JP6476275B2 - 分析装置およびその分析方法 - Google Patents

Description

本発明は、分析装置およびその分析方法に関し、例えば、生物学的試料に含まれる核酸を増幅することによって生物学的試料を分析するための分析装置およびその分析方法に関する。

血液、血漿、組織片などの生物学的試料に含まれる核酸の分析は、生物学、生化学、医学などの学術研究ばかりでなく、診断、農作物の品種改良、食品検査といった産業など多岐の分野で行われている。核酸の分析方法としてもっとも広く普及している方法は、ＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）と呼ばれる、分析したい領域の核酸を塩基配列特異的に増幅させる技術である。ＰＣＲでは、核酸とそれを増幅させるための試薬を含む反応液を、９５℃程度に加熱して核酸を熱変性させ、その後６０℃程度まで冷却して核酸のアニーリングと伸長反応を進めるというサイクルが３０〜４０回繰り返される。反応の進行に伴う核酸の増幅を検出する方式として、多くの場合、ＰＣＲ生成物量に依存して蛍光強度が変化する蛍光標識を反応液に混合し、励起光を照射して、蛍光標識から放射される蛍光強度を測定する方式が用いられる。

ＰＣＲは数百万ものＤＮＡコピーを合成できる一方で、混入物に非常に敏感なためごく微量の鋳型ＤＮＡから反応を開始する場合、反応系の外から入ってくる物質のコンタミネーションが問題となっている。

特許文献１には、回転軸線回りに回転可能なカローセルと、カローセルの円周状の縁に沿って保持された複数の反応容器と、反応容器に励起光を照射する光源と該反応容器内の反応液からの蛍光を検出する検出素子とを有する少なくとも１個の検出器と、を有する分析装置に関しての記載がある。

特許文献2では、自動分析装置上での散乱光測定における気泡・ゴミの影響を低減する方法について記載されている。

特開2013-148590号公報 特開2014-202523号公報

ＰＣＲ法を用いた際、核酸とそれを増幅させるための試薬を含む反応液中に気泡やゴミが存在すると、分析したい領域の核酸を効率的に増幅できないという問題が生じる。さらに、反応液に励起光を照射して、蛍光標識から放射される蛍光強度を測定する際に、反応液中に気泡やゴミなどの外乱物質が存在するとノイズとなってしまい効果的に蛍光強度を測定できないという問題が生じる。

例えば、特許文献１にはＰＣＲ法を用いて反応液を増幅させる方法が記載されているが、ノイズに関する記載はない。さらに、特許文献２には自動分析装置上での散乱光測定における気泡・ゴミの影響についての記載はあるが、自動分析装置とは異なる方法で検出する核酸分析装置では、そのまま適用できない。

本発明は、このようなことを鑑みてなされたものであり、その目的の一つは、反応液中のコンタミネーションを迅速に検出することが可能な核酸分析装置およびその核酸分析方法を提供することにある。

本願において開示される発明のうち、代表的な実施の形態の概要を簡単に説明すれば、次のとおりである。試料を入れた反応容器を保持できる保持部材と、保持部材の所定の位置に光を照射する光源と、光源からの光の照射に応じて保持部材の所定の位置から放射される蛍光を検出する第１検出器と、光源からの光の照射に応じて保持部材の所定の位置から放射される散乱光を検出する第２検出器と、を有することを特徴とする核酸分析装置。

本願において開示される発明のうち、代表的な実施の形態によって得られる効果を簡単に説明すると、核酸分析装置において、分析の異常等を迅速に検出することが可能になる。

本実施例におけるによる核酸分析装置の全体構成を示す上面図 図１のＡ−Ａ’間の構成例を示す断面図 光度計の詳細な構成例を示す模式図 図３の蛍光検出器および散乱光検出器において、核酸を分析する際に得られる各検出信号の時間的推移の一例を示す図 図１および図２の核酸分析装置において、その機能面での主な構成例の概略ブロック図 図５における分析処理部の処理内容の一例を示すフロー図 蛍光検出器および散乱光検出器によって得られる各検出信号の一例を示す図 蛍光検出器および散乱光検出器によって得られる各検出信号を基に出力値を設けた場合の一例を示す図 測定中に盲蛍光物質の増加がない場合の各検出信号の時間的推移の一例を表す図 測定中に盲蛍光物質の増加がある場合の各検出信号の時間的推移の一例を表す図 本発明の実施の形態４による核酸分析装置において、その概略的な構成例を示す上面図である。

以下の実施の形態においては便宜上その必要があるときは、複数のセクションまたは実施の形態に分割して説明するが、特に明示した場合を除き、それらは互いに無関係なものではなく、一方は他方の一部または全部の変形例、詳細、補足説明等の関係にある。また、以下の実施の形態において、要素の数等（個数、数値、量、範囲等を含む）に言及する場合、特に明示した場合および原理的に明らかに特定の数に限定される場合等を除き、その特定の数に限定されるものではなく、特定の数以上でも以下でも良い。

さらに、以下の実施の形態において、その構成要素（要素ステップ等も含む）は、特に明示した場合および原理的に明らかに必須であると考えられる場合等を除き、必ずしも必須のものではないことは言うまでもない。同様に、以下の実施の形態において、構成要素等の形状、位置関係等に言及するときは、特に明示した場合および原理的に明らかにそうでないと考えられる場合等を除き、実質的にその形状等に近似または類似するもの等を含むものとする。このことは、上記数値および範囲についても同様である。

以下、本発明の実施の形態を図面に基づいて詳細に説明する。なお、実施の形態を説明するための全図において、同一の部材には原則として同一の符号を付し、その繰り返しの説明は省略する。

図１を用いて、本発明の実施形態１について説明する。本発明の実施の形態１による核酸分析装置において、その主要部の構成例を示す上面図である。図２は、図１のＡ−Ａ’間の構成例を示す断面図である。図１および図２の核酸分析装置９において、温調ブロック１は、カローセル２の中心軸周りで外周に沿って複数個（この例では１２個）配置されており、回転軸３を中心に回転駆動される。複数の温調ブロック１とカローセル２との間にはそれぞれペルチェ素子４が配置される。温調ブロック１の温度は、温調ブロック１内に搭載された温度センサ５で温度をモニタしながらペルチェ素子４を制御することで調整される。複数の温調ブロック１のそれぞれに対応してペルチェ素子４及び温度センサ５を一組ずつ配置することで、複数の温調ブロック１の温度は、それぞれ独立に調整される。

カローセル２の外周には、光度計６が配置される。ここでは、一例として、それぞれ異なる波長の光を用いる２個の光度計６は示しているが、カローセル２の外周であれば１個あるいは３個以上の光度計６を配置しても構わない。全ての温調ブロック１は回転駆動により同一円周上を動くため、光度計６の前を通過する際の光度計６と温調ブロック１との相対位置は、全ての温調ブロック１で同じになる。

複数の温調ブロック１は、光度計６で分析する際に光学的な外乱を低減するため、カローセル２を含めて遮蔽板７で覆われている。分析が実施される際には、核酸に試薬などを混ぜた反応液（試料）を含むチューブ（反応容器）１０が温調ブロック（保持部材）１で保持される。全ての温調ブロック１には、光度計６から励起光を受けるための励起光照射窓８と、光度計６が蛍光を取り込むための蛍光検出窓９とが設けられる。ここでは、励起光照射窓８を温調ブロック１の下面側に、蛍光検出窓９を温調ブロック１の側面側に配置しているが、光度計の構造に応じて窓の配置は自由に設定することが可能である。

次に、光度計６の詳細な説明を行う。図３は、図１および図２の核酸分析装置における光度計の詳細な構成例を示す模式図である。図３の光度計６において、光源であるＬＥＤ（Light Emitting Diode、発光ダイオード）１１から照射された励起光は、レンズ１２を通過して平行光となり、第一波長選択フィルタ１３を通過して必要な波長成分だけが取り出される。第一波長選択フィルタ１３を通過した光は、レンズ１４で集光され、温調ブロック（保持部材）１の励起光照射窓８へ入射する。温調ブロック１では、核酸に試薬などを混ぜた反応液（試料）を含むチューブ（反応容器）１０が保持される。レンズ１４で集光された励起光がチューブ１０を保持した状態の温調ブロック１に照射されると、励起光に反応してチューブ１０内の反応液の蛍光成分より蛍光を放射する。さらにチューブ内の反応液に散乱光成分が含まれている場合は励起光に反応して散乱成分より散乱光を放射する。さらに温調ブロック１の蛍光検出窓９から放射された蛍光および散乱光は、レンズ１５で再び平行光となる。レンズ１５を通過した光の一部は、光スプリッタ１６で反射し、第二波長選択フィルタ１７を通過して必要な波長成分だけが取り出される。第二波長選択フィルタ１７を通過した光は、レンズ１８で集光され、散乱光検出器（第２検出器）１９へ入射する。散乱光検出器１９は、例えば、光電変換用ダイオード（ＰＤ）等で構成される。

一方、光スプリッタ１６を通過した残りの光は、第三波長選択フィルタ２０を通過して必要な波長成分だけが取り出される。第三波長選択フィルタ２０を通過した光は、レンズ２１で集光され、蛍光検出器（第１検出器）２２へ入射する。蛍光検出器２２は、例えば、光電変換用ダイオード（ＰＤ）等で構成される。

例えば、光源であるＬＥＤ１１は常に励起光を照射し、散乱光検出器１９および蛍光検出器２２は常に検出を行っている。散乱光検出器１９および蛍光検出器２２で検出された光は、光の強度に応じた検出信号（電流または電圧）を生成し、当該検出信号は、信号増幅回路を経てＡ／Ｄ変換され、信号処理部２７へ伝送される。ただし、全ての検出信号を常に信号処理すると、核酸分析装置３１の負担が大きいため、核酸分析装置３１は、実際には、温調ブロック１が光度計６の前を通過する直前にトリガをかけ、通過した直後に検出信号の取得を止める制御を行う。

このような制御によって核酸の分析を行った場合、典型的には図４に示すような検出信号が得られる。

図４は、図３の散乱光検出器１９および蛍光検出器２２において、核酸を分析する際に得られる各検出信号の時間的推移の一例を示す図である。一般に、散乱光検出器１９および蛍光検出器２２による検出信号は、経時的に山なりの波形を持つ信号となり、計測対象の温調ブロック１の中心線が光度計６のＬＥＤ１１の光軸を通過する瞬間にピークを迎える。しかし、散乱光が小さい場合には、散乱光検出器１９による検出信号は電気的なノイズに隠れ、図４に示すようにほぼ一定の値を示す。多くの核酸分析装置では、検出信号に含まれる電気的なノイズの影響を低減するために、検出信号の波形をある規則に従ってカーブフィッティングして近似曲線を求め、その近似曲線のピークの値を取得し、その変化を観測することで核酸の分析が行われる。

次に、以上のように構成した核酸分析装置において、反応容器中の気泡やゴミ等の盲蛍光物質の混入有無を検出するための方法について説明する。

図５は、図１および図２の核酸分析装置において、その機能面での主な構成例を示す概略ブロック図である。図５に示す核酸分析装置３１は、前述した複数の温調ブロック１、カローセル２および光度計６に加えて、これらの制御等を行う分析処理部３６を備える。分析処理部３６は、主にコンピュータシステム等によって構成され、主に、所定の処理シーケンスに基づいて、各温調ブロック１の温度調整を行う温度処理部３８や、カローセル２の回転制御を行う回転処理部３９や、光度計６の制御等を行う信号処理部２７を有する。信号処理部２７は、光度計６内の蛍光検出器２２や散乱光検出器１９等の各検出器によって得られた信号を処理する。さらに、分析処理部３６の結果等を表示部４０に表示する。

図６は、図５における分析処理部３６の処理内容の一例を示すフロー図である。分析処理部３６は、例えば、核酸分析装置３１の電源投入直後に起動され、測定開始直後に図６の処理を実行する。まず、分析処理部３６は、光度計６内のＬＥＤ（光源）１１を、光度計６上に図３に示したチューブ（反応容器）１０が保持された状態の温調ブロック（保持部材）１に向けて励起光を照射させる。一般に光源は、点灯直後は不安定なため、予め照射させておいても構わない。また、温調ブロック１を通過させる場合も、ＬＥＤ（光源）１１は予め照射させておけばよい。

次いで、蛍光検出器２２に、チューブ（反応容器）１０から放射された蛍光の強度を検出させる。さらに、散乱光検出器１９はチューブ（反応容器）１０から生じる散乱光の強度を検出させる。ここで、散乱光は、チューブ（反応容器）１０内の例えば気泡やゴミ等の盲蛍光物質のみならず、それ以外の様々な箇所で生じ得る。

続いて、分析処理部３６の信号処理部３７は、検出された蛍光の強度や、散乱光の強度に基づいて、盲蛍光物質の混入の有無を検出する。

図７は、蛍光検出器および散乱光検出器によって得られる各検出信号の一例を示す図である。蛍光検出器１９からの検出信号は、蛍光物質が含まれ、かつ盲蛍光物質が混入していない場合は、バックブラウンドと比較して一定以上の値を示す。一方、散乱光検出器２２は盲蛍光物質が混入している場合に検出される。さらに、盲蛍光物質の混入により、混入していない場合と比較すると蛍光の検出値が減少する場合もある。なお、図７の例は、説明のために蛍光強度と散乱光強度を一定としているが、蛍光物質や盲蛍光物質の含量、あるいはＰＣＲサイクルの進行によって、蛍光強度と散乱光強度は変化する場合がある。また、装置の実使用条件を想定して、ＬＥＤ１１の発光パワーを図４の場合と同レベルに設定した状態で診断を行っているが、場合によっては、ＬＥＤ１１の発光パワーを増やし、散乱光を増やした状態で盲蛍光物質の混入の有無を検出してもよい。

図８は、散乱光検出器によって得られる検出信号に閾値を設けた場合の一例を示す図である。図７の場合と同様に、盲蛍光物質が混入している場合は、散乱光が増加する。この際に、図７における散乱光検出信号のレベルに予め閾値を設けておき、この閾値を上回った場合には盲蛍光物質が混入していると判定し、表示部４０にアラームを出すようにしておけば、チューブ内の反応容器に盲蛍光物質が入っていることを容易に判断可能となる。

図９は測定中に盲蛍光物質がない、あるいは盲蛍光物質が極めて微量でＰＣＲによって盲蛍光物質が増加しない場合の各検出信号の時間的推移の一例を表す図である。このような場合は、散乱光強度は増加せず、さらに、異物の有無の出力値は検出されない。

一方、図１０は測定中に盲蛍光物質があり、ＰＣＲによって盲蛍光物質が増加する場合の各検出信号の時間的推移の一例を表す図である。反応容器中に含まれる盲蛍光物質が増加すると、散乱光強度は増加する。さらに、散乱光検出信号のレベルに予め閾値を設けておくことによって、この閾値を上回り、盲蛍光物質が混入していると判定される出力信号が得られる。

図１１は、本実施例による核酸分析装置において、その概略的な構成例を示す上面図である。図１１の核酸分析装置３２は、検体から核酸を抽出する核酸抽出ユニット３３と、抽出した核酸に試薬を分注し、混合する試薬混合ユニット３４と、混合後の反応液を温調して蛍光を検出する核酸分析ユニット３５とを備える。

核酸抽出ユニット３３は、検体架設部４１、遠心部４２、退避室４３、チューブ架設部４４、抽出試薬保管庫４５、消耗品保管庫４６などから構成され、詳しい説明は省略するが、検体から不要成分を取り除き、分析に必要な核酸だけを抽出する機能を担う。試薬混合ユニット３４は、分析試薬保管庫４７、消耗品保管庫４８、混合部４９などから構成され、詳しい説明は省略するが、核酸抽出ユニット３３で抽出された核酸に分析用の試薬を混合する機能を担う。核酸分析ユニット３５の構成は、図１に示した核酸分析装置３１と同じであり、最終工程となる核酸を分析する機能を担う。各ユニット間のチューブの搬送は、ロボットアーム５０によって行われる。

分析の実行者は、核酸分析装置３２を立ち上げ、検体、試薬、チューブなどの消耗品をセットし、分析を開始する。この際に、分析処理部において仮に盲蛍光物質が混入していた結果が示された場合には、盲蛍光物質が混入していた検体と同様の処理により試薬の調製を行った検体グループに対して分析用の前処理を施す前（具体的には試薬を混合する前であり、より望ましくは核酸を抽出する前）にユーザーにて盲蛍光物質の混入がないかを確認することができ、検体が無駄にならなくて済む。比較例として、核酸抽出ユニット３３、試薬混合ユニット３４および核酸分析ユニット３５がそれぞれ別の装置によって構成されるような場合、既に試薬の混合が行われてしまっているような事態が生じ得る。

以上、本発明者によってなされた発明を実施の形態に基づき具体的に説明したが、本発明は前記実施の形態に限定されるものではなく、その要旨を逸脱しない範囲で種々変更可能である。例えば、前述した実施の形態は、本発明を分かり易く説明するために詳細に説明したものであり、必ずしも説明した全ての構成を備えるものに限定されるものではない。また、ある実施の形態の構成の一部を他の実施の形態の構成に置き換えることが可能であり、また、ある実施の形態の構成に他の実施の形態の構成を加えることも可能である。また、各実施の形態の構成の一部について、他の構成の追加・削除・置換をすることが可能である。

例えば、これまでの説明では、本実施の形態による装置診断方法の特に有益な適用例となる核酸分析装置について説明を行った。ただし、必ずしも核酸分析装置に限定されるものではなく、反応容器を保持部材にセットし、光度計を用いて反応容器内の試料を分析する装置であれば、同様に適用して、同様の効果が得られる場合がある。

１ 温調ブロック
２ カローセル
３ 回転軸
４ ペルチェ素子
５ 温度センサ
６ 光度計
７ 遮蔽板
８ 励起光照射窓
９ 蛍光検出窓
１０ チューブ
１１ ＬＥＤ
１２，１４，１５，１８，２１ レンズ
１３ 第一波長選択フィルタ
１５ 励起光モニタ検出器（第２検出器）
１６ 光スプリッタ
１７ 第二波長選択フィルタ
１９ 散乱光検出器（第２検出器）
２０ 第三波長選択フィルタ
２２ 蛍光検出器（第１検出器）
３１，３２ 核酸分析装置
３３ 核酸抽出ユニット
３４ 試薬混合ユニット
３５ 核酸分析ユニット
３６ 分析処理部
３７ 信号処理部
３８ 温度処理部
３９ 回転処理部
４０ 表示部
４１ 検体架設部
４２ 遠心部
４３ 退避室
４４ チューブ架設部
４５ 抽出試薬保管庫
４６，４８ 消耗品保管庫
４７ 分析試薬保管庫
４９ 混合部
５０ ロボットアーム

Claims (5)

1. 試料を入れた反応容器を保持できる保持部材と、
   保持部材を複数配置可能なカローセルと、
   前記保持部材と前記カローセルを覆う光学的な外乱を低減するための遮蔽板を備え、
   保持部材の所定の位置に光を照射する光源と、
   光源からの光の照射に応じて保持部材の所定の位置から放射される蛍光を検出する第１検出器と、
   光源からの光の照射に応じて保持部材の所定の位置から放射される散乱光を検出する第２検出器と、
   前記第１検出器と前記第２検出器の検出結果を用いて前記反応容器中の試料を分析する分析処理部と、を有し、
   前記保持部材は、光源から照射された光を通す光照射窓と、前記保持部材の所定の位置から放射される光を前記第１検出器および前記第２検出器で検出するための検出窓を備え、
   前記遮蔽板は、光源から照射された光を通す光照射窓と、前記保持部材の所定の位置から放射される光を前記第１検出器および前記第２検出器で検出するための検出窓を備え、
   前記保持部材は、それぞれ独立に温度調整が可能な機構を備え、前記温度調整が可能な機構により試料に対してＰＣＲサイクルを行うことにより試料を増加させ、前記分析処理部は、前記第２検出器で検出された散乱光の強度が予め定めた基準値よりも高くなった場合には、前記反応容器中の試料を異常と判断することを特徴とする核酸分析装置。
2. 請求項１記載の分析装置において、
   さらに前記分析処理部の結果を表示する表示部を有し、
   前記表示部は、前記分析処理部は、前記反応容器中の試料を異常と判断した場合にアラームを表示することを特徴とする核酸分析装置。
3. 請求項１記載の分析装置において、
   さらに、反応容器内で核酸に試薬を混合して試料を作成する試薬混合ユニットと、
   前記試料を分析する分析ユニットと、を有することを特徴とする核酸分析装置。
4. 試料を入れた反応容器を保持できる保持部材と、
   保持部材を複数配置可能なカローセルと、
   前記保持部材と前記カローセルを覆う光学的な外乱を低減するための遮蔽板を備え、
   保持部材の所定の位置に光を照射する光源と、
   光源からの光の照射に応じて保持部材の所定の位置から放射される蛍光を検出する第１検出器と、
   光源からの光の照射に応じて保持部材の所定の位置から放射される散乱光を検出する第２検出器と、
   前記保持部材は、光源から照射された光を通す光照射窓と、前記保持部材の所定の位置から放射される光を前記第１検出器および前記第２検出器で検出するための検出窓を備え、
   前記遮蔽板は、光源から照射された光を通す光照射窓と、前記保持部材の所定の位置から放射される光を前記第１検出器および前記第２検出器で検出するための検出窓を備え、
   前記第１検出器および前記第２検出器を備える光度計と、
   を有する核酸分析装置の検出方法であって、前記光源から前記反応容器に向かって光を照射し、
   前記保持部材が、前記光度計の前を通過する直前から
   前記第１検出器が蛍光の検出を開始し、
   さらに、前記第２検出器が散乱光の検出を開始し、
   前記保持部材が、前記光度計の前を通過した直後に検出を止め、
   前記試料に対してＰＣＲサイクルを行うことにより試料を増加させ、前記検出された散乱光の強度が予め定めた基準値よりも高くなった場合には、前記反応容器中の試料を異常と判断することを特徴とする核酸分析装置の検出方法。
5. 請求項４記載の分析装置において、
   さらに、検体から核酸を抽出する核酸抽出ユニットと、
   抽出した核酸に試薬を分注し、混合する試薬混合ユニットと、
   混合後の反応液を温調して蛍光を検出する核酸分析ユニットと、を備え、
   前記検出された散乱光の強度が予め定めた基準値よりも高くなった場合には、前記反応容器中の試料を異常と判断し、前記核酸抽出ユニットまたは前記試薬混合ユニットで、盲蛍光物質の混入がないか確認できることを特徴とする核酸分析装置の検出方法。

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