JP6475162B2

JP6475162B2 - プレバイオティックチラコイド組成物

Info

Publication number: JP6475162B2
Application number: JP2015530443A
Authority: JP
Inventors: ペル−オーケアルベルトソン; アルベルトソンカルロッテエルランソン
Original assignee: ティラビスコアーベー
Priority date: 2012-09-11
Filing date: 2013-09-10
Publication date: 2019-02-27
Anticipated expiration: 2033-09-10
Also published as: AU2013314410A1; CN104780783A; WO2014040962A1; AU2013314410B2; ES2656619T3; JP2015533484A; CA2884281C; DK2895012T3; BR112015005355A2; EP2895012B1; NO2895012T3; ZA201502431B; CA2884281A1; US20150209396A1; EP2895012A1; KR20150053769A

Description

本発明は、プレバイオティクスの分野、とりわけ哺乳動物の消化器系における、プロバイオティック細菌、典型的には乳酸菌の増殖及び／又は活性を刺激する組成物に関する。

プロバイオティック細菌は当該技術分野で周知であり、それらの健康上の利益は実証されている。プロバイオティック細菌による利益を増加させるために、それらに、細菌の増殖を促進するプレバイオティック物質が補われ得る。プレバイオティクスは、微生物相に対して有益な効果を有する、非細菌性の生成物である。それらは、結腸内微生物相への肥料として作用し、これにより、ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）及びラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）のような、有益な共生生物の増殖を促進する。プレバイオティックは、腸内微生物相又は共生の細菌叢としても知られる、胃腸のミクロフローラにおける組成及び／又は活性の両方において、特異的に変化できる、典型的には、選択的に発酵された成分であり、宿主の健康状態及び健康に利益を与える。

典型的には乳酸菌、例えば乳酸桿菌及びビフィドバクテリウムのようなプロバイオティック細菌の促進は、乱れた腸内微生物相に関連する疾患の治療に有益であり得る。例として、抗生物質関連下痢、旅行者の下痢、小児の下痢、及び過敏性腸症候群は、乱れた腸内微生物相に関連することが知られている病態である。また、プレバイオティック作用物質の使用は、結直腸癌のリスクの低減に関連している。さらに、共生の細菌叢における乱れは、これらに限定されないが、放射線の治療又は偶発的曝露、抗生物質及び細菌増殖に影響を及ぼす他の作用物質の使用、グルテンに対する不耐性のような腸の疾患を含む様々な他の要因のために起こり得る。そのような望まれない変化は、疾患及び乱れた免疫機能をもたらすことがあり、正常な生理学的増殖、並びに細菌叢及び宿主双方の機能が果たされ得るように、プレバイオティクスの使用により正すことができる。

このように、有益な腸細菌性の細菌叢を乱す病態は、プロバイオティック細菌の増殖を促進することにより、処置又は予防されるだろう。

かなり多様な潜在的なプレバイオティック物質が存在する。一例として、ＥＰ１０５６３５８Ｂ１には、プレバイオティック食品における特定の単糖の経口摂取が、ヒトの結腸における有益な細菌の増殖を刺激することが記載されている。

しかしながら、製造するのに容易であり、摂取するのに安全である、付加的な利益を有する、新規で且つ改良されたプレバイオティック物質を発見することの必要性がある。

従って、本発明は、好ましくは、当該技術分野単独で又は任意の組合せで上記の欠乏を克服しようとし、製造するのに容易であり、摂取するのに安全である、付加的な利益を有する、新規で且つ改良されたプレバイオティック組成物を提供することにより、少なくとも上述の問題を解決する。

本発明の一態様によれば、プレバイオティック作用物質として、単離され、濃縮されたチラコイド、又はそれらの部分を含む、組成物の非治療的な使用が提供される。そのような使用は、典型的には、回腸及び盲腸、例えば哺乳動物の回腸のような腸管における、乳酸桿菌及びビフィドバクテリウムのような乳酸菌の増殖を促進するためである。

本発明の別の態様によれば、乱れた腸内微生物相に関連する病態の処置又は予防に使用するための組成物であって、単離され、濃縮されたチラコイド、又はその部分を含み、その使用が、回腸及び盲腸、例えば哺乳動物の回腸のような腸管において、乳酸桿菌及びビフィドバクテリウムのような乳酸菌の増殖を促進するための、ヒトのような哺乳動物に対する経口投与を含む、組成物が提供される。

本発明の別の態様によれば、単離され、濃縮されたチラコイド、又はその部分、及びプロバイオティック細菌を含む組成物が提供される。

本発明の別の態様によれば、単離され、濃縮されたチラコイド、又はその部分を含む組成物の経口投与による、被験体である哺乳動物における、乱れた腸内微生物相に関連する病態の処置の方法が提供される。

さらに、本発明の有利な特徴は、従属する請求項に定義される。加えて、本発明の有利な特徴は、本願明細書に開示される実施形態に詳述される。

本発明により可能となる、これら及び他の態様、特徴及び利点は、本発明の実施形態の以下の説明から明らかになり、解明され、参照が添付の図面に対してなされる。

図１は、１つの実施形態による、血漿インスリンの濃度（ｐＭ）を示すグラフである。図２は、本発明の実施形態による、乳酸桿菌の生菌数（ＣＦＵ／ｇ組織）を示すグラフである。図３は、本発明の実施形態による、乳酸桿菌の生菌数（ＣＦＵ／ｇ組織）を示すグラフである。図４は、１つの実施形態による、細菌の生菌数（ＣＦＵ／ｇ組織）を示すグラフである。図５は、本発明の実施形態による、Ｔ−ＲＦＬＰデータの主成分分析（ＰＣＡ）を示すグラフである。図６は、本発明の実施形態による、Ｔ−ＲＦＬＰデータの主成分分析（ＰＣＡ）を示すグラフである。

［詳細な説明］
いくつかの本発明の実施形態は、本発明を実施することができる当業者のために、添付の図面を参照して、以下に、より詳細に記載されるだろう。本発明は、多くの異なる形態で具体的に示され得るが、本願明細書において説明する実施形態に限定されるものと解されるべきではない。むしろ、この開示が完全で且つ徹底的であり、当業者に本発明の範囲を、完全に伝えるように、これらの実施形態は提供される。実施形態は本発明を限定せず、本発明は特許請求の範囲の記載のみにより限定される。さらに、添付の図面に示される特定の実施形態の詳細な説明で使用される用語は、本発明を限定することを意図しない。

チラコイドは、緑葉の葉緑体膜から抽出され得、タンパク質、脂質、及び色素（例えばクロロフィル及びカロテノイド）を含有する。それは、ヒト及び動物の被験体の双方におけるいくつかの研究において、満腹感を高め、空腹感を抑え、体重減少を促進することが発見されている（とりわけＷＯ２００６／１３２５８６及びＷＯ２０１０／００８３３３を参照されたい）。満腹感を高める効果は、二通りに説明される：チラコイドが食物性のトリアシルグリセリド及びリパーゼ／コリパーゼ複合体と互いに作用し、その結果、物理的な妨害を引き起こし、これにより食物性の脂肪の消化、及び、腸内壁を越えた栄養素の摂取も長引かす。

如何なる毒性効果もなく使用され得るとの理由から、チラコイドは、体で消化される。しかしながら、有益である、ミトコンドリアのような、他の細胞コンパートメントより、チラコイドはゆっくり消化される。当業者により認識される通り、プレバイオティック作用物質は、宿主の健康状態及び健康に利益を与える、胃腸のミクロフローラにおける組成及び／又は活性の両方において、特異的に変化できる成分である。

発明者らは、腸内微生物相におけるチラコイドの効果、及びラットにおけるブドウ糖負荷試験後の結果を調べた。彼らは、驚くべきことに、チラコイドが腸内微生物相を整えること（図２〜４を参照のこと）、故に、プレバイオティック作用物質として機能することを発見した。さらに、彼らは、チラコイドがインスリン感度を高めることを発見した（図１参照のこと）。

簡潔に説明すると、スプラーグドーリー（Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ）系のラットは、２つの群に分けられ、１０日間、標準的なラットの固形飼料の、チラコイドを濃縮した食餌、又は対照の食餌の何れかが与えられた。１０日後、ブドウ糖負荷試験が実施され、対照と比較して、チラコイドの食餌が与えられたラットにおけるインスリンの濃度が著しく低いという結果になった（図１を参照のこと）。細菌の分析では、チラコイドの添加により引き起こされた、回腸における乳酸桿菌のかなりの増殖が示され、腸内サンプルの細菌培養と、ｑＰＣＲにより、双方で実証した。また、糞便中の乳酸桿菌の量の著しい減少が、チラコイドの群におけるｑＰＣＲ分析により観察され、１０日間のチラコイドの補給後、乳酸桿菌は腸管の粘膜に対してより付着力が増している可能性が示唆された。

他の細菌の分析は、対照と比較したチラコイドの群に関して、結腸、盲腸、及び糞便におけるグラム陽性菌が著しく減少したことを示した。末端標識制限酵素断片多型分析（Ｔ−ＲＦＬＰ）の主成分分析を経た糞便の微生物相の分析は、チラコイドを与えた動物と、その対照の動物を比較する際、微生物個体群が異なることを証明した。まとめると、これらの知見は、チラコイドが腸内微生物相を整え得ること、故にプレバイオティック作用物質として機能することを示す。これは、つまり、体重及び代謝障害の調整に重要であるだろう。

本発明者らは、このように、哺乳動物へのチラコイド又はその部分を含む組成物の経口投与が、腸内プロバイオティック細菌叢の機能を高め、乳酸菌の増殖を促進することを発見している。単離され、濃縮されたチラコイドを含む組成物は、このように、プレバイオティック作用物質として機能し得る。さらに、種々のプロバイオティック株、とりわけ乳酸桿菌は、障害のある免疫機能、並びに抗生物質関連下痢、旅行者の下痢、小児の下痢、及び過敏性腸症候群を予防又は処置することに有用であると示されている。

１つの実施形態によれば、単離され、濃縮されたチラコイド、又はその部分を含む組成物は、このように、哺乳動物の腸管における、乳酸桿菌及びビフィドバクテリウムのような乳酸菌の増殖を促進するために提供される。哺乳動物はヒトであってもよい。典型的には、組成物を、腸管に届けるために、経口で投与する。腸管、とりわけ回腸及び盲腸、より好ましくは回腸、において乳酸菌の増殖を促進することにより、これらに限定されないが、障害のある免疫機能、並びに抗生物質関連下痢、旅行者の下痢、小児の下痢、及び過敏性腸症候群を含む、乱れた腸内微生物相に関連する病態は、予防又は処置され得る。

単離され、濃縮されたチラコイド、又はその部分は腸内微生物相を整えるために使用され得るが、プロバイオティック細菌は、１つの実施形態によれば、組成物に含まれる。プロバイオティック細菌を含むことにより、腸内微生物相における効果を高めることができ、現存のプロバイオティック細菌が補完された。組成物に含まれるためのプロバイオティック細菌は、ビフィドバクテリウム、例えばビフィドバクテリウム・インファンテス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｉｎｆａｎｔｉｓ）、及びラクトバチルス、例えばラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｐｌａｎｔａｒｕｍ）であってもよい。

チラコイドを単離及び濃縮することの一般原則は、当該技術分野で公知である（ＰＣＴ／ＳＥ２００６／０００６７６、ＷＯ／ＳＥ２００９／０００３２７、及びＥｍｅｋ、ＳＣ、ＳｚｉｌａｇｙｉＡ、ＡｋｅｒｌｕｎｄＨＥら（２０１０）ＡｌａｒｇｅｓｃａｌｅｍｅｔｈｏｄｆｏｒｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｏｆｐｌａｎｔｔｈｙｌａｋｏｉｄｓｆｏｒｕｓｅｉｎｂｏｄｙｗｅｉｇｈｔｒｅｇｕｌａｔｉｏｎＰｒｅｐａｒｂｉｏｃｈｅｍ＆ｂｉｏｔｅｃｈ４０（１）、１３−２７を参照のこと）。

典型的には、本発明の組成物のチラコイドは、緑葉又は緑藻類から濃縮される。好ましくは、チラコイドは、ホウレンソウから単離され、濃縮される。チラコイドは、組成物に加えられる前に、単離され、濃縮されたチラコイドのクロロフィル含有量が１ｇ当たり約８ｍｇ〜１５０ｍｇのクロロフィルとなるような方法で濃縮され得る。組成物におけるチラコイドの含有量は、組成物１ｇ当たり１ｍｇ〜７５ｍｇのクロロフィルとなるクロロフィル含有量に相当してもよい。

腸管における、乳酸桿菌及びビフィドバクテリウムのような、乳酸菌の増殖を促進するために使用される組成物は、食品又は医薬であってもよい。１つの実施形態によれば、組成物は、チラコイドを含む、生理的に許容できる水中油型エマルションを含む経口用製剤又は栄養補助食品組成物である。このような実施形態において、チラコイドの量は２０〜３０ｗｔ％、例えば、約２５ｗｔ％である。さらに、油分含有量は２０〜３０ｗｔ％、例えば、約２５ｗｔ％であってもよい。使用される油分は、菜種油、オリーブ油、ヒマワリ油等のような食用の植物油であってもよい。

組成物が種々の形態で投与され得るように、投与されるチラコイドの１日用量を変えてもよい。指針の通り、投与される組成物の量は、哺乳動物の体重１ｋｇ当たり２．４ｍｇ〜２４０ｍｇのチラコイドの１日用量に、その投薬量が相関するような方法で選択されてもよい。

別の実施形態によれば、本願明細書に開示されるチラコイドの組成物は、プレバイオティック作用物質として非治療的な使用のために提供される。本願明細書に開示されるチラコイドの組成物は、胃腸のミクロフローラの組成及び／又は活性の両方を変化させ得るため、宿主の健康状態及び健康に利益を与え得る。

別の実施形態は、乱れた腸内微生物相に関連する哺乳動物の病態を処置又は予防する方法に関する。そのような方法において、本願明細書に開示される組成物の有効量は、乱れた腸内微生物相に関連する病態に罹患している哺乳動物に対して、経口で投与される。さらに、その方法は、哺乳動物の腸内微生物相が乱されるのを予防するために、哺乳動物に対して、本願明細書に開示される組成物を経口投与することも含む。乱れた腸内微生物相に関連する病態の例は、抗生物質関連下痢、旅行者の下痢、小児の下痢、及び過敏性腸症候群を含む。

本願明細書で使用される場合、「予防する（ｐｒｅｖｅｎｔ）／予防すること（ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ）」は、予防を果たすための本願明細書に開示される実施形態による組成物の使用後、病態及び／又は疾患が再び生じ得ないことを意味すると解釈されるべきではない。さらに、その用語は、前記病態を予防するためのそのような使用後、少なくともある程度の病態も生じる可能性がないことを意味すると解釈されるべきでもない。むしろ、予防されるその病態がそのような使用にも関わらず生じると、「予防する／予防すること」は、そのような使用がない場合より症状が抑えられるだろうということを意味すると意図される。１つの実施形態によれば、「予防する／予防すること」は、予防的処置に関する。

別の実施形態は、本願明細書に開示される通り、インスリン感度を増加させるための、ヒトのような哺乳動物の腸管への投与のための組成物に関する。そのインスリン感度は、２型糖尿病（インスリン非依存型糖尿病）を処置又は予防するために高められ得る。

まとめて腸内微生物相と呼ばれる、通常、ヒトの消化管に生息するプロバイオティック細菌は、栄養分の獲得及びエネルギーの調整での重要な役割を有する。近年は、微生物相が正常な体重の人と、過体重又は肥満の人との間で異なることが提唱されている。ヒト及び動物の研究からの多数の知見は、腸内細菌の２つの有力な分類、すなわち、グラム陽性ファーミキューテス門（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）及びグラム陰性バクテロイデス門（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ）の量が、宿主のエネルギー−収得効率を変えることによる肥満症の病態生理学と密接に関わっていることを明らかにしている。従って、肥満の動物及び患者において、腸内におけるファーミキューテス門の増加及びバクテロイデス門の減少が実証されている。肥満の患者が低カロリー食で体重を減らすと、これらの特異的な細菌の割合において逆の変化が生じる。他方、肥満のヒトにおける腸内微生物相のそういう変動の証拠は、矛盾していた。たとえ肥満の人々において、正常な体重の人々と比較して、バクテロイデス門の著しい存在比が実証されているとしても、肥満の個体と、非肥満の個体との間に、ファーミキューテス門及びバクテロイデス門に関する違いは発見されなかった。腸内微生物相が体重の調整に重要な役割を果たし、肥満症の改善における要素で有り得ることの可能性を、これらの知見は提起する。

他の代謝病も、糖尿病と同様に、微生物相の組成変動に関連していると実証されている。調節不全の腸内バリア、リーキーガット（ｌｅａｋｙｇｕｔ）、がインスリン耐性、及び結果的に糖尿病の改善に導き得ることも提案されている。従って、腸内バリアを補強することは、糖尿病を予防し、処置もし得るため、及び肥満症を予防するための新しい治療の方法であろう。

プレバイオティクスと呼ばれる、繊維質のような、低血糖食品の摂取は、炭水化物の腸内消化を緩慢化することにより満腹感を高める方法としてよく受け入れられている。プレバイオティクスは、微生物相に有益な効果を有する非細菌性の産物である。それらは、結腸内微生物相に対して肥料として作用し、これにより、ビフィドバクテリウム及びラクトバチルスのような有益な共生生物の増殖を促進する。しかしながら、炭水化物の消化を長引かせることからの満腹感は、明らかに十分ではない。

今日、世界中で、１０億人超の成人が、２５〜３０ｋｇ／ｍ^２の肥満度指数（ＢＭＩ）を有する過体重であり、３億を超える人が３０ｋｇ／ｍ^２より高いＢＭＩを有する肥満である。さらに、過体重及び肥満症は高脂血症、アテローム性動脈硬化症、及び心血管疾患と強く関連している。

今日では、西欧社会において、嗜好性食品（すなわち、脂肪及びスクロースが豊富な食品）の入手機会が増している。これは、過去数十年にわたり、観察される世界的な体重の増加に寄与しているだろう。過体重及び肥満症に苦しんでいる個人を助けるため、それゆえ、満腹感を強め、空腹感を弱める方法を発見するのは極めて重要である。食品に対する、緑葉由来のチラコイド膜の栄養補給の後、グレリン及びコレシストキニン（ＣＣＫ）（非公表データ）やインスリン及びレプチンのような、いくつかの食欲ホルモン（ａｐｐｅｔｉｔｅｈｏｒｍｏｎｅｓ）が影響を受けることを、我々は発見している。

さらなる詳述を必要とせずに、当業者は、前述の説明から、本発明を最大限利用できると解される。以下の好ましい特定の実施形態は、それゆえ、単なる例示として解釈され、決して本開示の残りを限定するものではない。

本発明は、具体的な実施態様を参照して、先に説明さているが、本願明細書に説明する特定の形態に限定することを意図するものではない。むしろ、本発明は、添付の特許請求の範囲によって限定されるだけであり、上記以外の他の実施形態、例えば、上記のものと異なる実施形態が、これらの添付の特許請求の範囲内で同等に可能である。

特許請求の範囲において、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）／含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、他の要素又は工程の存在を除外しない。付加的に、異なる請求項において個々の特徴が含まれ得るが、これらは、可能な場合、有利に組み合わされてもよく、異なる請求項に包含するものは、特徴の組合せが、実現可能がなく及び／又は有利でないものを意味しない。

加えて、単数形への言及は、複数性を除外しない。「ａ」、「ａｎ」、「第一（ｆｉｒｓｔ）」、「第二（ｓｅｃｏｎｄ）」等の用語は、複数性を排除しない。

［実験］
以下に説明する実験作業の狙いは、健康なラットの腸内微生物相におけるチラコイドの効果と、また、血中インスリンにおけるそれらの効果を研究することであった。微生物相の組成を、培養上及び培養に依存しない手法の双方で分析した。特定の細菌の生菌数は、培養上の手法としてそれらの代謝要求量と、培養に依存しない手法として定量的ＰＣＲ（ｑ−ＰＣＲ）、末端標識制限酵素断片多型（Ｔ−ＲＦＬＰ）、及び１６ＳｒＤＮＡ配列決定とに基づいた。

しかしながら、以下の実施例は単なる例であり、決して、本発明の範囲を限定すると解釈されるべきではない。むしろ、本発明は、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される。

［動物及び実験手順］
研究を、スプラーグドーリー系のラット（ドブネズミ（Ｒａｔｔｕｓｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ））（Ｍｏｌ：ＳＰＲＤＨａｎ；ＴａｃｏｎｉｃＭ＆ＢＡ／Ｓ，Ｒｙ，デンマーク）において実施し、ラットを、オープンケージシステム（ｏｐｅｎｃａｇｅｓｙｓｔｅｍ）を用い、調整された環境（２０℃±１℃、相対湿度５０％±１０％、１２：１２時間の明暗周期）を備える特定病原体を含まない状況下で飼育した。順化７日後、合計で１６匹のラットを個々に管理し、１０日間、対照の食餌（８匹のラット）又は濃縮したチラコイドの食餌（８匹のラット）の何れかを与えた。

チラコイド膜を、前述した通り、新鮮な赤ちゃんホウレンソウの葉から精製し、抽出した（Ｅｍｅｋ，ＳＣ，ＳｚｉｌａｇｙｉＡＡｋｅｒｌｕｎｄＨＥら（２０１０）ＡｌａｒｇｅｓｃａｌｅｍｅｔｈｏｄｆｏｒｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｏｆｐｌａｎｔｔｈｙｌａｋｏｉｄｓｆｏｒｕｓｅｉｎｂｏｄｙｗｅｉｇｈｔｒｅｇｕｌａｔｉｏｎＰｒｅｐａｒｂｉｏｃｈｅｍ＆ｂｉｏｔｅｃｈ４０（１），１３−２７；ＭｏｎｔｅｌｉｕｓＣ，ＧｕｓｔａｆｓｓｏｎＫ，ＷｅｓｔｒｏｍＢら（２０１１）Ｔｈｙｌａｋｏｉｄｓｒｅｄｕｃｅｇｌｕｃｏｓｅｕｐｔａｋｅａｎｄｄｅｃｒｅａｓｅｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ．ＢｒＪＮｕｔｒ１０６（６），８３６−４４）。

標準的なラットの固形飼料（Ｒ３６、Ｌａｎｔｍａｎｎｅｎ、ストックホルム、スウェーデン）を、菜種油のみ（対照の食餌）、又はチラコイド−油懸濁液（チラコイドの食餌）の何れかで濃縮した。

チラコイドの食餌を、ミキサーを用いて４ｇのチラコイド粉末（１３２ｍｇのクロロフィルに対応する）、５ｇの菜種油、及び１０ｇの水を混合することにより調製した。補充されたチラコイドの量を、正常な食物摂取量（２２ｇの食餌／ラット／１日）１ｇ当たり６ｍｇのクロロフィルの添加により計算した。双方の食餌は、同じカロリーであり、エネルギー（Ｅ）分布が２５Ｅ％の炭水化物、６０Ｅ％の脂肪、及び１５Ｅ％のタンパク質であった。

体重を、１０日間の実験期間、毎日記録した。午前中に、２５ｇの正常なラット固形飼料を、その日の間中、自由に摂取できる状態で、全てのラットに与えた。後の午後に、残ったラットの固形飼料を取り除き、摂取した量を測定した。次いで、それぞれのラットに、本実験に係る食餌１５ｇを与えた。１１日目に、糞便の試料を、ブドウ糖負荷試験を実施する前、午前中に、特定病原体を含まない状況下で採取した。

１５％のグルコース溶液を、ラットの体重の１０％の量で、ボーラス投与として与えた。尻尾における刺し傷により、０、１５、３０、４５、６０、９０、及び１２０分の時点で、血漿グルコースの濃度を測定し、一方で、１２０分後のみインスリンを測定した。次いで、ラットを、開腹手術を実施する前に、イソフルラン（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｇｈａ／ｓ、バラールップ、デンマーク）で麻酔にかけた。回腸、盲腸、及び結腸からの腸内粘膜の試料を採取し、すぐに、３ｍｌの凍結保存培地（ｆｒｅｅｚｉｎｇｍｅｄｉａ）を含有する無菌チューブに入れた。研究を、動物実験に対するルンド大学倫理審査委員会（ＬｕｎｄＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＥｔｈｉｃａｌＲｅｖｉｅｗＣｏｍｍｉｔｔｅｅ）が認証し、実験動物の保護に関する欧州共同体の規則に従って実施した。

［細菌性数の分析］
回腸、盲腸、及び結腸からの腸内粘膜の試料と、糞便からの試料とにおける、乳酸桿菌、ビフィズス菌、及び腸内細菌科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）の生菌数計測に対して、従来の希釈手順を用いた。適切な希釈物からの試料を、ロゴサ（Ｒｏｇｏｓａ）寒天、変性Ｗｉｌｋｉｎｓ−Ｃｈａｌｇｒｅｎ（ＭＷ）寒天、及び赤紫色の胆汁グルコース（ｂｉｌｅｇｌｕｃｏｓｅ）寒天（全てＯｘｏｉｄ（マルメ、スウェーデン）製）に蒔き、１ｇの組織又は糞便当たりのコロニー形成単位（ＣＦＵ）を算出する前に、嫌気的に７２時間及び好気的に２４時間、３７℃でインキュベートした。

［１６ＳｒＤＮＡ配列決定］
結腸及び回腸試料からの、合計で１６９の分離株（全てのラットから４〜６）を、１６ＳｒＤＮＡ配列決定のために無作為に取り出した（ＭＷ寒天プレート：５２の結腸の分離株、ロゴサ（Ｒｏｇｏｓａ）プレート：５３の結腸の分離株、ロゴサプレート：６４の回腸の分離株）。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のための鋳型として、粗細胞抽出物を使用した。１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を、順方向プライマーＥＮＶ１及び逆方向プライマーＥＮＶ２（表１）、（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ストックホルム、スウェーデン）を用いることで増幅した。合計で２５μＬのＰＣＲ反応混合物は、０．４μΜのプライマーＥＮＶ１、０．２μΜのプライマーＥＮＶ２、２．５μＬの１０×ＰＣＲ反応緩衝液（５００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１００ｍＭのＫＣｌ、５０ｍＭの（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、２０ｍＭのＭｇＣｌ_２、ｐＨ８．３）、０．２μΜのデオキシリボヌクレオチド三リン酸、２．５Ｕのファストスタート（ＦａｓｔＳｔａｒｔ）ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（ＲｏｃｈｅＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、マンハイム、ドイツ）、及び２μＬの鋳型ＤＮＡ含んでいた。ＰＣＲを、以下のプログラムでＥｐｐｅｎｄｏｒｆＭａｓｔｅｒＣｙｃｌｅｒ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ、ハンブルク、ドイツ）において実施した：９５℃３分間、９４℃３分間、９４℃１分間、５０℃４５秒、及び７２℃２分間を３０サイクルの後、７２℃７分間の付加的な延長動作。試料のＤＮＡが存在しない試薬のみを含有するＰＣＲを、陰性ＰＣＲ対照として、並行して実施した。ＰＣＲ産物（２μＬ）を１．５％のアガロースゲルで検証した。増幅した産物を、ＭＷＧ−Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｅｂｅｒｓｂｅｒｙ、ドイツ）による配列決定のために９６−ウェルプレートに移した。決定した配列を、ＧｅｎＢａｎｋデータベース（ＮａｔｉｏｎａｌＣｅｎｔｅｒｆｏｒＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，ＲｏｃｋｖｉｌｌｅＰｉｋｅ，ベセスダ、メリーランド州、ＵＳＡ）で比較した。

［糞便及び腸内生検のＤＮＡ抽出］
糞便、並びに回腸及び結腸の腸内切片を解凍し、１２８５１ｇで１０分間、遠心分離（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ５８０４Ｒ、ハンブルク、ドイツ）する前に、５分間超音波浴（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、スンドビュベリ、スウェーデン）に入れ、２分間ボルテックスにかけた。上清を捨て、１９０μＬの緩衝液Ｇ２、及び１５μＬのプロテイナーゼＫ（ＤＮＡ組織キット（ＤＮＡＴｉｓｓｕｅＫｉｔ）；Ｑｉａｇｅｎ、ヒルデン、ドイツ）を腸内試料に加えた。全ての試料を、振とう式恒温水槽（ｓｈａｋｉｎｇｗａｔｅｒｂａｔｈ）において５６℃で一晩中インキュベートする前に、ＰＢＳ緩衝液（５００μＬ／５０ｍｇ）を、糞便の試料に加えた。１２８５１ｇで８分間遠心分離（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ５８０４Ｒ）した後、溶液をＱｉａｇｅｎの試料管に移した。全てのＤＮＡを抽出し、製造業者の説明書に従いＢｉｏｒｏｂｏｔＥＺ１（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、２００μＬの緩衝液に溶離した。

［定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）分析］
分離定量（ｓｅｐａｒａｔｅｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ）ＰＣＲ分析を用いて、細菌の分類を推定した。それぞれの分析反応では、１０μＬのＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ（登録商標）ＳＹＢＲＧｒｅｅｎＰＣＲＭａｓｔｅｒＭｉｘ（Ｑｉａｇｅｎ）、０．５μΜのそれぞれのプライマー（表１）、２μＬの鋳型ＤＮＡ、及び２０μＬの最終体積に達するようにＲＮａｓｅフリーの水を含んでいた。試料、基準、及び非鋳型の対照を、重複して実行した。９５℃１５分間の後、９５℃１５秒間の変性、５６℃〜６０℃３０秒間のアニーリング、及び７２℃３０秒間の伸長反応による４０サイクルのプログラムを有するＲｏｔｏｒ−ＧｅｎｅＱ（Ｑｉａｇｅｎ）において、熱サイクルを実施した。蛍光性の産物をそれぞれのサイクルの最終段階で検出した。特異的な増幅を確認するために、融解曲線分析を行った。１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の絶対存在量（Ａｂｓｏｌｕｔｅａｂｕｎｄａｎｃｅ）を、Ｒｏｔｏｒ−ＧｅｎｅＱシリーズ（ソフトウェア１．７、Ｑｉａｇｅｎ）を用いる標準曲線を基に算出した。検出限界は、全ての分析について、１０^２コピー／反応であった。標準曲線を作成するために、ラクトバチルス・プランタルムＤＳＭ９８４３、ビフィドバクテリウム・インファンテスＤＳＭ１５１５９、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）ＣＣＵＧ２９３００、及びバクテロイデス・プレボテラ（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ）からのクローニング産物を使用した。細胞懸濁液（クローニング産物）の１つのループを、アンピシリンを有する１０ｍＬの溶原培地（ＬＢ培地）に移し、３７℃で一晩インキュベートした。ＱＩＡｐｒｅｐ（登録商標）（Ｍｉｎｉｐｒｅｐｋｉｔ，Ｑｉａｇｅｎ）を用いることにより、ＤＮＡ抽出を実施した。ＮａｎｏｄｒｏｐＮＤ−１０００（ＳａｖｅｅｎＷｅｒｎｅｒＡＢ、マルメ、スウェーデン）により、ＤＮＡの濃度（ｎｇ／μＬ）を、最終的に測定し、コピー数を算出するために用いた。ＤＮＡ産物の１０倍の希釈系列をＴＥ緩衝液（１０ｍＭのＴｒｉｓ、１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８）において作成した。細菌数を、糞便又は組織の湿重量１ｇ当たりの増幅産物コピー数として表した。

［末端標識制限酵素断片多型（Ｔ−ＲＦＬＰ）分析］
順方向プライマーＥＮＶ１を、５’末端で蛍光染料（ＦＡＭ）により蛍光で標識化したこと以外、上記の通り、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を増幅した。３系列反応（Ｔｒｉｐｌｉｃａｔｅｒｅａｃｔｉｏｎｓ）をそれぞれの試料に対して実施し、陰性対照も全てのＰＣＲで実施した。ＰＣＲ産物を１．５％のアガロースゲルで検証した。それぞれの試料のＰＣＲ産物を貯蔵し、ＭｉｎＥｌｕｔｅＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いることにより、さらに精製した。ＤＮＡを、最終的に、１５μＬのＰＥ緩衝液に溶離し、ＤＮＡ濃度をＮａｎｏｄｒｏｐＮＤ−１０００（ＳａｖｅｅｎＷｅｒｎｅｒＡＢ）により測定した。

［Ｔ−ＲＦＬＰ分析］
精製したＰＣＲ産物のアリコート（２００ｎｇ）を、制限エンドヌクレアーゼ酵素ＭｓｐＩで５時間、又は制限エンドヌクレアーゼ酵素ＡｌｕＩで２時間（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ、ザンクト・レオン＝ロート、ドイツ）の何れかにより、３７℃で消化した（Ｍａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ（登録商標）５３３３、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）。不活化の例を６５℃で２０分間加熱することにより形成した。消化後、産物のアリコートを、９６−ウェルプレートにおいて滅菌水で４倍に希釈した。次いで、キャピラリー電気泳動システムにおけるＴ−ＲＦＬＰ分析のために、試料をＤＮＡ−ｌａｂ（ＳｋａｎｅＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＨｏｓｐｉｔａｌ、マルメ、スウェーデン）に移した。ＧｅｎｅＭａｐｐｅｒ（登録商標）（ｖｅｒｓｉｏｎ４．０、ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、フォスターシティ、カリフォルニア州、ＵＳＡ）により、電気泳動からのデータを分析し、断片サイズ及びピーク領域を、サザン法（ＧｅｎｅＭａｐｐｅｒ）を用いて概算した。サイズ範囲を３０塩基対（ｂｐ）〜６００ｂｐに設定した。ピーク振幅の閾値を、試料に対して５０相対蛍光単位（ｒｆｕ）、及び内部標準に対して１０ｒｆｕに設定した。それぞれの試料について全てのピーク領域を、試料における全てのピークについての領域を集計することにより算出した。個々の相対的なピーク領域を、全ての領域のパーセンテージとして表した。

［計算］
試料について全ての領域のパーセンテージとして表した相対的なピーク領域を用いて、シャノン＝ウィーバー指標（Η’）を、以下の数式により算出した：
Ｈ’＝−Σｐｉｌｎｐｉ
ｐｉがパーセンテージとして表した相対的な領域であり、ｌｎは自然対数である。実験群の間の微生物個体群における相違の可能性を明らかにするため、主成分分析（ＰＣＡ）による多変量データ解析を、ＳＩＭＣＡ−Ｐ＋（１２．０．１、Ｕｍｅｔｒｉｃｓ、ウメオ、スウェーデン）において実施した。

［統計］
数値を、中央値±平均値の標準誤差、又は１０％値、２５％値、７５％値、及び９０％値として示す。マン・ホイットニー順位和検定及び／又はＳｉｇｍａ−Ｓｔａｔ３．０（ＳＰＳＳＩｎｃ．、シカゴ、イリノイ州、ＵＳＡ）及びＧｒａｐｈＰａｄ４．０，（ＧｒａｐｈｐａｄＩｎｃ．、ラホヤ、カリフォルニア州、ＵＳＡ）を用いるｔ検定により、２つの実験群の間の相違を評価した。フィッシャー直接確率法（Ｑｕｉｃｋ−Ｓｔａｔｖｅｒｓｉｏｎ２．６、ＳａｐｉｏＨＢ、スウェーデン）により、細菌の発生率を評価した。Ｐ＜０．０５は有意差があるとみなされる。

［結果］
（体重、血漿グルコース、及びインスリン）
全てのラットは、研究中の毎晩の実験的な食餌を終えた。１０日間の実験中に示す体重又は標準のラットの摂取量に関して、チラコイドと対照群との間に有意差を発見しなかった（データは示さない）。しかしながら、ボーラス投与後、１２０分間での血漿インスリン濃度は、図１に示すように、対照と比較して、チラコイド群では有意に低下した。ここで、グルコースのボーラス投与をラットに与えた後１２０分の、血漿インスリン濃度（ｐＭ）を示す。インスリンレベルは、対照群と比較してチラコイド群では有意に下がった（ｐ＝０．００８２）。しかしながら、それらの群の間で、血漿グルコース濃度について差異はなかった。

（細菌の定量化及び同定）
乳酸桿菌についての図２に示すような生菌数計測と、図３に示すようなｑＰＣＲ分析との双方に関し、対照と比較してチラコイド群では、回腸の粘膜において有意に増加した。図２は、回腸、盲腸、及び結腸の粘膜、並びに糞便における乳酸桿菌の生菌数（ＣＦＵ／ｇ組織）を示す。チラコイド群における乳酸桿菌の量は、対照群と比較して、回腸では有意に増加したが（ｐ＝０．００７）、盲腸、結腸、及び糞便に関して差異は見られなかった；図３は回腸及び結腸の粘膜、並びに糞便における、乳酸桿菌の含有量のｑＰＣＲ分析を示す。乳酸桿菌は、対照群と比較してチラコイド群では、回腸の粘膜において有意に増殖し（ｐ＝０．０３２）、糞便において有意に減少した（ｐ＝０．００７）。結腸の粘膜において、差異を観察しなかった。双方の方法に関し、結腸又は盲腸の粘膜試料において、差異を観察しなかった。しかしながら、生菌数計測ではなく、ｑＰＣＲは、図３に示すように、チラコイド群では、糞便試料において乳酸桿菌の有意な減少を示した。ｑＰＣＲの融解曲線分析は糞便及び粘膜の乳酸桿菌が異なっていることを証明した（データは示さない）。ロゴサプレートから無作為に取り出した分離株に対する１６ＳｒＤＮＡ配列決定は、対照と比較して、チラコイド群では、回腸におけるラクトバチルス・ロイテリのかなり高い発生率を示した。また、結腸におけるチラコイドによるラクトバチルス・ロイテリの発生率の増加傾向も、回腸及び結腸におけるラクトバチルス・ジョンソニー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）の発生率の有意な低下と同様に観察した（表２）。

ｑＰＣＲによるビフィズス菌の分析は、回腸、結腸の粘膜において、また、糞便においても、双方の実験群では同様の含有量を示した（データは示さない）。生菌数について、ビフィズス菌選択培地における増殖細菌の有意な減少を、チラコイド群で発見した。しかしながら、１６ＳｒＤＮＡによる同定は、ビフィズス菌ではない他のグラム陽性菌が、顕著に寒天プレートに存在することを示した（ビフィズス菌は、２５％未満を示す）。それ故に、群としてのグラム陽性菌は、図４に示すように、盲腸及び結腸の粘膜、並びに糞便の双方において、対照と比較してチラコイド群で有意に減少した。ここで、回腸、盲腸、及び結腸の粘膜、並びに糞便におけるビフィズス菌選択培地での増殖細菌の生菌数（ＣＦＵ／ｇ組織）を示す。細菌の量は、対照群と比較して、チラコイド群では盲腸（ｐ＝０．０１０４）、結腸（ｐ＝０．０２０７）、及び糞便（ｐ＝０．０００６）において有意に減少した。これらのグラム陽性菌を、ブドウ球菌種（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓｓｐｐ）、コクリア属細菌（Ｋｏｃｕｒｉａ）、及びバシラス・シンプレックス（ＢａｃｉｌｌｕｓＳｉｍｐｌｅｘ）と同定した（データは示さない）。

制限エンドヌクレアーゼＭｓｐＩによる、回腸及び結腸由来の粘膜試料のＴ−ＲＦＬＰ分析では、主成分分析（ＰＣＡ）により示すように、実験群の間で細菌群における差異が無いとの結果になった。しかしながら、糞便の試料において、図５に示すように、対照と比較してチラコイド群では、特異的な細菌群は、完全に、互いに分離した。ここで、対照群及びチラコイド群における、結腸及び回腸の粘膜、並びに糞便のＭｓｐＩ消化からのＴ−ＲＦＬＰデータの主成分分析（ＰＣＡ）を示す。糞便の試料（□＝対照群からの糞便、■＝チラコイド群からの糞便）において、完全に互いに分離した、特異的な細菌性群の間で差異を見ることができる。図６に示すように、制限エンドヌクレアーゼＡｌｕＩによっても、チラコイド群及び対照群それぞれからの糞便の試料において、ＰＣＡにより同様に示される分離した細菌群を発見した。ここで、対照群及びチラコイド群における、糞便の試料のＡｌｕＩ消化からのＴ−ＲＦＬＰデータの主成分分析（ＰＣＡ）を示す。対照群（□）及びチラコイド群（■）からの、糞便の試料間の差異を、互いに分離しているので、見ることができる。

生菌数及びｑＰＣＲの双方による、腸内細菌科及びバクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄ）の分析（データは示さない）において、また、シャノン＝ウィーバー多様性指数により計算された後の細菌多様性（データは示さない）でも、チラコイド群と対照群との間の有意差を観察しなかった。

［検討］
この研究では、２つの主な知見に至った。第一に、１０日間の食餌に対するチラコイドの補給は、ラットにおけるインスリン感度に影響を及ぼす。食餌の間、血漿グルコースの濃度に差異を観察しないにも関わらず、グルコースのボーラス投与を与えてから１２０分後、チラコイドの食餌を与えたラットの血液中において、インスリンがより低濃度であった。腸壁の摂取及び透過性に関するインビトロモデルである拡散チャンバーを用いると、チラコイドは、投与量に依存して、メチルグルコースの摂取を長引かせ、腸管の粘膜側を被覆するチラコイドの立体障害が起こることを示している。仮説では、インビボでグルコース摂取が長引くと、分泌されるインスリンの濃度が低くなる。しかしながら、本研究において、血液中のグルコースで差異が観察されなかったものの、１２０分後のインスリン濃度が、チラコイド群では有意に下がった。近年は、「リーキーガット」、すなわち腸管の透過性の増加が、インスリン耐性、及び結果的に糖尿病の改善に導き得ることが提案されている。インスリンの濃度低下に対する１つの説明は、それゆえ、チラコイドにより引き起こされた立体障害が、腸壁を強化したことであるだろう。

糖尿病を予防し、処置もし得るための新しい治療の方法を切り開くことができるため、この現象は、さらに研究される必要がある。

第二に、チラコイドは、いくつかの方法で微生物相を調整する。回腸における乳酸桿菌の濃度が増加し、同時に糞便において乳酸桿菌が減少することは、チラコイドが乳酸桿菌の回腸におけるコロニー形成を促進させることを示唆する。我々の知見をサポートする、乳酸桿菌の株は高い濃度で粘膜にコロニー形成する能力がある、ということが知られている。ラットにおける乳酸桿菌の共通の亜種は、対照と比較して、チラコイド群で特に増加するラクトバチルス・ロイテリである。さらに、チラコイド群では、結腸及び糞便において、グラム陽性菌の偏ったコロニー形成が観察された。しかしながら、ビフィズス菌の濃度は、実験群の間で差異が無かった。対照群ではなく、チラコイド群において、細菌個体群の異なる群が発見されたように、微生物相のチラコイドによる調整も、Ｔ−ＲＦＬＰ分析により見られた。

以前の研究では、抗肥満症要素として作用することにより、ラクトバチルス及びビフィドバクテリウムのいくつかの株が、体重調整にとって重要であり得ることを報告している。また、過体重の患者では、やせた患者に比べて、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ）のような、いくつかのグラム陽性菌の増殖が促進されることが言われている。有害なグラム陽性菌、及びその微生物相の組成全体の除去は、このように、エネルギーバランスにとって重要であることは明らかである。さらに、ラクトバチルス・ロイテリが、有害な細菌の増殖を抑制する健康促進効果を有するということが示され、ラクトバチルス・ラムノサスＧＧ、及びガセリ菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｇａｓｓｅｒｉ）のような他の乳酸桿菌種が、肥満症、及び肥満に関連する炎症を軽減することが発見されている。ブドウ球菌種、コクリア属細菌、及びバシラス・シンプレックスのような、潜在的に有害な細菌の観察された減少は、チラコイドの直接的な効果、又はラクトバチルス・ロイテリのコロニー形成を促進する第二の効果等の何れかであり得る。

上記の知見の全ては、ラットにおいて、１０日間の食餌へのチラコイドの添加が、いくつかの点で微生物相に効果があることを示す。微生物相の組成が体重の管理に関わることを示しており、チラコイドが、以前に、体重を減少させることを示しているため、以前の研究で見られる体重減少のいくつかの効果が、微生物相の偏りに起因し得るとの仮説を立てることができる。

終わりに、チラコイドが、腸内微生物相を制御することで、乳酸桿菌のコロニー形成の促進、及び潜在的に有害なグラム陽性菌の増殖の減少に至ることを示す本知見を、我々は提案する。このように、チラコイドはプレバイオティック作用物質である。チラコイドは、おそらく腸内のバリア機能を補強することによって、インスリン感度も増加させる。

実施形態で使用したプライマー

回腸及び結腸の粘膜試料のロゴサプレートから無作為に取り出した分離株の１６ＳｒＤＮＡ配列決定により調べた、異なるラクトバチルス菌種の発生率。Ｐ＜０．０５を、対照に対するチラコイド群での有意な増加と見なした。

Claims

単離され、濃縮されたチラコイド、又はその部分を含むプレバイオティック用組成物。
哺乳動物の腸管における乳酸菌の増殖を促進するためである、請求項１に記載のプレバイオティック用組成物。
増殖が促進される前記細菌が、乳酸桿菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ）及び／又はビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）である、請求項１又は２に記載のプレバイオティック用組成物。
前記チラコイド又はその部分が、緑葉又は緑藻類から濃縮される、請求項１〜３の何れか１項に記載のプレバイオティック用組成物。
前記チラコイド又はその部分が、ホウレンソウから濃縮されたチラコイド又はその部分である、請求項４に記載のプレバイオティック用組成物。
前記組成物におけるクロロフィルの含有量が、前記組成物１ｇ当たり１ｍｇ〜７５ｍｇである、請求項１〜５の何れか１項に記載のプレバイオティック用組成物。
前記組成物が食品の部分である、請求項１〜６の何れか１項に記載のプレバイオティック用組成物。
前記組成物が、前記チラコイド又はその部分を含む、生理的に許容できる水中油型エマルションを含む、経口用栄養補助食品組成物である、請求項１〜７の何れか１項に記載のプレバイオティック用組成物。