由度が制限されているm1(実施例1)、m4(実施例2)、m5(実施例3)、m6(実施例4)、m11(実施例5)、m12(実施例6)、m13(実施例7)、m14(実施例8)、m15(実施例9)、m16(実施例10)、m17(実施例11)、m18(実施例12)、m19(実施例13)、m20(実施例14)、m21(実施例15)では蛍光が見られたが、m2(比較例1)、m3(比較例2)、m7(比較例3)、m8(比較例4)、m9(比較例5)では蛍光が消失していた(表1及び図3)。すなわち、sfGFPの131番〜H139番の領域に、アミノ酸長5−14の認識ペプチドを組み込んだ場合は、GFPの蛍光が維持されることが示された。
作製したペプチド提示タンパク質に組み込んだペプチドの構造自由度が制限されていれば、分子動力学シミュレーションにおいてK131−H139領域は構造的なゆらぎが小さくなると考えられた。
カスパーゼ3に分解されにくいsfGFP、m1(実施例1)、m6(実施例4)、m19(実施例13)の分子動力学シミュレーションを実施した。コントロールとしてカスパーゼ3に分解されるm7(比較例3)を用いた。これらのタンパク質の初期構造はsfGFPの結晶構造(PDB ID:2B3P)より作成した。計算を簡便にするために蛍光団を構成する2アミノ酸(65T,66Y)はグリシン残基に置換した。Amber 11 program package(Amber)のff99SB力場を利用して初期構造から熱力学的な安定構造を計算した。分子動力学シミュレーションはAmber 11のSanderモジュールを利用し、GB/SA溶媒モデルにおいて10ナノ秒の計算を行い、平衡状態に達した4.5ナノ秒〜10ナノ秒の構造を用いてゆらぎを評価した。
本実施例では、乳癌マーカータンパク質HER2に結合することが報告されている5種のペプチドをsfGFPの131番〜139番のアミノ酸配列の領域に組み込み、発現ベクター及び精製タンパク質を得た。
プライマーとして、配列番号47及び48(実施例16)、配列番号49及び50(実施例17)、配列番号51及び52(実施例18)、配列番号72及び73(実施例19)、配列番号74及び75(実施例20)のプライマーを用いた以外は、実施例1の操作を繰り返して、ベクターpGEX−mH1(実施例16)、pGEX−mH2(実施例17)、pGEX−mH3(実施例18)、pGEX−mH4(実施例19)、及びpGEX−mH5(実施例20)を得た。置換されたペプチドの長さ及び位置を図5(A)に示す。mH1は「KEDGKCCYSLGH」(配列番号55)、mH2は「KEDGCDGFYACGH」(配列番号56)、mH3は「KEDGFHAHPGH」(配列番号57)、mH4は「KEDGWYAWMLGH」(配列番号76)、そしてmH5は「KEDGWYSWLLGH」(配列番号77)である。
更に、ベクターpGEX−mH1、pGEX−mH2、pGEX−mH3、pGEX−mH4、及びpGEX−mH5を用いたことを除いては、前記「ペプチド提示タンパク質の発現及び精製」の操作を繰り返して、ペプチド提示タンパク質を得た(以下、pGEX−mH1〜mH5から得られたペプチド提示タンパク質を、それぞれmH1〜mH5と称することがある)。
2.5×104個のHER2陽性N87胃がん細胞及びHER2陰性SUIT−2膵がん細胞を8wellスライドチャンバー培養プレート中で16時間培養した。細胞は4%パラホルムアルデヒドリン酸バッファーと15分反応させて固定し、PBS溶液で洗浄、3%ウシ血清アルブミン/TBSTで15分ブロッキングした。次に2μMのペプチド提示タンパク質(mH1、mH2、mH3、mH4、又はmH5)を添加して4℃で16時間インキュベートし、蛍光顕微鏡観察により結合性を評価した。この結果、mH1及びmH2ではN87細胞への特異的な結合が見られたが、mH3、mH4、及びmH5は結合しなかった(図4(B))。つまり、構造が制限されている条件でスクリーニングされたペプチドを組み込んだ場合には同様に高い結合性が見られ、構造が自由に変化する条件でスクリーニングされたペプチドを組み込んでも結合は見られなかった。前者は既にマウス生体内でも機能することが分かっている。従って、sfGFPのK131−H139領域にペプチドを組み込み評価に利用することで、生体内でも機能する特異性の高い標的結合ペプチドを簡便に高感度にスクリーニングできることが示された。
K131−L137領域における本発明のペプチド提示タンパク質であるm12(実施例6)、m15(実施例9)、m16(実施例10)、m19(実施例13)、m21(実施例15)、及びm22(実施例17)の分子動力学シミュレーションを実施した。陽性コントトールとして、sfGFPを用いた。m12(実施例6)、m15(実施例9)、m16(実施例10)、m19(実施例13)、m21(実施例15)、及びm22(実施例17)を用いた以外は、解析例1の操作を繰り返した。
以上、本発明を特定の態様に沿って説明したが、当業者に自明の変形や改良は本発明の範囲に含まれる。
Claims (12)
- 配列番号54で表される30番がアルギニン、39番がアスパラギン、105番がトレオニン、145番がフェニルアラニン、171番がバリン、及び206番がバリンであるsfGFPタンパク質のアミノ酸配列における131番〜139番の提示領域にペプチドが提示されたペプチド提示タンパク質であって、
前記提示が、4〜15個のペプチドのアミノ酸配列を、前記131番〜139番のアミノ酸配列に挿入、若しくは131番〜139番のアミノ酸配列の1〜9個のアミノ酸配列と置換するものであって、且つ131番〜139番のアミノ酸配列に相当するアミノ酸配列の鎖長が15個以下である、ペプチド提示タンパク質。 - 前記配列番号54で表される30番がアルギニン、39番がアスパラギン、105番がトレオニン、145番がフェニルアラニン、171番がバリン、及び206番がバリンであるsfGFPタンパク質のアミノ酸配列における1番〜130番のアミノ酸配列又は140番〜238番のアミノ酸配列において、1〜15個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び/又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つ提示されたペプチドの構造自由度が制限され、そして蛍光発生活性を有する請求項1に記載のペプチド提示タンパク質。
- 前記挿入又は置換される4〜15個のペプチドの末端のアミノ酸配列が、制限酵素サイトを含む塩基配列から翻訳されたアミノ酸配列である、請求項1又は2に記載のタンパク質。
- 請求項1〜3のいずれか一項に記載のペプチド提示タンパク質及び表面提示タンパク質の融合タンパク質。
- 請求項1〜3のいずれか一項に記載のペプチド提示タンパク質、又は請求項4に記載の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
- 請求項5に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
- 請求項6に記載のベクターを含む宿主細胞。
- 前記提示されるペプチドがランダムなアミノ酸配列からなる複数のペプチドである、請求項7の宿主細胞を含むライブラリー。
- (1)(a)配列番号54で表される30番がアルギニン、39番がアスパラギン、105番がトレオニン、145番がフェニルアラニン、171番がバリン、及び206番がバリンであるsfGFPタンパク質のアミノ酸配列における131番〜139番の提示領域にペプチドが提示可能なペプチド提示用タンパク質、
(b)配列番号54で表される30番がアルギニン、39番がアスパラギン、105番がトレオニン、145番がフェニルアラニン、171番がバリン、及び206番がバリンであるsfGFPタンパク質のアミノ酸配列における1番〜130番のアミノ酸配列又は140番〜238番のアミノ酸配列において、1〜15個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び/又は付加されたアミノ酸配列からなり、131番〜139番の提示領域にペプチドが提示可能なペプチド提示用タンパク質であって、提示されたペプチドの構造自由度が制限され、そして蛍光発生活性を有するペプチド提示用タンパク質、又は
(c)前記ペプチド提示用タンパク質(a)又は前記ペプチド提示用タンパク質(b)と、表面提示タンパク質との融合タンパク質、
をコードするポリヌクレオチドを含むベクターに、
4〜15個のペプチドであって、そのアミノ酸配列を、前記131番〜139番の提示領域のアミノ酸配列に挿入、若しくは131番〜139番の提示領域のアミノ酸配列の1〜9個のアミノ酸配列と置換し、且つ131番〜139番のアミノ酸配列に相当するアミノ酸配列の鎖長が15個以下であるペプチド、
をコードするヌクレオチドを組込み、発現ベクターを得る工程、及び
(2)前記発現ベクターを宿主細胞に導入する工程、
を含むライブラリーの構築方法。 - (1)標的分子及び請求項8に記載のペプチドライブラリーを接触させる工程、
(2)標的分子に結合した宿主細胞を回収する工程、
を含む標的分子に結合するペプチドのスクリーニング方法。 - (3)前記回収した宿主細胞を増幅する工程、
を更に含む請求項10に記載のペプチドのスクリーニング方法。 - 前記接触工程(1)、宿主細胞回収工程(2)及び増幅工程(3)を繰り返す、請求項11に記載のペプチドのスクリーニング方法。
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